CN103800892A - 一种滴眼液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滴眼液及其制备方法,该治疗角膜病滴眼液的配方按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液;该治疗角膜病滴眼液的制备方法包括以下步骤:通过按滴眼液的配方,将增稠剂、牛血清、抗生素和重组Nodinhibit-1蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀,用酸碱调节剂调pH值为7.2~7.4,用渗透压缓冲剂调渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。本发明方法简单、可靠,且易于实施;成分简单,成本相对较低,配制方便。本发明没有添加激素类成分,可长期使用,大大减少用药期间并发症和后遗症的发生;加入了牛血清,可以显著减少使用其他血清的不良反应。
Description
技术领域
本发明属于角膜病治疗技术领域,尤其涉及一种滴眼液及其制备方法。
背景技术
角膜病是我国的主要致盲眼病之一,是引起视力丧失的第二位主要病因,每年因角膜炎、角膜损伤等造成的新增角膜盲为150~200万,严重威胁着患者的健康。而在角膜病中,感染性角膜炎占有重要地位,初步保守估计全球每年50万人发生感染性角膜炎。因角膜位置靠前,受损伤感染的机会较大,所以当角膜受到外伤或病原微生物的侵袭时,极容易发生感染性炎症。角膜在正常生理状态下透明无血管,而角膜缘血供丰富,及角膜周边部存在许多免疫相关的细胞和活性分子,所以当角膜遭遇细菌等病原微生物入侵时,角膜上皮作为抵御病原微生物侵袭角膜的第一道屏障,或通过调动角膜周边部的体液及细胞免疫等防御机制,来抑制致病因子对角膜的侵袭,以阻止角膜的进一步损害。随着角膜炎的病理变化过程的推进,若角膜炎症持续时间较短,角膜炎症反应程度逐渐减轻,并伴随着新生血管进入角膜,最终角膜各层组织修复,遗留厚薄不等的瘢痕。但是任何性质的角膜炎,若炎症持续时间长,都可引起角膜新生血管导致角膜失去透明性从而引起视力不同程度的下降,所以角膜病最主要的致盲原因是角膜持续长时间的炎症状态导致的角膜新生血管化,同时治疗药物的作用局限也是一个关键问题。目前,由于参与角膜新生血管形成及角膜炎症的因素较多,有关其发生机制、病理过程、以及有效治疗手段等诸多方面的问题还尚未完全阐明。所以对于角膜新生血管及角膜炎症的药物研究,有望解决角膜创口愈合困难和术后免疫排斥反应二大关键问题,是目前治疗角膜盲的新途径。因此,如何寻找新的药物治疗这两类主要角膜疾病已经成为当前眼科界研究的一个热点和难点。
天然免疫系统存在于所有多细胞动物中,当机体接触致病微生物后迅速对病原体进行识别并产生抵抗病原体入侵的反应,发挥这一功能的主要是天然免疫细胞,这些细胞表达模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs),而PRRs可识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs)。现已证实,哺乳动物具有两个微生物识别系统,一个识别系统是由Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)的膜结合受体家族组成,TLR在天然免疫及获得性免疫中起着关键作用,这一家族中具有代表性的是TLR4;另一个识别系统是苷酸结合寡聚域(nucleotide-bindingoligomerzation domain,NOD)的蛋白质家族,现已发现20多个成员,其中最具有代表性的是NOD-1和NOD2,此两种蛋白属于胞浆蛋白,NOD-1广泛表达于成人组织细胞;NOD-2主要表达于髓源性细胞,肠上皮细胞,它们通过识别细菌细胞壁成分-肽聚糖(PGN)的降解产物而起到抗细菌感染等作用。目前已有研究发现,鼠类,犬类及人类的角膜上皮细胞胞浆中有NOD-1和NOD-2蛋白的表达。它们可作为一种胞内PRRs参与角膜炎症反应,并且与角膜新生血管的形成有着密切关系。Kim等学者在研究鼠角膜碱烧伤模型诱导角膜新生血管形成的过程中发现,Nodinhibit-1信号通路在角膜新生血管的形成中具有促进作用。该研究结果显示:Nodinhibit-1蛋白受体激动剂使血管性生成因子(VEGF、b-FGE、TGF-B1)的表达量上升从而促进角膜新生血管的形成,而且还通过作用于下游信号通路分子RICK/Rip2等,最终激活NF-kB,促进促炎细胞因子的转录而介导天然免疫反应;为进一步阐明Nodinhibit-1信号通路在角膜新生血管形成中的作用,用Nodinhibit-1蛋白受体激动剂治疗RICK基因敲出的角膜新生血管鼠模型,结果显示角膜新生血管数量明显减少,这说明Nod-1信号通路在介导角膜新生血管的形成及角膜炎症状态有着密切联系,这就为研发新的抗角膜新生血管及抗炎药提供新的治疗靶点。
临床上应用的大多数抗炎滴眼液产品多含有激素类成分,长期使用不但严重影响患者的眼表微环境,还增加患者患白内障,青光眼的风险,部分抗炎药物还有相关的并发症如氯霉素滴眼液大剂量用药可致眼睑、角膜水肿,眼球运动受限及视盘萎缩,长期应用可致再生障碍性贫血等;抗新生血管药物,如青蒿琥酯滴眼液,成分比较复杂,效果尚不够肯定,且没有抗炎作用;强力霉素滴眼剂是目前治疗炎症的有效药物,但目前我国尚无正式商品化的制剂。目前我们通过查阅国内外大量相关文献,得知Nodinhibit-1胞浆蛋白受体与病原微生物的病原体相关分子模式识别结合后启动天然免疫反应,以抗细胞内病原菌感染。最新国外研究表明NOD-1蛋白受体刺激物激活NOD-1蛋白信号通路,促进角膜新生血管的形成及角膜炎性因子的表达。研究Nodinhibit-1蛋白滴眼液在抗角膜新生血管及角膜炎症中的作用及效果,可能会对角膜疾病的防治开辟一条崭新的思路。
