CN112986551A - 一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒 - Google Patents

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CN112986551A CN202011434928.2A CN202011434928A CN112986551A CN 112986551 A CN112986551 A CN 112986551A CN 202011434928 A CN202011434928 A CN 202011434928A CN 112986551 A CN112986551 A CN 112986551A
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Abstract

一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒。本发明涉及一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并持续至少第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间有特异结合活性；向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A之间具有特异结合活性而与所述目标分子X不具有任何结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0；将体系混匀并等待至少第二给定时间后检测所述系统的荧光强度L；在理想浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0‑L值建立线性关系；以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0‑L推算出目标分子X的浓度。本发明还涉及与上述方法搭配的试剂盒。

Description

一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒。
背景技术
物质浓度的检测在化工，生物医药，医学等领域应用广泛。20世纪90 年代新兴并发展的有关核酸适配体的研究更加促使了这一领域的发展。核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台，并在许多方面展示了良好的应用前景。
传统的用核酸适配体对目标分子浓度的检测方法大多需要牵涉到G4 联体显色，荧光能量共振转移，复杂的引物探针设计以及较为繁琐的实验过程。这就导致各个检测方法无法在时间，成本，特异性，灵敏度，简单性上达到很好的统一。
Cas12a蛋白与crRNA复合物可以对某一特定序列的DNA单链进行识别并结合，之后展现出惊人的反式切割活性(trans-cleavage)。因此Cas12a 结合体系中的单链DNA荧光报告分子被用于对DNA检测的研究中。近期，张立新和谭高翼团队开发了“猫鼻子”方法，利用小分子别构蛋白在特定小分子存在时释放出DNA的特点，结合Cas12a进行目标分子的检测。但是该方法只能对拥有对应别构蛋白的小分子进行检测，局限性很大。
发明内容
因此，本申请开发了一种针对目标分子的结合适配体和CRISPR技术的检测方法，其命名为Molecular radar(random Molecular aptamer-dependent CRISPR-assist reporter)。该方法可在0.5h之内对任意小分子进行定量检测。
本申请的技术方案提供了：
1.一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：
向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并等待至少第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间有特异结合活性；
向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A 之间具有特异结合活性而与所述目标分子X不具有任何结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0；
将体系混匀并等待至少第二给定时间后检测所述系统的荧光强度L；
在理想浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0-L值建立线性关系；
以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0-L推算出目标分子X的浓度。
2.根据项1所述的方法，其中，所述目标分子X是任意的适合筛选核酸适配体的分子。
3.根据项2所述的方法，其中，所述报告分子A是ssDNA，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光-淬灭探针 ssDNA。
4.根据项3所述的方法，其中，所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。
5.根据项4所述的方法，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体 ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.1(5’-3’):
ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO.2(5’-3’):
