CN101829048B - 一种滴眼液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种滴眼液及其制备方法，涉及一种滴眼液。提供一种作用时间短、纯度高、效果相对较好、可同时起到抗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎症的滴眼液及制备方法。滴眼液的组成及其按体积百分比的含量为牛血清0.1％～5％，增稠剂5％～15％、酸碱调节液1％～5％，抗生素0.5％～2％，重组蛋白5％～20％，余为平衡盐溶液。滴眼液含有平衡盐溶液、增稠剂、牛血清、抗生素、酸碱调节液和重组蛋白。将增稠剂、牛血清、抗生素和重组蛋白加到平衡盐溶液中，用酸碱调节剂调pH值，用渗透压缓冲剂调渗透压，经膜过滤除菌；或将重组蛋白制成无菌微粉，将牛血清溶解于平衡盐溶液中，调节pH值，膜过滤除菌，将重组粉末溶于该溶液中，即得滴眼液。
Description
技术领域
本发明涉及一种滴眼液，尤其是涉及一种用于治疗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎症性疾病的滴眼液及其制备方法。
背景技术
据世界卫生组织报告，角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，每年因角膜溃疡、眼外伤等造成的新增角膜盲为150～200万，严重威胁着患者的健康。而在角膜病中，最主要的致盲原因是的角膜血管化和瘢痕化，同时治疗药物的作用局限也是一个关键问题。角膜新生血管和新生淋巴管可以继发于多种角膜炎症性疾病(角膜炎、溃疡等)及各类角膜损伤(角膜外伤、烧伤等)，是角膜对缺氧、炎症等多种刺激因素综合的病理反应，可能导致角膜移植时的排斥反应和炎症反应，严重影响着患者视力恢复。目前，由于参与角膜新生血管、新生淋巴管及角膜炎症的因素较多，有关其发生机制、病理过程、以及有效治疗手段等诸多方面的问题还尚未完全阐明。然而对于角膜新生血管、淋巴管及角膜炎症的药物研究，有望解决角膜创口愈合困难和术后免疫排斥反应二大关键问题，是目前治疗角膜盲的新途径。因此，如何寻找新的药物治疗这三类主要角膜疾病已经成为当前眼科界研究的一个热点和难点。
Netrin家族是作为神经导向因子而被发现和命名的，但越来越多的研究显示它们在非神经组织中亦广泛分布且在形态发生方面起着一定的作用，如哺乳动物腺体的形成、肺分支形态发生、肿瘤发生等。最近的研究显示，netrins在血管生成过程中还担任了内皮导向分子的功能。这也使Netrin家族再次成为当前国际生物医学界的前缘、热点研究领域之一。然而Netrin家族在正常角膜及炎症组织中的功能的尚无人研究，机理了解甚少，与角膜的新生血管和新生淋巴管形成过程以及炎症反应等角膜疾病关系还不清楚，受到了越来越多眼科学者的重视。
目前，市面上尚无抗炎、抗新生血管和抗新生淋巴管的滴眼液产品，临床上应用的大多数眼科药物具有局限的治疗功能，而且各种药品成分中可能存在相互影响和制约的因素，加上多种联合应用眼药中的毒性成分及防腐剂会给眼表微环境造成破坏，给本身就存在的眼表疾患雪上加霜，对多种角膜病的治疗带来一定的困惑；此外，大多数抗炎产品多含有激素类成分，长期使用可严重影响患者的眼表微环境，部分抗炎药物还有相关的并发症如氯霉素滴眼液大剂量用药可致眼睑、角膜水肿，眼球运动受限及视盘萎缩，长期应用可致再生障碍性贫血等；抗新生血管药物，如青蒿琥酯(陈欢欢，周慧君.青蒿琥酯的抗血管生成作用.药学学报2004，39(1)：29-33)滴眼液，成分比较复杂，效果尚不够肯定，且没有抗炎抗淋巴管作用；强力霉素滴眼剂是目前治疗炎症的有效药物，但目前我国尚无正式商品化的制剂。而目前我们发现Netrin4在角膜病理情况下对于细胞的分化、迁移和增殖，炎症发生，新生血管形成，免疫功能的维持以及创伤愈合和组织再生等方面存在着不可估量的作用。研究Netrin4与病理角膜的关系，特别是其在角膜新生血管、新生淋巴管及角膜炎症中的作用及机制，可能会对角膜疾病的防治开辟一条崭新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种与现有的滴眼液相比，作用时间更短、纯度更高、效果相对较好、可同时起到抗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎症的滴眼液及其制备方法。
所述一种滴眼液的组成及其按体积百分比的含量为牛血清0.1％～5％，增稠剂5％～15％、酸碱调节液1％～5％，抗生素0.5％～2％，重组蛋白5％～20％，余为平衡盐溶液。
所述一种滴眼液的组成及其按体积百分比的含量最好为牛血清0.5％～2.5％，增稠剂9.5％～11.5％、酸碱调节液2％～3％，抗生素1％～1.5％，重组蛋白10％～15％，余为平衡盐溶液。
