CN106084017B - 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106084017B
CN106084017B CN201610419991.6A CN201610419991A CN106084017B CN 106084017 B CN106084017 B CN 106084017B CN 201610419991 A CN201610419991 A CN 201610419991A CN 106084017 B CN106084017 B CN 106084017B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aqpz
mjpppars
pppa
plasmid
obtains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610419991.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106084017A (zh
Inventor
徐志南
庄冰佳
唐云平
蔡谨
黄磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201610419991.6A priority Critical patent/CN106084017B/zh
Publication of CN106084017A publication Critical patent/CN106084017A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106084017B publication Critical patent/CN106084017B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括：定点突变詹氏甲烷球菌的酪氨酸‑tRNA合成酶获得MjpPpaRS基因，将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；将重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA转化至大肠杆菌BL21，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变；向无细胞表达体系中添加去污剂可溶表达编入pPpa的AQPZ蛋白，利用亲和层析纯化获得定点编入pPpa的AQPZ蛋白。本发明利用大肠杆菌无细胞体系生产编入pPpa的AQPZ蛋白并利用亲和层析纯化获得该目标蛋白，非天然氨基酸的嵌入使得该水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。

Description

一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的 方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。
背景技术
生物体由64个密码子来编码20种天然氨基酸和3个终止信号。由于20种天然氨基酸所含的功能基团有限，无法满足生物科学、化学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。基因编码非天然氨基酸技术已可将70多种非天然氨基酸成功编码蛋白质，某些非天然氨基酸的加入可增强蛋白性能、稳定蛋白结构、甚至产生新的功能。这些UAAs含有酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸酮基、醛基、叠氮、炔基和烯基等多样性功能基团，可进行多种修饰反应，如光化学、糖基化和荧光显色等反应，从而使得基因编入非天然氨基酸技术被广泛应用。
无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。相对于体内表达体系，大肠杆菌无细胞体系可以很好的解决膜蛋白表达引起的细胞毒性问题。
大肠杆菌水通道蛋白Z(AQPZ)属于水通道蛋白中的orthodox aquaporin亚族，透水性和选择性都非常高。由于AQPZ来自于大肠杆菌，相对于来源于哺乳动物细胞的水通道蛋白更易于在大肠杆菌中进行表达，因此对AQPZ的制备和膜过滤应用研究受到更为广泛关注。传统生物仿生膜以流动镶嵌模式将AQPZ嵌入两亲性双嵌段聚合物或天然磷脂双分子层中，但这种以疏水作用嵌入的水通道蛋白较易流失，从而影响整个膜的使用性能与寿命。本专利将非天然氨基酸基因编入AQPZ水通道蛋白，为含水通道蛋白的生物仿生膜制备提供蛋白基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
本发明在水通道蛋白AQPZ中定点基因编入非天然氨基酸pPpa，打破水通道蛋白在天然氨基酸的局限，为多样的生物仿生膜制备方法提供更为丰富蛋白基础，扩宽思路。因编入pPpa的AQPZ蛋白的高疏水性会对大肠杆菌细胞产生的毒害作用，导致编入pPpa的AQPZ蛋白在大肠杆菌体内难以表达，利用大肠杆菌无细胞体系开放性的特点可有效避免目标蛋白对宿主细胞的损害；通过向大肠杆菌无细胞体系中添加去污剂，提高目标蛋白的可溶性表达效率，利用pIVEX2.4c-AqpZTAG所带的6his亲和标签，可以高效的利用亲和层析纯化编入pPpa的AQPZ蛋白重组蛋白，为制备高稳定性的生物仿生膜提供了蛋白基础。
附图说明
图1：载体pIVEX2.4c-AqpZTAG结构示意图。
图2：无细胞体系表达pPpa编入的AQPZ的电泳图；
Lane 1：蛋白markers；Lane 2：不添加pPpa的表达沉淀；Lane 3：不添加pPpa的表达上清；Lane 4：添加pPpa沉淀；Lane 5：添加pPpa上清；Lane 6：阴性对照沉淀；Lane 7：阴性对照上清；Lane 8：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS沉淀；Lane 9：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS上清。
图3：停留光谱光散射测定AQPZ和P-AQPZ的透水效率。
具体实施方式
本发明的转化细胞通过公知的氯化钙法制得。上述载体通过公知的热击法导入感受态细胞。无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。本发明所涉及的无细胞体系是按实例中所描述的方法制备。蛋白中含有6his亲和标签，可使用亲和层析进行纯化。基于以上原理，一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转化大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；AqpZTAG的基因序列见SEQ NO.3。
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(3)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1，MjpPpaRS基因的获得，包括以下步骤：
