WO2019022467A1 - 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산의 정량 방법 - Google Patents

무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산의 정량 방법 Download PDF

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WO2019022467A1
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cell
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protein synthesis
free protein
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김동명
유태현
이경호
장연재
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충남대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying an amino acid using a cell-free protein synthesis system, and more particularly, to a method for quantifying an amino acid using a cell-free protein synthesis system, (b) mixing an assay sample containing a target amino acid into the cell-free protein synthesis reaction mixture to perform cell-free protein synthesis; (c) measuring a signal of the synthesized protein; And (d) calculating the concentration of the target amino acid by comparing the intensity of the measured signal with a standard concentration curve for each amino acid according to a signal of the protein prepared using a standard sample, A method for screening a substance for preventing or treating an amino acid metabolism-related disease, and a screening method for a transaminase substrate.
  • Amino acid analysis has been actively applied in various fields such as food, environment, fine chemicals, medicine, and diagnosis.
  • the food industry quantifies amino acids when analyzing the contents of nutrients such as amino acids contained in foods, and the content and composition of various amino acids must be considered in animal feeds. do.
  • the transfer of amine groups by enzymes such as transaminases and the decomposition of carboxyl groups by amino acid dicarboxylase are used in the synthesis of various pharmaceutical intermediates and the like. In many cases, these reactions Amino acid synthesis and transformation, amino acid analysis techniques can be usefully used as a screening tool for screening substrates and for discovering and engineering new enzymes in reactions carried out by these enzymes.
  • amino acid quantification is actively applied in the field of medicine and diagnosis.
  • the profile of plasma free amino acids in cancer patients exhibiting distinctive features from normal persons is a diagnostic of cancer patients And can be used as a new biomarker for prognosis (Yu Gu, Gu et al. Journal of Translational Medicine (2015) 13:35; Hong-Shiee Lai, Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 267-276; Miyagi Y, PLoS One. 2011; 6 (9): e24143.).
  • alanine aminotransferase (ALT) / aspartate aminotransferase (ALT) activity assay a commonly used method for the diagnosis of liver disease, is performed by the activity of ALT and AST in the blood sample as follows The method of measuring alanine, aspartate and glutamate concentrations involved in these reactions can be used for liver function tests.
  • the cell-free protein synthesis method can overcome many limitations of the cell-based protein synthesis method.
  • protein synthesis occurs in highly complex, regular, and limited cellular structures, but since cell-free synthesis is performed in an open in vitro manner, the components necessary for protein synthesis are individually manipulated And it is advantageous in that it is simple to operate because a simple device is used.
  • a cell-free protein synthesis method using a yeast extract as an amino acid source, and a cell-free protein synthesis method characterized by controlling the pH using an enzyme have been developed (Korean Patent Publication No. 10-2017-0014459 Korean Patent Registration No. 10-1671688).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for easily quantifying amino acids.
  • the progress of the protein synthesis reaction depends on the exogenous addition of amino acids, Considering that the amino acid can be quantitatively analyzed, it has been confirmed that the objective amino acid can be quantified quickly and inexpensively through the development of a method for directly or indirectly measuring the signal intensity of the reporter protein produced by the cell-free protein synthesis method Thereby completing the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a method for preparing a cell-free protein synthesis reaction mixture comprising the steps of: (a) preparing a cell-free protein synthesis reaction mixture not containing a target amino acid; (b) mixing an assay sample containing a target amino acid into the cell-free protein synthesis reaction mixture to perform cell-free protein synthesis; (c) measuring a signal of the synthesized protein; And (d) calculating the concentration of the target amino acid by comparing the intensity of the measured signal with a standard concentration curve for each amino acid according to a signal of the protein prepared using a standard sample, .
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosis of an amino acid metabolism-related disease, which comprises comparing the concentration of amino acid quantified according to the above method to a normal control.
  • the present invention also provides a method for screening a substance for preventing or treating an amino acid metabolism-related disease.
  • Another object of the present invention is to provide a process for preparing a compound of formula (I), comprising: (a) reacting a transaminase to a mixture of a candidate amine providing substrate and an amine accepting substrate; (b) measuring the concentration of the amino acid after the reaction in the reaction solution; And (c) comparing the amino acid concentration of step (b) with a control.
  • the present invention also provides a method for screening a transaminase substrate.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing an amine-containing substrate, comprising: (a) reacting a candidate enzyme with a mixture of an amine-providing substrate and an amine- (b) measuring the concentration of the amino acid after the reaction in the reaction solution; And (c) comparing the amino acid concentration of step (b) with a control.
  • the method for quantifying amino acids according to the present invention can be used in various industries because it can quantify amino acids in a short time at a low cost.
  • FIG. 1 is a reaction formula showing the reaction progressed by ALT and AST used as main markers of liver function diagnosis.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the concept of a cell-free protein synthesis system used in the amino acid quantitation method of the present invention.
  • Figure 4 relates to the results using FBS as an analytical sample.
  • A is a graph showing fluorescence signals of sfGFP when heat-treated FBS is used.
  • NC is a negative control reaction mixture containing no sfGFP DNA
  • PC is a positive control reaction mixture containing sfGFP DNA and all amino acids RM-Ile, RM-Leu, RM-Lys, RM-Met, RM-Phe, RM-Tyr or RM-Val respectively represent arginine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, Phenylalanine, tyrosine, or valine.
  • B is a graph showing the concentration of amino acids contained in the untreated FBS analyzed by a standard amino acid analyzer, and Arg, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Tyr or Val are arginine, isoleucine, leucine, lysine, Methionine, phenylalanine, tyrosine or valine.
  • Fig. 5 relates to the results obtained by using FBS without heat treatment as an analytical sample, heat treatment, or heat treatment and filtration.
  • A is a graph showing fluorescence signals of sfGFP when heat-treated FBS (black bar), heat-treated FBS (gray bar), and heat-treated and filtered FBS (white bar) are used.
  • B is an image showing the RNA present in the reaction mixture when FBS without heat treatment is used.
  • C is an image showing the RNA present in the reaction mixture when heat-treated and filtered FBS is used.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an outline of quantitative determination of amino acid using a glucose meter.
  • Figure 7 relates to the results of heat treatment as an analytical sample and filtration using filtered FBS.
  • B is a graph showing the concentration (white bars) of amino acids quantified according to the present invention and the concentration (gray bars) of amino acids analyzed by a standard amino acid analyzer. * Means p> 0.05.
  • Figure 8 shows the concentration of alanine, cysteine, glycine, histidine, proline, serine, threonine or tryptophan on sfGFP fluorescence intensity It is a standard curve graph showing.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of using heat treated and filtered FBS as an analytical sample, and showing the concentrations of glycine, histidine, serine, threonine, tryptophan or proline contained in the FBS. * Means p> 0.05.
  • 10 is a graph showing the concentration (amino acid concentration) of the amino acid determined using a glucose analyzer in comparison with the result (gray bar) obtained by analyzing with a standard amino acid analyzer.
  • Figure 11 shows the results of using recombinant protein mixtures as a cell-free protein reaction mixture, showing the concentration of aspartic acid, asparagine, glutamic acid or glutamine on sfGFP fluorescence intensity It is a standard curve graph.
  • FIG. 12 is a graph showing the process of amino acid production by transamination reaction, and a graph showing the result of screening of a transaminase substrate through a cell-free protein synthesis method.
  • one aspect of the present invention provides a method for producing a cell-free protein synthesis reaction mixture comprising the steps of: (a) preparing a cell-free protein synthesis reaction mixture containing no amino acid; (b) mixing an assay sample containing a target amino acid into the cell-free protein synthesis reaction mixture to perform cell-free protein synthesis; (c) measuring a signal of the synthesized protein; And (d) calculating the concentration of the target amino acid by comparing the intensity of the measured signal with a standard concentration curve for each amino acid according to a signal of the protein prepared using a standard sample, to provide.
  • the present invention provides a simple and economical method for quantifying an amino acid based on the fact that an amino acid is polymerized into a signal-producing protein, that is, a reporter protein.
  • cell-free protein synthesis relies on the exogenous addition of missing components. That is, protein synthesis is carried out by supplementing the cell-free protein synthesis reaction mixture in which components essential for protein synthesis are missing. Based on this, the present inventors have developed a method for quantifying amino acids by selectively missing a specific component in a cell-free protein reaction mixture.
  • the method utilizes a cell-free protein synthesis system that produces specific signals in response to exogenous amino acids. More specifically, when an assay sample containing a target amino acid to be quantified is mixed with a cell-free synthesis reaction mixture solution containing no amino acid of interest, incubation is performed to rapidly synthesize a reporter protein, The signal generated by the reaction proceeded by the synthesized protein is based on linearly proportional to the concentration of the amino acid.
  • the method of quantifying amino acids requires chemical derivatization of amino acids, and compared to the need for expensive chromatography equipment, the method of the present invention allows direct conversion of amino acid titers into bio-signals in a short time, Allowing quantification of amino acids.
  • the method according to the present invention can detect amino acids at concentrations as low as 100 nM and quantify amino acids associated with diseases contained in biological samples. Therefore, the present invention can be widely applied for various purposes such as immediate analysis of amino acid and field diagnosis of disease.
  • the step (a) is a step of preparing a cell-free protein synthesis reaction mixture containing no target amino acid.
  • the term " objective amino acid" of the present invention means an amino acid to be quantified by the method according to the present invention.
  • the amino acid of the target amino acid may be selected from the group consisting of arginine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tyrosine, valine, alanine a protein selected from the group consisting of alanine, cysteine, serine, glycine, histidine, threonine, proline, tryptophan, aspartic acid, asparagine, Glutamic acid and glutamine.
  • it may be at least one selected from the group consisting of arginine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tyrosine, valine, alanine, cysteine, serine, glycine, histidine , Threonine, proline, and tryptophan, but the present invention is not limited thereto.
  • cell-free protein synthesis refers to protein synthesis that has been carried out in a cell in vitro, such as in vitro, and includes only components necessary for protein production, that is, Means that the desired protein is produced in a short period of time by artificially repeating only the synthesis process of the protein in a state where the physiological regulation mechanism of the cell is excluded from the outside of the cell.
  • the protein biosynthesis mechanism required for the cell-free protein synthesis that is, ribosome, initiation factor, renal factor, terminator, aminoacyl tRNA synthetase, RNA polymerase, Can be added separately or can be separately produced and used by recombinant DNA technology.
  • cell-free protein synthesis reaction mixture of the present invention means a substance containing components for performing the cell-free protein synthesis. Specifically, it may include a cell extract or a mixture of recombinant proteins, including a ribosome necessary for protein production, an initiation factor, an elongation factor, a termination factor, a protein biosynthetic mechanism such as an aminoacyl tiearne synthase, and the like, But is not limited to.
