JP2005198651A

JP2005198651A - 無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法及び無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法

Info

Publication number: JP2005198651A
Application number: JP2004366321A
Authority: JP
Inventors: Naoki Doi; 直樹土肥; Shigeo Iwahashi; 茂雄岩橋; Shigeo Morisada; 重男森貞
Original assignee: Molecuence Corp
Current assignee: Molecuence Corp
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2005-07-28

Abstract

【課題】無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を効率よく安全に製造するための胚芽選別方法及び無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法を提供する。
【解決手段】胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から胚芽を選別する無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法、および植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法及び無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法に関し、更に詳しくは、合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を効率よく製造するための胚芽の選別方法及び胚芽抽出物の製造方法に関する。

細胞内でおこなわれているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を生体外で行う方法としては、例えばリボソームを生物体から抽出し、これらを用いて試験管内（無細胞系）でタンパク質を合成する方法（無細胞タンパク質合成系）の研究が盛んに行われている（例えば特許文献１〜５参照）。これらの方法には、リボソームの原料として、大腸菌、植物種子（胚芽）、家兎網状赤血球などが用いられてきた。

植物種子からリボソームを含有する無細胞タンパク質合成に用いる細胞抽出物を得る方法としては、通常、植物種子を粉砕し、篩、重液選別、目視等により種皮、胚乳画分を取り除いて粗胚芽画分を取得し、洗浄により胚乳成分を除去した後、粉砕、抽出、精製する方法が行われている（特許文献６参照）。
このうち、重液選別は、液体中に種子粉砕物（粗胚芽画分）を入れ、比重の違いを利用して種皮や胚乳画分を取り除き、より純化された粗胚芽画分を取得する工程である（非特許文献１参照）。液体としては、通常、四塩化炭素とシクロヘキサンとの混合溶液が用いられているが、特に四塩化炭素等の有機塩素系溶媒は、環境面及び健康面から、使用することは好ましくない。
特開平６−９８７９０号公報特開平６−２２５７８３号公報特開平７−１９４号公報特開平９−２９１号公報特開平７−１４７９９２号公報特開２０００−２３６８９６号公報 A. H. Erickson and G. Blobel,[3] Cell-Free Translation of Messenger RNA in a Wheat Germ System, Method in Enzymology, vol.96, pages 38-50, 1983, Academic Press Inc.

本発明は、工業的に効率よく安全に無細胞タンパク質合成用胚芽を選別する方法及び合成効率の高い無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を効率よく安全に製造する方法の提供を目的としてなされたものである。

本発明者等は、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、従来の四塩化炭素とシクロヘキサンとの混合溶液を用いた重液選別に替えて特定の比重を持つ非塩素系溶液を用いた重液選別を行うことにより、植物種子の粉砕物から胚芽を環境への影響が小さく、安全に取得でき、これにより無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物が効率的に安全に製造可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明によれば、（１）胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から胚芽を選別する無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、（２）植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法が提供される。

これらの発明の好ましい態様により、（３）非塩素系溶液が、比重１．２以上、１．７以下のものである上記（１）又は（２）に記載の方法、（４）非塩素系溶液が、室温において５０ｍｍＨｇ以上の蒸気圧を有するものである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、（５）非塩素系溶液が、比重１．２以上の非塩素系物質と比重が胚芽又は胚乳より小さく、かつ室温において５０ｍｍＨｇ以上の蒸気圧を有する溶媒との混合溶液である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、（６）非塩素系物質が、ハイドロフルオロエーテル系溶媒である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、（７）胚芽の選別が、さらに振動による輸送現象を利用する方法との組み合わせによって行われる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法、（８）胚芽の選別が、さらに胚芽の光学的情報に基づいて選別する方法との組み合わせによって行われる上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法が提供される。

本発明によれば、環境面及び健康面から使用が好ましくない溶媒を使うことなく、効率的に大量の胚芽を選別することができ、また斯くして選別された胚芽を用いて無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物を大量に調製することができる。この胚芽抽出物は、タンパク質の無細胞系での大量調製、たとえば機能解析や構造解析用のタンパク質の調製、進化分子工学分野での新しい酵素や抗体の調製に極めて有用である。

