FI79554B - Foerfarande foer framstaellning av hyaluronsyrafraktioner med farmaceutisk aktivitet. - Google Patents

Description

79554

Menetelmä farmaseuttisen aktiivisuuden omaavien hyaluroni-happofraktioiden valmistamiseksi Tämän keksinnön kohteena ovat eräät sellaiset hyaluronihapon (tämän jälkeen HA:n) molekyylipainofraktiot, joita voidaan käyttää terapeuttisesti ja joilla tällöin ei ole tulehduksia aiheuttavia ominaisuuksia. Erästä tämän keksinnön mukaista HA-fraktiota voidaan käyttää haavojen parantumisen edistämiseen, toinen HA-fraktio taas sopii käyttäväksi intraokulaa-risesti (silmän sisäisesti) endobulbaaristen nesteiden korvaamiseen tai intra-artikulaarisessa (nivelensisäisessä) injektiossa hoidettaessa vahingoittuneita luuliitoksia. HA-fraktioiden on edelleen todettu olevan käyttökelpoisia apuaineina silmälääkkeissä, jolloin saadaan aikaan valmisteita, jotka ovat yhteensopivia sarveiskalvoepiteelin kanssa ja parantavat silmälääkkeiden aktiviteettiä.

Hyaluronihappo on luonnossa esiintyvä heteropolysakkaridi, joka koostuu D-glukuronihapon ja N-asetyyli-D-glukosamiinin vuorottelevista tähteistä. HA on lineaarinen polymeeri, jolla on korkea molekyylipaino, yleisesti noin 8-13 miljoonaa, ja sitä on löydetty solukuorissa, selkärankaisten sidekudosten solun ulkopuolisessa aineessa, nivelten nivelvoide-nesteessä, silmän endobulbaarisissä nesteissä, ihmisen napa-nuorakudoksessa ja kukon heltoissa.

Aikaisemmat HA:n käytön tutkimukset sisältyvät Balazsin työhön, US-patentti 4,141,973, ja niiden kohteena on HA:n fraktio, jota voidaan käyttää endobulbaaristen nesteiden korvaamiseksi samoin kuin muihin terapeuttisiin sovellutuksiin. Mainittu patentti koskee kuitenkin erityisesti HA-fraktiota, jonka keskimääräinen molekyylipaino on suurempi kuin noin 750.000 ja mieluummin suurempi kuin noin 1.200.000. Balazs esittää nimenomaan, että HA:n fraktiot, joiden keskimääräinen molekyylipaino on alle 750.000, eivät ole terapeuttisesti käyttökelpoisia niiden tulehduksellisen aktivitee- 2 79554 tin johdosta. Balazs hylkää nämä HA:n alhaisemman molekyyli-painon omaavat fraktiot. Kuitenkin tämä saa aikaan sen, että noin 90 % koko käytettävissä olevan HA:n määrästä, jotka voidaan saada lähdekudoksista, hylätään ja siten käytetään vain pieni määrä (noin 10 %) käytettävissä olevasta HA:sta.

Päinvastoin kuin Balazsin opit esillä olevan hakemuksien hakija on todennut, että HA:n alhaisemman molekyylipainon omaavilla fraktioilla on todella käyttökelpoinen farmaseuttinen aktiviteetti. Siten esillä olevan keksinnön mukaisesti käytetään noin 80 % erilaisista lähteistä saatavaa HA:ta. Etenkin hakija on löytänyt yhden HA:n fraktion, jota voidaan käyttää haavan parantumisen stimuloimiseen, ja toisen HA:n fraktion, jota voidaan käyttää intraokulaarisissa injektioissa endobulbaaristen nesteiden korvaamiseksi silmässä ja intra-artikulaarisissa injektioissa vahingoittuneiden liitosten hoitamiseksi.

Kuvio 1 on kaavio, joka esittää ne hyaluronihapon eri fraktiot, jotka keksijät ovat tunnistaneet.

Kuten yllä on esitetty, HA:n aikaisemmat tutkimukset, kuten esimerkkinä esitetty Balazsin patentti, ovat kohdistuneet niiden korkean molekyylipainon omaavien fraktioiden käyttöön, joiden keskimääräisenä molekyylipainona on yli 750.000. Hakija on eristänyt ja karakterisoinut kaksi uutta HA:n fraktiota, joista toisella on alhainen molekyylipaino ja toisella on keskikokoa oleva keskimääräinen molekyylipaino ja joiden katsotaan olevan olennaisesti puhtaita, koska niillä on suuri puhtausaste eikä niillä ole tulehduksia aiheuttavaa aktiviteettiä. Nämä uudet HA:n fraktiot voidaan saada erilaisista sidekudoksista, jotka sisältävät uutettavissa olevia määriä hyaluronihappoa. Keksinnön fraktiot erotetaan molekyylisuodatustekniikkojen avulla.

Hakijan eristämää ensimmäistä fraktiota kutsutaan nimellä HYALASTIINI ja sen keskimääräinen molekyylipaino on noin 50.000 - noin 100.000. Tämän HYALASTIINI-fraktion on to- li 3 79554 dettu soveltuvan ihmisiin ja eläimiin kohdistuvaan terapeuttiseen käyttöön sen haavoja parantavan aktiviteetin johdosta. Hakijan eristämää toista fraktiota kutsutaan nimellä HYALEKTIINI ja sen keskimääräinen molekyylipaino on noin 500.000 - noin 730.000. Tämä HYALEKTIINI-fraktio sopii käytettäväksi silmäkirurgiassa endobulbaaristen nesteiden korvaamiseksi ja eläinten ja ihmisten terapiaan nivelten traumaattisissa ja degeneratiivisissä sairauksissa.

HYALASTIINIA voidaan antaa joko intradermaalisena (ihon sisäisenä) injektiona tai sitä voidaan käyttää paikallisena aineena haavojen parantamiseksi. HYALEKTIINI on toisaalta sopiva intraokulaariseen ja intra-artikulaariseen injektioon.

Tämän keksinnön hakija on intensiivisesti tutkinut HA:n erilaisia fraktioita ja on etenkin määrittänyt huomattavasti tarkemmalla tavalla kuin aikaisemmin HA:n terapeuttisesti käyttökelpoiset fraktiot ja HA:n tulehduksia aiheuttavat ja käyttökelvottomat fraktiot. Näiden tutkimusten tuloksena hakija on tunnistanut HA-fraktioiden kaksi erityistä ominaisuutta ja tutkinut niitä, nimittäin solumobilisaation aktiviteettiä ja sisäistä viskositeettiä. Solumobilisaatio, etenkin fibroblastien mobilisaatio, edistää eläinten haavojen parantumisprosessia. Toisaalta solumobilisaatio- tai uudiskasvuaktiviteettiä (so. mytosis) on vältettävä suoritettaessa kirurgisia toimenpiteitä silmämunassa. Näin on etenkin kun suoritetaan leikkauksia verkkokalvon irtoamisen korjaamiseksi, jolloin lisääntyneellä parantumisnopeudella voi olla vahingollisia vaikutuksia.

HA-fraktion ominaisviskositeetti on myös tärkeä parametri, joka on otettava huomioon arvioitaessa fraktion hyödyllisyyttä. Korkean ominaisviskositeetin omaava fraktio sopii edullisesti kirurgiseen käyttöön, luonteeltaan traumaattisten tai degeneratiivisten nivelten sairauksien terapiaan ja endobulbaaristen nesteiden korvaamiseen. Korkea viskositeetti ei toisaalta ole toivottava ominaisuus sellaisissa frak 4 79554 tioissa, joita käytetään lääkeaineina haavojen paranemisen edistämiseksi. Haavojen parantamiseen käytettävillä fraktioilla tulisi itse asiassa olla alhainen viskositeetti niin, että ne ovat helpommin käytettävissä käytännön sovellutuksissa.

Hakijan tunnistamalla HYALASTIINI-fraktiolla on todettu olevan hyvä mobilisaatio- tai solujen uudiskasvuaktiviteetti ja alhaiset viskositeettiominaisuudet. Siten HYALASTIINILLA on ominaisuudet, joita toivotaan materiaalilta, jota voidaan käyttää haavojen parantumisen edistämiseen.

Samat ominaisuudet tekevät HYALASTIINI-fraktiosta ei-toivot-tavan intraokulaarisissa tai intra-artikulaarisissa injektiohoidoissa tapahtuvaan käyttöön.

Hakijan tunnistamalla HYALEKTIINI-fraktiolla on todettu olevan merkityksetön solumobilisaatio- tai uudiskasvuaktii-visuus, kun taas samalla sillä on korkea viskositeetti.

Tästä syystä nämä ominaisuudet tekevät HYALEKTIINI-frakti-osta käyttökelpoisen intraokulaarisiin ja intra-artikulaa-risiin injektiokäsittelyihin. Toisaalta HYALEKTIINI ei kuitenkaan ole käyttökelpoinen haavojen parantamiskäsittelyis-sä, koska tällä fraktiolla ei ole solumobilisaatioaktiivi-suutta.