  • the cell extract may be a wheat germ, a rabbit reticulocyte, a yeast, a Chinese hamster ovary cell or a HeLa cell extract, more specifically, an E. coli extract
  • it is not limited as long as it can be used in a cell-free protein synthesis reaction.
  • the recombinant protein may be one produced by recombinant technology, and specifically includes initiation factors such as IF1, IF2 and IF3, an elongation factor such as EF-G, EF-Tu and EFTs, RF1 , A release factor such as RF2 and RF3, a termination factor such as RRF, aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA transformylase, RNA polymerase, Or ribosomes.
  • initiation factors such as IF1, IF2 and IF3
  • an elongation factor such as EF-G, EF-Tu and EFTs
  • RF1 A release factor such as RF2 and RF3
  • a termination factor such as RRF, aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA transformylase, RNA polymerase, Or ribosomes.
  • the mixture of recombinant proteins may contain all of the components necessary for cell-free protein synthesis, and specifically includes the initiation factor, the elongation factor, the release factor, the termination factor, the aminoacyl-tRNA synthetase, A DNA polymerase, a transmembrane transferase, an RNA polymerase, and a ribosome.
  • the recombinant protein or a mixture thereof it is possible to exclude enzymes using the target amino acid as a substrate, so that all kinds of amino acids can be quantified.
  • the cell-free protein synthesis reaction mixture may not contain the desired amino acid.
  • the mixture may comprise a polynucleotide encoding a reporter protein.
  • reporter protein of the present invention is a labeling protein that generates a signal that can easily confirm its production or synthesis, wherein the signal is a luminescence, fluorescence, phosphorescence, And the like.
  • the reporter protein may be selected from the group consisting of sfGFP (superfolder green fluorescence protein), GFP (green fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein), mCherry fluorescent protein, lactamase, But are not limited to, galactosidase, HRP (horseradish peroxidase), or glucose oxidase.
  • Fluorescent proteins of the above proteins measure the fluorescence of the fluorescent protein accumulated in the cell-free synthesis reaction solution or directly activate the enzyme using the substrate corresponding to each enzyme. Another possible measurement method is to use a glucose meter that is widely used as personal diagnostic equipment all over the world including Korea.
  • sucrose, maltose, maltose, and the like such as invertase, maltase and glucoamylase, instead of polynucleotides of the above- Starch, and the like, as well as enzymes that dissociate glucose from polysaccharides.
  • glucose produced from sucrose, maltose, starch and the like is used in the reaction for producing the enzymes, respectively.
  • the resulting glucose is quantitated using a glucose analyzer to obtain an amino acid-synthesized enzyme-glucose concentration Can be used to measure the amino acid concentration of the sample.
  • a polynucleotide encoding a reporter protein means a reporter gene, and specifically a DNA (deoxyribonucleic acid) strand of the gene.
  • the nucleotide sequence of the gene can be obtained from a known database such as NCBI's GenBank.
  • a cell extract of E. coli strain BL21-Star (DE3), a plasmid containing a polynucleotide encoding sfGFP, a cell-free protein such as ribonucleoside triphosphate such as ATP, GTP, UTP and CTP A cell-free protein synthesis reaction mixture containing the necessary components for synthesis but not including the target amino acid was prepared (Examples 1-1 and 1-2).
  • the step (b) is a step of performing cell-free protein synthesis by mixing an assay sample containing a target amino acid into the cell-free protein synthesis reaction mixture, wherein the reaction mixture is mixed with the assay sample And then incubating.
  • target amino acid the "cell-free protein synthesis reaction mixture” and “cell-free protein synthesis” are as described above.
  • analytical sample of the present invention includes a target amino acid and means a sample to be applied to the method of the present invention.
  • it may be derived from one or more members selected from the group consisting of feed, food or chemical.
  • the analytical sample may be one separated from the organism, more specifically, one or more selected from the group consisting of blood, plasma, serum, cancer tissue and cancer cells separated from the organism, But is not limited thereto.
  • FBS contains a component that interferes with the cell-free protein synthesis reaction.
  • the FBS was heat-treated, and the resulting aggregate was removed by filtration.
  • amino acids contained in the FBS can be quantified (Examples 1-4 and Fig. 4).
  • organism is an organism containing an amino acid and may include mammals including a rat, a livestock, a human, and aquaculture without limitation.
  • the analytical sample may contain the above-mentioned target amino acid.
  • the analytical sample may be isolated from a patient having an amino acid metabolism-related disease, and specifically, the amino acid metabolism-related disease may be an amino acid metabolism disorder or a cancer.
  • abnormal amino acid metabolism disorder means a disease that induces a decrease or increase of a specific amino acid in the body. It is known that this occurs due to deficiency or loss of activity of enzymes involved in a specific amino acid metabolism, and a patient having the above-mentioned disease is distinguished from the normal amino acid concentration in the body.
  • the amino acid metabolic disorder is selected from the group consisting of arginase deficiency, cystinuria, maple syrup urine disease, hyperlysinemia, homocystinuria, But is not limited to, one or more selected from the group consisting of hypermethioninemia and phenylketonuria.
  • the arginase-depleting enzyme is arginine;
  • the cystinuria is arginine or lysine;
  • said foliar molassesuria is selected from the group consisting of: Iroleucine or valine;
  • the hyperlipemia is selected from the group consisting of lysine;
  • the homocystinuria is caused by methionine;
  • the hypermethionine is methionine;
  • the phenylketonuria may be caused by phenylalanine or tyrosine, but is not limited thereto.
  • the prepared cell-free protein reaction mixture was mixed with pretreated FBS as an analytical sample and incubated to perform cell-free protein synthesis (Examples 1-4).
  • cell-free protein synthesis was also performed when a sample containing amino acids (arginine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, tyrosine, valine) -3).
  • the step (c) is a step of measuring a signal intensity of the synthesized protein.
  • the intensity of the signal of the protein can be measured by a method known in the art.
  • a measuring device capable of detecting a signal of a protein
  • it can be measured using TRIAD Multimode Detector, Wallac / Victor Fluorescence, Perkin-Elmer LB50B Fluorescence Spectroscopy
  • TRIAD Multimode Detector Wallac / Victor Fluorescence
  • Perkin-Elmer LB50B Fluorescence Spectroscopy But are not limited to, a Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer, a luminometer, a spectrophotometer, a cyclic voltammetry (CV), or the like.
  • a method of generating glucose by using the activity of a cell-free synthesized protein and quantitatively measuring it using a glucose analyzer can be used.
  • the invertase is produced in a cell-free synthesis solution containing a gene encoding a protease derived from Escherichia coli, and the resulting solution is incubated in a solution containing sucrose, and the resulting glucose is measured using a glucose meter, The activity of the enzyme can be estimated.
  • the estimated invertase activity is proportional to the amino acid concentration in the cell-free synthesis reaction sample, and consequently, the concentration of the amino acid in the sample can be measured by measuring the glucose concentration.
  • maltase for producing glucose from maltose and glucoamylase for producing glucose from starch may be used for amino acid analysis using this principle, but the present invention is not limited thereto.
  • the step (d) is a step of calculating the concentration of the target amino acid by comparing the intensity of the measured signal with a standard concentration curve for each amino acid according to a signal of a protein prepared using a standard sample.
  • standard sample of the present invention includes each amino acid at a specific concentration, and specifically includes, but is not limited to, 0.01 to 100 [mu] M of amino acid.
  • the standard concentration curve for each amino acid according to the signal of the protein includes information on the signal of the protein according to the specific concentration of the amino acid, and the signal intensity measured according to the steps (a) to (c) The concentration of the target amino acid can be calculated by comparison with the curve.
  • the concentration of the target amino acid is calculated by comparing with the standard concentration curve prepared using the target amino acid as a standard sample.
  • the method of quantifying an amino acid according to the present invention is characterized in that an amino acid at a concentration of 10 nM to 150 ⁇ M, specifically 50 nM to 130 ⁇ M, more specifically 100 nM to 110 ⁇ M, more specifically 130 nM to 100 ⁇ M, But is not limited thereto.
  • a cell extract of E. coli strain BL21-Star (DE3), a plasmid containing a polynucleotide encoding sfGFP, a cell-free protein such as ribonucleoside triphosphate such as ATP, GTP, UTP and CTP A cell-free protein synthesis reaction mixture containing the necessary components for synthesis but not including the target amino acid was prepared (Examples 1-1 and 1-2), and the reaction mixture was incubated with a specific concentration of the desired amino acid (arginine, isoleucine, leucine , Lysine, methionine, phenylalanine, tyrosine, valine), and incubated to perform cell-free protein synthesis to draw a standard concentration curve for each amino acid according to the sfGFP fluorescence signal (Examples 1-3 and 3).
  • a specific concentration of the desired amino acid arginine, isoleucine, leucine , Lysine, methionine,
  • Example 1-4 fetal bovine serum
  • the target amino acids such as alanine, cysteine, serine, glycine, histidine, threonine, proline or tryptophan were quantified by comparing the intensity of the detected sfGFP fluorescence with the above standard concentration curve, and their concentrations ranged from about 130 nM to 100 ⁇ M (Figs. 7 and 8).
  • Another aspect of the present invention provides a method for providing information for diagnosis of an amino acid metabolism-related disease, comprising the step of comparing the concentration of amino acid quantified according to the method for quantifying amino acid with a normal control.
  • this method may be a method for diagnosing an amino acid metabolism-related disease, specifically, an abnormal amino acid metabolism disorder or cancer, and the above description of the amino acid metabolism disorder disease and cancer is as described above.
  • the amino acid quantitation method according to the present invention can be used for diagnosing the above-mentioned diseases.
  • step (a) performing an amino acid quantitation method according to the present invention using an analytical sample separated from a patient having an amino acid metabolism-related disease; And (b) comparing the concentration of the amino acid quantitated in step (a) with that of the normal control, and judging the amino acid metabolism-related disease to be low if the amino acid concentration is lower or higher than the normal control group. Or a method of providing information for diagnosis of the subject.
  • the analysis sample is as described above, and the concentration (profile) of the characteristic amino acid represented by the disease is well known in the art. Those skilled in the art will recognize that the method according to the present invention, ) And (b), patients with an amino acid metabolism-related disease can be easily determined.
  • Another aspect of the present invention is a method for treating an amino acid metabolism-related disease, comprising the steps of: (a) treating a candidate substance for prevention or treatment of an amino acid metabolism-related disease in an analytical sample separated from an organism; (b) measuring the concentration of the target amino acid contained in the analytical sample to which the candidate substance has been treated according to the method; And (c) comparing the amino acid concentration of step (b) with a normal control.