所述牛血清最好采用胎牛血清，尤其是特级胎牛血清，特级胎牛血清是在无菌条件下通过心脏穿刺的方式采血取到，经过40nm正压气流过滤的胎牛血清，具有极佳的促细胞生长作用及产品稳定性，内毒素含量≤10EU/ml，血红蛋白含量≤10mg/dl。按体积百分比，所述牛血清的浓度为1％～15％，最好为10％。
所述增稠剂最好选自硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖等中的至少一种。
所述酸碱调节剂可选自碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、HEPES(英文名为2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesμlfonic acid，中文名为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为C8H18N2O4S)、硼酸-硼砂缓冲对等中的一种，最好选用作用较强的HEPES。
所述抗生素可选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素等中的一种，最好采用妥布霉素。
所述平衡盐溶液最好采用PBS溶液。PBS溶液是最常用的平衡盐溶液，也是抗炎药物的基础溶液，其成分包含了部分离子成分，可以满足用药期间阴阳离子平衡和渗透压的需要。
所述滴眼液：以10ml计，含有重组Netrin4蛋白5g，pH值为7.2～7.4。
所述一种滴眼液的制备方法包括以下步骤：
按滴眼液的配方，将增稠剂、牛血清、抗生素和重组蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀，用酸碱调节剂调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得滴眼液；或
按滴眼液的配方，将重组蛋白制成无菌重组蛋白粉末，将牛血清溶解于平衡盐溶液中，酸碱调节剂调节pH值为7.2～7.4，膜过滤除菌，然后将重组蛋白粉末溶于该溶液中，即得滴眼液。
所述渗透压缓冲剂最好选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖等中的一种。所述渗透压缓冲剂的用量参照眼科制剂标准。
与现有的滴眼液相比，本发明具有以下优点：(1)制作流程简单、可靠，且易于实施；(2)滴眼液成分简单，成本相对较低，配制方便；(3)本发明没有添加激素类成分，可以可长期使用，大大减少用药期间并发症和后遗症的发生；(4)本发明添加抗生素后无污染，病原菌培养观察发现此滴眼液能较长时间保存(3个月)，应用于大鼠角膜碱烧伤模型后发现不仅可以预防和治疗角膜新生血管、新生淋巴管的发生，而且对控制角膜炎症也发挥了一定的作用；(5)本发明加入了牛血清，无病原微生物，低内毒素，低补体，可以显著减少使用其他血清的不良反应；(6)本发明加入了一定剂量的增稠剂，可明显提高药物的舒适度；(7)同时本发明可方便临床医生工作，为术前控制和稳定角膜新生血管、新生淋巴管及角膜炎症性疾病患者的病情提供更合理的手术时机；(8)本发明不仅可以用于抗角膜新生血管、新生淋巴管、角膜炎症性疾病，同时将为其作用机制的进一步研究提供重要的线索和技术支持。
本发明所述的Netrin4滴眼液不仅可以预防和治疗角膜新生血管、新生淋巴管的发生，而且能控制角膜炎症，将来可能会用于各种炎症或相关新生血管及淋巴管疾病的药物治疗，并能被广大患者接受而应用于临床。
附图说明
图1为经过本发明所述Netrin4滴眼液连续作用30h，HUVEC在细胞运动修复实验中细胞修复情况的照片。
图2为经过PBS滴眼液连续作用30h，HUVEC在细胞运动修复实验中细胞修复情况的照片。
图3为经过本发明所述Netrin4滴眼液连续作用36，48，72h，HUVEC在细胞增殖实验中的情况。
图4为大鼠角膜碱烧伤后，经过本发明所述Netrin4滴眼液和PBS滴眼液连续治疗14d的炎症指数情况。
图5为大鼠角膜碱烧伤后，经过本发明所述Netrin4滴眼液连续治疗14d的裂隙灯的照片。
图6为大鼠角膜碱烧伤后，经过PBS滴眼液连续治疗14d的裂隙灯的照片。
图7为大鼠角膜碱烧伤后，经过本发明所述Netrin4滴眼液和PBS滴眼液连续治疗14d内的新生血管面积变化情况。
图8为经过本发明所述Netrin4滴眼液及PBS连续治疗14d的大鼠角膜碱烧伤的VEGF、PEDF的Western blot图片。
图9为经过本发明所述Netrin4滴眼液滴眼液连续治疗14d的大鼠角膜碱烧伤的TNF-α的免疫荧光图片。
图10为经过PBS滴眼液连续治疗14d的大鼠角膜碱烧伤的TNF-α的免疫荧光图片。
图11大鼠角膜碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述Netrin4滴眼液和PBS滴眼液连续治疗14d的炎症指数情况。
