CN101522897A - 检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法和鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法,和鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法。
Description
本发明涉及检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法和鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法。
细胞和蛋白质功能、尤其哺乳动物细胞和蛋白质功能的许多方面的分子基础在许多情况下仍然是难以捉摸的,并且需要在蛋白质功能的基于细胞的可视筛选背景中允许开发基因组工具的方法。这对于鉴定在目标细胞生物学系统周围和内部运行的蛋白质网络和鉴定通过化学遗传(Eggert和Mitchison,2006)和类似的高通量筛选方法鉴定的小分子调节剂的靶是有益的。当前在蛋白质功能的基于细胞的高含量筛选中的瓶颈是这些靶的鉴定(Peterson等人,2006)。
此外,在许多情况下,甚至难以可靠和定量地检测细胞中靶蛋白的表达。现有技术中的一些方法已集中在使用核酸阵列,和对于外部试剂或者致病状态对阵列内核酸的表达概况的影响的作用。该方法在许多情况中最多是仅仅定性的。此外,此种核酸阵列实验的输出产生了大量数据,其大部分不适于直接进行进一步的分析。此外,该类型的实验仅仅提供了对核酸表达的了解,并且关于蛋白质表达的任何推论仅仅是间接的。因此,本领域中需要提供检测和/或定量细胞中蛋白质表达的方法,该方法容易进行和分析。
小分子是研究动态生物学过程的具有高的时间分辨率的有价值的工具。小分子也可以促成治疗性药物的发现。通过在纯蛋白质体外测定中筛选化学文库中特定蛋白质活性的改变或者在基于细胞的测定中筛选所希望的表型可以发现药学活性小分子。在过去。通常已经确立了基于细胞的测定来报告对单个途径或过程的活性的作用,通常使用作为在平板读出器中测量的读出的发光或者荧光信号。在细胞成像测定中,使用附着到不同的大分子的荧光标记和自动化的显微术显现细胞视野。此种数据潜在含有与希望的以及意外的表型改变相关的大量信息,并且该方法有时被称作“高含量筛选”。该方法在学术界和工业中发现和表征有用化合物的潜力是高的,但是仍然存在许多挑战,尤其在靶鉴定和数据分析的水平上。
小分子成像筛选通常涉及许多步骤。首先,通常将细胞铺平板在透明底(optical-bottom)的多孔板中,用小分子处理并温育合适的时间段。然后通过小分子荧光探针的某种组合使得目的蛋白发荧光,用抗体使得发免疫荧光,和/或在细胞中表达荧光蛋白(例如,GFP)-标记蛋白。后一方法可以应用于活细胞和固定的细胞。在第二步中,通过自动化显微术捕获荧光图像,于是分析图像以提供对表型改变的度量,鉴定含有所希望的、不希望的或者意外表型的孔。在小分子筛选方法中,最终必须鉴定引起表型改变的生物化学靶。这是具有挑战性的,尤其是如果表型改变由一种以上大分子的扰乱引起的话。
因此,在现有技术中存在提供鉴定小分子调节剂的靶蛋白的改进方法的需要,所述方法容易进行并且适于容易的分析。所以,本发明的目的是提供允许靶鉴定,即鉴定小分子调节剂的大分子靶,而不需要复杂的生物化学测定的方法。此外,本发明的目的是提供作为靶鉴定的全基因组方法的方法,其避免了劳动密集型生物化学方法,如现有技术中存在的那些方法。描述了允许通过鉴定调节小分子调节剂活性的那些基因鉴定小分子调节剂的大分子靶的方法,通过一组潜在靶核酸、优选cDNA的表达,或者它们的表达的抑制来进行所述鉴定。具体地,小分子的分子靶通过它们使小分子表型回转或者加强该表型的能力来鉴定。与现有技术中存在的劳动密集型生物化学方法相反,该方法允许靶鉴定而不需要复杂的生物化学测定,且从而作为靶鉴定的全基因组方法(Peterson等人,2006)。
通过检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法解决了本发明的目的,所述方法包括:
-向载体中导入编码标记蛋白的第一个核酸,
-向所述载体中导入编码要检测和/或定量其表达的所述靶蛋白候选物的第二个核酸,从而使得所述第一个和第二个核酸可操作地连接,从而使得所述标记蛋白的表达指示所述靶蛋白候选物的表达,
-向细胞中导入所述载体,
-检测和/或定量所述标记蛋白的表达,
-将所述标记蛋白的表达与所述靶蛋白候选物的表达联系起来,且由此检测和/或定量所述靶蛋白候选物的表达。
在一个实施方案中,所述第一个和第二个核酸通过下面的排列之一在所述载体内可操作地连接:
a)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下,且所述第二个核酸处于第二个启动子的控制下,所述第二个启动子与所述第一个启动子的位置分开,并且所述第一个和第二个启动子序列相同或者具有相同的活性,
b)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下,且所述第二个核酸处于第二个启动子的控制下,所述第二个启动子与所述第一个启动子的位置分开,并且所述第一个和第二个启动子序列不同,每个所述启动子的活性是可预测的,
c)所述第一个和所述第二个核酸处于单个启动子的控制下,并且所述第一个和所述第二个核酸通过含有内部核糖体进入位点(IRES)的一段核苷酸相互分开。
在一个实施方案中,所述标记蛋白是荧光蛋白、抗体的片段、表位、酶、单体抗生物素蛋白、肽生物素模拟物(mimic)、通过直接结合可被检测的肽或者通过与含有化学荧光团或者类似结构的有机分子化学结合或反应从而使得产生光学上可检测信号而被检测的肽。
在一个实施方案中,所述IRES选自来自病毒的IRES、来自细胞mRNAs的IRES,尤其来自如下病毒的IRES:小RNA病毒,如脊髓灰质炎病毒、EMCV和FMDV,黄病毒属,如丙型肝炎病毒(HCV),瘟病毒属,如经典猪瘟病毒(CSFV),反转录病毒,如鼠白血病病毒(MLV),慢病毒,如猿猴免疫缺陷病毒(SIV),和昆虫RNA病毒,如蟋蟀麻痹病毒(CRPV),和来自细胞mRNA的IRES,所述mRNA如翻译起始因子,如eIF4G,和DAP5,转录因子,如c-Myc,和NF-κB-抑制因子(NRF),生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF),成纤维细胞生长因子2(FGF-2),血小板衍生生长因子B(PDGF-B),同源异形基因,如触角足,存活蛋白,如细胞凋亡的X连锁的抑制剂(XIAP),和Apaf-1,和其他细胞mRNA,如BiP。
在一个实施方案中,
-如果所述第一个和第二个启动子序列相同,那么它们选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-如果所述第一个和第二个启动子具有相同活性,那么它们每个独立地选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-如果所述第一个和第二个启动子序列不同并且所述启动子的活性是可预测的,那么每个所述启动子独立地选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-所述单个启动子选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,并且所述IRES选自包含核酸的组,所述核酸具有选自包含SEQID NO:1-15的组的序列。在优选实施方案中,所述单个启动子是CMV启动子并且所述IRES来自EMCV。在尤其优选的实施方案中,所述启动子是CMV立即早期(IE)启动子(pCMVIE)并且IRES来自EMCV;优选地,所述来自EMCV的IRES是具有选自SEQ ID NO:9、14和15,更优选14和15且最优选14的序列的核酸。
在一个实施方案中,通过转化、转染、电穿孔、病毒转导、转导、冲击(ballistic)递送将所述载体导入所述细胞中。