  • the present invention also provides a method for screening a substance for preventing or treating an amino acid metabolism-related disease.
  • the description of the analytical sample is as described above, and may be specifically separated from a patient having an amino acid metabolism-related disease.
  • prophylactic or therapeutic candidate for an amino acid metabolism-related disease of the present invention is a substance expected to be able to treat an amino acid metabolism-related disease, and is expected to improve or ameliorate an amino acid metabolism-related disease, directly or indirectly Any substance can be used without limitation and includes all possible therapeutic substances such as compounds, genes or proteins.
  • the step (a) for treating a candidate substance for the prevention or treatment of an amino acid metabolism-related disease in an analytical sample may be carried out using a method known in the art.
  • the candidate substance may be treated by treating the candidate substance with the analytical sample by treating it with the candidate substance, or by administering it in vivo, but a person skilled in the art can use a method suited to the purpose of the present invention .
  • step (b) for measuring the concentration of the target amino acid contained in the analysis sample may use the method according to the present invention.
  • the step (c) is a step of judging whether the candidate substance can be used as a substance for preventing or treating an amino acid metabolism-related disease.
  • Candidate substances that have the same or similar amino acid concentration as the normal control group can be used as a preventive or therapeutic agent for amino acid metabolism-related diseases since the concentration profile of the amino acid metabolism-related disease patients is different from that of normal individuals.
  • Another aspect of the present invention is a process for preparing a compound of formula (I), comprising: (a) reacting a transaminase to a mixture of a candidate amine providing substrate and an amine accepting substrate; (b) measuring the concentration of the amino acid after the reaction in the reaction solution; And (c) comparing the amino acid concentration of step (b) with a control.
  • the screening method may be a method of screening a candidate substrate by confirming the concentration of the amino acid produced by the transamination reaction through quantitative determination of an amino acid in the cell-free protein synthesis method.
  • the term " transaminase &quot refers to an enzyme that catalyzes a biochemical reaction in which an amino group is removed between an amino acid and an alpha -keto acid and transferred to another molecule. Specifically, it removes an amino group from an amino acid to generate an a-keto acid, and then catalyzes a reaction in which an amino group is transferred to another? -Keto acid having no amino group to generate a new amino acid.
  • the amine providing substrate means a substrate having an amine group and capable of transferring an amine group by an enzyme or a catalyst.
  • the amine accepting substrate means a substrate capable of receiving an amine group by an enzyme or a catalyst.
  • the transaminase catalyzes the exchange of the primary amine group of the amine donor substrate with the ketone group of the amine acceptor substrate.
  • the amine group of the donor substrate is replaced with a ketone group
  • the ketone group of the acceptor substrate is replaced with an amine group.
  • various amines having a primary amine group may be used as the amine providing substrate for the application of the present invention.
  • the amine accepting substrate substrates in which a ketone group is substituted with an amine group to be converted into an amino acid can be used.
  • ketone groups are changed to amine groups to produce alanine, and when alpha-ketoglutarate is used as an amine accepting substrate, glutamate is produced.
  • alpha-ketoglutarate is used as an amine accepting substrate
  • glutamate is produced.
  • aspartate is produced and the activity of the transaminase can be measured by the present invention.
  • the step of measuring the concentration of the amino acid in the step (b) may be performed by a method of quantifying an amino acid according to the cell-free protein synthesis method.
  • the reaction product was reacted with an enzyme to quantitate the amino acid according to the cell-free protein synthesis method. As a result, it was confirmed that the substrate could be screened through the difference in the amino acid level according to each substrate 12).
  • Another aspect of the present invention is a process for preparing a compound of formula (I), comprising: (a) reacting a candidate transaminase with a mixture of an amine providing substrate and an amine accepting substrate; (b) measuring the concentration of the amino acid after the reaction in the reaction solution; And (c) comparing the amino acid concentration of step (b) with a control.
  • transaminase the amine-providing substrate, and the amine-receiving substrate are as described above.
  • the step of measuring the concentration of the amino acid in the step (b) may be performed by the amino acid quantification method according to the cell-free protein synthesis method.
  • the transaminase screening method can be performed by a known transaminase screening method (Mathew, Sam, et al., 2013; Truppo, Matthew D., et al., 2009) And the method developed by applying the amino acid quantitation method is used. Therefore, it is suggested that the transaminase having excellent activity can be screened through the screening method.
  • Example 1-1 Method for obtaining cell extract for cell-free protein synthesis
  • the cell extract used for constructing the cell-free protein synthesis system of the present invention was obtained according to a known method (Korean Patent Registration No. 10-0733712).
  • E. coli strain BL21-Star (DE3) cells were cultured in 3 L of 2X YTPG medium at 37 ⁇ ⁇ .
  • IPTG isopropyl-thiogalactopyranoside
  • the cells were harvested at an OD600 of ⁇ 4.5 and washed with 10 mM TRIS-acetate pH 8.2, 14 mM magnesium acetate, 80 mM potassium acetate, 1 mM DTT (dithiothreitol) and 0.05% (v / v) 2-mercaptoethanol (2-ME) per g of cells.
  • the washed cells (10 g) were resuspended in 12.7 ml of lysis buffer (2-ME free wash buffer) and lysed with French Pressure Cell (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) under constant pressure (20,000 psi) Respectively.
  • the cell lysate was centrifuged twice at 12,000 g for 30 minutes to obtain a supernatant of the cells (hereinafter referred to as "S12 extract”).
  • S12 extract was centrifuged using a Vivaspin centrifuge (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Germany) with a membrane blocking the molecular weight of 50,000 Da.
  • Vivaspin centrifuge Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Germany
  • centrifugation at 2,000 g was repeated three times to reduce the volume of the diluted extract to the original volume (2 ml).
  • an aliquot of the S12 extract was rapidly frozen and then stored at -80 [deg.] C.
  • reaction mixtures (hereinafter referred to as 'reaction mixture') of cell-free protein synthesis were prepared as follows: 57 mM HEPES-KOH, pH 8.2; 1.2 mM ATP; GTP, UTP, and CTP each 0.85 mM; 80 mM ammonium acetate; 12 mM magnesium acetate; 80 mM potassium acetate; 34 [mu] g / ml 1,5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid; Amino acid 2 mM each; 2% polyethylene glycol 8000; 3.2 U / ml creatine kinase; 67 mM creatine phosphate; 24% (v / v) filtered S12 extract; And 6.7 [mu] g / ml pK7-sfGFP (sfGFP (superfolder green fluorescence protein) plasmid.
  • sfGFP superfolder green fluorescence protein
  • the signal of sfGFP fluorescence intensity generated through the cell-free synthesis reaction was measured and amino acid was quantified by comparing it with a standard curve for measuring the amino acid concentration. In order to confirm the significance of the analysis results, the results were compared with those obtained through Hitachi L-8900 Amino Acid Analyzer (Hitachi High-Technologies, Tokyo, Japan).
  • SPSS Version 22.0 software SPSS Inc., Chicago, IL was used and P > 0.05 was considered to be statistically insignificant.
  • the amino acid quantitation method of the present invention is accomplished by the analysis sample supplementing one amino acid not possessed by the reaction mixture (including 19 amino acids).
  • the ribosomes stop working at the lysine codon of the mRNA, so that only the cleaved protein fragments are generated, and therefore the sfGFP translation from the template DNA can not be completed Fluorescence signals can not be generated.
  • an assay sample containing lysine is mixed in the reaction mixture, all 20 amino acids are included in the reaction mixture, so that the translation for producing a complete sfGFP is completed, resulting in a fluorescent signal.
  • the present inventors have developed a method for quantifying an amino acid of the present invention, focusing on the fact that the intensity of the sfGFP fluorescence signal is proportional to the amino acid titer contained in the assay sample.
  • arginine as the target amino acids, arginine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, and phenylalanine, which are related to different amino acid metabolism disorder diseases as described in the following Table 1 (phenylalanine), tyrosine and valine (eight amino acids).
  • the method of the present invention can be utilized for the quantification of the eight amino acids, and its quantifiable concentration is as wide as 130 nM to 100 ⁇ M.
  • Fetal bovine serum was used as an assay sample to confirm whether the method of the present invention can quantify the amino acids contained in the biological sample.
  • FBS phosphate buffered saline
  • FBS contains specific components that interfere with the cell-free protein synthesis reaction of the present invention.
  • FBS was used for analysis after heat treatment. Specifically, FBS was heat-treated at 80 DEG C for 10 minutes, and protein aggregates thus formed were removed using a centrifuge.
  • Cell-free protein synthesis reaction was carried out under the same conditions as described in Example 1-2. However, by using an invertase gene that is not a sfGFP gene as a template nucleotide of a cell-free synthesis reaction, invertase production was achieved through a cell-free synthesis reaction. After the cell-free synthesis reaction, 10 ⁇ L of the reaction solution was mixed with the same volume of sucrose solution (100 mM potassium acetate, 100 mM sucrose, pH 6.0) and reacted at 25 ° C. for 5 minutes. The reaction was terminated by heating at 95 ° C for 5 minutes, and 5 ⁇ L of the supernatant was collected and the amount of glucose produced was measured using a glucose analyzer (Accu-check, Roche Diagnostics) (FIG. 5).
  • sucrose solution 100 mM potassium acetate, 100 mM sucrose, pH 6.0
  • Example 2-1 Determination of the amino acid quantification method of the biological analysis sample by measuring the fluorescent protein produced in the cell-free protein synthesis system
  • amino acids contained in the analytical sample were quantitatively analyzed by using heat-treated and filtered FBS as analytical samples.
  • the sfGFP fluorescence signal was substituted into the standard curve, and the concentration of each amino acid was determined.
  • the concentration of the amino acid determined by this method was very similar to that obtained by standard HPLC analysis Respectively.
  • Example 2-2 Determination of significance of amino acid quantification method of biological analysis sample using glucose meter
  • amino acids contained in the analytical sample were quantitatively analyzed using heat-treated and filtered FBS as analytical samples.
  • Example 3 Determination of the significance of amino acid quantification method using a mixture of recombinant proteins
  • the cell extract contains enzymes using amino acid as a substrate, there may arise a problem that the target amino acid is not quantified.
  • the above-mentioned enzymes from the recombinant protein reaction mixture
  • the components necessary for the cell-free protein synthesis were respectively prepared through recombinant techniques known in the art, and the cell-free protein synthesis according to the above Example 1-2 was carried out by mixing them.