图12为大鼠角膜碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述的Netrin4滴眼液连续治疗14d的的裂隙灯的照片。
图13为大鼠角膜碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过PBS滴眼液连续治疗14d的的裂隙灯的照片。
图14为大鼠角膜碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述Netrin4滴眼液和PBS滴眼液连续治疗14d内的新生血管长度变化情况。
图15为大鼠碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述的Netrin4滴眼液及PBS连续治疗14d的VEGF、PEDF的Western blot图片。
图16为大鼠碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述的Netrin4滴眼液治疗14d的TNF-α的免疫荧光图片。
图17为大鼠碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过PBS滴眼液治疗14d的TNF-α的免疫荧光图片。
图18为经过本发明所述Netrin4滴眼液滴眼液连续治疗14d的大鼠角膜碱烧伤的Lyve-1和CD34的免疫荧光图片。
图19为经过PBS滴眼液连续治疗14d的大鼠角膜碱烧伤的Lyve-1和CD34的免疫荧光图片。
图20为大鼠碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过本发明所述的Netrin4滴眼液治疗14d的Lyve-1和CD34的免疫荧光图片。
图21为大鼠碱烧伤炎症血管模型制作后10d，再经过PBS滴眼液治疗14d的Lyve-1和CD34的免疫荧光图片。
具体实施方式
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液制作方法。
实施例1
以10ml滴眼液计，以7.4ml PBS为基础溶液，含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl，妥布霉素100μl，重组Netrin4蛋白2ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将50μg重组Netrin4蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlPBS溶液中，然后和200μl胎牛血清，1M HEPES200μl及10％妥布霉素100μl混合均匀，补加PBS溶液于10ml，调节pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，即得Netrin4滴眼液。
制备方法2：将50μg Netrin4制成无菌微粉，将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1M HEPES200μl、10％妥布霉素100μl及9.4ml PBS，调节pH值为7.2～7.4，经0.2μm膜过滤除菌，然后将Netrin4粉末溶于该溶液溶液中，渗透压为350～380mOsm/L，即得Netrin4滴眼液。
实施例2
以10ml滴眼液计，以7.4ml HBSS为基础溶液，含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl，妥布霉素100μl，重组Netrin4蛋白2ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将50μg重组Netrin4蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlHBSS溶液中，然后和200μl胎牛血清，1M HEPES200μl及10％妥布霉素100μl混合均匀，补加HBSS溶液于10ml，调节pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，即得Netrin4滴眼液。
制备方法2：将50μg Netrin4制成无菌微粉，将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1M HEPES200μl、10％妥布霉素100μl及9.4ml HBSS，调节pH值为7.2～7.4，经0.2μm膜过滤除菌，然后将Netrin4粉末溶于该溶液溶液中，渗透压为350～380mOsm/L，即得Netrin4滴眼液。
实施例3
