CN109022472A - 含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含驯鹿25羟基维生素D‑1α羟化酶基因的重组载体及其编码蛋白的表达、分离纯化和活性测定的方法：1)根据从驯鹿的基因组上注释出的25羟基维生素D‑1α羟化酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿25羟基维生素D‑1α羟化酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的25羟基维生素D‑1α羟化酶基因序列，用以作为对照；2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子、羊25羟基维生素D‑1α羟化酶基因、皮质铁氧还原蛋白基因和NADPH‑皮质铁氧还原蛋白还原酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET‑28a，获得重组载体。最终检测，含驯鹿25羟基维生素D‑1α羟化酶基因的菌株表达获得酶的催化活性是羊的2倍，是狍子的1.5倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体及其编码蛋白的表达、分离纯化和活性测定的方法。
背景技术
维生素D是一种类固醇激素，在促进肠道中钙的吸收及维持钙动态平衡具有重要的意义，对人体骨骼的生长，健康起到关键的作用。近年来研究表明，维生素D除了具有骨骼效应外，还与自身免疫性疾病，糖尿病，心血管病，细胞生长分化等有关的非骨骼效应。维生素D有维生素D2和D3两种形式。人体中维生素D来源于饮食，而维生素D3则可由暴露在紫外线下的皮肤组织合成。
在肝脏中，维生素D3经过25-羟化酶作用，可形成25-羟基维生素D3(25-hydroxy-vitamin D3，calcidiol，又称骨化二醇)。被运送到肾脏后，经过25羟基维生素D-1α羟化酶作用，形成1α，25-双羟基维生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D，calcitriol，又称骨化三醇)，催化反应见附图1。1α，25-双羟基维生素D3是活性最高的维生素D代谢物，但在人体血液中含量很低。在血液中的维生素D主要以25-羟基维生素D3形式存在，因此被认为是个体中维生素D状态的准确指标。然而，在动物体内，尤其是对角质形成需求量比较大的动物体内，1α，25-双羟基维生素D3的需求量也会比较大，25羟基维生素D-1α羟化酶的作用也显得尤为重要，只有25羟基维生素D-1α羟化酶的催化效率高，才会在动物体内更快的合成1α，25-双羟基维生素D3，以提供动物的钙日常利用。
不仅如此，1α，25-双羟基维生素D3可制约肿瘤的生长，其发挥作用的主要机制有抑制增殖和血管生成以及诱导肿瘤细胞分化和凋亡。25羟基维生素D-1α羟化酶的研究，可以为利用1α，25-双羟基维生素D3来治疗肿瘤起到一定的推动作用。本发明旨在提供一种涉及含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体及其编码蛋白的表达、分离纯化和活性测定的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种涉及含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体及表达、分离纯化和活性测定的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：
1)根据从驯鹿的基因组上注释出的25羟基维生素D-1α羟化酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶核酸序列，同时，得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的25羟基维生素D-1α羟化酶，用以作为驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶的对照，在检测25羟基维生素D-1α羟化酶的活性过程中，还需要额外的两个蛋白承担传递电子的功能，一个是皮质铁氧还原蛋白(adrenodoxin，ADX)，另一个是NADPH-皮质铁氧还原蛋白还原酶(NADPH-adrenodoxin reductase，ADR)，这两个蛋白都来自牛科(bovine)；
2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊25羟基维生素D-1α羟化酶基因、ADX和ADR分别构建于大肠杆菌表达载体pET-28a，构建好的一系列质粒见附图1、2、3、4和5，质粒的核酸验证结果见附图6，获得表达质粒；
3)将表达质粒分别转入大肠杆菌高效表达菌株BL21(DE3)中，将载有表达质粒的菌株在2YT培养基中培养，经过IPTG诱导表达，菌体收集，高压破碎，之后过镍离子柱纯化，得到目的蛋白，跑SDS-PAGE蛋白胶电泳，验证其大小，见附图7，然后在人工合成体系中作反应，检测25羟基维生素D-1α羟化酶的活性；
4)检测结果显示，含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的菌株表达获得酶的催化活性是含羊25羟基维生素D-1α羟化酶基因的菌株表达获得酶的2倍，是含狍子25羟基维生素D-1α羟化酶基因的菌株表达获得酶的1.5倍(见附图8)。
附图说明
图1为驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因质粒(pET-28a-XVD)图谱；
图2为狍子25羟基维生素D-1α羟化酶基因质粒图谱；
图3为羊25羟基维生素D-1α羟化酶基因质粒图谱；
图4为牛的ADR质粒图谱；
图5为牛的ADX质粒图谱
图6为质粒的核酸验证结果
图7为本发明中的蛋白胶SDS-PAGE电泳图
其中：A驯鹿的25羟基维生素D-1α羟化酶；B狍子的25羟基维生素D-1α羟化酶；C羊的25羟基维生素D-1α羟化酶；D牛的ADR；E牛的ADX；
图8为本发明实施过程中的25羟基维生素D-1α羟化酶活性对比结果。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1质粒构建过程：
