CN113117053B - 一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于基因重组蛋白Tat‑hMsrA的眼用组合物，包括有基因重组蛋白Tat‑hMsrA，所述组合物的各组分质量配比包括：海藻糖2～8份、基因重组蛋白Tat‑hMsrA 5～10份，小牛血清5～10份，以及稀释液50～70份。本发明还公开了上述眼用组合物的制备方法。本发明具有抗氧化、清除自由基的功效，能够较好地保持基因重组蛋白Tat‑hMsrA的活性，而且具有较佳的保湿效果，对于干眼症和白内障有较佳的预防和缓解症状的效果。
Description
技术领域
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物及其制备方法。
背景技术
大量现代神经科学研究表明，氧自由基介导的病理损伤参与多种神经系统重大疾病的发生和发展。脑部丰富的脂质含量和相对缺乏的抗氧化酶水平使其在氧化应激中更易受损。多种因素(如异常折叠蛋白积聚、缺血再灌注损伤等)通过线粒体有氧呼吸等途径诱导神经元产生更多的活性氧(ROS)，如O2-.、H2O2、OH·和1O2，而衰老过程中常伴有ROS清除系统(如谷胱甘肽还原系统、超氧化物歧化酶等)的减弱，从而导致氧自由基或氧化产物的异常积累，引发神经系统重大疾病的发生。
蛋氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A，MsrA)是目前发现的可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。MsrA在很多生物体中，从进化上非常古老的古细菌大肠杆菌到植物和哺乳动物中均有发现，其抗氧化作用对于生物体的生存具有特别重要的意义。大量研究表明，MsrA是一种存在于生物体中的抗氧化修复因子。过表达MsrA基因可以显著减轻氧化应激引起的人T细胞、人Lens细胞、PC12细胞和WI-38SV40等细胞的损伤和凋亡。
目前，白内障和干眼症等眼部疾病的发病率较高，而且呈低龄化、发病率上升的趋势。目前对于上述疾病并没有较好的预防和早期干预措施。
中国专利“CN101974089B”就公开了融合有TAT蛋白转导结构域和人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA以及硫氧还原蛋白Trx所形成的融合蛋白及其制备方法和在神经细胞保护方面的应用。但是，目前上述蛋白的制备仅仅停留在实验室阶段，规模化量产很难。
目前还未有基因重组蛋白Tat-hMsrA在眼用领域应用的文献报道。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物及其制备方法，具有抗氧化、清除自由基的功效，能够较好地保持基因重组蛋白Tat-hMsrA的活性，而且具有较佳的保湿效果，对于干眼症和白内障有较佳的预防和缓解症状的效果。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物，包括有基因重组蛋白Tat-hMsrA，所述组合物的各组分质量配比包括：海藻糖2～8份、基因重组蛋白Tat-hMsrA5～10份，小牛血清5～10份，以及稀释液50～70份。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述基因重组蛋白Tat-hMsrA的添加量为6～8份。
进一步，所述海藻糖的添加量为4～5份。
进一步，所述稀释液为添加了水溶性羧甲基壳聚糖的电解质溶液。
优选的，所述稀释液中，水溶性羧甲基壳聚糖的质量百分比为0.1～1％。
优选的，所述稀释液中的电解质溶液为氯化钠和氯化钾的混合溶液。
更优选的，所述电解质溶液中氯化钠的质量百分比为0.6～0.85％。
更优选的，所述电解质溶液中氯化钾的质量百分比为0.03～0.05％。
本发明还保护上述眼用组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，将配方量的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到配方量的小牛血清中，低温保存备用；
步骤2)，配置稀释液；
步骤3)，将取配方量的稀释液，加入配方量的海藻糖，混合均匀；
步骤4)，将步骤1)得到的基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清的混合液，取配方量，加入到步骤3)制得的添加了海藻糖的稀释液中，混合均匀；
步骤5)，将步骤4)制得的眼用组合物通过滤膜除菌，而后灌装，制得基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤2)中，所述稀释液的配置采用以下步骤：首先，取配方量的水溶性羧甲基壳聚糖，加注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；其次，取配方量的电解质，直接溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后，加入注射用水，直至各成分至配比浓度，而后将溶液搅拌均匀，制得稀释液。