迄今为止对于角膜炎及角膜炎继发角膜新生血管的治疗,仍然是所有眼科医师治疗过程中一个棘手的难题,角膜炎的预后仍然不容乐观,其治疗原则是控制感染、减轻炎症反应、促进愈合、减少瘢痕形成,但在实际临床治疗当中,各种类型的抗炎,抗感染及促进角膜愈合的滴眼液产品药效不一,所以临床上多采用联合用药的方法以提高疗效,而且用于治疗的滴眼液中主要以抗炎,促进角膜愈合为主,而对于具有抗角膜新生血管及抗炎双重药效的滴眼液产品,目前市面上尚无此类药物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种滴眼液及其制备方法,旨在解决现有缺少具有抗角膜新生血管及抗炎双重药效的滴眼液产品的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种滴眼液,该治疗角膜病滴眼液的配方按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白(Nod1抑制剂,ML130:imidazol-2-amine)5%~20%,余为平衡盐溶液。
进一步,该治疗角膜病滴眼液按体积百分比的最佳比例为:牛血清0.5%~2.5%,增稠剂9.5%~11.5%、酸碱调节液2%~3%,抗生素1%~1.5%,重组Nodinhibit-1蛋白10%~15%,余为平衡盐溶液。
进一步于,平衡盐溶液采用PBS溶液;牛血清采用胎牛血清,增稠剂为硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆或壳聚糖。
进一步,牛血清尤其选择特级胎牛血清,特级胎牛血清是在无菌条件下通过心脏穿刺的方式采血取到,经过40nm正压气流过滤的胎牛血清,毒素含量不大于10EU/ml,血红蛋白含量不大于0mg/dl,按体积百分比,牛血清的浓度为1%~15%,最好为10%。
进一步,酸碱调节剂选自碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES羟乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸-硼砂缓冲中的一种,渗透压缓冲剂选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一种,抗生素选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素中的一种。
进一步,酸碱调节剂最好选用HEPES羟乙基哌嗪乙硫磺酸;抗生素最好采用妥布霉素。
本发明实施例的另一目的在于提供一种滴眼液的制备方法,该治疗角膜病滴眼液的制备方法包括以下步骤:
步骤一,按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;
步骤二,将增稠剂、牛血清、抗生素和重组Nodinhibit-1蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀,用酸碱调节剂调pH值为7.2~7.4,用渗透压缓冲剂调渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
进一步,步骤二还可以将重组Nodinhibit-1蛋白制成无菌微粉,将牛血清溶解于平衡盐溶液中,酸碱调节剂调节PH值为7.2~7.4,膜过滤除菌,然后将重组Nodinhibit-1粉末溶于该溶液中,即得Nodinhibit-1滴眼液。
进一步,该滴眼液的制备方法步骤为:
按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L;
将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加PBS溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
进一步,该滴眼液的制备方法步骤为:
按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L;
将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4mlPBS,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液。
本发明提供的滴眼液及其制备方法,通过按滴眼液的配方,将增稠剂、牛血清、抗生素和重组Nodinhibit-1蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀,用酸碱调节剂调pH值为7.2~7.4,用渗透压缓冲剂调渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液;或按滴眼液的配方,将重组Nodinhibit-1蛋白制成无菌微粉,将牛血清溶解于平衡盐溶液中,酸碱调节剂调节PH值为7.2~7.4,膜过滤除菌,然后将重组Nodinhibit-1粉末溶于该溶液中,即得Nodinhibit-1滴眼液。
本发明具有以下优点:
(1)制作流程简单、可靠,且易于实施;
(2)滴眼液成分简单,成本相对较低,配制方便;
(3)本发明没有添加激素类成分,可以可长期使用,大大减少用药期间并发症和后遗症的发生;
(4)本发明添加抗生素后无污染,病原菌培养观察发现此滴眼液能较长时间保存(3个月),应用于大鼠角膜碱烧伤模型后发现不仅可以预防和治疗角膜新生血管的发生,而且对控制角膜炎症也发挥了一定的作用;
(5)本发明加入了牛血清,无病原微生物,低内毒素,低补体,可以显著减少使用其他血清的不良反应;
(6)本发明加入了一定剂量的增稠剂,可明显提高药物的舒适度;
(7)同时本发明可方便临床医生工作,为术前控制和稳定角膜新生血管及角膜炎症性疾病患者的病情提供更合理的手术时机;
(8)本发明不仅可以用于抗角膜新生血管及角膜炎症性疾病,同时将为其作用机制的进一步研究提供重要的线索和技术支持。
本发明的Nodinhibit-1滴眼液不仅可以预防和治疗角膜新生血管发生,而且能控制角膜炎症,为将来用于各种炎症或相关新生血管性疾病的药物治疗奠定了基础,并能被广大患者接受而应用于临床。
附图说明
图1为Nodinhibit-1滴眼液制备流程框图。