以10ml滴眼液计，以7.4ml生理盐水为基础溶液，含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl，妥布霉素100μl，重组Netrin4蛋白2ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将50μg重组Netrin4蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2ml生理盐水溶液中，然后和200μl胎牛血清，1M HEPES200μl及10％妥布霉素100μl混合均匀，补加生理盐水溶液于10ml，调节pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，即得Netrin4滴眼液。
制备方法2：将50μg Netrin4制成无菌微粉，将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1M HEPES200μl、10％妥布霉素100μl及9.4ml生理盐水，调节pH值为7.2～7.4，经0.2μm膜过滤除菌，然后将Netrin4粉末溶于该溶液溶液中，渗透压为350～380mOsm/L，即得Netrin4滴眼液。
实施例4
以10ml滴眼液计，以7.4ml林格氏液为基础溶液，含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl，妥布霉素100μl，重组Netrin4蛋白2ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将50μg重组Netrin4蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2ml林格氏液中，然后和200μl胎牛血清，1M HEPES200μl及10％妥布霉素100μl混合均匀，补加林格氏液于10ml，调节pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，即得Netrin4滴眼液。
制备方法2：将50μg Netrin4制成无菌微粉，将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1M HEPES200μl、l0％妥布霉素100μl及9.4ml林格氏液，调节pH值为7.2～7.4，经0.2μm膜过滤除菌，然后将Netrin4粉末溶于该溶液溶液中，渗透压为350～380mOsm/L，即得Netrin4滴眼液。
实施例5
以10ml滴眼液计，以7.4ml Hanks溶液为基础溶液，含有胎牛血清200μl、低分子右旋糖酐100μl、HEPES200μl，妥布霉素100μl，重组Netrin4蛋白2ml，pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L。
制备方法1：将50μg重组Netrin4蛋白和100μg低分子右旋糖酐溶解于2mlHanks溶液中，然后和200μl胎牛血清，1M HEPES 200μl及10％妥布霉素100μl混合均匀，补加Hanks溶液于10ml，调节pH值为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，经0.2μm膜过滤除菌，即得Netrin4滴眼液。
制备方法2：将50μg Netrin4制成无菌微粉，将100μg低分子右旋糖酐、200μl胎牛血清、1M HEPES200μl、10％妥布霉素100μl及9.4ml Hanks溶液，调节pH值为7.2～7.4，经0.2μm膜过滤除菌，然后将Netrin4粉末溶于该溶液溶液中，渗透压为350～380mOsm/L，即得Netrin4滴眼液。
实施例6
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液在体外影响HUVEC细胞生长的初步实验研究。
目的：了解5.0μg/ml重组Netrin4蛋白在体外对HUVEC的增殖和迁移的影响。
方法：采用原代HUVEC细胞株进行细胞培养，传至第3代时，将3×10-4个/cm3细胞培养于96孔板中，待细胞铺满孔板后使用黄色枪头在中央划痕，然后在培养液中分别加入PBS，1％BSA，0.1μg/ml重组Netrin4蛋白和5.0μg/ml重组Netrin4蛋白，观察培养8h，12h，16h，20h，24h，28h，30h后各组细胞在划痕上的迁移情况。并以相同密度接种培养HUVEC细胞，利用CCK8实验观察各组在96孔板中培养36h，48h，72h后细胞增殖情况。
结果：细胞运动修复实验中，加药培养30h后，PBS组，1％BSA组，0.1μg/ml重组Netrin4蛋白组HUVEC细胞已经完全铺满中央划痕区域，但5.0μg/ml重组Netrin4蛋白组仍有部分区域没有细胞铺满中央划痕，差异有统计学意义；CCK8实验结果显示PBS组，1％BSA组，0.1μg/ml重组Netrin4蛋白组HUVEC细胞在36h，48h，72h增殖速度明显快于5.0μg/ml重组Netrin4蛋白组，差异具有统计学意义。
