TWI787710B - 用於親和層析的新型清洗緩衝液 - Google Patents

用於親和層析的新型清洗緩衝液 Download PDF

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Abstract

本發明提供了一種在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之方法，上述方法包括：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含組胺酸或咪唑及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述層析管柱。

Description

用於親和層析的新型清洗緩衝液
本發明總體涉及在純化蛋白質樣品時移除雜質之組合物及方法。
由於蛋白A配位體與單株抗體之間的特異性相互作用，蛋白A層析通常被視為高度有效之純化步驟。因此，它通常被用於直接捕獲步驟，隨後再藉由精製管柱進行處理，以滿足生物製藥產品之純度要求。在此初始步驟中，蛋白A樹脂之高選擇性將大多數非目標蛋白留在流穿液中。然而，包括高分子量(HMW)及低分子量(LMW)，宿主細胞蛋白(HCP)在內之某些雜質可能與目標蛋白一起保留在管柱中。作為在下游製程中移除雜質最有效之單元操作，蛋白A層析可移除澄清收穫液中大於90%之HCP。因此，在親和層析步驟中優化雜質之移除尤為重要。
在雜質中，HCP係由生物體產生或編碼且與目標重組產品無關的雜質。HCP構成了一大類與製程相關之雜質，且其即使在低含量下亦能潛在地損害生物藥品之安全性及有效性。除了安全性問題之外，HCP之存在亦會對產品品質產生影響。由於HCP同時引起安全性及有效性問題，因此希望藉由下游製程將它們儘可能完全地移除。
已描述了用於自蛋白A層析管柱移除雜質的各種不同清洗液，包括含有下述物質之一的清洗液：疏水性電解質(例如pH 5.0-7.0的四甲基氯化銨、四乙基氯化銨、四丙基氯化銨或四丁基氯化銨)、溶劑(例如5-20%異丙醇或聚丙二醇/己二醇)、脲(例如濃度為1-4M)、去污劑(例如0.1-1% PS 20或PS 80)、聚合物(例如5-15%聚乙二醇例如PEG400或PEG8000)、或高度濃縮之緩衝溶液例如濃度為0.8-2.0M且pH在5.0至7.0之間的Tris-HCl、乙酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液。
一方面，本發明提供了一種在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之方法，上述方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含式I化合物及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述管柱，
Figure 110101967-A0305-02-0003-1
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。
在一個實施例中，上述化合物為組胺酸或咪唑。
本發明亦提供了一種在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之方法，上述方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含絲胺酸及/或半胱胺酸及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述管柱。
在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue (High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
在一個實施例中，上述pH調節劑包含乙酸緩衝液諸如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
在一個特定實施例中，在上述清洗緩衝液體積中上述化合物之莫耳濃度為約100 mM及更高，較佳為約100 mM至約1 M，更佳為約300 mM至約700 mM，例如約100 mM、約200 mM、約300 mM、約400 mM、約500 mM、約600 mM、約700 mM、約800 mM、約900 mM或約1 M。
在一個特定實施例中，上述清洗緩衝液之pH為約pH 5.5或更低，例如約pH 5.0、約pH 4.5、約pH 4.0、約pH 3.5。
在另一個實施例中，上述方法在上述步驟2)後不包括溶離步驟。
在一個特定實施例中，上述蛋白質樣品為抗體例如單株抗體或融合蛋白。上述融合蛋白為含有可被蛋白A識別之Fc結構域的Fc-融合蛋白。上述Fc-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的IgG之Fc結構域組成。在另一個特定實施例中，上述融合蛋白為人血清白蛋白(HAS)-融合蛋白。上述HAS-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的HAS組成。
在一個特定實施例中，上述雜質包含宿主細胞蛋白(HCP)。
另一方面，本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之組合物，其中上述組合物包含至少一種式I化合物：
Figure 110101967-A0305-02-0005-2
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。
在一個實施例中，R1為H，且上述化合物為咪唑。
在一個實施例中，R1為被羧基及胺基取代之C3烷基。
在一個實施例中，上述化合物為組胺酸或咪唑。
本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除之組合物，其中上述組合物包含絲胺酸及/或半胱胺酸。
在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
在一個實施例中，上述pH調節劑包含乙酸緩衝液諸如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
另一方面，本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之套組，其中上述套組包含含有式I化合物、絲胺酸或半胱胺酸之組合物：
Figure 110101967-A0305-02-0006-3
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。
在一個實施例中，R1為H，且上述化合物為咪唑。
在一個實施例中，R1為被羧基及胺基取代之C3烷基。
在一個實施例中，上述化合物包含組胺酸或咪唑。
在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
在一個實施例中，上述pH調節劑包含乙酸緩衝液諸如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
本發明提供了上述組合物在製備清洗液中之用途，上述清洗液用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除。
特點與優點
本發明提供了用於親和層析的高效且穩健的清洗液。上述清洗液之特徵在於存在組胺酸或咪唑(一種芳族雜環，組胺酸之官能基)，在溶離步驟之前在清洗步驟中使用而不損害產物回收率。
為了可更容易地理解本發明，首先定義了某些術語。其他定義在整個詳細描述中闡述。應理解，本文中使用之術語僅僅係出於描述特定實施例之目的，且不打算為限制性的。
當在本說明書及隨附之申請專利範圍中使用時，並無具體數目的指稱包括複數指稱物，除非上下文明確敍述並非如此。因此，例如，對「多肽」之指稱包括兩種或更多種多肽之組合等。
本文中使用之「約」在指稱可量測之值如量、時距等時，意在涵蓋與所指定之值相差± 20%或± 10%，包括± 5%、± 1%及± 0.1%，因為此類偏差對於執行所揭示之方法而言為適合的。
除非另有定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習此項技術者通常理解的相同之含義。儘管與本文中描述的相似或等同的任何方法及材料都可在實踐中用於本發明之試驗，但本文中描述了較佳的材料及方法。在描述及主張本發明中，將使用下述術語。
