CN113552106A

CN113552106A - 一种检测ATP、谷胱甘肽、Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器

Info

Publication number: CN113552106A
Application number: CN202110835567.0A
Authority: CN
Inventors: 黄加栋; 朱志学; 王玉; 刘素; 王业茹; 孙文玉; 张曼茹; 江龙; 李静静; 张清心; 徐婉晴
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-07-23
Also published as: CN113552106B

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及检测ATP、GSH、Fpq糖基化酶的通用荧光生物传感器，为了解决以上现有技术中检测方法的特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。设计出一种检测ATP、GSH、Fpq糖基化酶的通用荧光生物传感器，根据目标物的性质，ATP通过结合适配体介导链置换，GSH断裂二硫键，Fpg糖基化酶断裂8oxo‑G，从而介导封闭的sgRNA恢复构象，结合Cas12a蛋白，使其可以非特异性切割单链DNA，产生荧光信号，实现目标物的定量。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点。

Description

一种检测ATP、谷胱甘肽、Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器

技术领域

本发明属于荧光生物传感器技术领域，特别涉及一种检测ATP、谷胱甘肽、Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器。

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）是生物体内一种重要的生物分子，是参与细胞合成必不可少的能量来源，而ATP 的异常表达与多种疾病密切相关，是一种可靠的疾病检测指标。

谷胱甘肽（GSH）是一种哺乳动物体内含量较为丰富的含巯基的三肽类物质，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，其具有抗氧化、清除自由基以及调控重要的细胞内的生理过程的能力。由于GSH是一种重要的抗氧化物质，因此它在体内的含量异常与很多疾病息息相关。

生物体内每天自发产生大量DNA损伤，从而诱发基因突变并具有潜在致癌性。而DNA糖基化酶参与基因损伤的修复过程，在很多癌细胞中，DNA糖基化酶异常表达。

目前，检测ATP的方法有电化学法、表面增强拉曼散射法等，检测谷胱甘肽的方法有比色法、双光子发射法等，检测Fpg糖基化酶的方法有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法等，但这些分析方法都存在耗时、仪器昂贵、操作复杂等缺点，不适合现场检测。因此，开发一种快速、通用且准确检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的方法，对疾病检测具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂、设备昂贵且需专业人员操作的缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、成本低的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，包含ATP block链，GSH block链，Fpgblock链，Apt1，Apt2，Cas12a蛋白，S链，FQ链、sgRNA；

所述的sgRNA序列为SEQ ID No:1；

所述的ATP block序列为SEQ ID No:2；

所述的GSH block序列为SEQ ID No:3；

所述的Fpg block序列为SEQ ID No:4；

所述的Apt1序列为SEQ ID No:5；

所述的Apt2序列为SEQ ID No:6；

所述的S序列为SEQ ID No:7；

所述的FQ序列为SEQ ID No:8；

所述的sgRNA序列为：5’ -UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAUGAUAA CUAAGAAUAUA -3’；

所述的ATP block序列为：5’ -TTCGTACTTAGTAGAAATTA -3’；

所述的GSH block序列为：5’ -TCTACAC/iHS-SH/AGTAGAAA -3’；

所述的Fpg block序列为：5’ -TACACTAATAGAAAT -3’；

所述的Apt1序列为：5’ -ACCTGGGGGAGTACCAAGTACGAA -3’；

所述的Apt2序列为：5’ -TAATTTCTACTGGTGCGGAGGAAGGT -3’；

所述的S序列为：5’ -TATATTCTTAGTTATCATAG -3’；

所述的FQ序列为：5’ -FAM-TTATT-BHQ -3’；

所述的GSH block链的5’端的第七个碱基修饰有二硫键，Fpg block链的5’端的第八个碱基修饰有8oxo-G，FQ链的5’末端与3’末端分别修饰有荧光基团与淬灭基团。

优选地，所述的ATP block与sgRNA的摩尔比为1:1。

优选地，所述的GSH block与sgRNA的摩尔比为1:1。

优选地，所述的Fpg block与sgRNA的摩尔比为1:1。

优选地，所述的Apt1、Apt2、ATP Lock的摩尔比为1:1:1。

上述检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）将sgRNA分别与ATP block，GSH block，Fpg block退火，得到ATP Lock，GSHLock，Fpg Lock；

