CN105238798B - 人源蛋氨酸亚砜还原酶a表达基因、载体、菌株及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因、载体、菌株及其制备方法。通过人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因序列从信号肽序列、偏好密码子、GC含量、mRNA二级结构方面进行优化调整，并配合相应的载体和表达菌株，能够取得在体外通过细菌培养工业化批量生产人源蛋氨酸亚砜还原酶A的有益效果。

Description

人源蛋氨酸亚砜还原酶A表达基因、载体、菌株及方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的表达基因、载体、菌株及方法。

背景技术

蛋氨酸亚砜还原酶(methonine sulfoxide reductase，Msr)是目前发现的唯一可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残疾氧化结构变化和功能损失的抗氧化酶系统。MsrA存在于所有已知的真核细胞、真细菌及大部分古细菌中，说明它对于细胞生命至关重要。这种酶能够保护细胞免受氧化应激，同时有证据表明它能延缓衰老进程及神经退行性疾病的恶化。原因有二：其一，它能修复由于蛋氨酸氧化而失活的蛋白质；其二，它能通过逆转蛋白质中蛋氨酸氧化/还原来清除活性氧。

蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)是一种很好的抗氧化酶和蛋白修复酶，在体内扮演多种角色，与多种疾病和皮肤衰老密切相关，如：白内障、白癜风、光老化等等。蛋氨酸亚砜还原酶A，具有对抗这类疾病有潜力。另外，蛋氨酸亚砜还原酶A还可以像SOD一样添加到化妆品、保健品和药品当中，因此具有非常好的应用前景。

目前能大量生产的蛋氨酸亚砜还原酶A为鼠源性蛋氨酸亚砜还原酶A，如基于比色法检测蛋氨酸亚砜还原酶活性新方法的建立及应用一文，含有鼠源性MsrA(rMsrA)表达序列的重组质粒连接到PET-32a载体，使用平板培养筛选出转染成功的菌落,扩增并诱导大量表达,提取重组蛋白,并采用Ni-层析柱纯化得到融合蛋白。使用轻链肠激酶酶切处理后再次过柱纯化,得到纯化的基因重组TAT-MsrA酶，可以用于大量表达目的蛋白。此方法得到的MsrA重组蛋白纯度高达92％,抗原活性显示阳性反应。

人源蛋氨酸亚砜还原酶A虽然在人体应用上，具有更优秀的生物效应以及更小的副作用，而人源性的蛋氨酸亚砜还原酶A，尚无法在体外大量表达，从而大量生产。因此亟需一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达系统，从而工业化大量生产人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因、载体、菌株及方法，其目的在于通过对人蛋氨酸亚砜还原酶A基因的修饰和优化，配合适合的表达系统和表达条件，实现人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的体外大量表达，由此解决人源性蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白无法体外大量表达的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因，所述人蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因为：

(1)由SEQ NO.1所示的DNA序列编码的基因；

(2)由SEQ NO.1所示的DNA序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的DNA序列编码的基因。

按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体，所述载体包含如权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因。

按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株，所述菌株含有如权利要求2所述的蛋氨酸亚砜还原酶A表达载体。

按照本发明的另一方面，提供了一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将如权利要求3所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，直至OD在0.5至0.7之间；

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养3小时至6小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20℃至30℃之间，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度在0.2mM至0.5mM之间，摇床转速在150rpm至220rpm之间；

(3)超声破碎：采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液；

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A。

优选地，所述制备方法，其步骤(3)的破碎条件如下：破碎脉冲持续3至5秒，间隔3至5秒，超声脉冲破碎20分钟至45分钟。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于对人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因序列从信号肽序列、偏好密码子、GC含量、mRNA二级结构方面进行优化调整，并配合相应的载体和表达菌株，能够取得在体外通过细菌培养工业化批量生产人源蛋氨酸亚砜还原酶A的有益效果。

附图说明

图1是实施例2的蛋白凝胶电泳照片，其中图1A是TAT-hMsrA-6P、TAT-hMsrA-28a在Rosetta(DE3)中测试表达图，图1B是TAT-hMsrA-6P、TAT-hMsrA-28a在BL21(DE3)中测试表达图；

图2是实施例3的蛋白凝胶电泳照片，其中图2A是TAT-hMsrA-6P BL21(DE3)大量表达后纯化浓缩的图片，图2B是TAT-hMsrA-28a BL21(DE3)大量表达后纯化浓缩的图片

图3是实施例4的蛋白凝胶电泳照片，TAT-hMsrA-28a BL21(DE3)在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.5mM时，不同温度诱导情况下上清和包涵体蛋白电泳图片。

图4是实施例5的蛋白凝胶电泳图片，其中图4A是TAT-hMsrA-28a BL21(DE3)在20℃诱导温度下、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.2mM时的纯化图片，图4B是浓缩后的电泳图片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因为：

(1)由SEQ NO.1所示的DNA序列编码的基因；

(2)由SEQ NO.1所示的DNA序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的DNA序列编码的基因。