优选地,通过能够定量测量的任一种光学检测方法,尤其具有空间分辨率的光学检测、显微术、荧光激活细胞分选、UV-Vis光谱测定法、荧光或磷光测量、生物发光测量进行所述检测和/或定量,其中更优选地,所述显微术选自包含下述的组:光学显微术、亮视野显微术、偏振光显微术、荧光显微术,尤其共焦荧光显微术、渐消波激发显微术、荧光相关光谱学、荧光寿命显微术、荧光交叉相关显微术、荧光漂白恢复显微术、行扫描成像、点扫描成像、结构化照明、去褶合显微术、光子计数成像。
在一个实施方案中,所述靶蛋白候选物和所述标记蛋白在所述细胞中作为单独的蛋白表达。
通过鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法也解决了本发明的目的,所述方法包括步骤:
-提供如下类型的第一个细胞,当所述第一个细胞暴露于小分子调节剂时能够产生信号,其中所述信号是可以优选通过显微术在空间上分辨并任选定量的信号,
-将所述第一个细胞暴露于小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第一个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第一种信号,
-提供与所述第一个细胞相同类型的第二个细胞并
-对所述第二个细胞进行根据权利要求1-9任一项的方法,
-在对所述第二个细胞进行根据权利要求1-9任一项的方法期间,将所述载体导入所述第二个细胞后,将所述第二个细胞暴露于所述小分子调节剂,并在空间上分辨且任选定量所述第二个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第二种信号,
-比较所述第一种信号与第二种信号,并且如果所述第一种信号与第二种信号之间存在差异,那么将所述差异归因于所述靶蛋白候选物在所述第二个细胞中的表达,从而将所述靶蛋白候选物鉴定为所述小分子调节剂的靶蛋白。
优选地,所述第一种信号与所述第二种信号是光学信号,其可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量,其中更优选地,所述第一种信号与所述第二种信号是荧光信号。
在一个实施方案中,所述标记蛋白的表达产生第三种信号,其可以在空间上分辨并且与所述第一种和第二种信号不同,其中优选地,所述第三种信号可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量。
在优选实施方案中,所述第三种信号是荧光信号,并且所述第一种和第二种信号是荧光信号,并且所述第三种信号与所述第一种和第二种信号在光谱上不同。
在一个实施方案中,所述第一种信号与所述第二种信号仅可以通过它们各自的量相互区分。
优选地,对于给定的小分子调节剂,用一种以上、优选多种靶蛋白候选物进行本发明的方法,其中,更优选地,对于给定的小分子调节剂,该方法用生物基因组的所有可能的靶蛋白候选物进行。
在一个实施方案中,用一种以上、优选多种小分子调节剂进行本发明的方法。
通过鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法也解决的了本发明的目的,所述方法包括步骤:
-提供如下类型的第一个细胞,当所述细胞暴露于小分子调节剂时能够产生信号,其中所述信号是可以优选通过显微术在空间上分辨并任选定量的信号,
-将所述第一个细胞暴露于小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第一个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第一种信号,在所述小分子调节剂的许多不同浓度下进行该步骤以确定所述小分子调节剂的第一个半最大活性浓度(AC50),其是不存在所述靶蛋白候选物的表达抑制时的半最大活性浓度,
-测定所述第一个半最大活性浓度,
-提供与所述第一个细胞相同类型的第二个细胞并
-向所述第二个细胞导入小抑制性RNA(siRNA),其经选择以便抑制所述第二个细胞中靶蛋白候选物的表达,优选用小抑制性RNA(siRNA)转染所述第二个细胞,所述小抑制性RNA经选择以便抑制所述第二个细胞中靶蛋白候选物的表达,
-将所述第二个细胞暴露于所述小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第二个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第二种信号,在所述小分子调节剂的许多不同浓度下进行该步骤以确定所述小分子调节剂的第二个半最大活性浓度(AC50),其是存在所述靶蛋白候选物的表达抑制时的半最大活性浓度,
-测定所述第二个半最大活性浓度,
-比较所述第一个半最大活性浓度与所述第二个半最大活性浓度,并且如果所述第一个半最大活性浓度与所述第二个半最大活性浓度之间存在差异,那么将所述差异归因于所述靶蛋白候选物表达的抑制,从而将所述靶蛋白候选物鉴定为所述小分子调节剂的靶蛋白。
优选地,所述第一个和第二个半最大活性浓度是半最大抑制浓度(IC50),并且所述小分子调节剂是抑制剂。
在另一实施方案中,所述第一个和第二个半最大活性浓度是半最大增强浓度(EC50)并且所述小分子调节剂是增强剂。
应该注意,如本文所述的术语“半最大活性浓度(AC50)”在一些实施方案中也可以指另一活性比例。例如,它可以指“90%最大活性浓度(AC90)”或者可以用作有差别值的另一百分数值,如60%、70%或80%等(AC60、AC70、AC80等)。再次,在该情况下,该百分数也可以应用于术语“ICX”和“ECX”,其中“x”表示最大活性浓度的前述百分数,并且其中“IC”表示在该情况中小分子调节剂是抑制剂,且“EC”表示小分子调节剂是增强剂。在优选实施方案中,“半最大活性浓度”是具有等于或大于最大值50%的活性的浓度,即,“AC≥50”。
基因沉默是本领域技术人员公知的并且可以通过多种方法实现(在Echeverri & Perrimon Nature,Reviews Genetics 2006中综述)。
优选地,所述第一种信号和所述第二种信号是光学信号,其可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量。
更优选地,所述第一种信号和所述第二种信号是荧光信号。
发明人已经设法设计了允许通过鉴定调节小分子调节剂活性的那些基因鉴定小分子调节剂的大分子靶的方法,通过一组潜在靶cDNA的表达,或者它们的表达的抑制来进行所述鉴定。具体地,小分子的分子靶通过它们使小分子表型回转或者加强该表型的能力来鉴定。与现有技术中存在的劳动密集型生物化学方法相反,该方法允许靶鉴定而不需要复杂的生物化学测定,且从而作为靶鉴定的全基因组方法(Peterson等人,2006)。
具体地,在其中所述第一和所述第二核酸处于单个启动子控制下,且所述第一和所述第二核酸通过含有内部核糖体进入位点(IRES)的一段核苷酸相互分开的实施方案中,本发明人已经设法设计了尤其可用于高含量筛选的系统,因为所述第一核酸的表达水平与所述第二核酸的表达水平匹配。如本文所用的术语“核酸的表达水平”意指对应于所述核酸的mRNA或蛋白质的表达水平。在该“IRES实施方案”中,在来自所述第一和所述第二核酸的每一个的表达和表达水平之间存在1:1关系。与此相反,涉及两种不同启动子的使用的其他方法可以与许多问题相关。例如,可以发生启动子干扰现象,并且两个核酸的可靠的共表达没有保证。因此,此种“双启动子方法”当用于鉴定小分子调节剂的靶蛋白方法中时,尽管被本发明包括,但是与两个核酸处于单个启动子控制下并且通过含有内部核糖体进入位点的一段核苷酸相互分开的方法相比,是较不优选的。在例如双启动子方法中,与表达目的基因的转录单位不同的转录单位上抗性基因的存在不能确保表达目的基因的转录单位将实际上被抗性细胞表达。例如,如果目的基因对细胞增殖具有抑制作用,或者具有细胞毒性作用,那么单独的转录单位上的选择压力不能防止目的基因的反选择,其因此导致仅仅表达抗性基因的抗性克隆。“IRES方法”不具有这些问题的任一种,并且因此,是该具体实施方案的优点之一。