图2为不同浓度NOD-1重组蛋白上调巨噬细胞培养液中NO情况。
图3为不同浓度NOD-1重组蛋白上调巨噬细胞培养液中TNF-α情况。
图4为不同浓度NOD-1重组蛋白上调巨噬细胞培养液中IL-6情况。
图5为不同浓度NOD-1重组蛋白上调巨噬细胞培养液中IL-1β情况。
图6为巨噬细胞在PBS培养液中培养48h的细胞凋亡情况。
图7为巨噬细胞在含10.0μg/ml重组Nod-1蛋白培养液中培养48h的细胞凋亡情况。
图8为不同浓度Nod-1重组蛋白连续作用24,48,72小时,HUVEC在细胞增殖实验中的情况。
图9为10.0μg/mlNOD-1蛋白抑制HUVEC的粘附情况。
图10为10.0μg/mlNOD-1蛋白促进HUVEC侵袭情况。
图11为大鼠角膜碱烧伤后应用浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液14天角膜裂隙灯的情况,
图12为大鼠角膜碱烧伤后应用PBS滴眼液14天在角膜裂隙灯的情况,
图13为大鼠角膜碱烧伤后给予浓度为10μg/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼1,4,7,14天角膜炎症指数情况。
图14为大鼠角膜碱烧伤后给予浓度为10μg/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼1,4,7,14天角膜新生血管长度情况。
图15为大鼠角膜碱烧伤后给予浓度为10μg/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼1,4,7,14天角膜新生血管面积情况。
图16为大鼠角膜碱烧伤后给予浓度为10μg/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼1,4,7,14天角膜上皮修复面积情况。
图17为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜VEGF的变化情况,
图18为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜PEDF的变化情况,
图19为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用PBS滴眼液14天VEGF的变化情况,
图20为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用PBS滴眼液14天PEDF的变化情况,
图21为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜TNF-α的变化情况,
图22为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜CD31的变化情况,
图23为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用PBS滴眼液14天TNF-α的变化情况,
图24为在大鼠角膜碱烧伤后连续应用PBS滴眼液14天CD31的变化情况,
图25为大鼠角膜碱烧伤10天后应用浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液14天角膜裂隙灯的情况,
图26为大鼠角膜碱烧伤10天后应用PBS滴眼液14天在角膜裂隙灯的情况,
图27为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜VEGF的变化情况,
图28为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜PEDF的变化情况,
图29为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用PBS滴眼液14天VEGF的变化情况,
图30为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用PBS滴眼液14天PEDF的变化情况,
图31为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜TNF-α的变化情况,
图32为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜CD31的变化情况,
图33为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用PBS滴眼液14天TNF-α的变化情况,
图34为在大鼠角膜碱烧伤10天后连续应用PBS滴眼液14天CD31的变化情况,
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例的治疗角膜病滴眼液的配方:按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液;最好为牛血清0.5%~2.5%,增稠剂9.5%~11.5%、酸碱调节液2%~3%,抗生素1%~1.5%,重组Nodinhibit-1蛋白10%~15%,余为平衡盐溶液;
平衡盐溶液最好采用PBS溶液,PBS溶液是最常用的平衡盐溶液,也是抗炎药物的基础溶液,其成分包含了部分离子成分,可以满足用药期间阴阳离子平衡和渗透压的需要;
牛血清最好采用胎牛血清,尤其是特级胎牛血清,特级胎牛血清是在无菌条件下通过心脏穿刺的方式采血取到,经过40nm正压气流过滤的胎牛血清,具有极佳的促细胞生长作用及产品稳定性,内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤10mg/dl,按体积百分比,牛血清的浓度为1%~15%,最好为10%;
增稠剂最好选自硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖等中的至少一种;