在本發明中使用之術語「蛋白質樣品」係指含有可被蛋白A識別之Fc結構域的蛋白質。此類蛋白質包括抗體及Fc-融合蛋白。上述抗體可為單株抗體或多株抗體。上述抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性的。上述抗體可為小鼠抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。上述抗體可為天然抗體或重組抗體。Fc-融合蛋白係由抗體之Fc結構域及遺傳連接的活性蛋白組成。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。多肽可為天然(組織衍生的)起源的，由原核或真核細胞製備物重組或天然表現的，或藉由合成方法化學產生的。上述術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應的天然存在之胺基酸的人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物或非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之通用化學結構不同的結構，但以與天然存在之胺基酸相似之方式發揮作用的化學化合物。非天然殘基在科學及專利文獻中被充分描述；可用作天然胺基酸殘基的模擬物的若干例示性之非天然組合物在下文描述。芳族胺基酸的模擬物可藉由用例如下述化合物代替來產生：D-或L-萘基丙胺酸，D-或L-苯甘胺酸，D-或L-2噻吩基丙胺酸，D-或L-l、-2、3-或4-芘基丙胺酸，D-或L-3噻吩基丙胺酸，D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸，D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸，D-或L-(2-吡𠯤基)-丙胺酸，D-或L-(4-異丙基)-苯甘胺酸，D-(三氟甲基)-苯甘胺酸，D-(三氟甲基)-苯丙胺酸，D-p-氟-苯丙胺酸，D-或L-p-聯苯基苯丙胺酸，K-或L-p-甲氧基-聯苯基苯丙胺酸，D-或L-2-吲哚(烷基)丙胺酸及D-或L-烷基胺代，其中烷基可為取代或未取代之甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、二級丁基、異戊基，或非酸性胺基酸。非天然胺基酸之芳環包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳環。
當在本文中使用時，「肽」包括作為本文中具體例示的肽的保守變異的肽。當在本文中使用時，「保守變異」係指胺基酸殘基被另一個生物學上相似的殘基代替。保守變異之實例包括但不限於一個疏水殘基例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸、正白胺酸或甲硫胺酸替換另一個疏水殘基，或一個極性殘基替換另一個極性殘基，例如精胺酸替換離胺酸、麩胺酸替換天冬胺酸或麩醯胺酸替換天冬醯胺等。可彼此替換之中性親水胺基酸包括天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。「保守變異」亦包括使用取代之胺基酸代替未取代之母體胺基酸，只要針對上述取代之多肽產生的抗體亦與上述未取代之多肽免疫反應即可。此類保守替換在本發明之多肽類別的定義之內。當在本文中使用時，「陽離子型」係指在pH 7.4下具有淨正電荷之任何肽。肽之生物活性可藉由熟習此項技術者已知及本文中描述之標準方法來測定。
在本發明中使用之術語「Fc結構域」係指抗體之可結晶片段區。Fc結構域源自於抗體重鏈之恆定結構域。「Fc結構域」可被蛋白A識別且結合。
在一個實施例中，上述蛋白質為抗原結合蛋白。在一個實施例中，上述抗原結合蛋白為抗體。在一個實施例中，上述抗體為IgG類別之抗體。在一個實施例中，上述抗原結合蛋白為免疫球蛋白單鏈可變結構域。
可用於本發明之例示性抗體包括阿達木單抗、貝洛托舒單抗、阿利庫單抗、度匹魯單抗、度伐利尤單抗、奧瑞珠單抗、柏達魯單抗、瑞利珠單抗、奧拉木單抗、達雷木單抗、埃羅妥珠單抗、耐昔妥珠單抗、英夫利西單抗、奧必托昔單抗、阿特珠單抗、蘇金單抗、美泊利單抗、納武單抗、阿利庫單抗、依伏庫單抗、地努圖希單抗、貝伐單抗、派姆單抗、雷莫蘆單抗、維多珠單抗、司妥昔單抗、阿侖單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、英夫利西單抗、奧濱尤妥珠單抗、本妥昔單抗、瑞西巴庫單抗、貝利單抗、伊匹單抗、地諾單抗、奧法木單抗、貝索單抗、托珠單抗、康納單抗、戈利木單抗、優特克單抗、賽妥珠單抗、卡妥索單抗、依庫麗單抗、蘭尼單抗、帕尼單抗、那他珠單抗、卡妥索單抗、貝伐單抗、奧馬珠單抗、西妥昔單抗、依法珠單抗、替伊莫單抗、法索單抗、托西莫單抗、阿侖單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗、英夫利西單抗、帕利珠單抗、耐昔妥珠單抗、巴利昔單抗、利妥昔單抗、卡羅單抗、沙妥莫單抗、莫羅莫那等。
可用於本發明之例示性Fc-融合蛋白包括依那西普、阿法西普、阿巴西普、利納西普、咯咪珀咯、貝拉西普、阿柏西普等。
術語「層析」係指將混合物中存在的關注之分析物(例如含有Fc結構域之蛋白質例如免疫球蛋白)與其他分子分離開的任何種類之技術。通常，上述關注之分析物與其他分子之分離為作為上述混合物的各個分子在移動相之影響下或在結合及溶離過程中藉由固定介質遷移的速率差異的結果。
在本發明中使用之術語「蛋白A」涵蓋了自天然來源回收之蛋白A、合成(例如藉由肽合成或藉由重組技術)產生的蛋白A及其功能性變體。蛋白A對Fc結構域表現出高親和性。蛋白A可自Repligen、Pharmacia及Fermatech商購。蛋白A通常被固定化在固相支持材料上。術語「蛋白A」亦指含有共價附連有蛋白A的層析固相支持基質的親和層析樹脂或管柱。
「緩衝液」係藉由其酸鹼共軛組分的作用抗拒pH變化的溶液。取決於例如緩衝液之所需pH，可使用之各種不同緩衝液描述在Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems，Gueffroy, D.主編，Calbiochem Corporation, 1975中。在本發明方法之某些步驟中，緩衝液具有2.0至4.0或2.8至3.8範圍內之pH。在本發明之其他步驟中，緩衝液具有5.0至9.0範圍內之pH。在本發明之其他步驟中，緩衝液具有4.0至6.5範圍內之pH。在本發明方法之另外的其他步驟中，緩衝液具有低於4.0之pH。將pH控制在該範圍之內的緩衝液之非限制性實例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丁二酸鹽及銨鹽緩衝液以及它們之組合物。術語「pH調節劑」係指能夠在水溶液中產生約1.0與約14.0之間的選定pH值的緩衝溶液，pH調節劑可為乙酸緩衝劑，如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝劑、磷酸緩衝劑或Tris-HCl。
術語「清洗緩衝液」係指用於在樣品裝載之後及溶離之前清洗層析管柱的緩衝液。
術語「溶離緩衝液」係指用於自固相溶離目標蛋白的緩衝液。上述溶離緩衝液之電導率及/或pH通常使得上述目標蛋白自上述層析樹脂溶離。
材料 三水乙酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、三(羥甲基)胺基甲烷、磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉係購自Merck (Darmstadt, Germany)。乙酸、L-組胺酸、L-組胺酸單鹽酸鹽、L-精胺酸鹽酸鹽、L-半胱胺酸、絲胺酸、脯胺酸及鹽酸(6.0N溶液係購自J. T. Baker, Millipore (Bedford, MA, America)。咪唑係購自Sigma (Saint Louis, America)。
設備 將安裝有Unicorn軟體6.3版之AKTA pure 150系統(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)用於所有層析運作。pH及電導率使用SevenExcellence S470 pH/電導率儀(Mettler-Toledo, Columbus, OH, USA)量測。蛋白質濃度使用NanoDrop One分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)量測。將Agilent 1260液相層析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)用於SEC-HPLC分析。
方法 蛋白 A/Capto Blue 層析 將Eshmuno A (蛋白A親和介質)/Capto Blue (high-sub)裝填在床高度為15 cm之直徑0.5 cm之管柱中。管柱體積(CV)為大約3 ml。裝載物為澄清化之培養收穫物。對於所有運作而言，層析管柱載樣以後在結合-溶離模式下運作，目的蛋白用相應溶離緩衝液進行溶離。對於所有運作而言，在載樣後，在溶離之前將上述管柱用不同緩衝液清洗3 CV。對於所有層析運作而言，系統以180 cm/小時之流速運作(停留時間：5分鐘)。所有層析圖係藉由在280 nm處監測UV吸收值來記錄。來自於所選運作的溶離被分部收集且藉由SEC-HPLC分析單體純度，用於HCP及/或PLBL2測定法。