（2）在ATP block中加入Apt1，Apt2，Cas12a蛋白，S链，FQ链；反应；

（3）在GSH block与Fpg block中加入Cas12a蛋白，S链，FQ链；反应。

上述检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器在检测ATP、GSH、Fpg糖基化酶上的应用。

优选地，所述应用的具体方法为：激发波长为485nm，发射波长为520nm，电压为670V，通过荧光变化检测待测目标物。

本发明一共用到了8条核酸链，其序列（5’-3’）分别是：

sgRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAUGAUAACUAAGAAUAUA

ATP block：TTCGTACTTAGTAGAAATTA

GSH block：TCTACAC/iHS-SH/AGTAGAAA

Fpg block：TACACTAA8oxo-GTAGAAAT

Apt1：ACCTGGGGGAGTACCAAGTACGAA

Apt2：TAATTTCTACTGGTGCGGAGGAAGGT

S：TATATTCTTAGTTATCATAG

FQ：FAM-TTATT-BHQ

其中，ATP block，GSH block，Fpg block链均可与sgRNA中一半碱基杂交，改变其构象使其无法与Cas蛋白结合。

GSH可将GSH Lock中的二硫键断开，从而使完整的GSH block变两条短链，与sgRNA分离，sgRNA构象恢复后可与Cas12a蛋白结合，sgRNA的另一半碱基与S链结合，激活Cas12a蛋白非特异性切割单链DNA的能力，切断FQ链，FQ链中的荧光与猝灭基团分开，荧光基团荧光恢复。我们就是通过该荧光变化达到检测目标物的目的。

类似的，Fpg糖基化酶可将Fpg Lock中的8oxo-G切除，使完整的Fpg block变两条短链，与sgRNA分离，sgRNA构象恢复后可与Cas12a蛋白结合，sgRNA的另一半碱基与S链结合，激活Cas12a蛋白非特异性切割单链DNA的能力，切断FQ链，FQ链中的荧光与猝灭基团分开，荧光基团荧光恢复。

与上述原理不同的是，Apt1与Apt2含有劈开的ATP适配体，结合ATP时使两条链靠近，Apt1与Apt2的靠近同时形成完整的trigger链，可以将ATP Lock中的ATP block通过一段4个碱基的teohold置换下来，恢复sgRNA的构象，sgRNA构象恢复后可与Cas12a蛋白结合，sgRNA的另一半碱基与S链结合，激活Cas12a蛋白非特异性切割单链DNA的能力，切断FQ链，FQ链中的荧光与猝灭基团分开，荧光基团荧光恢复。

本发明基于ATP与适配体结合，GSH切割二硫键，Fpg断裂8oxo-G的性质，通过恢复sgRNA的构象，激活Cas12a蛋白非特异性切割DNA单链的能力，构建了光学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，最重要的是，该发明实现了一种通用性方法对不同目标物的检测，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对快速、准确的定量检测。

1、特异、灵敏检测

利用适配体的特异性识别，及目标物的性质实现了对目标物的高特异性检测；利用sgRNA与Cas12a蛋白的特异性结合，Cas12a蛋白的核酸酶特性以及高切割活性，实现了对目标物的高灵敏检测，提高了检测的灵敏度。

2、反应条件温和、速度快

该传感器的反应条件温和，反应速度快；检测原理的主要过程是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

3、适用于产业化

该方案的制备方法简单，性质稳定，重复性好，适用于样品中的目标物的检测和生物传感器产业化的实际应用。

附图说明

图1为该发明原理示意图；

图2为实施例1传感器检测ATP的工作曲线；

图3为实施例2传感器检测GSH的工作曲线；

图4为实施例3 传感器检测Fpg糖基化酶的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一种本发明所述光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

a.将5 µL sgRNA（50nM），5 µL ATP block（50nM），5 µL 1×TAE于1.5mL离心管中，震荡混匀后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；

b.取5 µL Apt1（100nM），5 µL Apt2 （100nM），5 µL Cas12a蛋白（100nM），5 µL S链（50nM），5 µL 10×Buffer2.1，1 µL FQ链（1µM），4 µL 灭菌水，5 µL ATP（0µM、100nM、200nM、500nM、1µM、2µM、3µM、4µM、5µM、6µM），加入上一步骤所得15µL溶液中；

c.将离心管置于37℃水浴锅中反应90min；

d.将离心管置于65℃水浴锅中10min，终止反应；

e. 激发波长为485nm，发射波长为520nm，电压为670V，通过荧光变化检测待测目标物。

结果见图2，从图2A中可以看出，检测到的荧光信号随着目标物浓度在100 nM- 6µM区间内增大而增大，图2B显示ATP浓度的对数与荧光强度大小呈正比关系，拟合曲线：I=545.606+ 319.245 lgC(nM) （相关系数是0.992，其中C代表了ATP的浓度），同时，我们在100 nM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于84 nM时，ATP浓度的对数与荧光强度大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的荧光强度最低值。因此，可得到该方法检测ATP的下限为84 nM。