  • nucleic acid encoding a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of an initiation factor, an elongation factor, an emission factor, a termination factor, aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA transformylase, Ribosomes and the like were prepared and used.
  • amino acid can be quantified by a cell-free protein synthesis method using a recombinant protein rather than a cell extract. Specifically, aspartic acid, asparagine ), Glutamic acid (glutamic acid) or glutamine (glutamine).
  • the screening effect was confirmed by applying the cell - free protein synthesis method and the amino acid quantification method to the screening of the transaminase substrate.
  • an amine providing substrate to be screened (S01,? -Methylbenzylamine, S02, benzylamine, S03, 3-phenyl- , Phenylbutylamine S05, propylamine S06, amylamine S07, isopropylamine S08, sec-butylamine S09,? -Alanine S10, phenylalanine) 10 mM transaminase, 1000 rpm, 10 mM Tris-HCl (pH 7.2), 10 mM amine providing substrate, 10 mM amine accepting substrate, 20 M pyridoxal-5'- And incubated for 3 hours.
  • the reaction solution obtained in the above procedure was diluted with an appropriate dilution and added to the reaction solution of the cell-free protein synthesis in which alanine, which is the result of the transamination reaction of pyruvic acid, was added, and a final volume of 150 ⁇ l; GTP and UTP, 2 mM DTT, 90 mM potassium glutamate, 80 mM ammonium acetate, 12 mM magnesium acetate, 67 [mu] g / mL l- 5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid, 2 mM each of 19 amino acids (except for alanine), 2% PEG 8000, 67 mM CP, 3.2 ⁇ g / ml CK, 13 ⁇ g / 40 ⁇ l of S12 extract, and 3 ⁇ l of transaminase were incubated at 30 ° C. for 3 hours to measure sfGFP expression. The measured fluorescence value was compared with the standard

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Abstract

본 발명은 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산의 정량 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계; (c) 상기 합성된 단백질의 신호를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계를 포함하는 아미노산의 정량 방법, 상기 정량 방법을 이용하는 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법, 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법, 및 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아미노산의 정량 방법은 저렴한 비용으로 짧은 시간에 아미노산을 정량할 수 있으므로, 다양한 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산의 정량 방법
본 발명은 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산의 정량 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계; (c) 상기 합성된 단백질의 신호를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계를 포함하는 아미노산의 정량 방법, 상기 정량 방법을 이용하는 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법, 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법 및 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
아미노산 분석은 식품, 환경, 정밀화학, 의약, 진단 등 다양한 분야에서 활발히 응용되고 있다. 대표적인 예로, 식품 산업에서는 식품에 포함된 아미노산 등 영양소의 함량 분석 시 아미노산을 정량하며, 또한 동물 사료에는 각종 아미노산의 함량과 그 조성이 필수적으로 고려되어야 하는바, 사료의 제조 시에도 아미노산 정량이 이용된다. 정밀화학산업의 경우, 트랜스아미나제 등의 효소에 의한 아민기의 전이 반응, 아미노산디카르복실라아제 등에 의한 카르복실기의 분해 반응 등이 다양한 의약품 중간체 등의 합성에 이용되고 있는데, 많은 경우 이러한 반응들은 아미노산의 생성과 변환을 수반하게 되므로 아미노산 분석기술은 이들 효소들에 의해 진행되는 반응들에 있어 기질의 스크리닝 및 신규 효소들의 발굴과 엔지니어링을 위한 스크리닝 도구로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 의약 및 진단 분야에서도 아미노산 정량이 활발히 응용되고 있다. 예로서, 암의 성장 및 발달을 지원하기 위하여 혈장의 유리 아미노산이 재분배(redistribution) 또는 전위(translocation)되므로, 정상인과는 다른 특징적인 형태를 나타내는 암 환자의 혈장 유리 아미노산의 프로파일은 암 환자의 진단 및 예후를 위한 새로운 바이오마커로 사용될 수 있음이 공지되었다(Yu Gu, Gu et al. Journal of Translational Medicine (2015) 13:35; Hong-Shiee Lai, Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 267-276; Miyagi Y, PLoS One. 2011;6(9):e24143.).
나아가, 아르기닌 분해효소 결핍증(arginase deficiency), 시스틴뇨증(cystinuria), 단풍당밀뇨증(maple syrup urine disease), 고라이신혈증(hyperlysinemia), 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 고메티오닌혈증(hypermethioninemia), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria) 등의 아미노산 대사 이상 질환은 정상적인 아미노산 대사를 방해하므로(Layer R., Inherited Metab. Dis. 2016, 21, 86-100.; Harris H., Ann. Hum. Genet. 1995, 19, 196-208.; Chace D.H., Clin. Chem. 1995, 41, 32-38.; Prensky A.L., Neurochem. 1966, 13, 863-874.; Saudubray J.M., Nutr. 2007, 137, 1669S-1672S.; Chace D.H., Clin. Chem. 1996, 42, 349-355.; Mudd S.H., Science 1964, 143, 1443-1445.; Blau N., Lancet 2010, 376, 1417-1427.; Stephenson J.B.P., Br. Med. J. 1967, 3, 579-581.), 체내에 존재하는 관련 아미노산을 정량하는 경우 상기의 아미노산 대사 이상 질환들을 간편히 진단할 수 있을 것이다. 아미노산 분석기술은 상기한 아미노산 대사질환의 진단 이외에도 다양한 질병의 진단에 이용될 수 있다. 예를 들어 현재 간질환의 진단을 위해 일반적으로 사용되는 방법인 ALT (alanine aminotransferase)/AST (aspartate aminotransferase) 활성 분석 방법은 혈액 시료 중의 ALT 및 AST에 의해서 진행되는 다음과 같은 반응의 활성도에 의해서 진행되는바, 해당 반응들에 관여되는 alanine, aspartate, glutamate 농도의 측정방법은 간기능 검사에 이용될 수 있다.
현재의 아미노산 정량 분석법은 유도체화 유무에 관계없이 액체 크로마토그래피 분리법을 기본으로 하는데, 이는 복잡한 과정과 긴 처리시간을 가지며, 기기가 고가라는 점에서 많은 개선이 요구되고 있다. 이에 따라, 생물학적 방법으로 아미노산을 분석하는 방법이 최근 보고되고 있으며, 영양 요구성 대장균(Escherichia coli) 균주를 이용하는 방법 등이 개발되었다. 그러나, 각 세포의 생존 능력을 유지하는 것뿐만 아니라 분석하고자 하는 목적 아미노산에 적합한 균주를 확립하는 것이 상당히 까다로운 실정이었다.
한편, 무세포 단백질 합성법은 세포를 기반으로 한 단백질 합성법이 갖는 많은 한계를 극복할 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 살아있는 세포에서는 단백질 합성이 고도로 복잡하고 규칙적이며 제한된 세포 구조 내에서 일어나지만, 무세포 합성법은 개방된 시험관 내(in vitro)에서 수행되므로 단백질 합성에 필요한 구성 성분이 개별적으로 제한없이 조작될 수 있으며, 나아가 간단한 장치를 이용하기 때문에 조작이 간편하다는 장점이 있다. 이에 따라, 아미노산 공급원으로서 효모 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성방법, 효소를 이용하여 pH를 조절하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법 등이 개발된바 있다(한국 공개특허공보 제10-2017-0014459호, 한국 등록특허공보 제10-1671688호).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 아미노산을 간편히 정량하는 방법을 개발하고자 예의노력 연구한 결과, 단백질 합성반응의 진행이 아미노산들의 외인성 첨가에 의존한다는 무세포 단백질 합성 시스템의 특성을 이용하면 분석 시료에 존재하는 아미노산을 정량적으로 분석할 수 있을 것이라는 점에 착안하여, 무세포 단백질 합성법으로 생성된 리포터 단백질의 신호 세기를 직접 또는 간접적으로 측정하는 방법의 개발을 통해 목적 아미노산을 빠르고 저비용으로 정량할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계; (c) 상기 합성된 단백질의 신호를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계를 포함하는 아미노산의 정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 따라 정량한 아미노산의 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 생물로부터 분리된 분석 시료에 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 방법에 따라 상기 후보물질이 처리된 분석 시료에 포함된 목적 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 후보 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 트랜스아미나제를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 후보 효소를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 아미노산의 정량 방법은 저렴한 비용으로 짧은 시간에 아미노산을 정량할 수 있으므로, 다양한 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 간 기능 진단의 주요 마커로 사용되는 ALT 및 AST에 의해 진행되는 반응을 보여주는 반응식이다.
도 2는 본 발명의 아미노산 정량 방법에 이용한 무세포 단백질 합성 시스템의 개념을 보여주는 개략도이다.
도 3은 sfGFP(superfolder green fluorescence protein) 형광 강도에 대한 아르기닌(arginine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine) 및 발린(valine)의 농도를 보여주는 표준 농도 곡선 및 sfGFP의 형광 이미지이다.
도 4는 분석 시료로서 FBS를 이용한 결과에 관한 것이다. 구체적으로, A는 열처리하지 않은 FBS를 사용했을 때 sfGFP의 형광 신호를 보여주는 그래프로서, NC는 sfGFP DNA가 포함되지 않은 음성대조군 반응 혼합물, PC는 sfGFP DNA 및 모든 아미노산이 포함된 양성대조군 반응 혼합물로 반응한 결과를 보여주며, RM-Arg, RM-Ile, RM-Leu, RM-Lys, RM-Met, RM-Phe, RM-Tyr 또는 RM-Val은 각각 아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 발린이 포함되지 않은 불완전 반응 혼합물로 반응한 결과를 보여준다. B는 표준 아미노산 분석기를 통해 분석한 열처리하지 않은 상기 FBS에 포함된 아미노산의 농도를 보여주는 그래프로서, Arg, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Tyr 또는 Val은 각각 아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 발린을 의미한다.
도 5는 분석 시료로서 열처리하지 않거나, 열처리하거나, 또는 열처리 및 여과한 FBS를 이용한 결과에 관한 것이다. 구체적으로, A는 열처리하지 않은 FBS(검은색 막대), 열처리한 FBS(회색 막대), 및 열처리 및 여과한 FBS(흰색 막대)를 사용했을 때 sfGFP의 형광 신호를 보여주는 그래프이다. B는 열처리하지 않은 FBS를 사용했을 때 반응 혼합물에 존재하는 RNA를 보여주는 이미지이다. C는 열처리 및 여과한 FBS를 사용했을 때 반응 혼합물에 존재하는 RNA를 보여주는 이미지이다.
도 6은 포도당 측정기를 이용한 아미노산 정량의 개요를 보여주는 개략도이다.
