CN111201328A - 使用双半抗原探针的对重组酶聚合酶扩增的检测 - Google Patents
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- C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
- C12Y302/02023—DNA-formamidopyrimidine glycosylase (3.2.2.23)
Abstract
本公开涉及使用双半抗原探针检测靶核酸序列的方法和组合物。更具体地说,本公开涉及使用重组酶聚合酶扩增(RPA)和双半抗原探针检测靶核酸序列。在一些情况下,检测是在侧流试纸条上。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月14提交的标题为“使用双半抗原探针的对重组酶聚合酶扩增的检测”的美国专利申请序列号62/558,705的权益,所述专利申请以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及使用双半抗原探针检测靶核酸序列的方法和组合物。更具体地说,本公开涉及使用重组酶聚合酶扩增(RPA)和双半抗原探针检测靶核酸序列的方法和组合物。在一些情况下,检测是在侧流试纸条上。
背景技术
某些等温扩增方法能够在几分钟之内将靶核酸从痕量水平扩增至极高和可检测的水平。这类等温方法如重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)能够允许用户检测痕量的具体序列,促进即时检验(point-of-care testing)并增加诊断的方便性和速度。
已经证明RPA适用于非实验室背景下,据报告其灵敏度与基于PCR的对靶DNA的诊断和实时检测相当。然而,这些测定仍然更适用于实验室背景或‘手提箱内实验室(lab-in-a-suitcase)’型装备。因此,许多团体已经研发出用于仅仅需要定性数据的情况下的侧流测定。对于未受训练的人员/家庭使用来说,侧流测试操作相对简单,并且是用于资源有限的背景下的优选格式之一,因为所述测试不需要操作昂贵的设备。然而,侧流技术仍然需要许多操控,包括在侧流分析前的稀释步骤。仍然需要一种通过减少所需的操控数目而简化的使用RPA扩增和侧流检测的方法。这种改良将为制造用于RPA侧流测定的消耗品带来益处,允许简化测试装置,因此降低消耗品成本,使得这类测定更适合在实验室外使用。
发明内容
本公开至少部分地基于以下发现:能够在无稀释步骤下使用双半抗原探针在侧流试纸条上准确有效地检测靶核酸序列的RPA。鉴于此发现,本文提供了使用双半抗原探针检测靶核酸的存在或不存在的RPA组合物和方法。这些靶核酸序列能够诊断疾病或病症。
在一方面,本公开的特征为一种重组酶聚合酶扩增组合物,所述重组酶聚合酶扩增组合物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成:拥挤剂;具有双半抗原离去基团的寡核苷酸探针;和核酸酶。在另一方面,本公开的特征为一种重组酶聚合酶扩增组合物,所述重组酶聚合酶扩增组合物用于样品中存在的靶核酸的侧流分析中,所述分析不需要在侧流试纸条上分离扩增产物前稀释扩增混合物,所述重组酶聚合酶扩增组合物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成:拥挤剂;具有双半抗原离去基团的寡核苷酸探针;和核酸酶。
在所有方面的一些实施方案中,本文所述的组合物和方法的拥挤剂包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Ficoll或葡聚糖。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂具有至少1千道尔顿、至少2千道尔顿、至少3千道尔顿、至少4千道尔顿、至少5千道尔顿、至少6千道尔顿、至少8千道尔顿或至少10千道尔顿的分子量。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂以至少15%v/v的浓度、至少12%v/v的浓度、至少10%v/v的浓度、至少8%v/v的浓度、至少6%v/v、至少5%v/v的浓度、至少4%v/v的浓度或至少3%v/v的浓度存在于组合物中。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂在20℃下具有小于或等于5mPa/s、小于或等于4mPa/s、小于或等于3mPa/s、小于或等于2mPa/s或小于或等于1mPa/s的粘度概况。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂为在20℃下具有小于或等于3mPa/s的粘度的PEG。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂为具有3千道尔顿的分子量的PEG,并且其中PEG浓度为6.5%v/v。
在所有方面的一些实施方案中,本文所述的组合物和方法的寡核苷酸探针包含缺少将离去基团连接至寡核苷酸的碱基的dR-O-[C]n核苷酸。在所有方面的一些实施方案中,具有双半抗原的寡核苷酸探针在所述寡核苷酸探针与互补核苷酸序列杂交时由甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶裂解,释放双半抗原离去基团。在所有方面的一些实施方案中,双半抗原离去基团包含具有不同表位的两个免疫原性基团、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中,免疫原性基团包含以下、由以下组成或基本上由以下组成:荧光基团、酶或其片段、肽或其片段、生物素。在所有方面的一些实施方案中,免疫原性基团选自包括生物素、荧光素、地高辛或二硝基苯基的组。
在所有方面的一些实施方案中,本文所述的组合物和方法的核酸酶为甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶。
在另一方面,本公开的特征为包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的组合物:
在另一方面,本公开的特征为包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的组合物:
在另一方面,本公开的特征为包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的组合物:
在另一方面,本公开的特征为包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的组合物:
在另一方面,本公开的特征为包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的组合物:
其中:半抗原1和半抗原2为如本文所述的免疫原性基团;Z选自:(i)在RNA或DNA寡核苷酸的情形下分别无碱基核糖或脱氧核糖环的C1';在异头碳原子处具有β-构型;(ii)被配置用于连接于DNA或RNA寡核苷酸的氨基磷酸酯化合物;并且其中当Z为DNA或RNA氨基磷酸酯时,半抗原1和半抗原2的反应基团可任选地经特戊酰基、叔丁基苯甲酰基、酰基、苯甲酰基或异丁酰基保护;R表示氢,或直链或支链C1至C6烷基;X1、X2和X4为连接基团,所述基团可独立地不存在,或为可任选地插有一个或多个-O-、-C(=O)-或-NR-基团的直链或支链C1至C12烷基;X3为直链或支链C1至C6烷基;并且X5为任选地插有一个或多个-O-、-C(=O)-或-NR-基团的直链或支链C1至C12烷基。
在一些实施方案中,寡核苷酸探针能够由核酸外切酶裂解,并且寡核苷酸在裂解时释放双半抗原离去基团。在一些实施方案中,核酸外切酶为核酸外切酶III。在一些实施方案中,寡核苷酸探针具有结构5'X(n)aL(n)bH(n)cB3',其中n为核苷酸,a、b和c为整数,X为5'己基或半抗原,H为THF残基,B为C3间隔子,并且L为包含多个半抗原的支链修饰子。在一些实施方案中,举例来说,半抗原为DNP和生物素,不过可利用其它半抗原(例如FAM)。在一些实施方案中,寡核苷酸探针包含介于半抗原之间的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,a和c为至少15个核苷酸。在一些实施方案中,b为零。在一些实施方案中,a大约为15并且c大约为30。在一些实施方案中,寡核苷酸探针与靶核酸互补。在一些实施方案中,L代替胞嘧啶核苷酸。
在另一方面,本公开的特征为包括侧流试纸条、由侧流试纸条组成或基本上由侧流试纸条组成的装置,所述侧流试纸条包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:样品施加区;在所述样品施加区的下游并且与所述样品施加区处于流体连通中的试剂区,所述试剂区包含用于扩增靶核酸的干燥的RPA试剂组合物、对扩增的靶核酸产物具有特异性的结合剂和检测分子;在所述试剂区的下游并且与所述试剂区处于流体连通中的至少一个测试区,所述测试区包含对所述扩增的靶核酸产物具有特异性的固定的捕获分子;以及在所述测试区的下游的对照区。在一些实施方案中,装置提供连续的(例如同时发生的)RPA和检测。在一些实施方案中,装置在测试区中包含特别重的吸收垫。
在所有方面的一些实施方案中,干燥的RPA试剂组合物包含拥挤剂、重组酶、聚合酶、核酸酶、双半抗原探针和检测分子。在所有方面的一些实施方案中,双半抗原探针包含生物素与羧基荧光素(FAM)或生物素与二硝基苯基(DNP)的缀合物。在所有方面的一些实施方案中,对扩增的靶核酸具有特异性的固定的捕获分子选自由抗FAM捕获分子或抗DNP捕获分子组成的组。在所有方面的一些实施方案中,抗FAM或抗DNP独立地选自由以下组成的组:多克隆抗体、单克隆抗体以及它们的包括FAB、ScFv、Fv或DAB在内的功能结合片段。在所有方面的一些实施方案中,检测分子选自由以下组成的组:金溶胶、银溶胶、乳胶溶胶、纤维素纳米珠或碳纳米线以及抗生物素捕获分子。
在所有方面的一些实施方案中,对照区包含指示侧流试纸条的正确操作的结合区。在所有方面的一些实施方案中,对照区包含抗小鼠抗体捕获线。
在另一方面,本公开的特征为检测扩增产物的方法,所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:使怀疑含有所关注的靶核酸的样品与用于扩增所述靶核酸的RPA试剂、包含与所述靶核酸互补的核酸序列和共价连接的双半抗原离去基团的寡核苷酸探针以及核酸酶接触;对所述靶核酸进行扩增以产生靶核酸产物;以及通过检测从与所述靶核酸杂交的所述寡核苷酸探针裂解的游离双半抗原部分来检测所述靶核酸产物。
在所有方面的一些实施方案中,RPA试剂位于侧流试纸条的样品施加区上。在所有方面的一些实施方案中,在样品与RPA试剂接触形成核酸扩增混合物后在侧流试纸条上进行核酸扩增。在所有方面的一些实施方案中,在其它液体未稀释所述RPA混合物或未将加入RPA混合物下在侧流试纸条上进行核酸扩增。在一些实施方案中,RPA反应和检测是同时发生的。