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA。
6.根据项4所述的方法，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3：1至1.05:1。
7.根据项4所述的方法，其中，所述荧光-淬灭探针ssDNA的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。
8.根据项1所述的方法，其中，为进行所述荧光强度测定使用荧光分析仪。
9.根据项4所述的方法，其中，所述理想浓度范围为25μM到0.5mM。
10.根据项4所述的方法，其中所述第一给定时间为15分钟。
11.根据项4所述的方法，其中所述第二给定时间为10分钟。
12.一种用于测定目标分子X的浓度的试剂盒，其至少包括报告分子A 和竞争分子B，其中所述报告分子A能够与所述目标分子X特异性结合，而所述竞争分子B能够与所述报告分子A特异性结合并且不与所述目标分子X发生任何方式的结合；当不存在所述目标分子X时，所述竞争分子B 与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0。
13.根据项12所述的试剂盒，其中，所述目标分子X是任意的适合筛选核酸适配体的分子。
14.根据项13所述的试剂盒，其中，所述报告分子A是ssDNA，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光-淬灭探针ssDNA。
15.根据项14所述的试剂盒，其中，所述竞争分子B是Crispr-Cas12a/ crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。16.根据项15所述的试剂盒，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2。
17.根据项15所述的试剂盒，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3：1至1.05:1。
18.根据项15所述的试剂盒，其中，所述荧光-淬灭探针ssDNA在使用时的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。
本申请的技术方案取得的有益技术效果：
本申请的技术方案相较于其他检测技术的优点在于，有潜力针对各种类型的分子筛选出合适的核酸适配体从而建立检测方法来替代传统方法，同时操作简单、耗时极短(可以在10-30min内获得结果)且可以定量。
附图说明
图1为Cas12a介导的小分子检测的原理示意图；
图2a和图2b为可行性验证示意图；其中图2a显示了阳性对照组加入ATP后可以使得荧光信号下降；而图2b显示了信号下降不是由于ATP 对于蛋白的活性影响造成的；
图3a和图3b为不同的缓冲液对Cas12a反式切割活性的影响；
图4a和图4b为不同浓度Cas12a/crRNA复合物时荧光随时间增长曲线；其中图4a为阳性对照；图4b为5mM ATP；
图5为Cas12a:crRNA添加比例优化；
图6a—6d为不同浓度DNA激活子时Cas12a拥有不同的反式切割活性。其中图6a：不同浓度ssDNA(无PAM序列)(ATP适配体)荧光值随时间变化曲线；图6b：6a图中30min时刻荧光值绘制的柱状图；图 6c：不同浓度ssDNA(带有PAM序列)在30min时刻荧光值绘制的柱状图；图6d：不同浓度dsDNA(带有PAM序列)在30min时刻荧光值绘制的柱状图；
图7a和图7b为不同F-Q probe浓度对于反式切割的影响。其中图7a：前40min的荧光值-时间曲线。图7b：第90min所有曲线均达到平台期的荧光值。
图8a为不同ATP浓度下荧光的动力学；图8b为通过监测抑制现象对 ATP浓度的量化；图8c为对1mM核苷的特异性；其中ATP:三磷酸腺苷； TTP：三磷酸胸苷；CTP:三磷酸胞苷；GTP:三磷酸鸟苷；UTP:三磷酸尿苷。
具体实施方式
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本申请在第一方面涉及混合体系中低浓度目标分子的检测方法。
在一个具体实施方式中，提供了一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并持续至少第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间有特异结合活性；
向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A 之间具有特异结合活性而与所述目标分子X不具有任何结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0；
将体系混匀并等待至少第二给定时间后检测所述系统的荧光强度L；
在理想浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0-L值建立线性关系；
以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0-L推算出目标分子X的浓度。
在本说明书的上下文中，“反应系统”应当作广义理解，它可以是化学反应的产物溶液、生物反应的产物溶液、细胞培养液、发酵液、取自患者或试验动物的血样等。
在一个具体实施方式中，所述目标分子X是任意的适合筛选核酸适配体的分子。
在本说明书的上下文中，“目标分子X”涵盖了各种分子量的分子，以这些分子作为靶标可以从特定的寡核苷酸库中筛选出适配体，目标分子例如可以为诸如ATP目标分子，也可以为诸如流感病毒、大肠杆菌、沙门菌的表面蛋白的大分子。