Eristettäessä hyaluronihapon käyttökelpoisia fraktioita on myös tärkeää saada ne fraktiot, joilla ei ole tulehduksia aiheuttavaa (eli inflammatorista) aktiivisuutta. Balazsin yllä mainitussa patentissa esitetään, että kun halutaan saada hyaluronihappofraktiot, joilla ei ole inflammatorista aktiivisuutta, on käytettävä yksinomaan fraktioita, joiden keskimääräinen molekyylipaino on yli 750.000. Siten Balazs hylkää ne fraktiot, joiden keskimääräinen molekyylipaino on alle 750.000, katsoen niiden olevan käyttökelvottomia inflammatorisen aktiivisuutensa vuoksi. Päinvastoin kuin mitä Balazsin julkaisussa on esitetty, esillä olevan hakemuksen hakija on todennut, että se inflammatorinen aktiivisuus, s 79554 jonka Balazs väittää johtuvan fraktiosta, joiden keskimääräinen molekyylipaino on alle 750.000, johtuu itseasiassa epäpuhtauksista, joiden keskimääräinen molekyylipaino on alle 30.000. Esillä oleva keksintö saa siten aikaan menetelmän, joka käsittää useita molekyylisuodatusmenetelmiä yhdistettynä kemiallisiin menetelmiin ja jolla voidaan poistaa inflammatorinen fraktio, jonka molekyylipaino on alle 30.000.

Keksinnön mukaisilla menetelmillä on mahdollista saada hyal-uronihapon käyttökelpoisia fraktioita, joilla ei ole inflammatorista aktiivisuutta ja jotka muodostavat yhdessä noin 80 %:n kokonaissaannon siitä hyaluronihappomäärästä, joka voidaan saada kyseeseen tulevista lähtöaineista. Tämä käytettävissä olevan hyaluronihapon 80 %:n saanto käsittää yhdistetyn fraktion, joka on HYALEKTIINI- ja HYALASTIINI-fraktioiden yhdistelmä ja jonka keskimääräinen molekyyli-paino on noin 250.000 - noin 350.000. Etenkin HYALEKTIINI-fraktiota saadaan noin 30 %:n saantona käytettävissä olevasta HA:sta ja HYALASTIINI-fraktiota saadaan noin 50 %:n saantona käytettävissä olevasta HA:sta lähtökudoksista. Tämä tekijä on tärkeä parannus verrattuna yllä esitetyn Balazsin patentin menetelmään siinä, että esillä olevan keksinnön keksijät ovat havainneet, että käytettävissä olevan hyaluronihapon merkittävästi suuremmat määrät ovat farmaseuttisesti käyttökelpoisia. Käyttämällä vain fraktiota, jonka keskimääräinen molekyylipaino on yli 750.000, Balazsin menetelmä antaa vain noin 10 %:n saannon alkuperäisestä eläinten elimistä peräisin olevasta hyaluronihaposta ja hylkää noin 90 % käytettävissä olevasta hyaluronihaposta. Siten esillä olevan keksinnön mukaisesti koko hyaluroniuut-teen käyttökelpoisuus on lisääntynyt huomattavasti.

Suhteellisten saantojen vertailu hyaluronihapon eri fraktioiden uuttamisesta on esitetty taulukossa 1.

6 79554

Taulukko 1

Hyaluronihappo- g/100 g % Viite tyyppi tuoretta kudosta

Kukonheltoista 0,8 100 Swann D.A. 1968, saatava koko Biochim, Biophys.

hyaluronihappo Acta 156, 17-29 HA (Balazsin 0,08 10 US-patentti esittämä tyyppi) 4,141,973 HYALEKTIINI + HYALASTIINI 0,6 80 esillä oleva keksintö HYALEKTIINI 0,2 30 esillä oleva keksintö HYALASTIINI 0,4 50 esillä oleva keksintö

Inflammatorinen 0,16 20 esillä oleva fraktio keksintö

Kuvio 1 esittää graafisesti eri HA-fraktioita, jotka tämän hakemuksen hakija on tunnistanut. Kuvion 1 yhtenäisellä viivalla piirretty kellonmuotoinen käyrä esittää lähtökudokses-ta saatavien HA-fraktioiden likimääräistä jakautumista.

Kuvion 1 alue "B" esittää HA-fraktiota, jonka Balazs on tunnistanut US-patentissa 4,141,973 farmaseuttisesti käyttökelpoiseksi. Kuvion 1 alueet "A", I ja II ovat fraktiot, jotka tämän hakemuksen hakija on tunnistanut, jolloin alue A on inflammatorinen fraktio, jonka keskimääräinen molekyyli-paino on alle 30.000; alue I on HYALASTIINI-fraktio ja alue II on HYALEKTIINI-fraktio. Tästä kaaviosta voidaan nähdä, että Balazsin menetelmä hylkää suurimman osan käytettävissä olevasta uutettavasta HA:sta eliminoimalla HA-fraktiot, joiden keskimääräinen molekyylipaino on alle 750.000. Esillä oleva keksintö sallii toisaalta käytettävissä olevan HA:n suuren osuuden farmaseuttisen käytön, koska alhaisen mole-kyylipainon omaava hyaluronihapon fraktio, jonka keskimää 7 79554 räinen molekyylipai.no on alle 30.000, saa aikaan inflammatorisen aktiivisuuden, jota aikaisemmat tutkijat eivät ole havainneet HA:n erilaisilla uutteilla.

Esillä olevan hakemuksen hakija on havainnut, että suuri prosenttimäärä käytettävissä olevaa HA:ta voidaan itse asiassa käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin, jos se erotetaan tämän keksinnön oppien mukaisesti aina terapeuttisen sovellutuksen mukaan. Vaikka Balazsin patentti esittää erityisesti vain käytettävissä olevan HA:n noin 10 %:n käyttöä, esillä oleva keksintö sallii käytettävissä olevan HA:n noin 80 %:n käytön joko HYALASTIINI-fraktion muodossa haavan parantamis-sovellutuksissa tai HYALEKTIINI-fraktion muodossa intraoku-laarisiin ja intra-artikulaarisiin käyttötarkoituksiin tai yhdistetyn HYALASTIINI ja HYALEKTIINI-fraktion muodossa, jota voidaan myös käyttää haavan parantamistarkoituksiin.

Tunnistettujen fraktioiden kemiallisia ja fysikaalisia ominaisuuksia on myös tutkittu esillä olevan hakemuksen hakijan toimesta ja nämä ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.

, 1 8 79554 C (β (0 0) M -4 •π M O 3 td P • P 01 -4 -4 x a *

0 »H

b S £ öP dP dP

*5 O -H M ^

H i( Ό V V V

3 3 ·Η « e u

I I

Ή 01 H (Ö c 3 m c <*><*>(*> —4 3—4 ia m m *W 01 c c ^ ^ ^ <D —i <o —4 o o o P O Ό —· , ,,

£h O -t-* 3 E V v V

ω ui -4 (0 3 o fc 04 c xi o

O

CO

M

< «J

Z I c

W -4 -H ·· (Q

S U C dP nj 4J X

OOOjJo} dPdPdP

t, ϋ S 5 « β vo VO VO

S " 3 & g J Λ Λ N J, 3 S 5L S ^ * Λ Λ N - J ^ >1 « 3 SI ¢)

£ X X * -r, C

2 -H c

S , C CU

co« _ Λ Λ ω « fc * « -H -4 -< -5 * *

^ w 01 -H -H -H C o .H

^ 5**· r-l (ΰ M

CJ 01 a 01 tn ^ 4)3 S So e-'# a# a’i c :ro p 2 5™ E-ts^s-1 § iid £ J C _. , 4J P 3 t E —4 o*o*c* m 4j o.

<e-vJ ooioW^OT 4J —I :rn 5 2 1r? i—4 c vo c γ-η 2 -h « a • - S g.® o o o U<UQ)

S α-ρ — a-4 dP

- n vi *r • 1 « ' · - «0 P :td : is 01 P :to

1 o o o 01 -4 4J

Q O O O Φ -H rH

x ,Η ooo Ί3 P :td U5 >1 O ... 1) 01 O >1 C OOO ^ C —4 - - 2 M -H m o m ·· 01

.30)(0 m-Hi^ srOdP

' < r-4 a III -H VO Q)

S n OOO P CT» X

^ y O O O 0) 3 OOO 4J -H 10 • · · P 01 -n <0 OOO -4 J* 0 tn m o --<—4 c a m in P m <u a P <U «3

c <D M X

·* E «H -H

«C -H 1(0 C

m m m uj X tn -n o

z 2 2 5 WP

Jj M M M pj P C 3 —1 M M M u ltd · *H i-4 .Z E-· E* E~* £ > C C « .j W X UI S ϊ(β 0) C >1 Z < + w < £ p <u -4 x - « J w pj 3 pj^o

2 < < < 3 -4 *-j C dP

£ >4 >4X5 ffl « -4 VO

K X X 2 W ·η ε «Λ .

X

5 79554

Biologisen ja farmaseuttisen aktiivisuuden arviointi 1. Hyaluronihappofraktioiden solumobilisaation biologinen aktiivisuus:

Menetelmää, joka koostuu fibroblastien kiinnitysaktiivisuu-den määrityksestä viljelyssä, käytettiin menetelmänä HA-fraktioiden solumobilisaatioaktiivisuuden määrittämiseksi.

Hiiren BALB 3T3-soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 %:sella vasikan-seerumilla, penisilliinillä (250 yksikköä/ml) ja streptomysiinillä (0,25 mg/ml), ja inkuboitiin kostutetussa 5 %:sessa C02JSsa, 95 %:sessa ilmassa 37°C:ssa. Koetarkoituksia varten solut istutettiin rutiininmukaisesti läpimitaltaan 60 mm oleviin muovikudosviljelymaljoihin (6xl05 solua/malja).