尺寸排阻層析 - 高效液相層析 (SEC-HPLC) 所有樣品均使用Tosoh TSKgel G3000SWxl不鏽鋼管柱(7.8 × 300 mm)進行分析。每次運作進樣100 µg樣品。移動相係由pH 6.8的50 mM磷酸鈉、300 mM氯化鈉構成。將每個樣品以1.0 mL/分鐘之流速等度溶離20分鐘。蛋白質溶離係藉由280 nm處的UV吸收值來監測。將對應於單體及團聚體的峰積分以計算每種物質之百分率。
宿主細胞蛋白 (HCP) 測定法 殘留CHO宿主細胞蛋白之測定使用來自於Cygnus Technologies之CHO宿主細胞蛋白F550套組來實現。將含有CHO HCP之樣品同時與HRP標記的抗CHO抗體及包被在微量滴定盤中的抗CHO捕獲抗體反應。上述免疫反應引起形成固相抗體-HCP-酶標記抗體的夾心複合物。然後將底物TMB與HRP反應。終止反應，且在450 nm及650 nm讀取OD值。上述測定之OD值與樣品中存在之CHO HCP的濃度成正比，以便測定樣品中存在的殘留CHO宿主細胞蛋白之含量。
倉鼠磷脂酶 B- 樣蛋白 2 (PLBL2) 測定法 樣品係使用來自於MyBioSource之倉鼠磷脂酶B-樣蛋白(PLBL2) ELISA套組進行分析。在此測定法中，樣品中存在之PLBL2與已被吸附至聚苯乙烯微量滴定盤孔表面的抗PLBL2抗體反應。在藉由清洗移除未結合的蛋白之後，添加偵測抗體生物素結合的抗PLBL2抗體且形成複合物。在清洗步驟後，添加辣根過氧化物酶(HRP)結合的鏈親合素且形成複合物。在另一個清洗步驟後，藉由添加TMB分析上述複合物。測試樣品中PLBL2之量可自使用標準品構建的標準曲線內推，且對樣品稀釋度進行校正。
方法
本發明提供了一種在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之方法，上述方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含至少一種式I化合物及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述管柱，
Figure 110101967-A0305-02-0014-4
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。
在一個實施例中，上述組合物包含組胺酸及/或咪唑。
本發明亦提供了一種在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之方法，上述方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含絲胺酸及/或半胱胺酸及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述管柱。
在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
在一個實施例中，上述pH調節劑包含乙酸緩衝液諸如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
在一個特定實施例中，在上述清洗緩衝液體積中上述化合物之莫耳濃度為約100 mM及更高，較佳為約100 mM至約1 M，更佳為約100 mM至約900 mM、100 mM至約800 mM、100 mM至約700 mM、100 mM至約600 mM、100 mM至約500 mM、100 mM至約400 mM、100 mM至約300 mM、100 mM至約200 mM、200 mM至約1 M、300 mM至約1 M、400 mM至約1 M、500 mM至約1 M、600 mM至約1 M、700 mM至約1 M、800 mM至約1 M、900 mM至約1 M、250 mM至約750 mM或500 mM。
在一個特定實施例中，上述清洗緩衝液之pH為約pH 5.5或更低、pH 5或更低、pH 4.5或更低、pH 4或更低、pH 3.5或更低、pH 3或更低。
在另一個實施例中，上述方法在上述步驟2)後不包含溶離步驟。
在一個特定實施例中，上述蛋白質樣品為抗體例如單株抗體或融合蛋白。上述融合蛋白為含有可被蛋白A識別之Fc結構域的Fc-融合蛋白。上述Fc-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的IgG之Fc結構域組成。在另一個特定實施例中，上述融合蛋白為人血清白蛋白(HAS)-融合蛋白。上述HAS-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的HAS組成。
在一個特定實施例中，上述雜質包含宿主細胞蛋白(HCP)。
組合物
一方面，本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之組合物，其中上述組合物包含至少一種式I化合物：
Figure 110101967-A0305-02-0016-5
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。在一個實施例中，R1為H且上述化合物為咪唑。在一個實施例中，R1為被羧基及胺基取代之C3烷基。在一個實施例中，上述組合物包含組胺酸及/或咪唑。
本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除之組合物，其中上述組合物包含絲胺酸及/或半胱胺酸。
在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
本發明提供了上述組合物在製備清洗液中之用途，上述清洗液用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除。
套組
另一方面，本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行蛋白質純化中提高雜質移除之套組，其中上述套組包含含有式I化合物之組合物：
Figure 110101967-A0305-02-0017-6
其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代。在一個實施例中，R1為H且上述化合物為咪唑。在一個實施例中，R1為被羧基及胺基取代之C3烷基。在一個實施例中，上述組合物包含組胺酸及/或咪唑。在一個實施例中，上述親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、Ig Select層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。在一個實施例中，上述套組亦包含pH調節劑。在一個實施例中，上述pH調節劑包含乙酸緩衝液諸如NaAc及/或HAc、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
本發明提供了一種用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除之套組，其中上述套組包含絲胺酸及/或半胱胺酸。
實例 實例1：組胺酸清洗液與其他清洗液之比較
將美國專利號6,090,382中揭示的用於表現抗hTNFα抗體之cDNA序列選殖於分別含有殺稻瘟菌素與博萊黴素抗性標誌物的兩個載體中。使用脂質體進行穩定轉染。在轉染後，將細胞在選擇性培養基(含有9 µg/mL殺稻瘟菌素與400 µg/mL博萊黴素之CD CHO培養基)中傳代，用於合併物選擇。在合併物選擇約2週後，藉由FACS分選將上述合併物選殖。將上述純系在離心管中藉由分批培養進行篩選。對選出的細胞純系進行培養，自含有抗hTNFα IgG4之細胞培養物澄清出收穫物。
在本實例中，評估了在親和層析期間含有組胺酸的清洗液對自含有IgG4 (抗hTNFα抗體)的細胞培養物澄清的收穫物移除雜質的影響。具體而言，比較了三種清洗液：一種含有pH 5.5之1 M NaCl，第二種含有pH 5.5之0.5 M組胺酸，第三種含有pH 5.5之0.5 M精胺酸。
自含有IgG4之細胞培養上清液澄清的收穫物藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照下表1中描述之條件進行純化。上樣載量為30 g/L。
表1. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 保留時間(分鐘) 體積(管柱體積)
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後如表2中所述用清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液示出在表2中。
表2. 具有不同組分的用於第二次清洗的清洗液
緩衝液 CV
對照(無清洗2) 3
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，500 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，500 mM精胺酸- HCl, pH 5.5 3
使用上述三種不同清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在表3中。
