CN113430249B - 一种dna腺苷酰化酶活性测定方法及测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法及测定试剂盒。所述的测定方法包括：以单链5′端磷酸化DNA(pDNA)和适量ATP为底物，以待测DNA腺苷酰化酶作用于所述底物，获得腺苷酰化的DNA产物；利用ATP检测试剂确定反应体系中剩余ATP量；将最初加入的ATP量减去剩余ATP量，获得与底物发生反应的ATP量，从而确定底物消耗量和产物生成量，进而确定待测DNA腺苷酰化酶的活性。本发明优化了用于该测定方法的底物序列，所述底物作为灵敏性高的底物，仅需要很低的量即可实现高效的反应，由单链5′端磷酸化DNA底物转化为腺苷酰化的DNA产物。
Description
技术领域
本发明属于生化技术领域；更具体地，本发明涉及一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法及测定试剂盒。
背景技术
DNA腺苷酰化酶，即DNA Adenylase，作为一种工具酶，在分子生物学研究领域中有着非常重要的应用，由它催化产生的5′端腺苷酰化修饰的单链DNA，常用于miRNA等3′端为羟基的RNA或3′端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3′端添加接头。
DNA腺苷酰化酶可以催化磷酸化的单链DNA(pDNA)转换生成腺苷酰化DNA(AppDNA)，且不管DNA的3′端封闭与否，都具有类似的腺苷酰化效果。在反应体系中不存在ATP的条件下，该酶可以催化单链DNA(ssDNA)生成环状DNA(circular DNA)。
目前通常采用腺苷酰化反应后，pDNA转变为腺苷酰化DNA(AppDNA)后存在的电泳迁移率发生变化，而进行酶活性的半定量检测(Torchia et al.Archaeal RNA ligase isa homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA；Nucleic Acids Res36(19):6218-6227；2008)。然而，在实际工作中，基于电泳的方法操作比较繁琐，并较难进行精确定量。
本领域中，也有采用放射性同位素标记的ATP进行DNA腺苷酰化反应，使生成的腺苷酰化AppDNA带上放射性，从而通过放射性的强弱来定量检测DNA腺苷酰化酶的活性。然而，使用放射性同位素标记ATP的方法，存在对于人体造成放射性伤害的风险，也可能造成环境放射性污染的风险，并且进行放射性同位素操作相对比较繁琐。
因此，本领域中对于DNA腺苷酰化酶的活性检测，还缺乏简便、快速并且可以定量的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法以及用于该方法的测定试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种进行DNA腺苷酰化酶活性测定的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法，所述方法包括：
(1)以单链5′端磷酸化DNA(pDNA)和ATP为底物，和待测DNA腺苷酰化酶反应，获得腺苷酰化的DNA产物；
(2)在(1)的反应体系中加入ATP检测试剂，确定反应体系中剩余ATP量；
(3)将(1)中ATP量减去(2)中剩余ATP量，获得与底物发生反应的ATP量，从而确定(1)中底物消耗量和产物生成量，进而确定待测DNA腺苷酰化酶的活性。
在另一优选例中，所述单链5′端磷酸化DNA(pDNA)的3’端可以为-NH2基团或为-OH基团，或为磷酸基团，或为Spacer C3，或为生物素基团，或为地高辛基团，或为双脱氧胞苷(ddC Dideoxy-C)、ddG、ddT或ddA，或为非脱氧的A、U、G或C。
在另一优选例中，所述的DNA腺苷酰化酶活性测定方法为定量测定方法，也可以为定性测定方法。
在另一优选例中，(1)中，所述的单链5′端磷酸化DNA为能在二级结构上形成茎环的DNA；较佳地，所述的单链5′端磷酸化DNA当形成二级结构时，其茎环为以下结构：
Z-Seq1-X-Seq2-Y 式I，
式I中，Seq1为DNA序列，Seq2为与Seq1互补的DNA序列；
X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补；
Y和Z为彼此不互补且与Seq1和Seq2不互补的DNA序列，碱基长度0～20nt；
式I所示的结构在溶液中形成式II所示的二级结构：
式II中，“||”表示在Seq1和Seq2之间形成的氢键。