3T3-solujen yhtyvät yksiatomiset filmikerrokset dekantoitiin ja lisättiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi 2,0 mg/ml HA:n eri fraktioita. Määrätyin välein tutkittiin soluirtoa-mista sekä mikroskooppisesti että laskemalla liikkuneet solut Coulter-laskimessa.

Irtoamisanalyysi: Irtoamiskinematiikan mittaamiseksi solut istutettiin muovimaljoihin ja niiden annettiin kasvaa 24 tuntia. Tämän ajan jälkeen viljelyväliaine dekantoitiin ja lisättiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi 2,0 mg/ml HA:ta. Joka 24 tunnin kuluttua dekantoitiin kaksi maljaa, yksi testiviljely ja yksi kontrolliviljely ja sekä superna-tantissa olevat solut että kiinnittyneet solut laskettiin Coulter-laskimessa.

Taulukko 3 esittää tuloksia, jotka on saatu testeillä käytettäessä valmistusesimerkeissä 1-3 saatuja fraktioita.

10 79554

Taulukko 3

Mobilisaatiotutkimusten tulokset

Fraktio Konsentraatio Irronneiden % tehokkuus (mg/ml) solujen mää- (verrattuna rä verrattuna vertailun kontrolleihin fraktioon)

Vertailu 2 x 106

HYALEKTIINI

+ 2 3,5 x 106 75

HYALASTIINI

HYALEKTIINI 2 2,1 x 106 5 HYALASTIINI 2 5 x 106 150

Taulukon 3 arvot osoittavat, että HYALASTIINI-fraktiolla on korkea solumobilisaatioaktiivisuus ja tätä fraktiota voidaan käyttää haavojen parantamiseksi. HYALASTIINIn tämä mobili-saatioaktiivisuus stimuloi uusien solujen migraatiota ja uu-diskasvua, kun fraktion farmaseuttista valmistetta käytetään vaurioituneella kudosalueella.

Toisaalta HYALEKTIINI-fraktio11a on hyvin vähän solumobili-saatioaktiivisuutta eikä sitä voida siitä syystä käyttää haavojen parannuksessa. HYALEKTIINI-fraktio on kuitenkin sen korkean keskimääräisen molekyylipainon ja luonteenomaisen viskositeetin johdosta käyttökelpoinen okulaarisissa ja intra-artikulaarisissa injektioissa ja huomattavan solumobi-lisaatioaktiivisuuden puute on hyvin tärkeä HYALEKTIINI-fraktion ominaisuus, mikä tekee siitä erittäin käyttökelpoisen intraokulaarisissa ja intra-artikulaarisissa injektioissa.

2. Hyaluronihappofraktioiden biologinen inflammatorinen aktiivisuus: 11 79554 Tätä arviointia varten käytetään invasiivisen solulaskennan menentelmää, kun fraktioita on annettu intraokulaarisesti kaneilla.

Menetelmä Tässä testissä käytettiin viittä New Zealand- tai Califor-nia-kania, jotka painoivat noin 2 kg ja joilla on varmistettu täydellinen näkö. Kanien ulkosilmä tarkistetaan inflammatoristen prosessien suhteen makroskooppisella tasolla ja sisäsilmä tarkastetaan oftalmoskoopilla. Jos silmänpohja on selvästi nähtävissä ja normaali, testi voi edetä.

Valitut eläimet alistetaan paikallispuudutukseen oftalmolo-giaa varten tiputtamalla muutama pisara sopivaa steriiliä puudutusainetta. Saunoin tiputetaan muutama pisara oftalmo-logisessa liuoksessa olevaa atropiinia.

Testi suoritetaan steriileissä olosuhteissa. Silmämuna saatetaan työntymään esiin paineen avulla, kunnes on mahdollista injisoida kovakalvon läpi noin 5 - 6 mm reunuksesta lasi-aisontelon keskikohdassa 100 μΐ liuosta käyttämällä 26 G neulaa. Toinen silmä otetaan Kontrolliksi. Kaksi pisaraa antibioottista liuosta tiputetaan käsiteltyyn silmään ja eläimet sijoitetaan sitten yksittäisiin häkkeihin.

50-60 tunnin kuluttua testiä voidaan jatkaa. Silmät tarkistetaan samalla tavalla kuin yllä eläimien valintaa varten. Eläimet tapetaan Pentothalin intravenöösisellä injektiolla. Sitten ensin kerätään vesipitoinen neste (noin 0,2 ml) insuliiniruiskun avulla 26 G neulalla. Silmämunat poistetaan sitten, vapautetaan kaikesta vieraasta aineesta, pestään suolaliuoksessa, kuivataan billbolous-paperilla ja leikataan ja avataan petrilevyissä, erottamalla lasiaisneste ja keräämällä se steriilillä ruiskulla (noin 0,7 ml). Lasiaisneste sijoitetaan pieniin polyetyleenitestiputkiin ja lisätään 50 μ 1 hyaluronidaasia (100 U NF/ml). Seos pidetään sitten 37°C:n lämpötilassa noin 3 tuntia liuoksen pitämiseksi vähemmän viskoosina.

12 79554

Leukosyyttilaskenta suoritetaan mikroskoopilla vaihekontras-tilla (120 x) Burker-kammiossa. Laskentojen sarja suoritetaan jokaisella näytteellä laskemalla keskiarvo ja esittä- ' mällä tulos leukosyyttien määränä per mm3.

Testi katsotaan positiiviseksi, kun 1) tutkituissa silmissä ei ole mitään vahingoittumismerkkejä ja 2) leukosyyttien määrä käsittelyn 5 silmän vähintään neljän keskiarvo ei ole yli 200/mm3 ja jokaisen kontrollisilmän leukosyyttien keskimäärä ei ole yli 50/mm3.

Taulukossa 4 on esitetty tästä arvioinnista saadut tulokset käytettäessä yllä valmistusesimerkeissä 1-3 saatuja HA-fraktioita.

Taulukko 4

Inflammatorisen aktiivisuuden tutkimustulokset

Fraktio Invasiivisien solujen määrä

Kontrolli 25 HYALASTIINI + HYALEKTIINI 32 HYALASTIINI 20 HYALEKTIINI 22

Inflammatorinen fraktio (keskim. molek.paino 30.000) 150

Kukon heltoista saatu koko hyaluronihappo (RF. Swann D.A.

1968, B.B.A. 156, 17-29) 120

Taulukossa 4 esitetyt tulokset esittävät, että HYALASTIINI-ja HYALEKTIINI-fraktioilla ei ole inflammatorista aktiivisuutta yli kontrollin ja yhdistetyillä HYALASTIINI- ja HYA-LEKTIINI-fraktioilla on vain mitätön inflammatorisen aktiivisuuden kasvu verrattuna kontrolliin. Siten HYALASTIINI- ja 13 79554 HYALEKTIINI-fraktiot ovat farmaseuttisesti käyttökelpoisia ilman että niillä on ei-toivottuja inflammatorisia sivuvaikutuksia. Nämä tulokset vahvistavat myös edelleen hakijan havainnon, että HA-fraktio, jolla on alhainen noin alle 30.000 oleva keskimääräinen molekyylipaino, on vastuussa HA-valmisteiden inflammatorisesta aktiivisuudesta. Kukonhel-toista saadulla hyaluronihapolla, joka on valmistettu kirjallisuudessa esitetyllä Swannin menetelmällä (Swann D.A. 1968, B.B.A. 156, 17-29) on huomattava inflammatorinen aktiivisuus.

Siten on esitetty, että HYALASTIINI-fraktiolla, jonka keskimääräinen molekyylipaino on noin 50.000 - 100.000, on korkea solumobilisaatioaktiivisuus ja se on siten käyttökelpoinen haavanparannussovellutuksissa, ilman että sillä on ei-toivottuja inflammatorisia reaktioita. HYALEKTIINI-fraktio, jonka keskimääräinen molekyylipaino on noin 500.000 - 730.000, on todettu sopivaksi okulaariseen ja intra-artikulaariseen injektioon sen korkean molekyylipainon ja luonteenomaisen viskositeetin johdosta ja samanaikaisesti se ei stimuloi solumobilisaatioaktiivisuutta eikä inflammatorisia reaktioita, jotka ovat ei-toivottuja sivuvaikutuksia, joita tulee välttää farmaseuttisissa sovellutuksissa.

Etenkin HYALASTIINI-fifaktio on todettu käyttökelpoiseksi haavanparannusvalmisteissa seuraavien ominaisuuksien johdosta.

1. Valmiste edistää huomattavasti lyhentynyttä parantu-misaikaa verrattuna tavanomaiseen terapiaan, jolloin vahingoittunut alue tasoittuu nopeasti, haavan reunat tulevat säännöllisiksi, jyväiskudos kehittyy voimakkaasti, makrofagien ja fibroblastien solumigraatio aktivoituu ja epitelisoituu aikaisin.

2. Valmiste edistää lisääntynyttä mukautuvuutta rekons-truktiivisen kirurgian suhteen vakavammissa tapauksissa.

3. Arpikasvaimen tai kokoonvetäytyneen arpimuodostuksen 14 79554 puuttuminen, jolloin lopullinen arpisen kudoksen uudelleenmuotoutuminen tuottaa hyvät kosmeettiset ja toiminnalliset tulokset.