1.以p15a-MjtyrRS为模板，利用RS F2/RS R4和RS F4/RS R2两对引物通过PCR扩增获得两个DNA片段，将这两个DNA片段同源重组得到含三个位点突变(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala)的氨酰tRNA合成酶质粒。以上述突变质粒为模板，利用RS F1/RS R3和RS F3/RS R1两对引物，进行第二轮突变获得包含5个位点(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala/Phe110Ala/Asp158Ala)突变的M.jannaschii tyrosyl-tRNA synthetase(TyrRS)，突变后的氨酰tRNA合成酶命名为MjpPpaRS，获得p15a-MjpPpaRS质粒。引物基因序列如表1所示。
表1突变所用引物
2.PCR反应条件为：PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，70℃延伸5min，循环数为32个，70℃延伸10min。最后4℃降温至冷却取出。
实施例2，大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备，包括以下步骤：
1.将重组载体p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转化大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子；
2.从平板上挑取重组大肠杆菌BL21(DE3)/p15a-MjpPpaRS/pUC-MjtRNA单菌落接种于5mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素(Amp)。37℃摇床200rpm培养过夜。
3.将步骤2培养后的全部种子液分别转接至两瓶500mL的无细胞发酵培养基中，加入终浓度为50μg/mL的Amp。
4.37℃，200rpm培养至菌浓OD600至0.8-1之间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，直至菌浓OD600达到3-4，即可收菌。
5.将步骤4获得的两种菌液分别倒入500mL离心瓶后，4℃，6000g离心30min收集菌体，倒去上清。
6.用预冷的Buffer 1(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT，7mMβ-ME)重悬菌体，每1g菌体加入16.6mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
7.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。
8.用预冷的Buffer 1重悬菌体，每1g菌体加入6.6mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
9.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。
10.用预冷的Buffer 2(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT)重悬菌体，每1g菌体加入1.3mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
11.用高压细胞破碎仪6000psi破碎菌体细胞。
12.破胞液在4℃，30000g离心30min，将上清转移至新的离心管，再次4℃，30000g离心30min，取上清(抽提物)。
13.转移上清至15mL离心管，用孵育缓冲液(300mM Tris-乙酸(pH7.6)，10mM乙酸镁，10mM ATP，80mM磷酸烯醇丙酮酸，5mM DTT，40μM Amino Acid mix(5mM of each aminoacid)，8U/mL丙酮酸激酶)在37℃黑暗环境中孵育90min。每10mL抽提物加入1mL孵育缓冲液。
14.将孵育后的抽提物装入5kDa的透析袋中，在预冷的Buffer 3(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁)中4℃透析1h，更换Buffer 3，4℃透析过夜。抽提物和Buffer 3的体积比为1:100。
15.转移抽提物至15mL离心管，4℃，4,000g离心10min。分装上清至0.5mL离心管，每管200μL，液氮预冷后放入-80℃冰箱保存。
实施例3，重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS的制备，包括以下步骤：
无细胞表达载体pIVEX2.4c和p15a-MjpPpaRS分别用限制性内切酶NcoI和BamHI在37℃酶切4h，切胶回收的酶切产物在16℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用NcoI和BamHI双酶切和测序鉴定转化子，获得构建成功的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS。
实施例4，质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG的制备，包括以下步骤：
对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，从而获得蛋白AqpZTAG。以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，用引物aqpz32-36-F/aqpz32-36-R和aqpz48-F/aqpz48-R进行两轮全质粒PCR后获得pIVEX2.4c-AqpZTAG，所用引物见表1，获得质粒示意图如图1。
实施例5，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白的无细胞体系表达，包括以下步骤：
1.用实施例2所制备的大肠杆菌无细胞体系抽提物制备大肠杆菌无细胞表达体系，体系中的各组分名称及用量如表2所示。
表2大肠杆菌无细胞表达体系组分表
组分 体积(μL)
E.coli BL21(DE3)MjTyrRS/MjtRNA抽提物/E.coli BL21(DE3)抽提物 16
E coli BL21(DE3)抽提物 8
Energy Mix(EM 3.2×) 16
Amino Acid Mix(25mM) 4
pIVEX2.4c-AqpZTAG 4
Creatine kinase 1
Brij 78 1
Total 50
表2中Energy Mix(3.2×)的配制方法如表3所示。
表3Energy Mix(3.2×)成分表
组分 储液 终浓度 体积(μL)
DTT 1000mM 1.7mM 19.7
NTPs 30mM 1.2mM 464
cAMP 100mM 0.65mM 75.4
Creatine phosphate 3000mM 80mM 309.3
tRNA(E.coli) 87.5mg/mL 0.175g/L 23.2
K-Glutamate 4000mM 200mM 580
PEG 8000 30％ 2％ 773.3
EM Buffer 10× 1160
ddH<sub>2</sub>O 220
Total 3,625
表3中EM Buffer(10×)的配制方法如表4所示。
表4EM Buffer(10×)成分表
