CN101223275B - 通过OmpF和目的蛋白的共表达的目的蛋白细胞外生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种向细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的方法。更特别的是，本发明涉及与含E.coli外部膜蛋白F(OmpF)的重组表达载体共转化的微生物以及向细胞培养基中分泌含目的蛋白的重组载体，同时，经过培养微生物向细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的一种方法。根据本发明，该目的蛋白可以以不与其它蛋白融合的纯态分泌到细胞培养基中，因此使有效的分离和纯化目的蛋白成为可能。

Description

通过OmpF和目的蛋白的共表达的目的蛋白细胞外生产方法
技术领域
本发明涉及一种向细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的方法，并且更特别地，包含E.coli外部膜蛋白F(OmpF)的重组表达载体跟微生物的共转化以及在细胞培养基中分泌含有目的蛋白的重组表达载体，以及通过培养所述微生物在细胞培养基中分泌和生产目的蛋白的方法。
背景技术
随着基因处理技术的发展，通过使用细菌和各种动物和植物研究生产大量有用蛋白已经频繁进行。至今为止，E.coli作为一种宿主细胞通常主要用作多种有用蛋白的批量生产，研究也还是主要集中在这里(Choi等，Chem.Eng.Sci.，66：876，2006；Lee，Trends Biotechnol.，14：98，1996)。然而，如果将待生产的有用蛋白在E.coli的细胞质中生产，还是会存在许多问题。首先，为了在细胞质中生产蛋白要进行分离和纯化以获得高纯度，这要进行相当复杂和昂贵的分离和纯化步骤。并且，上述蛋白易于曝露于当前细胞质中的多种蛋白酶中，这将导致减少产量。还有，在大多数情况下，蛋白在细胞质中的过表达并不能完全折叠并形成不活动的包涵体。因为这些包涵体蛋白没有作为蛋白质的活性，为了从所述包涵体蛋白中获得生物活性和水溶性的蛋白质需要进行复杂和昂贵的变性和再折叠步骤(Choi等，Chem.Eng.Sci.，66：876，2006)。
作为解决类似问题的方法之一，存在一种方法其在细胞质中生产的蛋白质被分泌到外周胞质或细胞培养基中。E.coli中的目的蛋白的细胞外生产有多种优点。首先，在E.coli细胞中的目的蛋白的生产可以根本地防止细胞内蛋白裂解，以至于可以得到预期蛋白质的固定生产。其次，通过分泌步骤可以使蛋白质得到正确的折叠以生产具有活性的蛋白质，并可以防止由非正确折叠导致的包涵体的形成。第三，通过分泌步骤，去除N端分泌信号序列以至于可以保持同样的氨基酸序列作为自然出现的不带有N端的蛋氨酸(Met)残基序列，蛋氨酸不可避免地在细胞内生产中连接上来。最后，纯化步骤很容易实施。由于很少或几乎没有蛋白质可以从E.coli天然地分泌到培养基中，细胞培养基中的目的蛋白分泌生产允许目的蛋白维持在高纯度，因此从细胞培养基中纯化分离目的蛋白变得非常容易。尽管在E.coli中的目的蛋白的细胞外生产同分泌到E.coli外周胞质中一般的分泌生产具有相似的优点，但是上述细胞外生产的优点在工业生产上可以更有效。因为所述细胞外分泌生产是一种将目的蛋白完全分泌在细胞外部的方法，而不是将目的蛋白分泌在有限的外周胞质中，它可以显著减少导致蛋白过表达的细胞中的负担以允许通过高细胞浓度培养基和连续培养基大量生产蛋白质。尽管两种方法可以使高纯度的蛋白质在纯化步骤中进行生产，但是将目的蛋白生产分泌在外周胞质中比细胞外分泌生产需要更复杂的步骤，它不易用于工业应用(Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.，64：625，2004)。如上所述，细胞外分泌的优点非常突出和多样化并因此有许多研究实施将E.coli中的目的蛋白在外周胞质或细胞外分泌。
在重组蛋白生产方面，在外周胞质或细胞培养基中分泌分析自E.coli的有用蛋白的方法具有多种优点。首先，因为外周胞质或培养基比细胞质包括显著较少量的蛋白质，它非常易于分离和纯化预期有用的具有高纯度的蛋白质。而且，因为有用的蛋白质分离自含有大部分蛋白酶的细胞质，细胞内的蛋白分解可以被预先防止，这样在产量方面得到好的结果。而且，因为外周胞质是一个比细胞质更易被氧化的环境，二硫化物更容易被键接，由此得到具有准确折叠的蛋白质生产，它导致包涵体蛋白的形式显著减少(Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.，64：625，2004)。
为了分泌E.coli不分泌的外部蛋白质，在先已知的分泌信号序列(例如OmpA，OmpF，PhoA，SpA，等)连接到外部蛋白质的N端末端或在经过一些修饰后进行连接(Abrahmsen等，EMBO J.，4：3901，1985；Choi和Lee，Appl.Microbiol.Biotechnol.64：625，2004；Jobling等，Plasmid，38：158，1997；Klein等，Protein Eng.，5：511，1992；Utsumi等，Gene基因，71：349，1988)。