表3. 組胺酸清洗液與其他清洗液之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
對照(無清洗2) 105 14.5 85.5 0.1 34409 8
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 105 14.6 85.5 0.0 27517 5
50 mM NaAc-HAc，500 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 104 14.4 85.5 0.1 14522 ＜2
50 mM NaAc-HAc，500 mM精胺酸- HCl, pH 5.5 102 14.1 85.7 0.0 13340 ＜2
如表3中所示，結果表明不同的清洗2溶液對步驟得率及聚體水準沒有影響，且同時維持較高之產物回收率。亦應注意到，與對照相比NaCl清洗沒有顯示出HCP的顯著降低。然而，與NaCl清洗及對照相比，組胺酸與精胺酸清洗液顯示出顯著的HCP與PLBL2移除。此外，組胺酸在HCP移除中顯示出與精胺酸溶液相近的能力，而組胺酸清洗尚未報道過。具體而言，組胺酸清洗引起＞ 95%的可接受之回收率，同時提供與對照相比2.5倍的HCP減少。
實例 2 ：清洗液中不同組胺酸濃度之比較 在本實例中，調查了在親和層析中不同組胺酸濃度對雜質移除之影響。比較了清洗2溶液中4種不同之組胺酸濃度。
含有IgG4的澄清之細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照表2中描述的條件進行純化。
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用下表5中描述的清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在下表4中。
表4. 用於清洗2的具有不同組胺酸濃度的清洗液
緩衝液 CV
對照(無清洗2) 3
50 mM NaAc-HAc，100 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，300 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，500 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，700 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 3
使用上述含有四種不同濃度組胺酸的清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在表5中。
表5. 用於清洗2的不同組胺酸濃度之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
無清洗2 105 14.5 85.5 0.1 34409 8
50 mM NaAc-HAc，100 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 108 14.1 85.9 0.1 25537 4
50 mM NaAc-HAc，300 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 106 14.2 85.9 0.0 18154 2
50 mM NaAc-HAc，500 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 104 14.4 85.5 0.1 14522 ＜2
50 mM NaAc-HAc，700 mM組胺酸-HCl，pH 5.5 103 14.2 85.7 0.1 13463 ＜2
如表5中所示，結果證實與不含組胺酸之緩衝液相比含有組胺酸的清洗液對得率沒有影響。此外，顯然組胺酸溶液在移除HCP與PLBL2中有效。較高組胺酸濃度之清洗液引起溶離液合併物中較低的HCP與PLBL2。具體而言，在pH 5.5下，與不含組胺酸之緩衝液相比，使用含有700 mM之高濃度組胺酸的清洗液引起HCP減少3倍及PLBL2減少至少4倍。
實例 3 ：清洗液中不同咪唑濃度之比較 在本實例中，調查了在親和層析中不同濃度之咪唑的對雜質移除的影響。具體而言，比較了4種不同濃度的清洗液。
含有IgG4的澄清的細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照表6中描述之條件進行純化。
表6. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt(分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變(參見表7) 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用下表7中描述的清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由在同一細胞株上開發的酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在表8中。
表7. 用於清洗2的具有不同咪唑濃度的清洗液
緩衝液 CV
無清洗2 3
50 mM NaAc-HAc，100 mM咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，300 mM咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，500 mM咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，700 mM咪唑-HCl，pH 5.5 3
使用上述含有四種不同濃度咪唑的清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在表8中。 表8. 清洗液中不同咪唑濃度之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
無清洗2 105 14.5 85.5 0.1 34409 8
50 mM NaAc-HAc，100 mM咪唑-HCl，pH 5.5 109 14.0 86.0 0.0 29245 4
50 mM NaAc-HAc，300 mM咪唑-HCl，pH 5.5 104 15.1 84.8 0.1 14853 ＜2
50 mM NaAc-HAc，500 mM咪唑-HCl，pH 5.5 103 14.3 85.7 0.0 12070 ＜2
50 mM NaAc-HAc，700 mM咪唑-HCl，pH 5.5 105 15.4 84.4 0.0 11473 ＜2
如表8中所示，上述結果證明，與不含咪唑之緩衝液相比，含有咪唑之清洗溶液對步驟得率沒有影響。此外，顯然含有咪唑之溶液在移除HCP與PLBL2中有效。較高咪唑濃度之清洗液引起溶離液合併物中較低的HCP。具體而言，在pH 5.5下，與不含咪唑之緩衝液相比，使用含有700 mM之高濃度咪唑之清洗液引起HCP減少3倍及PLBL2減少至少4倍。與最後一個表格中示出之資料相比，顯然咪唑(一種芳香族雜環，組胺酸之官能基)與組胺酸相比在移除HCP中更加有效。
實例 4 ：在含有組胺酸之清洗液中酸性與鹼性同生理 pH 之比較 在本實例中，調查了在親和層析中含有咪唑之清洗緩衝液之pH對移除雜質之影響。具體而言，比較了3種不同pH之清洗液。
含有IgG4的澄清的細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照下表9中描述之條件進行純化。
表9. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt (分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變(參見表10) 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用下表10中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在表10中。
表10. 具有不同pH值的含有組胺酸的清洗液
緩衝液 CV
50 mM NaAc-HAc，pH 5.0 3
50 mM NaAc-HAc，250 mM組胺酸-HCl，pH 5.0 3
50 mM PB，pH 7.0 3
50 mM PB，250 mM組胺酸--HCl，pH 7.0 3
50 mM Tris- HCl，pH 9.0 3
50 mM Tris-HCl，250 mM組胺酸-HCl，pH 9.0 3
使用上述含有三種不同pH的含有組胺酸的清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在表11中。 表11. 含有組胺酸的清洗液中酸性與鹼性同生理pH之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