在又一具体实施方式中，所述报告分子A是ssDNA，所述报告分子 ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体 ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光-淬灭探针 ssDNA。而所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。
在再一具体实施方式中，所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。
在本说明书的上下文中，“竞争分子B”可以是Cas12a蛋白与crRNA 的复合物。其中CRISPR-Cas是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein(成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白)的缩写；而crRNA是CRISPR RNA的缩写。Cas12a是这个蛋白家族中一个特定蛋白的名字。在此，crRNA的作用是特异性地识别核苷酸底物并与之杂交结合；而Cas12a作用是在crRNA识别并与核苷酸底物杂交结合后对该核苷酸底物进行切割以及游离在周围的ssDNA底物进行切割。
在本说明书的上下文中，“报告分子A”的化学本质是ssDNA，“ssDNA”是单链DNA的英文缩写。在一些具体的实施方式中，ssDNA报告分子由两个独立的部分构成：“适配体(aptamer)ssDNA”和“荧光-淬灭探针(F-Q probe)ssDNA”。其中适配体ssDNA因具有特定序列可以与目标分子特异性结合(该结合属于物理结合，结合力基本上由氢键，分子间作用力，π- π堆积力组成)，也可以与竞争分子B(Cas12a蛋白与crRNA的复合物) 特异性结合从而激发Cas12a蛋白的切割活性。其中荧光-淬灭探针ssDNA 则是固定序列，其一端标记为FAM荧光基团，另一端标记为BHQ淬灭基团，核酸序列为5’-FAM-TTTTT-BHQ-3’在本说明书中其可以称为荧光探针 (F-Q probe,即Fluorophore-Quencher probe的英文缩写)；该荧光-淬灭探针ssDNA游离在体系中，天然状态下FAM与BHQ基团距离较近，荧光被淬灭，无荧光信号；而当荧光探针被Cas12a蛋白的反式切割活性切断，FAM 荧光基团和BHQ淬灭基团分开，整个体系呈现荧光信号。需要注意，当 Crispr-Cas12a被激发出反式切割活性时，会无差别地切割周围所有的 ssDNA，自然也包括荧光-淬灭探针ssDNA。因此，对于竞争分子B(Crispr-Cas12a蛋白与crRNA的复合物)，适配体ssDNA起到了“激活底物”的作用，而荧光-淬灭探针ssDNA起到了“反应底物”的作用。
在再一具体实施方式中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA 的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.1(5’-3’):ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO.2(5’-3’):
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA。
在一个具体实施方式中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体 ssDNA在使用时的比例为3：1至1.05:1。具体地，该比例可以为3:1、2.8:1、 2.6:1、2.4:1、2.2:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.45:1、1.4:1、 1.35:1、1.3:1、1.25:1、1.2:1、1.15:1、1.1:1、1.05:1。
在又一具体实施方式中，所述荧光-淬灭探针ssDNA的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。这里描述的“过量”例如可以理解为：所述荧光-淬灭探针ssDNA的浓度为所述核酸适配体ssDNA的浓度的至少15倍，具体地，可以为15倍、20倍、25倍、30 倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
在一个具体实施方式中，对荧光强度的测定使用的是荧光分析仪。
在又一具体实施方式中，所述理想浓度范围为25μM到0.5mM。
在再一具体实施方式中，所述第一给定时间为15分钟；而所述第二给定时间为10分钟。
本申请在第二方面涉及一种针对目标分子X的检测试剂盒。
在一个具体实施方式中，提供了一种配合上述荧光分析仪使用的针对目标分子X的检测试剂盒，其至少包括上述报告分子A和竞争分子B，其中所述报告分子A能够与所述目标分子X特异性结合，而所述竞争分子B 能够与所述报告分子A特异性结合并且不与所述目标分子X发生任何方式的结合；当不存在所述目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A 结合时发出给定强度的荧光强度L0。
在又一具体实施方式中，提供了一种检测试剂盒，其中，该试剂盒还包括混合及检测用一次性容器和说明书，所述说明书记载了有关上述试剂盒使用的相关信息。