本发明的有益效果是：本发明产品含有基因重组蛋白Tat-hMsrA，具有抗氧化、消除自由基、抗老化等多种功效，其特殊活性能够有效消除人体眼球细胞的自由基，修复因氧化而导致损伤的眼部细胞，能够对白内障起到预防作用；同时，本发明产品还包括一定含量的海藻糖和稀释液，可以有效保持基因重组蛋白Tat-hMsrA的活性，在常温条件下，能够保障基因重组蛋白Tat-hMsrA在较长时间内具有活性，便于本发明产品的运输和保存；本发明稀释液的比例较高，并且含有小牛血清，能够有效对眼部补液，可以缓解眼部干眼症症状，同时基因重组蛋白Tat-hMsrA的修复作用，对于干眼症也能起到预防和缓解症状的较佳效果。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明所设计的一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物，包括有基因重组蛋白Tat-hMsrA，所述组合物的各组分质量配比包括：海藻糖2～8份、基因重组蛋白Tat-hMsrA 5～10份，小牛血清5～10份，以及稀释液50～70份。
基因重组蛋白Tat-hMsrA是本发明的核心成分，具有抗氧化、修复细胞等多种功效，其特殊活性能够有效消除人体皮肤的自由基，修复因氧化而导致损伤的细胞。本发明所使用的基因重组蛋白Tat-hMsrA的批量化生产可以采用枯草芽孢杆菌增殖的方式生产。具体生产方法可以采用公开号为“CN110387380A”，发明名称为“一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的生产方法”中记载的方法生产。
而基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化可以采用公开号为“CN110283798A”，名称为“一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法”中记载的方法。
本发明是基于目前干眼症的辅助治疗而研发的。目前对于干眼症的辅助治疗一般采用药物治疗和补充泪液为主。近年来，干眼症的治疗开始出现生物治疗的方式，目前有公开文献报道，自体血清对于干眼症具有较好的治疗作用。例如公开号为公开号为DE102015205293A1，发明名称为一种制备滴眼液的方法制备血清滴眼液，对干眼症就有较好的治疗效果。
然而自体血清治疗需要取人体的自体全血，而后通过分离出血清制备。制备的滴眼液需要低温冻存，常温下储存会使得生长因子等活性物质失活，因而使用不便。
而将基因重组蛋白Tat-hMsrA用于干眼症的治疗，目前尚未有任何的公开文献的报道。
发明人发现，以基因重组蛋白Tat-hMsrA，辅以小牛血清，在稀释液稀释后，对于干眼症有较好的辅助治疗效果。基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清中的活性蛋白及生长因子，能够对眼部细胞具有较佳的修复作用，同时能够补充眼部水分，起到同时补充泪液的效果，能够迅速环节干眼症的各种不适感。同时，发明人还发现，引入了基因重组蛋白Tat-hMsrA后，能够对晶状体蛋白的MetO进行修复，从而在抑制晶状体损伤方面具有较佳的功效，对于白内障的辅助治疗和预防也能起到较佳的效果，具有意想不到的效果。
基因重组蛋白Tat-hMsrA的应用难点在于蛋白活性很难保持，采用冻干粉的形态可以保持其活性，但是很难用于滴眼液中。因此基因重组蛋白Tat-hMsrA应用于滴眼液中最大的难点在于需要使蛋白在常温条件下能够长时间保持较高的活性。
本发明辅助添加了：海藻糖4～5份，配合小牛血清共混，能够有效解决基因重组蛋白Tat-hMsrA在常温下保持活性的问题。
海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂。而基因重组蛋白Tat-hMsrA性质很不稳定，单纯依靠海藻糖很难保持其活性。发明人对此进行深入研究后发现，导致基因重组蛋白Tat-hMsrA失活主要有两个因素影响：首先是该蛋白较易凝结成块，导致变性失活；其次是该蛋白对外界刺激和环境影响反应较敏感，些许的外界刺激和环境影响都会导致其失去活性。发明人通过不断试验后发现，以小牛血清和海藻糖共混作为稳定剂，能够有效解决上述问题。
在本发明较为优选的实施方式中，所述稀释液为添加了水溶性羧甲基壳聚糖的电解质溶液。
优选的，所述稀释液中，水溶性羧甲基壳聚糖的质量百分比为0.1～1％。
优选的，所述稀释液中的电解质溶液为氯化钠和氯化钾的混合溶液。
更优选的，所述电解质溶液中氯化钠的质量百分比为0.6～0.85％。
更优选的，所述电解质溶液中氯化钾的质量百分比为0.03～0.05％。
本发明作为干眼症的辅助治疗滴眼液，发明人在考虑基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清的活性保持的同时，也充分考虑了泪液补充的问题。采用上述配比的稀释液，不但能够保湿，还能较好的作为补充泪液，缓解干眼的各种不适感。同时，上述稀释液能够对基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清的活性保持也有较佳的作用。