此外,关于涉及siRNA的本发明的另一方面,发明人已经设计了一种方法,其中通过测量靶基因沉默中的半最大活性浓度(AC50)的改变鉴定小分子调节剂的靶蛋白。在高含量筛选或高通量筛选的发明人已知的所有现有技术方法中,没有测量AC50的此种改变,并且如果测量的话,也仅仅测量了单点浓度。如果此种单点浓度测量在高浓度水平下进行,那么这通常导致高的假阳性率,即,此种方法根本不是靶特异的。同样,一些小分子调节剂可以在远高于它们的“正确”AC50浓度下使用,在该情况中,可以观察到毒性作用并且可能检测不到靶。此外,有时候关于此种单浓度测量,有效使用的浓度可能太低,在该情况下不能检测到作用并且因此靶可以逃避它们的鉴定。本发明人已经设计了一种方法,其中通过进行AC50滴定实验,它们组合了AC50的改变与表型的可滴定改变。仅仅正确的靶改变AC50并且因此可以与其他基因区分开,所述其他基因在单点浓度测量中,有可能并且不正确地也表现为靶。所以,通过在使用siRNA鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法中进行AC50测量,本发明人已经设计了尤其可靠的高含量筛选方法。
如本文所用,术语“靶蛋白候选物”意指人们希望检测和/或定量其表达的任何蛋白质。优选地,随后怀疑此种蛋白是小分子化合物作用的靶。术语“小分子化合物”和“小分子调节剂”被同义和可互换地使用。如本文所用的“靶蛋白候选物”被怀疑是小分子调节剂的靶,但是还没有验证此种怀疑。如果将“靶蛋白候选物”鉴定为小分子调节剂的实际靶,那么此种“靶蛋白候选物”是所检查的小分子调节剂的“靶蛋白”。
如本文所用的术语“可操作地连接”意指两个编码核酸相互的排列,从而使得这些核酸编码的各自蛋白质的表达相互为成比例的关系。因此根据一种核酸编码的一种蛋白质的表达的检测和/或定量,人们可以推导出另一核酸编码的第二种蛋白质的表达的存在和/或量。在最简单形式中,此种比例关系可以是线性关系,但是本发明不必局限于线性关系。
如本文所用的“内部核糖体进入位点”或“IRES”意指编码序列内的一段核苷酸,其允许此种编码序列内在mRNA水平上的翻译起始。此种IRES起始的翻译得到的蛋白质与这样的蛋白质不同,前一蛋白质位于后一蛋白质的mRNA序列中。通常,在真核生物中,翻译可以仅在mRNA分子的5’末端起始,因为5’帽识别是起始复合物的装配所需的。当前认为IRES位点模拟5’帽结构。此种IRES序列首先在RNA病毒中发现,但是随后已在许多生物中被鉴定。IRES位点位于RNA的5’非翻译区并且允许RNA以不依赖帽的方式翻译。已经鉴定了许多IRES位点,并且其特征在于它们以不依赖帽的方式起始mRNA内的翻译的前述能力。已经详尽综述了IRES位点((Martinez-Salas等人,Journal of GeneralVirology,2001,Vol.82,973-984,和Jackson,R.J.,Translational Control ofGene Expression,2000,Sonenberg等人Eds.,pp.127-184,Cold SpringHarbor NY。此外,在http://www.iresite.org存在所鉴定的IRES位点的定期更新的数据库。
用于本发明方法中的尤其优选的IRES位点是来自病毒RNA的IRES,如小RNA病毒、黄病毒属、瘟病毒属、反转录病毒、慢病毒和昆虫RNA病毒,和来自细胞mRNA的IRES位点,如来自翻译起始因子、转录因子、生长因子、同源异形基因和存活蛋白。尤其优选的IRES位点是来自小RNA病毒和黄病毒属如EMCV和HCV的IRES位点。用于本发明的优选的IRES位点是来自下述的IRES位点:黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)触角足、同源异形基因触角足和超双胸、人c-myc癌基因、人v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因、人髓磷脂转录因子2(MYT2)人细胞凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)、人柯萨奇病毒B2株20、脑心肌炎病毒(EMCV)、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、猪瘟病毒(经典猪瘟病毒)、和肝炎GB病毒B(GBV-B)。
更具体地,来自EMCV的IRES位点是尤其优选的,其中优选地,所述来自EMCV的IRES是具有选自SEQ ID NO:9、14和15,更优选14和15,且最优选14的序列的核酸。
成为本发明基础的一个想法是编码真核mRNA分子的两个蛋白的两个核酸之间的IRES位点的排列作为双顺反子mRNA。在该情况中,此种IRES位点可以独立于结合到mRNA分子5’端的5’帽结构驱动下游蛋白质编码区的翻译。在该设置中,两种蛋白质都在细胞中产生,并且它们的表达是单一偶联的。位于第一个顺反子中的第一个蛋白质通过依赖于帽的起始方法合成,而第二个蛋白质的翻译起始受到位于两个蛋白质编码区之间的顺反子间间隔区中的IRES位点的指导。
向细胞导入核酸的方法,如转化、转染、电穿孔、病毒转导、转导和/或冲击递送是本领域技术人员已知的并且例如在Sambrook和Russell,2006中综述。
如本文所用的“小分子调节剂”意指不是蛋白质并且分子量不超过10,000的分子。在确定分子是否为“小分子调节剂”的过程中,考虑所称作的Lipinsky规则也是有帮助的。Christopher Lipinsky搜索负药物设计规则,并且制定了5组参数规则以排除由于弱的吸收或渗透而不可能成功的化合物。因此,根据Lipinsky氏规则,如果分子具有如下各项则不可能有效作为小分子药物或调节剂:
1.大于5个氢键供体(通常NH和OH的总和),
2.大于10个氢键受体(通常N和O的总和),
3.分子量(MW)>500,
4.计算的log P>,和
5.弱抑制(<100nM)(Lipinsky等人,1997,experimental andcomputational approaches to estimate solubility and permeability in drugdiscovery and development settings.ADV.Drug Delivery REV.23(1-3)。(P=疏水和亲水环境之间分子的分配系数。然而,偏离这些Lipinsky规则,如本文所用的“小分子调节剂”也具有>500但是不超过10000的分子量。更具体地,然而,如本文所用的“小分子调节剂”也指分子量不超过10,000的寡肽或者寡核苷酸。
如果小分子对蛋白质的活性和/或细胞代谢和/或表型具有作用,那么将此种小分子也在本文称作“调节剂”。在实验上,通常使用应用于化学文库的高通量筛选方法鉴定蛋白质的小分子调节剂。此种文库可以在固相或溶液相中开发并且可以由天然化合物和它们的衍生物或合成分子组成(Hall等人,2001,J.Comb.Chem.,3:125-150)。通常使用组合化学产生化学文库,从而,顺序改变前体化合物的官能团和分子骨架(Burke等人,2003,Science,302:613-618;Schreiber,2000,Science,287:1964-1969)。已经证明高通量筛选是有用的,特别在药物发现、农用化学品和食物研究领域。
通常用于进行本发明方法的方法是显微术。存在许多类型的显微术并且它们是本领域技术人员已知的。术语“显微术”包括但不限于光学显微术、共焦显微术和自动化的显微术筛选方法。显微术的尤其优选的形式是荧光显微术,尤其共焦荧光显微术,光学显微术、荧光寿命显微术、荧光交叉相关显微术和偏振光显微术。显微术受到它的分辨本领的限制,分辨本领由分辨率决定。通常,取决于使用的显微术的具体类型,分辨率界限是300nm-10μm,优选300nm-1μm。在该上下文中,如本文所用的术语“空间分辨信号”意指信号在空间上的分辨率至低至300nm-10μm,优选300nm-1μm的界限,且通常通过Abbé界限限定。在本申请中,有时提及“提供如下类型的第一个细胞,...”和“提供如下类型的第二个细胞,...”。本领域技术人员将清楚的是,在每个这些步骤中,可以提供一个以上的具体类型的细胞,并且所以,根据本发明的方法的性能不限于仅仅使用单个细胞。实际上,根据本发明方法进行的许多实验将在细胞培养物上进行,其中细胞培养物中将存在特定类型的许多细胞。所以,“提供如下类型的第一个细胞,...”和“提供如下类型的第二个细胞,...”也可以用“提供如下类型的第一组细胞,...”和“提供如下类型的第二组细胞,...”代替。