所述基因为于N端添加了穿膜肽序列全长hMsrA序列，经剪切修饰以及从成熟序列的大肠杆菌稀有密码子、GC含量和mRNA的二级结构方面进行优化后的序列。该基因能在原核生物，例如大肠杆菌中表达重组的人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白，具有穿膜效果，能有效促进皮肤对该蛋白的吸收，并经实验验证，具备生物学活性。

为大量表达本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因，本发明还提供了所述基因的配套表达系统。所述系统包含用于构建重组菌株的表达载体及用于大量表达的菌株。

所述人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体，包含本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因，并带有tac启动子或T7启动子，优选pGEX-6P-1载体或pET-28a载体。

pGEX-6P-1载体，带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达，可提高目的蛋白的表达量；载体上的GST是一个高度可溶的蛋白，可提高外源蛋白的可溶性表达，而且GST标签可用PreScission^TM蛋白酶从融合产物中切除。pET-28a是T7启动子，也可实现化学诱导的高水平表达，His tag只有6个His，约0.84KD，分子量很小一般不影响目标蛋白的功能，易表达出有活性的蛋白。

所述人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株，为大肠杆菌，含有本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶A表达载体。优选采用BL21(DE3)和Rosetta(DE3)菌株。BL21(DE3)是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，可以保持蛋白的稳定不被降解，适合T7启动子的载体；Rosetta(DE3)系列是来自BL21lacY1，它含有大肠杆菌(Escherichia coli)稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA，可降低外源蛋白稀有密码子对表达的影响，适合T7启动子的载体。

利用本发明提供的人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因及系统，表达人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，直至OD在0.5至0.7之间，优选培养至OD值为0.6；

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养3小时至6小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20℃至30℃之间，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度在0.2mM至0.5mM之间，摇床转速在150rpm至220rpm之间；

(3)超声破碎：采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液，破碎条件如下：破碎脉冲持续3至5秒，间隔3至5秒，超声脉冲破碎20分钟至45分钟；

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A。

以下为实施例：

实施例1人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体构建

选择pGEX-6P-1载体和pET-28a载体，载体由武汉华美生物科技有限公司提供。

1、将目的基因构建到pGEX-6P-1和pET-28a载体上，根据SEQ No.1序列设计引物：

F:CCGGAATTCGGCTATGGTCGCAAAAAACGT，

R:CCGCTCGAGTTATTTTTTGATACCAACCGGACA。

两种载体设计的引物相同，分别进行PCR扩增，50ul体系，质粒模版1ul，上下游引物各1ul，10×Pfu Buffer 5ul，dNTP mixture(10mM)1ul

Pfu DNA酶(2.5u/ul)0.5ul，用ddH2O补足体积到50ul。PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。反应结束后取5μL PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示出1条大小约为700bp的特异带。

2、双酶切pet28a和pgex-6p-1表达载体以及PCR产物。

3、琼脂糖凝胶回收酶切产物。

4、T4DNA连接酶16℃连接过夜。

5、连接产物转化DH5α克隆宿主，涂布与固体LB(含相应抗生素)培养基，37℃倒置培养过夜。

6、随机挑取6个单菌落，进行PCR菌落鉴定，选取PCR菌落鉴定阳性的单克隆进行基因测序。

实施例2人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株构建

1、各取2ul质粒分别添加到30ul BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态中，采用热激转化法，将菌液转移到含有Kan+(pet8a)或Amp+(pgex-6p-1)的LB平板上，涂布均匀，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

2、挑取阳性单菌落转入至含有Kan+(pET-28a)或Amp+(pGEX-6P-1)3ml LB培养基中，37℃220rpm过夜培养。取30ul过夜培养的菌液加入到3ml LB培养基中,37℃220rpm培养至OD值为0.6；剩余的菌液加甘油于-80℃保存备用。

3、加入IPTG至终浓度0.5mmol/L进行诱导，并设置对照组，37℃220rpm诱导3h。

4、取200ul菌液，12000g离心30s，弃上清，菌体用40μl 1XSDS-PAGE上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测，结果如图1所示，显示成功表达了目的蛋白。测试结果分析：TAT-hMsrA-6P和TAT-hMSRA-28a在BL21DE3中的表达优于Rosetta DE3，TAT-hMsrA-6P BL21DE3、TAT-hMsrA-28a BL21DE3都进行大量表达。

实施例3

表达人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将实施例2中的TAT-hMsrA-6P BL21DE3、TAT-hMsrA-28a BL21DE3蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，步骤如下：

各取20ul接种于20ml含有Amp+或Kan+的LB培养基，37℃220rpm过夜培养；取10ml过夜培养的菌液加入到含有相应抗生素的1000ml LB培养基中，37℃220rpm培养至OD值为0.6。

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养4小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在30℃，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.5mM，摇床转速为220rpm。