HYALASTIINI-valmiste on todettu käyttökelpoiseksi hoidettaessa erilaisia haavoja mukaanlukien makuuhaavat, kudosravitse-mukselliset haavat, palovammat, kivuttomat haavat, posttrau-maattiset haavat, suonikohjuiset ja postplebiittiset haavat laskimoveritäplistä, radionekroosi, ihovauriot, ihosiirrän-näiset ja herpes simplexin aiheuttamat ihovammat. Näitä haavanparannuskäsittelyjä varten HYALASTIINI-valmistetta tai sen natriumsuolaa voidaan antaa eri menetelmillä, kuten har-sotyynyillä, voiteena, spraynä tai ampulleina intramediaali-sia injektioita varten. Tooppisia sovellutuksia, kuten voiteena tai harsotyynyllä HYALASTIINI yhdistetään mieluummin emulgointiaineen kanssa, joka absorboi tulehdusnesteen paljaana olevalta alueelta ja antaa hyaluronihapon erinomaisen diffuusion, ja veteen dispergoituvan täyteaineen kanssa, niin että haavasidos on helposti poistettavissa.

HYALEKTIINI-fraktion on todettu olevan erittäin käyttökelpoinen hevosten, etenkin kilpahevosten hoitamisessa, joilla on nivelsairauksia ja -tauteja, jotka aiheutuvat akuutin tai kroonisen trauman, infektioiden ja toistettujen intra-arti-kulaaristen kortikosteroidisten injektioiden johdosta. Erityisiä HYALEKTIINIllä käsiteltävien sairauksien esimerk-: kejä ovat osteoartroosi joko inflammatoristen ilmiöiden kanssa tai ilman, akuutti tai krooninen synoritis, degenera-tiiviset prosessit nivelrustoissa ja kuiva niveltauti. Näiden sairauksien yleisimpiä symptomeja ovat yleisesti kipu, heikentynyt niveltoiminta ja vähentynyt niveltaipuminen. Keksinnön mukaisen HYALEKTIINI-fraktion on todettu edistävän tällaisten sairastavien hevosten parantumisajän huomattavaa lyhentymistä verrattuna tavanomaiseen terapiaan, edistävän niveltoiminnan aikaista ja kestävää parannusta ja vähentävän kipua ja raajarikkoisuutta. Näitä kliinisesti edullisia vaikutuksia uskotaan edistettävän nivelvoidenesteen viskoelas-tisuuden normaalistumisen ja kudoksen korvautumisprosessien aktivoinnin ansiosta nivelrustoissa.

15 79 554

Lisäksi kaikkia yllä olevia edullisia vaikutuksia edistetään HYALEKTIINI-fraktiolla ilman paikallisia ja/tai systeemisiä toksisia vaikutuksia. Toistettu HYALEKTIINIn antaminen ei aiheuta allergisia reaktioita eikä mitään haitallisia tai kestäviä vaikutuksia.

Lisätutkimuksessa on tutkittu hyaluronihapon kykyä ja tehokkuutta apuaineena erilaisia molekyylejä varten, etenkin sen käyttöä apuaineena silmälääkkeitä varten, jotka takaavat täydellisen siedettävyyden ja yhteensopivuuden (so. ilman herkistysilmiöitä) sarveiskalvoepiteelin kanssa. Hyaluroni-happoa pidetään erittäin mielenkiintoisena o£talmisena apuaineena. Kuten edellä esitettiin, HA on glykosaminogly-kaani, joka on läsnä erilaisissa sidekudoksissa ja biologisissa nesteissä (kuten nivelvoidenesteessä ja erityisesti lasiaisnesteessä), missä sillä on sen kemiallisen ja fysikaalisen luonteen ja sen huomattavien visko-elastisten ominaisuuksien johdosta perusteellista laatua oleva rakenteellinen ja biologinen merkitys.

Siten suoritettiin tutkimus erilaisia molekyylipainoja omaa-vien HA-fraktioiden, etenkin hyalastiini- ja hyalektiini-fraktion ja niiden seoksen käytön tutkimiseksi erilaisten farmaseuttisten muotojen, kuten silmäveden, geelin, voiteiden,kiinnittimien tai kuivien jauheiden valmistamiseksi. Tästä syystä erityyppisiä silmälääkkeitä tutkittiin tämän biologisen polymeerin mahdollisen käytön selvittämiseksi sen erilaisina fraktioina apuaineena.

Tämän jälkeen esitettyjen tutkimusten tarkoituksena on määrittää, pystyvätkö täyteaineena hyaluronihappoa sisältävät valmisteet parantamaan apuainetta sisältävien lääkeaineiden bio-käyttökelpoisuutta tai tuottamaan synergistisen vaikutuksen yhdessä apuainetta sisältävien lääkeaineiden kanssa, etenkin lääkeaineiden kanssa, joilla on oftalminen aktiivisuus tai käyttö.

Näitä mahdollisia HA:n kykyjä apuaineena tutkittiin kaniinin silmässä neljällä erityyppisellä ja erilaisen toiminnan 16 79554 omaavilla silmälääkkeillä, etenkin pilokarpiininitraatilla, triamkinoliinillä, epidermaalisella kasvutekijällä (EGF) ja antibiootilla, kuten streptomysiinillä ja gentamysiinillä. Kaikkien näiden lääkkeiden tiedetään omaavan mioottinen, anti-inflammatorinen, parantava ja anti-mikrobiaalinen vaikutus. Lisäksi antibioottisen streptomysiinin aktiivisuuden arviointi, jossa on apuaineena hyaluronihappoa, on hyvin tärkeä, koska se on yksi laajimmin käytetyistä antibiooteista silmäinfektioissa.

Tutkitut kokeelliset mallit ja suoritetut tutkimukset olivat seuraavat: 1) apuaineena hyaluronihappoa sisältävän pilokarpiini-nitraatin mioottinen aktiivisuus kanin silmässä; 2) hyaluronihappoa apuaineena sisältävän triamkinolo-nin anti-inflammatorinen vaikutus kanin silmässä dekstraanilla indusoidun tulehduksen mallissa; 3) hyaluronihappoa apuaineena sisältävän epidermaali-sen kasvutekijän (EGF) parantava aktiivisuus kanin sarveiskalvon epiteelivammassa; 4) hyaluronihappoa apuaineena sisältävän streptomysiinin antimikrobinen aktiivisuus Bacillus subtilis 6633:a vastaan agar-levyissä.

I. Hyaluronihappoa apuaineena sisältävän pilokarpiininit-raatin mioottinen aktiivisuus

Seuraavia aineita käytettiin pilokarpiinin täyteaineina erilaisia pilokarpiininitraatti-valmisteita varten: — hyaluronihapponatriumsuolaa, hyalastiini-fraktiota (molekyylipaino noin 100.000) 10 mg/ml:n ja 20 mg/ml:n konsentraatiossa; — hyaluronihapponatriumsuolaa, hyalektiini-fraktio (molekyylipaino 500.000 - 730.000) 10 mg/ml:n ja 20 mg/ml:n konsentraatiossa; — 5%:sta polyvinyylialkoholia oftalmisena vertailu-täyteaineena.

17 79554

Erilaisia pilokarpiininitraatin 2%:n valmisteita (silmävetta tai geeliä) valmistettiin ja niihin lisättiin apuaineeksi HA-natriumsuolan kahta erilaista fraktiota 10 ja 20 mg/ml:n konsentraatiossa. Seuraavat liuokset valmistettiin:

Valmiste 1 - suolaliuos pilokarpiininitraatin (P1NO3) (2%) kanssa, jota käytettiin vertailuna.

Valmiste 2 - PiN03:n (2%) liuos, jossa on apuaineena 5%:sta polyvinyylialkoholia (käytettiin vertailuna).

Valmiste 3 - PiNC^sn liuos (2%), jossa on apuaineena hyalas-tiini-fraktion natriumsuolaa (10 mg/ml).

Valmiste 4 - PiNC^sn liuos (2%), jossa on apuaineena hyalas-tiini-fraktion natriumsuolaa (20 mg/ml).

Valmiste 5 - PiNC>3:n liuos (2%), jossa on apuaineena hyalektiini-fraktion natriumsuolaa (10 mg/ml).

Valmiste 6 - PiN03:n liuos (2%), jossa on apuaineena hyalektiini-fraktion natriumsuolaa (20 mg/ml).

Käytettiin Zealand-albiinokaneja (2 - 2,5 kg). Testattavat valmisteet tiputettiin yhteen silmään mikroinjektioruiskulla (10 μΐ), toinen silmä toimi vertailuna. Pupillin läpimitta mitattiin kaikissa tapauksissa sopivin aikavälein. Jokainen liuos testattiin vähintään 8 kanissa. Kumpikin silmä käsiteltiin korkeintaan kolme kertaa ja vähintään yhden viikon loppujaksoa tarkkailtiin jokaisen käsittelyn välillä.

Pupillin läpimitat mitattiin eri aikavälein mioottisen aktiivisuuden käyrän määrittämiseksi ajan suhteen. Seuraavat aktiiyisuusparametrit laskettiin tämän jälkeen mioosi/aika-kaavioista:

Imax * maksimiero pupillin läpimitassa käsitellyn silmän ja vertailun välillä.