도 7은 분석 시료로서 열처리 및 여과한 FBS를 이용한 결과에 관한 것이다. A는 아르기닌(흰색 원), 이소류신(흰색 마름모), 류신(검은색 마름모), 리신(흰색 사각형), 메티오닌(흰색 삼각형), 페닐알라닌(검은색 원), 타이로신(검은색 사각형) 또는 발린(검은색 마름모)을 포함하지 않는 불완전 반응 혼합물을 사용했을 때 sfGFP의 형광 신호를 보여주는 그래프이다. B는 본 발명에 따라 정량한 아미노산의 농도(흰색 막대) 및 표준 아미노산 분석기로 분석한 아미노산의 농도(회색 막대)를 보여주는 그래프이다. *는 p> 0.05를 의미한다.
도 8은 sfGFP 형광 강도에 대한 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 글라이신(glycine), 히스티딘(histidine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine) 또는 트립토판(tryptophan)의 농도를 보여주는 표준 곡선 그래프이다.
도 9는 분석 시료로서 열처리 및 여과한 FBS를 이용한 결과에 관한 것으로서, 상기 FBS에 포함된 글라이신, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 트립토판 또는 프롤린의 농도를 보여주는 그래프이다. *는 p> 0.05를 의미한다.
도 10은 포도당 측정기를 이용하여 정량한 아미노산의 농도 (흰색막대)를 표준 아미노산 분석기로 분석한 결과 (회색막대)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 11은 무세포 단백질 반응 혼합물로서 재조합 단백질 혼합물을 이용한 결과에 관한 것으로서, sfGFP 형광 강도에 대한 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid) 또는 글루타민(glutamine)의 농도를 보여주는 표준 곡선 그래프이다.
도 12는 트랜스아미네이션 반응에 의해 아미노산이 생성되는 과정을 개략적으로 나타낸 도면 및 트랜스아미나제 기질을 무세포 단백질 합성법을 통해 스크리닝한 결과를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계; (c) 상기 합성된 단백질의 신호를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계를 포함하는 아미노산의 정량 방법을 제공한다.
본 발명에서는 아미노산이 신호-생성 단백질, 즉 리포터 단백질로 중합되는 것을 기반으로 한 간단하고 경제적인 아미노산의 정량 방법을 제공한다.
일반적으로, 무세포 단백질 합성은 누락된 성분의 외인성 첨가에 의존한다. 즉, 단백질 합성에 필수적인 구성요소가 누락된 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 이를 보완하면 단백질 합성이 수행되는 것이다. 이것에 기초하여, 본 발명자들은 무세포 단백질 반응 혼합물에서 특정 성분을 선택적으로 누락시키는 방식을 통해 아미노산의 정량 방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 방법은 외인성 아미노산에 반응하여 특정 신호를 생성하는, 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한다. 더욱 구체적으로, 정량하고자 하는 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 해당 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 합성 반응 혼합액과 혼합한 후 인큐베이션(incubation)하면 리포터 단백질의 합성이 빠르게 일어나며, 합성된 단백질의 신호 또는 합성된 단백질로 인해 진행되는 반응으로 인해 발생하는 신호 는 아미노산의 농도에 선형적으로 비례하는 것에 기초한다.
현재 사용되는 아미노산 정량 방법은 아미노산의 화학적인 유도체화가 필요하고, 고가의 크로마토그래피 기기가 필요한 것에 비해, 본 발명의 방법은 아미노산 역가를 짧은 시간에 생체 신호로 직접 변환할 수 있게 함으로써 보다 저렴한 비용으로 아미노산의 정량화를 가능하게 하였다. 특히, 본 발명에 따른 방법은 100 nM 정도로 낮은 농도의 아미노산을 검출할 수 있으며, 생물학적 시료에 포함되어 있는 질병과 관련된 아미노산의 정량도 가능하다. 따라서, 본 발명은 아미노산의 즉시 분석 및 질환의 현장 진단 등 다양한 목적으로 폭넓게 응용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 (a)는 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계이다.
본 발명의 용어, "목적 아미노산"은 본 발명에 따른 방법으로 정량하고자 하는 아미노산을 의미한다. 구체적으로, 상기 목적 아미노산은 아미노산은 아르기닌(arginine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 발린(valine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 글라이신(glycine), 히스티딘(histidine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글루타민(glutamine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 발린, 알라닌, 시스테인, 세린, 글라이신, 히스티딘, 트레오닌, 프롤린 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "무세포 단백질 합성"은 세포 내에서 수행되던 단백질 합성을 시험관 등의 생체 외에서 행하는 것으로서, 단백질 생산에 필요한 구성 요소들, 즉 세포 내 단백질 합성기구와 이의 인자들만을 세포에서 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 생산하는 것을 의미한다. 이때, 무세포 단백질 합성에 요구되는 단백질 생합성 기구 즉, 리보좀, 개시인자, 신장인자, 종결인자, 아미노아실티알엔에이(aminoacyl tRNA) 합성효소, RNA 중합효소 등은 세포 추출액에 포함된 것을 이용하거나 별개로 추가하거나, 유전자 재조합 기술에 의해 별도로 생산하여 사용할 수 있다.
본 발명의 용어, "무세포 단백질 합성 반응 혼합물"은 상기 무세포 단백질 합성을 수행하기 위한 구성 요소를 포함하고 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 단백질 생산에 필요한 리보좀, 개시인자, 신장인자, 종결인자, 방출인자 아미노아실티알엔에이 합성효소 등의 단백질 생합성 기구 등을 포함하는 세포 추출물 또는 재조합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 세포 추출물은 밀배아(Wheat germ), 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte), 효모, 중국 햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary cell) 또는 헬라 세포(HeLa cell) 추출물, 더욱 구체적으로 대장균 추출물일 수 있으나, 무세포 단백질 합성 반응에 이용될 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 재조합 단백질은 단백질 생산에 필요한 구성 요소들이 재조합 기술을 통해 제조된 것일 수 있고, 구체적으로 IF1, IF2 및 IF3 등의 개시인자, EF-G, EF-Tu 및 EFTs 등의 신장인자, RF1, RF2 및 RF3 등의 방출인자, RRF 등의 종결인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetases), 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소(methionyl-tRNA transformylase), RNA 중합효소(RNA polymerase) 또는 리보솜(ribosomes)일 수 있다. 상기 재조합 단백질의 혼합물은 무세포 단백질 합성을 위하여 필요한 구성 요소들을 모두 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 개시인자, 신장인자, 방출인자, 종결인자, 아미노아실-tRNA 합성효소, 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소, RNA 중합효소 및 리보솜으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 재조합 단백질 또는 이의 혼합물을 사용하는 경우, 목적 아미노산을 기질로 사용하는 효소들을 제외할 수 있으므로, 모든 종류의 아미노산을 정량할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 상기의 목적 아미노산을 포함하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 목적상, 상기 혼합물은 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "리포터 단백질"은 그의 생성 또는 합성을 용이하게 확인할 수 있는 신호를 발생하는 표지 단백질로서, 이때 상기 신호는 발광(luminescence), 형광(fluorescence), 인광(phosphorescence), 발색, 전자의 이동 등 다양한 형태일 수 있다.
구체적으로, 상기 리포터 단백질은 sfGFP(superfolder green fluorescence protein), GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), RFP(Red fluorescent protein), mCherry 형광 단백질, 락타마아제(lactamase), 갈락토시다아제(galactosidase), HRP(Horseradish peroxidase) 또는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기의 단백질 중 형광단백질들은 무세포 합성 반응액 내에 축적된 형광단백질의 형광을 측정하거나, 효소들의 경우 각 효소에 해당하는 기질을 이용하여 직접적으로 그 활성을 하게 된다. 또 다른 가능한 측정방법으로는 우리나라를 포함하여 전 세계에 개인진단장비로 널리 보급되어 있는 포도당 측정기를 사용할 수 있다. 이 경우, 무세포 단백질 합성 반응의 주형으로서 상기한 형광 단백질 및 효소들의 폴리뉴클레오티드 대신 인버타제 (invertase), 말타아제 (maltase), 글루코아밀라아제 (glucoamylase) 등과 같이 수크로즈 (sucrose), 말토오스 (maltose), 녹말 (starch)등과 같은 포도당이 포함된 이당류 및 다당류로부터 포도당을 해리시키는 효소들을 이용할 수 있다. 무세포 합성 시스템에서 이들 효소들을 생산할 경우 생산된 효소들을 각각 수크로즈, 말토오스, 녹말 등으로부터 포도당을 발생시키는 반응에 이용한 후 생성된 포도당을 포도당 측정기를 이용하여 정량함으로써 아미노산-합성된효소-포도당 농도의 비례적 상관관계를 이용하여 시료의 아미노산 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 용어, "리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 리포터 유전자를 의미하며, 구체적으로 상기 유전자의 DNA(deoxyribonucleic acid) 가닥일 수 있다. 이때, 상기 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 대장균 균주 BL21-Star(DE3) 세포 추출물, sfGFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, ATP, GTP, UTP 및 CTP 등의 리보뉴클레오시드 3인산 등 무세포 단백질 합성에 필요한 구성 요소들을 포함하지만 목적 아미노산은 포함하지 않는 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하였다(실시예 1-1 및 1-2).
본 발명에서, 상기 단계 (b)는 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계로서, 상기 단계는 상기 반응 혼합물과 상기 분석 시료를 혼합하여 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이때, "목적 아미노산", "무세포 단백질 합성 반응 혼합물" 및 "무세포 단백질 합성"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "분석 시료"는 목적 아미노산을 포함하고 있는 것으로서, 본 발명의 방법에 적용 대상이 되는 시료를 의미한다.
구체적으로, 사료, 식품 또는 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 유래된 것일 수 있다.
또한, 상기 분석 시료는 생물로부터 분리된 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 생물로부터 분리된, 혈액, 혈장, 혈청, 암조직 및 암세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 또한 전처리로서 열처리 및 여과된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, FBS에는 무세포 단백질 합성 반응을 방해하는 성분이 포함되어 있음을 확인함에 따라, 이를 해결하기 위하여 FBS를 열처리하였고, 생성된 응집체를 여과하여 제거한 후 본 발명의 방법에 사용한 결과, FBS 내에 포함된 아미노산을 정량할 수 있음을 확인하였다(실시예 1-4 및 도 4).
이때, 상기 용어 "생물"은 아미노산을 포함하고 있는 생물체로서, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적상, 상기 분석 시료는 상기의 목적 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 분석 시료는 아미노산 대사 관련 질환을 가진 환자로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 상기 아미노산 대사 관련 질환은 아미노산 대사 이상 질환 또는 암일 수 있다.