在所有方面的一些实施方案中,在侧流上的位于样品施加区下游的测试区选择性地捕获从寡核苷酸探针裂解的双半抗原部分。在所有方面的一些实施方案中,在侧流试纸条上的测试区不选择性地捕获包含共价连接的双半抗原的寡核苷酸探针。在所有方面的一些实施方案中,侧流试纸条包含测试区和对照区、由测试区和对照区组成或基本上由测试区和对照区组成,其中测试区包含用于捕获从寡核苷酸裂解的双半抗原的结合对成员、由所述结合对成员组成或基本上由所述结合对成员组成,并且对照区包含用于内部对照的结合对成员。在所有方面的一些实施方案中,对照区包含抗小鼠抗体或其片段、由抗小鼠抗体或其片段组成或基本上由抗小鼠抗体或其片段组成。在所有方面的一些实施方案中,测试区包含抗DNP捕获分子或抗FAM捕获分子、由抗DNP捕获分子或抗FAM捕获分子组成或基本上由抗DNP捕获分子或抗FAM捕获分子组成。在所有方面的一些实施方案中,抗FAM捕获分子选自由单克隆抗体、多克隆抗体和它们的功能结合片段组成的组。在所有方面的一些实施方案中,抗DNP捕获分子选自由单克隆抗体、多克隆抗体或它们的功能结合片段组成的组。
在所有方面的一些实施方案中,检测扩增产物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:在测试区中捕获双半抗原离去基团以及用检测分子标记所捕获的双半抗原离去基团。在所有方面的一些实施方案中,检测分子选自由以下组成的组:金溶胶、银溶胶、乳胶溶胶、纤维素纳米珠以及碳纳米线。
在另一方面,本公开的特征为一种方法,所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:将怀疑含有靶核酸的样品施加至侧流试纸条;使所述样品与干燥至侧流试纸条的试剂区上的用于扩增靶核酸的RPA试剂混合物接触;以及如果扩增产物存在,那么在侧流试纸条的测试区上检测扩增产物。
在所有方面的一些实施方案中,将怀疑含有靶核酸的样品施加至侧流试纸条的施加区。在所有方面的一些实施方案中,RPA试剂混合物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成:拥挤剂、重组酶、聚合酶、核酸酶和双半抗原寡核苷酸探针。
在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Ficoll和葡聚糖。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂具有至少1千道尔顿、至少2千道尔顿、至少3千道尔顿、至少4千道尔顿、至少5千道尔顿、至少6千道尔顿、至少8千道尔顿或至少10千道尔顿的分子量。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂以至少15%v/v的浓度、至少12%v/v最终浓度、至少10%v/v、至少8%v/v、至少6%v/v、至少5%v/v、至少4%v/v或至少3%v/v最终浓度存在于混合物中。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂在20℃下具有小于或等于5mPa/s、小于或等于4mPa/s、小于或等于3mPa/s、小于或等于2mPa/s或小于或等于1mPa/s的粘度概况。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂为PEG并且在20℃下具有小于或等于3mPa/s的粘度。在所有方面的一些实施方案中,拥挤剂为包含3千道尔顿的分子量的PEG,并且其中PEG的最终浓度为6.5%v/v。
在所有方面的一些实施方案中,如果存在扩增产物,那么检测扩增产物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:检测从与扩增产物杂交的寡核苷酸探针裂解的双半抗原部分。在所有方面的一些实施方案中,在检测扩增产物前不需要稀释RPA混合物。
如用于本公开中的术语“一种或多种”或“至少一种”代表1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种化合物或更多种。
如本文所用,“样品”是指从环境(例如来自动物的血液或组织、细胞或来自组织培养的条件培养基)中分离并且怀疑含有或已知含有分析物或其它期望物质的生物材料。样品还可以是例如来自患有特定疾病或疾患的受试者的组织或体液的部分纯化部分。参考样品可以是来自未患所述疾病或疾患的供体的“正常”样品。参考样品还可以来自于未经处理的供体或未用活性剂处理(例如未处理或仅施用媒介物)或未经受诱发疾病病况的条件的细胞培养物。还可以在细胞与有待测试的剂接触前的“零时间点”获取参考样品。
本文中使用的章节标题仅仅是出于组织的目的,并且不应视为以任何方式限制所描述的主题。当术语在并入的参考文献中的定义似乎与本传授内容中提供的定义不同时,应以本传授内容中提供的定义为主。应了解,在例如温度、浓度和时间等本传授内容中所论述的量度前暗含“约”,以便轻微和非实质性的偏差在本传授内容的范围内。在本申请中,除非另外特别陈述,否则单数的使用包括复数。并且,“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”的使用不意图为限制性的。应了解以上概述及以下详细描述仅仅是例示性和说明性的,并且不限制本公开。冠词“一(a和an)”在本文中用以指一种或超过一种(即至少一种)所述冠词的语法宾语。例如,“一要素”意指一种要素或超过一种要素。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。本文中描述用于本公开中的方法和材料;还可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是例示性的,并且不意图限制。本文中提到的所有公布、专利申请、专利、序列、数据库登录和其它参考文献都以引用的方式整体并入本文中。万一发生矛盾,将以包括定义在内的本说明书为准。
在以下附图和描述中阐明本公开的一个或多个实施方案的细节。本公开的其它特征、对象和优点将从描述和图式以及从权利要求书中显而易见。
附图说明
图1i)-iii)展示使用小的双半抗原分析物在侧流试纸条上进行未稀释的检测的例示性RPA反应法。图1i)为展示在模拟RPA反应中3kDa PEG诱发的凝聚层和FAM标记的核酸定位至凝聚层的影像。图1ii)描绘了根据本公开的例示性双半抗原分析物的结构,展示生物素-FAM、生物素-DNP和通用标记结构,用于合成后连接至经氨基修饰的探针寡核苷酸。图1iii)为展示在运行缓冲液中稀释或在模拟RPA反应中未稀释下运行的双标记寡核苷酸、生物素-FAM双标记(R=OH)和生物素-FAM Fpg探针的检测的影像。
图2i)-iii)描绘了使用根据本公开的双半抗原Fpg探针在侧流试纸条上对RPA的直接分析。图2i)为示出分析物在扩增诱发下从RPA凝聚层释放和随后在侧流试纸条上检测的示意图。图2ii)为用于未稀释下RPA检测的原型测定的影像。图2iii)为并入了流量控制的干燥缀合物格式的试纸条的影像。
图3i)-iii)显示通过探针优化减少了假阳性信号。图3i)展示一种例示性侧流测定的影像,其中非特异性信号可能依赖于Fpg。图3ii)描绘了例示性Fpg双半抗原探针(标记为‘探针1’或‘rs1207445’)的发夹和自身二聚体结构。图3iii)展示含有具有减少的二级结构的例示性Fpg双半抗原探针的扩增的影像,当在侧流上分析时展现减少的假阳性信号。
图4描绘了rs1207445(基因组DNA)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,PCR产物)模板DNA的未稀释RPA检测的影像。
图5i)-ii)显示原型大肠杆菌O157:H7血清型标志物测定。图5i)为rfbEO157测定的TwistAmp Fpg荧光数据。NTC(红色)和含有10(黄色)、100(绿色)和1000(蓝色)的反应一式四份地进行。荧光反应与原型直接侧流测定相比较。图5ii)为fliCH7的TwistAmp Fpg数据与相应Fpg双半抗原探针测定的比较。
图6为显示‘连续流’侧流试纸条分析的影像。
图7为针对沙门氏菌(Salmonella)InvA标靶的TwistAmp Nfo测定的侧流分析的影像。
图8为示出双标记扩增子在侧流试纸条上未稀释下运行时的限制检测的机制的示意图。
图9展示未稀释Exo RPA LF检测的示意图。
图10展示未稀释Fpg对比Exo RPA LF。
图11展示使用Exo LF的同时进行的扩增/检测。
图12展示例示性连续流装置。
具体实施方式
本公开至少部分地基于以下发现:可在无稀释步骤下使用双半抗原探针在侧流试纸条上准确有效地检测靶核酸序列的RPA。为此,本文提供了使用双半抗原探针检测靶核酸的存在或不存在的RPA组合物。并且为此,本申请公开了使用双半抗原探针在侧流试纸条上检测靶核酸序列的方法。
虽然本公开描述了使用双半抗原探针在侧流试纸条上检测靶核酸序列的RPA组合物和方法,但熟练的技术人员将了解,所公开的方法和组合物可适合于所属领域已知的其它核酸扩增方法(例如等温核酸扩增方法)。
对核酸低成本而又快速灵敏的检测能够改进当前用于传染性疾病诊断和食品检验中的病原体检测的作法。此外,如果能够降低测定的复杂性,那么核酸扩增测试可用于资源有限和家庭使用的情况下。
已经研发出新颖的RPA Fpg(甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶)探针化学,其允许在未稀释RPA反应中对扩增产物进行侧流检测。为了克服RPA反应的粘性,研发出一类新的双半抗原标记用于Fpg RPA探针。例示性测定是基于现有的Fpg荧光测定(rs1207445人基因组基因座和空肠弯曲杆菌的16S rRNA),对这些测定加以修改以用于所述新双半抗原探针化学。然后在研发两种用于对大肠杆菌O157:H7的基因(rfbO157和fliCH7)进行血清分型的新颖单重测定的过程中应用本文公开的双半抗原探针技术。预期这些遗传标志物将鉴定出因O157:H7的复杂遗传学而导致其它NAAT可能遗漏的大肠杆菌O157:H7的形式。旨在研发出一步“样品进,结果出”核酸侧流免疫测定(NALFIA)和消耗品,用于O157:H7多重测试以用于食品卫生检验中。此外,新颖的双半抗原探针化学的通用性意味着这项技术容易应用于一大批目标物种,从而研发出非实验室测定。
在以下实施例中,新颖的核酸侧流化学施加于人基因组标靶(rs1207445)、空肠弯曲杆菌16S rDNA和重要食物病原体大肠杆菌O157:H7的两种遗传标志物。所有四个测定的测定灵敏度介于每个扩增反应10拷贝与100拷贝DNA之间。此外,与现有的RPA Nfo侧流测定法相比,所述测定需要较少的上手(hand-on)步骤。
数据表明扩增靶核酸的检测可以与RPA同时进行(‘连续流’)。这减少了测试时间(从样品到结果约30分钟)。简化的工作流程意味着连续流化学适用于低成本的一次性使用消耗品,这对于非实验室背景下的使用,例如即时检测(例如使用图12中描述的装置或其它装置)来说是理想的。
在一些情况下,本文所述的双标记寡核苷酸探针包含连接于双官能结构(例如双半抗原离去基团)的寡核苷酸。所述双官能结构可包括两个部分,例如两种半抗原,其中半抗原中的一种为第一结合对的第一成员并且第二半抗原为第二结合对的第一成员。探针被配置成在探针结合于靶核酸时,双官能结构从寡核苷酸裂解,释放双官能结构。然后可以通过多种方法,包括例如在侧流试纸条上检测此游离的双官能结构(例如游离的双标记)。