以下、本発明の実施態様の代表例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で用いられる胚芽は、植物種子より取得することができる。用い得る植物種子としては、通常コムギ、オオムギ、イネ等のイネ科の植物から選択される植物の種子が挙げられる。これらの中でも、本発明に好適な植物種子として、コムギ又はオオムギが挙げられ、特に好適なものとしてコムギが挙げられる。

本発明においては、植物種子から無傷の胚芽を主成分とする胚芽画分を取得する。ここで、無傷の胚芽とは、少なくとも発芽能を有する胚芽を意味し、胚芽画分とは、無傷の胚芽を主要成分とするものであり、これを用いて無細胞タンパク質合成に使用し得る細胞抽出物が調製可能なものを意味する。植物種子に含まれる胚芽の量は少なく、種子から胚芽を効率的に取得するためには、胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。

通常は、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いて、乾式で行うことが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよい。例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。

次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。

本発明は、得られた粗胚芽画分を、特定の比重を有する非塩素系溶液を用いた重液選別（比重差選別）に付し、粗胚芽画分からより多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得る点に一つの特徴を有するものである。粗胚芽画分に含まれる胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とは、比重が異なっているため、非塩素系溶液の比重を調整することにより、安全で有機塩素による環境への影響を発生させずに胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別することができる。

本発明において使用することのできる非塩素系溶液は、胚芽の比重より大きく、胚乳の比重より小さい比重に調整された溶液である。この溶液は単独の溶媒であっても良いが、好ましくは比重１．２以上の非塩素系物質に、胚芽又は胚乳の比重より小さい比重の非塩素系溶媒を加えて、胚芽の比重より大きく、胚乳の比重より小さい比重に調製された混合溶液である。非塩素系溶液の比重は、下限が通常１．２、好ましくは１．３程度であり、上限が通常１．７、好ましくは１．５、さらに好ましくは１．４程度である。非塩素系溶液の比重は、これら上限と下限の組み合わせにより規定される範囲に調整して用いられ、通常比重１．２乃至１．７、好ましくは比重１．３乃至１．５の範囲に調整された混合溶液として用いられる。

上記の通り、比重が調整された非塩素系溶液に粗胚芽画分を加え、浮いた胚芽分の多い粒子を、網ですくい取るなどして採取すれば良い。
胚芽や胚乳の比重は、品種や種子の乾燥状態等により微妙に異なるので、先ず、胚乳が浮く程度の比重の溶液を調整し、それに粗胚芽画分を投入し、胚芽又は胚乳の比重より小さい比重の非塩素系溶媒を加えて比重を調整し、胚乳分を沈ませて、浮いている胚芽分の多い粒子を採取してもよい。また、選別に際し、通常より低めの比重に調整すると胚芽の収率は下がるが、純度の高い胚芽が得られる。

通常、非塩素系溶液による比重差選別を行ったあと、低温または常温で速やかに乾燥させる。そのため、比重差選別に用いる非塩素系溶液の室温における蒸気圧は５０ｍｍＨｇ以上であることが望ましい。
本発明で用いられる非塩素系物質としては、比重が１．２以上の非塩素系物質であれば特に制限されないが、例えばハイドロフルオロエーテル系溶媒が好ましく用いられる。ハイドロフルオロエーテル系溶媒としては、例えばPerfluorobutyl methyl ether (C₅H₃F₉O)、Perfluorobutyl ethyl ether (C₆H₅F₉O)、1,1,2,2-Tetrafluoroethyl 2,2,2-trifluoroethyl ether (C₄H₃F₇O)、Bis(2,2,2-trifluoroethyl)ether (C₄H₄F₆O)、1H,1H,3H-Perfluoro-n-butyl difluoromethyl ether (C₅H₄F₈O)、Heptafluoropropyl 1,2,2,2-Tetrafluoroethyl ether (C₅HF₁₁O)、2H-Perfluoroisobutyl methyl ether (C₅H₄F₈O)、2H-Perfluoroisopropyl methyl ether (C₄H₄F₆O)、1H,1H-Perfluoropropyl difluoromethyl ether (C₄H₃F₇O)、2H-Perfluoropropyl ethyl ether (C₅H₆F₆O)、2H-Perfluoropropyl methyl ether (C₄H₄F₆O)、1H,1H-Perfluoropropyl 1,1,2,2-tetrafluoroethyl ether (C₅H₃F₉O)、2H-Tetrafluoroethyl 2,2,2-trifluoroethyl ether (C₄H₃F₇O)、1H,1H,3H-Tetrafluoropropyl difluoromethyl ether (C₄H₄F₆O)等が挙げられる。これらの中で、Perfluorobutyl methyl ether、Perfluorobutyl ethyl ether、1,1,2,2-Tetrafluoroethyl 2,2,2-trifluoroethyl etherを用いるのが特に好ましい。