结论：5.0μg/ml重组Netrin4蛋白在体外对HUVEC的增殖和迁移均有抑制作用。
参见图1～3，HUVEC细胞在相同密度接种后，待细胞完全铺满平板底部时，给予相同宽度的划痕后，分别给予不同的培养基连续处理30h情况。其中图1为5.0μg/ml重组Netrin4蛋白对HUVEC在细胞运动修复实验中细胞修复情况，结果显示在浓度为5.0μg/ml重组Netrin4蛋白作用下，HUVEC在细胞划痕中央区域仍然有部分区域没有细胞铺满中央划痕空余(图1)，而加入相同剂量的PBS组则已全部铺满划痕区域(图2)，说明浓度为5.0μg/ml重组Netrin4蛋白对HUVEC细胞的运动修复有明显抑制作用。CCK8实验结果(图3)显示PBS组HUVEC细胞在36h，48h，72h增殖速度较快，而浓度为5.0μg/ml重组Netrin4蛋白组增殖速度明显偏慢，两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均＜0.05)，说明HUVEC细胞的增殖明显受到浓度为5.0μg/ml重组Netrin4蛋白的限制。在图3中，a为Netrin4滴眼液，b为PBS滴眼液；横坐标为作用时间，纵坐标为在酶标仪下，HUVEC细胞增殖过程中测得450nm波长的OD值。
实施例7
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液抑制大鼠角膜新生血管和炎症的初步实验研究。
目的：了解5.0μg/ml Netrin4滴眼液对大鼠角膜碱烧伤模型中新生血管和炎症反应的影响。
方法：先将30只Wistar大鼠用1％NaOH制作角膜碱烧伤模型，然后将模型动物平均分为两组，一组给予PBS滴眼液，另一组给予5.0μg/ml Netrin4滴眼液，连续点眼14d后，观察两组大鼠角膜新生血管生长和炎症指数情况。取点药14d后角膜，采用免疫荧光染色和Western blot技术对比两组TNF-α、VEGF以及PEDF表达情况。
结果：在连续用药14d后，5.0μg/ml Netrin4组的角膜炎症指数和新生血管长度和面积分别为35.6±24.9mm2，明显优于PBS滴眼液组的65.3±21.1mm2，Western blot结果显示，与PBS滴眼液组相比较，VEGF在5.0μg/mlNetrin4组明显下调而PEDF则明显上调，两组差异有统计学意义；免疫荧光染色结果显示TNF-α在5.0μg/ml明显下调，两组差异有统计学意义。
结论.5.0μg/ml Netrin4滴眼液能显著抑制大鼠碱烧伤角膜的新生血管形成和炎症反应发生。
参见图4～10，大鼠角膜碱烧伤模型制作后，给予浓度为5.0μg/ml Netrin4和PBS滴眼液连续点眼14d，大鼠角膜新生血管和炎症反应的改变情况，图4为浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液(a)和PBS滴眼液(b)在碱烧伤后1，4，7，14d角膜炎症指数的变化情况，结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4炎症指数明显少于PBS滴眼液组，两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均＜0.05)，说明浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液能有效控制炎症.图5～8为浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液(A)和PBS滴眼液(B)在碱烧伤后1，4，7，14d角膜新生血管长度和面积的变化情况，结果显示Netrin4滴眼液组(图5)角膜新生血管面积(图7)明显少于PBS滴眼液组(图6)，两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液能显著抑制大鼠碱烧伤角膜的新生血管形成，图8为在碱烧伤后连续应用浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液和PBS滴眼液14d时角膜VEGF和PEDF的变化情况，结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4组VEGF明显下调而PEDF明显上调，两者比较存在有统计学意义(P＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液是通过使VEGF表达下降而使PEDF表达升高而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的。图9和10为碱烧伤后连续应用浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液和PBS滴眼液14d时角膜TNF-α(白)的变化情况，结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4组TNF-α明显下调，两者比较存在有统计学意义(P＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液也通过使TNF-α表达下降而抑制大鼠碱烧伤角膜新生血管形成的。