最优地，本申请所涉及的方法可以设计为：在反应体系中包含针对ATP (目标分子X的具体实施方式)的适配体ssDNA以及荧光-淬灭探针ssDNA (报告分子A的具体实施方式)、Cas12a蛋白以及可以特异性识别前述适配体并互补配对的crRNA(竞争分子B的具体实施方式)和反应缓冲液。申请人将crRNA设计为可以与ssDNA适配体互补的序列，当反应体系中没有目标分子存在时，ssDNA适配体作为激活子将会和Cas12a/crRNA复合物结合形成适配体/Cas12a/crRNA三体复合物，此时Cas12a被激活，展现出反式切割(trans-cleavage)活性，把周围所有的ssDNA水解(包括荧光- 淬灭探针ssDNA)。此时，荧光-淬灭探针ssDNA成为Cas12a的反式切割的底物，它被水解后，它的荧光基团和淬灭基团分离，荧光基团发出的光不再被淬灭，整个体系可以读到荧光值，将这时的荧光值作为阳性对照组。而当反应体系中存在目标分子时，特异性的适配体将会与目标分子高亲和性和强特异性地结合，此时和Cas12a/crRNA复合物结合形成的适配体 /Cas12a/crRNA三体复合物减少，导致被激活的Cas12a数量减少，单位时间内利用反式切割活性水解的F-Q probe减少，最终使得单位时间内荧光强度下降。本反应系统的工作原理可见于图1。
<实施例部分>
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1可行性验证实验
为了验证该方法的可行性，我们选择了ATP的适配体序列(SEQ ID NO.1)，并根据此序列，结合Cas12a核酸酶及其crRNA的特点和性质，设计了crRNA-ATP的序列(SEQ IDNO.2)。阳性对照(PC,带圆点的曲线)通过形成Cas12a-crRNA-适配体复合物，Cas12a被激活，利用反式活性切割F-Q probe，获得较高的荧光值；而另一组通过添加ATP目标分子作为实验组(带方框的曲线)，由于适配体可以和ATP特异性结合，导致用于激发的有效适配体减少，荧光值下降(见图2a)。
考虑到加入了ATP后信号下降，还有可能是这种目标分子在反应体系中对蛋白的活性造成了影响，从而降低了荧光信号，并不是竞争适配体起到的抑制作用。因此设计了另一条crRNA-EGFR，可以特异性识别EGFR 基因。在此，crRNA-EGFR序列为SEQ ID NO.3(5’-3’):UAAUUUCUACU AAGUGUAGAUUCUUCCGCACCCAGCAGUUU，而EGFR基因和crRNA- EGFR均不与ATP结合。用在EGFR基因激活Cas12a蛋白/crRNA复合物的体系中作为对照组，分别添加ATP和汞离子(见图2b)，可以看出添加 ATP后荧光值未发生明显下降，ATP不会对Cas12a蛋白的活性有非特异性的抑制，但是相比之下，汞离子会严重影响Cas12a蛋白活性。排除了ATP对蛋白活性的影响，验证了实验的可行性。
所设计的实验条件
典型的反应体系：
Figure RE-GDA0003041301510000081
Figure RE-GDA0003041301510000091
注：下述所有的PC组是将上述表格中ATP替换为等体积的水。NC组是将上述的ATP和适配体替换为等体积的水。
操作步骤：
1.取1.5ml避光离心管，记为管A，加入ATP目标分子和适配体提前孵育20min，开始20min倒计时。
2.倒计时至15min时，取另一个1.5ml离心管，记为管B，cas12a与crRNA 提前混合孵育。
3.倒计时至3min时，向管A中依次加入H20，cutsmart缓冲液，F-Q probe。
4.倒计时为0min时，将管B溶液与管A溶液混合，轻微震荡并离心。
5.分装至黑色96孔板中，放入酶标仪读取荧光值。
酶标仪程序：
保持温度37℃，隔30s测一次荧光值。激发波长492nm，发射波长 518nm。
数据处理：
在本研究中，理想的情况是荧光值随着时间线性增长直到F-Q probe被完全切割，荧光值达到最大值，保持在平台期不在增长。用graphpadprism 7 绘图软件处理数据并绘制荧光值随时间变化图像。计算敏感度时，未达到平台期且近似于线性增长的数据被视为有效数据，定义一个参数抑制率％ (Inhibition Rate(％)，IR(％))，用来表示目标分子对于阳性对照的抑制程度。
公式如下
IR1(％)＝(A-B)/(A-C)×100
IR2(％)＝(A-B)/A×100
IR(％)＝MeanofIR1(％)andIR2(％)
A:未添加ATP的反应体系荧光强度，PC组
B:添加了ATP的反应体系荧光强度，实验组
C:背景荧光强度，NC组
IR1和IR2的区别是计算抑制率时是否考虑NC组的影响，我们认为两者都不是最完美的选择。这两种统计方法，对于荧光值-时间曲线中可回归为直线的数据而言，在零时刻点，IR1和IR2数值会一个极大一个极小，但是随着时间的增长趋于同一个中间定值，其两者的曲线分布成轴对称。因此定义IR用来表示二者的均值最为合理。
实施例2.反应体系的优化实验
1反应缓冲体系的优化：
Cas12a是核酸酶，其切割活性表现一定会受到周围环境的影响。之前的报道中，也有人使用过NEB缓冲液2.1，NEB缓冲液3.1，NEB缓冲液4，NEB cutsmart缓冲液或者自己配置的缓冲液。因此我们研究了不同成分的缓冲液对于Cas12a切割活性的影响(见图3a和图3b)。可以看出影响Cas12a裂解活性的重要因素是测试溶液中的二价阳离子Mg2+浓度。因为Cas12a RuvC结构域通过双金属离子机制裂解ssDNA，Mg2+离子通过改变 ssDNA在RuvC活性切割中心周围的空间分布来诱导RuvC结构域和ssDNA 的构象配位。这一结果与之前报道一致。但是当Mg2+浓度一定时，不同的缓冲液也表现出不同的切割活性，这可能是由于盐浓度造成的影响，这与核酸酶的特性一致。
