CN107475215A - 一种磷酸化酶b的提取方法 - Google Patents

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张文宝
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Abstract

本发明公开了一种磷酸化酶B的提取方法，包括以下步骤：(1)制备初级上清液；(2)制备次级上清液；(3)制备粗体磷酸化酶B；(4)对粗体磷酸化酶B进行透析、纯化与洗脱后得到最终的磷酸化酶B。本发明提供一种磷酸化酶B的提取方法，使得磷酸化酶B的生产能够更加简单，提高了产品的生产效率与生产量，进而更好的促进了行业的发展。

Description

一种磷酸化酶B的提取方法
技术领域
本发明属于一种酶的提取方法，具体是指一种磷酸化酶B的提取方法。
背景技术
磷酸化酶B，即兔肌是一种浅黄色的冷冻干燥粉末，常用于生化研究，其如今的提取的过程较为复杂，且难度较高，难以进行大批量的提取。所以，如今需要一种简单的，能够对其大量提取的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种磷酸化酶B的提取方法，使得磷酸化酶B的生产能够更加简单，提高了产品的生产效率与生产量，进而更好的促进了行业的发展。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种磷酸化酶B的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取新鲜的家兔肌肉加水进行匀浆处理，得到家兔肌肉浆；
(1.2)将家兔肌肉浆用纱布过滤，得到初滤液和组织；
(1.3)将步骤(1.2)中得到的组织加入水中搅拌，得到初级搅拌液；
(1.4)对步骤(1.3)中得到的初级搅拌液进行再次过滤并将该滤液与初滤液合并得到最终的肌肉混合滤液；
(1.5)对肌肉混合滤液进行离心处理，并在静置后收集上层的初级上清液；
(2)制备次级上清液；
次级上清液的具体制备步骤为：
(2.1)向初级上清液中以3-5：1的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至初级上清液的pH值到6.0，并对其搅拌得到次级搅拌液；
(2.2)对次级搅拌液离心去除杂蛋白，并保留离心液并添加HCl调整该离心液的pH值到5.9，得到初级离心液；
(2.3)对初级离心液进行冰浴静置，并再次离心后收集上清液并通过添加K2CO3将该上清液pH值调整到6.8，进而得到次级上清液；
(3)制备粗体磷酸化酶B；
粗体磷酸化酶B的具体制备步骤为：
(3.1)并向次级上清液中加入相同温度的硫酸铵，接着将其搅拌均匀后在4℃的环境下放置8-10小时，从而得到初级静置液；
(3.2)离心初级静置液，并在离心后将其静置使其沉淀；
(3.3)将沉淀滤出，从而得到粗体磷酸化酶B；
(4)对粗体磷酸化酶B进行透析、纯化与洗脱后得到最终的磷酸化酶B；
最终的磷酸化酶B的制备步骤为：
(4.1)将粗体磷酸化酶B重新溶解，之后将其与平衡液混合均匀，并透析8小时，得到透析液；
(4.2)通过DEAE亲和层析住纯化透析液，得到纯化液；
(4.3)通过洗脱液对纯化液进行洗脱，并最终得到磷酸化酶B。
步骤(1.1)和步骤(1.3)中均选用去离子水，其中，步骤(1.1)中去离子水与肌肉的重量比例为2-2.5：1，步骤(1.3)中去离子水与组织的重量比例为0.5-1.5：1。
步骤(1.3)中的搅拌过程需要在20-25℃的温度范围内进行，在搅拌过程中搅拌棒的搅拌方向需始终保持一致，且搅拌过程中搅拌棒的转速需控制在80-100r/min；在搅拌时，先对混合液搅拌15min，接着将混合液静置5min，最后对其搅拌5min后得到最终的初级搅拌液。
步骤(1.5)中肌肉混合滤液的离心温度为4℃，其离心转速为8000r/min，离心时间为5-10min，离心后静置时间为20min。
步骤(2.1)中对次级搅拌液离心去除杂蛋白时的离心转速需控制在800-1000r/min，后续的搅拌需在4℃的环境下进行4小时的搅拌，且搅拌过程中搅拌棒的转速控制在120-150r/min；步骤(2.3)中冰浴的时间为30min，而在对初级离心液的再次离心过程须在4-5℃下持续进行45min，且其转速需保持在1500r/min。
步骤(3.1)中次级上清液与硫酸铵的比例为3：1；步骤(3.2)中使初级静置液在4℃的环境下离心20min，其离心转速为1500r/min。
步骤(4.1)中平衡液的组份及其重量份数为：
步骤(4.2)中洗脱液的组份及其重量份数为：
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明简化了磷酸化酶B的生产方法，降低了磷酸化酶B的制备难度，提高了产品的生产效率与生产量，进而更好的促进了行业的发展。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种磷酸化酶B的提取方法，包括以下步骤：