实施例8
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液在大鼠角膜新生血管回退中的初步作用研究。
目的：了解5.0μg/ml Netrin4滴眼液对大鼠角膜新生血管形成后的影响。
方法：先将30只Wistar大鼠用1％NaOH制作角膜碱烧伤模型，待新生血管形成10d后，将这些大鼠平均分为两组，一组给予PBS滴眼液，另一组给予5.0μg/ml Netrin4滴眼液，分别连续点眼14d后，观察两组大鼠角膜新生血管生长和情况。取点药14d后角膜，采用免疫荧光染色和Western blot技术对比两组TNF-α、VEGF以及PEDF表达情况。
结果：新生血管形成10d后连续用药14d显示，5.0μg/ml Netrin4组的角膜新生血管长度分别为0.72±0.39mm，明显优于PBS滴眼液组的1.52±0.42mm；Western blot结果显示，与PBS滴眼液组相比较，VEGF在5.0μg/ml Netrin4组明显下调而PEDF则明显上调，两组差异有统计学意义；免疫荧光染色结果显示TNF-α在5.0μg/ml明显下调，两组差异有统计学意义。
结论：5.0μg/ml Netrin4滴眼液能使大鼠碱烧伤模型中已经形成的角膜新生血管回退。
参见图11～17，大鼠角膜碱烧伤模型制作10d后，给予浓度为5.0μg/ml Netrin4和PBS滴眼液连续点眼14d，大鼠角膜新生血管的改变情况.图11为浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液(a)和PBS滴眼液(b)在碱烧伤后10，14，17，24d角膜炎症指数的变化情况，结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4炎症指数明显少于PBS滴眼液组，两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均＜0.05)，说明浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液在此过程中抗炎作用.图12-14为浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液(A)和PBS滴眼液(B)在碱烧伤后10，14，17，24d角膜新生血管长度和面积的定量变化，结果显示Netrin4滴眼液组(图12)角膜新生血管长度(图14)明显少于PBS滴眼液组(图13)，两者比较在各时间点均存在有统计学意义(P值均＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液能使大鼠碱烧伤模型中已经形成的角膜新生血管回退。图15为大鼠角膜碱烧伤模型制作10d给予浓度为5.0μg/ml Netrin4和PBS滴眼液连续点眼14d后，大鼠角膜VEGF和PEDF的改变情况。结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4组VEGF明显下调而PEDF明显上调，两者比较存在有统计学意义(P＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液是通过使VEGF表达下降而使PEDF表达升高而使已经形成的角膜新生血管回退，图16，17为对应的24d角膜TNF-α(白)变化情况，结果显示浓度为5.0μg/ml Netrin4组TNF-α明显下调，两者比较存在有统计学意义(P＜0.05)，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液也通过使TNF-α表达下降而使已经形成的角膜新生血管回退。
实施例9
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液抑制大鼠角膜新生淋巴管的初步实验研究。
目的：了解5.0μg/ml Netrin4滴眼液对大鼠角膜碱烧伤模型中新生淋巴管的影响。
方法：先将30只Wistar大鼠用1％NaOH制作角膜碱烧伤模型，然后将模型动物平均分为两组，一组给予PBS滴眼液，另一组给予5.0μg/ml Netrin4滴眼液，连续点眼14d后，观察两组大鼠角膜新生淋巴管情况。取点药14d后角膜，采用免疫荧光染色技术对比两组以Lyve-1(白)的表达情况。
结果：在连续用药14d后，5.0μg/ml Netrin4组的角膜新生淋巴管长度明显短于PBS滴眼液组，两组差异有统计学意义。