Huippuaika = aika Imax:in saavuttamiseksi.

Kesto » aika perusolosuhteiden palauttamiseksi. Tasanne = ie 79554 absoluuttisen mioottisen aktiivisuuden kesto.

AUC = alue mioosi/aikakäyrän alapuolella.

Testien tulokset on esitetty taulukossa 5. Voidaan nähdä eri parametrien arvoista, jotka on määritetty kaikkien testattujen liuosten mioottisen aktiivisuuden aikakäyrästä, että hy-aluronihapon lisäys 2%:seen pilokarpiininitraattiliuokseen lisää lääkkeen mioottista aktiivisuutta. Itse asiassa lääkkeen bio-käyttökelpoisuus voi olla jopa 2,7 kertaa suurempi kuin 2% pilokarpiininitraattia (valmiste 1) sisältävän vesipitoisen liuoksen.

Tulisi myös huomata, että esiintyy statistisesti merkittävä aktiivisuuden kasvu, kun apuaineena käytetään hyaluronihapon hyalektiini-fraktiota sekä 10 että 20 mg/ml:n annoksessa (valmisteet 5-6) verrattuna polyvinyylialkoholia apuaineena sisältävään pilokarpiininitraattiliuokseen (valmiste 2).

Hyaluronihapon käyttö apuaineena on erittäin mielenkiintoinen, koska pilokarpiininitraatin mioottinen aktiivisuus kestää kauemmin, kun se sisältää tätä ainetta apuaineena. Tämä tarkoittaa, että hyaluronihappoa sisältävien valmisteiden kohdalla aika pupillin läpimitan palautumiseksi perustiloihin on korkeintaan 190 minuuttia (valmiste 6) verrattuna yksinään suolaliuoksessa olevan pilokarpiinin (valmiste 1) 110 minuuttiin.

II. Hyaluronihappoa apuaineena sisältävän triamkinolonin anti -inflammatorinen aktiivisuus

Seuraavia aineita käytettiin: - hyaluronihapponatriumsuola-hyalektiini-fraktion liuos, molekyylipaino 500.000 - 730.000, 10 mg/ml suolaliuoksessa; - triamkinolonin liuos (10% suolaliuoksessa).

Kokeet suoritettiin koiraspuolisilla New-Zealand-kaneilla (keskimääräinen paino 1,6 kg). 5 päivän sopeuttamisajän jälkeen intraokulaarinen tulehdus indusoitiin kaneissa injek- 19 79554 toimalla intraokulaarisesti dekstraaniliuosta (10%, 0,1 ml). Anto suoritettiin molempiin silmiin paikallispuudutuksessa 4%:sella novesinalla sovittamalla injektioruiskun neula 4 mm etukammioon 2 mm:n etäisyydellä sarveiskalvon reunuksesta. Testi suoritettiin 10 eläimellä.

20 79554 c O) c

•H

iH

rH *3* m co vo m ® O V£> Ο Γ'· O I" 5

+ 1« Ή rH CM rH CM CM

•C 3 CO

CM_ d» CO CM O rH CO in £ m in n <· d d v ϋ σι r +1 +1 +1 +1 +1 +1 - &< O i-4 r- <n o cd (N o

Z3 rH CTi rl" O M" CM

< +1 —I Ή CN CN cs n

4J

<D -H

C -U

C 3 -in ns 3 I · I I I τ a c , <0 Ή * I ε· ε 2 03 5 t ° rH £

'<•5 Q 7j OOOOOO

a JJ3 >-h •m· cm in η- σι

g* 0) 0 «H rH »H

;2 0) <u a

W 4J « H

> m ε •rt w + e H 5 «0 --

'.Λ ^ M 4J

B il H H

•H (C JJ

n n m 2 3 o o o o m o

3 9- 3 CM CM (N m rH CM

|2 c a £ 2 -2 ” 3 e 12 g e> > Wt ·* ’JS «w m co cm co co co 55 • h *i — m cm m m n pj 3 :« m op ...... .5 “* tn ia E ^ oooooo v *® ή E σι ·£ - mc +1+1 +1+1 +1+1 m

X <U - ^ X

rt rt c XU m ri o co o o O 14 *h ro σι ro m in m r- c :::.&*) ö> E +1 *···».«.*. q Q< 4-> O M —’ Ή CM CM CM CM CM m

<0 dj r—I

«C <fl 0 ·Η ^ * ' (Q

•H l-l -H rH H —. -n c 4-> .a o s ε ή <h

0- Η JO \ \ E Ξ CO

1- i c c o en en \ \

;3-h<u j* E E en O’ 4J

r-i C Ό rH EE :« (0 ·Η ·Η (¾ O O >

>1 -H Q) .H rH (N O o MC

S di 4-) rH —« ' <H CM 4J

m >» —' —’ 4J

5 2 c c c ’r ^ 03 in 3^.h-hCC m rt -H ·> .H -H *”

O 3 r—I >, 4J + 7! 4J

·-'.* Of rt nH 03 M ^ o -X Ή o rt rt *5J; ·τ, >

3 2 & ^ ^ .E ^ C

' ••H 3 « « - * rt 3 “ e >1 >1 S. 5.

rt Q) S. Λ 5? 4J

E* fl, e £ Λ >,

4J ·· JJ

» <*> a>

h m 4J

ε ·* rH 03 ns cq

j> cm ro *r in vo X

2i 79554 Käsittely suoritettiin jokaisessa eläimessä sekä oikeassa että vasemmassa silmässä tiputtamalla 3 pisaraa 3 kertaa päivässä kaikkiaan 6 päivän ajan seuraavasti: - triamkinolonin liuos (10% suolaliuoksessa) vasemmassa silmässä (LE); - hyaluronihapponatriumsuolan liuosta, hyalektiini-fraktio (10 mg/ml) + triamkinolonia (10%) oikeassa silmässä (RE).

Anti-inflammatorinen vaikutus dekstraanilla indusoituun flo-gistiseen (tulehdukselliseen) reaktioon arvioitiin tutkimalla silmää rakolampulla seuraavin välein: 0, 1, 3, 24, 48 tuntia, 3 päivää, 4 päivää, 5 päivää ja 6 päivää.

Aikaväleissä silmän tutkimuksessa tehtiin seuraavat havain- * not: - sarveiskalvon ja sidekalvon tila hypermian, turvotuksen mahdollisen esiintymisen suhteen ja etenkin iiriksen tutkimus, joka on normaalisti herkkä flogistisen tulehduksen suhteen inflammatoristen aineiden intraokulaarisen injektion jälkeen; - Tyndall-vaikutus, jossa enemmän tai vähemmän intensiivinen sameus ("nubecula") on osoituksena hiuk-kasmaisten (inflammatoristen) elementtien läsnäolosta etukammiossa.

Tutkimuksen tulos esitettiin subjektiivisena vaotuksena (0 - 3) suhteessa havaitun vaikutuksen asteittaisuuteen.

Taulukossa 6 esitetyistä tuloksista voidaan nähdä, että triamkinolonin antamisella on anti-inflammatorinen vaikutus iirikseen ja se saa aikaan sameuden (Tyndalla-ilmiö) häviämisen etukammiossa. Inflammatorinen prosessi, joka on selvä ensimmäisestä...kolmannesta tunnista kolmanteen...neljänteen päivään asti, vähenee asteittain, kunnes lähes normaalit olosuhteet ovat palautuneet, jolloin silmä on täysin kuula-kas 6. päivänä. Toisaalta hyaluronihapponatriumsuolan, hyalektiini-fraktion antaminen yhdessä triamkinolonin kanssa 22 79554 vähentää yllä esitettyinä aikoina havaittua intraokulaarista tulehdusta suhteessa yksinään triamkinolonin antamiseen.

Tämä tarkoittaa, että flogistisen iiriksessä esiintyvän prosessin ja etukammion sameuden nähdään vähentyneen 24. tunnissa, progressiivisen vähenemisen tapahtuessa 48 tunnissa ja inflammatorisen reaktion koko poistumisen tapahtuessa neljännestä päivästä alkaen.

Sidekalvossa ja sarveiskalvossa ei havaittu olennaisesti mitään huomattavia reaktioita dekstraanin intra-okulaarisen injektion jälkeen.

Siten triamkinolonin antaminen yhdessä hyaluronihappo-frak-tion kanssa paransi lääkkeen aktiivisuutta kuten nähdään kanin silmän nopeammasta regeneroitumisesta.

23 79554 :5 o o o o g M K K *

£ Di O O O O

*2 o o -<r m

a H

vo (-50 0 0 0 M o o o o ^ H * ·. ^ £ o: o o o o :5 o o cm in W ·» * ·* ·.

tn i-3 o o ·—i i-H

*rt o o o o •® £3 ^ κ > CS O o O o

H

'·*£ · o o cm

Λ H

(-3 O O CM CM

m S2 *5 O O CM ·*Γ td > £3

SI 3 es o O o O

* g Ä o o o o en £3 v ·- *. *.