然而，类似的信号序列或蛋白质在分泌效率方面显示了巨大的差异并且在大量实施例中没有出现分泌。这是因为没有清楚地建立信号序列和目的蛋白之间的相关性以及这样的研究调查能够有效分泌目的蛋白的新的信号序列仍在世界范围内广泛实施。进一步说，尽管从外周胞质中分离和纯化目的蛋白比从细胞质中分离和纯化容易，但是目的蛋白的细胞外分泌可以使目的蛋白的分离和纯化更加容易。
E.coli中的目的蛋白的细胞外分泌的方法，到目前为止已开始实施，其广义上可以分为如下四类：
(1)第一种方法基于将信号缩氨酸和目的蛋白质组合成融合蛋白质并且主要地用所述信号缩氨酸来从E.coli到外周胞质中分泌目的蛋白。Toksoy等人报道了通过融合带有麦芽糖结合蛋白(MBP)的TaqI蛋白的细胞外生产(Toksoy等，Biotechnol Techniq.，3：803，999).在这一方面，采用的是E.coli XL1菌株，并在1mM IPTG的诱导表达之后，在细胞培养基中，有大约270×103单位/1L TaqI蛋白。Lo等人报道了β-1，4-葡聚糖内切酶衍生自Bacillus subtilis并在E.coli中表达，结果出现了蛋白质的细胞外分泌(Lo等，Appl.Environ.Microbiol.，54：2287，1988).Nagahari等人报道了通过融合带有分泌信号序列和OmpF蛋白的八N端氨基酸的β-内啡肽的细胞外分泌(Nagahari等，EMBO J.，4：3589，1985).在这一方面，E.coli N99，RRI，和MC4100以及它们的突变株MH1461(envZ)和MH1160(ompR)用作宿主细胞，并且在它们当中RR1菌株显示了最高的分泌效率，其中β-内啡肽在分泌之后在细胞外蛋白酶的作用下出现降解。N99菌株显示了最稳定的分泌效率。另一方面，Yamamoto等人欲尝试通过如上所述融合带有OmpF分泌信号序列的Harvey小鼠肉瘤病毒衍生自p21蛋白来分泌生产。然而，所述p21蛋白在细胞外未分泌，却以溶性的包涵体形式积累在细胞质中(Yamamoto等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35：615，1991).
(2)第二种方法采用目的蛋白和包含在E.coli中目的蛋白分泌中的蛋白的共同生产。Baneyx等人报道了OmpA-TEM-β-内酰胺酶融合蛋白的分泌生产中的TolAIII蛋白(E.coli transmembrane protein)的共同生产(Baneyx和Eugene，Protein Expr.Purif.，14：13，1998).为了得所述OmpA-TEM-β-内酰胺酶融合蛋白的分泌生产，使用需要lpp-lac启动子，而且为了表达TolAIII蛋白，使用需要IPTG衍生物的T7lac启动子。在E.coliBL21(DE3)中的蛋白表达采用1mM IPTG诱导。结果是，与蛋白的单一表达相比带有TolAIII的共同表达在β-内酰胺酶的活性中显示了3.5倍的增长。Robbens等人报道了在白细胞介素-2(IL-2)生产中的kil基因的共同表达(Robbens等，Protein Expr.Purif.，6：481，1995)。在这一方面，IL-2基因在融合OmpA分泌信号序列之后，采用需要IPTG衍生物的tac启动子对它的表达进行诱导，并且kil基因的共同表达需要在42℃下的震荡加热中采用PL启动子。已知在kil基因通过加热震荡的诱导表达之前IL-2蛋白产生于E.coli的外周胞质中，在kil基因的诱导表达之后它主要通过外部膜分泌到细胞培养基中。van der Wal等人采用细菌素释放蛋白(BRP)，它是一种E.coli脂蛋白，获得β-内酰胺酶的细胞外分泌(van derWal等，Appl.Environ.Microbiol.，64：392，1998).van der Wal等人通过随即诱变现有的BRP基因得到了修饰的BRP基因，并且采用这些修饰的BRP基因以开发比现有BRP基因更稳定的方式来培养可分泌和产生到细胞外部的系统。Aristidou等人报道了在采用BRP的细胞外分泌中将甘氨酸加入培养基中可以有效增加分泌效率(Aristidou等，Biotechnol.Lett.，15：331，1993).作为目的蛋白质，采用α-淀粉酶和β-内酰胺酶，并通过lpp/lac启动子对BRP表达进行诱导。在介质中添加1％的甘氨酸比添加0.1％的甘氨酸该α-淀粉酶显示了大约高出10倍的活性。在添加1.0％的甘氨酸时该β-内酰胺酶的活性显示增加了大约2.5倍。
(3)第三种方法采用不带外部膜的E.coli菌株。这种突变株被称为“L-形(form)”，它处于E.coli的外部膜去除后细胞形成的状态，具有不带外周胞质的内膜。也就是说，分泌蛋白到外周胞质所用到的方法在现有技术中被广泛采用，它允许蛋白质的细胞外产生，因为一旦该蛋白质通过细胞内膜就不经过外周胞质而暴露于细胞培养基中。Kujau等人采用RV308菌株，它是一种L-形E.coli菌株，以得到微型抗体(miniAb)的细胞外分泌(Kujau等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：51，1998).该miniAb基因与OmpA分泌信号序列融合，之后通过lac启动子对它的表达进行诱导。在低温26℃下培养比在37℃中培养显示了较高的细胞浓度和蛋白质产生。