结论：5.0μg/ml Netrin4滴眼液能显著抑制大鼠角膜新生淋巴管的形成。
参见图18和19，大鼠角膜碱烧伤模型制作后，给予浓度为5.0μg/ml Netrin4和PBS滴眼液连续点眼14d，大鼠角膜新生淋巴管的改变情况，图18为浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液在碱烧伤后14d角膜新生淋巴管的变化情况，相比PBS滴眼液组(图19)，Netrin4滴眼液组新生淋巴管长度明显短于PBS滴眼液组，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液能显著抑制大鼠碱烧伤角膜的新生淋巴管形成。
实施例10
以下给出一种优化的Netrin4滴眼液在大鼠角膜新生淋巴管回退中的初步作用研究抑制。
目的：了解5.0μg/ml Netrin4滴眼液对大鼠角膜新生淋巴管形成后的影响。
方法：先将30只Wistar大鼠用1％NaOH制作角膜碱烧伤模型，待新生血管形成10d后，将这些大鼠平均分为两组，一组给予PBS滴眼液，另一组给予5.0μg/ml Netrin4滴眼液，分别连续点眼14d后，观察两组大鼠新生淋巴管生长情况。取点药14d后角膜，采用免疫荧光染色技术对比两组Lyve-1(白)的表达情况。
结果：新生血管形成10d后连续用药14d显示，5.0μg/ml Netrin4组的新生淋巴管长度明显短于PBS滴眼液组，两组差异有统计学意义。
结论：5.0μg/ml Netrin4滴眼液能使大鼠碱烧伤模型中已经形成的角膜新生淋巴管回退。
参见图20和21，大鼠角膜碱烧伤模型制作10d后，给予浓度为5.0μg/mlNetrin4和PBS滴眼液连续点眼14d，大鼠角膜新生淋巴管的改变情况，图20为5.0μg/ml Netrin4滴眼液组在碱烧伤后24d角膜新生淋巴管的变化情况，图21为PBS滴眼液组，结果显示Netrin4滴眼液组新生淋巴管长度明显短于PBS滴眼液组，说明了浓度为5.0μg/ml Netrin4滴眼液能能使大鼠碱烧伤模型中已经形成的角膜新生淋巴管回退。
Claims (10)
1.一种滴眼液，其特征在于其组成及其按体积百分比的含量为牛血清0.1％～5％，增稠剂5％～15％、酸碱调节液1％～5％，抗生素0.5％～2％，Netrin4蛋白5％～20％，余为平衡盐溶液。
2.如权利要求1所述的一种滴眼液，其特征在于其组成及其按体积百分比的含量为牛血清0.5％～2.5％，增稠剂9.5％～11.5％、酸碱调节液2％～3％，抗生素1％～1.5％，Netrin4蛋白10％～15％，余为平衡盐溶液。
3.如权利要求1或2所述的一种滴眼液，其特征在于所述牛血清为胎牛血清。
4.如权利要求1所述的一种滴眼液，其特征在于所述牛血清为特级胎牛血清，特级胎牛血清是在无菌条件下通过心脏穿刺的方式采血取到，经过40nm正压气流过滤的胎牛血清，内毒素含量≤10EU/ml，血红蛋白含量≤10mg/dl；按体积百分比，所述牛血清的浓度为1％～15％。
5.如权利要求1或2所述的一种滴眼液，其特征在于所述增稠剂选自硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖中的至少一种。
6.如权利要求1或2所述的一种滴眼液，其特征在于所述酸碱调节剂选自碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲对、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸-硼砂缓冲对中的一种。
7.如权利要求1或2所述的一种滴眼液，其特征在于所述抗生素选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素中的一种。
8.如权利要求1或2所述的一种滴眼液，其特征在于所述平衡盐溶液为PBS溶液。
9.如权利要求1所述的一种滴眼液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
按滴眼液的配方，将增稠剂、牛血清、抗生素和Netrin4蛋白加到平衡盐溶液中混合均匀，用酸碱调节剂调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得滴眼液；或
按滴眼液的配方，将Netrin4蛋白制成无菌Netrin4蛋白粉末，将牛血清溶解于平衡盐溶液中，酸碱调节剂调节pH值为7.2～7.4，膜过滤除菌，然后将Netrin4蛋白粉末溶于该溶液中，即得滴眼液。
10.如权利要求9所述的一种滴眼液的制备方法，其特征在于所述渗透压缓冲剂选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一种。
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