本发明还保护上述眼用组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，将配方量的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到配方量的小牛血清中，低温保存备用；
步骤2)，配置稀释液；
步骤3)，将取配方量的稀释液，加入配方量的海藻糖，混合均匀；
步骤4)，将步骤1)得到的基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清的混合液，取配方量，加入到步骤3)制得的添加了海藻糖的稀释液中，混合均匀；
步骤5)，将步骤4)制得的眼用组合物通过滤膜除菌，而后灌装，制得基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物。
优选的，所述步骤2)中，所述稀释液的配置采用以下步骤：首先，取配方量的水溶性羧甲基壳聚糖，加注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；其次，取配方量的电解质，直接溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后，加入注射用水，直至各成分至配比浓度，而后将溶液搅拌均匀，制得稀释液。
实施例1
(1)基因重组蛋白Tat-hMsrA的配置：将5份的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到10份的小牛血清中，配成蛋白混合液，4℃低温保存备用。
(2)配置稀释液：取1g羧甲基壳聚糖，加入适量注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；然后加入0.85g氯化钠和0.03g氯化钾，溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后加入注射用水，直至羧甲基壳聚糖、氯化钠和氯化钾的质量百分比浓度达到1％、0.85％和0.03％，搅拌混合均匀，制得稀释液。
(3)海藻糖的添加：取50份的稀释液，添加2份海藻糖，搅拌混合均匀。
(4)滴眼液复配：将蛋白混合液取出，加入到添加了海藻糖的稀释液中，搅拌混合均匀，配置出滴眼液。
(5)灭菌、灌装：将滴眼液通过滤膜过滤除菌，而后灌装，制得本实施例的滴眼液成品。
实施例2
(1)基因重组蛋白Tat-hMsrA的配置：将6份的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到7份的小牛血清中，配成蛋白混合液，4℃低温保存备用。
(2)配置稀释液：取0.4g羧甲基壳聚糖，加入适量注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；然后加入0.7g氯化钠和0.04g氯化钾，溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后加入注射用水，直至羧甲基壳聚糖、氯化钠和氯化钾的质量百分比浓度达到0.4％、0.7％和0.04％，搅拌混合均匀，制得稀释液。
(3)海藻糖的添加：取60份的稀释液，添加4份海藻糖，搅拌混合均匀。
(4)滴眼液复配：将蛋白混合液取出，加入到添加了海藻糖的稀释液中，搅拌混合均匀，配置出滴眼液。
(5)灭菌、灌装：将滴眼液通过滤膜过滤除菌，而后灌装，制得本实施例的滴眼液成品。
实施例3
(1)基因重组蛋白Tat-hMsrA的配置：将8份的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到8份的小牛血清中，配成蛋白混合液，4℃低温保存备用。
(2)配置稀释液：取0.1g羧甲基壳聚糖，加入适量注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；然后加入0.8g氯化钠和0.04g氯化钾，溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后加入注射用水，直至羧甲基壳聚糖、氯化钠和氯化钾的质量百分比浓度达到0.1％、0.8％和0.04％，搅拌混合均匀，制得稀释液。
(3)海藻糖的添加：取70份的稀释液，添加5份海藻糖，搅拌混合均匀。
(4)滴眼液复配：将蛋白混合液取出，加入到添加了海藻糖的稀释液中，搅拌混合均匀，配置出滴眼液。
(5)灭菌、灌装：将滴眼液通过滤膜过滤除菌，而后灌装，制得本实施例的滴眼液成品。
实施例4
(1)基因重组蛋白Tat-hMsrA的配置：将10份的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到5份的小牛血清中，配成蛋白混合液，4℃低温保存备用。