(4)第四种方法是通过融合带有目的蛋白的外部膜蛋白F(OmpF)来实施细胞外分泌。在这种方法中，融合有末端为C-端的外部膜蛋白F的目的蛋白β-内啡肽在高的细胞浓度中培养从而使其分泌到细胞的外部(韩国专利号：10-0447530；Jeong和Lee，Appl.Environ.Microbiol.，68：4979，2002).然而，这种方法的问题在于为了得到目的蛋白的细胞外分泌必须使用高细胞浓度培养基，并且通过消化分离和纯化目的蛋白的步骤需要多种蛋白酶，因为产生的目的蛋白融合有OmpF蛋白。
如上所述，尽管在E.coli中目的蛋白的细胞外生产已开发研究了多种方法，但是仍存在许多问题。上述方法允许目的蛋白的分泌产生。然而，因为这些方法中的大多数包含有E.coli的部分裂解，E.coli的大量的细胞内蛋白包含在细胞培养基中从而降低了目的蛋白的纯度，这使得很难得到简单的纯化步骤，而这却是细胞外分泌生产的最重要的优点。而且，因为这些方法涉及E.coli的裂解，它们有一个缺点在于，在高细胞浓度的培养基中很难生产，以至于获得预期蛋白的批量生产也变得困难。尤其是在L-形的E.coli中，因为E.coli菌株结构的问题只有低细胞浓度的培养基中才可以。
发明内容
因此，本发明者作了很大的努力开发了一种从E.coli有效地分泌目的蛋白到微生物细胞外部(进入培养基中)的方法，结果发现当E.coli外部膜蛋白F(OmpF)和目的蛋白共同表达时，该目的蛋白可以从E.coli中有效地分泌到细胞培养基中，并且该分泌的蛋白可以以一种非常简单的方式被分离和纯化，因为在细胞培养基中它是一种纯态，由此完成了本发明。
因此，本发明的主要目的是提供一种微生物，其特征在于将OmpF和目的蛋白的共同表达以将目的蛋白分泌和生产到微生物细胞外部。
本发明的另一个目的在于提供一种目的蛋白的细胞外分泌和生产的方法，该方法包含有培养所述微生物。
为了完成上述目的，一方面，本发明提供一种共转化(co-transformed)重组微生物，其带有含OmpF编码基因的重组载体和含目的蛋白编码基因的重组载体，并能够表达和分泌目的蛋白到微生物的外周胞质中，该重组微生物的特征在于能够对OmpF编码基因和目的蛋白编码基因共同表达以分泌和产生目的蛋白到微生物细胞的外部(进入培养基中)。
在另一方面，本发明提供一种通过诱导含目的蛋白编码基因的重组载体得到的重组微生物并且能够将目的蛋白表达和分泌到微生物的外周胞质中，在具有OmpF编码基因的微生物中它的启动子诱导进入它的染色体，从而能够表达OmpF编码基因，该重组微生物的特征在于能够共同表达OmpF编码基因和目的蛋白编码基因以将目的蛋白分泌和生产到微生物细胞的外部(进入细胞培养基)。
在本发明中，该含有OmpF编码基因的重组载体和含目的蛋白编码基因的重组载体具有在基本相同条件表达的多个起点(origins)。例如，含OmpF编码基因的重组载体的起点是p15A，并且含目的蛋白编码基因的重组载体的起点是ColE1。
该含有OmpF编码基因的重组载体在它的本身中具有OmpF启动子，并且优选地，该重组载体为pACYC-OmpF。
同时，该含目的蛋白编码基因的重组载体优选其特征能够表达和分泌目的蛋白到微生物的外周胞质中。当重组微生物与含有这种特征的重组载体共转化(co-transformed)以及该OmpF编码基因被培养时，该目的蛋白可被分泌到细胞培养基中。
因此，本发明还提供了一种目的蛋白的细胞外分泌和生产的方法，该方法包括步骤：(a)培养所述重组体微生物以分泌目的蛋白到微生物细胞的外部(进入培养基中)；和(b)从培养基中收集目的蛋白。
在另一方面，本发明提供一种重组载体，其通过诱导OmpF编码基因进入含有目的蛋白编码基因的载体中构成，并能够表达和分泌目的蛋白到微生物的外周胞质。该重组载体的特征在于能够共同表达该OmpF编码基因和目的蛋白编码基因以将目的蛋白分泌到微生物细胞的外部(进入培养基中)。
然而在又一方面，本发明还提供一种得到目的蛋白的细胞外分泌和生产的方法，该方法包括步骤：(a)培养微生物与所述重组载体变换并且该变换的微生物分泌目的蛋白到微生物细胞的外面(进入培养基中)；和(b)从培养基中回收目的蛋白。
在本发明获得目的蛋白的细胞外分泌和生产的方法中，在步骤(a)中的目的蛋白的细胞外分泌并不伴随该微生物的裂解。
本发明将在下文中作详细描述。
为了E.coli OmpF的共同表达，本发明者创立了重组质粒载体pACYC-OmpF。这种重组质粒包含E.coli OmpF基因和启动子和氯霉素抗体基因并具有p15A起点，因此它易于与用于大多数表达载体的ColE1起点共同表达。该OmpF基因和启动子是通过PCR方法从E.coli BL21(DE3)染色体中获得的。
