CN108148150A - 一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺 - Google Patents

一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺 Download PDF

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Abstract

一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，包括以下步骤：（1）软骨预处理；（2）双酶解：调pH值至8.8‑9.3，加入碱性蛋白酶2709，搅拌速度为20‑60rpm，酶解；调pH值至8.4‑8.8，加入活化猪胰脏，搅拌速度为20‑60rpm，酶解；（3）脱蛋白：升温至70‑80℃，搅拌速度为90‑110rpm，调节pH至等电点，处理10‑30min，停止搅拌，静置；（4）压滤；（5）碟式离心；（6）离子交换；（7）洗脱；（8）硫酸软骨素的精制。本发明在现有技术双酶法提取硫酸软骨素的技术基础上，通过对工艺路线以及工艺参数的改进，采用适当的搅拌速度，提高酶解效率，降低酶解时间，从而降低提取时间，提高收率。

Description

一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺
技术领域
本发明涉及生化制药领域，具体是一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺。
背景技术
硫酸软骨素（简称CS）是一种酸性粘多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、鲨鱼骨、鱿鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子。硫酸软骨素由50-70个双糖单元组成，其双糖单元是由葡糖醛酸和氨基半乳糖通过β-1,3糖苷键形成，双糖再以β-1,4糖苷键连接聚合成大分子。
硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理功能。临床上主要作为骨关节炎、高血脂、心绞痛、动脉粥样硬化等疾病的治疗，其滴眼液具有治疗角膜损伤、角膜溃疡或角膜炎；在食品上硫酸软骨素被美国FDA归类维膳食补充，澳大利亚将其作为改善或预防关节病的营养保健品。
目前，硫酸软骨素通常采用双酶解法从动物软骨中提取，主要包括煮料、酶解、调pH脱蛋白、过滤、离心、离子交换、醇沉、干燥等步骤。但现有的双酶法在提取过程中不搅拌或者在不同环节中使用同一搅拌速度，从而导致提取时间长，酶解效果差，蛋白质去除率低，收率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过控制搅拌速度缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，以减少提取硫酸软骨素的提取时间，改善酶解效果，提高硫酸软骨素的得率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，包括以下步骤：
（1）软骨预处理：将动物软骨在NaHCO3清洗液中用超声波辅助清洗，再将清洗后的软骨放入提取罐，加入水，采用盘管加热和直接蒸汽加热，至95-105℃，保温2-4h（优选2.5-3.0h），然后取出上层骨油，控制搅拌速度为40-80rpm，采用盘管将蒸煮液冷却到45-55℃；
（2）双酶解：将蒸煮液调pH值至8.8-9.3，加入软骨质量0.5-0.9%的碱性蛋白酶2709，搅拌速度为20-60rpm，酶解1-3h（优选1.5-2.0h）；重新调整pH值至8.4-8.8，加入软骨质量3%-8%的活化猪胰脏（将猪胰脏粉碎，25-35℃ 活化36-60 h），搅拌速度为20-60rpm，酶解1-3h（优选1.5-2.0h）；
（3）脱蛋白：将温度升温至70-80℃，搅拌速度设置为90-110rpm，调节pH至等电点，处理10-30min，停止搅拌，静置至分层明显；
（4）压滤；
（5）碟式离心；
（6）离子交换；
（7）洗脱；
（8）硫酸软骨素的精制：将（7）的洗脱液经过氧化、压滤、超滤、醇沉、脱水离心、干燥即得硫酸软骨素。
现有技术中软骨的预处理采取夹套传热，加热和冷却速度慢，本发明加热采取盘管联合直接蒸汽加热，大大降低了升温时间；冷却时，搅拌速率过低，冷却速率慢；但搅拌速率过高，一方面搅拌产热不利于冷却，另一方面过高的搅拌速度需要消耗更多的电能。作为优选，冷却时搅拌速率为40-80rpm。
酶解时，提高搅拌速度一方面能增加传质速率，提高提取液的均匀度，避免出现物料混合不均匀的现象，从而提高酶解效率，降低提取时间；另一方面，酶分子的邻近效应和定向效应能增加酶分子周围的局部底物浓度，从而提高催化效率，过高的搅拌速度破坏酶分子的邻近效应和定向效应，反而降低酶解效率。现有技术，不搅拌或者搅拌速率过高，使酶解效率差，酶解时间长，本发明作为优选，酶解时搅拌速度为20-60rpm。
硫酸软骨素提取过程中可以通过调节等电点沉淀蛋白质，通过小试获得提取液的等电点，然后调节pH使提取液中蛋白质沉淀，但等电点沉淀蛋白质得到的蛋白质沉淀为絮状沉淀，静置分层不明显，大量的蛋白质保留在提取液中，不利于后续分离。软骨经酶解后的骨渣主要成分是蛋白纤维，具有非常大的表面积，在等电点沉淀蛋白质时，通过高速搅拌产生轴向流，将骨渣悬浮，骨渣在沉降的过程中由于巨大的表面积将絮状蛋白质吸附，从而使提取液更加澄清。作为优选，本发明沉淀蛋白质时搅拌速度为90-110rpm。
进一步，步骤（1）中，所述NaHCO3清洗液的浓度为0.01-0.06mol/L。