5 3 1-3 o o m en 2 · X z rt n) 3 1 2 xm a ° ° " S i SS S § a«oo-,-< -See WBS ·Λ ** S o O O O -h E rt rt m < *5 oo £ £3 -< *2 s φ »53 S S ^ o X O ^ m +4 ^ φ M m

m id 7? r-ί W

2 O JS 7; § o o ^ in rt M

z S U S H CS O O CM CM JS 5 r- ‘i o K ” 3 «. rt e -p »JZ 2·^ o m o o nj rt rt ·-< O m ^ *»· U *k ·· s - n "J ® z cm h3 o o m m . j4h*j m Z Λ -h e 2 VOSSD »H »H 2 c S D _ Ή <H 5 - - O < E-< rt O r-k O r~ -H Ή ·* 2 5 iA4 MM *H £3 -k - ^ CC - f.®

*050 *i DJ O o m cm 0 0 9 5S

S E-> U3 e I—I rH r 2 -¾

m D 3 o o o r- OO

SCO ·*> K ~ cc 2 H « rt 1-3 Z en (-3 o o en cm -h -h r* £ g t- M k> V —< O ^ ^ z ΐ *S n rt ·ή O C rt rt S > 5 (X* h3 , O CM CM [-> -H -H ^ C J Ti &3 ‘ * k K e e e ®H £ es o o o ^ § g § Z C 2 cM.oom >, >1 O < Z ** £3 ^ ~ _ 4-1 -P ^ ^ ^ K te U *Ή 1-3 O #—( M O ιΗ Ή 3 2 "

o & w o) « 5 ZJ S

(3 M W U *J ? n v

X £3 O OOOO 01 «1 5 ni «J

K O O W * «. ·. *. ad mb ** ® 5 «oooo MM ^ OOOO * ‘-25 £3 ·. « ^ s :rt :rt £ m ®

a o o o o BSO^U

H .H O P rt o w w U 0) 13 ο Λ SS -H tn o rt 3; S e tn t* 2 "2 rt rt ad «2^ > o e 2

5 ° .H Id rH

·* rt rt m m -m ή rt > -σ ·-. « n JS m Ό M C u O :rt :rt H rt >1 -*4 £3 £3 I-) (o >

WW6hM O CC X

24 79554 III. Hyaluronihappoa apuaineena sisältävän EGF:n parantava aktiivisuus Käytettiin seuraavia aineita:

Valmiste A - EGF (epidermaalinen kasvutekijä) liuotettuna suolaliuokseen (0,5 mg/5 ml).

Valmiste B - hyaluronihapponatriumsuola, hyalastiini-fraktio (molekyylipaino noin 100.000) liuotettuna suolaliuokseen (10 mg/ml).

Kokeet suoritettiin koiraspuolisilla New Zealand-albiinoka-neilla (keskimääräinen paino 1,8 kg). Eläimet alistettiin noin 5 päivän sopeuttamisjakson jälkeen sarveiskalvon epi-teeliseen vammaan sopivissa Novesinalla suoritetun paikallispuudutuksen olosuhteissa (4%). Vamma tehtiin leikkaamalla yhdestä silmästä pyöreä alue optisella alueella, joka aikaansaatiin terävillä kulmilla varustetulla koverolla lasisylinterillä (0 3 mm).

Eläimet jaettiin ryhmiin, joissa kussakin oli 5 eläintä ja jotka alistettiin farmakologiseen käsittelyyn sidekalvotipu-tuksella seuraavasti:

Ryhmä Käsittely

Ryhmä 1 (kontrolli) Suolaliuos

Ryhmä 2 EGF-liuos (valmiste A)

Ryhmä 3 Hyaluronihapponatriumsuolan, hyalastiini-fraktion liuos + EGF-liuos - valmisteen A + valmisteen B yhdistelmä suhteessa 1:1 valmisteen C muodo st «uni seksi Käsittely suoritettiin oikeaan silmään (RE) tiputtamalla si-„ dekalvolle 2 pisaraa joka 8. tunti 3 koko antoa varten.

25 79554

Sarveiskalvon epiteelin paraneminen arvioitiin tutkimalla silmää ja valokuvaamalla rakolampulla eri aikavälein leikkauksen jälkeen: 0, 8, 16, 24, 32, 40 ja 48 tuntia.

Taulukossa 7 esitetty oftalmologinen tutkimus 1 osoitti, että kontrolleissa (ryhmä 1) täydellinen paraneminen saatiin aikaan (5/5 eläintä) 48 tunnin kuluttua vamman jälkeen.

EGF:llä käsitellyissä eläimissä (ryhmä 2) paranemisprosessi oli ilmeinen jo 24 tunnin kuluttua leikkauksen jälkeen huomattavalla tehokkuudella (4/5 eläintä). Valmisteella C, joka sisälsi hyaluronihapponatriumsuolaa, hyalastiini-fraktiota + EGF:ä, käsitellyissä eläimissä (ryhmä 3) paranemisprosessi oli täydellinen kaikissa eläimissä (5/5) jo 16 tunnin kuluttua leikkauksen jälkeen.

Nämä tulokset osoittavat, että hyalastiini-hyaluronihappo-fraktion käyttö EGF:n apuaineena parantaa paranemisprosessia edistämällä nopeampaa tehokasta sarveiskalvovammojen paranemista.

26 79554

Taulukko 7

SARVEISKALVON EPITEELIN VAMMOJEN PARANEMINEN

Ryhmä Käsittely Tuntia leikkauksen jälkeen 0 8 16 24 48 1 Suolaliuosta + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 EGF + + + - (Valmiste A) + + + - + + + - + + + + + + + - 3 Hyaluronihappoa + + - + EGF (Valmiste C) + + - + + + + - + + - + = parantumaton silmä - = parantunut silmä 27 7 9 5 5 4 IV. Hyaluronihappoa apuaineena sisältävän gentamysiinin antimikrobinen aktiivisuus

Seuraavia aineita käytettiin: - suolaliuokseen liuotettua gentamysiiniä (50 mg/ml) - hyaluronihapponatriumsuolaa, hyalektiini-fraktiota (2 mg/ml)

Septinen tulehdus aiheutettiin 11 kanin molempiin silmiin antamalla intraokulaarinen injektio titrattua Pseudomonas aeruginosa-suspensiota (0,1 ml). Septisen tulehduksen omaa-ville kaneille annettiin hyaluronihappoa, hyalektiini-fraktiota yhdessä gentamysiinin kanssa tiputtamalla oikeaan silmään ja vasempaan silmään annettiin gentamysiiniä puskuroidussa suolaliuosapuaineessa. Käsittely (3 pisaraa joka 6. tunti) aloitettiin välittömästi infektoivan aineen injektion jälkeen ja sitä jatkettiin, kunnes infektio oli hävinnyt. Kanien silmiä tutkittiin joka päivä rakolampulla.

Käsittely hyaluronihapon ja gentamysiinin yhdistelmällä tuotti septisen infektion nopeamman häviämisen verrattuna yksinään antibiootin antamiseen. Tämä päätelmä on selvä taulukossa 8 esitetyistä arvoista.

28 79554

Taulukko 8

HYALURONIHAPON HYALEKTIINI-FRAKTIOTA APUAINEEN SISÄLTÄVÄN GENTAMYSIININ VAIKUTUS INTRAOKULAARISEEN SEPTISEEN TULEHDUKSEEN

Käsittely Päivää tulehduksen käynnistämisestä_ 1 2 3 4 5 6 7

Gentamisiiniä + puskurisuola- liuosta 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 36,3 100

Gentamisiiniä + hyaluronihapon hyalektiini- fraktiota 0,0 0,0 9,0+ 27,2+ 72,7+ 100 100

Arvot on esitetty prosenttimäärinä (tulehduksesta parantuneiden silmien määrä käsiteltyjen silmien määrän suhteen).

+ = merkittävä ero vs. puskuriapuaine (alle 0,05, Fischerin tarkka T-testi).

29 79554

Silmälääkkeiden lisäesimerkkejä (vaikkakaan ei-rajoittavia), joita voidaan käyttää keksinnön mukaisten HA-fraktioiden kanssa, ovat seuraavat: antibiootit: kloramfenikoli neomysiini aureomysiini myksiini ja polymyksiini basitrasiini mysetiinit hormonit: nandroloni ja nandroloni- sulfaatti puudutusaineet (paikalliset): henoksinaatti ja sen hyd- rokloridi antiviraaliset aineet: jodideoksiuridiini jodideoksisytidiini anti-inflammatoriset aineet: deksametasoni ja sen fosfaatti vasopressorit ja vasokonstriktorit: synefriini ja neosynefriini

Perustuen yllä esitetyissä kokeissa saatuihin tuloksiin voidaan päätellä, että hyaluronihapponatriumsuolan liuoksia (sekä hyalastiini - että hyalektiini-fraktioina) voidaan käyttää silmälääkkeiden apuaineena ja ne näyttävät olevan tehokkaita sellaisenaan erityyppisiä lääkeaineita varten, joilla on erilaisia biologisia vaikutuksia. Esimerkiksi lääkkeitä, jotka sisältävät anti-glaukooma-aineita, kuten pilokarpiininitraattia, antiallergisia ja anti-inflammato-risia aineita, kuten triamkinolonia, kudoksen parantamista ja solukasvua edistäviä aineita silmäkudoksen paranemisen edistämiseksi, kuten EGF:ä ja antibiootteja, kuten streptomysiiniä ja gentamysiiniä, joiden mioottista, anti-inflam- 3o 79554 matorista, parantavaa ja vastaavasti antimikrobista aktiivisuutta on selostettu, voidaan kaikkia antaa tehokkaasti käyttämällä apuaineena HA:ta.