然后，为了制备分泌目的蛋白到微生物细胞外部的转化E.coli菌株，采用了多种重组质粒。首先，E.coli碱性磷酸酶用作目的蛋白。该碱性磷酸酶由450个氨基酸组成并且具有大约50kDa的分子量。已知这种蛋白质在E.coli中被表达并分泌到外周胞质，而且它只有在外周胞质中存在才具有酶活性(Manoil等，科学，233：1403，1986)。该重组质粒pTrcS1PhoA能够分泌和生产碱性磷酸酶到外周胞质，并且质粒pACYC-OmpF在E.coli中得到共转化和培养，并且分析该培养基，结果显示该分泌自E.coli BL21(DE3)和MC4100的目的蛋白碱性磷酸酶以良好的效率进入培养基中。纯的碱性磷酸酶可以从上述E.coli菌株分泌到微生物细胞的外部获得。同样，添加碱性磷酸酶的其他蛋白质，例如，由53个氨基酸组成的上皮细胞生长因子(EGF)，人血清瘦素(leptin)蛋白，来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的木聚糖内切酶，用作目的蛋白来分析它们分泌进入培养基中。本发明还显示所有上述蛋白质被有效地分泌自转基因E.coli而进入培养基中。
附图说明
图1显示质粒pACYC-OmpF的基因图。
图2显示获得E.coli BL21(DE3)培养基与质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图3显示得到E.coli MC4100培养基与质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图4显示通过培养E.coliBL21(DE3)与质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA在不同浓度的NaCl中变换得到的培养基的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图5是质粒psEGF的基因图。
图6显示得到E.coli BL21(DE3)培养基与质粒pACYC-OmpF和psEGF共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图7显示CuCl2染色的E.coli BL21(DE3)培养基与质粒pACYC-OmpF和psEGF的共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图8显示E.coli BL21(DE3)培养基与质粒pACYC-OmpF和pJS101ΔP的共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
图9显示E.coli BL21(DE3)培养基与质粒pACYC-OmpF和pTrcKObD的共转化的SDS-PAGE凝胶分析结果。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例对本发明作进一步描述。然而对本领域技术人员来说显而易见这些实施例只是对发明目的进行详细说明，而本发明的范围并不限于这些实施例。
特别地，下列实施例说明了培养与含OmpF编码基因的重组载体和含目的蛋白编码基因的重组载体共转化的微生物从而分泌和生产目的蛋白到微生物细胞的外部(进入细胞培养基)。然而，本领域技术人员显而易见采用与通过OmpF编码基因诱导到含目的蛋白编码的载体中构成的重组载体变换的微生物，并能够将目的蛋白表达和分泌到微生物的外周胞质，同样承认待分泌和生产到微生物细胞外的目的蛋白(进入培养基中)。除了含OmpF编码基因的重组载体之外，采用通过诱导含目的蛋白编码基因重组载体构成的重组微生物并将目的蛋白表达和分泌到微生物的外周胞质对本领域技术人员是显而易见的，进入具有OmpF编码基因的重组微生物并且它的启动子诱导进入它的染色体，目的是能够表达该OmpF编码基因，使得待分泌和生产的目的蛋白到达微生物细胞的外部(进入培养基中)。
此外，下面实施例说明了pJS101ΔP(一种能向外周胞质表达和分泌木聚糖内切酶的重组载体)和pTrcKObD(一种能向E.coli外周胞质表达和分泌人血清瘦素(leptin)蛋白的重组载体)作为含有目的蛋白编码基因的重组载体，并能够向E.coli的外周胞质表达和分泌目的蛋白。然而，如果该重组载体能够向微生物外周胞质表达和分泌目的蛋白，则所有重组载体可不限制地被使用，这对本领域技术人员来说是显而易见的。而且，尽管下面的实施例中仅列举了碱性磷酸酶、表皮生长因子(EGF)、木聚糖内切酶和人血清瘦素(leptin)作为目的蛋白，但是对本领域技术人员来说可以预见到本发明并不限于所列举的目的蛋白。
实施例1：OmpF基因表达系统的研制
从E.coli BL21(DE3)中分离的染色体，然后克隆OmpF基因和它的启动子区，合成序列为5’-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3’(序列1)的引物1和序列为5’-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3’(序列2)的引物2.该染色体采用引物1和2通过PCR以得到2160-bp PCR产物。该PCR产物经HidIII和BamHI进行消化并被克隆进入pACYC184(新英格兰Biolabsd，美国).该克隆后的质粒被转化到E.coli XL1-Blue[supE44hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF′(proAB+lacIq lacZ ΔM15Tn(tetr))]以获得重组质粒pACYC-OmpF(图1).
实施例2：重组质粒pTrcS1PhoA的结构