进一步，步骤（1）中，加入相当于动物软骨质量2-8倍水。
进一步，步骤（1）中，所述动物软骨为牛鼻骨、牛喉骨、牛肩胛骨、牛喉管、牛胸甲骨中的一种或几种。
进一步，步骤（5）中，采用碟式分离机进行分离，转鼓转速 6000～8000rpm/min，温度 45～50℃。
进一步，步骤（6）中，分离液与大孔阴离子交换树脂的质量比为 1～1.5:1，吸附时间1～2 小时。
进一步，步骤（8）中，所述洗脱液经氧化脱色后进行离心处理。
进一步，步骤（8）中，所述醇沉工艺为二次醇沉。
进一步，步骤（8）中，所述干燥工艺为真空干燥。
本发明在现有技术酶法提取硫酸软骨素的技术基础上，通过对工艺路线以及工艺参数的改进，尤其是采用适当的搅拌速度，提高酶解效率，降低酶解时间，从而降低提取时间，提高收率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以助于更好地理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
实施例1
一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，包括以下步骤：
（1）软骨预处理：称取牛鼻骨1000kg，用超声波在0.02mol/L NaHCO3清洗液中清洗，再将清洗后的软骨放入提取罐，加入8倍蒸馏水，采用盘管加热和直接蒸汽加热，至105℃，保温3h，然后取出上层骨油，控制搅拌速度为60rpm，采用盘管将蒸煮液冷却到50℃；
（2）双酶解：将蒸煮液调pH值至9.0，加入软骨质量0.8%的碱性蛋白酶2709，搅拌速度为40 rpm，酶解2h；重新调整pH值至8.7，加入软骨质量6%的活化猪胰脏（将猪胰脏粉碎，25-35℃ 活化50 h），搅拌速度为40rpm，酶解2h；
（3）脱蛋白：将温度升温至80℃，搅拌速度设置为100 rpm，调节pH 值至4.3，处理20min，停止搅拌，静置至分层明显；
（4）压滤：将上清液用747滤布过滤；
（5）碟式离心；采用碟式分离机进行分离，转鼓转速8000rpm/min，温度 45～50℃；
（6）离子交换；分离液经阴离子交换树脂吸附，分离液与阴离子交换树脂的质量比为1.4:1，吸附时间2 小时；
（7）洗脱：离子交换树脂经浓度 2mol/L 的 NaCl 溶液洗脱；
（8）硫酸软骨素的精制：将步骤（7）中的洗脱液经氧化脱色后，用747滤布过滤，滤液泵入超滤装置，经超滤设备进行脱盐浓缩得浓缩液，超滤膜截留分子量 5000道尔顿，操作压力为 0.4MPa，温度在 50℃，膜面速度 4m/s，截留液经两次醇沉、脱水离心、真空干燥得到硫酸软骨素。
最终产品收率为28.15％，HPLC纯度为98.21%，提取时间（仅包括蒸煮、双酶解）为7h。中国专利文献（申请号CN105085714A-对比文件1）公布了一种双酶法提取硫酸软骨素的工艺，其实施例1中硫酸软骨素的收率为17.5%，HPLC纯度为97.32%，提取时间为11h，与之相比，本实施例收率明显提高，提取时间大大缩短。中国专利文献（申请号CN 104531817 A-对比文件2）公布了一种双酶法提取硫酸软骨素的方法，其实施例2中硫酸软骨素的收率为26.2%，HPLC纯度为98.18%，提取时间为9h，此外其软骨预处理还包括软骨的浸泡和粉碎过程，与之相比，本实施例收率稍有提高，提取时间缩短，简化了提取工艺。此外，本实施例采取盘管联合直接蒸汽加热降低了加热时间，冷却时控制搅拌速度降低了冷却时间。经检测，硫酸软骨素的各项质量指标如表1所示，各指标皆达到要求。
实施例 2
一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，包括以下步骤：
（1）软骨预处理：称取牛鼻骨1000kg，用超声波在0.05mol/L NaHCO3清洗液中清洗，再将清洗后的软骨放入提取罐，加入7倍蒸馏水，采用盘管加热和直接蒸汽加热，至105℃，保温3 h，然后取出上层骨油，控制搅拌速度为60 rpm，采用盘管将蒸煮液冷却到50℃；
（2）双酶解：将蒸煮液调pH值至9.0，加入软骨质量0.9%的碱性蛋白酶2709，搅拌速度为40 rpm，酶解2 h；重新调整pH值至8.7，加入软骨质量5%的活化猪胰脏（将猪胰脏粉碎，25-35℃ 活化40 h），搅拌速度为40rpm，酶解2h；
（3）脱蛋白：将温度升温至80℃，搅拌速度设置为100 rpm，调节pH值至4.4，处理20min，停止搅拌，静置至分层明显；
（4）压滤：将上清液用747滤布过滤；
（5）碟式离心；采用碟式分离机进行分离，转鼓转速 8000rpm/min，温度 45～50℃；
（6）离子交换；分离液经阴离子交换树脂吸附，分离液与阴离子交换树脂的质量比为1.4:1，吸附时间1 小时；
（7）洗脱：离子交换树脂经浓度 2mol/L 的 NaCl 溶液洗脱；
（8）硫酸软骨素的精制：将步骤（7）中的洗脱液经氧化脱色后，用747滤布过滤，滤液泵入超滤装置，经超滤设备进行脱盐浓缩得浓缩液，超滤膜截留分子量 5000道尔顿，操作压力为 0.4MPa，温度在 50℃，膜面速度 4m/s，截留液经两次醇沉、脱水离 心、真空干燥得到硫酸软骨素。
最终产品收率为27.41％，HPLC纯度为97.21%，提取时间（包括蒸煮、双酶解）为7h。经检测，硫酸软骨素的各项质量指标如表1所示，各指标皆达到要求。
表 1 硫酸软骨素检测报告表
实施例3
除将牛鼻骨替换为牛喉管外，其他同实施例1，硫酸软骨素的收率为18.8％，纯度为96.8％，提取时间为7h。
实施例4
除将牛鼻骨替换为牛月牙外，其他同实施例1，硫酸软骨素的收率为17.6％，纯度为97.3％，提取时间为7h。
实施例5
除将牛鼻骨替换为牛肩胛骨外，其他同实施例1，硫酸软骨素的收率为19.8％，纯度为96.5％，提取时间为7h。