Silmälääkkeiden valmisteet, joissa on apuaineena erilaisia molekyylipainoja omaavia hyaluronihappofraktioita, ovat osoittautuneet tehokkaasti siedettäväksi ja ne sopivat yhteen sarveiskalvon epiteelin kanssa ilman, että ne aiheuttavat herkistymisilmiöitä.

On myös mahdollista todeta yllä esitetyistä arvoista, miten tämä biologinen tuote, hyaluronihappo, on tehokas apuaine, joka pystyy parantamaan apuainetta sisältävien lääkkeiden in vivo-biokäytettävyyttä ja voimistaa tällaisten lääkkeiden farmakologista aktiivisuutta. Hyaluronihappo-fraktioiden käyttö lääkeaineen apuaineena saa etenkin aikaan: pilokarpiininitraatin mioottisen aktiivisuuden kasvun pidentäen samalla lääkkeen aktiivisuusaikaa; triamkinolonin anti-inflammatorisen aktiivisuuden kasvun dekstraanilla indusoidussa tulehduksessa ja flogistisen prosessin palautumisen lyhemmissä ajoissa verrattuna yksinään triamkinolonilla saatuihin tuloksiin; epidermaalisen kasvutekijän (EGF) suojatoiminnan kasvun sarveiskalvon pintavammoissa ja selvän sy-nergismin ja vähenemisen paranemisajoissa verrattuna yksinään EGF:llä saatuihin regeneroitumis-aikoihin; ja antibioottien, kuten gentamysiinin in vivo biologisen aktiivisuuden kasvun.

Kuten yllä esitetyistä tuloksista käy ilmi voidaan tätä biologista polymeeriä, hyaluronihappoa, käyttää luonteeltaan ja vaikutusmekanismiltaan mitä erilaisimpien lääkeaineiden apuaineena. Tästä voidaan edelleen päätellä, että se soveltuu käytettäväksi apuaineena lukuisissa muissakin silmälääkkeissä.

31 79554

Hyaluronihappofraktioiden valmistus

Esimerkki 1: Menetelmä sellaisten HYALASTIINI ja HYALEKTIINI-fraktioiden valmistamiseksi, joilla ei ole tulehduksia aiheuttavaa aktiivisuutta

Kananhelttoja, jotka ovat joko tuoreita tai pakastettuja (3000 g), hienonnetaan lihamyllyssä ja sitten ne homogenoidaan huolellisesti mekaanisessa homogenointilaitteessa. Näin saatu tahna sijoitetaan ruostumattomasta teräksestä (AISI 316) olevaan säiliöön tai lasisäiliöön, jossa on 10 tila-vuusosaa vedetöntä asetonia. Koko sisältöä sekoitetaan sitten 6 tuntia nopeudella 50 kierrosta minuutissa ja se jätetään erottumaan 12 tunniksi, minkä jälkeen asetoni imetään lapolla pois ja poistetaan.

Tämä uuttamisprosessi toistetaan, kunnes poistettu asetoni on saavuttanut oikean kosteustason (Karl-Fischer-menetelmä).

Saatava aine sentri£ugoidaan sitten ja tyhjökuivatetaan sopivassa lämpötilassa 5-8 tunnin ajan. Tällä menetelmällä saadaan noin 500 - 600 g kuivaa jauhetta kananheltoista.

300 g kuivaa jauhetta alistetaan sitten papaiinillä (0,2 g) ... suoritettavaan entsymaattiseen hajotukseen puskuroidussa vesipitoisessa väliaineessa, jossa on fosfaattipuskuria, kysteiinihydrokloridin sopivan määrän läsnäollessa. Tätä seosta sekoitetaan sitten 24 tuntia nopeudella 60 kierrosta minuutissa 60 - 65°C:n vakiolämpötilassa. Tämä koko massa jäähdytetään 25°C:seen lisäämällä 60 g Celite ^-tuotetta ja sekoitusta jatketaan vielä tunnin ajan.

Saatavaa seosta suodatetaan, kunnes saadaan kirkas neste.

Tämä kirkas neste alistetaan sitten molekyyliultrasuodatuk-seen sellaisten kalvojen avulla, joiden molekyylien ekskluu-sioraja on 30.000, niiden molekyylien pidättämiseksi kalvolla, joiden molekyylipaino on yli 30.000. 5-6 alkuperäis-tilavuusosaa ultrasuodatetaan samalla, kun tislattua vettä 79554 32 lisätään jatkuvasti tuotteeseen. Tislatun veden lisäys keskeytetään ja tuotetta ultrasuodatetaan, kunnes sen tilavuus on vähentynyt yhteen kolmasosaan alkuperäisestä tilavuudesta.

Jäännösneste asetetaan 0,1 molaariseksi lisäämällä natrium-kloridia ja lämpötila saatetaan 50°C:seen. 45 g setyyli-pyridiniumkloridia lisätään samalla, kun tuotetta sekoitetaan nopeudella 60 kierrosta minuutissa. Tätä seosta sekoitetaan 60 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 50 g Celite ®-tuotetta. Sekoitettaessa tuotteen lämpötilaa alennetaan 25eC:seen ja muodostunut sakka otetaan talteen sentrifugoi-malla. Näin saatu sakka suspentoidaan 0,01 molaariseen natriumkloridi-liuokseen (5 litraa), joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia. Sitä sekoitetaan vielä 60 minuuttia 50°C:ssa. Lämpötila alennetaan 25°C:seen ja sakka sentri-fugoidaan.

Pesumenetelmä toistetaan kolme kertaa ja sakka kerätään lopuksi säiliöihin, jotka sisältävät 3 litraa 0,05 molaarista natriumkloridiliuosta, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia. Tätä sekoitetaan nopeudella 60 kierrosta minuutissa 60 minuuttia ja pidetään 25°C:n vakiolämpötilassa 2 tuntia. Emäliuos poistetaan sentrifugoinnin avulla.

Menetelmä toistetaan sitten useita kertoja 0,1 molaarisella natriumkloridiliuoksella, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia. Tämä seos sentrifugoidaan ja emäliuos poistetaan. Sakka dispergoidaan 0,30 molaariseen natriumkloridi-liuokseen, joka sisältää 0,05 % setyylipyridiniumkloridia (3 1). Seosta sekoitetaan ja sekä sakka että kirkas liuos otetaan talteen. Uuttaminen toistetaan sakalla vielä 3 kertaa, joka kerta käyttämällä 0,5 litraa samaa vesiliuosta.

Lopuksi jäännössakka poistetaan ja kirkkaat liuokset yhdistetään yhteen ainoaan säiliöön. Nesteen lämpötila nostetaan 50°C:seen sekoittaen. Neste saatetaan sitten 0,23 molaariseksi natriumkloridilla. Lisätään 1 g setyylipyridiniumkloridia ja jatketaan sekoitusta 12 tuntia. Seos jäähdytetään 33 79554 25°C:seen, sitten se suodatetaan, ensin Celite ®-kerrosten ja sitten suodattimen (1 yum) läpi.

Saatava seos saatetaan sen jälkeen vielä molekyyliultra-suodatukseen, jolloin käytetään kalvoja, joiden molekyyli-ekskluusioraja on 30.000. Ultrasuodatetaan 3 alkutilavuus-määrää lisäämällä 0,33 molaarista natriumkloridiliuosta. Natriumkloridiliuoksen lisäys lopetetaan ja nesteen määrä vähennetään neljäsosaan sen alkumäärästä.

Näin konsentroitu liuos saostetaan kolmella tilavuusosalla 95 %:sta etanolia sekoittaen (60 kierrosta minuutissa) 25eC:n lämpötilassa. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla ja emäliuos poistetaan. Sakka liuotetaan 1 litraan 0,1 molaarista natriumkloridiliuosta ja saostamiskäsittely toistetaan kolmella tilavuusosalla 95 %:sta etanolia.

Sakka otetaan talteen ja pestään, ensin 75 %:lla etanolilla (kolme kertaa), sitten absoluuttisella asetonilla (kolme kertaa).

Näin saadun tuotteen (HYALASTIINI + HYALEKTIINI-fraktiot) keskimääräinen molekyylipaino on 250.000 - 350.000.

Hyaluronihapon saanto on 0,6 % alkuperäisestä tuoreesta kudoksesta.

Esimerkki 2 - Menetelmä HYALASTIINI-fraktion valmistamiseksi esimerkissä 1 esitetyllä menetelmällä saadusta seoksesta:

Esimerkissä 1 esitetyllä menetelmällä saatu seos liuotetaan pyrogeeni-vapaaseen tislattuun veteen, jolloin 1 ml:aan vettä annostellaan 10 mg tuotetta. Näin saatu liuos alistetaan molekyyliultrasuodatukseen käyttämällä kalvoja, joiden molekyyliekskluusioraja on 200.000, konsentrointitekniikalla ja lisäämättä vettä kalvolle. Kun ultrasuodatusprosessissa käytetään kalvoa, jonka sulkuraja on 200.000, molekyyli-painoltaan yli 200.000 olevat molekyylit eivät pääse kalvon läpi, kun taas pienemmät molekyylit kulkevat sen läpi veden 34 79554 kanssa. Suodatusprosessin aikana ei lisätä vettä kalvon yläpuolella olevaan osastoon. Tästä syystä tämän osaston liuosmäärä vähenee ja molekyylipainoltaan yli 200.000 olevien molekyylien konsentraatio kasvaa. Ultrasuodatusta jatketaan sitten kunnes tilavuusmäärä kalvolla on vähentynyt 10 %:iin alkutilavuudesta. Kaksi tilavuusmäärää pyrogeeni-vapaata kaksi kertaa tislattua vettä lisätään ja liuos ultrasuodatetaan taas, kunnes tilavuus on vähentynyt yhteen kolmasosaan. Käsittely toistetaan vielä kaksi kertaa.