CutSmart缓冲液的成分为：50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,100μg/mlBSA(pH 7.9@25℃)；
NE缓冲液3.1：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μ g/mlBSA(pH 7.9@25℃)；
缓冲液A：50mM KAc,20mM Tris-Ac,1mM Mg(Ac)2,100μg/mlBSA (pH 7.9@25℃)。
2.蛋白和RNA浓度优化：
Cas12a/crRNA复合物的浓度直接决定了反式切割活性位点的数量，也决定了体系中荧光信号的增长速度。我们使用浓度比Cas12a:crRNA＝1:1，对于Cas12a/crRNA复合物的浓度作了优化(见图4a和图4b)。可以看出当Cas12a/crRNA复合物浓度高于5nM时，反应速度很快，此时PC组只能观测到平台期的数据，不利于数据处理；而当Cas12a/crRNA复合物浓度低于5nM时，添加目标分子的实验组荧光值极低，造成和NC组区别的困难。因此综合考虑，选用Cas12a/crRNA复合物的浓度为5nM进行后续实验。相比此前报道，DETECTR方法添加50nM的Cas12a，HOLMES方法添加250 nM的Cas12a，本研究使用的浓度大大减少了试剂的使用了，极大地节约了成本。图4a和图4b中不同Cas12a/crRNA复合物是NC组荧光值一致，在图中统一用NC表示。
3.蛋白和RNA浓度比例优化：
为了保证Cas12a有效的发挥反式切割的能力，需要保证其有效的生成 Cas12a/crRNA复合物。在已报道的研究中，DETECTR方法中，Cas12a： RNA＝1:1.25，HOLMES方法Cas12a：RNA＝1:2，可见对于不同的反应体系有不同的Cas12a-RNA浓度比例。因此我们对不同Cas12a-RNA浓度比进行了优化(见图5)。可以看出在本研究的体系中，不同的添加比例没有明显区别，为了节约成本，选择Cas12a：RNA＝1:1进行后续实验。
4.适配体添加量的优化：
在PC组中添加的适配体实质上是一条ssDNA激活子，体系中的ATP 和适配体特异性的结合导致荧光下降。因此适配体的添加量对PC的荧光值和ATP检测的灵敏度均有很大的影响。因此我们对不同浓度的适配体进行了优化。(见图6a、6b)有趣的是，PC组荧光值并没有随着适配体的浓度增加而一直增加，而是呈现出钟形曲线。在峰值的左侧，当适配体浓度较低时，随着适配体浓度增大，同样时间释放的荧光值增加，说明被激活的 Cas12a随着适配体浓度增大而增加。但是当适配体浓度过高时，同样时间内的荧光信号反而下降，说明被激发的Cas12a数量下降。这是在Cas12a 上首次报道这个现象，之前并没有文献对其进行过报道。猜测可能是由于 Cas12a发挥作用时，需要形成Cas12a-crRNA-DNA形成三体复合物，而当适配体浓度过高时，由于空间位阻效应，降低了三者有效碰撞的几率，从而降低了被有效激活的Cas12a数量。在本反应中Cas12a主要体现为反式切割活性，F-Q probe是被切割的底物。所以适配体不能严格的称之为反应底物。如将它视为激活Cas12a的“激活底物”，这条钟形曲线说明过高的“激活底物”浓度导致酶活的下降，这与先前报道过的底物抑制现象极为相似。
此外，为了探究这种现象是否仅在适配体(ssDNA)激活Cas12a时候出现，我们用不同浓度的带有PAM序列的ssDNA(见图6c)和带有PAM 序列的dsDNA(见图6d)分别去验证。发现在ssDNA和dsDNA中均可以观测到这种现象。值得一提的是，最高荧光值出现时，Cas12a:crRNA:DNA激活子三者的比例接近1:1:1，但又根据不同的序列而有一些区别，如ssDNA (不带PAM序列)(ATP适配体)的最大荧光值出现在浓度12.5nM；ssDNA (带PAM序列)的最大荧光值出现在浓度1nM；dsDNA(带PAM序列) 的最大荧光值出现在浓度5nM。因此对于每一个不同的体外RNA与DNA (ssDNA和dsDNA)结合的检测方法，都需要先绘制一条工作曲线来寻求最适浓度。
这个底物抑制现象也可以从一个侧面被验证。当ssDNA(带PAM序列) (ATP适配体)(在此，带PAM的ssDNA序列为SEQ ID NO.4(5’-3’): AGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCA TGCAGAAGGA)浓度升高为25nM时，加入不同浓度的ATP目标分子作为抑制物，整个体系的荧光值与PC组相比，0.01mM的ATP使得信号升高(见图1)。那是因为此浓度的ATP结合一部分适配体后，使得有效ssDNA 激活子的浓度从25nM下降，从而更加接近最佳浓度。
5.F-Q probe的浓度优化：
我们还评估了probe浓度对整个反应体系的影响。随着probe浓度增加，荧光增长速度加快，酶促反应速度加快，该规律符合酶促反应动力学及米氏方程，此时cas12a核酸酶是一级反应(见图7a)。可以看出在40min时， 800nM浓度的probe还没有没完全消耗，荧光值没有进去平台期的趋势，到第90min所有的probe全都被cas12a核酸酶通过反式切割活性水解，荧光值不再增加(见图7b)，其荧光强度于probe浓度成正比。因此选择了合适的浓度。由于在有ATP存在的体系中荧光值会降低，为了在有限的时间内与NC组保证一定的区分度，最终选择了200nM的F-Q probe进行后续实验。
实施例3灵敏度和特异性实验
