CN105214071A - 一种纤连蛋白类滴眼液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白类滴眼液，其特有成分为纤连蛋白，同时含有玻璃酸钠，以及pH调节剂、渗透压调节剂，不含防腐剂，采用单剂量包装。本发明滴眼液适用于顽固性角膜上皮损伤、各种原因的角膜上皮病变、角膜炎等眼部疾病。

Description

一种纤连蛋白类滴眼液及其制备方法

技术领域

本发明涉及药学或保健品领域，更具体地，本发明涉及一种含蛋白类滴眼液及其制备方法。

背景技术

纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种高分子糖蛋白。纤连蛋白主要功能是介导细胞粘着。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。大量的研究和临床应用已证明，FN在伤口的修复和愈合中起着十分重要的作用，是促进伤口愈合的关键物质。国外已进行了人血浆FN在烧伤、创伤、败血症、感染等方面的应用研究。中国医学科学院基础医学研究所等单位的研究结果也证明：将FN与一些介质配合作为外用药膏治疗受机械创伤和烧伤的大鼠，伤口愈合时间比对照组减少1/3—1/2，无感染、无疤痕、无任何副作用。在眼科方面也有不少研究：对患有营养型角膜溃疡的病人，用一些介质混合FN，以眼药形式对病人进行治疗，用药2天后，表皮便开始大量增生。三周后，溃疡完全消失，未产生疤痕及副作用。将FN应用于治疗顽固性角膜上皮损害、角膜炎等眼科疾病获得显著疗效。成都军区昆明总医院做的大鼠实验结果为：实验组较对照组再生表皮平均长89.27um，差异显著。虽然FN在眼科上已有研究，但是真正形成滴眼液的产品很少，不能满足临床需求。

玻璃酸钠又名透明质酸钠(SodiumHyaluronate,HA-Na)是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸钠为双糖单位聚合而成的直链大分子。玻璃酸钠是广泛存在于人体内的生理活性物质，在眼玻璃体、房水、皮肤、关节滑液、脐带等处均有分布。玻璃酸钠高度亲水，可形成水膜覆盖于眼表面上，与纤连蛋白结合，通过后者的作用促进角膜上皮细胞的连接和伸展,从而促进结膜创伤、角膜上皮细胞的修复，高浓度的玻璃酸钠效果更显著。另外玻璃酸钠对眼具有保湿和润滑作用。

角膜损伤及角膜炎症在人群发病率中较高，目前常见的治疗方法为使用抗生素类滴眼液，包括氯霉素滴眼液、红霉素滴眼液及以左氧氟沙星为代表的第4代喹诺酮类滴眼，但是滥用抗生素滴眼液的后果非常严重，首先使病原菌耐药性增加，临床疗效降低，造成疾病久治不愈，其次是抗生素本身及其辅助成分一定程度上会影响眼睛的正常生理环境，干扰角膜上皮的正常代谢，甚至加重原有的病情，不能长期使用。因此需要开发一种生物安全性高、效果明显、使用方便的滴眼液。

本发明目前做的纤连蛋白及玻璃酸钠量效关系研究中，结果显示，两种药物联合治疗顽固性角膜上皮损伤、各种原因的角膜上皮病变、角膜炎可起到双效用药效果。

发明内容

1.上述背景材料指出纤连蛋白用于角膜损伤、角膜病变有显著疗效，生物安全性高，但是目前此类滴眼液较少，不能满足临床需求。本发明的优点是创造性的将纤连蛋白和玻璃酸钠联合使用，不仅能各自发挥疗效，由于二者的协同作用，能使药物长时间停留于眼角膜损伤表面，延长药物作用时间，大大增强对眼角膜的修复、保护作用，提高疗效，安全性高，制备方法简单，不含防腐剂，能长期使用，大大满足目前临床对此类滴眼液的需求。

2.本发明中的案例中，两种物质均可单独作为滴眼液剂型，复方制剂为新型发明。

3.一种复方制剂，主要成分为纤连蛋白和玻璃酸钠。该复方制剂的pH值为6.0～7.5，优选pH值为6.0～7.0，纤连蛋白的含量为50μg/ml～500μg/ml，玻璃酸钠的含量为0.1％-0.3％，所述助剂为等渗调节剂、pH调节剂、注射水。其中pH调节剂优先选择磷酸盐缓冲液，等渗调节剂为氯化钠和氯化钾，其含量为0.3％-0.8％：0.1％-0.3％。

4.其制备过程为：

(1)量取处方量40％-60％的注射用水依次将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾倒入容器中，搅拌约15-30分钟使完全溶解，0.2um滤膜过滤除菌，滤液收集。