如本文所用,术语“siRNA”意指一段RNA,其可以用于沉默基因表达和/或干扰基因的表达。所以,siRNA有时也被称作“小干扰RNA”。此种siRNA可以以多种方法导入细胞,一种方法是用此种siRNA转染细胞。然而,在另一实施方案中,通过将siRNA首先导入细胞并允许其在细胞中表达从而使得短发夹RNA实际上在细胞内通过合适的载体如质粒表达,可以实现此种基因沉默。
如本文所用的,术语“半最大活性浓度”或“AC50”意指显示出其半最大活性的小分子调节剂浓度。例如,此种小分子调节剂可以是抑制剂,在该情况下活性是抑制。因此,此种小分子抑制剂的半最大活性浓度是“半最大抑制浓度”或“IC50”。如果小分子调节剂是增强剂,则此种半最大活性浓度是“半最大增强浓度”或“EC50”。
应该指出,如本文所用的术语“半最大活性浓度(AC50)”在一些实施方案中也可以指另一活性比例。例如,它可以指“90%最大活性浓度(AC90)”或者可以用作有差别值的另一百分数值,如60%、70%或80%等(AC60、AC70、AC80等)。再次,在该情况下,该百分数也可以应用于术语“ICX”和“ECX”,其中“x”表示最大活性浓度的前述百分数,并且其中“IC”表示在该情况中小分子调节剂是抑制剂,且“EC”表示小分子调节剂是增强剂。在优选实施方案中,“半最大活性浓度”是具有等于或大于最大值的50%活性的浓度,即,“AC≥50”。
本发明人已经发现通过检查蛋白质表达对基于细胞的测定的影响,可能鉴定小分子调节剂的靶蛋白,其中基于细胞的测定是基于细胞暴露于小分子调节剂,作为该暴露的结果,细胞产生信号。依赖于靶蛋白候选物的表达程度(或者表达的不存在)测量此种基于细胞的测定的结果。如果靶蛋白候选物的表达或表达的不存在对基于细胞的测定的结果具有可检测的影响,那么其表达被人工诱导或增加或沉默的靶蛋白候选物是用于基于细胞的测定的小分子调节剂的靶。
在下文参考附图,其中
图1显示了细胞的共焦激光扫描显微术照片,其中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白通过IRES位点可操作地连接,并且它们任一种的表达都可以用作IRES载体中第二个插入片段的表达的度量;小图A(左上角)显示了转染细胞中GFP荧光的共焦图像,小图B(右上角)是相同细胞中RFP荧光的共焦图像,且小图C(左下角)显示了A和B中图像的比例图像,代表GFP:RFP比的任意伪彩色比例尺。每个像素的GFP和RFP强度之间的相关性在小图D(右下角)中显示,其中X轴上的GFP强度对RFP荧光作图。如本文所述,D中强度之间的相关性为0.92+-0.023(n=5)。
图2显示了三种IRES载体向内皮缩血管肽A受体-GFP细胞系(GFP=绿色荧光蛋白)中的转染和表达效果;“etar”是用内皮缩血管肽A受体:IRES:RFP载体(RFP=红色荧光蛋白)转染的稳定细胞系,“etbr”是用内皮缩血管肽B受体:IRES:RFP载体转染的相同细胞系,且“kOPr”是用κ阿片样物质受体:IRES:RFP载体转染的相同细胞系(图2a);
图2B显示了相同类型的实验,但是这次用κ阿片样物质受体:GFP细胞系形成;
图3显示了三种IRES载体的转染结果,每种载体中具有不同的Gα蛋白质组分:Gαs、Gαi和Gαq(Gs、Gi和Gq)。
图4显示了使用IRES方法鉴定靶蛋白;
图4B显示了用带有蛋白激酶c-α或蛋白激酶c-β的IRES:RFP构建体对内皮缩血管肽A-受体-GFP细胞的转染实验结果;
图5显示了高通量免疫荧光测定中NF-κ-B核质转运的定量;
图6显示了平行实验的结果,其中将细胞用特异性siRNA或者非特异性杂乱siRNA转染,并且测量细霉素敏感性NFκ-B转运,
图7显示了用于实施例1中利用红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的实验中的构建体的示意图示,
图8显示了可以用于通过IRES位点连接的两个蛋白质插入片段的双顺反子表达的商业上可利用的载体的实例。例如,可以使用可以从Clontech Laboratories,Inc.,USA商业上得到的商业上可利用的载体pIRES2-DsRed-Express-Vector。或者,如果在IRES上游插入可测量/可检测的蛋白质,如GFP或RFP,那么DsRed-Express-Gene,即红色荧光蛋白可以由任意其他目的基因代替。有商业上可利用的载体,从而其在IRES位点上游和下游具有多克隆位点,如Clontech Laboratories,Inc.,USA的pIRES载体。
图9显示了当机理上相关的备选siRNA在与图6中相同条件下被沉默时,siRNA对细霉素B对NfκB的核输入的IC50的作用。
此外,参考下面的序列,其中SEQ ID NO:1是来自NM_206445黑腹果蝇触角足CG1028-RJ转录变体J(Antp)mRNA的IRES。IRES名称:Antp-D(1323-1574,252bp),如Oh S.K.,Scott M.P.,Sarnow P.(1992)Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5′-noncoding sequences thatconfer translational initiation by internal ribosome binding.Genes.Dev.6(9):1643-1653中引用。
SEQ ID NO:2是IRES,名称Antp-DE(1323-1730,408bp),如Oh S.K.,Scott M.P.,Sarnow P.(1992)Homeotic gene Antennape dia mRNAcontains 5′-noncoding sequences that confer translational initiation byinternal ribosome binding.Genes.Dev.6(9):1643-1653,和Ye X.,Fong P.,Iizuka N.,Choate D.,Cavener D.R.(1997)Ultrabithorax and Antennapedia5′untranslated regions promote developmentally regulated internaltranslation initiation.Mol.Cell.Biol.17(3):1714-1721中引用,
SEQ ID NO:3是IRES,名称:Antp-CDE(1-1730,1730bp),如Oh S.K.,Scott M.P.,Sarnow P.(1992)Homeotic gene Antennape dia mRNAcontains 5′-noncoding sequences that confer translational initiation byinternal ribosome binding.Genes.Dev.6(9):1643-1653,和Ye X.,Fong P.,Iizuka N.,Choate D.,Cavener D.R.(1997)Ultrabithorax and Antennapedia5′untranslated regions promote developmentally regulated internaltranslation initiation.Mol.Cell.Biol.17(3):1714-1721中引用,