50 mM NaAc-HAc，pH 5.0 103 14.1 85.9 0.0 35766 5
50 mM NaAc-HAc，250 mM組胺酸-HCl，pH 5.0 107 13.6 86.2 0.0 23728 3
50 mM PB，pH 7.0 109 13.9 86.0 0.0 29306 4
50 mM PB，250 mM組胺酸-HCl，pH 7.0 107 14.7 85.2 0.1 31517 3
50 mM Tris-HCl，pH 9.0 112 14.5 85.4 0.0 17800 3
50 mM Tris-HCl，250 mM組胺酸-HCl，pH 9.0 108 14.7 85.2 0.1 18641 ＜2
如表11中所示，與不含組胺酸之清洗液相比，將pH自酸性(pH 5.0)改變至(pH 9.0)對得率及團聚體水準沒有影響。顯然，基於組胺酸之溶液在低pH下在移除HCP中顯著有效，強調了上述含有組胺酸之清洗液在酸性pH下對親和層析的功效。此外，在此情況下，顯然單獨的組胺酸引起所需的HCP移除，且它僅在具有低pH之組合物中有效。
實例 5 ：在含有咪唑之清洗緩衝液中酸性與鹼性同生理 pH 之比較 在本實例中，調查了在親和層析中含有咪唑之清洗緩衝液之pH移除雜質的影響。具體而言，比較了3種不同pH之清洗液。
含有IgG4的澄清的細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照表12中描述之條件進行純化。
表12. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt (分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變(參見表13) 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH 5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用下表14中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在下表13中。
表13. 具有不同pH值的含有咪唑的清洗液
緩衝液 CV
50 mM NaAc-HAc，pH 5.0 3
50 mM NaAc-HAc，500 mM咪唑-HCl，pH 5.0 3
50 mM PB，pH 7.0 3
50 mM PB，500 mM咪唑，pH 7.0 3
50 mM Tris-HCl，pH 9.0 3
50 mM Tris-HCl，500 mM咪唑，pH 9.0 3
使用上述含有三種不同pH的含有組胺酸之清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在表14中。 表14. 在含有咪唑之清洗液中酸性與鹼性同生理pH之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
50 mM NaAc-HAc，pH 5.0 103 14.1 85.9 0.0 35766 5
50 mM NaAc-HAc，500 mM咪唑-HCl，pH 5.0 106 14.4 85.5 0.0 15970 ＜2
50 mM PB，pH 7.0 109 13.9 86.0 0.0 29306 4
50 mM PB，500 mM咪唑，pH 7.0 106 14.9 85.0 0.0 19891 ＜2
50 mM Tris-HCl，pH 9.0 112 14.5 85.4 0.0 17800 3
50 mM Tris-HCl，500 mM咪唑，pH 9.0 109 14.5 85.4 0.1 15024 ＜2
如表14中所示，與不含咪唑之清洗液相比，將pH自酸性(pH 5.0)改變至(pH 9.0)對得率及聚體水準沒有影響。顯然，基於咪唑之溶液在低pH下在移除HCP中顯著有效，強調了上述含有咪唑之清洗液在酸性pH下對親和層析的功效。此外，在此情況下，顯然單獨的咪唑引起所需的HCP移除，且它僅在具有低pH之組合物中有效。
實例 6 ：組胺酸清洗液與其他胺基酸清洗之比較 在本實例中，調查了在親和層析中含有不同胺基酸的清洗緩衝液對移除雜質的影響。具體而言，比較了7種清洗液。
含有IgG4的澄清的細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照下表15中描述之條件進行純化。
表15. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt (分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變(參見表13) 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH 5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用表16中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在表17中。
表16. 用於第二次清洗的具有不同組分的清洗液  
緩衝液 CV
無清洗2 3
50 mM NaAc-HAc，1 M NaCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M脯胺酸, pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M L-半胱胺酸, pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M絲胺酸，pH 5.5 3
使用上述7種不同清洗液進行單株抗體的蛋白A純化的過程效能示出在下表17中。
表17. 用於IgG4抗體的不同清洗液之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
無清洗2 105 14.5 85.5 0.1 34409 8
50 mM NaAc-HAc，1 M NaCl，pH 5.5 105 14.6 85.5 0.0 27517 5
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 103 14.3 85.7 0.0 17407 ＜2
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 104 14.4 85.5 0.1 14522 ＜2
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 102 14.1 85.7 0.0 13340 ＜2
50 mM NaAc-HAc，0.5 M 脯胺酸, pH 5.5 109 14.1 85.7 0.1 24885 5
50 mM NaAc-HAc，0.5 M L-半胱胺酸 ，pH 5.5 108 14.2 85.7 0.1 16008 6
50 mM NaAc-HAc，0.5 M絲胺酸，pH 5.5 109 14.3 85.6 0.0 19310 5
如表17中所述，結果表明，與對照相比組胺酸與精胺酸顯示出顯著的HCP移除。此外，與對照相比，半胱胺酸與絲胺酸亦顯示出HCP移除。
實例 7 ：用於雙特異性抗體的不同清洗液之比較 將WO 2019/057124A1中揭示的用於表現雙特異性抗CD3 × CD19抗體的cDNA序列選殖於分別含有殺稻瘟菌素與博萊黴素抗性標誌物的兩個載體中。使用脂質體進行穩定轉染。在轉染後，將細胞在96孔盤中，在選擇性培養基(含有9 µg/mL殺稻瘟菌素與400 µg/mL博萊黴素之CD CHO培養基)中塗鋪，用於小型合併物選擇。在小型合併物選擇約2週後，將高產的小型合併物單個地擴增。將上述小型合併物藉由一輪FACS進行選殖，將上述純系在離心管中藉由分批培養進行篩選。對選出的細胞純系進行培養，自含有雙特異性抗CD3 × CD19抗體的細胞培養物澄清出收穫物。
在本實例中，評估了在親和層析中含有組胺酸之清洗緩衝液對自含有雙特異性抗體之細胞培養物移除雜質的影響。
含有上述雙特異性抗體之澄清的細胞培養上清液係藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照下表18中描述之條件進行純化。
表18. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt (分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變(參見表19) 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH 5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用表19中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液示出在下表19中。