Claims (9)

1.一种缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）软骨预处理：将动物软骨在NaHCO3清洗液中用超声波辅助清洗，再将清洗后的软骨放入提取罐，加入水，采用盘管加热和直接蒸汽加热，至95-105℃，保温2-4 h，然后取出上层骨油，控制搅拌速度为40-80rpm，采用盘管将蒸煮液冷却到45-55℃；
（2）双酶解：将蒸煮液调pH值至8.8-9.3，加入软骨质量0.5-0.9%的碱性蛋白酶2709，搅拌速度为20-60rpm，酶解1-3h；重新调整pH值至8.4-8.8，加入软骨质量3%-8%的活化猪胰脏，搅拌速度为20-60rpm，酶解1-3h；
（3）脱蛋白：将温度升温至70-80℃，搅拌速度设置为90-110rpm，调节pH至等电点，处理10-30min，停止搅拌，静置至分层明显；
（4）压滤；
（5）碟式离心；
（6）离子交换；
（7）洗脱；
（8）硫酸软骨素的精制：将（7）的洗脱液经过氧化、压滤、超滤、醇沉、脱水离心、干燥即得硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（1）中，步骤（1）中，所述NaHCO3清洗液的浓度为0.01-0.06mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（1）中，加入相当于动物软骨质量2-8倍水。
4.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（1）中，所述动物软骨为牛鼻骨、牛喉骨、牛肩胛骨、牛喉管、牛胸甲骨中的一种或几种。
5.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（5）中，采用碟式分离机进行分离，转鼓转速 6000～8000rpm/min，温度 45～50℃。
6.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（6）中，分离液与大孔阴离子交换树脂的质量比为 1～1.5:1，吸附时间1～2 小时。
7.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（8）中，所述洗脱液经氧化脱色后进行离心处理。
8.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（8）中，所述醇沉工艺为二次醇沉。
9.根据权利要求1或2所述的缩短硫酸软骨素提取时间的工艺，其特征在于，步骤（8）中，所述干燥工艺为真空干燥。
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