SEQ ID NO:4是来自编码c-myc癌基因的V00568人mRNA的IRES。IRES名称:c-myc(1-395,395bp),如Stoneley M.,Paulin F.E.,LeQuesne J.P.,Chappell S.A.,Willis A.E.(1998)C-Myc 5′untranslatedregion contains an internal ribosome entry segment.Oncogene.16(3):423-428中引用,
SEQ ID NO:5是来自NM_005378智人(Homo sapiens)v-myc髓细胞瘤病病毒相关癌基因,成神经细胞瘤来源的(鸟)(MYCN),mRNA的IRES。
IRES名称:N-myc(989-1308,319bp),如Jopling C.L.,Willis A.E.(2001)N-myc translation is initiated via an internal ribosome entry segmentthat displays enhanced activity in neuronal cells.Oncogene.20(21):2664-2670中引用,
SEQ ID NO:6是来自AF006822智人髓磷脂转录因子2(MYT2)mRNA完整cds的IRES,
IRES名称:MYT2_997-1152(997-1152,156bp),如Kim J.G.,Armstrong R.C,Berndt J.A.,Kim N.W.,Hudson L.D.(1998)A secretedDNA-bin ding protein that is translated through an internal ribosome entrysite(IRES)and distributed in a discrete pattern in the central nervoussystem.Mol.Cell.Neurosci.12(3):119-140中引用,
SEQ ID NO:7是来自AF013263智人细胞凋亡蛋白酶活化因子l(Apaf-1)mRNA完整cds的IRES。IRES名称:Apaf-1(345-577,233bp),如Coldwell M.J.,Mitchell S.A.,Stoneley M.,MacFarlane M.,Willis A.E.(2000)Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry.Oncogene.19(7):899-905中引用,
SEQ ID NO:8是来自AY752946人柯萨奇病毒B3株20的完整基因组的IRES。IRES名称:CVB3(1-750,750bp),如Jang G.M.,Leong L.E.,Hoang L.T.,Wang P.H.,Gutman G.A.,Semler B.L.(2004)Structurallydistinct elements mediate internal ribosome entry within the 5′-noncodingregion of a voltage-gated potassium channel mRNA.J.Biol.Chem.279(46):47419-47430,和Jimenez J.,Jang G.M.,Semler B.L.,WatermanM.L.(2005)An internal ribosome entry site mediates translation oflymphoid enhancer factor-1.RNA.11(9):1385-1399中引用,
SEQ ID NO:9是来自NC_001479脑心肌炎病毒完整基因组的IRES。IRES名称:EMCV(257-832,576bp),如Wang Z.,Weaver M.,Magnuson N.S.(2005)Cryptic promoter activity in the DNA sequencecorresponding to the pim-1 5′-UTR.Nucleic Acids Res.33(7):2248-2258中引用,
SEQ ID NO:10是来自NC_003924蟋蟀麻痹病毒完整基因组的IRES。IRES名称:CrPV_5NCR(1-708,708bp),如Wilson J.E.,PowellM.J.,Hoover S.E.,Samow P.(2000)Naturally occurring dicistroniccricket paralysis virus RNA is regulated by two internal ribosome entry sites.Mol.Cell.Biol.20(14):4990-4999中引用,
SEQ ID NO:11来自NC_001461牛病毒性腹泻病毒1完整基因组的IRES。IRES名称:BVDV1_1-385(1-385,385bp),如Chon S.K.,Perez D.R.,Donis R.O.(1998)Genetic analysis of the internal ribosome entrysegment of bovine viral diarrhea virus.Virology.251(2):370-382中引用,
SEQ ID NO:12是来自Z46258猪瘟病毒(经典猪瘟病毒)“中国”株(C-株;EP 0 351 901 B1)编码多蛋白的IRES。IRES名称:CSFV(1-373,373bp),如Rijnbrand R.,Bredenbeek P.J.,Haasnoot P.C,Kieft J.S.,SpaanW.J.,Lemon S.M.(2001)The influence of downstream protein-codingsequence on internal ribosome entry on hepatitis C virus and otherflavivirus RNAs.RNA.7(4):585-597中引用,
SEQ ID NO:13是来自NC 001655肝炎GB病毒B完整基因组的IRES,RES名称:GBV-B(1023-1467,445bp),如Rijnbrand R.,Abell G.,Lemon S.M.(2000)Mutational analysis of the GB virus B internalribbosome entry site.J.Virol.74(2):773-783中引用。
SEQ ID NO:14是来自如用于下面实施例的EMCV的IRES,和
SEQ ID NO:15是来自如ww.iresite.org中公开的EMCV的IRES。
此外,参考下面的实施例,给出这些实施例用于阐明而不是限制本发明。
实施例
实施例1
蛋白质功能的基于细胞的测定和蛋白质表达的定量
激动剂诱导的受体内化
设计和应用蛋白质功能-如激动剂诱导的G蛋白偶联受体内化-的基于细胞的测定,从而使得可以在高含量(视觉)测定中测量或显现并测量蛋白质的希望的活性。通常,对于激动剂诱导的受体内化,这可以包括视觉鉴定作为细胞群体的部分的其中受体被内化的细胞。这可以例如通过计算机辅助图像识别定量。该测定可以是使用与受体的融合蛋白,其可以在细胞中表达并且在显微镜中直接显现,如绿色荧光蛋白(GFP)。它也可以是这样的测定,其中通过间接方法如免疫标记或者使用荧光激动剂显现内源细胞受体。测定细胞系通常是被稳定转染的。在一个实施方案中,使用488nM激发和合适的发射光滤光器显现受体测定。
该概念给出了检查蛋白质表达(靶)对测定的影响的下述方法。靶与转录上相关的报道分子表达,所述报道分子的光谱与用于测定法中的报道分子不同。这样设计从而使得在靶表达和报道分子表达之间接近线性相关。实现其的方法包括使用内部核糖体进入位点、驱动靶和报道分子表达的两个相同活性启动子或者活性可预测的两个启动子。在最简单的情况下,报道分子的表达是测量靶表达的测量/表达尺。这里,本发明人描述了使用内部核糖体进入位点。