“结合对的成员”意指第一部分和第二部分中的一个,其中所述第一部分和所述第二部分对彼此具有特异性结合亲和力。适用于本公开的结合对包括(但不限于)抗原/抗体(例如地高辛/抗地高辛、二硝基苯基(DNP)/抗DNP、丹酰-X-抗丹酰、荧光素/抗荧光素、荧虾黄/抗荧虾黄、肽/抗肽、配体/受体和罗丹明/抗罗丹明)、生物素/亲和素(或生物素/抗生蛋白链菌素)和调钙蛋白结合蛋白(CBP)/调钙蛋白。其它合适的结合对包括多肽,例如FLAG-肽(DYKDDDDK)[Hopp等人,BioTechnology,6:1204 1210(1988)];KT3表位肽(Martin等人,Science 255:192 194(1992));微管蛋白表位肽(Skinner等人,J.Biol.Chem 266:1516315166(1991));以及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393 6397(1990))和它们各自的抗体。一般地,在一个优选的实施方案中,结合对搭配物中较小的一方用作可检测的标记,因为空间因素是重要的。
适合于与本发明的方法有关的扩增的核酸(例如多核苷酸)包括双链和单链核酸分子,例如DNA和RNA分子。多核苷酸可来源于基因组、染色体、质粒、线粒体、细胞和病毒核酸。对于双链多核苷酸来说,扩增可为一条链或两条链。
如这里所述,RPA采用被称为重组酶的酶,所述酶能够使寡核苷酸引物与模板双链核酸中的同源序列成对。以这种方式,DNA合成针对模板双链核酸中的指定点。使用序列特异性(例如基因特异性)引物,如果存在模板核酸,那么开始指数扩增反应。反应进展迅速,并使模板双链核酸内存在的序列在几分钟内从模板核酸仅仅几个拷贝特异性扩增至可检测水平的扩增产物。RPA方法公开于例如US 7,270,981、US 7,399,590、US 7,666,598、US7,435,561、US 2009/0029421和WO 2010/141940中,所有这些都以引用的方式并入本文中。
本文公开的组合物可含有一组使靶核酸序列扩增的引物。引物可包含与靶核酸序列互补或在一个或多个位置不同于靶核酸序列的序列。如本文所述,利用在一个或多个位置不同于靶核酸序列的引物的RPA扩增产物可在一个或多个位置不同于靶序列。本文所述的RPA反应的扩增产物可包含靶序列。
此组引物可使靶核酸序列扩增或者其可引入在一个或多个位置不同于靶核酸序列的序列。此引入的序列可由靶核酸序列组成。第一引物可与靶核酸序列互补。第二引物可包含与靶核酸序列互补的第一部分和在一个或多个位置不同于靶核酸序列的第二部分。当两种引物使核酸序列扩增时,第二引物将一个或多个不同位置并入扩增产物中。此扩增区域在一个或多个位置不同于靶核酸序列,并且可由靶序列组成。在一些情况下,扩增区域与靶核酸序列相同。
术语“第一”和“第二”仅仅是以其相对意义用于本公开。应了解,除非另作说明,否则那些术语仅仅是为了方便描述实施方案中的一个或多个实施方案而使用。术语“第一”和“第二”仅仅用于区别一个要素与另一个要素,并且所公开技术的权利范围不应该受这些术语限制。举例来说,第一要素可称为第二要素,类似地,第二要素可称为第一要素。
本文公开的RPA组合物含有可来源于原核、病毒或真核来源的重组酶。例示性重组酶包括RecA和UvsX(例如从任何物种获得的RecA蛋白或UvsX蛋白)和其片段或突变体以及它们的组合。可以从任何物种获得RecA和UvsX蛋白。RecA和UvsX片段或突变蛋白还可能使用可利用的RecA和UvsS蛋白和核酸序列以及分子生物学技术产生(参见例如美国专利No.8,071,308中描述的UvsX的突变形式)。例示性UvsX蛋白包括源自于以下的UvsX蛋白:肌尾噬菌体科(myoviridae)噬菌体,例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40;不动杆菌属(Acinetobacter)噬菌体133、气单胞菌属(Aeromonas)噬菌体65、噬蓝藻体(cyanophage)P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属(Vibrio)噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。其它例示性重组酶蛋白质包括古细菌RADA和RADB蛋白以及真核(例如植物、哺乳动物和真菌)Rad51蛋白(例如RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、DMC1、XRCC2、XRCC3和recA)(参见例如Lin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:10328-10333,2006)。
在本公开的任何方法中,重组酶(例如UvsX)可以是突变或杂交重组酶。在一些实施方案中,突变UvsX为在Rb69 UvsX氨基酸序列中包括至少一个突变的Rb69 UvsX,其中突变选自由以下组成的组:(a)在位置64上氨基酸不是组氨酸、在位置64上氨基酸不是丝氨酸、一个或多个谷氨酸残基添加在C端、一个或多个天冬氨酸残基添加在C端以及它们的组合。在其它实施方案中,突变UvsX为在T6 UvsX氨基酸序列中具有至少一个突变的T6 UvsX,其中突变选自由以下组成的组:(a)在位置66上氨基酸不是组氨酸;(b)在位置66上为丝氨酸;(c)一个或多个谷氨酸残基添加在C端;(d)一个或多个天冬氨酸残基添加在C端;以及(e)它们的组合。在使用杂交重组酶蛋白质的情况下,杂交蛋白可以例如为包括至少一个包括源自于不同UvsX物种的氨基酸序列的区域的UvsX蛋白。所述区域可为例如UvsX的DNA结合环-2区域。
本文公开的DNA聚合酶可为真核或原核聚合酶。真核聚合酶的实例包括pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε以及其突变体或片段或它们的组合。原核聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I(例如克列诺片段(Klenow fragment))、噬菌体T4 gp43 DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶I大片段、Phi-29 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)Pol I、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Pol I、大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、大肠杆菌DNA聚合酶IV、大肠杆菌DNA聚合酶V和其突变体或片段或它们的组合。在一些实施方案中,DNA聚合酶缺乏3'-5'核酸外切酶活性。在一些实施方案中,DNA聚合酶具有链置换特性,例如pol I或pol V类原核聚合酶的大片段。
在一些实施方案中,一个或多个探针(例如分子信标探针)经可具有免疫原性的可检测标记进行双标记。在一些情况下,可检测标记为半抗原。探针上的两个半抗原可为相同的,或其可为不同的。在一些情况下,可检测标记之一为结合对的一个成员。本文所述的探针可以用半抗原、酶、酶底物、辅酶、酶抑制剂、荧光团、猝灭剂、发色团、磁粉或磁珠、氧化还原灵敏部分(例如电化学活性部分)、发光标志物、放射性同位素(包括放射性核苷酸)和结合对的成员。更特定实例包括荧光素、藻胆蛋白、四乙基罗丹明和β-半乳糖苷酶。结合对可包括生物素/抗生蛋白链菌素、生物素/亲和素、生物素/中性亲和素、生物素/凯普亲和素(captavidin)、表位/抗体、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-标签/金属(例如镍、钴或铜)、抗原/抗体、FLAG/M1抗体、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、调钙蛋白结合蛋白/调钙蛋白、酶-酶底物、受体-配体结合对以及结合对的类似物和突变体。
如本文所用,术语“半抗原”是指与结合搭配物,例如针对其产生的抗体特异性反应的免疫原性小分子。用于本文提供的方法中的半抗原包括例如地高辛、荧光素、二硝基苯基、谷胱甘肽和生物素。本文所述的半抗原还可能包括例如免疫原性基团。在一些情况下,免疫原性基团包含荧光基团、酶或其片段、肽或其片段或者生物素。在一些情况下,免疫原性基团选自包含生物素、荧光素、地高辛或二硝基苯基的清单。
如本文所用,术语“荧光标记”和“荧光团”可互换使用,并且是指当用不同波长(激发波长)的放射线照射时发射一定波长(发射波长)的电磁能的任何物质,并且意图涵盖能够与样品中所关注的分析物特异性相互作用或反应从而提供一个或多个光信号的化学或生物化学分子或其片段。
用于本文提供的方法中的代表性荧光团包括例如FAM、(四甲基罗丹明)TexasRedTM、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹磺酰氯(DNS-C1)、5-(碘乙酰胺)荧光素(5-IAF)、6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基氯(NBD-Cl)、溴化乙锭、荧虾黄、罗丹明染料(5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明-B-异硫氰酸盐(RITC)、罗丹明800);四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸盐(TRITC))、Texas RedTM、磺酰氯、萘胺磺酸(包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽酸基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、Texas red-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、萘基苯乙烯基、3,3'二丙基硫二羰花青(diS-C3-(5))、4-(对二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶鎓盐(di-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸盐、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、酞菁铝、噁嗪1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙锭同二聚体、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉盐(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、植物荧光素(phytofiuors)、晕苯以及金属-配体络合物。
应注意,荧光猝灭剂也被视为可检测的标记。举例来说,荧光猝灭剂可与荧光染料接触并检测猝灭的量。
本文所述的实施方案还可能会包括能够使具体的靶核酸序列裂解的剂或核酸酶。如本文所用,术语“核酸酶”是指能够催化核酸水解,使核酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键裂解的酶。“限制核酸酶”是靶向被称为限制位点的特异性识别核苷酸序列处或附近的核酸分子并使所述核酸分子裂解的核酸酶。核酸酶可以进一步分成核酸内切酶(即,使多核苷酸链内部的磷酸二酯键裂解的酶)和核酸外切酶(即,通过从多核苷酸链的末端(外部)开始使核苷酸一次一个地裂解而起作用的酶),不过一些酶可能属于两种类别。核酸酶可为天然存在的限制性核酸内切酶或人工核酸内切酶。