(1)制备初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取新鲜的家兔肌肉加水进行匀浆处理，得到家兔肌肉浆；
步骤(1.1)中选用去离子水，去离子水与肌肉的重量比例为2：1；此处的匀浆处理为本领域的常规处理手段，其主要依靠匀浆机来完成组织的打散与碾磨，具体的匀浆处理过程在此不进行赘述。
(1.2)将家兔肌肉浆用纱布过滤，得到初滤液和组织；
(1.3)将步骤(1.2)中得到的组织加入水中搅拌，得到初级搅拌液；
步骤(1.3)中选用去离子水，去离子水与组织的重量比例为0.5：1。
该搅拌过程需要在20的温度下进行，在搅拌过程中搅拌棒的搅拌方向需始终保持一致，且搅拌过程中搅拌棒的转速需控制在80r/min；在搅拌时，先对混合液搅拌15min，接着将混合液静置5min，最后对其搅拌5min后得到最终的初级搅拌液。
(1.4)对步骤(1.3)中得到的初级搅拌液进行再次过滤并将该滤液与初滤液合并得到最终的肌肉混合滤液；
(1.5)对肌肉混合滤液进行离心处理，并在静置后收集上层的初级上清液；
肌肉混合滤液的离心温度为4℃，其离心转速为8000r/min，离心时间为5min，离心后静置时间为20min。
(2)制备次级上清液；
次级上清液的具体制备步骤为：
(2.1)向初级上清液中以3：1的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至初级上清液的pH值到6.0，并对其搅拌得到次级搅拌液；
对次级搅拌液离心去除杂蛋白时的离心转速需控制在800r/min，后续的搅拌需在4℃的环境下进行4小时的搅拌，且搅拌过程中搅拌棒的转速控制在120r/min。
(2.2)对次级搅拌液离心去除杂蛋白，并保留离心液并添加HCl调整该离心液的pH值到5.9，得到初级离心液；
(2.3)对初级离心液进行冰浴静置，并再次离心后收集上清液并通过添加K2CO3将该上清液pH值调整到6.8，进而得到次级上清液；
冰浴的时间为30min，而在对初级离心液的再次离心过程须在4-5℃下持续进行45min，且其转速需保持在1500r/min。
(3)制备粗体磷酸化酶B；
粗体磷酸化酶B的具体制备步骤为：
(3.1)并向次级上清液中加入相同温度的硫酸铵，接着将其搅拌均匀后在4℃的环境下放置8小时，从而得到初级静置液；
次级上清液与硫酸铵的比例为3：1。
(3.2)离心初级静置液，并在离心后将其静置使其沉淀；
使初级静置液在4℃的环境下离心20min，其离心转速为1500r/min。
(3.3)将沉淀滤出，从而得到粗体磷酸化酶B；
(4)对粗体磷酸化酶B进行透析、纯化与洗脱后得到最终的磷酸化酶B；
最终的磷酸化酶B的制备步骤为：
(4.1)将粗体磷酸化酶B重新溶解，之后将其与平衡液混合均匀，并透析8小时，得到透析液；
步骤(4.1)中平衡液的组份及其重量份数为：
(4.2)通过DEAE亲和层析住纯化透析液，得到纯化液；通过DEAE作为透析液为本领域技术人员的常规技术手段，在此便不进行赘述。
(4.3)通过洗脱液对纯化液进行洗脱，并最终得到磷酸化酶B；
步骤(4.2)中洗脱液的组份及其重量份数为：
实施例2
本实施例与实施例1的内容基本相同，其不同的地方为：
步骤(1.1)中选用去离子水，去离子水与肌肉的重量比例为2.5：1。
步骤(1.3)中选用去离子水，去离子水与组织的重量比例为1.5：1；搅拌过程需要在25℃的温度下进行，且搅拌过程中搅拌棒的转速需控制在100r/min。
步骤(1.5)中的离心时间为10min。
步骤(2.1)向初级上清液中以5：1的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠；离心转速需控制在1000r/min，搅拌过程中搅拌棒的转速控制在150r/min。
步骤(3.1)中将其搅拌均匀后在4℃的环境下放置10小时
步骤(4.1)中平衡液的组份及其重量份数为：
步骤(4.2)中洗脱液的组份及其重量份数为：
实施例3
本实施例与实施例1的内容基本相同，其不同的地方为：
步骤(1.1)中选用去离子水，去离子水与肌肉的重量比例为2.3：1。
步骤(1.3)中选用去离子水，去离子水与组织的重量比例为1.2：1；搅拌过程需要在23℃的温度下进行，且搅拌过程中搅拌棒的转速需控制在90r/min。
步骤(1.5)中的离心时间为8min。
步骤(2.1)向初级上清液中以4：1的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠；离心转速需控制在900r/min，搅拌过程中搅拌棒的转速控制在140r/min。步骤(3.1)中将其搅拌均匀后在4℃的环境下放置9小时步骤(4.1)中平衡液的组份及其重量份数为：
步骤(4.2)中洗脱液的组份及其重量份数为：
如上所述，便可很好的实现本发明。