酸碱调节剂选自碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES羟乙基哌嗪乙硫磺酸,分子式为C8H18N2O4S)、硼酸-硼砂缓冲对等中的一种,最好选用作用较强的HEPES;
渗透压缓冲剂最好选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖等中的一种,渗透压缓冲剂的用量参照眼科制剂标准;
抗生素选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素等中的一种,最好采用妥布霉素;滴眼液:以10ml计,含有重组Nodinhibit-1蛋白10μg,PH值为7.2~7.4。
如图1所示,本发明的治疗角膜病滴眼液的制备方法包括以下步骤:
S101:按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;
S102:将增稠剂、牛血清、抗生素和重组Nodinhibit-1蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀,用酸碱调节剂调pH值为7.2~7.4,用渗透压缓冲剂调渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液;
步骤S102还可以为将重组Nodinhibit-1蛋白制成无菌微粉,将牛血清溶解于平衡盐溶液中,酸碱调节剂调节PH值为7.2~7.4,膜过滤除菌,然后将重组Nodinhibit-1粉末溶于该溶液中,即得Nodinhibit-1滴眼液。
结合本发明的具体实施例对本发明做进一步的说明:
按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L(图1)。
实施例1
以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L。
制备方法1:将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加PBS溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
制备方法2:将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4mlPBS,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液.
实施例2
以10ml滴眼液计,以7.4mlHBSS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L。
制备方法1:将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlHBSS溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加HBSS溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
制备方法2:将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4mlHBSS,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液.
实施例3
以10ml滴眼液计,以7.4ml生理盐水为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L。
制备方法1:将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2ml生理盐水溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加生理盐水溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
制备方法2:将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4ml生理盐水,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液.
实施例4
以10ml滴眼液计,以7.4ml林格氏液为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L。
制备方法1:将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2ml林格氏液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加林格氏液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
制备方法2:将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4ml林格氏液,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液.
实施例5
以10ml滴眼液计,以7.4mlHanks溶液为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L。
制备方法1:将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlHanks溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加Hanks溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
制备方法2:将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4mlHanks溶液,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液.