在一些情况下,本文所述的双半抗原探针被配置成在寡核苷酸探针与互补核苷酸序列杂交时由甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶(“fpg”)裂解,从而释放双半抗原离去基团(例如双标记)。在一些情况下,核酸酶为甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶。
在一些实施方案中,本文中提供了能够由核酸外切酶(例如Exo III)裂解的半抗原(例如双半抗原或更高阶半抗原)探针。在一些实施方案中,寡核苷酸探针具有结构5'X(n)aL(n)bH(n)cB3',其中n为核苷酸,a、b和c为整数,X为5'己基或半抗原,H为THF残基,B为C3间隔子,并且L为包含多个半抗原的支链修饰子。在一些实施方案中,举例来说,半抗原为DNP和生物素,不过可利用其它半抗原(例如FAM)。在一些实施方案中,寡核苷酸探针包含介于半抗原之间的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,a和c为1至50个核苷酸并且b为0至50个核苷酸。在一些实施方案中,a和c为至少15个核苷酸。在一些实施方案中,b为零。在一些实施方案中,a大约为15并且c大约为30。在一些实施方案中,寡核苷酸探针与靶核酸互补。在一些实施方案中,L代替胞嘧啶核苷酸。探针的其它细节描述于以下实施例16中。
在含有靶扩增子的RPA反应中,Exo III使探针的无碱基残基H裂解,并且随后ExoIII进行3'-5'消化,释放出经两个不同半抗原标记的单核苷酸L(具有5'-磷酸酯和3'-OH)。所述经双半抗原标记的单核苷酸自由地离开RPA凝聚层,并与LF试纸的目测颗粒和测试线上的抗体相互作用。
另外,一种或多种单链DNA结合蛋白可用于在反应中进行的多种交换反应期间稳定核酸。一种或多种单链DNA结合蛋白可源自于或获自任何物种,例如原核、病毒或真核物种。非限制性例示性单链DNA结合蛋白包括大肠杆菌SSB和源自于以下的DNA结合蛋白:肌尾噬菌体科噬菌体,例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40;不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。单链DNA结合蛋白的其它实例包括反硝化无色杆菌Alide_2047、泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)BthaB_33951、苍白普雷沃菌(Prevotellapallens)HMPREF9144_0124和真核单链DNA结合蛋白复制蛋白A。
本公开的任一方法可以在拥挤剂存在下进行。在一些实施方案中,拥挤剂可包括聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚苯乙烯、Ficoll、葡聚糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)和白蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中,拥挤剂具有小于200,000道尔顿的分子量。此外,拥挤剂可例如以约0.5%至约15%重量:体积(w/v)的量存在。在一些情况下,拥挤剂为PEG。
在一些情况下,拥挤剂具有至少1千道尔顿、至少2千道尔顿、至少3千道尔顿、至少4千道尔顿、至少5千道尔顿、至少6千道尔顿、至少8千道尔顿或至少10千道尔顿的分子量。
在一些情况下,拥挤剂以至少15%v/v的浓度、至少12%v/v的浓度、至少10%v/v的浓度、至少8%v/v的浓度、至少6%v/v、至少5%v/v的浓度、至少4%v/v的浓度或至少3%v/v的浓度存在于组合物中。
在一些情况下,拥挤剂在20℃下具有小于或等于5mPa/s、小于或等于4mPa/s、小于或等于3mPa/s、小于或等于2mPa/s或小于或等于1mPa/s的粘度概况。
在一些情况下,拥挤剂为具有3千道尔顿的分子量和6.5%的最终浓度的PEG。在一些情况下,拥挤剂为PEG并且在20℃下具有小于或等于3mPa/s的粘度。
如果使用重组酶装载蛋白,那么重组酶装载蛋白可源于原核、病毒或真核来源。例示性重组酶装载蛋白包括大肠杆菌RecO、大肠杆菌RecR、UvsY和其突变体或片段或它们的组合。例示性UvsY蛋白包括源自于以下的UvsY蛋白:肌尾噬菌体科噬菌体,例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40;不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3和噬菌体LZ2。在本公开的任一方法中,重组酶装载剂可源自于肌尾噬菌体科噬菌体。肌尾噬菌体科噬菌体可为例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌属噬菌体133、气单胞菌属噬菌体65、噬蓝藻体P-SSM2、噬蓝藻体PSSM4、噬蓝藻体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌属噬菌体25、弧菌属噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3或噬菌体LZ2。
此外,本公开的任一方法可以用受阻引物进行。受阻引物为不容许在聚合酶下延长的引物。在使用受阻引物的情况下,解除阻断剂可用于解除引物阻断以允许延长。解除阻断剂可为能够使阻断基团从引物裂解的核酸内切酶或核酸外切酶。例示性解除阻断剂包括大肠杆菌核酸外切酶III和大肠杆菌核酸内切酶IV。
本公开的方法包括检测靶核酸序列,其中靶核酸可包括限制性核酸内切酶或核酸酶的天然切割位点。另外,切割位点可通过用在一个或多个位置不同于靶核酸序列的引物扩增靶序列而引入靶核酸序列中。人工切割位点或在靶核酸序列中未发现的切割位点的引入可用于检测靶核酸序列或者检测靶核酸序列中SNP的存在。
本文所述的方法还能够使用多种限制性核酸内切酶或本文所述的核酸酶同时进行。扩增产物的检测能够同时进行并且将扩增速率与参考样品相比较。本文所述的方法能够用于检测靶序列或对序列进行基因分型。
在一些实施方案中,监测核酸扩增产物的增加可包括随时间测定反应混合物中扩增产物的数目或比例,或测定例如双半抗原或游离的双半抗原/标记的双标记的数目或比例。
在一些实施方案中,双半抗原能够用眼睛检测。在一些实施方案中,使用荧光、相差显微术、发光检测、光谱(颜色)检测、磁性检测、放射性同位素的检测和/或电化学检测来检测双半抗原标记。本领域的技术人员将了解,本领域中已知的测量混合物中的核酸扩增产物的量的任何技术都能够用于检测扩增产物和监测扩增产物随时间的增加。在本文所述的一些RPA方法中,可检测的标记可以用于监测RPA反应的进展(扩增产物的产生)。
本文公开的方法和组合物可用于例如检测靶核酸序列。本公开还能够鉴定与野生型等位基因相比包含SNP的变异等位基因。在一些情况下,此SNP可能与具体的疾病状态或诊断(例如镰状细胞贫血的诊断或肿瘤或癌症的诊断)有关或与耐药性或感病性有关。本文所述的等温扩增反应法和组合物允许快速检测靶序列和/或其中相关的多态现象。
实施例
实施例1:侧流试纸条材料和制造
从Fisher或Sigma购买用于配制缓冲液的试剂和化学品。
除非另有说明,否则使用Prima 40硝化纤维(GE)、粘性衬纸(HF000MC100,Millipore)和CF5吸收垫材料(GE)制备侧流试纸条。对于连续流实验,测试的额外吸液垫材料包括CF6(GE)和320级厚重纤维素(Ahlstrom)。通过使用Amicon Ultra 10k MWCO离心浓缩器,根据制造商的说明书,将存储缓冲液更换成10mM磷酸钠pH 7.4+0.005%Triton X100来制备抗DNP(MAB2223,Millipore)和抗FAM(MIF2902,Thermo Fisher)单克隆抗体和抗小鼠多克隆抗体(A16162,Novex)以用于分配。将纯化抗体点样至预切试纸条(0.5μg/条)上,或使用Biodot ZX1010分配平台以1μg/cm膜的比率分配至膜上。在分层前膜或打点的试纸条在强风型烘箱中在40℃下干燥1小时。
除非另有说明,否则通过用与衬纸(预切至300mm×45mm)的一个长边齐平的300mm×25mm抗FAM/抗DNP膜进行分层来制备试纸条叠层。然后CF5吸收材料的300mm×22mm试纸条分层,与衬纸的顶边齐平,使得吸液垫与膜重叠2mm。然后使用Biodot CM5000闸刀将分层的纸切成5mm×45mm的条。在使用前将切成的条存储在干燥器中于室温下。
在采用缀合垫的情况下,金缀合物通过在9000x g下离心20分钟进行缓冲液更换,去除上清液,并且金在50mM Borax、10%蔗糖、1%酪蛋白和0.5%Brij-35中复原成原始体积。使用Biodot ZX1010分配器以3μl/cm的比率将缀合物喷雾至玻璃纤维条(GFDX103000,Millipore)上。然后在分层前金缀合垫在40℃下干燥2小时。
实施例2:抗生物素缀合至20nm金胶体
使用AbPure BSA去除试剂盒(Innova Biosciences),根据制造商的说明书,制备单克隆抗生物素(ab201341,Abcam)用于缀合。使用InnovaCoat金20nm试剂盒(InnovaBiosciences),还根据制造商的说明书,使纯化的抗生物素缀合至金;例外是在缀合步骤中抗生物素以0.5mg/ml存在。除非如上所述喷雾至缀合垫,否则典型地对着RPA反应加入抗生物素金。
实施例3:寡核苷酸和探针标记
从Eurogentec获得寡核苷酸引物和未标记的Fpg侧流探针;购买在无碱基dR位点具有氨基修饰并且在3'末端具有C3间隔子修饰的未标记的探针。从LGC Biosearch获得所有荧光Fpg探针。
实施例4:双半抗原标记和寡核苷酸标记的合成
从Merck购买Fmoc-Lys(Mtt))-王树脂(Wang resin)。从Anaspec购买定性茚三酮试验试剂盒。从Fisher Scientific购买用于HPLC的二氯甲烷(DCM)、肽合成级N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻(PyBOP)、N-甲基吗啉(NMM)、哌啶、D-生物素、三异丙基硅烷(TIS)、5(6)-羧基荧光素、甲醇、甲酸、乙腈、乙醚、三乙胺(TEA);乙酸、NaHCO3、NaOH、2,4-二硝基氟苯和四氟硼酸N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-丁二酰亚胺基)脲盐(TSTU)。从Sigma-Aldrich购买用于LCMS的三氟乙酸(TFA)、N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、Nε-DNP-L-Lys、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、N,N-二异丙基乙胺(DiPEA)、三乙胺(TEA);以及用于LCMS的水。二甲亚砜(DMSO)来自于AppliChem。HCl和丙酮来自于VWR。Millipore水用于合成和脱盐;HPLC级水用于HPLC纯化。NAP-10大小排除(SE)柱来自于GE。从Iris Biotech购买N-羟基丁二酰亚胺基生物素(生物素-OSu)。