分离自E.coli W3110(衍生自E.coli K-12，λ-，F-，原养的)的染色体，之后，为了得到碱性磷酸酶基因，合成序列为5’-GGACTGCAGCACGGACACCAGAAATGCCTGTT-3’(序列3)的引物3和序列为5’-GCGGGATCCTTATTATTTCAGCCCCAGAGCCGG-3’(序列4)的引物4。该染色体采用引物3和4进行PCR。该PCR反应在如下条件下完成：94℃下预变性5分钟；94℃变性45秒，52℃下退火45秒，72℃下延长1分10秒，进行30个循环；之后，在72℃下延长7分钟。通过PCR反应得到的DNA片段在琼脂糖凝胶中作电泳以分离大约1360bp DNA片段。该分离后的DNA片段在两种限制酶PstI和BamHI中消化。同时，重组质粒pJS101ΔP(Choi，J.H.，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：640，2000)在两种限制酶PstI和BamHI中消化以去除endoxylase基因，并且所得到的质粒与上面得到的DNA序列通过T4DNA连接酶混合和连接，从而得到重组质粒pTrcS1PhoA。
实施例3：碱性磷酸酶的细胞外生产
E.coli BL21(DE3)菌株是共转化自重组质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA。该转化通过电穿孔实现。该转化菌株选自包含氨苄青霉素抗生素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB平板培养基。该转化菌株接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)和在30℃培养，之后，检查碱性磷酸酶的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中加入0.1和1.0mM的IPTG，以诱导基因表达。在诱导基因表达12小时之后，在每个培养基中收集1mL培养物并测量碱性磷酸酶的活性，同时在SDS-PAGE凝胶中分析(图2)。在图2中，“M”表示标准分子量的蛋白质，“1”表示在0.1mM IPTG中诱导表达12小时之后，用SDS-PAGE凝胶分析BL21(DE3)转化pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA的培养基的结果，如图2所示，可以检测出对应大约50kDa的碱性磷酸酶，暗示了上述系统可以使目的蛋白有效地分泌到培养基中。即，可见在E.coli碱性磷酸酶分泌中出现。分泌的碱性磷酸酶的量通过Bradford方法测量，结果显示在培养基中生产大约0.1g/L的水溶性碱性磷酸酶。
如上所述，可见碱性磷酸酶可以有效地从E.coli BL21(DE3)分泌到培养基中，同样，除了E.coli BL21(DE3)之外，这种蛋白质还分泌自其他的E.coli菌株进入培养基中。上述重组质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA是共转化进入E.coli MC4100[F- araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150(strr)relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR].该转化通过电穿孔实施，该转化菌株选自包含氨苄青霉素抗生素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB平板培养基。该转化菌株接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)并在30℃在培养基中培养，并检查碱性磷酸酶的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中加入0.1和1.0mM的IPTG，以诱导基因表达。在引起基因表达12小时之后，收集1mL培养物并进行SDS-PAGE凝胶分析(图3)，在图3中，“M”表示标准分子量的蛋白质，“1”表示在1mM IPTG中引起表达12小时之后，用SDS-PAGE凝胶分析E.coliMC4100转化pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA的培养基的结果，如图3所示，碱性磷酸酶对应大约50kDa可以被检测出，暗示了上述系统可以将目的蛋白有效地分泌到培养基中。然而，在E.coli MC4100中的碱性磷酸酶的分泌效率要低于在E.coli BL21(DE3)中的分泌效率。
实施例4：分泌自重组E.coli的碱性磷酸酶的活性测量