(2)配置稀释液：取0.5g羧甲基壳聚糖，加入适量注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；然后加入0.6g氯化钠和0.05g氯化钾，溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后加入注射用水，直至羧甲基壳聚糖、氯化钠和氯化钾的质量百分比浓度达到0.7％、0.6％和0.05％，搅拌混合均匀，制得稀释液。
(3)海藻糖的添加：取60份的稀释液，添加8份海藻糖，搅拌混合均匀。
(4)滴眼液复配：将蛋白混合液取出，加入到添加了海藻糖的稀释液中，搅拌混合均匀，配置出滴眼液。
(5)灭菌、灌装：将滴眼液通过滤膜过滤除菌，而后灌装，制得本实施例的滴眼液成品。
以家兔通过人工BAC滴眼，破坏和损伤眼表，构建动物实验模型，以市售的爱丽和海露滴眼液为对比例，以本发明的实施例1～4的滴眼液为实施例，对家兔动物模型进行滴眼治疗实验。
实验选取72只健康的，年龄在6周、体重在2～2.5kg的家兔，分为6组，每组12只。通过每日两次的人工BAC滴眼，连续12天后检查全部72只家兔的眼表受损情况，如未达标则继续BAC滴眼1～2天，直至全部72只家兔眼表损伤，完成干眼症动物模型的构建。由于BAC本身具有较强的抑菌作用，因此建模过程中不进行抗生素注射，避免药物对实验结果产生影响。
对6组家兔进行对比例和实施例滴眼液的滴眼治疗，4周后对各组进行对各组进行SIT检查，判断辅助治疗效果，具体数据见表1。
| 类目 | 治疗前SIT(mm/5min) | 治疗后SIT(mm/5min) |
| 爱丽 | 4.97±1.32 | 4.56±1.61 |
| 海露 | 5.04±1.41 | 4.73±1.57 |
| 实施例1 | 5.13±1.53 | 5.21±1.69 |
| 实施例2 | 4.79±1.42 | 4.87±1.48 |
| 实施例3 | 4.64±1.47 | 4.92±1.71 |
| 实施例4 | 5.02±1.39 | 5.08±1.63 |
表1家兔实验SIT检查数据表
通过表1的数据可以看出，采用本发明实施例1～4的滴眼液，对于干眼症具有抑制的作用，滴眼4周后，干眼症得到了有效的抑制，病情不再恶化。而对比例的滴眼液，滴眼4周后，干眼症病情发生了一定程度的恶化。由此可见，本发明对于干眼症具有较佳的辅助治疗作用。
以本发明实施例3、4的滴眼液为实施例，以空白组为对比例验证本发明对白内障的辅助治疗功效。选取4组SD大鼠，共48只，每组12只，通过喂食半乳糖2周，建立白内障模型。以两组SD大鼠在建模过程中每日进行滴眼治疗2次，分别以实施例3、4的滴眼液滴眼；另两组不进行滴眼治疗，正常喂食建模，作为空白组。两周后通过在裂隙灯下观察晶状体浑浊程度，以现有建模的标准进行浑浊程度评级。
发明人建模两周后，空白组的SD大鼠浑浊程度均超过Ⅲ期，建模成功。而以实施例3、4的滴眼液滴眼的两组SD大鼠的浑浊程度超过Ⅰ期，部分达到Ⅱ期，还需要继续喂食完成建模。通过上述建模实验可知，本发明对于白内障也具有抑制发病的作用，具有一定的辅助治疗和预防效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物，其特征在于，包括有基因重组蛋白Tat-hMsrA，所述组合物的各组分质量配比为：海藻糖5份、基因重组蛋白Tat-hMsrA 8份，小牛血清8份，以及稀释液70份；
所述稀释液为添加了水溶性羧甲基壳聚糖的电解质溶液，稀释液中，水溶性羧甲基壳聚糖的质量百分比为0.1％；
所述稀释液中的电解质溶液为氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述电解质溶液中氯化钠的质量百分比为0.8％，所述电解质溶液中氯化钾的质量百分比为0.04％。
2.一种权利要求1所述的一种基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)，将配方量的基因重组蛋白Tat-hMsrA加入到配方量的小牛血清中，低温保存备用；
步骤2)，配置稀释液；
步骤3)，将取配方量的稀释液，加入配方量的海藻糖，混合均匀；
步骤4)，将步骤1)得到的基因重组蛋白Tat-hMsrA和小牛血清的混合液，取配方量，加入到步骤3)制得的添加了海藻糖的稀释液中，混合均匀；
步骤5)，将步骤4)制得的眼用组合物通过滤膜除菌，而后灌装，制得基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物。
3.根据权利要求2所述的基于基因重组蛋白Tat-hMsrA的眼用组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述稀释液的配置采用以下步骤：首先，取配方量的水溶性羧甲基壳聚糖，加注射用水，浸泡溶胀，直至充分溶解；其次，取配方量的电解质，直接溶解于羧甲基壳聚糖溶液中；最后，加入注射用水，直至各成分至配比浓度，而后将溶液搅拌均匀，制得稀释液。
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