(2)准确称取玻璃酸钠加入上述滤液中，搅拌桨搅拌3-6小时，转速100-200rpm，温度15-25℃，直至玻璃酸钠完全溶解。

(3)加入处方量纤连蛋白，补足注射用水，摇匀，0.2um滤膜过滤除菌，无菌灌装，即得。

附图说明

图1为早期角膜上皮愈合与晚期角膜愈合率比较示意图；

图2为上皮破损率比较示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并非是对本发明的限定。

实施例1

纤连蛋白0.1g，玻璃酸钠2g，磷酸氢二钠0.28g，磷酸二氢钠1.5g，氯化钠5.6g，氯化钾1.4g，注射用水1000ml。

操作步骤：

(1)量取400ml的注射用水依次将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾倒入容器中，搅拌约15-30分钟使完全溶解，0.2um滤膜过滤除菌，滤液收集。

(2)准确称取玻璃酸钠加入上述滤液中，搅拌3-6小时，转速100-150rpm，温度15-25℃，直至玻璃酸钠完全溶解。

(3)加入处方量纤连蛋白，补足注射用水，摇匀，0.2um滤膜过滤除菌，无菌灌装，即得。实施例2

纤连蛋白0.25g，玻璃酸钠1g，磷酸氢二钠0.5g，磷酸二氢钠1g，氯化钠6.0g，氯化钾2g，注射用水1000ml。

操作步骤：

(1)量取500ml的注射用水依次将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾倒入容器中，搅拌约15-30分钟使完全溶解，0.2um滤膜过滤除菌，滤液收集。

(2)准确称取玻璃酸钠加入上述滤液中，搅拌3-6小时，转速100-200rpm，温度20-25℃，直至玻璃酸钠完全溶解。

(3)加入处方量纤连蛋白，补足注射用水，摇匀，0.2um滤膜过滤除菌，无菌灌装，即得。

实施例3

纤连蛋白0.4g，玻璃酸钠3g，磷酸氢二钠0.7g，磷酸二氢钠0.4g，氯化钠7.0g，氯化钾1g，注射用水1000ml。

操作步骤：

(1)量取600ml的注射用水依次将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾倒入容器中，搅拌约15-30分钟使完全溶解，0.2um滤膜过滤除菌，滤液收集。

(2)准确称取玻璃酸钠加入上述滤液中，搅拌4-6小时，转速100-200rpm，温度20-25℃，直至玻璃酸钠完全溶解。

(3)加入处方量纤连蛋白，补足注射用水，摇匀，0.2um滤膜过滤除菌，无菌灌装，即得。

实施例4稳定性考察

将实施例1、实施例2、实施例3产品于40℃±2℃、相对湿度40％±5％条件下进行加速实验6个月，考察其关键指标：外观形状、蛋白含量、玻璃酸钠含量、pH值、渗透压、黏度的变化情况、检验标准为中国药典2010年版。其中，蛋白含量检测方法按照中国药典2010年版三部附录ⅥB第二法(lowry法)检测，玻璃酸钠含量按照“玻璃酸钠”原料药含量检测方法测定，黏度按照中国药典2010年版二部附录ⅥG第一法测定，其他常规项目按照中国药典2010年版眼用制剂项下规定测试。结果见下表1。

表1稳定性考察数据

加速6个月后，本品各项指标均无明显变化，表明本品性质稳定，适合常温、长期储存。

实施例5药效学实验

目的：考察制剂对碱烧伤兔眼修复作用。

样品：实验组：按照本实施例2制备的滴眼液样品；阳性对照组：纤连蛋白滴眼液(除不含玻璃酸钠，其余处方同实施例2)；

动物：新西兰兔。

操作：

取新西兰兔，眼表采用3.5％利多卡因麻醉，将直径8mm的滤纸原片置0.5N的NaOH溶液中浸湿，置角膜正中1分钟后取下，立即用无菌生理盐水冲洗。

取造模成功的兔6只，伤后6小时即刻右眼滴实施例2制备的滴眼液样品，左眼滴阳性对照样品，5次/日，共2周。

评价：

角膜上皮愈合率及破损率计算：相机配近摄接圈，固定焦距，于伤后6h、20h、24h、36h、48h在角膜荧光着色区拍摄，冲洗后绘出荧光着色区，spss软件测出各时点面积值，经线性回归计算上皮愈合率(mm²/h)。于伤后3～15天每天观察角膜2次，凡荧光着色为阳性，上皮破损率＝(治疗眼或对照眼阳性数/治疗眼或对照眼总数)Χ100％。

结果：

(1)早期角膜上皮愈合与晚期角膜愈合观察

早期(伤后6小时)角膜愈合十分缓慢，伤后6～48小时，角膜愈合趋于一条直线，见下图1。实验组角膜平均愈合率1.18±0.035mm²/h，对照组角膜平均愈合率0.91±0.047mm²/h，前者明显较后者快(p<0.01)。请看说明书附图图1。