根据gibson技术的要求设计好本发明中需要的引物(引物的5F端带有20-40bp左右同源臂)，将根据大肠杆菌密码子偏好优化后的基因和pET-28a载体分别利用PCR技术线性化，然后将线性化后的基因和载体加入到gibson体系中，孵育，连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，提取质粒验证，留阳性克隆的质粒，备用。
实施例2表达载体转化过程：
取上述阳性克隆质粒200ng，与50μL商业大肠杆菌感受态BL21(DE3)混合均匀，冰上孵育30min，然后42℃热击45S，再在冰上放置2min，然后加入300uL的LB培养基，37℃复苏1h，后涂布于有卡那霉素抗性(pET28a质粒为卡那抗性)的LB固体平板培养基中。过夜培养，挑取单克隆验证，阳性克隆留取备用。
实施例3蛋白的表达纯化：
1)种子液培养：挑取上述包含目的质粒的BL21(DE3)菌株，接种于含5mL LB液体培养基(Kan+，100μg/mL)的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液。
2)转接：将种子液按1％接种量转入800mL 2YT液体培养基(Kan+，100μg/mL)中，37℃、220rpm，摇床培养(约4-6h)至OD 600约为0.6-0.8。
3)诱导：降低摇床温度至16℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)至终浓度0.5mM，诱导表达14-16h。
4)收菌：表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，6000rpm，离心30min。
5)清洗：去除上清，加入30mL蛋白缓冲液(磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液)，用旋涡振荡器重悬菌体。将重悬的菌体再次离心6000rpm，10min。倒掉上清，加入30mL蛋白缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬(不能有固体颗粒状)，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。
6)破菌：将上述收集好的菌液采用高压低温破碎仪在压力1200bar，4℃条件下进行破菌3-4次，使细胞充分裂解，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中。
7)离心：将破碎好的菌液于预冷好4℃的离心机中8000rpm，离心50min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液；
8)纯化及浓缩：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
(1)柱平衡：先用蒸馏水洗2个柱体积，再用20mM咪唑蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积。
(2)上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次。
(3)洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样。
(4)洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，分别取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测。
(5)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。再加10mL蛋白缓冲液，再浓缩至1mL，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到纯化的目的蛋白，备用。
9)蛋白浓度测定。蛋白浓度测定采用Pierce BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher Scientific)。首先利用蛋白在280nm有吸光值进行蛋白浓度的初步测定，然后根据初测的值将蛋白浓度稀释到0.5-1mg/mL。将BCA Protein Assay Kit中试剂A与试剂B按50∶1的比例配置好做反应液。取200μL反应液放置在酶标板中，在反应液中加入25μL稀释后的蛋白，用枪吹吸混匀后放置在37℃下，反应30min。将酶标板放入酶标仪中测定562nm吸光值，并按照蛋白标准曲线进行数据处理，即可得到蛋白浓度Cpr。蛋白溶液存于-80℃冰箱，备用。
实施例4蛋白的活性检测：
驯鹿的25羟基维生素D-1α羟化酶有着较高的催化活性，可以催化骨化二醇生成骨化三醇，同时催化还原型铁氧还原蛋白生成氧化型铁氧还原蛋白，消耗NADPH，由于NADPH在340nm出有特征吸收峰，通过分光光度计测定340nm吸光度的变化速率，来计算25羟基维生素D-1α羟化酶的催化活性，利用NADPH的变化速率k来表征25羟基维生素D-1α羟化酶的活性。
1)先将磷酸盐缓冲液在37℃水浴锅中保温，预热30min。
2)取1个比色板，依次加入不加蛋白溶液作为对照，2uL的骨化二醇母液，20uL的tris-HCl溶液，10uL的EDTA溶液，加入预热至37℃的蒸馏水补齐至190uL，再加10uL的NADPH溶液，速混匀后，于340nm处，每10S测定的吸光值，测定30min，取斜率最大的5min内的吸光值，斜率记为k0，由于没有加蛋白催化反应，因此k0约为0。
3)取1个比色板，依次加入2mg的目的蛋白液，30mg左右的ADR，30mg左右的ADX，2μL的骨化二醇母液，20uL的tris-HCl溶液，10μL的EDTA溶液，加入预热至37℃的蒸馏水补齐至190μL，再加10μL的NADPH溶液，速混匀后，于340nm处，每10S测定的吸光值，测定30min，取斜率最大的5min内的吸光值，斜率记为k1。
4)分别计算驯鹿、狍子和羊的25羟基维生素D-1α羟化酶的催化活性，进行对比。
5)实施例中用到的溶液浓度：
1.骨化二醇溶液：4.18mg溶于100mL的乙醇中，制备成100μM的母液，工作浓度为1μM；
2.ADX蛋白液母液：20-40mg/μL，反应体系中加30mg左右；
3.ADR蛋白液母液：20-40mg/μL，反应体系中加30mg左右；
4.25羟基维生素D-1α羟化酶蛋白液母液：20-40mg/μL，反应体系中加2mg；
5.tris/HCl溶液：12.1g溶于100mL的水中，用HCl调节pH为7.4，制备成1M的母液，工作浓度为100mM；