在另一优选例中，其中X的长度为3～100nt；较佳地7～20nt，更佳地7-10nt。
在另一优选例中，其中Y为1-10nt，Z为0-5nt；更佳的，Y为1-3nt，Z为0nt。
在另一优选例中，Seq1或Seq2的长度为4～30nt，较佳地6-10nt。
在另一优选例中，所述的单链5′端磷酸化DNA为核苷酸序列如SEQ ID NO:2(DNA1)、SEQ ID NO:3(DNA2)、SEQ ID NO:5(DNA1-1)、SEQ ID NO:6(DNA2-1)、SEQ ID NO:7(DNA1-2)、SEQ ID NO:8(DNA2-2)、SEQ ID NO:1(DNA0)、SEQ ID NO:4(DNA0-1)所示的DNA；较佳地为核苷酸序列如SEQ ID NO:2(DNA1)、SEQ ID NO:5(DNA1-1)、SEQ ID NO:7(DNA1-2)所示的DNA。
在另一优选例中，(1)的反应进行5～30分钟，较佳地10～25分钟(如12、15、18、20、22分钟)。
在另一优选例中，(1)的反应之后，还包括终止反应的步骤，使DNA腺苷酰化酶失活；较佳地，在82～95℃(如84℃、86℃、88℃、90℃、92℃等)；孵育(如孵育2～20分钟，更具体如3、5、8、10、12、15、18分钟)以使DNA腺苷酰化酶失活。
在另一优选例中，(1)中，单链5′端磷酸化DNA终浓度为0.5～50μM；较佳地为1～25μM(如2、3、5、6、8、10、12、15、18、20、22μM)。
在另一优选例中，ATP终浓度为0.5～50μM；较佳地为1～25μM(如2、3、5、6、8、10、12、15、18、20、22μM)。
在另一优选例中，待测DNA腺苷酰化酶终浓度为0.00625～0.6μg/μl；较佳地为0.001～0.2μg/μl(如、0.001、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2μg/μl)。
在另一优选例中，(1)中的反应体系中，包括乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA。
在另一优选例中，乙酸钠终浓度为10～200mM，如20、40、50、60、80、100、150mM。
在另一优选例中，MgCl2终浓度为2～50mM，如3、5、8、10、20、30、40mM。
在另一优选例中，DTT终浓度为1～25mM，如2、4、5、6、8、10、15、20mM。
在另一优选例中，EDTA终浓度为0.02～0.5mM，如0.03、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4mM。
在另一优选例中，(2)中，所述ATP检测试剂包括：荧光素和荧光素酶，其与(1)的反应体系中剩余ATP反应、发光，根据发光强度确定剩余ATP量；较佳地，检测化学发光的强度，根据ATP标准曲线，计算出化学发光强度对应反应体系中剩余ATP的量(如摩尔量)。
在另一优选例中，所述的荧光素是萤火虫荧光素，所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶。
在本发明的另一方面，提供一种用于DNA腺苷酰化酶活性测定的试剂盒，其中包括：
(a)单链5′端磷酸化DNA(pDNA)；较佳地，其中所述的单链5′端磷酸化DNA为能在二级结构上形成茎环的DNA；更佳地，所述的单链5′端磷酸化DNA当形成二级结构时，其茎环为以下结构：
Z-Seq1-X-Seq2-Y 式I，
式I中，Seq1为5～10nt的DNA序列，Seq2为与Seq1互补的核苷酸序列，
X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补；
Y和Z为彼此不互补且与Seq1和Seq2不互补的DNA序列，碱基长度0～20nt；
式I所示的结构在溶液中形成式II所示的二级结构：
式II中，“||”表示在Seq1和Seq2之间形成的氢键；
(b)ATP；和
(c)ATP检测试剂。
在一个优选例中，其中还包括：乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA。
在另一优选例中，其中还包括：ATP标准品。
在另一优选例中，其中还包括：阳性对照。
在另一优选例中，其中还包括：阴性对照。
在另一优选例中，其中还包括：pH调节剂。
在另一优选例中，其中还包括：说明DNA腺苷酰化酶活性测定方法的使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明中用荧光素酶报告基因系统检测DNA腺苷酰化酶活性的工作原理。