Liuos, joka kulkee kalvon läpi, saatetaan 1,0 molaariseksi natriumkloridilla ja sitten se saostetaan neljällä tilavuus-osalla 95 %:sta etanolia. Sakka pestään kolme kertaa 75 %:sella etanolilla ja sitten se tyhjökuivataan.

Näin saadun tuotteen (HYALASTIINI-fraktio) keskimääräinen molekyylipaino on 50.000 - 100.000.

Hyaluronihapon saanto on 0,4 % alkuperäisestä tuoreesta kudoksesta.

Esimerkki 3 - Menetelmä HYALEKTIINI-fraktion valmistamiseksi:

Esimerkissä 2 selostetulta ultrasuodatuskalvolta, jonka molekyyliekskluusioraja on 200.000, kerätty konsentroitu liuos siirretään säilöön, jossa sitä laimennetaan vedellä, kunnes saadaan liuos, joka sisältää 5 mg/ml hyaluronihappoa määritettynä kvantitatiivisella glukuronihapon määritykseen perustuvalla analyysillä.

Liuokseen lisätään natriumkloridia kunnes se tulee 0,1 molaariseksi natriumkloridin suhteen ja sitten hyaluronihappo saostetaan 4 tilavuusosalla 95 %:sta etanolia. Sakka pestään kolme kertaa 75 %:sella etanolilla ja sitten se tyhjökuivataan.

Näin saadun tuotteen (HYALEKTIINI-fraktion) keskimääräinen molekyylipaino on 500.000 - 730.000. Tämä vastaa erittäin puhdasta hyaluronihapon fraktiota, jonka määritelty mole-kyyliketjun pituus on noin 2.500 - 3.500 sakkaridiyksikköä.

35 79554

Hyaluronihapon saanto on 0,2 % alkuperäisestä tuoreesta kudoksesta.

Farmaseuttiset valmisteet

Hakemuksen yleisessä osassa annettu selostus on osoittanut, että HYALASTIINI- ja HYALEKTIINI-fraktioit soveltuvat aktiviteetiltään hyvin farmaseuttisiin sovellutuksiin. Farmaseuttisia valmisteita voidaan valmistaa yhdistämällä keksijöiden löytämät HYALASTIINI- ja HYALEKTIINI-fraktiot tai niiden kalium- tai natriumsuolat farmaseuttisesti sopivien kantoaineiden, laimentimien tai täyteaineiden kanssa ja erilaisina annostuksina valmisteen käytön mukaan.

Haavan parantamiseksi HYALASTIINI-fraktion valmisteet levitetään vahingoittuneelle ihoalueelle jossakin yllä esitetyssä annostusmuodossa, so. joko voiteena, spraynä, harsotyynyllä, kuivana jauheena tai intradermaalisena injektiona .

Intra-artikulaarista käyttöä varten HYALEKTIINIn valmisteet annetaan yleensä kahden ml:n annostusnopeudella /nivel, joka otetaan joko valmistetusta pienpullosta tai esitäytetystä injektioruiskusta, kuten yllä on esitetty.

Hyaluronihapon, etenkin olennaisesti puhtaiden hyalektiini-ja hyalastiini-fraktioiden on todettu olevan tehokas apuaine tai täyteaine käytettäväksi yhdessä erilaisten, oftalmisen soveltuvuuden tai aktiivisuuden omaavien lääkeaineiden kanssa. HA-fraktioita lääkeaineen apuaineena sisältävät farmaseuttiset koostumukset ovat erittäin käyttökelpoisia, koska HA-fraktioilla on hyvä siedettävyys silmän suhteen ja hyvä yhteensopivuus sarveiskalvon epiteelin kanssa. HA-fraktioiden käyttö saa lisäksi aikaan keinon silmälääkkeiden in vivo biologisen aktiivisuuden parantamiseksi todella. Erityisten hyalektiini- ja hyalastiini-HA-fraktioiden käyttö on lisäksi käyttökelpoista ja tärkeää, koska näillä fraktioilla ei ole ei-toivottuja inflammatorisia sivureaktioita käytettäessä niitä silmässä.

Claims (13)

36 79554

1. Menetelmä olennaisesti puhtaan, ei-inflammatorisen hyaluronihappofraktion valmistamiseksi, tunnettu siitä, että - uutetaan molekyylipainoiltaan erilaisten hyaluroni-happojen seos hyaluronihappoa sisältävästä kudoslähtö-aineesta, j a - alistetaan saatava seos molekyylisuodatukseen sellaisen hyaluronihappofraktion saamiseksi, jonka keskimääräinen molekyylipaino on n. 50.000 - 100.000, n. 250.000 - 350.000 tai n. 500.000 - 730.000, jolloin mainittu fraktio on olennaisesti vapaa hyal-uronihapoista, joiden molekyylipaino on alle 30.000.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että hyaluronihapposeos alistetaan molekyyli-suodatukseen, jossa käytetään kalvoa, jonka molekyylipainon mukainen ekskluusioraja on 30.000, niiden molekyylien erottamiseksi, joiden molekyylipaino on yli 30.000, jolloin kalvolle jää ensimmäinen hyaluronihappofraktio, joka on olennaisesti vapaa hyaluronihapoista, joiden molekyylipaino on alle 30.000.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatavan ensimmäisen hyaluronihappofraktion keskimääräinen molekyylipaino on 250.000 - 350.000.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että - ensimmäinen hyaluronihappofraktio alistetaan edelleen molekyyli-ultrasuodatukseen, jossa käytetään kalvoa, jonka molekyylipainon mukainen ekskluusioraja on 200.000, niiden molekyylien erottamiseksi, joiden molekyylipaino on yli 200.000, - ultrasuodatusta jatketaan kunnes ultrasuodatukseen alistettavan liuoksen tilavuus on pienentynyt 10 %:iin alkutilavuudesta, ja I; 37 79554 - kalvon läpi kulkeva seos kerätään sellaisen toisen hyaluronlfraktlotuotteen saamiseksi, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 50.000 - 100.000.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kerätään ultrasuodatusvaiheen jälkeen kalvolle jäänyt seos kalvolla, jonka molekyylipainon mukainen ekskluusioraja patenttivaatimuksessa 4 on n. 200.000, jolloin saadaan kolmas hyaluronihappofraktiotuote, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 500.000 - 730.000.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hyaluronihapposeos saadaan alistamalla lähtökudosaine liuotinuuttoon, esim. asetonilla suoritettavaan liuotinuuttoon.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että saatava hyaluronihapposeos saatetaan sitten entsymaattiseen hajotukseen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että entsymaattinen hajotus suoritetaan papa-iinillä.

9. Menetelmä hyaluronihapposeoksen puhdistamiseksi tulehduksia aiheuttavista aineista, tunnettu siitä, että hyaluronihappoa sisältävä seos alistetaan molekyylisuodatuk-seen sellaisen hyaluronihappofraktion tuottamiseksi, jonka keskimääräinen molekyylipaino on n. 50.000 - 100.000, n. 250.000 - 350.000 tai n. 500.000 - 730.000, joka on olennaisesti vapaa hyaluronihapoista, joiden molekyylipaino on alle 30.000, ja joka muodostaa olennaisesti puhtaan, ei-inflammatorisen hyaluronihappofraktion.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen puhdistusmenetelmä, tunnet-t u siitä, että hyaluronihapposeos alistetaan molekyyli-suodatukseen, jossa käytetään kalvoa, jonka molekyylipainon mukainen ekskluusioraja on 30.000, niiden molekyylien erottamiseksi, joiden molekyylipaino on yli 30.000, jolloin kai- 38 7 9 5 5 4 voile jää ensimmäinen hyaluronihappofraktio, joka on olennaisesti vapaa sellaisista hyaluronihapoista, joiden mole-kyylipaino on alle 30.000.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen puhdistusmenetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen hyaluronihappo-fraktion keskimääräinen molekyylipaino on 250.000 - 350.000.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen puhdistusmenetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen hyaluronihappofraktio alistetaan edelleen molekyyli-ultrasuodatukseen, jossa käytetään kalvoa jonka molekyylipainon mukainen eks-kluusioraja on 200.000, niiden molekyylien erottamiseksi, joiden molekyylipaino on yli 200.000, ultrasuodatusta jatketaan kunnes ultrasuodatukseen alistettavan liuoksen tilavuus on pienentynyt 10 %:iin alkutilavuudesta, ja kalvon läpi kulkeva seos kerätään sellaisen toisen hyaluronifraktiotuotteen saamiseksi, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 50.000 -100.000.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen puhdistusmenetelmä, tunnettu siitä, että kerätään ultrasuodatusvaiheen jälkeen kalvolle jäänyt seos kalvolla, jonka molekyylipainon mukainen ekskluusioraja patenttivaatimuksessa 4 on n. 200.000, jolloin saadaan kolmas hyaluronihappofraktiotuote, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 500.000 - 730.000. li 39 7 9 5 5 4