6.EDTA溶液：0.598g EDTA溶于100mL水中，制备成20mM的母液，工作浓度为1mM。
7.NADPH溶液：0.74g NADPH溶于100mL水中，制备成10mM的母液，工作浓度为0.5mM。
所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
<120> 含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法
<130> 2018
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1569
<212> DNA
<213> 驯鹿(Rangifertarandus)
<400> 1
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<213> 狍子(Capreolus pygargus)
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<211> 1476
<212> DNA
<213> 牛(bovin)
<400> 1
atggcccctc gctgctggcg ttggtggccg tggagcagct ggacccgcac ccgtctgccg 60
cctagccgta gcattcagaa ttttggccag cattttagta cccaggaaca gaccccgcag 120
atttgcgttg tgggcagtgg tccggccggc ttttataccg cccagcatct gctgaaacat 180
catagccgtg cacatgtgga tatctatgaa aaacagctgg ttccgtttgg tctggttcgc 240
tttggcgttg ccccggatca tccggaagtt aaaaatgtta ttaacacctt tacccagacc 300
gcacgcagtg atcgttgcgc attttatggt aatgttgaag ttggccgtga tgttaccgtt 360
caggaactgc aggatgcata tcatgccgtt gttctgagtt atggcgcaga agatcatcag 420
gccctggata ttccgggcga agaactgccg ggcgttttta gcgcccgtgc ctttgttggt 480
tggtataatg gcctgccgga aaatcgtgaa ctggccccgg atctgagttg cgataccgca 540
gttattctgg gccagggcaa tgtggccctg gatgttgcac gtattctgct gaccccgccg 600
gatcatctgg aaaaaaccga tattaccgaa gcagcactgg gtgccctgcg tcagagtcgt 660
gtgaaaaccg tgtggattgt tggtcgccgc ggcccgctgc aggtggcatt cactattaag 720
gaactgcgtg aaatgattca gctgccgggt acacgcccga tgctggaccc tgcagatttt 780
ctgggcctgc aggatcgtat taaggaagca gcacgcccgc gtaaacgtct gatggaactg 840
ctgctgcgca ccgccaccga aaaaccgggc gttgaagaag cagcccgtcg cgcaagcgca 900
agccgcgcat ggggtctgcg tttctttcgt agcccgcagc aggttctgcc gagcccggat 960
ggtcgtcgcg cagctggtat tcgcctggcc gttacccgtc tggaaggtat tggtgaagcc 1020
acccgtgccg tgccgaccgg tgacgttgaa gatctgccgt gtggtctggt gctgagtagt 1080
attggttata aaagccgtcc gattgatccg agcgtgccgt ttgatccgaa actgggcgtg 1140
gttccgaata tggaaggtcg tgttgtggat gttccgggcc tgtattgcag cggttgggtg 1200
aaacgtggtc cgaccggtgt tattaccacc accatgaccg atagttttct gaccggccag 1260
attctgctgc aggatctgaa agcaggccat ctgccgagcg gtccgcgtcc tggtagtgcc 1320
tttattaagg ccctgctgga tagccgtggt gtttggccgg tgagctttag cgattgggaa 1380
aaactggatg cagaagaagt gagccgtggt caggcaagcg gcaaaccgcg cgaaaaactg 1440
ctggaccctc aggaaatgct gcgtctgctg ggtcat 1476
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> 牛(bovin)
<400> 1
atggcagccc gtctgctgcg tgttgcaagt gccgcactgg gcgataccgc aggccgttgg 60
cgcctgctgg ccagacctcg tgccggtgca ggcggtctgc gtggtagtcg tggtccgggc 120
ctgggtggcg gtgctgttgc tacccgtacc ctgagcgtga gcggtcgtgc acagagcagt 180
agcgaagata aaattaccgt gcattttatt aaccgtgatg gtgaaaccct gaccaccaaa 240
ggtaaaattg gtgacagcct gctggatgtg gttgtgcaga ataatctgga tattgatggt 300
tttggcgcat gcgaaggcac cctggcatgt agcacctgtc atctgatttt tgaacagcat 360
attttcgaaa agctggaagc aattaccgat gaagaaaatg atatgctgga tctggcatac 420