Claims (8)

1.一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备初级上清液；
该初级上清液的具体制备步骤为：
(1.1)取新鲜的家兔肌肉加水进行匀浆处理，得到家兔肌肉浆；
(1.2)将家兔肌肉浆用纱布过滤，得到初滤液和组织；
(1.3)将步骤(1.2)中得到的组织加入水中搅拌，得到初级搅拌液；
(1.4)对步骤(1.3)中得到的初级搅拌液进行再次过滤并将该滤液与初滤液合并得到最终的肌肉混合滤液；
(1.5)对肌肉混合滤液进行离心处理，并在静置后收集上层的初级上清液；
(2)制备次级上清液；
次级上清液的具体制备步骤为：
(2.1)向初级上清液中以3-5：1的比例添加柠檬酸钠和磷酸三钠，直至初级上清液的pH值到6.0，并对其搅拌得到次级搅拌液；
(2.2)对次级搅拌液离心去除杂蛋白，并保留离心液并添加HCl调整该离心液的pH值到5.9，得到初级离心液；
(2.3)对初级离心液进行冰浴静置，并再次离心后收集上清液并通过添加K2CO3将该上清液pH值调整到6.8，进而得到次级上清液；
(3)制备粗体磷酸化酶B；
粗体磷酸化酶B的具体制备步骤为：
(3.1)并向次级上清液中加入相同温度的硫酸铵，接着将其搅拌均匀后在4℃的环境下放置8-10小时，从而得到初级静置液；
(3.2)离心初级静置液，并在离心后将其静置使其沉淀；
(3.3)将沉淀滤出，从而得到粗体磷酸化酶B；
(4)对粗体磷酸化酶B进行透析、纯化与洗脱后得到最终的磷酸化酶B；
最终的磷酸化酶B的制备步骤为：
(4.1)将粗体磷酸化酶B重新溶解，之后将其与平衡液混合均匀，并透析8小时，得到透析液；
(4.2)通过DEAE亲和层析住纯化透析液，得到纯化液；
(4.3)通过洗脱液对纯化液进行洗脱，并最终得到磷酸化酶B。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(1.1)和步骤(1.3)中均选用去离子水，其中，步骤(1.1)中去离子水与肌肉的重量比例为2-2.5：1，步骤(1.3)中去离子水与组织的重量比例为0.5-1.5：1。
3.根据权利要求2所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(1.3)中的搅拌过程需要在20-25℃的温度范围内进行，在搅拌过程中搅拌棒的搅拌方向需始终保持一致，且搅拌过程中搅拌棒的转速需控制在80-100r/min；在搅拌时，先对混合液搅拌15min，接着将混合液静置5min，最后对其搅拌5min后得到最终的初级搅拌液。
4.根据权利要求3所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(1.5)中肌肉混合滤液的离心温度为4℃，其离心转速为8000r/min，离心时间为5-10min，离心后静置时间为20min。
5.根据权利要求4所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(2.1)中对次级搅拌液离心去除杂蛋白时的离心转速需控制在800-1000r/min，后续的搅拌需在4℃的环境下进行4小时的搅拌，且搅拌过程中搅拌棒的转速控制在120-150r/min；步骤(2.3)中冰浴的时间为30min，而在对初级离心液的再次离心过程须在4-5℃下持续进行45min，且其转速需保持在1500r/min。
6.根据权利要求5所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(3.1)中次级上清液与硫酸铵的比例为3：1；步骤(3.2)中使初级静置液在4℃的环境下离心20min，其离心转速为1500r/min。
7.根据权利要求6所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(4.1)中平衡液的组份及其重量份数为：
8.根据权利要求7所述的一种磷酸化酶B的提取方法，其特征在于：步骤(4.2)中洗脱液的组份及其重量份数为：
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