如下进行实验:根据标准规程将靶::报道分子构建体瞬时转染到测定细胞中(如阳离子脂质:DNA复合体转染、磷酸钙介导的转染、基于聚合物的转染方法、树状聚体,如Sambrook和Russell,Molecular Cloning第三版,第16章,CSH press,2001所述)。这些方法不是高度有效的并且因此检测到一系列报道分子表达。这提供了在可测量的水平上表达靶的一系列细胞并从而通过在不同水平表达靶的细胞中显现该测定可以测定表达的影响。从而,由于显微术的基于细胞的分辨率,其允许鉴定单个细胞,所以细胞转染的通常的缺点被用作优点。这样,该测定在未被转染的细胞中和在被转染并且表达靶的细胞中在单个实验图像中的一系列浓度下测量。
将绿色荧光蛋白的拷贝插入内部核糖体进入载体,从而使得IRES和红色荧光蛋白(dsRED表达-在下文中称作RFP的单体红色荧光蛋白)处于它的下游(图7)。将HEK293细胞用该载体瞬时转染,其中插入片段的表达受到pCMV启动子的控制(也见图8),然后使用适于单独定量两种荧光团表达的激发(488/532nm)和检测光学器件,通过每个视野大于25个细胞的共焦激光扫描显微术测量绿色和红色荧光蛋白的荧光强度(图1)。在转染细胞的共焦图像中的GFP和RFP强度之间,所测定的相关系数为0.91+-0.023(n=5),从而表明RFP或者GFP表达可以用作IRES载体中其他各自的插入片段的表达的测量。
将一系列cDNA克隆到IRES:RFP载体中,该载体编码a)G蛋白偶联受体,b)小G蛋白或者c)蛋白激酶。用于这些和所有随后实验中的IRES的序列是SEQ ID NO:14,其是来自EMCV的IRES。最初,IRES载体在细胞系中瞬时表达,所述细胞系稳定表达内皮缩血管肽A受体和绿色荧光蛋白的c-末端拷贝之间的融合蛋白。通过监控用IRES载体转染后表达RFP的细胞,向该细胞系的转染效率为细胞的约50%。这些载体包含IRES和RFP 5’的编码内皮缩血管肽B受体、κ阿片样物质受体或者内皮缩血管肽A受体的cDNA。然后测量异源/外部受体的表达对激动剂诱导的内皮缩血管肽A受体的内化的作用。用40nM内皮缩血管肽-1刺激细胞后2小时,使用自动化共焦显微镜使细胞成像。在细胞系中稳定表达的GFP标记的内皮缩血管肽A受体的图像然后可以用于测定已经发生受体胞吞的细胞的分数并用RFP图像确定相同图像中IRES载体转染的细胞中GFP标记的内皮缩血管肽A受体的胞吞作用的程度。
这用单盲手工计数和自动化图像分析,使用商业图像分析包中的定制日志进行(Metamorph offline,Molecular Devices,CA)。将细胞鉴定为对照(非RFP表达者)或表达者(RFP生产者),并基于图像中积分的RFP强度/像素将表达者细胞进一步分为低、中等和高表达者类别。显示受体内化的细胞数目在这四类中自动计数并表示为每个类别中细胞总数的分数。
a)三个IRES载体单独转染到内皮缩血管肽A受体-GFP细胞系:内皮缩血管肽A受体:IRES:RFP,内皮缩血管肽B受体:IRES:RFP,和κ阿片样物质受体:IRES:RFP。当与相同图像中的对照细胞相比时,ETAR:IRES:RFP表达对ETAR-GFP内化具有最小的作用,而内皮缩血管肽B受体和κ阿片样物质受体都显著减小了ETAR-GFP内化作用(图2A)。这表明蛋白质表达本身是筛选途径中涉及的蛋白质的可行方法。
b)为了阐明该方法在整个测定中具有选择性,将其用κ阿片样物质受体-GFP细胞系重复,其中在使用IRES载体表达的任何受体的激动剂诱导的阿片样物质受体内化的测定中没有测定到显著差异(图2B)。
为了进一步确定表达的有用性,构建IRES:RFP载体用于表达异源三聚G蛋白的三种G-α蛋白质组分:Gαs、Gαi和Gαq。在ETAR-GFP细胞系中表达时,与仅表达RFP的对照细胞系相比,两种G蛋白显著降低了内化(Gαs、Gαi),而Gq没有显著作用(图3A)。
这证明该表达分析策略对于受体和小信号传导蛋白发挥功能。
c)将包含插入IRES:RFP的5’的蛋白激酶C同工型,蛋白激酶Cα或者蛋白激酶Cβ的一系列载体转染到内皮缩血管肽A-受体-GFP融合蛋白稳定细胞系中。如图4中所示,当与用在IRES之前不具有5’插入片段并且仅仅表达GFP的IRES:RFP载体转染的细胞比较时,这些蛋白激酶C同工型的表达在内皮缩血管肽A-受体融合蛋白的激动剂诱导的内化中没有引起显著改变。
实施例2
小分子调节剂的靶蛋白的鉴定
本发明人确定IRES方法也可以用于鉴定化合物的靶蛋白。
用标准方法(如Sambrook和Russell,2006中综述),尤其脂转染,使用商业上可利用的方法和规程,如 Fugene6、靶系统targefect和其变型、lipofectamine等等转染细胞。然后将包含转染的细胞和未转染的细胞的细胞暴露于渐增浓度范围的,用激动剂内皮缩血管肽-1刺激细胞。通过半自动化图像分析测定表达RFP的转染细胞群体与它们的对照的未转染邻近细胞相比,每个细胞的内体数目—作为内皮缩血管肽A受体活性的测量。
使用自动化共焦显微术,在的整个实验浓度范围中相同的视野中将蛋白激酶Cα在PKCα:IRES:RFP转染的细胞中的表达的作用和对照的未转染细胞进行比较。通常,首先将细胞暴露于1%血清培养基中某一浓度范围的 120分钟,然后将培养基交换成含有相同浓度但是补加激动剂(10倍激动剂EC50:40nM)的培养基。温育后,用自动化高通量共焦显微镜使细胞成像(如,来自EvotecTechnologies,Hamburg的Opera)。与光谱上单独的RFP表达者细胞的图像一样,获得了限定内皮缩血管肽A-受体-GFP分布的图像。比对每个细胞视野的两色图像以校正光学晕映图像、机械失调(约1-3μm的XY移位;Metamorph Offline,Molecular devices corporation)。将非RFP表达者细胞定义为图像中的对照群体并将RFP表达者细胞分段并基于每个细胞的平均RFP强度分离为低、中等和高(较低20%,中值,较高20%)表达者。
如所预期的,随着浓度的升高,对照细胞中每个细胞的内体数目显著减少(图4B,左边)。在表达PKCα:IRES:RFP的细胞中观察到类似的减少(图4B,左边),从而表明蛋白激酶Cα没有逆转化合物的作用。相反,PKCβ:IRES:RFP转染细胞中蛋白激酶Cβ的表达的作用是不同的。尽管升高浓度减少了对照细胞中内体的数目,但是即使在最高浓度的下,在表达PKCβ:IRES:RFP的细胞中也产生了内体(图4B)。从而,将蛋白激酶Cβ鉴定为该测定中的靶,因为它提供了“功能获得”并且逆转了的表型和作用。
当将每种浓度下的内体数目对对照标准化时,有力地证明了将蛋白激酶Cβ鉴定为的靶(图4C)。如在图4C中清楚的,使用该系统的蛋白激酶Cα表达和分析没有逆转的作用,而是蛋白激酶Cβ表达逆转了表型并且因此是该测定中的靶。
实施例3
使用siRNA鉴定小分子调节剂的靶蛋白
转录因子核因子κB的核转运
除了上述包含作为药物靶的“功能获得”筛选的基因表达的方法,本发明人还证明一种方法,其中用RNA干扰降低蛋白质表达且然后通过给出该测定的50%抑制所需的化合物的AC50/IC50浓度的改变确定这是否是所研究药物的靶。这是“功能失去”筛选。
在核转运作为原理论证(proof of principle)的情况下,使用内源表达的NF-κB复合体的高通量免疫荧光检测测量转录因子核因子κB的转运。简言之,将Hela细胞用PBS洗涤两次,然后用溶于PBS中的4%(w/v)低聚甲醛固定10分钟,然后用PBS洗涤。用0.1%TX-100PBS进行透化作用10分钟,然后将细胞用PBS洗涤并与10%山羊血清-PBS中兔抗NF-κB的1:200稀释物在4℃过夜温育。在定轨旋转器上用PBS洗涤板3次,进行10分钟。在室温下将1:1000Alexa-488山羊抗兔第二抗体与细胞温育60分钟,在定轨摇床上用PBS洗涤细胞3次,进行10分钟,然后在37℃下加入溶于PBS中的5μM DRAQ5(DRAQ5=核染料)保持10分钟。
细霉素B用于阻断核转运并得到2ng/mL或4.4nM的IC50(图5)。通过靶向核输出蛋白1序列的小抑制RNA的转染降低核输出蛋白核输出蛋白1/CRM1的表达,并如上述评估细霉素B对NFκB转运的作用。平行地使用GFP表达者稳定细胞系中GFP的沉默作为水准点,估计使用siRNA的核输出蛋白1/CRM 1击倒为50%(未显示)。与用和人基因没有已知的同源性的杂乱siRNA转染的对照细胞相比,核输出蛋白1/CRM 1击倒细胞中细霉素B的IC50被显著降低-降低至小于1/10(图6)。因此,如从文献预测的(Fornerod等人,1997),将CRM 1/核输出蛋白1鉴定为细霉素B的靶,从而确定该靶鉴定方法是可行的,并且将在全基因组筛选的更大背景中发挥功能。