본 발명의 용어, "아미노산 대사 이상 질환"은 체내에서 특정 아미노산의 감소 또는 증가를 유도하는 질환을 의미한다. 이는 특정 아미노산 대사과정에 관여하는 효소의 결손 혹은 활성 저하 때문에 발생한다고 알려져 있으며, 상기 질환을 앓는 환자는 체내 아미노산의 농도가 정상인과는 확연히 구분된다. 구체적으로, 상기 아미노산 대사 이상 질환은 아르기닌 분해효소 결핍증(arginase deficiency), 시스틴뇨증(cystinuria), 단풍당밀뇨증(maple syrup urine disease), 고라이신혈증(hyperlysinemia), 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 고메티오닌혈증(hypermethioninemia) 및 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 상기 아르기닌 분해효소 결핍증은 아르기닌; 상기 시스틴뇨증은 아르기닌 또는 리신; 상기 단풍당밀뇨증은 이로류신 또는 발린; 상기 고라이신혈증은 리신; 상기 호모시스틴뇨증은 메티오닌; 상기 고메티오닌혈증은 메티오닌; 상기 페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 또는 티로신에 의해 야기되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 암의 성장 또는 발달을 위하여 혈장의 유리 아미노산이 재분배(redistribution) 또는 전위(translocation)되므로, 암 환자는 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과는 확연히 구분된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 준비한 무세포 단백질 반응 혼합물을 분석 시료로서 전처리된 FBS와 혼합하고 인큐베이션하여 무세포 단백질 합성을 수행하였다(실시예 1-4). 또한, 다양한 아미노산 대사 이상 질환과 관련이 있는 아미노산(아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 발린)을 포함하는 시료를 이용하는 경우에도 무세포 단백질 합성이 수행됨을 확인하였다(실시예1-3).
본 발명에서, 상기 단계 (c)는 상기 합성된 단백질의 신호의 세기를 측정하는 단계이다.
이때, 상기 단백질의 신호의 세기는 당업계에 공지된 방법으로 측정될 수 있다.
구체적으로, 단백질의 신호 검출이 가능한 측정 장치를 이용하여 측정될 수 있으며, 더욱 구체적으로 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 왈락/빅터 형광(Wallac/Victor Fluorescence), 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), 루미노미터(luminometer), 분광광도계(spectrophotometer), CV(Cyclic voltammetry) 등을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (c)의 또 다른 방법으로, 무세포 합성된 단백질의 활성을 이용하여 포도당을 생성하고 이를 포도당 측정기를 통하여 정량하는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 대장균 유래 인버타아제 유전자가 포함된 무세포 합성 용액에서 해당 인버타아제를 생산한 후 이를 수크로오스가 포함된 용액에 가하여 인큐베이션 한 후, 생성된 포도당을 포도당 측정기를 사용하여 측정함으로써 인버타아제의 활성을 추정할 수 있다. 추정된 인버타아제의 활성은 무세포 합성 반응 시료 내의 아미노산 농도에 비례하므로, 결과적으로 포도당의 농도 측정을 통해 시료 내 아미노산의 농도를 측정할 수 있게 된다. 이러한 원리를 이용한 아미노산 분석에는 상기한 인버타아제 이외에도 말토오스로부터 포도당을 생성하는 말타아제, 전분으로부터 포도당을 생성하는 글루코아밀라아제 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단계 (d)는 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계이다.
본 발명의 용어, "표준 시료"는 각 아미노산을 특정 농도로 포함하고 있는 것으로서, 구체적으로, 이에 제한되지 않으나, 0.01 내지 100 μM의 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 표준 시료를 이용하여 무세포 단백질 합성을 하는 경우, 각 아미노산의 특정 농도에 해당하는 단백질의 신호를 알 수 있으며, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산의 농도를 알 수 있다. 따라서, 상기 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선은 아미노산의 특정 농도에 따른 단백질의 신호에 대한 정보를 포함하고 있는바, 상기 단계 (a) 내지 (c)에 따라 측정한 신호 세기를 상기 곡선과 비교하면 목적 아미노산의 농도를 산출할 수 있다.
이때, 본 발명의 목적상, 상기 목적 아미노산의 농도는 목적 아미노산을 표준 시료로서 사용하여 제작한 표준 농도 곡선과 비교하여 산출된다.
본 발명에서, 본 발명에 따른 아미노산의 정량 방법은 10 nM 내지 150 μM, 구체적으로 50 nM 내지 130 μM, 더욱 구체적으로 100 nM 내지 110 μM, 더더욱 구체적으로 130 nM 내지 100 μM 농도의 아미노산을 정량할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 대장균 균주 BL21-Star(DE3) 세포 추출물, sfGFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, ATP, GTP, UTP 및 CTP 등의 리보뉴클레오시드 3인산 등 무세포 단백질 합성에 필요한 구성 요소들을 포함하지만 목적 아미노산은 포함하지 않는 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하였고(실시예 1-1 및 1-2), 상기 반응 혼합물을 특정 농도의 목적 아미노산(아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 발린)만을 포함하는 표준 시료와 혼합하고 인큐베이션하여 무세포 단백질 합성을 수행함으로써 sfGFP 형광 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선을 그렸다(실시예 1-3 및 도 3). 이후, 분석 시료인 소태아혈청(FBS)에 포함된 목적 아미노산을 정량하기 위하여 상기 FBS를 열처리 및 여과하였으며(실시예 1-4), 이를 상기 반응 혼합액과 혼합하고 인큐베이션하여 무세포 단백질 합성을 수행한 이후, 검출된 sfGFP 형광의 세기를 상기 표준 농도 곡선과 비교함으로써 알라닌, 시스테인, 세린, 글라이신, 히스티딘, 트레오닌, 프롤린 또는 트립토판 등의 목적 아미노산을 정량하였으며, 이들의 농도는 약 130 nM 내지 100 μM임을 확인하였다(도 7 및 8).
이는, 본 발명에 따른 아미노산의 정량 방법은 무세포 단백질 합성 시스템을 성공적으로 이용하는바, 저렴한 비용으로 짧은 시간에 아미노산을 정량할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 아미노산의 정량 방법에 따라 정량한 아미노산의 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
또한, 이 방법은 아미노산 대사 관련 질환, 구체적으로 아미노산 대사 이상 질환 또는 암을 진단하는 방법일 수 있으며, 상기 아미노산 대사 이상 질환 및 암에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
아미노산 대사 관련 질환 환자는 질환의 직접 또는 간접적인 결과로서 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과 달라지므로, 본 발명에 따른 아미노산 정량 방법은 상기의 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.
구체적으로, (a) 아미노산 대사 관련 질환을 가진 환자로부터 분리된 분석 시료를 이용하여 본 발명에 따른 아미노산 정량 방법을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 정량된 아미노산의 농도를 정상 대조군과 비교하여, 정상 대조군에 비하여 아미노산의 농도가 낮거나 높은 경우 아미노산 대사 관련 질환으로 판정하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법 또는 진단 방법일 수 있다.
이때, 상기 분석 시료에 대한 설명은 전술한 바와 같으며, 상기의 질환이 나타내는 특징적인 아미노산의 농도(프로파일)는 당업계에 공지된바, 당업자라면 본 발명에 따른 방법, 구체적으로 상기 단계 (a) 및 (b)를 통해 아미노산 대사 관련 질환 환자를 용이하게 판정할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 생물로부터 분리된 분석 시료에 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 방법에 따라 상기 후보물질이 처리된 분석 시료에 포함된 목적 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이때, 상기 분석 시료에 대한 설명은 전술한 바와 같으며, 구체적으로 아미노산 대사 관련 질환을 가진 환자로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 후보물질"은 아미노산 대사 관련 질환을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 아미노산 대사 관련 질환을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.
본 발명에서, 분석 시료에 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 상기 (a) 단계는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 분석 시료에 상기 후보물질을 처리하여 함께 배양하거나, 또는 생체 내에 투여함으로써 상기 후보물질을 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.
또한, 분석 시료에 포함된 목적 아미노산의 농도를 측정하는 상기 (b) 단계는 본 발명에 따른 방법을 사용할 수 있다.
마지막으로, 상기 (c) 단계는 상기 후보물질을 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질로서 사용할 수 있는지 판단하는 단계이다. 아미노산 대사 관련 질환 환자는 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과 다르므로, 정상 대조군과 동일하거나 유사한 아미노산 농도를 나타내게 하는 후보물질은 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 후보 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 트랜스아미나제를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 트랜스아미네이션 반응에 의해 생성된 아미노산의 농도를 무세포 단백질 합성 방법의 아미노산 정량을 통해 확인함으로써 후보 기질을 스크리닝하는 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, “트랜스아미나제”는 아미노산과 α-케토산 사이에서 아미노기를 제거하여 다른 분자로 옮기는 생화학적인 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 구체적으로, 아미노산으로부터 아미노기를 제거하여 α-케토산을 생성하게 하고 이후 아미노기가 없는 또 다른 α-케토산에 아미노기를 옮겨 새로운 아미노산을 생성하는 반응을 촉매한다.
상기 아민제공기질은 아민기를 가지며 효소 또는 촉매에 의해 아민기를 전달할 수 있는 기질을 의미한다. 또한, 상기 아민수용기질은 효소 또는 촉매에 의해 아민기를 전달받을 수 있는 기질을 의미한다.
구체적으로, 트랜스아미나제는 아민제공기질의 일차 아민(primary amine) 기를 아민수용기질의 케톤기와 교환하는 반응을 촉매한다. 그 결과, 제공기질의 아민기는 케톤기로, 수용기질의 케톤기는 아민기로 치환되게 된다.
따라서 본 발명의 적용을 위한 아민제공기질로는 일차 아민기를 가지는 다양한 화합물들이 사용될 수 있으며, 아민수용기질로는 케톤기가 아민기로 치환됨으로서 아미노산으로 전환되는 기질들이 사용될 수 있다.
예를 들어, 피루브산의 경우 케톤기가 아민기로 바뀜에 따라 알라닌을 생성하며, 알파-케토글루타레이트를 아민수용기질로 사용할 경우 글루타메이트가 생성된다. 또한, 옥살로아세테이트를 아민수용기질로 사용할 경우 아스파르테이트가 생성되어 본 발명에 의해 트랜스아미나제의 활성을 측정할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 아미노산의 농도를 측정하는 단계는 상기 무세포 단백질 합성법에 따른 아미노산 정량 방법을 통해 측정하는 것일 수 있다.본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 트랜스아미나제를 통해 다양한 기질의 스크리닝을 수행하기 위해 기질과 효소를 반응시킨 후 생성된 반응물을 무세포단백질 합성 방법에 따른 아미노산 정량을 진행한 결과, 각 기질에 따른 아미노산 수준의 차이를 통해 기질을 스크리닝할 수 있음을 확인하였다 (도 12).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 후보 트랜스아미나제를 반응시키는 단계; (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 트랜스아미나제, 아민제공기질, 아민수용기질은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 (b) 단계에서 아미노산의 농도를 측정하는 단계는 상기 무세포 단백질 합성법에 따른 아미노산 정량 방법을 통해 측정하는 것일 수 있다.