在具有Agilent 6410B三联四极ESI-MS的Agilent 1200LC系统上进行LCMS分析。所有LC方法均采用Agilent Eclipse Plus C18,3.5μm,室温下3.0×150mm柱;所有引用产率均基于254nm下的吸光度。LC溶剂:A=水+0.1%甲酸;B=乙腈+0.1%甲酸;C=200mMHFIP、4mM TEA水溶液;D=甲醇。LC方法:1(溶剂A和B)=25分钟内5至95%B,然后95%B历时5分钟;2(溶剂C和D)=3分钟内20%D,然后5分钟内20至30%D,然后7分钟内30至50%D,然后5分钟内50至60%D,然后1分钟内60至80%D,然后1分钟内80%D。
在Agilent 1100/1200LC系统上进行标记寡核苷酸的RP-HPLC纯化,所述系统装有洗脱份收集器,和具有Oligo-RP保护滤筒的Phenomenex Clarity 10u Oligo-RP 250×4.6mm柱(AJO-8135,Phenomenex)。LC溶剂A=甲醇;B=50mM TEAA pH 7.4中5%v/v乙腈。用于纯化的LC法:5分钟内5%B;35分钟内5至50%B;5分钟内50至60%B。在254nm以及494nm(用于Bio-FAM标记)或360nm(用于Bio-DNP标记)下记录色谱图。
最终标记寡核苷酸使用Thermo-Fisher NanoDrop 2000在260nm下定量,假定对于Bio-FAM标记,ε260=20960M-1cm-1,并且对于Bio-DNP标记,忽视ε260。使用装有BrukerAvance控制台的Oxford 400MHz磁体进行NMR分析;d6-DMSO(99.9%原子D)来自于Sigma-Aldrich。
实施例5:Bio-FAM双半抗原标记的固相合成
使用标准固相合成技术(W.C.Chan和P.D.White,Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis,W.C.Chan和P.D.White,Oxford University Press,Oxford,2000,第3章,第41-76页),从Fmoc-Lys(Mtt)-王树脂开始,合成(D-)Bio-(L-)Lys(5(6)FAM)-OH。具体地说,用DCM使树脂(0.25g,0.57mmol/g装载)膨胀1小时,然后测试小的样品以证实不存在游离胺(定性茚三酮试验)。使用含20%v/v哌啶的DMF(2×6分钟)去除Fmoc保护基,并且将树脂先后用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤,然后进行定性茚三酮试验,证实存在游离胺。在声波处理下将D-生物素(3当量)用DMF(4.3mL)中PyBOP(3当量)和NMM(5当量)活化4分钟,然后与树脂在60℃下反应38分钟;随后用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。树脂样品的茚三酮试验证实不存在游离胺,然后用DCM中1%v/v TFA、5%v/v TIS脱除保护基30分钟(2次),随后用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤。树脂样品的茚三酮试验显示游离胺。将5(6)-羧基荧光素(3当量)用DMF(4.3mL)中PyBOP(3当量)和NMM(5当量)活化10秒,然后与树脂在60℃下反应38分钟;随后用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。将树脂用DMF中20%v/v哌啶处理(2×10分钟)以使荧光素二聚体裂解,然后将树脂先后用DMF(3次)、DCM(3次)和MeOH(3次)洗涤;将洗涤过的树脂弄干并存储在制冷机(约5℃)下过夜。为了获得游离标记,使树脂在DCM中膨胀(2小时),然后在室温下用2.5mL 90/2.5/2.5v/v/v TFA/TIS/H2O使膨胀的树脂近二分之一裂解2小时,用TFA(2×1mL)洗涤。将组合的裂解混合物和TFA洗涤液在玻璃圆底烧瓶中真空干燥,然后转移至具有DCM洗涤液的5mL艾本德管(Eppendorf tube)中,用Ar(g)吹扫,并且在加入冰冷乙醚(4.5mL)后黄色固体沉淀,并通过离心形成小球。丢弃上清液,并将小球用乙醚(2×4.5mL)以离心的方式洗涤。获得30mg(58%产率)黄色固体。产物的LCMS(方法1)表明纯度良好(90%,tR 11.85min);ESI-MS(+m/z):731.3(100%,[M+H]+)。制备游离标记的2.05mMDMSO溶液,进一步用水稀释,以供采用释放Bio-FAM标记的侧流研究用。
实施例6:Bio-FAM标记连接至经氨基修饰的FPG探针
在黑暗中将Bio-FAM双标记(5mg,6.8μmol)用DCC(2.1mg,10μmol)和NHS(1.2mg,10μmol)活化3h,然后用甲醇稀释反应混合物的样品,并通过LCMS(方法1)来分析,LCMS表明存在Bio-FAM NHS酯,产率21%(tR 12.97min;ESI-MS(+m/z):828.8(9%,[M+H]+)。在3.5h的反应时间后,将10μL活化混合物加入约1mM的经氨基修饰的探针寡核苷酸(rs1207445)的水溶液(20μL)与1M pH 9NaHCO3水溶液(10μL)的混合物中。将标记混合物旋转,声波处理10分钟,旋转,然后在室温下在黑暗中静置过夜。然后通过NAP-10SE柱使混合物脱盐,通过RP-HPLC(目标tR 29.78min)来纯化,并且将目标洗脱份真空浓缩,通过NAP-10SE脱盐,并在真空中进一步浓缩,得到190μL 13.4μM目标Bio-FAM标记的寡核苷酸的溶液(产率25%)。标记的寡核苷酸通过LCMS(方法2)表征;纯度94%,tR 11.58min,ESI-MS(-):要求值11584.4,实验值11584.4。UV-Vis表征(Thermo-Fisher NanoDrop 2000)揭露在259nm和496nm处的吸收峰,符合FAM标记的DNA寡核苷酸。
实施例7:Bio-DNP双半抗原标记的溶液相合成
使用如上针对Bio-FAM标记所述的标准固相合成技术,使用2,4-二硝基氟苯(3当量)和DiPEA(4当量)在DMF(4.3mL)中并入DNP部分代替FAM来合成(D-)Bio-(L-)Lys(DNP)-OH。然而,研发一种改良的溶液相合成,如这里所述。具体地说,使生物素-OSu(602μmol,1.05当量)和Nε-DNP-L-Lys(1当量)悬浮在DMF(5.7mL)和DiPEA(0.25mL)中,并且声波处理30分钟,获得透明溶液,然后在室温下搅拌。2h后,在反应混合物中观察到沉淀,在室温下搅拌过夜,然后过滤(通过2×Whatman编号1滤纸),用丙酮(10mL)和乙醚(130mL)洗涤,收集到黄色固体(244mg)。通过将有机洗涤物合并,并加入另外的乙醚(100mL),获得第二批黄色固体(30mg),然后如上过滤并用另外的乙醚(100mL)洗涤。将两批目标标记的DiPEA盐合并,并溶于0.5M NaOH水溶液(5mL)中,得到深橙黄色溶液,然后加入1M HCl水溶液(5mL),使得甲酸目标呈黄色固体状沉淀。使混合物在冰上冷却,然后通过抽吸过滤来收集固体(通过2×Whatman编号1滤纸),先后用冰冷的1M HCl水溶液(2×25mL)、H2O(2×25mL)和乙醚(650mL)洗涤。将洗涤物丢弃,并在真空中干燥黄色固体,获得目标,产率优良(0.41mmol,72%)。LCMS(方法1)97%纯度,tR 13.71min,ESI-MS(+m/z):539.2(18%,[M+H]+).;1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δH 12.51(br s,1H,OH),8.88(d,1H,J=5.8Hz,NH-Ar),8.86(d,1H,J=2.7Hz,Ar-H3),8.25(dd,1H,J=9.7,2.6Hz,Ar-H5),8.05(d,1H,J=7.8Hz,NHC(O)CH2),7.22(d,1H,J=9.7Hz,Ar-H6),6.38(d,2H,J=16.2Hz,NHC(O)NH),4.29(dd,1H,J=7.5,5.0Hz,CH(CH2)S),4.20-4.10(m,2H,CHCO2H,NHCHCH(R)S),3.52-3.43(m,2H,CH2 NHAr),3.10-3.06(m,1H,NHCHCH(R)S),2.80(dd,1H,J=12.4,5.0Hz,CH(H)S),2.56(d,1H,J=12.4Hz,CH(H)S),2.11(t,2H,NHC(O)CH2 ),1.78-1.25(m,12H,6×CH2 )。
实施例8:Bio-DNP标记连接至经氨基修饰的FPG探针
将Bio-DNP双标记(10mg,18.6μmol)用TSTU(8.4mg,27.9μmol)和DiPEA(9.7μL,27.9μmol)活化8分钟,然后用乙腈稀释反应混合物的样品并通过LCMS(方法1)分析,LCMS表明存在Bio-DNP NHS酯,产率为19%(tR 15.09min;ESI-MS(+m/z):636.3(9%,[M+H]+)。在1.5h的反应时间后,将10μL活化混合物加入约1mM的经氨基修饰的探针寡核苷酸(rs1207445)的水溶液(20μL)与1M pH 9NaHCO3水溶液(10μL)的混合物中。将标记混合物旋转,声波处理10分钟,然后在室温下在黑暗中静置过夜。然后通过NAP-10SE柱使混合物脱盐,通过RP-HPLC(目标tR 31.10min)来纯化,并且将目标洗脱份真空浓缩,通过NAP-10SE脱盐,并在真空中进一步浓缩,得到470μL 7.1μM目标Bio-DNP标记的寡核苷酸的溶液(产率17%)。标记的寡核苷酸通过LCMS(方法2)表征;纯度90%,tR 10.48min:ESI-MS(-):需要值11392.4,实验值11392.2。
实施例9:RPA条件
除非另有说明,否则所有RPA反应均在40℃下孵育20分钟。用于侧流的RPA制剂(Fpg)含有各420nM的适当正向和反向引物、120nM双半抗原Fpg探针、50mM Tris乙酸盐pH8.3、100mM KOAc、5mM DTT、1x肌酸激酶、30μg Gp32、30μg UvsX、7μg UvsY、6.5%3kDa PEG、5.7%海藻糖、8.6μg DNA聚合酶I(金黄色葡萄球菌)、9.48μg Fpg、1x E-混合物、1.8mMdNTP和0.5%Brij-35。通过加入含有适当模板和Mg(OAc)2(22.5mM最终浓度)的混合物至100μl的最终体积,开始反应。
除Gp32(28μg/反应)和聚合酶(12.8μg/反应)外,Nfo RPA反应制剂与Fpg相同。另外,Fpg替换为Nfo(核酸内切酶IV;4.6μg/反应)。
使用市售TwistAmp Fpg试剂盒,根据制造商说明书,在T8仪器(Axxin)上进行荧光Fpg反应。反应在40℃下孵育20分钟。
实施例10:侧流试纸条检测
除非另有说明,否则1.5μl抗生物素金直接加入完成的RPA反应中并加入侧流试纸条。使试纸条吸液20分钟,然后在室温下干燥10分钟。去除吸收垫和玻璃纤维缀合垫(适当时)并扫描试纸条。
通过在70μl PCRD萃取缓冲液中稀释5μl扩增子,在PCRD条(Abingdon Health)上进行稀释检测。根据制造商说明书,在PCRD装置上加工整个75μl。
实施例11:侧流试纸条上新颖分析物的未稀释检测