图2、实施例1和实施例2中用荧光素酶报告基因系统对ATP标准品的检测效果(ATP标准曲线)。
图3A～B、实施例1中DNA腺苷酰化酶量与消耗掉的底物pDNA的曲线关系。
图4A～B、实施例2中DNA腺苷酰化酶量与消耗掉的底物pDNA的曲线关系。
图5A～B、实施例4中DNA腺苷酰化酶量与消耗掉的底物pDNA的曲线关系。
图6、检测DNA腺苷酰化酶催化DNA1转换生成AppDNA的效果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种简便、快速、且可以定量的DNA腺苷酰化酶活性测定方法。本发明人还优化了用于该测定方法的底物序列，所述序列具有发夹结构，所述底物作为灵敏性高的底物，仅需要很低的量即可实现高效的反应，由单链5′端磷酸化DNA底物转化为腺苷酰化的DNA产物。
术语
如本文所用，“待测DNA腺苷酰化酶”是指待检测的酶样品，需要定性或定量地了解其活性。
如本文所用，“互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，形成双链；在较佳的方式中，所述的“互补”为完全互补。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
检测原理
本发明建立了一种简便、快速、且可以定量的DNA腺苷酰化酶活性测定方法。其原理如图1所示：在腺苷酰化的反应体系中，以单链5′端磷酸化DNA(pDNA)为底物，加入ATP，利用DNA腺苷酰化酶使该磷酸化DNA(pDNA)的5′端腺苷酰化，生成腺苷酰化DNA(AppDNA)。随后，向该反应体系中加入ATP检测试剂，进行剩余ATP的检测。根据反应体系中剩余ATP的摩尔量，可计算出反应体系中消耗掉的底物pDNA的量，即相当于生产的AppDNA的量；其中反应体系中DNA腺苷酰化酶的量与消耗掉的pDNA量正相关。
据此，可以非常便捷、快速地检测出DNA腺苷酰化酶的活性水平。同时，本发明中也提供了适当优化的DNA序列，以用于DNA腺苷酰化酶活性的检测，从而优化了基于上述反应原理的检测方法，可以在很低的底物用量下实现优异的酶活性检测效果。
测定方法
本发明提供了一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法，包括：(1)以单链5′端磷酸化DNA(pDNA)和适量ATP为底物，以待测DNA腺苷酰化酶作用于所述底物，获得腺苷酰化的DNA产物；(2)在(1)的反应体系中加入ATP检测试剂，确定反应体系中剩余ATP量；(3)将(1)中ATP的量减去(2)中剩余ATP的量，获得与底物发生反应的ATP量，从而确定(1)中底物消耗量和产物生成量，进而确定待测DNA腺苷酰化酶的活性。
本发明所述的DNA腺苷酰化酶活性测定方法可以是定性测定的方法，用于确定体系中酶的存在与否；也可以是定量测定方法，用于确定体系中酶的存在量或酶活性。
作为底物的DNA，其以5’端磷酸化(pDNA)作为必要技术特征，而对该DNA的3’端没有特殊的要求。其3’端可以为-NH2基团或为-OH基团，或为磷酸基团，或为Spacer C3，或为生物素基团，或为地高辛基团，或为双脱氧胞苷(ddC Dideoxy-C)、ddG、ddT或ddA，或为非脱氧的A、U、G或C。
本发明人在深入研究和筛选中发现，作为底物的pDNA，其不同的设计方式，DNA腺苷酰化酶对其的识别能力、识别的敏感性并不相同。当pDNA的二级结构为线性结构时，其作为酶的底物的效果不如二级结构为茎环的pDNA。因此，作为本发明的优选方式，所述的单链5′端磷酸化DNA为能在二级结构形成茎环的DNA。
进一步地，本发明人比较了作为底物的pDNA在进行不同的茎环序列设计时，DNA腺苷酰化酶对其的识别能力、识别的敏感性。发现以其5’端首个碱基作为“茎”的双链的起始、在其3’端凸出若干(如1～3个)非互补的碱基时，其作为底物而被DNA腺苷酰化酶识别的效率是显著更高的。因此，作为本发明的优选方式，所述的单链5′端磷酸化DNA当形成二级结构时，其茎环为以下结构：
Z-Seq1-X-Seq2-Y 式I
式I中，Seq1为5～10nt的DNA序列，Seq2为与Seq1互补的核苷酸序列，X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补；Y和Z为彼此不互补且与Seq1和Seq2不互补的DNA序列，碱基长度0～20nt；较佳的，Y为1-10nt，Z为0-5nt；更佳的，Y为1-3nt，Z为0nt。
式I所示的结构能形成式II所示的二级结构：