上記ハイドロフルオロエーテル系溶媒は、いずれも比重１．２以上で、室温における蒸気圧が５０ｍｍＨｇ以上である。また、これらの溶媒は、それ自体既知であり、容易に入手することができる。
これら非塩素系溶媒の比重調整に用いられる胚芽又は胚乳の比重より小さい比重の非塩素系溶媒としては、比重が胚芽又は胚乳より小さく、室温における蒸気圧が５０ｍｍＨｇ以上で、上記非塩素系物質と均一に混合可能な溶媒であれば特に制限されないが、好ましくは、メタノール、エタノール等のアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素類が挙げられる。

以上の非塩素系溶液による比重差選別をより効率的に行い、かつ使用する溶媒の量を節約するために、比重差選別を行う前に本発明者が先に提案した振動による輸送現象を利用した選別（特開２００４−１８８号公報）を行っても良い。
粗胚芽画分に含まれる胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とは、形状、比重、摩擦係数等が異なっているため、振動を与えるとそれぞれ異なった挙動を示す。この挙動の違いを利用して、胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別することができる。

使用することのできる振動による輸送現象を利用する装置は、振動を発生させ、粉粒体に推進力を与える機能を有するものであればよい。例えば、図１に示すように、少なくとも種子粉砕物（胚芽粗画分）を輸送するトラフ及び振動源を有する装置を用いることができる。また、スプリングによりトラフを斜め上下方向に振動させることのできる装置が好ましい。図１は、本発明で使用することのできる装置の一例を模式的に示した図である。図１中、１はトラフ、２は振動源、３はスプリングを示す。

通常、トラフとしては、平底型の直線的トラフを用いることが好ましい。平底型トラフの表面粗さとしては、通常、中央平均粗さが０．１μｍ〜５．０μｍ、また最大粗さが２．０μｍ〜４．０μｍである。
通常、トラフ上に胚芽粗画分を供給し、振動源及びスプリングによりトラフを斜め上下方向に振動させ、トラフ上の胚芽粗画分に対して斜め上方（通常スプリングに対して直角方向）の加速度を繰り返し与えることにより、胚芽粗画分中の胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別する。例えば、０度〜２０度の傾斜をつけたトラフ上に胚芽粗画分を供給し、振動数５０Ｈｚ〜１２０Ｈｚ、振幅０．１ｍｍ〜５．０ｍｍ、振動角２０度〜６０度でトラフを振動させることにより、胚芽粗画分中の胚芽と、種皮、胚乳粉砕物等とを選別することができる。胚芽粗画分は、選別方法に応じて、トラフ中央部付近やトラフ下方部付近に適宜供給することができる。

選別方法としては、例えば、胚芽粗画分をトラフの中央部付近に供給し、トラフの振動により上方へ進むものと下へ落ちるものを分別することにより胚芽を回収する。通常、胚芽はトラフの振動により上方へ進み、胚乳粉砕物等は下へ転がり落ちたりすべり落ちたりする傾向にある。落ちる速度の早いものやトラフ上に残ったもの（通常、種皮、胚乳粉砕物等）をハケなどによって回収してもよい。また、胚芽粗画分をトラフの下部に供給し、前方へ進むもの（通常、胚芽）を回収してもよい。これらの操作は、複数回繰り返してもよい。また、好ましくはトラフ供給前に胚芽粗画分を液体で湿らせた後、乾燥させるとよい。この場合の液体は特に限定されない。これにより種皮付きの胚乳粉砕物の種皮が丸まって転がりやすくなるため、転がり落ちる不純物量が増え、製品中の胚芽純度が上がる。