实施例2

a.将5 µL sgRNA（50nM），5 µL GSH block（50nM），5 µL 1×TAE于1.5mL离心管中，震荡混匀后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；

b.取5 µL Cas12a蛋白（100nM），5 µL S链（50nM），5 µL 10×Buffer2.1，1 µL FQ链（1µM），14 µL 灭菌水，5 µL GSH（0µM、100nM、200nM、500nM、1µM、2µM、4µM），加入上一步骤所得15µL溶液中；

c.将离心管置于37℃水浴锅中反应90min；

d.将离心管置于65℃水浴锅中10min，终止反应；

结果见图3，从图3A中可以看出，检测到的荧光信号随着目标物浓度在100 nM- 4µM区间内增大而增大，图3B显示GSH浓度的对数与荧光强度大小呈正比关系，拟合曲线：I=362.789+ 228.851 lgC(nM) （相关系数是0.986，其中C代表了GSH的浓度），同时，我们在100 nM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于83 nM时，GSH浓度的对数与荧光强度大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的荧光强度最低值。因此，可得到该方法检测GSH的下限为83 nM。

实施例3

a.将5 µL sgRNA（50nM），5 µL Fpg block（50nM），5 µL 1×TAE于1.5mL离心管中，震荡混匀后放入95℃的水浴锅中保持5 min，后冷却至室温；

b.取5 µL Cas12a蛋白（100nM），5 µL S链（50nM），5 µL 10×Buffer2.1，1 µL FQ链（1µM），14 µL 灭菌水，5 µL Fpg（0µM、50nM、100nM、200nM、500nM、1µM），加入上一步骤所得15µL溶液中；

c.将离心管置于37℃水浴锅中反应90min；

d.将离心管置于65℃水浴锅中10min，终止反应；

结果见图4。从图4A中可以看出，检测到的荧光信号随着目标物浓度在50 nM- 1 µM区间内增大而增大，图4B显示Fpg浓度的对数与荧光强度大小呈正比关系，拟合曲线：I=632.626+ 318.827 lgC(nM) （相关系数是0.995，其中C代表了Fpg的浓度），同时，我们在50nM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于35 nM时，Fpg浓度的对数与荧光强度大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的荧光强度最低值。因此，可得到该方法检测Fpq糖基化酶的下限为35 nM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测ATP、谷胱甘肽、Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga ucuaugauaa cuaagaauau a 41

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

ttcgtactta gtagaaatta 20

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

tctacacagt agaaa 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

tacactaata gaaat 15

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

acctggggga gtaccaagta cgaa 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

taatttctac tggtgcggag gaaggt 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 7

tatattctta gttatcatag 20

<210> 8

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 8

ttatt 5

Claims

1. 一种检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，其特征在于，包含ATP block链，GSH block链，Fpg block链，Apt1，Apt2，Cas12a蛋白，S链，FQ链、sgRNA；

所述的sgRNA序列为SEQ ID No:1；

所述的ATP block序列为SEQ ID No:2；

所述的GSH block序列为SEQ ID No:3；

所述的Fpg block序列为SEQ ID No:4；

所述的Apt1序列为SEQ ID No:5；

所述的Apt2序列为SEQ ID No:6；

所述的S序列为SEQ ID No:7；

所述的FQ序列为SEQ ID No:8；

所述的GSH block链的中间修饰有二硫键，Fpg block链的5’端的第八个碱基修饰有8oxo-G，FQ链的5’末端与3’末端分别修饰有荧光基团与淬灭基团。

2. 根据权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，其特征在于，所述的ATP block与sgRNA的摩尔比为1:1。

3. 根据权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，其特征在于，所述的GSH block与sgRNA的摩尔比为1:1。

4. 根据权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，其特征在于，所述的Fpg block与sgRNA的摩尔比为1:1。

5. 根据权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器，其特征在于，所述的Apt1、Apt2、ATP Lock的摩尔比为1:1:1。

6.权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将sgRNA分别与ATP block，GSH block，Fpg block退火，得到ATP Lock，GSH Lock，Fpg Lock；

（3）在GSH block与Fpg block中加入Cas12a蛋白，S链，FQ链；反应。

7.权利要求1所述的检测ATP、谷胱甘肽及Fpg糖基化酶的通用荧光生物传感器在检测ATP、GSH、Fpg糖基化酶上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：激发波长为485nm，发射波长为520nm，电压为670V，通过荧光变化检测待测目标物。