在本发明相对优选的方式中，所述的单链5′端磷酸化DNA为核苷酸序列如SEQ IDNO:2(DNA1)、SEQ ID NO:3(DNA2)、SEQ ID NO:5(DNA1-1)、SEQ ID NO:6(DNA2-1)、SEQ IDNO:7(DNA1-2)、SEQ ID NO:8(DNA2-2)、SEQ ID NO:1(DNA0)、SEQ ID NO:4(DNA0-1)所示的DNA；较佳地为核苷酸序列如SEQ ID NO:2(DNA1)、SEQ ID NO:5(DNA1-1)、SEQ ID NO:7(DNA1-2)所示的DNA。
所述的pDNA、ATP以及所述DNA腺苷酰化酶在适当的反应体系中进行反应。在本发明的一个优选实施方式中，所述反应体系中包括乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA。
pDNA与ATP在DNA腺苷酰化酶催化下，形成腺苷酰化的DNA产物之后，利用ATP检测试剂来对体系中剩余的ATP进行检测。所述的ATP的检测可以应用本领域中已经开发的检测试剂或试剂盒。
ATP的检测方法可以是光学分析法，例如可以是分光光度法：采用ATP试剂盒，因ATP腺嘌呤碱基上存在共轭双键，在紫外下有吸收峰，可用紫外分光光度法检测ATP含量。
作为本发明的优选方式，利用生物发光法进行检测，根据发光强度确定剩余ATP量(计算出化学发光强度对应反应体系中剩余ATP的量)。所述检测试剂包括荧光素和荧光素酶，利用荧光素在荧光素酶(Luciferase)的作用下，与ATP发生反应，生成荧光素-ATP复合体，该复合体被分子氧氧化后激发荧光素发光，根据发光强弱可检测ATP含量。利用该反应体系中剩余的ATP使荧光素(Luciferin)氧化生成氧和荧光素，同时产生化学发光，检测化学发光的强度，根据ATP标准曲线，计算出化学发光强度对应反应体系中剩余ATP的摩尔量。
制备ATP标准曲线的方法通常包括：将ATP标准液配制成不同的浓度梯度，于分光光度计进行比色测定，测定化学发光数值；之后，以ATP浓度(或其对数值)为横坐标，以化学发光数值为纵坐标，绘制标准曲线。在获得了标准曲线后，基于该曲线，可以对待测体系中的ATP的量进行定量。
此外，作为其它可选的方式，也可以运用层析法进行ATP检测：利用样品各组分之间亲和力、分配系数等化学性质的差异，实现ATP与其它杂质的分离。例如，所述方法包括纸层析法、薄层层析法、离子交换色谱法(利用样品各组分离子交换能力或选择系数之间的差异，实现分离)或高效液相色谱法(利用样品各组分之间的差异，实现分离)。
检测试剂盒
结合本发明的检测方法，本发明也提供了一种用于DNA腺苷酰化酶活性测定的试剂盒，其中包括：(a)单链5′端磷酸化DNA(pDNA)，其中所述的单链5′端磷酸化DNA为能在二级结构上形成茎环的DNA；(b)ATP；和(c)ATP检测试剂。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括配合本发明的DNA腺苷酰化酶活性测定方法的检测试剂，例如但不限于：乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA，ATP标准品，样本(样品)保存液，缓冲液，pH调节剂，阳性对照和/或阴性对照等。
此外，所述的试剂盒中还可包括说明DNA腺苷酰化酶活性测定方法的使用说明书。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明巧妙利用了pDNA能够作为底物、在加入ATP后可由DNA腺苷酰化酶催化形成腺苷酰化的DNA产物、且反应体系中DNA腺苷酰化酶的量与消耗掉的pDNA量呈正相关这一反应原理，高效、精确地定性/定量测定DNA腺苷酰化酶活性。
(2)本发明优化筛选获得有效的pDNA作为底物，所述pDNA的序列具有发夹结构，所述底物作为灵敏性高的底物，仅需要很低的量即可实现高效的反应。
(3)本发明的检测方法/试剂盒灵敏度高，利用了长度较短的pDNA作为底物，不需要放射性同位素标记，可有效避免环境放射性污染，使实验污染降到最低，无需电泳这类过程繁琐但精确度低的检测步骤，无其他特殊试验条件，操作简单易培训。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、DNA腺苷酰化酶活性测定1
1、底物序列的设计
DNA0:5′p-GTCTACCGAGGATGAAT(SEQ ID NO:1)-NH23′；或
5′p-GTCTACCGAGGATGAAT(SEQ ID NO:1)-OH3′
DNA1:5′p-GTCTACACGAAGAGTAGACGA(SEQ ID NO:2)-NH23′；或
5′p-GTCTACACGAAGAGTAGACGA(SEQ ID NO:2)-OH3′