2. 50μL大肠杆菌无细胞表达体系在37℃恒温金属浴中以400rpm振荡反应4h后，12,000g离心2min，分离反应液上清和沉淀。
3.用水和5×蛋白电泳上样缓冲液将50μL上清稀释7.5倍，沉淀用300μL水和75μL5×蛋白电泳上样液重悬，12％SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
4.将pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒添加入无细胞表达体系中，提高MjpPpaRS在无细胞表达体系中的含量以提高P-AQPZ的表达量。从图2可以看出，在50μL无细胞体系中加入5μLpIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒，P-AQPZ表达量最高可达到48mg/L，是不添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒时的4倍。
实施例6，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白的亲和层析纯化，包括以下步骤：
1.配制亲和层析纯化所需的缓冲液：
上样缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，20mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
清洗缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，70mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
洗脱缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，500mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
2.分别吸取2mL左右保存在20％乙醇中的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶，加入2个10mL离心管，500g低速离心5min，吸出上清。
3.加入5-6mL ddH2O，颠倒离心管3-5min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤3次。
4.加入5-6mL上样缓冲液，在摇床中低速孵育平衡柱子10min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤2次，得到平衡的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶。
5.实施例5步骤2所制备的4mL无细胞反应液上清(添加去污剂为Brij78(0.5％))与本实施例中步骤1中的上样缓冲液按体积比1:3混合。混合均匀后，分别吸取8mL混合液加入到步骤4得到的平衡的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶中，4℃摇床振荡孵育2h。
6.孵育结束后，500g离心5min吸出的上清。加入8mL清洗缓冲液清洗杂蛋白，4℃摇床振荡孵育5min，500g离心5min吸出的上清，重复该步骤3次。
7.加入4mL洗脱缓冲液，4℃摇床振荡孵育1h后，500g离心5min，吸出的上清即为纯化后的非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白液。
实施例7，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白滤水功能检测，包括以下步骤：
1.含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白脂蛋白体的制备
含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白，蛋白溶液终浓度为100μg/mL，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)脂质体溶液终浓度为4mg/mL，Triton X-100终浓度为0.25％(m/v)。25℃、120rpm下震荡30min后以0.2g/mL加入SM-2生物珠继续震荡2h。吸取上清超速离心(300,000g、15min、4℃)，沉淀用MOPS-KOH缓冲液(100mM,pH7.5)洗涤一遍后，再次用MOPS-KOH缓冲液(100mM,pH7.5)重悬得到A含非天然氨基酸pPpa的AQPZ脂蛋白体。
2.含非天然氨基酸pPpa的AQPZ脂蛋白体的透水功能分析
分别制备AQPZ和P-AQPZ蛋白脂质体后采用停留光谱(SFM-300，BioLogic)测量脂蛋白体的透水功能。P-AQPZ脂蛋白体的Pf值计算为3.42×10-4m/s；AQPZ脂蛋白体的Pf值计算为1.23×10-4m/s；空脂质体的Pf值为Pf＝5.01×10-5m/s。AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的透水速率明显比空脂质体大，而且P-AQPZ脂蛋白体比AQPZ脂蛋白体的透水速率更高，表明所制备的P-AQPZ具有明显的滤水活性，且相较于AQPZ活性提高显著。非天然氨基酸的嵌入使水通道蛋白的与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。
<110> 浙江大学
<120> 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60
agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctgccatag gttttgaacc aagtggtaaa 120
atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180
gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240
gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300
aaatatgttt atggaagtcc attccagttt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360
ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420
gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tgctattcat 480
tatgcaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540
agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600
ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660
gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720
ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780
tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840
gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900
ccaattagaa agagattaca tcatcatcat catcattaa 939
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60
tccggcccgc cggacca 77
<210> 3
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtctggtt ctcatcatca tcatcatcat agcagcggca tcgaaggccg cggccgcatg 60
ttccgcaaat tagcagctga atgttttggt acttagtggc ttgtttaggg tggctgtggt 120
agtgctgtac tggccgcagg ctagccggaa ttaggcattg gttttgccgg cgtggcgttg 180
gcgttcggtc tgaccgttct gacgatggcc tttgctgttg gtcatatttc tggtggtcat 240
tttaacccgg cggtcactat tggtttatgg gctggcggac gttttccggc aaaagaagtc 300
gttggctacg taattgccca ggttgtcggc ggtattgttg cagcggcgct gctgtattta 360
attgccagtg gtaaaacggg ttttgacgcg gcagccagcg gttttgcttc taacggttat 420
ggcgagcatt caccaggcgg ttattccatg ctttccgcgc tggtagttga actggtattg 480
agtgcaggtt tcctgttggt gatccacggc gcaaccgaca aattcgcgcc ggcaggtttt 540
gcgccgatcg ctattggtct ggccttaacc ctgattcact taattagtat tccggtgact 600
aacacttctg ttaacccggc gcgcagcacc gcggttgcta tcttccaggg cggctgggca 660
ttagaacaac tgtggttctt ctgggtggtg ccaattgtcg gcggcattat cggtggtctg 720
atttaccgga ccctgctgga aaagcgtgat taa 753
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctg 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcag 28
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaatctgctg ccataggttt tgaaccaagt gg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaatctgctg ccataggttt tgaaccaagt gg 32
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtttatggaa gtccattcca gtttgataag gattatac 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtataatcct tatcaaactg gaatggactt ccataaac 38
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caggttaatg ctattcatta tgcaggcgtt gatgttgcag ttggagg 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctccaactg caacatcaac gcctgcataa tgaatagcat taacctg 47
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttagtggct tgtttagggt ggctgtggta gtgctg 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cagcactacc acagccaccc taaacaagcc actaag 36
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtactggccg caggctagcc ggaattaggc attg 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caatgcctaa ttccggctag cctgcggcca gtac 34

Claims (1)

1.一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得具有5个突变位点的MjpPpaRS基因，所述MjpPpaRS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其突变位点为Tyr32Ala、Glu107Pro、Leu162Ala、Phe110Ala、Asp158Ala，构建获得p15a-MjpPpaRS质粒；将MjtRNA基因克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA，所述MjtRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，获得重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4cAqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中进行表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
CN201610419991.6A 2016-06-13 2016-06-13 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法 Expired - Fee Related CN106084017B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610419991.6A CN106084017B (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610419991.6A CN106084017B (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106084017A CN106084017A (zh) 2016-11-09
CN106084017B true CN106084017B (zh) 2019-11-22