表19. 用於第二次清洗的具有不同組分的清洗液
緩衝液 CV
無清洗2 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，1 M NaCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 3
使用不同清洗液進行雙特異性抗體的蛋白A純化的過程效能示出在下表20中。
表20. 清洗液組分對純化過程效能的影響之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm) PLBL2 (ppm)
無清洗2 90 7.5 90.0 2.5 5145 210
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 89 7.8 89.9 2.5 2165 93
50 mM NaAc-HAc，1 M NaCl，pH 5.5 91 8.0 89.6 2.4 2796 207
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 86 10.0 87.1 2.9 1744 NA
如表20中所示，結果證實，不同清洗2溶液對步驟得率及團聚體水準沒有影響，且同時維持較高之產物回收率。此外，與對照相比，使用含有濃度為500 mM之組胺酸之清洗液引起HCP減少2.5倍，且PLBL2減少2倍。
實例 8 ： 組胺酸 / 咪唑清洗液與其他清洗液之比較 用於表現靶向PD1之單株抗體(Keytruda)的cDNA序列揭示於專利申請號WO2008/156712 A中。用於表現靶向VEGF之融合蛋白(Eylea)的cDNA序列揭示於美國專利號7,070,959B1中。將上述cDNA序列選殖於分別含有殺稻瘟菌素與博萊黴素抗性標誌物的兩個載體中。使用脂質體進行穩定轉染。在轉染後，將細胞在選擇性培養基(含有9 µg/mL殺稻瘟菌素與400 µg/mL博萊黴素之CD CHO培養基)中傳代，用於合併物選擇。在合併物選擇約2週後，將上述合併物藉由FACS分選進行選殖。將上述純系在離心管中藉由分批培養進行篩選。對選出的細胞純系進行培養，自含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白之細胞培養物澄清出收穫物。
在本實例中，評估了在親和層析期間含有組胺酸/咪唑之清洗液對自含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白之細胞培養物澄清的收穫物中移除雜質的影響。具體而言，比較了四種清洗液：一種含有pH 5.5之1 M NaCl，第二種含有pH 5.5之0.5 M組胺酸，第三種含有pH 5.5之0.5 M精胺酸，第四種含有pH 5.5之0.5 M咪唑。
自含有抗PD1 IgG4或抗VEGF融合蛋白的細胞培養上清液澄清的收穫物藉由離心來收穫，且使用親和層析管柱(AC管柱)、特別是蛋白A管柱(Millipore, Eshmuno A, 1 CV：3 mL)按照下表21中描述之條件進行純化。載樣能力對於抗PD1 IgG4而言為30 g/L，對於抗VEGF融合蛋白而言為19 g/L。
表21. 用於蛋白A管柱之操作條件
步驟 緩衝液 Rt (分鐘) (CV)體積
漂洗 50 mM Tris-HAc，150mM NaCl，pH 7.4 5 2
清潔殺菌 0.1 M NaOH 3
平衡 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
載樣 NA NA
清洗1 50 mM Tris-HAc，150 mM NaCl，pH 7.4 3
清洗2 可變 3
清洗3 50 mM NaAc-HAc，pH 5.5 3
溶離 50 mM NaAc-HAc，pH 3.5 50-50 mAu/mm
剝脫 1 M乙酸 3
將平衡過的管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用表22或表23中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後在低pH下溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其抗體或融合蛋白濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液示出在表22或表23中。
表22. 用於第二次清洗的具有不同組分的清洗液(抗PD1 IgG4)
緩衝液 容量(g/L) CV
對照(無清洗2) 30 3
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
表23. 用於第二次清洗的具有不同組分的清洗液(抗VEGF融合蛋白)
緩衝液 容量(g/L) CV
對照(無清洗2) 19 3
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
使用四種不同清洗液進行抗PD1 IgG4及抗VEGF融合蛋白的蛋白A純化的過程效能分別示出在表24與表25中。 表24. 組胺酸/咪唑清洗液與其他清洗液之比較(抗PD1 IgG4)
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm)
對照(無清洗2) 97.5 1.5 98.6 ND 1878
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 96.8 1.5 98.5 ND 1300
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 95.9 1.5 98.5 ND 792
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸-HCl，pH 5.5 93.5 1.5 98.5 ND 708
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 94.3 1.4 98.6 ND 924
表25. 組胺酸/咪唑清洗液與其他清洗液之比較(抗VEGF融合蛋白)
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm)
對照(無清洗2) 94.6 0.8 98.9 0.2 2238
50 mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5 71.3 0.9 98.8 0.3 1488
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 92.8 0.9 98.8 0.3 1145
50 mM NaAc-HAc，0.5 M精胺酸- HCl，pH 5.5 96.3 0.7 98.8 0.6 1947
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 97.9 0.8 98.1 0.2 1652
如表24與表25中所示，結果證實，不同的清洗2溶液對步驟得率及聚體水準沒有影響，且同時維持較高之產物回收率。此外應注意到，與對照相比NaCl清洗沒有顯示出HCP的顯著降低。然而，與NaCl清洗及對照相比，組胺酸與咪唑清洗液顯示出顯著的HCP移除。此外，組胺酸與咪唑在HCP移除中顯示出與精胺酸溶液相近的能力。
實例 9 ：用於人血清白蛋白 (HAS) 融合蛋白的不同清洗液之比較 對在美國專利申請號15/557358 (參見其SEQ ID NO: 145)中揭示的用於表現抗CD40 HSA融合蛋白的cDNA序列進行選殖且在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現，使用的是熟習此項技術者所熟悉的技術。
在本實例中，調查了在親和層析中含有組胺酸或咪唑之清洗緩衝液的濃度及pH對自含有HSA融合蛋白之細胞培養物移除雜質的影響。具體而言，比較了具有不同pH之四種不同濃度之清洗液(0.1M、0.3M、0.5M及0.7M)。
含有HSA融合蛋白的澄清的細胞培養上清液係藉由離心加上深度過濾來收穫，且使用親和層析管柱、特別是Capto Blue (High Sub)管柱(1 CV：3 mL)按照表26中描述之條件進行純化。
表26. 用於Capto Blue層析操作條件
步驟 緩衝液 保留時間(分鐘) 體積(CV)
漂洗 純化水 5 3
清潔殺菌 0.5 M NaOH 5 3
預平衡 1 M NaCl 5 3
平衡 20 mM Bis-Tris，60 mM NaCl，pH 6.0 5 3
載樣 NA 5 NA
清洗1 20 mM Bis-Tris，60 mM NaCl，pH 6.0 5 2
清洗2 可變 5 3
清洗3 50 mM Bis-Tris，pH 7.0 5 2
溶離 50 mM Bis-Tris，25 mM辛酸鹽，10 mM EDTA，pH 7.0 150 cm/h    250 - 50 mAu/mm
剝脫 20 mM Bis-Tris，0.5 M辛酸鹽，pH 7.5 5 2