DNA2:5′p-AGTCTACACGAAGAGTAGACGAG(SEQ ID NO:3)-NH23′；或
5’p-AGTCTACACGAAGAGTAGACGAG(SEQ ID NO:3)-OH3′。
2、腺苷酰化反应
DNA腺苷酰化酶(DNA Adenylase)是由本发明人通过大肠杆菌表达纯化获得的MthRNA连接酶重组蛋白(其氨基酸序列见GenBank登录号WP_048060995)，其浓度为6μg/μl。
将Mth RNA连接酶重组蛋白用储存液(10mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，1mMDTT，0.1mM EDTA，50％甘油)进行稀释，分别稀释至2μg/μl，1μg/μl，0.5μg/μl，0.25μg/μl，0.125μg/μl，0.0625μg/μl，分别加入2μl一系列稀释后的DNA腺苷酰化酶进行实验，参考如下表1。
表1
因此，反应体系为：5μM ATP，5μM pDNA，50mM乙酸钠(pH 6.0；25℃),10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM EDTA，及不同量的DNA腺苷酰化酶。
腺苷酰化反应条件：65℃孵育15min。本次反应中，pDNA运用的具体是3’端为-NH2的DNA。
终止反应：85℃孵育5min使DNA腺苷酰化酶失活。
3、ATP的检测
使用上海碧云天商品化的增强型ATP检测试剂盒(S0027)检测ATP水平。取上述反应产物10μl，加入100μl使用该试剂盒配制的ATP检测工作液(含有萤光素和萤火虫荧光素酶)，混匀。并使用试剂盒中的标准品设置标准曲线并同样进行检测。
检测时，不同的腺苷酰化反应产物同时进行检测。
4、化学发光检测
(1)用ThermoScientificVarioskan LUX 3020-80314酶标仪检测标准品和样品的化学发光，以ATP的浓度为横坐标，以对应的化学发光值为纵坐标制作ATP标准曲线(图2)，根据ATP标准曲线计算出反应体系中剩余ATP的摩尔量。进一步根据ATP的消耗量等于pDNA的消耗量，计算出反应体系中消耗的底物pDNA的摩尔量(即生成的AppDNA的量)。具体计算结果如表2。
表2
(2)用Two-Way ANOVA对DNA0、DNA1、DNA2对应的检测数据进行统计学分析，分析结果如表格3所示；然后以酶量(μg)为横坐标，以反应体系中消耗的pDNA的量(pmol)为纵坐标作折线图，结果如图3A、3B所示。
表3
根据上述的Two-Way ANOVA分析结果，结论如下：线性序列DNA0和5’平末端发夹结构的序列DNA1之间存在显著的差异，线性序列DNA0和5’非平末端发夹结构的序列DNA2之间也存在显著的差异；即没有发夹结构的序列和有发夹结构的序列，效果存在非常显著的差异(注：0.01<P<0.05表示显著性差异，用“*”表示；P<0.01表示极显著性差异，用“**”表示)。
实施例2、DNA腺苷酰化酶活性测定2
1、底物序列的设计
DNA0-1:5′p-TACGATGCTGACGACTC(SEQ ID NO:4)-NH23′；或
5′p-TACGATGCTGACGACTC(SEQ ID NO:4)-OH 3′
DNA1-1:5′p-AGCGCATAGGAAGTGCGCTCA(SEQ ID NO:5)-NH23′；或
5′p-AGCGCATAGGAAGTGCGCTCA(SEQ ID NO:5)-OH3′
DNA2-1:5′p-CTCGCTAAGGAAGATAGCGACAA(SEQ ID NO:6)-NH23′；或
5′p-CTCGCTAAGGAAGATAGCGACAA(SEQ ID NO:6)-OH3′
2、腺苷酰化反应
DNA腺苷酰化酶(DNA Adenylase)是由本发明人通过大肠杆菌表达纯化获得的MthRNA连接酶重组蛋白(其氨基酸序列见GenBank登录号WP_048060995)，其浓度为6μg/μl。
将Mth RNA连接酶重组蛋白用储存液(10mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，1mMDTT，0.1mM EDTA，50％甘油)进行稀释，分别稀释至2μg/μl，1μg/μl，0.5μg/μl，0.25μg/μl，0.125μg/μl，0.0625μg/μl，分别加入2μl一系列稀释后的DNA腺苷酰化酶进行实验，参考如下表4。
表4
因此，反应体系为：5μM ATP，5μM pDNA，50mM乙酸钠(pH 6.0；25℃),10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM EDTA。