상기 트랜스아미나제의 스크리닝 방법은 기존에 공지된 트랜스아미나제 스크리닝 방법 (Mathew, Sam, et al., 2013; Truppo, Matthew D., et al., 2009)에, 상기 무세포 단백질 합성 방법에 따른 아미노산 정량 방법을 적용하여 개발한 방법을 사용하였으므로, 상기 스크리닝 방법을 통해 활성이 우수한 트랜스아미나제를 스크리닝할 수 있음을 시사한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산 정량 방법의 구축
실시예 1-1. 무세포 단백질 합성을 위한 세포 추출물의 수득 방법
본 발명의 무세포 단백질 합성 시스템을 구축하기 위해 사용한 세포 추출물은 기존 공지된 방법(한국 등록특허공보 제10-0733712호)에 따라 수득하였다.
구체적으로, 대장균 균주 BL21-Star(DE3) 세포를 37℃의 2 × YTPG 배지 3 ℓ에서 배양하였다. T7 RNA 중합효소의 발현을 유도하기 위하여 OD600이 0.6에 도달할 때 1 mM IPTG(isopropyl-thiogalactopyranoside)를 배양액에 첨가하였고, OD600이 ~4.5일 때 세포를 수확하여 세척 버퍼[10 mM TRIS-아세테이트 pH 8.2, 14 mM 마그네슘 아세테이트, 80 mM 포타슘 아세테이트, 1 mM DTT(dithiothreitol), 및 세포 1 g당 0.05%(v/v) 2-머캅토에탄올(2-ME)] 20 ㎖로 세 번 세척하였다. 상기 세척한 세포(10 g)를 용해 버퍼(2-ME이 포함되지 않은 세척 버퍼) 12.7 ㎖에 재현탁하였고, 일정한 압력(20,000 psi)하에 French Pressure Cell(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 용해하였다.
이후, 상기 세포의 상층액(이하, 'S12 추출물'로 명명)을 수득하기 위하여, 세포 용해물을 12,000 g 30분 동안 두 번 원심분리하였다. 남아있는 아미노산을 제거하기 위하여, 상기 S12 추출물을 50,000 Da의 분자량을 차단하는 막을 갖는 Vivaspin 원심분리 장치(Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany)를 이용하여 원심분리하였다. 18 ㎖의 세척 버퍼에 2 ㎖의 상기 S12 추출물을 첨가한 후, 희석된 추출물의 부피를 원래의 부피(2 ㎖)로 감소시키기 위하여, 2,000 g에서 원심분리하는 과정을 세 번 반복하였다. 마지막으로, S12 추출물의 분취물을 급속동결한 후, -80℃에 보관하였다.
실시예 1-2. 아미노산 분석 방법
무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산 정량 방법의 구축하기 위하여, 다음과 같은 방법을 수행하였다.
먼저, 무세포 단백질 합성의 반응 혼합물(reaction mixtures; 이하, '반응 혼합물'로 명명함)은 다음과 같이 조성하였다: 57 mM HEPES-KOH, pH 8.2; 1.2 mM ATP; GTP, UTP, 및 CTP 각 0.85 mM; 80 mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate); 12 mM 마그네슘 아세테이트(magnesium acetate); 80 mM 포타슘 아세테이트(potassium acetate); 34 ㎍/㎖ 1,5-포르밀(formyl)-5,6,7,8-테트라하이드로폴릭산(tetrahydrofolic acid); 아미노산 각 2 mM; 2% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 8000; 3.2 U/㎖ 크레아틴 키나제(creatine kinase); 67 mM 크레아틴 인산(creatine phosphate); 24% (v/v) 여과한 S12 추출물; 및 6.7 ㎍/㎖ pK7-sfGFP(sfGFP(superfolder green fluorescence protein) 플라스미드.
이후, 정량할 목적 아미노산을 포함하고 있는 분석 시료(assay samples) 10 ㎕에 상기 목적 아미노산을 포함시키지 않은 불완전 반응 혼합물(incomplete reaction mixture) 20 ㎕를 혼합한 뒤, 이를 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션(incubation)함으로써 무세포 합성 반응을 수행하였다. 이때, 상기 불완전 반응 혼합물은 반응 혼합물 준비 시 정량할 목적 아미노산을 제외하여 준비하였다.
상기의 무세포 합성 반응을 통해 생성된 sfGFP 형광 강도 신호를 측정하였고, 이를 아미노산 농도 측정을 위한 표준 곡선과 비교함으로써 아미노산을 정량하였다. 또한, 분석 결과의 유의성을 확인하기 위하여, Hitachi L-8900 아미노산 분석기(Hitachi High-Technologies, Tokyo, Japan)를 통해 확인한 값과 비교하였다.
통계 분석을 위해 SPSS Version 22.0 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하였고, P > 0.05는 통계적으로 유의성이 없는 것으로 간주하였다.
실시예 1-3. sfGFP 형광 신호에 따른 아미노산의 농도 확인
무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산 정량 방법을 구축하기 위하여, 먼저 특정 농도의 목적 아미노산만을 포함하는 표준 시료를 이용하여 sfGFP 형광 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선을 그렸다.
한편, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아미노산 정량 방법은 반응 혼합물(19개의 아미노산은 포함하고 있음)이 가지고 있지 않은 1개의 아미노산을 분석 시료가 보완함으로써 이루어진다. 예를 들어, 리신이 포함되지 않은 반응 혼합물의 경우, 리보솜은 mRNA의 리신 코돈에서 작동을 멈추기 때문에 절단된 단백질 단편만 생성하고, 이에 따라 주형 DNA로부터 sfGFP 번역(translation)을 완료할 수 없어 결과적으로 형광 신호를 만들어낼 수 없다. 그러나, 상기 반응 혼합물에 리신을 포함하는 분석 시료를 혼합하면 반응 혼합물에 20개의 모든 아미노산이 포함되게 되므로, 온전한 sfGFP를 생성하기 위한 번역은 완료되어 결과적으로 형광 신호가 만들어지게 된다. 이에 따라, 본 발명자들은 sfGFP 형광 신호의 강도는 분석 시료 안에 포함된 아미노산 역가에 비례하는 것에 착안하여, 본 발명의 아미노산 정량 방법을 개발한 것이다.
구체적으로, 목적 아미노산으로서 하기 표 1에 기재한 바와 같은, 각기 다른 아미노산 대사 이상 질환과 관련있는 아르기닌(arginine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine) 및 발린(valine) 8개 아미노산을 선택하였다.
아미노산 관련 질환
아르기닌 아르기닌 분해효소 결핍증(arginase deficiency), 시스틴뇨증(cystinuria)
이소류신 단풍당밀뇨증(maple syrup urine disease)
류신
리신 시스틴뇨증, 고라이신혈증(hyperlysinemia)
메티오닌 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 고메티오닌혈증(hypermethioninemia)
페닐알라닌 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)
티로신
발린 단풍당밀뇨증
이후, 다양한 농도의 상기 아미노산을 포함하는 표준 시료를 이용하여, sfGFP 형광 강도에 대한 아미노산 농도의 직선 표준 곡선을 그렸다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 표준 곡선은 아미노산의 농도가 100 μM 정도로 비교적 높은 경우에도 직선의 형태를 나타냄을 확인하였고, sfGFP 형광은 아미노산의 농도가 130 내지 980 nM 정도로 낮은 경우에도 검출됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 방법은 상기 8개의 아미노산의 정량에 활용될 수 있으며, 이의 정량 가능한 농도는 130 nM 내지 100 μM로서 광범위함을 확인하였다.
실시예 1-4. 생물학적 분석 시료를 이용한 아미노산의 정량 방법의 확립
본 발명의 방법이 생물학적 샘플에 포함된 아미노산을 정량할 수 있는지 확인하기 위하여, 분석 시료로서 소태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)를 이용하였다.
구체적으로, FBS 5 ㎕를 물에 4배로 희석하였고, 이를 불완전 반응 혼합물에 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션한 후, 15 ㎕을 빼내어 PBS(phosphate buffered saline) 200 ㎕에 희석한 후 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 3의 A에서 볼 수 있듯이, 분석 시료로서 FBS를 첨가하는 경우에는 무세포 단백질 합성 반응이 활성화되지 않아 sfGFP가 생성되지 않고, sfGFP 형광 신호가 발생하지 않음에 따라, 이들의 sfGFP 형광 신호는 sfGFP DNA가 포함되지 않은 음성 대조군 반응 혼합물과 유사함을 확인하였다.
그러나, 도 3의 B에서 볼 수 있듯이, 표준 아미노산 분석기를 이용하여 FBS에 포함된 아미노산을 분석한 결과, FBS에는 35 내지 420 μM의 8개 목적 아미노산이 포함되어 있음을 확인하였고, 이들의 농도는 상기 실시예 2를 통해 준비한 표준 곡선의 범위 안이거나 또는 이를 초과하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, FBS는 본 발명의 무세포 단백질 합성 반응을 방해하는 특정 성분을 포함하고 있음을 알 수 있었다.
이에, 상기 FBS의 무세포 단백질 합성 반응 저해 효과를 감소시키기 위하여, FBS를 열처리한 후 분석에 사용하였다. 구체적으로, FBS를 80℃에서 10분 동안 열처리하고, 이에 따라 형성된 단백질 응집체를 원심분리장치를 사용하여 제거하였다.
그 결과, 도 4의 A에서 볼 수 있듯이, 열처리하지 않은 FBS를 분석 시료로 사용하는 경우에는 무세포 단백질 합성 반응이 저해되어 sfGFP 형광 신호가 급격히 감소하지만, 열처리 및 여과한 FBS를 분석 시료로 사용하는 경우에는 sfGFP 형광 신호가 높은 수준을 유지하는 것을 확인하였다.