更具体地,图5显示了通过高通量免疫荧光测定对NF-κB核质转运的定量。(a)在固定并用抗NF-κB和Alexa 488第二抗体检测,且用10μMDraq5进行核染色前,细胞质NF-κB在用0(左图)、1ng/mL(中间的图)或20ng/mL细霉素B处理40分钟的HeLa细胞的细胞核中积累。定标线条20μm。(b)模拟的细胞核定位图像,红色代表代表细胞核,绿色代表NF-κB定位,其中NF-κB的细胞质分布在从左到右的XZ(上面行)和XY(中央行)模拟图像系列中的细胞核上显示形态(morph)。下面行显示了0、1、5、10、20ng/mL细霉素B处理后细胞的标记,绿色NF-κB标记覆盖在从左到右的核染料上。定标线条5μM。(c)模拟图像(上图)和细胞图像(下图)上核输入的定量,(d)微量滴定板中与0-20ng/mL细霉素B温育、NF-κB的检测和细胞核染色后在NF-κB的细胞核定位方面细霉素的EC50测定。细霉素B的拟合的EC50为2.4ng/mL,在1.9到3ng/mL的95%置信区间内,R2为0.9957并且是>5次测定的代表值。在自动化共焦显微镜(confocal)上获得所有图像。
图6显示了通过高通量免疫荧光测定对NF-κB核质转运的定量。将细胞用crml特异性或杂乱siRNAs转染并在24小时后测量细霉素敏感性NFκB转运。LMB曲线用graphpad prism拟合并具有>0.95的R2。在自动化共焦显微镜上获得所有图像。(LMB=细霉素B)。
实施例4
图9显示了当在与实施例3中上述相同的条件下沉默机理上不相关的备选siRNA时,siRNA对细霉素B对NfκB的细胞核输入的IC50的作用。如实施例3中一样,使用高通量免疫荧光检测内源表达的NFκB复合体来测量转录因子核因子κB的转运。简言之,将Hela细胞用PBS洗涤两次,然后用溶于PBS中的4%(w/v)低聚甲醛固定10分钟,然后用PBS洗涤。用0.1%TX-100PBS进行透化10分钟,然后将细胞用PBS洗涤,然后与10%山羊血清-BPS中的兔抗NF-κB的1:200稀释物在4℃过夜温育。在定轨旋转器上用PBS洗涤板3次,进行10分钟。将1:1000的Alexa-488山羊抗兔第二抗体与细胞在室温温育60分钟,在定轨摇床上用PBS洗涤细胞3次,进行10分钟,然后在37℃加入溶于PBS中的5μM DRAQ5(DRAQ5=核染料)保持10分钟。
细霉素B用于阻断核转运,并测量IC50。在沉默实验中,使用杂乱siRNA或者靶向绿色荧光蛋白或蛋白激酶C同工型的siRNA。显示了使用对照杂乱siRNA、绿色荧光蛋白或蛋白激酶C同工型的沉默表达。
图9的数据证明进行该实验实现了特异性。沉默一系列其他cDNAs没有给出表型并且对IC50没有作用。在与实施例3所述相同的沉默条件下进行图9的实验。
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本说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独或以其任意组合对于以多种形式实现本发明是重要的。
序列表
<110>Institut Pasteur Korea
Emans,Neil
<120>检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物的表达的方法和鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法
<130>I30926PCT
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>252
<212>DNA
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400>1
<210>2
<211>408
<212>DNA
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400>2
<210>3
<211>1730
<212>DNA
<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400>3
<210>4
<211>395
<212>DNA
<213>智人(Homo sapieus)
<400>4
<210>5
<211>317
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
<210>6
<211>156
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
<210>7
<211>233
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
<210>8
<211>750
<212>DNA
<213>柯萨奇病毒
<400>8
<210>9
<211>552
<212>DNA
<213>脑心肌炎病毒
<400>9
<210>10
<211>708
<212>DNA
<213>蟋蟀麻痹病毒
<400>10
<210>11
<211>385
<212>DNA
<213>牛病毒性腹泻病毒
<400>11
<210>12
<211>373
<212>DNA
<213>猪瘟病毒
<400>12
<210>13
<211>445
<212>DNA
<213>肝炎GB病毒B
<400>13
<210>14
<211>585
<212>DNA
<213>脑心肌炎病毒
<400>14
<210>15
<211>577
<212>DNA
<213>脑心肌炎病毒
<400>15
Claims (24)
1.检测和/或定量细胞中靶蛋白候选物表达的方法,包括步骤:
-向载体中导入编码标记蛋白的第一个核酸,
-向所述载体中导入编码要检测和/或定量其表达的所述靶蛋白候选物的第二个核酸,从而使得所述第一个和第二个核酸可操作地连接,从而使得所述标记蛋白的表达指示所述靶蛋白候选物的表达,
-向细胞中导入所述载体,
-检测和/或定量所述标记蛋白的表达,
-将所述标记蛋白的表达与所述靶蛋白候选物的表达联系起来,且由此检测和/或定量所述靶蛋白候选物的表达。
2.根据权利要求1的方法,其中所述第一个和第二个核酸通过下面的排列之一在所述载体内可操作地连接:
a)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下,且所述第二个核酸处于第二个启动子的控制下,所述第二个启动子与所述第一个启动子的位置分开,并且所述第一个和第二个启动子序列相同或者具有相同的活性,
b)所述第一个核酸处于第一个启动子的控制下,且所述第二个核酸处于第二个启动子的控制下,所述第二个启动子与所述第一个启动子的位置分开,并且所述第一个和第二个启动子序列不同,且每个所述启动子的活性是可预测的,
c)所述第一个和所述第二个核酸处于单个启动子的控制下,并且所述第一个和所述第二个核酸通过含有内部核糖体进入位点(IRES)的一段核苷酸相互分开。
3.根据前面权利要求任一项的方法,其中所述标记蛋白是荧光蛋白、抗体的片段、表位、酶、抗生物素蛋白、肽生物素模拟物、通过直接结合可被检测的肽或者通过与含有化学荧光团或者类似结构的有机分子化学结合或反应从而使得产生光学上可检测信号而被检测的肽。
4.根据权利要求2-3任一项的方法,其中所述IRES选自来自病毒的IRES、来自细胞mRNAs的IRES,尤其来自如下病毒的IRES:小RNA病毒,如脊髓灰质炎病毒、EMCV和FMDV,黄病毒属,如丙型肝炎病毒(HCV),瘟病毒属,如经典猪瘟病毒(CSFV),反转录病毒,如鼠白血病病毒(MLV),慢病毒,如猿猴免疫缺陷病毒(SIV),和昆虫RNA病毒,如蟋蟀麻痹病毒(CRPV),和来自细胞mRNA的IRES,所述mRNA如翻译起始因子,如eIF4G,和DAP5,转录因子,如c-Myc,和NF-κB-抑制因子(NRF),生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF),成纤维细胞生长因子2(FGF-2),血小板衍生生长因子B(PDGF-B),同源异形基因,如触角足,存活蛋白,如细胞凋亡的X连锁的抑制剂(XIAP),和Apaf-1,和其他细胞mRNA,如BiP。