將平衡過的層析管柱用澄清的收穫物載樣，且首先用清洗1溶液清洗，然後用下表27中描述之清洗2溶液進行第二次清洗，然後進行第三次清洗，然後用溶離緩衝液溶離。將上述溶離液藉由UV 280分析其濃度，藉由分析型尺寸排阻層析(SEC)分析HMW/LMW且藉由酶聯免疫吸附測定法分析HCP含量。所比較的用於第二次清洗的各種不同清洗液闡述在表27中。
表27. 比較用於清洗2的具有不同組胺酸/咪唑濃度的清洗液(HSA融合蛋白)
清洗2條件 載量(g/L) CV
無清洗2 17.3 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M NaCl，pH 5.0 3
50 mM NaAc-HAc，0.1 M組胺酸-HCl，pH 5.0 50 mM NaAc-HAc，0.3 M組胺酸-HCl，pH 5.0 50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 4.5 3
3
3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.0 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.7 M組胺酸-HCl，pH 5.0 3
50 mM NaAc-HAc，0.1 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.3 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
50 mM NaAc-HAc，0.7 M咪唑-HCl，pH 5.5 3
使用上述四種含有不同濃度之組胺酸或咪唑之清洗液進行HAS-融合蛋白的Capto Blue純化的過程效能示出在表28中。 表28. 清洗液中不同組胺酸/咪唑濃度/pH之比較
緩衝液 得率 (%) HMW (%) 主峰 (%) LMW (%) HCP (ppm)
無清洗2 91.2 2.6 97.2 0.4 32911
50 mM NaAc-HAc，0.5 M NaCl，pH 5.0 85.3 0.7 99.2 0.1 19446
50 mM NaAc-HAc，0.1 M組胺酸-HCl，pH 5.0 87.2 0.7 99.1 0.3 33390
50 mM NaAc-HAc，0.3 M組胺酸-HCl，pH 5.0 87.3 1.2 98.6 0.3 12229
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 4.5 83.5 0.9 99.1 0.1 3885
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.0 81.9 0.8 99.1 0.1 1472
50 mM NaAc-HAc，0.5 M組胺酸-HCl，pH 5.5 68.2 0.6 99.3 0.0 1053
50 mM NaAc-HAc，0.7 M組胺酸-HCl，pH 5.0 71.5 0.5 99.4 0.1 438
50 mM NaAc-HAc，0.1 M咪唑-HCl，pH 5.0 89.7 0.7 99.0 0.2 32516
50 mM NaAc-HAc，0.3 M咪唑-HCl，pH 5.0 87.6 2.3 97.6 0.2 15148
50 mM NaAc-HAc，0.5 M咪唑-HCl，pH 5.0 83.2 0.9 99.0 0.0 3603
50 mM NaAc-HAc，0.7 M咪唑-HCl，pH 5.0 79.1 0.5 99.4 ND 1037
如表28中所示，結果證實，組胺酸與咪唑溶液在移除HCP中顯著有效。較高組胺酸與咪唑濃度之清洗液引起溶離液中較低的HCP。較高pH的含有組胺酸或咪唑之清洗液引起溶離液中較低的HCP但較低的步驟得率。

Claims (17)

  1. 一種在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除之方法，該方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含式I化合物及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述層析管柱，
    Figure 110101967-A0305-02-0036-7
     其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代；其中該化合物在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為100mM及更高；且其中該清洗緩衝液的pH為pH5.5或更低。
  2. 如請求項1之方法，其中該化合物為組胺酸或咪唑。
  3. 一種在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除之方法，該方法包括下述步驟：1)將蛋白質樣品裝載於親和層析管柱上，2)用包含一種化合物及pH調節劑的清洗緩衝液清洗上述層析管柱，其中該化合物為絲胺酸及/或半胱胺酸；其中該化合物在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為100mM及更高；且其 中該清洗緩衝液的pH為pH5.5或更低。
  4. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該親和層析係選自蛋白A層析、Capto Blue(High Sub)層析、蛋白G層析、蛋白L層析、Lambda Fab Select層析、Kappa Select層析、IgSelect層析、Blue Sepharose層析、Capto Heparin層析、VII Select層析、VIII Select層析、XSelect層析及Capto L層析。
  5. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該pH調節劑包含乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、或Tris-HCl。
  6. 如請求項5之方法，其中該乙酸緩衝液為NaAc及/或HAc。
  7. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該化合物在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為100mM至1M。
  8. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該化合物在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為300mM至700mM。
  9. 如請求項1-3中任一項之方法，其中在該步驟2)後不進一步包括溶離步驟。
  10. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該蛋白質樣品為包含Fc結構域的 抗體或者為融合蛋白。
  11. 如請求項10之方法，其中該融合蛋白為Fc-融合蛋白或HAS-融合蛋白。
  12. 如請求項11之方法，其中該Fc-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的IgG之Fc結構域組成。
  13. 如請求項11之方法，其中該HAS-融合蛋白係由與關注之肽或蛋白質相連的HAS組成。
  14. 如請求項1-3中任一項之方法，其中該雜質包含宿主細胞蛋白(HCP)。
  15. 一種組合物或套組，其包含含有至少一種式I化合物及pH調節劑之清洗緩衝液，用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除，其中
    Figure 110101967-A0305-02-0038-8
     其中R1為H或C1-6烷基，其中C1-6烷基為未取代的或者被獨立地選自羧基、胺基、鹵素或羥基之一個或兩個或三個取代基取代；其中該化合物在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為100mM及更高；且其 中該組合物或套組的pH為pH5.5或更低。
  16. 如請求項15之組合物或套組，其中該化合物為組胺酸或咪唑。
  17. 一種組合物或套組，其包含含有絲胺酸及/或半胱胺酸及pH調節劑之清洗緩衝液，用於在藉由親和層析進行之蛋白質純化中提高雜質移除效率，其中該絲胺酸及/或半胱胺酸在該清洗緩衝液中的莫耳濃度為100mM及更高；且其中該清洗緩衝液的pH為pH5.5或更低。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110151536A1 (en) * 2008-04-07 2011-06-23 Zymogenetics, Inc. Thrombin activator compositions and methods of making and using the same