实施例6
以下给出一种优化的Nod-1滴眼液在体外影响巨噬细胞功能的初步实验研究:
目的:了解不同浓度重组Nod-1蛋白在体外对巨噬细胞分泌和凋亡的影响。
方法:采用巨噬细胞RAW264.7进行细胞培养,然后在培养液中分别加入PBS,1%BSA,1.0μg/ml,10.0μg/ml和50.0μg/ml重组Nod-1蛋白,利用Elisa观察各组培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β及NO变化情况,Dead和Live试验观察巨噬细胞凋亡情况。
结果:Elisa实验显示了1.0μg/ml,10.0μg/ml和50.0μg/ml重组Nod-1蛋白能促进巨噬细胞分泌促炎症介质TNF-α、IL-6、IL-1β及NO,而且呈浓度依赖性;Dead和Live试验显示10.0μg/ml重组Nod-1蛋白能抑制巨噬细胞凋亡(P值均<0.05)。
结论:10μg/mlNOD-1促进巨噬细胞分泌促炎症介质TNF-α、IL-6、IL-1β及NO,抑制巨噬细胞凋亡。
参见图2-5,巨噬细胞RAW264.7在相同密度接种后,分别给予1.0μg/ml,10.0μg/ml和50.0μg/ml重组Nod-1蛋白,连续处理48h情况,Elisa实验显示不同浓度NOD-1重组蛋白能上调巨噬细胞培养液中NO(图2)、TNF-α(图3)、IL-6(图4)、IL-1β(图5)促炎性因子的表达。Dead和Live试验显示加入PBS组巨噬细胞凋亡明显(图6),而10.0μg/ml重组Nod-1蛋白组巨噬细胞凋亡减少(图7)。
实施例7
以下给出一种优化的Nod-1蛋白在体外影响人脐静脉内皮细胞HUVEC功能的初步实验研究:
目的:了解不同浓度重组Nod-1蛋白在体外对HUVEC细胞增殖、粘附、侵袭的影响。
方法:采用HUVEC进行细胞培养,然后在培养液中分别加入PBS,1%BSA,0.5μg/ml,1.0μg/ml,5.0μg/ml,10.0μg/ml和50.0μg/ml重组Nod-1蛋白,利用CCK8实验、细胞粘附试验、细胞侵袭试验、流式细胞检测HUVEC细胞增殖、粘附、及侵袭情况。
结果:CCK8实验结果显示PBS组,1%BSA组明显高于重组Nod-1蛋白各组(P值均<0.05),重组Nod-1蛋白浓度在0.5μg/ml-10μg/ml时,重组Nod-1蛋白组HUVEC细胞在36h,48h,72h增殖速度明显与重组Nod-1蛋白浓度呈正相关,各组间比较差异具有统计学意义(P值均<0.05),但Nod-1蛋白Nod-1蛋白细胞在10μg/ml与50μg/ml重组Nod-1蛋白组在各时间的增殖速度比较差异无统计学意义(P值均>0.05)。细胞粘附试验显示10.0μg/mlNOD-1蛋白能抑制HUVEC的粘附功能;细胞侵袭试验结果说明10.0μg/mlNOD-1能促进HUVEC侵袭。
结论:0.5μg/ml,1.0μg/ml,5.0μg/ml,10μg/ml重组Nod-1蛋白和50μg/ml重组Nod-1蛋白在体外对HUVEC的增殖均有抑制作用。试验显示10.0μg/mlNOD-1蛋白能抑制HUVEC的粘附,促进HUVEC侵袭。
参见图8,CCK8实验结果显示PBS组HUVEC细胞在36h,48h,72h增殖速度较快,而浓度为0.5μg/ml,1.0μg/ml,5.0μg/ml,10μg/ml重组Nod-1蛋白和50μg/ml重组Nod-1蛋白增殖速度明显偏慢,两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均<0.05),说明HUVEC细胞的增殖明显受到浓度为10μg/ml重组Nod-1蛋白的限制。细胞粘附试验显示10.0μg/mlNOD-1蛋白能抑制HUVEC的粘附功能(图9);细胞侵袭试验结果说明10.0μg/mlNOD-1能促进HUVEC侵袭(图10)。在图8中,横坐标为作用时间,纵坐标为在酶标仪下,HUVEC细胞增殖过程中测得450nm波长的OD值。
实施例8
以下给出一种优化的Nodinhibit-1滴眼液抑制大鼠角膜新生血管和炎症的初步实验研究
目的:了解10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液对大鼠角膜碱烧伤模型中新生血管和炎症反应的影响。
方法:先将32只Wistar大鼠用1%NaOH制作角膜碱烧伤模型,然后将模型动物平均分为两组,一组给予PBS滴眼液,另一组给予10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液,连续点眼14天后,观察两组大鼠角膜新生血管生长和炎症指数情况。取点药14天后角膜,采用免疫荧光染色和免疫组织化学对比两组TNF-α、VEGF、PEDF以及CD31表达情况。先将32只Wistar大鼠用1%NaOH制作角膜碱烧伤模型,然后将模型动物平均分为两组,一组给予PBS滴眼液,另一组给予10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液,连续点眼14天后,观察两组大鼠角膜新生血管生长和炎症指数情况。取点药14天后角膜,采用免疫荧光染色和免疫组织化学对比两组TNF-α、VEGF、PEDF以及CD31表达情况。
结果:在连续用药14天后,10μg/ml Nodinhibit-1组的角膜炎症指数分别为0.31±0.16,明显优于PBS滴眼液组的0.43±0.12,新生血管长度和面积分别为32±3.26mm2和1.15±0.18mm,明显小于PBS滴眼液组的65±4.32mm2和2.85±0.22mm,免疫荧光染色结果显示VEGF、及TNF-α在10μg/mlNodinhibit-1组明显下调,PEDF在10μg/mlNodinhibit-1组明显上调,两组差异有统计学意义(P值均<0.05),免疫组织化学结果显示CD31在10μg/mlNodinhibit-1组明显下调,两组差异有统计学意义(P值<0.05)。
结论:10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液能显著抑制大鼠碱烧伤角膜的新生血管形成和炎症反应发生。