基于上述优化条件，我们评估了该方法用于检测ATP目标分子的灵敏度。我们将以适配体作为ssDNA激活子的情况作为阳性对照。加入不同浓度的ATP后，由于ATP和适配体特异性结合，用于发挥激活子作用的适配体减少，荧光信号出现不同程度的下降(见图8a)。定量分析可以通过监控开始反应13min后的抑制率来完成。我们将ATP的IR％作为y轴，ATP浓度的对数作为x轴作图，可以拟合得到线性响应，R2＝0.9496，其动态范围 (dynamicrange)为0.1mM-5mM(见图8b)。根据公式检测限(LOD)＝3*SD/ 斜率.本方法LOD可以达到2.66μM。这个灵敏度和动态范围要优于和基于适配体的显色传感器，但是达不到基于无机材料检测方法。用[抑制剂]vs. 响应拟合出的曲线显示LC50＝0.60。
用1mM的各种核苷测试了该方法的特异性(见图8c)。可以看出，ATP 可以显著降低反应的荧光值，其他4中核苷对于PC组几乎无影响。说明了该方法具有极高的特异性。图8a、8b、8c中的数据来自于图8a和图8c的三个独立测量，以及图8b的九个独立测量。误差棒表示标准偏差。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒
<130> PB00169
<141> 2020-12-10
<150> 201911268117.7
<151> 2019-12-11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 针对ATP的适配体ssDNA
<400> 1
acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27
<210> 2
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 针对ATP的crRNA
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga uuccuccgca auacuccccc a 41
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 针对EGFR的crRNA
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uucuuccgca cccagcaguu u 41
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 带PAM的ssDNA
<400> 4
agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa gaataccatg cagaagga 58

Claims (10)

1.一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：
向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并等待第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间存在特异结合活性；
向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A之间存在特异结合活性而与所述目标分子X之间不存在结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度，即L0；
将添加竞争分子B后的反应体系混匀并等待第二给定时间后检测所述反应系统的荧光强度L；
在给定的浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0-L值建立线性关系；
以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0-L推算出目标分子X的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标分子X是能够筛选出核酸适配体的分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告分子A是ssDNA(单链DNA，single strandDNA)，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光-淬灭探针ssDNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2；
SEQ ID NO.1(5’-3’):
ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO.2(5’-3’):
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3:1至1.05:1。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述荧光-淬灭探针ssDNA的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，为进行所述荧光强度测定使用荧光分析仪。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述给定浓度范围为25μM到0.5mM。
10.一种用于测定目标分子X的浓度的试剂盒，其至少包括报告分子A和竞争分子B，其中所述报告分子A能够与所述目标分子X特异性结合，而所述竞争分子B能够与所述报告分子A特异性结合并且不与所述目标分子X发生任何方式的结合；当不存在所述目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0。
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