또한, 도 4의 B에서 볼 수 있듯이, 열처리하지 않은 FBS를 사용하는 경우에는 23S rRNA, 16S rRNA 및 mRNA 등이 분해되는 것을 확인하였으나,
도 4의 C에서 볼 수 있듯이, 열처리 및 여과한 FBS를 사용하는 경우에는 상기 RNA 종들이 분해되지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, FBS 내에는 무세포 단백질 합성 반응을 억제하는 요소가 존재하며, 이들은 RNA 등을 분해하는 핵산 분해효소 활성을 갖는 것임을 알 수 있었다. 다만, 이들의 억제 효과는 FBS를 열처리한 후, 여과하면 제거되는 것을 알 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 방법에 사용하는 분석 시료는 열처리 후, 생성된 응집체를 여과한 것을 사용하는 것이 바람직할 것임을 알 수 있었다.
실시예 1-5. 포도당 측정기를 이용한 생물학적 분석시료의 아미노산 정량 방법
실시예 1-2에 기술된 바와 같은 조건에서 무세포 단백질 합성 반응을 진행하였다. 단, 무세포 합성 반응의 주형 뉴클레오티드로서 sfGFP 유전자가 아닌 인버타아제 유전자를 사용함으로써 무세포 합성 반응을 통해 인버타아제가 생산되도록 하였다. 무세포 합성 반응 후 10 μL의 반응용액을 같은 부피의 수크로오스 용액 (100 mM potassium acetate, 100 mM sucrose, pH 6.0)과 섞은 후 25℃에서 5분간 반응하였다. 95℃에서 5분간 가열을 통해 포도당 생성반응을 종결한 후 5 μL의 상등액을 취하여 생성된 포도당의 양을 포도당 측정기 (Accu-check, Roche Diagnostics)를 이용하여 측정하였다 (도 5).
실시예 2. 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 아미노산 정량 방법의 유의성 확인
실시예 2-1. 무세포 단백질 합성 시스템에서 생산된 형광단백질의 측정을 통한 생물학적 분석시료의 아미노산 정량 방법의 유의성 확인
상기 실시예 1-2에 따라 개발한 아미노산 정량 방법의 유의성을 확인하기 위하여, 분석 시료로서 열처리 및 여과한 FBS를 사용하여, 상기 분석 시료에 포함되어 있는 아미노산을 정량하였다.
그 결과, 도 6의 A에서 볼 수 있듯이, 각각 아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 발린을 포함하지 않는 8개의 불완전 반응 혼합물 모두 sfGFP 형광 신호를 생성하는 것을 확인하였다.
또한, 도 6의 B에서 볼 수 있듯이, 상기 sfGFP 형광 신호를 표준 곡선에 대입하여 각 아미노산의 농도를 확인한 결과, 본 방법을 통해 정량한 아미노산의 농도는 표준 HPLC 분석을 통해 확인한 농도와 매우 유사함을 확인하였다.
아울러, 도 7 및 8에서 볼 수 있듯이, 본 방법을 통해 FBS에 포함된 대부분의 아미노산을 정량할 수 있음을 확인하였고, 구체적으로 상기 8개 아미노산 이외에, 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 글라이신(glycine), 히스티딘(histidine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline) 또는 트립토판(tryptophan)도 정량할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-2. 포도당 측정기를 이용한 생물학적 분석시료의 아미노산 정량 방법의 유의성 확인
상기 실시예 1-5에 따라 개발한 아미노산 정량 방법의 유의성을 확인하기 위하여, 분석 시료로서 열처리 및 여과한 FBS를 사용하여, 상기 분석 시료에 포함되어 있는 아미노산을 정량하였다.
그 결과, 도 9 및 10에서 볼 수 있듯이, 각각 아르기닌, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 발린을 포함하지 않는 8개의 불완전 반응 혼합물 모두 포도당 측정기에 의해 측정될 수 있음을 알 수 있었으며, 포도당 측정기에 의해 측정된 값을 표준 곡선에 대입하여 각 아미노산의 농도를 확인한 결과, 본 방법을 통해 정량한 아미노산의 농도는 표준 HPLC 분석을 통해 확인한 농도와 매우 유사함을 확인하였다.
실시예 3. 재조합 단백질의 혼합물을 이용한 아미노산 정량 방법의 유의성 확인
더욱 효율적인 아미노산 정량 방법을 개발하기 위하여, 무세포 단백질 합성에 세포 추출물이 아닌, 재조합 기술을 이용하여 제조한 재조합 단백질들을 이용하였다.
구체적으로, 세포 추출물에는 아미노산을 기질로 사용하는 효소들이 포함되어 있어, 목적 아미노산이 정량되지 않는 문제점이 발생할 수도 있는바, 상술한 효소들을 재조합 단백질 반응 혼합물에서 제외하기 위하여 무세포 단백질 합성에 필요한 구성 요소들을 당업계에 공지된 재조합 기술을 통해 각각 제조하였고, 이들을 혼합하여 상기 실시예 1-2에 따른 무세포 단백질 합성을 수행하였다. 이때, 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자, 종결 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetases), 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소(methionyl-tRNA transformylase), RNA 중합효소(RNA polymerase), 리보솜(ribosomes) 등을 제조하여 사용하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 세포 추출물이 아닌, 재조합 단백질을 이용하여도 무세포 단백질 합성 방법을 통해 아미노산을 정량할 수 있음을 확인하였고, 구체적으로 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid) 또는 글루타민(glutamine)도 정량할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 무세포 단백질 합성법에 의한 트랜스아미나제 기질 스크리닝
무세포 단백질 합성법과 아미노산 정량법을 응용하여 트랜스아미나제 기질의 스크리닝에 적용하여 스크리닝 효과를 확인하였다.
트랜스아미나제 (이 실시예에서는 Vibrio fluvialis 유래의 트랜스아미나제 사용), 스크리닝하고자 하는 아민제공기질 (S01, α-메틸벤질아민; S02, 벤질아민; S03, 3-페닐-1-프로필아민; S04, 페닐부틸아민; S05, 프로필아민; S06, 아밀아민; S07, 이소프로필아민; S08, sec-부틸아민; S09, β-알라닌; S10, 페닐알라닌) 중 하나, 및 아민수용기질 (이 실시예에서는 피루브산을 사용)을 50 mM Tris-HCl (pH7.2), 10 mM 아민제공기질, 10 mM 아민수용기질, 20 μM 피리독살-5'-포스페이트, 10 μl 트랜스아미나제, 37℃, 1000 rpm, 3 시간 배양 조건에서 반응시켰다.
상기 과정에서 수득한 반응용액을 적절한 희석배수로 희석하여 피루브산의 트랜스아미네이션 반응 결과물인 알라닌이 제외된 무세포 단백질 합성반응액에 첨가하고, 최종 부피 150 μl; 57 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 각각 0.85 mM의 CTP, GTP, 및 UTP, 2 mM DTT, 90 mM 포타슘 글루타메이트, 80 mM 암모늄 아세테이트, 12 mM 마그네슘 아세테이트, 67 μg/mL l-5-포밀-5,6,7,8-테트라하이드로폴산, 각각 2 mM의 19 종류 아미노산 (알라닌 제외), 2% PEG 8000, 67 mM CP, 3.2 μg/mL CK, 13 μg/mL 주형 DNA, 40 μl of S12 추출물, 및 3 μl of 트랜스아미나제 반응 혼합물, 30℃, 3 시간 배양 조건에서 sfGFP 발현을 측정하였다. 측정된 형광값을 알라닌 농도별로 측정된 표준곡선과 비교함으로써 트랜스아미네이션 반응과정에서 피루브산으로부터 생성된 알라닌의 양을 결정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 기질에 따라 알라닌 농도가 다르게 나타남을 확인하였으며, 이와 같은 방법을 이용하여 트랜스아미나제 기질을 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (24)

  1. (a) 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 준비하는 단계;
    (b) 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 혼합하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 단계;
    (c) 상기 합성된 단백질의 신호의 세기를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 측정된 신호의 세기를 표준 시료를 이용하여 제작한, 단백질의 신호에 따른 각 아미노산에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 아미노산의 농도를 산출하는 단계를 포함하는, 아미노산의 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적 아미노산은 아르기닌(arginine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 발린(valine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 글라이신(glycine), 히스티딘(histidine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글루타민(glutamine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 세포 추출물 또는 재조합 단백질의 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포 추출물은 대장균, 밀배아(Wheat germ), 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte), 효모, 중국 햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary cell) 또는 헬라 세포(HeLa cell) 추출물인 것인, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자, 종결 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetases), 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소(methionyl-tRNA transformylase), RNA 중합효소(RNA polymerase) 및 리보솜(ribosomes)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 리포터 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 sfGFP(superfolder green fluorescence protein), GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), RFP(Red fluorescent protein), mCherry 형광 단백질, 락타마아제(lactamase), 갈락토시다아제(galactosidase), HRP(Horseradish　peroxidase) 또는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase)인 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 분석 시료는 사료, 식품 또는 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 유래된 것인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 분석 시료는 생물로부터 분리된 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 분석 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 암조직 및 암세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 분석 시료는 열처리 및 여과된 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 분석 시료는 아미노산 대사 관련 질환을 가진 환자로부터 분리된 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아미노산 대사 관련 질환은 아미노산 대사 이상 질환 또는 암인 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 아미노산 대사 이상 질환은 아르기닌 분해효소 결핍증(arginase deficiency), 시스틴뇨증(cystinuria), 단풍당밀뇨증(maple syrup urine disease), 고라이신혈증(hyperlysinemia), 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 고메티오닌혈증(hypermethioninemia) 및 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 방법은 10 nM 내지 150 μM 농도의 아미노산을 정량하는 것인, 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 정량한 아미노산의 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 아미노산 대사 관련 질환은 아미노산 대사 이상 질환 또는 암인 것인, 방법.
  18. (a) 생물로부터 분리된 분석 시료에 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 후보물질이 처리된 분석 시료에 포함된 목적 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 아미노산 대사 관련 질환은 아미노산 대사 이상 질환 또는 암인 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 대사 이상 질환은 아르기닌 분해효소 결핍증, 시스틴뇨증, 단풍당밀뇨증, 고라이신혈증, 호모시스틴뇨증, 고메티오닌혈증 및 페닐케톤뇨증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  21. (a) 후보 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 트랜스아미나제를 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 (b)단계의 아미노산 농도를 측정하는 단계는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 측정하는 것인, 트랜스아미나제 기질의 스크리닝 방법.
  23. (a) 아민제공기질 및 아민수용기질의 혼합물에 후보 효소를 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응 용액에 포함된 반응 후 아미노산의 농도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 아미노산 농도를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 트랜스아미나제의 스크리닝 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 (b)단계의 아미노산 농도를 측정하는 단계는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 측정하는 것인, 트랜스아미나제의 스크리닝 방법.
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