CN105669844A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军第三军医大学 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法
CN107849122A (zh) * 2015-08-21 2018-03-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用低电导率洗涤缓冲液进行亲和层析纯化
WO2018165328A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Recombipure, Inc. Compositions, methods, and systems for affinity-based protein identification and purification

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5840851A (en) * 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
ATE421536T1 (de) 2001-06-05 2009-02-15 Genetics Inst Llc Verfahren zur reinigung stark anionischer proteine
CN1473843A (zh) * 2003-07-24 2004-02-11 华东理工大学 重组 trail 包含体蛋白的工业化提取、复性和纯化方法
US8329871B2 (en) * 2008-06-24 2012-12-11 Octapharma Ag Process of purifying coagulation factor VIII
JP2010209068A (ja) * 2009-03-11 2010-09-24 Wyeth Llc 小モジュラー免疫薬タンパク質を精製する方法
CN105153313A (zh) 2010-02-16 2015-12-16 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii融合蛋白
WO2011162210A1 (ja) 2010-06-21 2011-12-29 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸を利用したタンパク質の精製方法
CN102633867A (zh) * 2011-02-15 2012-08-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用
CZ2014524A3 (cs) * 2014-08-01 2015-12-30 Univerzita Pardubice Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu
PL3337817T3 (pl) 2015-08-21 2022-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposób zmniejszania zawartości białek komórek gospodarza w chromatografii powinowactwa
JP2019510812A (ja) 2016-02-26 2019-04-18 イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド 多重特異性分子
CN106046149B (zh) * 2016-06-28 2019-12-24 中国科学院福建物质结构研究所 去除血清白蛋白及其融合蛋白中杂质的方法
CN105950588B (zh) * 2016-07-21 2019-04-05 滁州学院 一种高转糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶双点突变体及其制备方法
JP7187436B2 (ja) * 2016-07-25 2022-12-12 セファロン インコーポレイテッド アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー
CN106349387B (zh) * 2016-11-21 2020-06-09 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法
CN106496321B (zh) * 2016-12-29 2020-12-18 德清知诺同丰生物科技有限公司 一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法
JP2020525445A (ja) * 2017-06-21 2020-08-27 セファロン・インコーポレイテッドＣｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ カチオン交換クロマトグラフィーの洗浄緩衝液
CN107475215A (zh) * 2017-09-06 2017-12-15 成都晟博源生物工程有限公司 一种磷酸化酶b的提取方法
CN108611358A (zh) * 2018-04-10 2018-10-02 佛山科学技术学院 一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
CN108977456A (zh) * 2018-08-08 2018-12-11 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 含驯鹿nadph-细胞色素p450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法
CN109022472A (zh) * 2018-08-08 2018-12-18 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法
CN109929032A (zh) * 2019-02-26 2019-06-25 青岛今墨堂生物技术有限公司 一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法
JP2022543187A (ja) * 2019-08-02 2022-10-11 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 抗体を精製するための方法
CN110468172A (zh) * 2019-08-13 2019-11-19 安徽医科大学第一附属医院 一种分离纯化重组lea蛋白的方法及试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110151536A1 (en) * 2008-04-07 2011-06-23 Zymogenetics, Inc. Thrombin activator compositions and methods of making and using the same
CN107849122A (zh) * 2015-08-21 2018-03-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用低电导率洗涤缓冲液进行亲和层析纯化
CN105669844A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军第三军医大学 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法
WO2018165328A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Recombipure, Inc. Compositions, methods, and systems for affinity-based protein identification and purification

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CN114901671B (zh) 2024-02-20
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KR20220130692A (ko) 2022-09-27
WO2021147857A1 (en) 2021-07-29
US20230092867A1 (en) 2023-03-23
EP4093745A4 (en) 2024-03-06

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