腺苷酰化反应条件：65℃孵育15min。本次反应中，pDNA运用的具体是3’端为-NH2的DNA。
终止反应：85℃孵育5min使DNA腺苷酰化酶失活。
3、ATP的检测
使用上海碧云天商品化的增强型ATP检测试剂盒(S0027)检测ATP水平。取上述反应产物10μl，加入100μl使用该试剂盒配制的ATP检测工作液(含有萤光素和萤火虫荧光素酶)，混匀。并使用试剂盒中的标准品设置标准曲线并同样进行检测。
检测时，不同的腺苷酰化反应产物同时进行检测。
4、化学发光检测
(1)用ThermoScientificVarioskan LUX 3020-80314酶标仪检测标准品和样品的化学发光，以ATP的浓度为横坐标，以对应的化学发光值为纵坐标制作ATP标准曲线，根据ATP标准曲线计算出反应体系中剩余ATP的摩尔量。进一步根据ATP的消耗量等于pDNA的消耗量，计算出反应体系中消耗的底物pDNA的摩尔量(即生成的AppDNA的量)。具体计算结果如表5。
表5
(2)用Two-Way ANOVA对DNA0-1、DNA1-1、DNA2-1对应的检测数据进行统计学分析，分析结果如表格6所示；然后以酶量(μg)为横坐标，以反应体系中消耗的pDNA的量(pmol)为纵坐标作折线图，结果如图4A、4B所示。
表6
| Test details | DNA0-1 vs DNA1-1 | DNA0-1 vs DNA2-1 |
| P value | 0.007 | 0.029 |
根据上述的Two-Way ANOVA分析结果，结论如下：线性序列DNA0-1和5’平末端发夹结构的序列DNA1-1之间存在显著的差异，线性序列DNA0-1和5’非平末端发夹结构的序列DNA2-1之间也存在显著的差异。没有发夹结构的序列和有发夹结构的序列，效果存在非常显著的差异(注：0.01<P<0.05表示显著性差异，用“*”表示；P<0.01表示极显著性差异，用“**”表示)。
实施例3、DNA腺苷酰化酶活性测定3
用DNA0、DNA1-2和DNA2-2作为底物。
DNA1-2:5′p-TCGCTAAGGATGATAGCGAGA(SEQ ID NO:7)-NH23′；或
5′p-TCGCTAAGGATGATAGCGAGA(SEQ ID NO:7)-OH3′DNA
DNA2-2:5′p-GAGCGCATAGGAAGTGCGCTGAA(SEQ ID NO:8)-NH23′；或
5′p-GAGCGCATAGGAAGTGCGCTGAA(SEQ ID NO:8)-OH3′。
实验方法同实施例1。结果也得到了与实施例1和实施例2一致的结论。
实施例4、DNA0系列、DNA1系列、DNA2系列的统计分析
分别对DNA0系列(DNA0、DNA0-1)、DNA1系列(DNA1、DNA1-1、DNA1-2)、DNA2(DNA2、DNA2-1、DNA2-2)系列计算平均值，计算结果如表格7所示；接着用Two-Way ANOVA对该组数据进行统计学分析，分析结果如表格8所示；然后以酶量(μg)为横坐标，以反应体系中消耗的pDNA的量(pmol)为纵坐标作折线图，结果如图5A、5B所示。
表7
表8
根据上述的配对Two-Way ANOVA分析结果，结论如下：线性序列DNA(包括DNA0和DNA0-1)和5’平末端发夹结构的序列DNA(DNA1、DNA1-1和DNA1-2)之间存在显著的差异，线性序列DNA(包括DNA0和DNA0-1)和5’非平末端发夹结构的序列DNA(DNA2、DNA2-1和DNA2-2)之间也存在显著的差异；即没有发夹结构的序列和有发夹结构的序列，效果存在非常显著的差异(注：0.01<P<0.05表示显著性差异，用“*”表示；P<0.01表示极显著性差异，用“**”表示)。
这一结果表明：DNA腺苷酰化酶可以利用ATP将pDNA腺苷酰化，且腺苷酰化程度呈现剂量依赖性，且用不同序列的pDNA作为底物进行反应，尽管可以得到类似的实验结果，但其中具有发夹结构的序列DNA1系列的效果和具有发夹结构的序列DNA2系列的效果较佳，线性序列DNA0系列的效果则相对较低(DNA0系列消耗相同量的底物需要的酶量高，说明该酶对此底物的活性越低，敏感性越差)。
根据上述，可以利用ATP的减少量检测出pDNA的减少量，即相当于AppDNA的生成量，从而检测出DNA腺苷酰化酶的活性水平。而ATP的水平可以通过基于荧光素酶催化的化学发光的ATP检测试剂盒进行高灵敏度的检测。
同时，DNA1系列、DNA2系列效果显著地优于DNA0系列。
实施例5、检测DNA腺苷酰化酶催化DNA1转换生成AppDNA的效果
1、底物序列
DNA1:5′p-GTCTACACGAAGAGTAGACGA(SEQ ID NO:2)-NH23′；或