迄今为止,已经使用市售NALFIA条,如Milenia Hybridetect条、Abingdon HealthPCRD条和UStar装置联合TwistAmp Nfo化学实现了在侧流装置上对RPA产物的检测,TwistAmp Nfo化学产生双半抗原标记的扩增子,所述扩增子包含各连接至单股核酸的标记,这些标记杂交,形成可以通过夹心侧流免疫测定检测的双半抗原标记。虽然在灵敏度和特异性方面,这项技术的性能与基于荧光探针的方法相当,但最终用户必须首先稀释高粘性的扩增子,以允许标记沿着测定试纸条迁移,从而允许在此类侧流试纸条上成功地测定扩增产物(图8)。图8中展示了示出双标记扩增子在侧流试纸条上未稀释下运行时的限制检测的机制的示意图。TwistAmp Nfo反应含有3'封阻的半抗原标记的探针(含有内部四氢呋喃(THF)残基)、半抗原标记的反向引物和核酸内切酶IV(Nfo)。在该研究中,探针典型地用生物素标记,而反向引物用DNP或FAM标记。在扩增后,生物素标记的探针结合于新合成的经DNP/FAM标记的链。一旦探针结合,Nfo就使位于THF残基5'的磷酸二酯键裂解(步骤1)。切割探针用作延长探针的链置换聚合酶的引物,有效地去除3'封阻(步骤2)。因此,连续数轮的RPA产生双半抗原标记的扩增子(步骤3)。然而,相信除非对反应进行稀释,否则大部分分析物仍然螯合在RPA凝聚层中(步骤4),使得其基本上不能结合在测试线上,引起假阴性/弱真阳性测试线信号。
本公开提供了最终用户用于进行侧流测定的方式,其具有数目减少的上手步骤,特别是没有稀释步骤,而稀释步骤是直接从RPA扩增子混合物成功进行侧流分离(直接检测)所需的。
最初,在没有稀释下直接在侧流装置上分析RPA证明是不成功的。标准RPA扩增混合物中使用的高浓度的35kDa PEG意味着反应太粘而无法完全吸液,并且相当大部分的金胶体聚集在试纸条的近端。本公开提供了一种改良的RPA混合物,其被设计成能减轻在使用35kDa PEG时所观察到的作用。修改的RPA混合物利用低分子量PEG作为拥挤剂(6.5%3kDaPEG)以及0.5%v/v Brij-35,这大大地提高了金胶体迁移通过硝化纤维素膜。虽然市售TwistAmp Nfo化学(其包含35kDa PEG)允许对扩增子进行一定程度的检测,但一旦在商业上或内部生产的现有的侧流测定试纸条上用运行缓冲液适当地稀释其,那么相比于当低分子量PEG(6.5%3kDa PEG)Nfo RPA在未稀释下在试纸条上运行时的NTC,在含有1,000拷贝模板的RPA反应中对测试点的可检测信号的刺激很小(图7)。
图7中示出针对沙门氏菌InvA标靶的TwistAmp Nfo测定的侧流分析。TwistAmpNfo反应(NTC和每个反应1,000拷贝模板DNA;TwistAmp Nfo反应含有35kDa PEG)。在商业侧流试纸条(PCRD,左图)和内部生产的抗FAM试纸条(中图)上分析在运行缓冲液中1/50稀释的RPA。同时,在相同批次的抗FAM试纸条上分析未稀释的3kDa PEG RPA反应(右图)。
为了确定双半抗原标记是否将更适用于侧流试纸条上未稀释下的直接检测,在试纸条上进行分析前,将三类分析物外加至TBST(从0至120nM)或外加至含有在6.5%3kDaPEG中的所有RPA组分的模拟RPA反应中。三类分析物为:1)在5'和3'末端分别用FAM和生物素标记的28聚体寡核苷酸,用于模拟半抗原标记的扩增子;2)新颖的Bio-FAM双半抗原探针;3)Fpg探针,其中无碱基dR基团用Bio-FAM双半抗原标记。重要的是,当外加至缓冲液中时,在类似的程度上检测到所有三种分析物,其中对最低浓度的测试分析物(约1nM)观察到正信号。当针对经过外加的模拟RPA在未稀释下进行检测时,在缺乏分析物下运行的试纸条显示一些微弱的非特异性信号。对于双标记寡核苷酸和双半抗原Fpg探针,直至120nM分析物,同样观察到弱信号。然而,仅仅对于游离的双半抗原分析物,观察到对比阴性样品,对测试线信号的显著刺激(图1iii)。这些数据符合如下假设:小的标记可以用于未稀释下RPA产物在侧流试纸条上的检测,而标记的核酸标记(从现有的商业Nfo RPA反应释放)不容易检测到,因为这类大体积探针位于RPA凝聚层内,这限制了在侧流试纸条上检测此类标记的可用性。
实施例12:侧流试纸条上RPA的直接检测
为了使用双半抗原分析物检测RPA,需要标记有效地螯合,直至发生扩增。因此,购买具有经氨基修饰的内部dR无碱基位点的针对rs1207445标靶的Fpg探针,所述探针可以缀合于双半抗原标记(rs1207445探针1)。在RPA期间,探针与扩增子杂交,此时通过βδ消除,Fpg使dR基团的5'和3'的无碱基位点裂解(图2i),步骤1),释放双半抗原标记(图2i),步骤2)。由于其尺寸小,所以双半抗原分析物自由地从RPA凝聚层逃脱(图2i),步骤3),因此可以在侧流试纸条上通过夹心免疫测定检测其(图2i),步骤4)。重要的是,未加工的探针(理论上可检测,因为其与两种半抗原偶合)很可能螯合在RPA凝聚层中,使得其在没有发生扩增的RPA反应中基本上无法检测到。此作用通过以下事实例示:外加至模拟RPA反应中的纯探针不如游离标记易检测(图1iii)。
为了获得Fpg双半抗原探针可用于侧流上RPA的直接终点检测的原理验证,一式四份地进行含有rs1207445双半抗原探针(探针1)的针对10、100和1,000拷贝/反应的人gDNA(加NTC)的低分子量PEG RPA反应。加入1.5μl抗生物素金,并将试纸条下垂至扩增子/金混合物中。虽然在NTC反应中观察到一些非特异性信号,但在含有10拷贝模板的RPA的4个复制品中的2个中观察到测试线信号的微小刺激。在每个反应含有≥100拷贝gDNA的所有反应中观察到对比NTC的测试线信号的强烈刺激(图2ii)。这些初步数据表明新的Fpg探针化学允许在侧流试纸条上在未稀释下检测RPA产物。
许多商业NALFIA条通过将胶体干燥至络合垫中来将检测络合物并入试纸条中。此外,大部分试纸条还包括流量控制线,其用于证实试纸条有效地吸液。为了确定是否可以产生用于直接检测并入了这些特征的RPA的试纸条,试纸条镶有抗DNP测试线、抗小鼠流量控制线(结合绕过测试线的任何缀合物)和含有干燥的抗生物素金胶体的玻璃纤维缀合垫。然后在1000拷贝的人gDNA缺乏或存在下进行rs1207445测定,然后一旦完成反应,就将试纸条直接下垂至RPA中。在所有情况下,如流量控制线处的强烈信号所证明,观察到有效流量。类似于先前观察到的,在阴性扩增中在抗DNP测试线处观察到一些弱的非特异性信号;然而,对比不含模板的扩增,在阳性扩增中观察到测试线信号的显著刺激(图2iii)。
综上所述,这些数据表明新的双半抗原Fpg探针可用于RPA产物在侧流试纸条上未稀释下的直接检测。
实施例13:探针设计对阴性RPA反应中假阳性信号的作用
在一些阴性反应中可用眼睛观察到非特异性信号;然而,如果利用数码读数器(此类装置通常用于商业侧流测定),那么测试设备可以被配置成通过图像分析算法减去背景信号。如果测定试纸条将用于资源有限的背景下,那么需要用眼睛目测测定试纸条,在这样的情况下需要能够将测试线上的非特异性信号减至最小,以减少用户可能对结果的错误判断。
如果使用试纸条读数器分析侧流试纸条,那么在阴性反应中观察到非特异性信号的事实不一定是问题,因为可在任何分析中减去背景信号。然而,如果试纸条将用于资源匮乏的背景下,那么需要能够用眼睛目测试纸条,在这样的情况下不太希望测试线上存在非特异性信号。因此,通过在Fpg存在或缺乏下进行rs1207445的低分子量PEG Fpg RPA反应来确定假阳性信号的原因,以确定噪音是由寡核苷酸探针直接结合于测试线引起还是由Fpg酶对探针的异常加工引起。在Fpg存在下,在NTC反应中rs1207445RPA显示假阳性信号,其中在含有1,000拷贝的人基因组DNA模板的反应中在测试线信号中有刺激。在缺乏Fpg下进行的反应显示在NTC反应中显著减少的非特异性信号(并且在含有1,000拷贝的模板DNA的反应中没有扩增),这表明了rs1207445双半抗原探针正在异常地进行加工,引起了假阳性信号(图3i)。在一些情况下,在缺乏Fpg下一些非特异性信号仍然存在,并且通过将膜封阻可以有效地去除此信号。
为了确定Fpg依赖性非特异性信号的原因,使用NetPrimer(可获自http:// www.premierbiosoft.com/netprimer/)或OligoAnalyser 3.1程序(IDT;可获自https:// eu.idtdna.com/calc/analyzer),针对发夹、引物/探针和探针/探针二聚体对rs1207445双半抗原Fpg探针序列进行分析。这些分析揭露了探针可形成弱的发夹结构(ΔG=-7.9kcal/mol)和强的自身二聚体(ΔG=-14.19kcal/mol)。在两种情况下,dR基团(图3ii中以红色突出显示)处于双链环境下,因此可充当Fpg酶的底物,这为在NTC RPA反应中为何存在Fpg依赖性噪音提供了潜在的解释。
设计两个新的rs1207445探针:1)探针1模型,此探针具有与探针1相同的序列并且形成相同结构。然而,无碱基位点现在位于假定的双链区外部,并且不应被Fpg加工;2)探针2,此双半抗原探针被设计成能与rs1207445扩增子内的不同区域杂交。对比探针1和探针1模型,此探针显示减少的发夹(ΔG=-2.07kcal/mol)和自身二聚体形成(ΔG=-8.05kcal/mol)。此外,dR基团位于任何双链环境之外,并且不应用作Fpg的底物(图3ii和iii)。
为了确定改良的探针设计是否可在维持在阳性扩增中检测RPA的能力的同时减少阴性扩增中的非特异性信号,在侧流试纸条上在未稀释下检测在三种探针存在下NTC和阳性(含有1000拷贝的人gDNA)RPA反应。所有的阳性反应都显示在阴性扩增上测试线信号的显著刺激,这表明RPA如所预期地进行(图3iii)。rs1207445探针1显示阴性扩增中最高的背景信号。在含有探针1模型的阴性扩增中几乎未检测到非特异性信号,并且在含有探针2的反应中非特异性信号不明显(图3iii)。因此,通过设计不形成二级结构、自身二聚体或交叉二聚体或降低形成二级结构、自身二聚体或交叉二聚体的可能性的探针可有效地减少或消除阴性扩增中的非特异性信号。在一些情况下,无法避免这些结构,并且无碱基位点应位于任何双链环境之外。
实施例14:在侧流上RPA的直接检测-对其它标靶的分析灵敏度和适用性
对Fpg双半抗原探针直接检测RPA进行进一步例证。最初比较rs1207445测定和用于空肠弯曲杆菌的另一现有的内部测定。空肠弯曲杆菌测定利用先前设计的靶向16S rRNA的引物,其中唯一的修饰是现有的Fpg探针序列替换为被设计用于直接侧流检测的新的双半抗原标记的探针。
在两个实例中,一式四份地进行低分子量PEG RPA,其中反应含有10、100或1,000拷贝的适当的模板DNA(rs1207445和弯曲杆菌属测定分别使用人gDNA和合成16S空肠弯曲杆菌rDNA模板)。然后在抗DNP侧流试纸条上在未稀释下分析RPA产物。在改良的rs1207445测定(利用rs1207445探针2)中,在NTC反应中测试线上未观察到信号。测试线微弱,但存在于含有10拷贝模板DNA的所有RPA中(图4i上以绿色概述);在试纸条边缘处更明显),其中在含有≥100拷贝的人gDNA的所有RPA反应的试纸条上观察到优良信号(图4i)。
在空肠弯曲杆菌测定中,在所有NTC中存在弱假阳性信号(应注意,此探针未针对侧流重新设计,其展现一些微小的二级结构和自身二聚)。然而,在含有≥10拷贝模板DNA的所有扩增中观察到极强烈的测试线信号(图4ii)。