5.根据权利要求2-4任一项的方法,其中
-如果所述第一个和第二个启动子序列相同,那么它们选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-如果所述第一个和第二个启动子具有相同活性,那么它们每个独立地选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-如果所述第一个和第二个启动子序列不同并且所述启动子的活性是可预测的,那么每个所述启动子独立地选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,
-所述单个启动子选自包含CMV、EF1、SV40、人H1和U6启动子的组,并且所述IRES选自具有选自包含SEQ ID NO:1-15的组的序列的核酸。
6.根据前面权利要求任一项的方法,其中通过转化、转染、电穿孔、病毒转导、转导、冲击递送将所述载体导入所述细胞中。
7.根据前面权利要求任一项的方法,其中通过能够定量测量的任一种光学检测方法,尤其具有空间分辨率的光学检测、显微术、荧光激活细胞分选、UV-Vis光谱测定法、荧光或磷光测量、生物发光测量进行所述检测和/或定量。
8.根据权利要求7的方法,其中所述显微术选自包含下述的组:光学显微术、亮视野显微术、偏振光显微术、荧光显微术,尤其共焦荧光显微术、渐消波激发显微术、荧光相关光谱学、荧光寿命显微术、荧光交叉相关显微术、荧光漂白恢复显微术、行扫描成像、点扫描成像、结构化照明、去褶合显微术、光子计数成像。
9.根据前面权利要求任一项的方法,其中所述靶蛋白候选物和所述标记蛋白在所述细胞中作为单独的蛋白表达。
10.鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法,所述方法包括步骤:
-提供如下类型的第一个细胞,当所述第一个细胞暴露于小分子调节剂时能够产生信号,其中所述信号是可以优选通过显微术在空间上分辨并任选定量的信号,
-将所述第一个细胞暴露于小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第一个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第一种信号,
-提供与所述第一个细胞相同类型的第二个细胞并
-对所述第二个细胞进行根据权利要求1-9任一项的方法,
-在对所述第二个细胞进行根据权利要求1-9任一项的方法期间,将所述载体导入所述第二个细胞后,将所述第二个细胞暴露于所述小分子调节剂,并在空间上分辨且任选定量所述第二个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第二种信号,
-比较所述第一种信号与所述第二种信号,并且如果所述第一种信号与所述第二种信号之间存在差异,那么将所述差异归因于所述靶蛋白候选物在所述第二个细胞中的表达,从而将所述靶蛋白候选物鉴定为所述小分子调节剂的靶蛋白。
11.根据权利要求10的方法,其中所述第一种信号与所述第二种信号是光学信号,其可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量。
12.根据权利要求11的方法,其中所述第一种信号与所述第二种信号是荧光信号。
13.根据权利要求10-12任一项的方法,其中所述标记蛋白的表达产生第三种信号,其可以在空间上分辨并且与所述第一种和第二种信号不同。
14.根据权利要求13的方法,其中所述第三种信号可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量。
15.根据权利要求14的方法,其中所述第三种信号是荧光信号,并且所述第一种和第二种信号是荧光信号,并且所述第三种信号与所述第一种和第二种信号在光谱上不同。
16.根据权利要求11-15任一项的方法,其中所述第一种信号与所述第二种信号仅可以通过它们各自的量相互区分。
17.根据权利要求10-16任一项的方法,其对于给定的小分子调节剂,用一种以上、优选多种靶蛋白候选物进行。
18.根据权利要求17的方法,其对于给定的小分子调节剂,用生物基因组的所有可能的靶蛋白候选物进行。
19.根据权利要求10-18任一项的方法,其用一种以上、优选多种小分子调节剂进行。
20.鉴定小分子调节剂的靶蛋白的方法,所述方法包括步骤:
-提供如下类型的第一个细胞,当所述细胞暴露于小分子调节剂时能够产生信号,其中所述信号是可以优选通过显微术在空间上分辨并任选定量的信号,
-将所述第一个细胞暴露于小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第一个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第一种信号,在所述小分子调节剂的许多不同浓度下进行该步骤以确定所述小分子调节剂的第一个半最大活性浓度(AC50),其是不存在所述靶蛋白候选物的表达抑制时的半最大活性浓度,
-测定所述第一个半最大活性浓度,
-提供与所述第一个细胞相同类型的第二个细胞并
-向所述第二个细胞导入小抑制性RNA(siRNA),其经选择以便抑制所述第二个细胞中靶蛋白候选物的表达,优选用小抑制性RNA(siRNA)转染所述第二个细胞,所述小抑制性RNA经选择以便抑制所述第二个细胞中靶蛋白候选物的表达,
-将所述第二个细胞暴露于所述小分子调节剂,并在空间上分辨和任选定量所述第二个细胞作为应答所述小分子调节剂而产生的第二种信号,在所述小分子调节剂的许多不同浓度下进行该步骤以确定所述小分子调节剂的第二个半最大活性浓度(AC50),其是存在所述靶蛋白候选物的表达抑制时的半最大活性浓度,
-测定所述第二个半最大活性浓度,
-比较所述第一个半最大活性浓度与所述第二个半最大活性浓度,并且如果所述第一个半最大活性浓度与所述第二个半最大活性浓度之间存在差异,那么将所述差异归因于所述靶蛋白候选物表达的抑制,从而将所述靶蛋白候选物鉴定为所述小分子调节剂的靶蛋白。
21.根据权利要求20的方法,其中所述第一个和第二个半最大活性浓度是半最大抑制浓度(IC50),并且所述小分子调节剂是抑制剂。
22.根据权利要求20的方法,其中所述第一个和第二个半最大活性浓度是半最大增强浓度(EC50),并且所述小分子调节剂是增强剂。
23.根据权利要求20-22任一项的方法,其中所述第一种信号与所述第二种信号是光学信号,其可以通过显微术检测、在空间上分辨和任选定量。
24.根据权利要求23的方法,其中所述第一种信号与所述第二种信号是荧光信号。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: PASTEUR INSTITUTE |
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C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20100415 Address after: Gyeonggi Do, South Korea Applicant after: Institut Pasteur Korea Co-applicant after: Institut Pasteur Address before: Gyeonggi Do, South Korea Applicant before: Institut Pasteur Korea |
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C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20090902 |