装置の振動源としては、例えば、ウェイト付きの振動モータ、板バネによる電磁式振動機などを採用することができる。振動による輸送現象を利用する装置としては、例えば一般に振動フィーダーとして知られている装置を用いることができる。

さらに好ましくは、以上の振動による選別を自動的に実施可能とした図２のような選別方式である。図２の選別方式を採用した市販機には原島電機製の振動選別機（ＭＨ−３１０Ｖ）が挙げられる。この方式において、選別対象となる胚芽粗画分は図２に示す振動デックの右後方から振動デック上へ供給され、粒子群は振動による輸送現象により振動デック左方向への推進力を受けるが、同時にデック前後の傾斜のために前方へ転がる。この際、転がり安い粒子は前方へ転がる速度が速いため振動デック前方に達するまでの左方向への移動量が小さく、その結果、振動デック前方の右側へ移動する。逆に転がりにくい粒子は振動デック前方に達するまでの左方向への移動量が大きくなるため、振動デック前方の左側へ移動する。胚芽は胚乳や種皮付きの胚乳と比較して転がりにくい傾向にあるため胚芽の多くが振動デック前方左側へ移動する。従って振動デック前方の適当な位置に仕切板を置くことにより、選別が可能となる。図２の選別方式により効果的な選別をするためには振動デックの表面材質に適切なものを使用する他、胚芽粗画分中の胚芽の多くが振動デック上の右後方と左前方を結ぶ対角線上を移動するように振動デックの振幅や振動デック前後左右の傾斜角度を調節するとよい。

以上のようにして得られたより多くの胚芽を含有する粗胚芽画分は、さらに胚芽含有率の高い胚芽画分を得るために、目視による選別、本発明者等が先に提案した胚芽の光学的情報、例えば胚芽と胚乳の色彩や形状の違い等を光学的情報として検知し、それに基づいて胚芽を選別する方法（ＷＯ０２／０９５３７７号公報）に供しても良い。胚芽の光学的情報に基づく選別は、必ずしも上記比重差選別の後に行う必要はなく、予め光学情報に基づいて選別した胚芽画分を比重差選別に供しても良い。これにより胚芽の純度を更に向上させることができる。

得られた胚芽画分には、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常２０℃以下、好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常２０℃以下、好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％程度の濃度で使用することができる。水又は水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。かくして、胚乳成分が除去された胚芽画分を取得することができる。

以上のようにして得られた胚芽を、微粉砕及び抽出処理することにより胚芽抽出物を得る。胚芽抽出物を得る方法は、従来公知の方法で行うことができる。例えば、液体窒素で凍結した胚芽を微粉砕し、抽出溶媒を加えて攪拌した後、胚芽抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製する。あるいは、本発明者等が先に提案した、胚芽を衝撃または切断により粉砕し、抽出溶媒を加えて撹拌した後、胚芽抽出物を遠心分離により回収し、ゲルろ過により精製する方法（ＷＯ０３／０６４６７１号公報）、胚芽を抽出溶媒の存在下に粉砕した後、ゲルろ過により精製する方法（ＷＯ０３／０６４６７１号公報）等も用いることができる。

抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。

ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。

ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に制限されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばSartorius製のMinisart^TM等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。

上記の通り、胚乳成分が除去された胚芽を原料として、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質を含まない無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を調製することができ、当該抽出物を使用してタンパク質を効率的に合成することができる。ここで、タンパク質合成機能を抑制する物質とは、リボソームに作用してその機能を抑制する物質である。この物質は、例えばトリチン、チオニン、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、タンパク質分解酵素等であり、種子の胚乳に大量に局在することが知られている。

本発明で調製される無細胞タンパク質合成用細胞抽出物は、上記の通り、胚乳部分をほぼ完全に除去した胚芽を使用して得られるものであり、胚乳成分を含まない細胞抽出物である。ここで、胚乳成分を含まない細胞抽出物とは、胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、これはリボソームがトリチンによって実質的に脱アデニン化されないことから確認できる。また、リボソームが実質的に脱アデニン化されないとは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下、より好ましくは０．１％以下、最も好ましくは脱アデニン化率が検出限界以下になっていることをいう。