综上所述,这些数据表明侧流试纸条的检测仅仅受扩增反应的成功与否限制;两种情况下使用相同的改良的RPA化学用于直接检测侧流测定。此外,数据显示改良的Fpg探针化学可应用于大范围的用于检测靶核酸的RPA工艺。此类改良的技术容易应用于许多潜在的标靶,预期分析灵敏度等同于其它的商业NAAT测定格式。虽然在空肠弯曲杆菌测定中观察到一些假阳性信号,但预期可以通过谨慎选择探针核苷酸序列以使自身二聚体/二级结构形成的可能性减至最小的方法来减少此类观察结果;如在用于rs1207445的测定中的修正探针下所观察。
对改良的直接检测侧流技术进行进一步例证。制备用于检测大肠杆菌O157:H7的新颖RPA引物和探针。这类测定可用于食品检验,能够使用粪便样品快速诊断疾病。研发出可用于鉴定血清型标志物基因(rfbO157)和(fliCH7)的RPA侧流测定,这些标志物基因代表大肠杆菌O157:H7的所有菌株中的高度保守区域。最初设计新研发的RPA测定作为单重测试,将来有机会在生物化学上进行多重测试(使用分别用Bio-DNP和Bio-FAM双半抗原标记进行标记的Fpg探针,因为此类探针可以在侧流试纸条上在不同的捕获线上独立地检测)。
使用TwistAmp Fpg荧光探针测定(含有5.5%35kDa PEG),使用等温T8仪器,对所有引物/探针组合针对大肠杆菌血清型进行初步筛选,意图发现展现每反应约10拷贝的分析灵敏度,具有快速扩增动力学的引物/探针组合(10拷贝下开始时间<6分钟,具有高的最大荧光)。然后在荧光测定中性能最佳的探针经过修饰,用作低分子量PEG RPA中的双半抗原Fpg探针,用于直接测定侧流(在荧光测定与侧流测定之间引物是相同的)。
图5i)展示新颖的rfbO157荧光Fpg测定(35kDa PEG)与在侧流试纸条上在未稀释下对低分子量PEG RPA反应的直接检测的测定的比较。在所有复制品中在10拷贝模板DNA(定量合成DNA)下荧光探针测定(使用35kDa PEG)展现超过NTC基线(以红色表示)的信号。如所预期,含有100拷贝(绿色)和1,000拷贝(蓝色)的所有反应都是阳性的,其中开始时间和最大荧光与每个反应模板DNA的量极为相关。在直接侧流测定中,在四个复制品中的三个中,在10拷贝模板DNA下观察到阳性测试线信号(含有≥100拷贝模板的所有复制品都是强烈阳性的)。未在NTC中观察到明显的假阳性信号,这进一步说明优良的探针设计可消除此类假象(因为在大肠杆菌的检测中还利用与用于rs1207445测定相同的试纸条化学)。
图5ii)展示与直接侧流方法相比单重fliCH7荧光探针的性能。再次,在测试的所有复制品中,荧光探针测定展示强烈扩增至10拷贝(黄色),其中最大荧光和开始时间与反应中存在的定量合成DNA模板的拷贝的量非常相关。在Fpg双半抗原侧流测定中,在四个复制品中的三个中在10拷贝下观察到弱信号,其中一个复制品的信号更强。在fliCH7测定的所有NTC中观察到极弱假阳性;然而,此类非特异性信号可以如先前所说明,通过进一步迭代探针设计和使用封阻试剂来消除。
这些数据说明新颖双半抗原Fpg探针化学的通用性,并且展示灵敏的测定可以针对重要的病原体相对容易地进行设计,实现与现有的商业荧光Fpg测定相比可比较的测定灵敏度。
实施例15:提高的Fpg双半抗原侧流测定的易用性-‘连续流’
RPA产物在未稀释下的直接的检测可降低测定消耗品的复杂性,由此降低制造成本,同时使测试程序对于最终用户来说更简单。本公开可使用Fpg双半抗原侧流RPA测定将测试时间从大约40分钟减少至30分钟或更少时间,取决于所需测定灵敏度。
进行可行性研究以证明在整个扩增循环中RPA反应中存在侧流测定试纸条的益处。反应体积从100μl增加至200μl,以适应在发生显著扩增前混合物开始沿着试纸条迁移的事实。最初,在扩增前抗生物素金胶体标记直接放入RPA反应混合物中,以防止在扩增子堆积前缀合物从垫释放。评估不同的特别重的吸液垫材料(对照材料:CF5,中等重量的纤维素纤维;实验材料:CF6和320级,特别重的纤维素),以增加可以在试纸条上加工的反应体积。用覆盖胶带将测定试纸条分层,以在进行RPA测定时帮助防止吸液垫从装置分层。
使用rs1207445Fpg双半抗原(Bio-DNP)测定,使用200μl用于侧流测定的冻干的RPA小球(3kDa PEG)建立概念验证。用含有0或5000拷贝模板DNA加1.5μl抗生物素金胶体以及具有由CF5(对照)、CF6或320级特别重的垫制成的吸液芯的抗DNP试纸条的缓冲液容器使小球水合;将所有反应混合物立即加入每一侧流试纸条,在40℃下孵育30分钟。
图6中,由所指示的吸收垫材料制成的试纸条在扩增期间在RPA反应中孵育。所示数据是针对rs1207445双半抗原Fpg测定,NTC反应与含有5000拷贝模板DNA的反应相比。
在对照(CF5)试纸条中,在所有NTC反应中观察到极强的假阳性信号,其中仅仅在5000拷贝输入模板DNA下测试线有微小的刺激(图6i),顶图)。然而,虽然CF6试纸条发出一些假阳性信号(比对照试纸条弱),但当使用320级试纸条时有效地消除了假阳性反应。预计这是由320级材料的床体积大引起的,与CF5或CF6材料相比较,这可具有提高的毛细管作用。与CF5试纸条相比,分析物可更容易地流过基于320级材料的试纸条,由此减少非特异性相互作用发生可利用的时间量。此外,在含有模板DNA的扩增中测试线信号中刺激显著(图6,底图)。
实施例16:Exo探针设计
本实施例描述了核酸外切酶III(Exo)可裂解探针的一种例示性探针设计。一种例示性探针结构显示如下。以下序列为示例探针;所述序列被设计成能与扩增的靶DNA互补。
5'-XAAATTTCTACTTTTGGCCAGTTCTACAATTTGTTLHATATCACATGGATGTB-3'(SEQ IDNO:1)
其中:
X=5'己基
H=THF残基
B=C3间隔子(3'-5'核酸酶消化的封阻)
L=包含DNP TEG和生物素己基的支链修饰子;介于DNP TEG与生物素己基部分之间的硫代磷酸酯(PS)键可以用以确保半抗原间键的稳定性。
探针设计有3'封阻B(例如C3间隔子,例如丙醇),预防探针的不必要的核酸酶消化。支链修饰子L并入无碱基THF残基H的5'-侧。在以上实施例中,L紧邻H的5',但L可能在5'方向上从H开始进一步延长。THF残基上游具有大约30nt的互补序列并且在下游具有大约15nt互补序列。
L表示经修饰的胞嘧啶(C)核碱基,因而将替换探针序列中的C残基。L是在固相寡核苷酸合成期间使用具有以下结构(LGC LINK(Teddington,UK)项目号2150)的市售氨基磷酸酯并入的:
在正常的固相DNA寡核苷酸合成过程中,并入此氨基磷酸酯;将寡核苷酸的5'-OH脱除保护基(去除DMTr保护基),然后用5'封阻X(例如C6,例如己基)封端,接着去除与以上描绘的经修饰的胞嘧啶的环外胺附加的乙酰丙酸保护基,这释放羟基,允许将具有其它氨基磷酸酯的胞嘧啶核碱基进一步分支延长。并入了半抗原的氨基酯,例如DNP TEG(下图顶部,LGC LINK项目号2549)、然后生物素(‘Bio’)己基(下图底部,LGC LINK项目号2109),得到在支链修饰子L处经半抗原双标记的探针。
在含有靶扩增子的RPA反应中,Exo III使探针的无碱基残基H裂解,并且随后ExoIII消化3'-5',释放出经两个不同半抗原标记的单核苷酸L(具有5'-磷酸酯和3'-OH)。所述经双半抗原标记的单核苷酸自由地离开RPA凝聚层,并与LF试纸的目测颗粒和测试线上的抗体相互作用。
所述的Exo探针设计允许使用市售的氨基磷酸酯将不同半抗原呈模块并入支链位点L上。Bio/DNP、Bio/FAM和FAM/DNP标记都是可能的;半抗原连接至L的胞嘧啶核碱基的次序也可以自由转换。最后,如果需要第三个不同的半抗原结合并且过滤未加工的探针,那么半抗原(例如DNP/FAM/BIO)可以用作探针的5'-帽X,代替例如己基。如果以上描绘的DNP-TEG氨基磷酸酯用作5'-帽,那么利用额外的脱除保护基和封端步骤来去除DMTr基团并用例如己基封阻所得到5'-OH。
图9展示Exo探针的例示性结构和其使用。左图展示Fpg探针分析物与Exo探针分析物的比较-Exo探针具有经DNP TEG和生物素己基标记的位于四氢呋喃残基上游一个核苷酸处的乙酰丙酸基dC支链修饰子。右图展示在RPA中分析物如何产生的预期机制。当探针结合扩增子的互补链时,Exo在THF处切割,然后使用3'核酸外切酶活性往后啃,释放生物素/DNP标记的胞嘧啶,然后在试纸条上检测(使用抗DNP测试线和抗生物素金胶体或其它纳米粒子)。
反应制剂
简单地说,将Exo LF RPA反应在40℃下孵育20分钟。用于侧流的RPA制剂(Exo)含有各420nM的适当正向和反向引物、120nM双半抗原Exo探针、50mM Tris乙酸盐pH 8.3、100mM KOAc、5mM DTT、1x肌酸激酶、30μg Gp32、30μg UvsX、7μg UvsY、6.5%3kDa PEG、5.7%海藻糖、8.6μg DNA聚合酶I(金黄色葡萄球菌)、10μg核酸外切酶III、50mM磷酸肌酸、2.5mM ATP、1.8mM dNTP和0.5%Brij-35。通过加入含有适当模板和Mg(OAc)2(22.5mM最终浓度)的混合物至100μl的最终体积,开始反应。
连续流-一步RPA侧流
Exo LF探针化学的高灵敏度允许用于‘连续流’系统,其中同时进行RPA核酸扩增和试纸条检测,这可将从加入模板至出结果的时间减少至大约5分钟(针对低输入DNA拷贝数,为求最佳灵敏度,为20-30分钟)。为使此可行,侧流试纸条应比单独未稀释的RPA LF系统中加工更多的分析物-对比用于终点检测试纸条中的CF5材料,这可通过使用特别重的吸收垫材料(例如320级棉绒(Ahlstrom))实现。不仅此材料允许更多的分析物在试纸条上流动,而且其似乎增加流速,对比其它垫类型,这减少了非特异性信号。试纸条还涵盖覆盖带,它帮助减少分层;分层在使用厚重的吸收垫时是常见的。
除了减少出结果的时间以外,总体上连续流系统的益处为:1)不需要加工/稀释扩增反应(降低污染风险,简化潜在消耗品射流);2)减少消耗品射流(本质上消耗品是RPA发生的加热室,其直接接触侧流试纸条)。
图10显示在以上实施例中所述的两个大肠杆菌测定中使用上述未稀释的Exo LF化学的数据并与上述Fpg测定相比(数字表明输入DNA复制数;NTC=无模板对照)。再次,在扩增后加入试纸条。Exo测定展现较高灵敏度和强烈测试线信号。信号显现比Fpg化学快得多。另外,虽然仍然有一些假阳性信号,但比Fpg设置改良得多。
图11展示使用Exo探针化学的同时进行的扩增/检测。同时进行的扩增和检测具有出结果的时间更快(20-30分钟)并且另外使消耗品设计更简单的益处。图10中的数据展示终点检测与连续流的比较。在两者之间观察到类似的灵敏度。在连续流中假阳性信号更强,这可能是因为存在覆盖带。
图12展示用于一步RPA侧流的例示性装置。所述装置具有测定试剂的反应室和在扩增期间用于检测的试纸条室。在图12中所示的装置中,在反应室与试纸条室之间存在允许在两个室之间流动的通道。在一些实施方案中,室装有含有RPA组分的冻干小球。加入模板DNA、缓冲液以及将室放在40℃下的加热块上,开始扩增。在一些实施方案中,室装有用于混合的磁性搅拌器。当反应抬高试纸条时,发生扩增,产生测试线信号。
其它实施方案
应了解虽然本公开已经结合其详细描述进行了描述,但上述描述意图说明而非限制本公开的范围,本公开的范围是由随附权利要求书的范围界定的。其它的方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 艾利尔圣迭戈公司(ALERE SAN DIEGO INC.)