Family

ID=57845778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610419991.6A Expired - Fee Related CN106084017B (zh) 2016-06-13 2016-06-13 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106084017B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107354189B (zh) * 2016-12-29 2018-11-02 中粮营养健康研究院有限公司 基于α-羟基酸的蛋白纯化方法
CN111304234A (zh) * 2020-02-27 2020-06-19 江南大学 一种适用于枯草芽孢杆菌的非天然氨基酸利用工具
CN113583910A (zh) * 2021-08-13 2021-11-02 江苏赛索飞生物科技有限公司 发酵法制备大肠的细胞提取物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101151366A (zh) * 2004-09-21 2008-03-26 斯克利普斯研究院 将炔基氨基酸体内掺入真细菌的蛋白
CN102643849A (zh) * 2012-04-11 2012-08-22 浙江大学 在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法
CN105624183A (zh) * 2016-02-05 2016-06-01 浙江大学 蛋白AqpSS9作为水通道蛋白的应用及利用无细胞蛋白合成体系合成并纯化活性蛋白AqpSS9的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101151366A (zh) * 2004-09-21 2008-03-26 斯克利普斯研究院 将炔基氨基酸体内掺入真细菌的蛋白
CN102643849A (zh) * 2012-04-11 2012-08-22 浙江大学 在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法
CN103173468A (zh) * 2012-04-11 2013-06-26 浙江大学 一种水通道蛋白AqpZ的制备方法
CN105624183A (zh) * 2016-02-05 2016-06-01 浙江大学 蛋白AqpSS9作为水通道蛋白的应用及利用无细胞蛋白合成体系合成并纯化活性蛋白AqpSS9的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli;Deiters A 等;《Bioorg Med Chem Lett》;20050301;第15卷(第5期);第1521-1524页 *
含his标签水通道蛋白AqpZ的体外表达和功能表征;王钦沪 等;《化学工程》;20151231;第43卷(第12期);第58-61,66页 *
含pPpa的水通道蛋白AQPZ在无细胞体系中的表达及其水过滤特性;庄冰佳 等;《高效化学工程学报》;20161231;第30卷(第6期);第1335-1340页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106084017A (zh) 2016-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11479584B2 (en) Alpha-hemolysin variants with altered characteristics
US11261488B2 (en) Alpha-hemolysin variants
CN106084017B (zh) 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法
CN106986922B (zh) 一种自组装双亲短肽及其应用
CN105238798B (zh) 人源蛋氨酸亚砜还原酶a表达基因、载体、菌株及方法
CN112225814A (zh) 一种新型冠状病毒rbd融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN104673810A (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因mimdh1及其重组表达载体
CN101556287A (zh) 一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法
Mirhosseini et al. The efficient solubilization and refolding of recombinant organophosphorus hydrolyses inclusion bodies produced in Escherichia coli
CN102994601B (zh) 一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法
CN104673809B (zh) 一种苹果酸脱氢酶基因及其重组表达载体
CN108404136B (zh) 一种基于穿膜肽的三元基因递送系统及其应用
CN105543234A (zh) 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法
CN109055416A (zh) 一种可溶性重组蛋白的制备方法
CN104031134B (zh) 一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途
CN108588084B (zh) 一种基因工程鲎血g因子及其制备方法和应用
CN102167733A (zh) 一种可酸切高拷贝降血压肽串联基因的构建、表达及应用
CN103675164B (zh) 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法
CN108802357A (zh) 一种用于免疫印迹分析的生物发光探针及其应用
CA3072620A1 (en) Compositions and methods using methanotrophic s-layer proteins for expression of heterologous proteins
CN105601749B (zh) 一种重组华支睾吸虫分泌型磷脂酶a2蛋白及其体外可溶性表达与纯化制备方法
CN113024642A (zh) 一种基于肺炎支原体的蛋白质及其制备方法和应用
CN109022471B (zh) 生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用
CN102911955B (zh) 人工合成人肠激酶基因及其表达纯化方法
CN112812156B (zh) 一种新型冠状病毒covid-19-s1蛋白的表达和纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20191122

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee