KR100733712B1 - 무세포 단백질 합성용 세포 추출액 제조 및 이를 이용한단백질 합성법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)의 경제성과 생산성 향상을 위한 하나의 방법으로, 무세포 단백질 합성의 촉매로 사용되는 세포 추출액을 간단하게 원심분리만으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 종래 세포 추출액 제조 공정은 세포배양 → 세포파쇄 → 고속원심분리(high-speed centrifugation)→ 전반응(pre-incubation)→ 투석(dialysis) 등의 복잡한 공정을 거쳐야 했지만, 본 발명에서는 위의 복잡한 공정을 대신하여, 세포 파쇄액을 간단하게 원심분리만을 거친 후 단백질 발현에 사용할 수 있게 함으로써, 종래 방법에 의해 제조된 세포 추출액보다 높은 단백질 생산 능력과 일정한 생산성을 나타내게 하면서 세포 추출액의 제조 공정을 단순화하여 제조 비용은 약 60%, 제조 시간은 약 80% 절감하는 효과를 제공하게 한 것이다.

무세포 단백질 합성, 세포 추출액

Description

무세포 단백질 합성용 세포 추출액 제조 및 이를 이용한 단백질 합성법{Preparation of cell extract and its application for cell―free protein systhesis}

도 1은 본 발명의 세포 추출액(S30 추출액)과 종래 세포 추출액(S12 추출액)을 제조하는 공정을 간략하게 나타낸 공정도.

도 2는 종래 세포 추출액(S30)을 제조하는 각 단계로부터 수득한 단계별 추출액 시료의 단백질 합성 능력을 나타낸 그래프.

도 3은 세포 종류에 따른 본 발명의 세포 추출액(S12)과 종래 세포 추출액(S30)의 무세포 단백질 합성 효과를 나타낸 그래프.

도 4는 본 발명의 세포 추출액(S12)과 종래 세포 추출액(S30)의 제조 비용과 시간을 비교하여 나타낸 그래프.

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본 발명은 무세포 단백질 합성용 세포 추출액 및 무세포 단백질 합성방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포를 배지에 배양하고, 이를 파쇄하여 원하는 단백질의 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 파쇄물로부터 간단하게 원심분리로 수득한 무세포 단백질 합성용 세포 추출액 및 이를 무세포 단백질 합성시스템에 적용한 무세포 단백질 합성법에 관한 것이다.

최근 각종 게놈 프로젝트의 진행과 함께 다양한 종의 유전자 서열이 밝혀짐에 따라, 이들 유전자 서열에 암호화된 수 많은 단백질들의 기능 규명이 생명과학의 당면과제로 떠오르게 되었다.

그러나,“유전자클로닝→ 클로닝된 유전자의 도입→ 유전자가 도입된 세포의 배양→ 배양된 세포의 파쇄→ 파쇄액으로부터의 단백질의 분리정제”등의 다단계 공정을 거쳐 단백질을 생산하는 종래의 재조합 유전자 공법은 기하급수적으로 늘어나고 있는 신규 유전정보들을 단백질의 형태로 번역하기에는 그 처리량(throughput)에 현저한 한계를 가지게 되었다.

이에 따라, 종래의 세포배양공정을 대체할 수 있는 새로운 단백질 발현 방법 으로 무세포 단백질 합성시스템이 새로이 주목을 받고 있다.

이는 일반적으로 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)은 세포에서 단백질 생산에 관련되는 세포 내 기구와 이의 인자들만을 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 대량 생산함으로써, 세포 배양공정을 거치지 않고 고속으로 단백질을 합성할 수 있을 뿐만 아니라 세포막과 세포벽의 공간 안에서 단백질 발현이 진행되는 세포 배양공정에 비해 물리적인 장벽이 존재하지 않는 완전히 열린 시스템으로서, 다양한 연구에 적용하기 위해서 단백질 합성의 조건을 자유롭게 변형시킬 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문이다.

예를 들면, 유전정보로부터 수 시간 내에 단백질 생산해야 하는 경우뿐만 아니라, 단백질에 선택적인 표식을 하거나, 라이보좀 디스플레이 (ribosomal display), 단백질을 고정된 표면에 정렬 (protein array)등을 하는데 유용하게 이용될 수 있다.

초기에는 유전정보의 번역과 관계된 과학적인 궁금증을 해결하기 우한 도구로 이용되어져 왔는 무세포 단백질 합성 시스템은, 그러나 상기와 같은 이유에 의해 Zamecmick에 의해 최초로 시연(1958년)한 이래로 다양한 형태의 무세포 단백질 합성시스템이 개발되고 있는 실정이다.

하지만, 종래의 무세포 단백질 합성법은 높은 구축 비용으로 인해 광범위한 사용과 적용이 제한을 받아왔다. 그리고, 이러한 고비용 문제는, 무세포 단백질 합성법에서 단백질 합성에 촉매로 작용하는 세포 추출액의 복잡하고 고비용의 제조 공정에서 발생되어져 왔다.

예를 들어, 현재까지 사용되고 있는 무세포 단백질 합성을 위한 대장균 유래의 세포 추출액은 1984년 프라트(Pratt)에 의해, 세포 파쇄(cell lysis), 고속 원심분리(high-speed centrifu gation, 30,000 RCF), 전배양(pre-incubation), 투석(dialysis)과 최종 저속 원심분리 (low-speed centrifugation, 4,000 RCF)단계를 순차적으로 거치게 하여 제조한 것을 사용함으로써, 비용이 무세포 단백질 합성법 전체 비용 기준으로 약 30% 이상을 차지하는 등, 복잡하면서 고비용의 문제점을 안고 있다.

따라서, 세포 추출액을 더욱 경제적으로 생산하는 방법의 개발은 무세포 단백질의 고비용 문제를 해결하기 위한 결정적인 요소이다.

또한, 제조비용뿐만 아니라 복잡한 제조공정상에서 기인하는 세포 추출액의 일정하지 않은 단백질 생산 능력은 무세포 발현 시스템의 제품화에도 걸림돌이 되어 왔다.

그러나, 무세포 단백질 합성법에서 생산 단백질의 생산성 향상을 위한 연구는 활발하게 진행되어온 반면, 이러한 세포 추출액의 제조 방법을 개선하고 공정의 경제성을 향상시키기 위한 연구는 상대적으로 미미하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 무세포 단백질 합성법에 사용하는 세포 추출액을 경제성 및 생산성 향상의 측면에서, 배지에서 배양한 세포를 파쇄하여 원하는 단백 질의 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 파쇄액을 제조한 다음, 간단하게 원심분리만으로 분리하여 제조한 세포 추출액을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조한 세포 추출액을 무세포 단백질 합성법에 적용하여 공정이 단순하게 경제적인 무세포 단백질 합성법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배지에서 배양한 세포를 파쇄하여 원하는 단백질의 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 파쇄액을 제조하는 단계; 및

상기 세포 파쇄물을 12,000~30,000×g로 원심분리하고, 이의 상등액을 수득하는 단계로부터 제조한 세포 추출액을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 무세포 단백질 합성법에 있어서,

상기 세포 추출액을, 글리신(Glycine;Gly,G), 알라닌(Alanine;Ala,A), 발린(Valine;Val,V), 류신(Leucine;Leu,L), 이소류신(Isoleucine;Ile,I), 프롤린(Proline; Pro,P), 페닐알라닌(Phenylalanine;Phe,F), 티로신(Tyrosine;Tyr,Y), 트립토판(Tryptophan;Trp,W), 시스테인(Cysteine;Cys,C), 메치오닌(Methionine;Met, M), 세린(Serine;Ser,S), 트레오닌(Threonine;Thr,T), 리신(Lysine;Lys,K), 아르기닌(Arginine;Arg,R), 히스트딘(Histidine;His,H), 아스파레이트(Aspartate;Asp,D), 글루타메이트(Glutamate; Glu,E), 아스파라긴(Asparagine;Asn,N) 및 글루타민(Glu tamine;Gln,Q)으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한 종인 L-형 아미노산으로 이루어지는 아미노산 혼합물과,

ATP, CTP, GTP, TTP 및 UTP 등 으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한 종의 에너지원으로 이루어지는 단백질 합성 에너지원과,

목적 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA로 이루어지는 유전자 정보원과,

완충용액이 포함되어 이루어지는 반응 배지에 첨가하여 반응시켜 목적 단백질을 합성하는 무세포 단백질 합성법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)의 경제성과 생산성 향상을 위한 하나의 방법으로, 무세포 단백질 합성의 촉매로 사용되는 세포 추출액을 간단하게 원심분리만으로 제조한 것이다.

즉, 종래 세포 추출액 제조 공정은 세포배양 → 세포파쇄 → 고속원심분리(high-speed centrifugation)→ 전반응(pre-incubation)→ 투석(dialysis) 등의 복잡한 공정을 거쳐야 했지만, 본 발명에서는 위의 복잡한 공정을 대신하여, 세포 파 쇄액을 간단하게 원심분리만을 거친 후 단백질 발현에 사용할 수 있게 함으로써, 종래 방법에 의해 제조된 세포 추출액보다 높은 단백질 생산 능력과 일정한 생산성을 나타내게 하면서 세포 추출액의 제조 공정을 단순화하여 제조 비용은 약 60%, 제조 시간은 약 80% 절감하는 효과를 제공하게 한 것이다.

이때, 본 발명에서 배양된 세포는, 세포를 배지에 배양하고 이를 원심분리하여 세포 침전물(pellet)을 수득하고, 상기 세포 침전물을 급속 냉동 보관한 다음 해동(thaw)한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 파쇄 시 세포질이 결빙과 해동을 거치면서 단백질 합성에 필요한 세포 소기관이나 인자들이 세포 외로 배출되는 효율이 우수해지기 때문이다.

본 발명에 사용되는 세포는 대장균, 고초균, 밀배아, 쌀배아, 보리 배아, CHO 세포, 하이브리도마 세포 및 망상적혈구로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

그리고, 본 발명은 상기 아미노산 혼합물과 단백질 합성 에너지원은 상술한 성분에 국한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어느 것을 사용해도 무방하다.

또한, 완충용액은 목적 단백질의 특성에 적합한 성분과 pH로 이루어지는 완충용액을 사용해야 하기 때문에, 반드시 특정 성분의 완충용액으로 한정할 필요는 없다.

그리고, 본 발명에서는 원심분리의 원심력을 상대적원심력(relative centrifugal force, RCF)으로 하여, ×g(gravity)의 단위로 나타내고, 이중 고속원 심분리는 30,000×g 이상의 RCF을, 저속 원심분리는 4,000 ×g을, 그리고, 본 발명의 간단한 원심분리는 12,000×g로 정의한다. 그러나, 본 발명은 파쇄된 세포에서 단백질 합성에 관여하는 세포 소기관과 이의 인자를 분리할 수 있는 최소의 원심력은 12,000×g 임으로, 본 발명에서는 세포 파쇄액을 12,000~30,000×g로 원심분리하는 것이 바람직하다. 이는 30,000×g를 초과하면 제조 비용 증가에 비하여 추출 효율은 큰 차이가 없기 때문이다.

그리고, 본 발명의 세포 추출액에 단백질의 합성을 높이기 위하여 공지된 샤퍼론(chaperone) 단백질, 단백질 분해효소저해제, 핵산 분해효소 저해제 또는 계면활성제 등을 더 첨가하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 세포 추출액을 사용하여 무세포 단백질 합성을 수행하는 것은 첨부한 종래기술의 문헌에 개시된 기술이라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 비록 기재되어 있지는 않더라도 본 발명의 목적에 부합된다면, 어떠한 단백질 합성법이라면 적용하여 사용할 수도 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[실시예] 세포 추출액의 제조

(1) 배양된 세포의 제조

공시재료: 대장균 유래의 BL21 (DE3)[Novagen, Madison, U.S.A]

먼저, 상기 대장균을 3 L 발효조(2x YT 배지)에서 37℃의 온도로 배양하였다. 그리고, 목적 단백질을 인식하는 유전자(DNA)로부터 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 중합효소(polymerase)를 발현시키기 위해서 흡광도(OD 600)가 0.6이 되었을 때, 최종적으로 1 mM의 아소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 발효조에 넣어주고, 흡광도(OD600)가 4.5가 되었을 때, 세포 배양을 중단하고, 원심분리(4,500 RPM, 20분, 4℃)을 통하여 배지로부터 대장균만(cell pellet)을 수집하였다.

이때, 회수된 대장균은 1g당 20 mL의 완충용액 A[10 mM Tris-acetate buffer(pH 8.2), 14 mM magnesium acetate, 60 mM potassium glutamate, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.05% (v/v) 2-mercaptoethanol(2-ME)]를 넣고, 잘 씻어주고(washing), 다시 원심분리(4,500 RPM, 20분)하는 절차를 3회 반복하였다.

이렇게 잘 씻어진 대장균은 영하 80℃의 액화 질소에 보관하였다.

(2) 세포 파쇄액 제조

상기 실시예 (1)의 냉동된 대장균 10g 당 12.7 mL의 완충용액 B (완충용액 A에서 2-ME만 제거)를 넣고 대장균을 균일하게 잘 풀어준 후, 압착기(french press, Amico)를 이용하여 일정한 압력(20,000 psi)하에 세포를 파쇄하였다.

(3) 세포 추출액 제조

상기 실시예 (2)의 세포 파쇄액을 간단한 원심분리(12,000 RCF, 10분, 4℃)로 분리하여 상등액을 수득하고, 이를 전배양용액없이 배양(37℃, 30분)을 통하여 세포 추출액을 만들었다. 그리고 이를 구별하기 편리하도록 S12 추출액(S12 extract)이라 명명하였다.

그리고, 본 발명의 세포 추출액(S12 추출액)은 무세포 단백질 합성을 수행하기 전까지 액체 질소에 보관하였다.

[비교예]

상기 실시예 (1)과 (2)와 동일하게 제조된 세포 파쇄액을 프라트(Pratt)에 의해 고안된 전통적인 방법으로 세포 추출액을 제조하였다.

먼저, 상기 세포 파쇄액(lysate)을 고속 원심분리(30,000 RCF, 30분, 4℃)하여 상등액 위층의 지질층을 제거한 상등액만을 회수한 후, 이 상등액을 다시 고속원심분리(30,000 RCF, 30분, 4℃)하였다. 그런 다음, 두 번 고속원심분리한 상등액 10mL 당 전배양용액(293.3 mM Tris-acetate pH 8.2, 2 mM magnesium acetate, 10.4 mM ATP, 200 mM creatine phosphate, 4.4 mM DTT, 0.04 mM amino acids, 26.7 g/mL creatine kinase) 3 mL을 천천히 넣으면서 잘 섞어주고, 37℃의 암실에서 80분 동안 전처리 배양을 수행하였다. 그리고, 상기 전배양된 용액을 투석 튜브(10 kDa, SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing, Rockford, U.S.A.)에 넣고 50배의 완충용액 B에서 45분 동안 4℃에서 4번 투석을 시켜, 전배양 후의 이물질을 제거한 후, 투석 튜브안의 용액은 저속원심분리(4,000RCF, 10분, 4℃)를 거친 후 비로소 단백질 합성을 위한 세포 추출액을 제조하였다. 이를 S30 추출액(S30 extract)이라 명명하였다.

그리고, S30 추출액은 무세포 단백질 합성을 수행하기 전까지 액체 질소에 보관하였다.

[실험예]

본 실험예는 종래 무세포 단백질 합성법에 대한 본 발명의 세포 추출액의 효과를 확인하고자, 목적하는 단백질의 합성 효과를 비교예와 다양한 실험을 통해 측정하여 비교하였다.

(1) 무세포 단백질 합성법

이때, 무세포 단백질 합성법은 다음과 같이 수행하였다.

먼저, 본 실험에서는 단백질 합성능력을 확인하기 위해서, 목적 단백질로 클로람페니콜 아세틸 전이효소(Chloramphenicol acetyltransferase; CAT)가 암호화된 유전자 (pK7-CAT)를 사용하였다.

그리고, 무세포 단백질 합성을 위하여 표준 반응용액[57 mM Hepes-KOH (pH 8.2), 1.2 mM ATP, 각 0.85 mM CTP, GTP 및 UTP, 2 mM DTT, 0.17 mg/mL E.colitotal tRNA mixture (from strain MRE600), 0.64 mM cAMP, 90 mM potassium glutamate, 80 mM ammonium acetate, 12 mM magnesium acetate, 34 g/mL L-5-formyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolic acid (folinic acid), 각1.5 mM 19 amino acids (0.5 mM leucine을 제외하고), 2% PEG 8000, 67 mM creatine phosphate (CP), 3.2 g/mL creatine kinase (CK), 0.01 M L-[U-14C] leucine (11.3 GBq/mmol, Amersham Biosciences), 6.7 g/mL DNA (pK7-CAT)]에 본 발명의 세포 추출액(S12 추 출액)과 비교 예(S30 추출액)을 각각 27%(v/v)이 되게 첨가하고 균일하게 혼합한 다음, 항온조(37℃)에서 3시간 동안 단백질 합성반응을 수행하였다.

한편, 무세포 단백질 합성법에 의해 생산된 전체 단백질의 양은 방사성동위원소법(Kim and Swartz, 2000)으로 ¹⁴C-류신과 결합된 단백질의 양을 측정하여 확인하였고, 합성된 단백질(CAT)의 효소 활성은 광학적 방법(Shaw, 1975)으로 확인하였다.

(2) 종래 세포 추출액(S30 추출액)을 제조하는 각 단계로부터 수득한 단계별 세포 추출액 시료의 단백질 합성 능력 평가

먼저, 프라트(Pratt)에 의해서 공지된 전통적인 세포 추출액의 여러 복잡한 공정을 간략화하기 위해서, 대장균 유래의 BL21(DE3)로부터 종래의 방법으로 세포 추출액(S30 추출액)을 제조하였다. 이때, S30 추출액을 제조하는 각 단계로부터 추출액의 샘플을 취하여 그 단백질 합성 활성을 테스트하였다.

이의 결과, 도 2에서 도시된 바와 같이, 놀랍게도 세포 추출액 공정상의 각 단계에서 취한 모든 세포 추출액들이 최종적으로 얻어진 세포 추출액과 유사한 수준의 단백질 합성 능력을 가짐을 알 수 있었다. 단, 예외적으로 전반응(pre-incubation) 후 단계의 세포 추출액에서는 현저히 낮은 단백질 생산 능력을 보임을 알 수 있었다. 그러나, 이 역시 투석 단계를 거친 후에 단백질 생산 능력이 다른 샘플들과 유사한 수준으로 회복됨을 확인할 수 있다. 이때, 도 2에서 1은 무처리 세포 파쇄액, 2는 첫번째 원심분리 단계를 거친 후의 상등액, 3은 두번째 원심분리 단계를 거친 후의 상등액, 4는 전배양 용액으로 전배양을 완료한 전배양 세포 추출액, 5는 투석한 세포 추출액 및 6은 투석한 세포 추출액을 저속 원심분리하여 얻은 최종 세포 추출액을 나타낸 것이다.

이의 사실로, 전반응(pre-incubation) 단계를 통해서 축적되는 저분자 물질들이(예: 무기인산 등) 단백질 합성을 저해하며 투석과정을 통해 이들을 제거함으로써 단백질 합성 능력이 회복되었음을 추정할 수 있었다.

또한, 본 실험을 통해 가장 중요한 것은 세포 파쇄액(crude lysate), 즉 전통적인 세포 추출액 방법에서 세포만을 파쇄한 용액도 표준 세포 추출액(S30 extract)과 유사한 단백질 생산 능력을 나타낸다고 하는 놀라운 사실을 발견함으로써, 비용 측면에서 세포 추출액 제조 비용의 대부분을 차지하는 전처리 배양과 투석을 수행하지 않아도 단백질을 충분히 합성할 수 있음을 알 수 있었다.

(3) 본 발명의 세포 파쇄액을 이용한 무세포 단백질 합성

위에서 언급한 바와 같이, 세포 파쇄액을 가지고 단백질을 합성할 수 있다는 것은 시간과 경제적으로 많은 잇점을 가져다 줄 수 있음을 의미한다. 이에, 본 실험예는 무세포 단백질 합성법에 적용하고자, 상기 세포 파쇄액의 단백질 합성에 대한 특성을 확인하고자 하였다.

이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이때, 측정치는 두번 반복하여 실험한 결과의 평균치를 나타낸 것이다.

먼저, 세포 파쇄액을 이용한 무세포 단백질 합성 능력은 표준 세포 추출액(S30 추출액)을 사용한 것과 유사한 결과를 나타내었다.

하지만, 이러한 세포 파쇄액은 상당히 높은 비선택적 단백질 발현(background expression)이 관찰되는 문제점이 밝혀졌다. 즉, 비선택적 단백질 발현율이 표준세포추출액(S30 추출액)에서의 수치인 0.9%보다 월등히 높았으며, 방사성 동위원소법으로 확인한 결과, 전체 목적 단백질 생산량의 3.5%를 차지하였다. 이는 세포파쇄액 내의 유전 물질(mRNA, DNA등)에 의해서 단백질 합성이 이루어지는 것을 말하는 것이기 때문에 당장 무세포 단백질 합성에 적용하는 것이 어렵다는 것을 의미한다.

게다가, 상기 세포 파쇄액은 높은 점성으로 인하여, 액체 조작 장치 (micro-pipeppet)로 쉽게 조작하기가 힘든 문제점을 확인하였다.

그러나, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세포 추출액(S12 추출액)은 세포 파쇄액을 간단히 원심분리 (12,000 RCF, 10min, 4℃)를 통하여 상기 문제점들은 상당 부분이 해소됨을 알 수 있었다. 즉, 조작하기 힘들 정도의 높은 점성 문제는 간단한 원심분리를 통해 완전히 해결되었고, 비선택적 발현도 34% 가량 감소되는 것으로 나타났다. 특히, 간단한 원심분리를 거친 세포 파쇄액의 상등액은 28%의 향상된 단백질 합성능력을 나타낸 것이다. 그리고, 세포 추출액을 이용하여 유전자 (pK7-CAT)을 발현시켜 본 결과, 표준 세포 추출액(S30 extract)을 이용했을 때보다도 1.5배 증가된 생산성을 나타내었다.

그리고, 비선택적 발현 문제를 좀 더 해결하기 위해, 전배양 용액이 없는 상태로 항온조에서 시간을 달리하며 파쇄액의 상등액을 배양시켜 본 결과, 약 30분 정도 배양된 세포 파쇄액의 상등액은 비선택적 발현이 1% 이하로 감소되었고, 단백 질 합성능력도 조금 상승됨을 알 수 있었다.