碱性磷酸酶的活性通过如下方式进行测量(Brickman和Beckwith，JMol.Biol.，96：307，1975).重组E.coli菌株BL21(DE3)与重组质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA共转化接种到含50mL LB介质的250mL烧瓶中在37℃中培养。当用分光光度计测量在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中加入1mM的IPTG，以诱导基因表达。在诱导基因表达12小时之后，收集1mL培养物加入0.1mL氯仿，之后，该混合物在37℃下反应5分钟。反应之后，将0.1mL的0.4％PNPP(p-硝基苯磷酸盐)加入反应混合物，随后在37℃下反应5分钟。反应之后，将0.1mL的1M K2HPO4溶液加入反应物以终止反应。将得到的反应溶液用相应的50mM Tris-HCl溶液进行稀释并在420nm和550nm波长下测量其吸收率。而且在控制实验中，不带质粒的E.coli BL21(DE3)和E.coliBL21(DE3)的培养基与pTrcS1PhoA转化，并以上述同样的方法测量得到碱性磷酸酶的活性。碱性磷酸酶的活性通过如下公式计算，结果显示在下表1中：
活性(U/mL)＝1000×(Abs420nm-1.75×Abs550nm)/[反应时间(min)×反应物体积(mL)]
表1：在重组E.coli菌株中在不同条件下碱性磷酸酶的活性
  重组E.coli   碱性磷酸酶的活性(U/mL)
  E.coli BL21(DE3)   未测得
  E.coli BL21(DE3)(pTrcS1PhoA)，0.1mM诱导剂   未测得
  E.coli BL21(DE3)(pTrcS1PhoA，pACYC-OmpF)，   7500
  0.1mM诱导剂
  E.coli BL21(DE3)(pTrcS1PhoA，pACYC-OmpF)，0.01mM诱导剂 7800
如表1所示，E.coli菌株的培养基与质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA的转化显示出碱性磷酸酶高的活性，其中未转化的E.coli菌株显示出很少或几乎没有活性。碱性磷酸酶在细胞中没有活性，只有通过分泌步骤出现二硫化物结合时才显示活性。由上述实验结果看，碱性磷酸酶生产在转化的重组E.coli菌株中，并以高效率连续地分泌到培养基中。
实施例5：NaCl的浓度对碱性磷酸酶的细胞外分泌的作用
使E.coli BL21(DE3)菌株与重组质粒pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA共转化，所述转化过程通过电穿孔实现，并从含有抗生素氨苄青霉素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB平板培养基中选择转化菌株。将转化的菌株在不同的NaCl浓度中接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和0、1、5和10g/L NaCl)，30℃下培养并检测碱性磷酸酶的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养液中加入0.1和1.0mM的IPTG，以诱导基因表达。在诱导基因表达12小时之后，收集1mL培养物并在SDS-PAGE凝胶中分析(图4)。在图4中，“M”表示标准分子量的蛋白质，“1”到“4”表示用0.1mM IPTG诱导表达12小时之后，用pACYC-OmpF和pTrcS1PhoA转化的E.coli BL21(DE3)培养物的SDS-PAGE凝胶分析结果。也就是说，该数字1-4分别显示结果在不同浓度NaCl中在LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和0、1、5和10g/L NaCl)培养之后得到的结果。如图4所示，可以被检测出对应大约50kDa的碱性磷酸酶，特别是，显示了在培养基中的碱性磷酸酶的分泌随NaCl浓度从0到10g/L的增长而增加。
实施例6：重组质粒psEGF的构建
采用重组质粒G82，嵌入上皮细胞生长因子(EGF)基因，由韩国细胞因子库提供(生命科学系，Jeonbuk大学，Jeonju-si，Jeollabuk-do)，作为模板DNA以获得EGF基因。合成序列为5’-GAACTGCAGCTAATAGTGACYCTGAATGTCCC-3’(序列5)的引物5和序列为5’-GCGGATCCTTATT AGCGCAGTTCCCACCACT-3’(序列6)的引物6并用于PCR。该PCR反应在如下条件下完成：94℃下预变性5分钟；在94℃变性45秒，在56℃下退火45秒，并在72℃下延长30秒；之后，在72℃下延长7分钟，循环30次。通过PCR反应得到的DNA片段在琼脂糖凝胶中作电泳以分离扩增的EGF DNA片段。该分离后的DNA片段在两种限制酶PstI和BamHI中消化。同时，重组质粒pJS101ΔP(Choi，J.H.，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：640，2000)在两种限制酶PstI和BamHI中消化以去除endoxylase基因，并且所得到的质粒与上面得到的DNA片段通过T4DNA连接酶混合和连接，从而得到重组质粒psEGF(图5)。
实施例7：EGF的细胞外分泌和生产
使E.coli BL21(DE3)菌株与重组质粒pACYC-OmpF和psEGF共转化，所述转化过程通过电穿孔实现，并从含有抗生素氨苄青霉素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB板介质中选择转化菌株。将转化的菌株接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和5g/L NaCl)，并检测EGF的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中加入0.1和1.0mM的IPTG，以诱导基因表达。在引起基因表达12小时之后，收集1mL培养物并在Tricine SDS-PAGE(Shagger，H.和von Jogot，G.，Anal.Biochem.，166：368，1987)凝胶中分析。图6显示的是SDS-PAGE之后采用通用染色法的染色结果。在图6中，“M”表示标准分子量的蛋白质，并且“1”表示在0.1mM IPTG中诱导表达12小时之后，用SDS-PAGE凝胶分析BL21(DE3)转化pACYC-OmpF和psEGF的培养基的结果，并且“2”表示在1mM IPTG中诱导表达12小时之后，用SDS-PAGE凝胶分析BL21(DE3)转化pACYC-OmpF和psEGF的培养基的结果。如图6所示，大约36kDa的外部膜蛋白F，结合EGF蛋白(标有箭头)对应大约5kDa可以通过SDS-PAGE检测出。而且，少量的细胞可从浓度为1mM的IPTG中裂解检测到，而且检测到的细胞暗示了上述系统可以将目的蛋白有效地分泌到培养基中。然而，在E.coli MC4100中的碱性磷酸酶的分泌效率要低于在E.coli BL21(DE3)中。并且检测到细胞没有裂解由于蛋白质的性质在浓度为0.1mM的IPTG表达速率没有降低，检测到未被染为蓝色。
因此，，使用300mM CuCl2染色5分钟(Lee，C.等，Anal.Biochem.，166：308，1987)来取代采用普通的考马斯蓝染色方法，同样的样品也可以测得(图7).在图7中，“M”表示标准分子量的蛋白质，并且“1”表示在0.1mM IPTG中诱导表达12小时之后，用SDS-PAGE凝胶分析BL21(DE3)转化pACYC-OmpF和psEGF的培养基的结果，如图7所示，可检测出有效分泌到培养基中的EGF蛋白(标有箭头)。也就是，可见EGF蛋白的分泌出现在E.coli中。分泌的EGF蛋白的量通过Bradford方法测量，结果显示在培养基中以水溶态生产大约0.07g/L的EGF蛋白。
实施例8：木聚糖内切酶的细胞外分泌和生产
重组质粒pJS101ΔP是一种能够从芽孢杆菌向外周胞质表达和分泌木聚糖内切酶的重组载体(Choi，J.H.，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：640，2000)。使E.coli BL21(DE3)菌株与重组质粒pACYC-OmpF和pJS101ΔP共转化，以从E.coli向培养液中分泌和生产木聚糖内切酶。所述转化过程通过电穿孔实现，并从含有抗生素氨苄青霉素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB平板培养基选择转化菌株。将转化的菌株接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和5g/L NaCl)，30℃下在培养基中培养并检测木聚糖内切酶的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中加入0.1mM的IPTG，以诱导基因表达。在诱导基因表达12小时之后，收集1mL培养物并在SDS-PAGE凝胶中分析。在SDS-PAGE分析之后，用通用染色方法将其染色(图8)。在图8中，“M”表示标准分子量的蛋白质，“1”表示用0.1mM IPTG诱导表达12小时之后，仅用pACYC-OmpF转化的BL21(DE3)培养物的SDS-PAGE凝胶分析结果，“2”表示用0.1mM IPTG诱导表达12小时之后，用pACYC-OmpF和pJS101ΔP转化的BL21(DE3)培养物的SDS-PAGE凝胶分析结果。如图7所示，通过SDS-PAGE能够检测到大约36kDa的外膜蛋白F以及对应于大约20kDa的木聚糖内切酶(标有箭头)。结果表明，在培养过程中E.coli中的木聚糖内切酶蛋白有效地分泌到培养液中。
实施例9：人血清瘦素(leptin)蛋白的细胞外分泌和生产
重组质粒pTrcKObD是一种能够向E.coli的外周胞质表达和分泌人血清瘦素(leptin)蛋白的重组载体(Jeong，K.J.和Lee，S.Y.，Biotechnol.Bioeng.，67：398，2000)。使E.coli BL21(DE3)菌株与重组质粒pACYC-OmpF和pTrcKObD共转化，以从E.coli向培养液中分泌和生产人血清瘦素(leptin)蛋白。所述转化过程通过电穿孔实现，并从含有抗生素氨苄青霉素(50μg/L)和氯霉素(34μg/L)的LB平板培养基选择转化菌株。将转化的菌株接种到LB液态培养基中(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，和5g/LNaCl)，30℃下在培养液中培养并检测人血清瘦素(leptin)蛋白的细胞外分泌。当用分光光度计测量接种到液态培养基中之后在600nm波长下的光密度值(O.D.)达到0.7时，向培养介质中分别加入0.1和1.0mM的IPTG，以引起基因表达。