ggtctgaccg atcgcagtcg cctgggttgt cagatttgtc tgaccaaagc aatggataat 480
atgaccgtgc gcgttccgga tgcagttagt gatgcacgcg aaagtattga tatgggcatg 540
aatagcagca aaattgaa 558
Claims (4)
1.含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法如下：
1)根据从驯鹿的基因组上注释出的25羟基维生素D-1α羟化酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的25羟基维生素D-1α羟化酶基因序列，用以作为对照；
2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊25羟基维生素D-1α羟化酶基因分别与皮质铁氧还原蛋白基因和NADPH-皮质铁氧还原蛋白还原酶基因构建于大肠杆菌表达载体pET-28a，获得重组载体。
2.含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体所编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，将重组载体分别转化入大肠杆菌高效表达菌株BL21中，在2YT培养基中培养，经过IPTG诱导表达，获得菌体，收集菌体，高压破碎，之后过镍离子柱纯化，得到目的蛋白。
3.根据权利要2所述含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体所编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，转化操作具体为：提取阳性克隆质粒200ng，与50μL商业大肠杆菌感受态BL21混合均匀，冰上孵育30min，然后42℃热击45S，再在冰上放置2min，然后加入300uL的LB培养基，37℃复苏1h，后涂布于有卡那霉素抗性的LB固体平板培养基中，过夜培养，挑取单克隆验证，阳性克隆留取备用。
4.根据权利要2所述含驯鹿25羟基维生素D-1α羟化酶基因的重组载体所编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)种子液培养：挑取包含目的质粒的BL21菌株，接种于含5mL LB液体培养基的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液；
2)转接：将种子液按1％接种量转入800mL 2YT液体培养基中，37℃、220rpm，摇床培养4-6h至OD 600约为0.6-0.8；
3)诱导：降低摇床温度至16℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度0.5mM，诱导表达14-16h；
4)收菌：表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，6000rpm，离心30min；
5)清洗：去除上清液，加入30mL蛋白缓冲液，用旋涡振荡器重悬菌体，将重悬的菌体再次离心6000rpm，10min，倒掉上清，加入30mL蛋白缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存；
6)破菌：将上述收集好的菌液采用高压低温破碎仪在压力1200bar，4℃条件下进行破菌3-4次，使细胞充分裂解，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中；
7)离心：将破碎好的菌液于预冷好4℃的离心机中8000rpm，离心50min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液；
8)纯化及浓缩：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
(1)柱平衡：先用蒸馏水洗2个柱体积，再用20mM咪唑蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；
(2)上样：将上清液按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；
(3)洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
(4)洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM、200mM和300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，分别取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测；
(5)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管离心浓缩，浓缩至1mL，再加10mL蛋白缓冲液，再浓缩至1mL，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到纯化的目的蛋白。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021147857A1 (en) * | 2020-01-20 | 2021-07-29 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd | A novel wash buffer solution for affinity chromatography |
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2018
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|---|---|---|---|---|
| WO2021147857A1 (en) * | 2020-01-20 | 2021-07-29 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd | A novel wash buffer solution for affinity chromatography |
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