参见图11-24,大鼠角膜碱烧伤模型制作后,给予浓度为10μg/mlNodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼14天,大鼠角膜新生血管和炎症反应的改变情况.图11,12为浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液(图11)和PBS滴眼液(图12)在碱烧伤后14天角膜裂隙灯的情况,图13-16为碱烧伤后1,4,7,14天角膜炎症指数(图13)、角膜新生血管长度(图14)和面积(图15)、角膜上皮修复面积(图16)的变化情况,结果显示浓度为10μg/ml Nodinhibit-1炎症指数、角膜新生血管长度和面积明显少于PBS滴眼液组,角膜上皮面积多于PBS滴眼液组,两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值<0.05),说明浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液能有效控制炎症,促进角膜上皮修复,抑制大鼠碱烧伤角膜的新生血管形成.图17,18为在碱烧伤后连续应用浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液14天时角膜VEGF(图17)和PEDF(图18)的变化情况,图19,20为PBS滴眼液应用14天后角膜VEGF(图19)和PEDF(图20)的变化情况,显示浓度为10μg/ml Nodinhibit-1组VEGF明显下调而PEDF明显上调,两者比较存在有统计学意义(P<0.05),说明了浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液是通过使VEGF表达下降而使PEDF表达升高而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的.图21,22为在碱烧伤后连续应用浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液14天时角膜TNF-α(图21)和CD31(图22)的变化情况,图23,24为PBS滴眼液应用后角膜TNF-α(图23)和CD31(图24)的变化情况,,结果显示浓度为10μg/ml Nodinhibit-1组TNF-α和CD31明显下调,两者比较存在有统计学意义(P<0.05),说明了浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液也通过使TNF-α和CD31表达下降而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的.
实施例9
以下给出一种优化的Nodinhibit-1滴眼液在大鼠角膜新生血管回退中的初步作用研究
目的:了解10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液对大鼠角膜新生血管形成后的影响。
方法:先将32只Wistar大鼠用1%NaOH制作角膜碱烧伤模型,待新生血管形成10天后,将这些大鼠平均分为两组,一组给予PBS滴眼液,另一组给予10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液,分别连续点眼14天后,观察两组大鼠角膜新生血管生长和情况。取点药14天后角膜,采用免疫荧光染色和Westernblot技术对比两组TNF-α、VEGF以及PEDF表达情况。
结果:新生血管形成10天后连续用药14天显示,免疫荧光染色结果显示VEGF、及TNF-α在10μg/mlNodinhibit-1组明显下调,PEDF在10μg/ml Nodinhibit-1组明显上调,两组差异有统计学意义(P值均<0.05)。
结论:10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液能使大鼠碱烧伤模型中已经形成的角膜新生血管回退。
参见图25-34,大鼠角膜碱烧伤模型制作10天后,给予浓度为10μg/ml Nodinhibit-1和PBS滴眼液连续点眼14天,大鼠角膜新生血管的改变情况.图25,26为浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液(图25)和PBS滴眼液(图26)在碱烧伤10天后连续应用14天角膜裂隙灯的情况,图27,28为在碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/mlNodinhibit-1滴眼液14天时角膜VEGF(图27)和PEDF(图28)的变化情况,图29,30为在碱烧伤10天后连续应用PBS滴眼液14天时角膜VEGF(图29)和PEDF(图30)的变化情况,结果显示浓度为10μg/ml Nodinhibit-1组VEGF明显下调而PEDF明显上调,两者比较存在有统计学意义(P<0.05),说明了浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液是通过使VEGF表达下降而使PEDF表达升高而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的.图31,32为在碱烧伤10天后连续应用浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液14天时角膜TNF-α(图31)和CD31(图32)的变化情况,图33,34为PBS滴眼液应用后角膜TNF-α(图33)和CD31(图34)的变化情况,结果显示浓度为10μg/ml Nodinhibit-1组TNF-α和CD31明显下调,两者比较存在有统计学意义(P<0.05),说明了浓度为10μg/ml Nodinhibit-1滴眼液也通过使TNF-α和CD31表达下降而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的.
本发明不仅可以预防和治疗角膜新生血管发生,而且能控制角膜炎症,将来可能会用于各种炎症或相关新生血管性疾病的药物治疗,并能被广大患者接受而应用于临床。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种滴眼液,其特征在于,该滴眼液的配方按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液。
2.如权利要求1所述的滴眼液,其特征在于,该滴眼液的配方按体积百分比的最佳比例为:牛血清0.5%~2.5%,增稠剂9.5%~11.5%、酸碱调节液2%~3%,抗生素1%~1.5%,重组Nodinhibit-1蛋白10%~15%,余为平衡盐溶液。
3.如权利要求1所述的滴眼液,其特征在于,平衡盐溶液采用PBS溶液;牛血清采用胎牛血清,增稠剂为硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆或壳聚糖。
4.如权利要求3所述的滴眼液,其特征在于,牛血清尤其选择特级胎牛血清,特级胎牛血清是在无菌条件下通过心脏穿刺的方式采血取到,经过40nm正压气流过滤的胎牛血清,毒素含量不大于10EU/ml,血红蛋白含量不大于0mg/dl,按体积百分比,牛血清的浓度为1%~15%,最好为10%。
5.如权利要求1所述的滴眼液,其特征在于,酸碱调节剂选自碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES羟乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸-硼砂缓冲中的一种,渗透压缓冲剂选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一种,抗生素选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素中的一种。
6.如权利要求5所述的滴眼液,其特征在于,酸碱调节剂最好选用HEPES羟乙基哌嗪乙硫磺酸;抗生素最好采用妥布霉素。
7.一种滴眼液的制备方法,其特征在于,该滴眼液的制备方法包括以下步骤:
步骤一,按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;
步骤二,将增稠剂、牛血清、抗生素和重组Nodinhibit-1蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀,用酸碱调节剂调pH值为7.2~7.4,用渗透压缓冲剂调渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤二还可以将重组Nodinhibit-1蛋白制成无菌微粉,将牛血清溶解于平衡盐溶液中,酸碱调节剂调节PH值为7.2~7.4,膜过滤除菌,然后将重组Nodinhibit-1粉末溶于该溶液中,即得Nodinhibit-1滴眼液。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,该治疗角膜病滴眼液的制备方法步骤为:
按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L;
将100μg重组Nodinhibit-1蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中,然后和200μl胎牛血清,1MHEPES200μl及10%妥布霉素100μl混合均匀,补加PBS溶液于10ml,调节PH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,经0.2μm膜过滤除菌,即得Nodinhibit-1滴眼液。
10.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,该治疗角膜病滴眼液的制备方法步骤为:
按滴眼液的配方,按体积百分比包括:牛血清0.1%~5%,增稠剂5%~15%、酸碱调节液1%~5%,抗生素0.5%~2%,重组Nodinhibit-1蛋白5%~20%,余为平衡盐溶液,准备材料;以10ml滴眼液计,以7.4mlPBS为基础溶液,含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl,妥布霉素100μl,重组Nodinhibit-1蛋白2ml,pH值为7.2-7.4,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L;
将100μgNodinhibit-1制成无菌微粉,将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1MHEPES200μl、10%妥布霉素100μl及9.4mlPBS,调节PH值为7.2-7.4,经0.2μm膜过滤除菌,然后将Nodinhibit-1粉末溶于该溶液溶液中,渗透压为350mOsm/L~380mOsm/L,即得Nodinhibit-1滴眼液。
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