在引起基因表达12小时之后，收集1mL培养物并在SDS-PAGE凝胶中分析。在SDS-PAGE分析之后，用通用染色方法将其染色(图9)。在图9中，“M”表示标准分子量的蛋白质，“1”表示用1mMIPTG诱导表达12小时之后，用pACYC-OmpF和pTrcKObD转化的BL21(DE3)培养物的SDS-PAGE凝胶分析结果，“2”表示用0.1mM IPTG诱导表达12小时之后，用pACYC-OmpF和pTrcKObD转化的BL21(DE3)培养物的SDS-PAGE凝胶分析结果。如图9所示，通过SDS-PAGE能够检测到大约36kDa的外膜蛋白F以及对应于大约14kDa的血清瘦素(leptin)蛋白(标有箭头)。而且，当用1mM IPTG的浓度引起表达时，检测到少量的细胞发生了裂解，当用0.1mM IPTG的浓度诱导表达时，没有检测到细胞裂解，并且表达速率没有降低。结果表明，在培养过程中E.coli中的血清瘦素(leptin)蛋白有效地分泌到了培养液中。
如上所述，已经对本发明的特殊部分进行了详细解释，然而，对于本领域技术人员来说显然这些特殊技术仅对应于优选的实施方式，本发明的范围并不受那些实施方式的限制。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等价方式所确定。
工业实用性
如上面详细描述和证明的那样，本发明提供了向细胞培养液中分泌目的蛋白的微生物，以及用于向微生物细胞外部分泌和生产目的蛋白的方法。尽管当使用现有技术的方法来从E.coli向细胞培养液中分泌重组蛋白质时，可以向微生物细胞外部分泌和生产预期的蛋白质，但大多数现有技术的方法会造成一些E.coli的裂解，这样培养液中含有不少量的E.coli的胞内蛋白质从而降低了目的蛋白的浓度，因此造成了纯化过程的难题。相反，在本发明中，利用OmpF启动子同时通过组成性表达的方式使细胞生长，可以表达目的蛋白。因此，目的蛋白的分泌相对细胞浓度的增加而成比例地增加，同时，可以以一种非常有效的方式高纯度地生产目的蛋白。而且，本发明的方法比现有技术更简单。因此根据本发明，利用本发明的微生物可以向细胞培养液中分泌和生产各种目的蛋白。
FP08KR507.ST25.txtSEQUENCE LISTING
<110>韩国科学技术院
<120>通过OmpF和目的蛋白的共表达的目的蛋白细胞外生产方法
<130>FP08KR507
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<160>6
<170>PatentIn version 3.3
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cggaattctg gattataccg acgcag          26
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<223>primer
<400>6
gcggatcctt attagcgcag ttcccaccac t    31

Claims (9)

1.一种用含OmpF编码基因的重组载体和含目的蛋白编码基因的重组载体共转化并且能够向微生物外周胞质中表达和分泌目的蛋白的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物能够通过共表达该OmpF编码基因和目的蛋白编码基因从而向微生物细胞的外部分泌和生产所述目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，含有OmpF编码基因的重组载体和含有目的蛋白编码基因的重组载体具有在同样条件下可表达的起点。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，含OmpF编码基因的重组载体的起点是p15A，并且含目的蛋白编码基因的重组载体的起点是ColE1。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，含OmpF编码基因的重组载体本身具有OmpF启动子。
5.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，含OmpF编码基因的重组载体是重组质粒pACYC-OmpF且具有图1中的基因图谱。
6.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，OmpF编码基因来源于E.coli。
7.根据权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，重组微生物是E.coli。
8.一种获得目的蛋白的细胞外生产的方法，其特征在于，该方法包括的步骤是：
(a)培养根据权利要求1至5中任一项所述的重组微生物，向微生物细胞的外部分泌目的蛋白；和
(b)从培养基中回收目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的获得目的蛋白的细胞外生产的方法，其特征在于，步骤(a)中的目的蛋白的细胞外分泌并不伴随着微生物进行裂解。
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