(3)超声破碎：将步骤(2)中培养好的菌液分别倒入离心瓶中，平衡后3900rpm，离心10min，菌体-20℃冻存，采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液，具体操作如下：用预冷的20ml破碎悬浮液悬浮菌体，冰上超声破碎，破碎脉冲持续3秒，间隔3秒，超声脉冲破碎30分钟；12000rpm 4℃离心30min，分别收集上清和沉淀。

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A，具体操作如下：

(4-1)将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的平衡液冲洗。上清样品用0.45um滤膜过滤后加到层析柱中，流速控制在0.5ml/min左右，收集穿透部分。

(4-1)洗杂蛋白，分别使用Wash buffer1和Wash buffer2洗涤15倍柱体积，收集洗涤液，流速1.5ml/min。

(4-3)洗脱目的蛋白，Elution buffer1洗脱30ml，用一管收集，Elution buffer2洗脱30ml。

(4-4)洗脱的蛋白用1*PBS溶液透析，用0.45um的超滤管浓缩蛋白，根据SDS-PAGED蛋白电泳检测确定纯度后，用Bradford方法测定浓度后，-80℃保存备用，电泳结果如图2所示。

各溶液配制如下，PH8.0

	Tris mM	Nacl mM	咪唑mM
				Balance buffer	50	250	5
Wash buffer1	50	250	5
				Wash buffer2	50	250	20
Elution buffer1	50	250	50
				Elution buffer2	50	250	250

1L培养基中TAT-hMSRA-6P BL21 DE3表达10mg可溶蛋白，测得的活性为50.98u/g；TAT-hMsrA-28a BL21 DE3表达3mg可溶蛋白，测得的活性为487.2u/g，28a载体表达的蛋白活性较好，但是表达量低。蛋白活性测定采用专利号为CN 102094068 A的专利所述的方法。

实施例4

表达人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将实施例2中的TAT-hMsrA-28a BL21 DE3氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，步骤如下：

取20ul接种于20ml含有Kan+的LB培养基，37℃220rpm过夜培养；取10ml过夜培养的菌液加入到含有相应抗生素的1000ml LB培养基中，制备相同的两份，37℃220rpm培养至OD值为0.6。

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养6小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度选择20℃和25℃，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.5mM，摇床转速为150rpm。

(3)超声破碎：将步骤(2)中培养好的菌液分别倒入离心瓶中，平衡后3900rpm，离心10min，菌体-20℃冻存，采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液，具体操作如下：用预冷的20ml破碎悬浮液悬浮菌体，冰上超声破碎，破碎脉冲持续4秒，间隔4秒，超声脉冲破碎45分钟；12000rpm 4℃离心30min，分别收集上清和沉淀。

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A，具体操作步骤如实施例3，电泳结果如图3所示。

TAT-hMsrA-28a BL21 DE3在20℃诱导比25℃诱导上清蛋白的量多，25℃条件下，1L培养基获得5mg可溶蛋白；20℃条件下获得10mg可溶蛋白。测得的蛋白活性分别为：504.3u/g，510.4u/g

实施例5

表达人源蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将实施例2中的TAT-hMsrA-28a BL21 DE3蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，步骤如下：

取20ul接种于20ml含有Kan+的LB培养基，37℃220rpm过夜培养；取10ml过夜培养的菌液加入到含有相应抗生素的1000ml LB培养基中，37℃220rpm培养至OD值为0.6。

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养6小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20℃，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.2mM，摇床转速为150rpm。

(3)超声破碎：将步骤(2)中培养好的菌液分别倒入离心瓶中，平衡后3900rpm，离心10min，菌体-20℃冻存，采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液，具体操作如下：用预冷的20ml破碎悬浮液悬浮菌体，冰上超声破碎，破碎脉冲持续4秒，间隔4秒，超声脉冲破碎45分钟；12000rpm 4℃离心30min，分别收集上清和沉淀。

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A，具体操作步骤如实施例3，电泳结果如图4所示。

在诱导温度20℃，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.2mM时，1L培养基获得的可溶蛋白为24mg，测得的蛋白活性为512.3u/g

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因，其特征在于，所述人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因为：由SEQ NO.1所示的DNA序列编码的基因。

2.一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达基因。

3.一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌，含有如权利要求2所述的蛋氨酸亚砜还原酶A表达载体。

4.一种人源蛋氨酸亚砜还原酶A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株培养：将如权利要求3所述的蛋氨酸亚砜还原酶A的表达菌株进行扩大培养，直至OD在0.5至0.7之间；

(2)诱导表达：将步骤(1)中培养的菌株，在以下条件下培养3小时至6小时获得诱导表达菌株，诱导蛋氨酸亚砜还原酶A表达：温度在20℃至30℃之间，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度在0.2mM至0.5mM之间，摇床转速在150rpm至220rpm之间；

(3)超声破碎：采用超声波脉冲破碎步骤(2)获得的诱导表达菌株获得破碎液；

(4)蛋白提纯：将步骤(3)中获得的破碎液进行蛋白提取和纯化获得蛋氨酸亚砜还原酶A。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的破碎条件如下：破碎脉冲持续3至5秒，间隔3至5秒，超声脉冲破碎20分钟至45分钟。