(2)上皮破损率

结果见下图2。实验组上皮破损率明显低于对照组，于烧伤后第7天角膜上皮痊愈，对照组于第9天角膜上皮痊愈。请看说明书附图图2。

实验结果可见，复合滴眼液治疗碱烧伤角膜上皮效果明显优于单一纤连蛋白滴眼液，对临床应用有指导意义。

实施例6药效学实验

目的：考察制剂对兔腺病毒性角膜炎治疗作用。

样品：实验组：按照本实施例2制备的滴眼液样品、阿昔洛韦滴眼液(修正药业)；

阳性对照组：0.9％生理盐水；

动物：新西兰兔24只(雌雄各半)。

操作：

实验动物检查双眼均无异常后，双眼用0.4％盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉，后将小鼠置于裂隙灯显微镜下，用4.5号无菌针头交叉划伤右眼角膜上皮层多次，呈1mm大小“井”形划痕,然后给结膜囊内滴入50μl含有15TCID/0.1ml的腺病毒3型病毒液。联系感染3d。腺病毒感染5d后出现病毒性角膜炎典型病变(角膜出现点状、地图状、树枝状病灶，虹膜充血，畏光流泪症状)。,

造模成功后，随机分为治疗组(实施例2制备的复合滴眼液)、阳性对照组(阿昔洛韦滴眼液)、阴性对照组(0.9％生理盐水注射液)。出现典型病变1d后，开始结膜囊给药，2滴/滴，4次/天，连续给药10d。于用药后第3、6、10天，以2％荧光素钠染色，裂隙灯下观察角膜病变范围。10天后处死各组白兔，取其角膜，常规处理后，HE染色，光镜观察。评价

角膜病变程度判定标准依据Heilienhaus等上皮表面缺损面积以0至4计分；

见表2所示。

表2角膜上皮病变程度分级

结果

(1)于用药后第3、6、10天观察各组兔眼角膜情况，以spss13.0统计软件进行统计分析，计量数据以X±s表示，组间差异采用多因方差分析，结果见表3所示。与阴性对照组比较，治疗组p<0.02，阳性对照组p<0.05，差异有统计学意义。

表3兔腺病毒性角膜炎病变评分

由结果可见，本发明的滴眼液治疗兔腺病毒性角膜炎效果比阳性对照药物明显，说明纤连蛋白和玻璃酸钠联合使用能大大提高对角膜炎的治疗效果。

(2)角膜病理观察

腺病毒感染阴性对照组白兔角膜上皮较松解、脱落，可见上皮内水泡，阳性对照组可见角膜修复，但细胞层次和细胞间连接的病理损害仍存在，治疗组可见上皮修复完整，新生的鳞状上皮排列整齐，未见脱落或水泡。可见纤连蛋白和玻璃酸钠联合使用能有效抑制角膜病毒向周围邻近细胞扩散，缩小病灶范围，有利于上皮细胞的迁移和增殖来修复伤口，又防止病菌的感染。

Claims (7)

1.一种单剂量包装的含纤连蛋白的滴眼液，可用于顽固性角膜上皮损伤、各种原因的角膜上皮病变、角膜炎；其特征是：主要成分是50μg/ml～500μg/ml的纤连蛋白和0.1%～0.3%的玻璃酸钠,pH值为6.0～7.5，渗透压为280～320mOsm/L，不含防腐剂，单剂量包装。

2.根据要求1所述，该滴眼液的特征为：主要成分为纤连蛋白和玻璃酸钠，同时还包括等渗调节剂、pH调节剂和注射水。

3.如权利要求1所述的人工泪液，其特征是所述的纤连蛋白取自动物体内，无来源限制。

4.如权利要求1所述的人工泪液，其特征是所述的玻璃酸钠分子量范围40w-150wDa。

5.如权利要求1或2所述的人工泪液，其特征是其pH调节剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，磷酸二氢钠含量为0.02%-0.2%，磷酸氢二钠含量为0.01%-0.1%。

6.如权利要求1或2所述的人工泪液，其特征是渗透压调节剂为氯化钠和氯化钾，氯化钠含量为0.3%-0.8%，氯化钾含量为0.1%-0.3%。

7.根据权利要求1或2所述滴眼液的制备方法，其具体制备过程为：

（1）量取取处方量40%-60%的注射用水依次将磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾倒入容器中，搅拌约15-30分钟使完全溶解，0.2um滤膜过滤除菌，滤液收集；

（2）准确称取玻璃酸钠加入上述滤液中，搅拌桨搅拌3-6小时，转速100-200rpm，温度15-25℃，直至玻璃酸钠完全溶解；

（3）加入处方量纤连蛋白，补足注射用水，摇匀，0.2um滤膜过滤除菌，无菌灌装，即得。