かくして調製された細胞抽出物を用いて、従来と同様の方法、例えばバッチ法や連続式無細胞タンパク質合成システム(A. S. Spirin et al. (1988), Science, 242, 1162-1164)のようなアミノ酸、エネルギー源の連続供給系でタンパク質を合成することができる。
バッチ法ではタンパク質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸、エネルギー源の連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。

また、連続供給系でタンパク質を合成する場合には、透析法を使用することもできる。例えば、本発明の胚芽抽出物を透析内液に、エネルギー源やアミノ酸を含む混合液を透析外液に用いた限外濾過膜透析系では、タンパク質を連続的に大量調製することが可能である。透析法においては、透析膜を介してエネルギー源やアミノ酸などの合成基質が透析内液に供給され、反応副生物等が透析外液へ排除される。透析膜は、それ自体既知の通常用いられるものを使用することができる。透析膜の分子量限界は、合成するタンパク質の分子量に応じて、適当なものを用いれば良い。

ここで、エネルギー源としては、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
合成されたタンパク質は、それ自体既知の方法により反応系から分離・精製することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。

小麦粗胚芽画分の回収（１）
北海道産のチホク小麦を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製ＲｏｔｏｒＳｐｅｅｄＭｉｌｌｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、風力分級機を用いてふすま（種皮）を選別した。残った胚芽と胚乳を含む混合粒子（胚芽粗画分）を、Perfluorobutyl ethyl ether (C₆H₅F₉O)（３Ｍ社製ＨＦＥ７２００）とエタノールを混合し比重１．３３〜１．３４に調整した混合溶液を８００ｍＬ入れた１リットルのビーカーに入れ、浮いた胚芽分の多い粒子を網ですくい取った。一晩室温で放置乾燥したあと、目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。
その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は２５％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は８０％になった。

小麦粗胚芽画分の回収（２）
北海道産のチホク小麦を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製ＲｏｔｏｒＳｐｅｅｄＭｉｌｌｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、風力分級機を用いてふすま（種皮）を選別した。残った胚芽と胚乳を含む混合粒子（胚芽粗画分）を、振動選別機（原島電機製ＭＨ−３１０Ｖ）を用いて以下のように選別を行った。図２はこの選別方式の概要を模式的に示したものである。

原島電機製振動選別機（ＭＨ−３１０Ｖ）に混合粒子を３００ｇ/ｈｒの割合で供給し、周波数６０Ｈｚ、振幅０．１５ｍｍ、デック表面材質６０メッシュ金網、デック左右傾斜４度、デック前後傾斜１３度の条件で運転した。ここでデック左右とはデックの振動による推進力が発生する方向を指し、デック左右の傾斜は粒子の流れの下流側に当たる左上がりとなっている。デック前後とはデックの振動による推進力が働く方向と直交する方向を指し、選別された粒子の出口となる前方が低くなっている。選別対象となる混合粒子はデックの右後方からデック上へ供給され、粒子群は前方へ転がりながら左へ進むが、転がり安い粒子はデック右側から回収され、転がりにくい粒子は左側から回収される。デック左右に分かれた粒子のうち、デックの左側１０ｃｍ幅から排出される粒子を取り出し、目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。
その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は２５％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は５５％になった。

次いで、回収した粒子を、Perfluorobutyl ethyl ether(C₆H₅F₉O)（３Ｍ社製ＨＦＥ７２００）とエタノールを混合し比重１．３３〜１．３４に調整した混合溶液を８００ｍＬ入れた１リットルのビーカーに入れ、浮いた胚芽分の多い粒子を網ですくい取った。一晩室温で放置乾燥したあと、目視によりその粒子群から胚芽を選別回収し、その重量を測定した。
その結果、供給した粒子の胚芽の重量割合は５５％であったのに対して、回収した粒子の胚芽の重量割合は８０％になった。

小麦胚芽の純化
実施例１と同様の方法で粗胚芽画分を回収し、次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｍ²となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。

まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、ベージュ色のベルトを取り付け、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、濃緑色のベルトに取り替えて胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別し、胚芽を純化した。