5′p-GTCTACACGAAGAGTAGACGA(SEQ ID NO:2)-OH3′
2、腺苷酰化反应
DNA腺苷酰化酶是由本发明人通过大肠杆菌表达纯化获得的Mth RNA连接酶重组蛋白，其浓度为6μg/μl。
将Mth RNA连接酶重组蛋白用储存液(10mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，1mMDTT，0.1mM EDTA，50％甘油)进行稀释，分别稀释至4μg/μl，3μg/μl，2μg/μl，1μg/μl，分别加入2μl一系列稀释后的DNA腺苷酰化酶进行实验，参考如下表9。
表9
反应体系为：5μM ATP，5μM pDNA，50mM乙酸钠(pH 6.0；25℃),10mM MgCl2，5mMDTT，0.1mM EDTA。
腺苷酰化反应条件：65℃孵育60min。本次反应中，pDNA运用的具体是3’端为-NH2的DNA。
终止反应：85℃孵育5min使DNA腺苷酰化酶失活。
3、DNA腺苷酰化酶的活性检测
反应结束后取出1.5μl反应液，用Nuclease-FreeWater补足至5μl，加入1μl DNA6X上样缓冲液，95℃孵育5min进行变性处理，之后用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，接着用NA-Red染色液室温染色15min，最后在紫外灯下观察结果。
结果如图6所示，用软件BeyoImager Image Analyzer计算图6中各电泳条带的灰度值，计算结果如表10所示。结合电泳图和计算得到的灰度值可知，DNA腺苷酰化酶对DNA 1具有显著的腺苷酰化活性。在DNA腺苷酰化酶低至2μg时即呈现显著的反应，且随着用量的增加，反应呈现剂量依赖性。
表10
| Lane | 0 | 2μg | 4μg | 6μg | 8μg |
| 灰度值(AppDNA) | 987034 | 1368376 | 1378599 | 1389698 | |
| 灰度值(pDNA) | 1558733 | 817246 | 227704 | 142941 | 88302 |
| 灰度值比值(AppDNA/pDNA) | 1.2 | 6 | 9.6 | 15.7 |
结论：本发明建立了一种基于荧光素酶催化的化学发光的ATP检测，从而简便、快速检测DNA腺苷酰化酶活性的技术方法，且揭示了用于检测DNA腺苷酰化酶活性的优化的pDNA序列DNA1系列和DNA2系列，该类序列具有发夹结构，将该序列用于检测DNA腺苷酰化酶活性的效果显著优于无明显发夹结构的序列DNA0系列。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海碧云天生物技术有限公司
<120> 一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法及测定试剂盒
<130> 212391
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 1
gtctaccgag gatgaat 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 2
gtctacacga agagtagacg a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 3
agtctacacg aagagtagac gag 23
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 4
tacgatgctg acgactc 17
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 5
agcgcatagg aagtgcgctc a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 6
ctcgctaagg aagatagcga caa 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 7
tcgctaagga tgatagcgag a 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 多核苷酸(polynucleotide )
<400> 8
gagcgcatag gaagtgcgct gaa 23
Claims (13)