[표 1]

(4) 세포 종류에 따른 무세포 단백질 합성 효과

본 실험예는 간단히 만들어진 본 발명의 세포 추출액이 다른 대장균 유래의 세포에서도 적용가능한지를 확인하기 위해서 무세포 단백질 합성을 위한 세포 추출액의 재료로 널리 이용되는 공지된 4 종의 세포 (Rosetta(DE3), BL21(DE3), BL21-star(DE3), A19(DE3))를 사용하여, 본 발명에 따른 세포 추출액의 방법과 비교예에 따른 세포 추출액을 제조한 다음 이를 상기 실험예 (1)과 동일한 방법으로 수행하여 무세포단백질합성을 수행하였다. 이때, A19은 대장균 K12(E.coli strain K12) 유래이고, 나머지 세가지는 대장균 B 유래의 세포이다.

이의 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포 추출액(S12 extract)은 목적 단백질(CAT)의 생산량이 종래의 세포 추출액(S30 extract)보다 대부분이 높은 생산성을 나타내었다. 또한 생산량의 측면에서도 보다 일정한 결과를 얻을 수 있었다. 단, 대장균 K12 유래의 A19에서의 결과는 종래 세포 추출액의 단백질 발현량이 약간 높았다. 이때, 도 3에서 불투명 막대는 합성된 CAT의 전체 단백질량을 나타낸 것이고, 투명한 막대는 CAT의 효소 활성도를 나타낸 것이다.

따라서, 본 발명에 따라 제조한 세포 추출액(S12 extract)은 전통적인 방법으로 만들어진 종래 세포 추출액(S30 extract)과 비교하여 선택적 단백질의 합성의 효율을 기준으로 시간과 비용적인 측면에서 매우 우수함을 알 수 있었다. 이를 도 4에 비교하기 편리하도록 그래프로 나타내었다. 이때, 도 4에서 종래 세포 추출액 제조 방법에 의해 소요된 전체 제조비용 72 달러와 제조 시간 8시간을 1로 기준한 다음, 본 발명의 세포 추출액의 제조비용과 제조 시간을 비교하여 나타내었다.

이의 결과, 본 발명의 세포 추출액은 종래의 방법으로 만든 세포 추출액 (S30 extract)기준으로 20% 수준의 비용과 40% 수준의 소요시간으로도 무세포 단백질 합성이 가능함을 알 수 있었으며, 그 단백질 발현 능력은 1.5배나 향상된 결과를 확인할 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 세포 추출액은 종래 방법에 의해 제조된 세포 추출액보다 높은 단백질 생산 능력과 일정한 생산성을 나타내게 하면서 세포 추출액의 제조 공정을 단순화하여 제조 비용은 약 60%, 제조 시간은 약 80% 절감하는 효과를 제공하게 한 것이다.

그리고, 전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항들이 넓게 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

Claims (4)

1. 세포 추출액을 이용한 무세포 단백질 합성 방법에 있어서,

   배지에서 배양한 세포를 파쇄하여 원하는 단백질의 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 파쇄액을 제조하는 단계;

   상기 세포 파쇄물을 12,000~30,000×g로 원심분리하고, 이의 상등액을 수득하여 세포 추출액을 생성하는 단계;

   상기 세포 추출액을 아미노산 혼합물, 단백질 합성 에너지원, 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응배지에 첨가하는 단계;

   를 포함하는 무세포 단백질을 합성하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 세포는 대장균, 고초균, 밀배아, 쌀배아, 보리 배아, CHO 세포, 하이브리도마 세포 및 망상적혈구로 이루어지는 군에서 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질을 합성하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 세포 파쇄액을 12,000×g로 원심분리하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질을 합성하는 방법.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 아미노산 혼합물은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 메치오닌, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스트딘, 아스파레이트, 글루타메이트, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한 종인 L-형 아미노산이고,

   단백질 합성 에너지원은 ATP, CTP, GTP, TTP 및 UTP으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 한 종이며,

   유전자 정보원은 목적 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질을 합성하는 방법.

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