<120> 使用双半抗原探针的对重组酶聚合酶扩增的检测
<130> ALERE-35632/WO-1/ORD
<150> 62/558,705
<151> 2017-09-14
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 扁嘴海雀(Synthliboramphus antiquus)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=5'己基
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n=包含DNP TEG和生物素己基的支链修饰子
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n=THF残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> n=C3间隔子
<400> 1
naaatttcta cttttggcca gttctacaat ttgttnnata tcacatggat gtn 53
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 扁嘴海雀(Synthliboramphus antiquus)
<400> 2
cagtgcccaa tacacacaca caagactggg catgg 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 扁嘴海雀(Synthliboramphus antiquus)
<400> 3
ggtacgggtc agaacacaca cacataaccc gtgac 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 扁嘴海雀(Synthliboramphus antiquus)
<400> 4
gggcatggtt tctgttccca ccagctagat tgcag 35
Claims (56)
1.一种重组酶聚合酶扩增组合物,所述重组酶聚合酶扩增组合物包含:
拥挤剂;
具有双半抗原离去基团的寡核苷酸探针;和
核酸酶。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述拥挤剂包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Ficoll或葡聚糖。
3.如权利要求1或2所述的组合物,其中所述拥挤剂具有至少1千道尔顿、至少2千道尔顿、至少3千道尔顿、至少4千道尔顿、至少5千道尔顿、至少6千道尔顿、至少8千道尔顿或至少10千道尔顿的分子量。
4.如权利要求1至3所述的组合物,其中所述拥挤剂以至少15%v/v的浓度、至少12%v/v的浓度、至少10%v/v的浓度、至少8%v/v的浓度、至少6%v/v、至少5%v/v的浓度、至少4%v/v的浓度或至少3%v/v的浓度存在于所述组合物中。
5.如权利要求1至4所述的组合物,其中所述拥挤剂在20℃下具有小于或等于5mPa/s、小于或等于4mPa/s、小于或等于3mPa/s、小于或等于2mPa/s或者小于或等于1mPa/s的粘度概况。
6.如权利要求1至5所述的组合物,其中所述拥挤剂为在20℃下具有小于或等于3mPa/s的粘度的PEG。
7.如权利要求1至6所述的组合物,其中所述拥挤剂为具有3千道尔顿的分子量的PEG,并且其中所述PEG浓度为6.5%v/v。
8.如权利要求1所述的组合物,其中所述寡核苷酸探针包含缺少将所述离去基团连接至所述寡核苷酸的碱基的dR-O-[C]n核苷酸。
9.如权利要求1所述的组合物,其中所述核酸酶为甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶。
10.如权利要求1至9所述的组合物,其中所述具有双半抗原的寡核苷酸探针在所述寡核苷酸探针与互补核苷酸序列杂交时由甲酰胺基嘧啶DNA糖苷酶裂解,释放所述双半抗原离去基团。
11.如权利要求1所述的组合物,其中所述双半抗原离去基团包含两个具有不同表位的免疫原性基团。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所述免疫原性基团包括荧光基团、酶或其片段、肽或其片段、生物素。
13.如权利要求12所述的组合物,其中所述免疫原性基团选自包括生物素、荧光素、地高辛或二硝基苯基的组。
14.如权利要求1所述的组合物,其中所述寡核苷酸探针能够由核酸外切酶裂解,并且其中所述寡核苷酸在裂解时释放所述双半抗原离去基团。
15.如权利要求14所述的组合物,其中所述核酸外切酶为核酸外切酶III。
16.如权利要求14所述的组合物,其中所述寡核苷酸探针具有结构5'X(n)aL(n)bH(n)cB3',其中n为核苷酸,a、b和c为整数,X为5'己基,H为THF残基,B为C3间隔子,并且L为包含多个半抗原的支链修饰子。
17.如权利要求16所述的组合物,其中所述半抗原选自由DNP、FAM和生物素组成的组。
18.如权利要求16所述的组合物,其中所述寡核苷酸探针包含介于所述半抗原之间的硫代磷酸酯键。
19.如权利要求16所述的组合物,其中所述C3间隔子为丙醇。
24.一种组合物,所述组合物包含:
半抗原1和半抗原2为根据权利要求22或23的免疫原性基团;
Z选自:(i)在RNA或DNA寡核苷酸的情形下分别无碱基核糖或脱氧核糖环的C1';在异头碳原子处具有β-构型;(ii)被配置用于连接于DNA或RNA寡核苷酸的氨基磷酸酯化合物;并且其中当Z为DNA或RNA氨基磷酸酯时,半抗原1和半抗原2的反应基团可任选地经特戊酰基、叔丁基苯甲酰基、酰基、苯甲酰基或异丁酰基保护;
R表示氢,或直链或支链C1至C6烷基;
X1、X2和X4为连接基团,所述基团可独立地不存在,或为可任选地插有一个或多个-O-、-C(=O)-或-NR-基团的直链或支链C1至C12烷基;
X3为直链或支链C1至C6烷基;并且
X5为任选地插有一个或多个-O-、-C(=O)-或-NR-基团的直链或支链C1至C12烷基。
25.一种装置,所述装置包括:
侧流试纸条,所述侧流试纸条包括:
样品施加区;
在所述样品施加区的下游并且与所述样品施加区处于流体连通中的试剂区,所述试剂区包含用于扩增靶核酸的干燥的RPA试剂组合物、对扩增的靶核酸产物具有特异性的结合剂和检测分子;
在所述试剂区的下游并且与所述试剂区处于流体连通中的至少一个测试区,所述测试区包含对所述扩增的靶核酸产物具有特异性的固定的捕获分子;以及
在所述测试区的下游的对照区。
26.如权利要求25所述的装置,其中所述干燥的RPA试剂组合物包含拥挤剂、重组酶、聚合酶、核酸酶、双半抗原探针和检测分子。
27.如权利要求26所述的装置,其中所述双半抗原探针包含生物素与羧基荧光素(FAM)或生物素与二硝基苯基(DNP)的缀合物。
28.如权利要求25所述的装置,其中所述对所述扩增的靶核酸具有特异性的固定的捕获分子选自由抗FAM捕获分子或抗DNP捕获分子组成的组。
29.如权利要求28所述的装置,其中所述抗FAM或所述抗DNP独立地选自由以下组成的组:多克隆抗体、单克隆抗体以及它们的包括FAB、ScFv、Fv或DAB在内的功能结合片段。
30.如权利要求25所述的装置,其中所述检测分子选自由以下组成的组:金溶胶、银溶胶、乳胶溶胶、纤维素纳米珠或碳纳米线以及抗生物素捕获分子。
31.如权利要求25所述的装置,其中所述对照区包含指示所述侧流试纸条的正确操作的结合区。
32.如权利要求25所述的装置,其中所述对照区包含抗小鼠抗体捕获线。
33.一种检测扩增产物的方法,所述方法包括:
使怀疑含有所关注的靶核酸的样品与用于扩增所述靶核酸的RPA试剂、包含与所述靶核酸互补的核酸序列和共价连接的双半抗原离去基团的寡核苷酸探针以及核酸酶接触;
对所述靶核酸进行扩增以产生靶核酸产物;以及
通过检测从与所述靶核酸杂交的所述寡核苷酸探针裂解的游离双半抗原部分来检测所述靶核酸产物。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述RPA试剂位于侧流试纸条的样品施加区上。
35.如权利要求33所述的方法,其中在所述样品与所述RPA试剂接触形成核酸扩增混合物后在所述侧流试纸条上进行核酸扩增。
36.如权利要求33所述的方法,其中在其它液体未稀释所述RPA混合物或未将其它液体加入所述RPA混合物的情况下在所述侧流试纸条上进行核酸扩增。
37.如权利要求33所述的方法,其中在所述侧流上的位于所述样品施加区下游的测试区选择性地捕获从所述寡核苷酸探针裂解的所述双半抗原部分。
38.如权利要求33至37所述的方法,其中在所述侧流试纸条上的测试区不选择性地捕获包含共价连接的双半抗原的寡核苷酸探针。
39.如权利要求33至38中任一项所述的方法,其中所述侧流试纸条包含测试区和对照区,其中所述测试区包含用于捕获从寡核苷酸裂解的双半抗原的结合对成员,并且所述对照区包含用于内部对照的结合对成员。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述对照区包含抗小鼠抗体或其片段。
41.如权利要求39所述的方法,其中所述测试区包含抗DNP捕获分子或抗FAM捕获分子。
42.如权利要求40所述的方法,其中所述抗FAM捕获分子选自由单克隆抗体、多克隆抗体和它们的功能结合片段组成的组。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述抗DNP捕获分子选自由单克隆抗体、多克隆抗体或它们的功能结合片段组成的组。
44.如权利要求33至43所述的方法,其中检测扩增产物包括在测试区中捕获双半抗原离去基团以及用检测分子标记所捕获的双半抗原离去基团。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述检测分子选自由以下组成的组:金溶胶、银溶胶、乳胶溶胶、纤维素纳米珠和碳纳米线。
46.一种方法,所述方法包括:
将怀疑含有靶核酸的样品施加至侧流试纸条;
使所述样品与干燥至所述侧流试纸条的试剂区上的用于扩增所述靶核酸的RPA试剂混合物接触;以及
如果存在扩增产物,那么在所述侧流试纸条的测试区上检测所述扩增产物。
47.如权利要求46所述的方法,其中将所述怀疑含有靶核酸的样品施加至侧流试纸条的施加区。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述RPA试剂混合物包含拥挤剂、重组酶、聚合酶、核酸酶和双半抗原寡核苷酸探针。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述拥挤剂选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Ficoll和葡聚糖。
50.如权利要求48或49所述的方法,其中所述拥挤剂具有至少1千道尔顿、至少2千道尔顿、至少3千道尔顿、至少4千道尔顿、至少5千道尔顿、至少6千道尔顿、至少8千道尔顿或至少10千道尔顿的分子量。
51.如权利要求49或50所述的方法,其中所述拥挤剂以至少15%v/v的浓度、至少12%v/v最终浓度、至少10%v/v、至少8%v/v、至少6%v/v、至少5%v/v、至少4%v/v或至少3%v/v最终浓度存在于所述混合物中。
52.如权利要求46至51中任一项所述的方法,其中所述拥挤剂在20℃下具有小于或等于5mPa/s、小于或等于4mPa/s、小于或等于3mPa/s、小于或等于2mPa/s或者小于或等于1mPa/s的粘度概况。
53.如权利要求46所述的方法,其中所述拥挤剂为PEG并且在20℃下具有小于或等于3mPa/s的粘度。
54.如权利要求46所述的方法,其中所述拥挤剂为包含3千道尔顿的分子量的PEG,并且其中所述PEG的最终浓度为6.5%v/v。
55.如权利要求48所述的方法,其中如果存在扩增产物,那么检测所述扩增产物包括检测从与所述扩增产物杂交的所述寡核苷酸探针裂解的双半抗原部分。
56.如权利要求46所述的方法,其中在检测扩增产物前不需要稀释所述RPA混合物。
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