1.一种DNA腺苷酰化酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以单链5′端磷酸化DNA和ATP为底物，和待测DNA腺苷酰化酶反应，获得腺苷酰化的DNA产物；所述的单链5′端磷酸化DNA为能在二级结构上形成茎环的DNA，其茎环为以下结构：
Z-Seq1-X-Seq2-Y 式I，
式I中，Seq1为DNA序列，Seq2为与Seq1互补的DNA序列；
X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补，Seq1或Seq2为5-10nt，X为7-10 nt；
Y和Z为彼此不互补且与Seq1和Seq2不互补的DNA序列，Y为1-3 nt，Z为0 nt；
(2)在(1)的反应体系中加入ATP检测试剂，确定反应体系中剩余ATP量；
(3)将(1)中ATP量减去(2)中剩余ATP量，获得与底物发生反应的ATP量，从而确定(1)中底物消耗量和产物生成量，进而确定待测DNA腺苷酰化酶的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式I所示的结构在溶液中形成式II所示的二级结构：
式II中，“||”表示在Seq1和Seq2之间形成的氢键。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中X为7 nt，Y为1-3 nt，Z为0nt；Seq1或Seq2为6 nt。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单链5′端磷酸化DNA为核苷酸序列如SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7所示的DNA。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)的反应进行5～30分钟；和/或
(1)的反应之后，还包括终止反应的步骤，使DNA腺苷酰化酶失活。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，(1)的反应进行10～25分钟；和/或
所述终止反应的步骤为在82～95℃孵育以使DNA腺苷酰化酶失活。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，单链5′端磷酸化DNA终浓度为0.5～50µM；
ATP终浓度为0.5～50µM；或
待测DNA腺苷酰化酶终浓度为0.00625～0.6µg/µl。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，(1)中，单链5′端磷酸化DNA终浓度为1～25µM；或
ATP终浓度为1～25µM；或
待测DNA腺苷酰化酶终浓度为0.001～0.2µg/µl。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的反应体系中，还包括乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述ATP检测试剂包括：荧光素和荧光素酶，其与(1)的反应体系中剩余ATP反应、发光，根据发光强度确定剩余ATP量。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，检测化学发光的强度，根据ATP标准曲线，计算出化学发光强度对应反应体系中剩余ATP的量。
12.一种用于DNA腺苷酰化酶活性测定的试剂盒，其特征在于，其中包括：
(a)单链5′端磷酸化DNA，其为能在二级结构上形成茎环的DNA，其茎环为以下结构：
Z-Seq1-X-Seq2-Y 式I，
式I中，Seq1为5-10nt的DNA序列，Seq2为与Seq1互补的核苷酸序列，
X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补，X为7-10nt；
Y和Z为彼此不互补且与Seq1和Seq2不互补的DNA序列，Y为1-3nt，Z为0nt；
式I所示的结构在溶液中形成式II所示的二级结构：
式II中，“||”表示在Seq1和Seq2之间形成的氢键；
(b) ATP；和
(c) ATP检测试剂。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：
乙酸钠，MgCl2，DTT，EDTA；和/或
ATP标准品；和/或
阳性对照；和/或
阴性对照；和/或
pH调节剂；和/或
说明DNA腺苷酰化酶活性测定方法的使用说明书。
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