小麦胚芽抽出物の調製
実施例３で得られた小麦胚芽５ｇを４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、小麦胚芽抽出物を得た。まず洗浄した小麦胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１０ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後、再び５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕する作業を２回行った。

得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を２回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取した。続いて分画分子量３０，０００の遠心式限外ろ過フィルター（ミリポア社製，ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５）により濃縮し，これを小麦胚芽抽出物とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ260）が２００（Ａ260／Ａ280＝１．５）になるように調製した。

小麦胚芽抽出物を用いたバッチ法による無細胞タンパク質合成
実施例４で得られた小麦胚芽抽出物を２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ260）が２００になるように抽出溶媒で濃度調整し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の合成をEndo, Y. et al., PNAS, January 18,2000/vol.97/no.2/559-564に記載の方法に準じて行った。ＧＦＰ合成量は、ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて、４９０ｎｍの励起波長で５１０ｎｍの蛍光強度から定量した。蛍光光度計の校正はＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓ社製ＳｏｌｉｄＳｔａｎｄａｒｄ，ＧＲ０１０（蛍光強度９８４０）を使用した。３時間の反応後、水で１０倍に希釈した反応液の蛍光強度は１６６５であり、ＧＦＰが合成されていることが確認できた。

透析法による連続式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成
連続式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成をEndo, Y. et al., (1992) J. Biotech., 25, 221-230およびEndo, Y. et al., PNAS, January 18,2000/vol.97/no.2/559-564に記載の方法に準じて行った。
全容量２５％（v/v）のコムギ胚芽抽出液、０．８ｕｎｉｔ／μＬリボヌクレアーゼ阻害剤、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍｇ／ｍＬクレアチンキナーゼ、１．２ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍＭスペルミジン、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ、５００μｇ／ｍＬｍＲＮＡを含有する反応溶液６０μＬをディスポダイアライザー（第一化学薬品株式会社製、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ透析カップＭＷＣＯ１２０００）に入れ、２ｍＬの透析外液（３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍＭスペルミジン、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及び０．１５ｍｇ／ｍＬセフォタキシムナトリウム）に対しての透析系で、反応は２６℃で行った。

以上の方法で得た条件の下に、Green fluorescent Protein（ＧＦＰ）の合成を試みた。ＧＦＰ合成量は、ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓ社製のＴＤ−３６０Ｍｉｎｉ−Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて、４９０ｎｍの励起波長で５１０ｎｍの蛍光強度から定量した。蛍光光度計の校正はＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓ社製ＳｏｌｉｄＳｔａｎｄａｒｄ，ＧＲ０１０（蛍光強度９８４０）を使用した。４８時間の反応後、水で５０倍に希釈した反応液の蛍光強度は２４１７であり、ＧＦＰが合成されていることが確認できた。

振動による輸送現象を利用する胚芽の選別装置の一例を模式的に示した図である。振動選別機を用いた胚芽選別方式の概要を模式的に示した図である。

符号の説明

１トラフ
２振動源
３スプリング
４振動デック
５振動フィーダー
６仕切板
７前後傾斜角
８左右傾斜角

Claims

胚芽及び胚乳粉砕物を含む植物種子粉砕物から胚芽を選別する無細胞タンパク質合成用胚芽の選別方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法。
植物種子の粉砕、胚芽の選別、洗浄、微粉砕及び抽出工程を含む無細胞タンパク質合成用胚芽抽出物の製造方法であって、胚芽の選別を、比重１．２以上の非塩素系物質を含む非塩素系溶液を用いて、比重差により行うことを特徴とする方法。
非塩素系溶液が、比重１．２以上、１．７以下のものである請求項１又は２に記載の方法。
非塩素系溶液が、室温において５０ｍｍＨｇ以上の蒸気圧を有するものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
非塩素系溶液が、比重１．２以上の非塩素系物質と比重が胚芽又は胚乳より小さく、かつ室温において５０ｍｍＨｇ以上の蒸気圧を有する溶媒との混合溶液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
非塩素系物質が、ハイドロフルオロエーテル系溶媒である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
胚芽の選別が、さらに振動による輸送現象を利用する方法との組み合わせによって行われる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
胚芽の選別が、さらに胚芽の光学的情報に基づいて選別する方法との組み合わせによって行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。