CN112342272A - 一种基于dna纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器 - Google Patents

一种基于dna纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，包括银纳米簇、序列如SEQ ID NO:1‑3所示的DNA 1、DNA 2、DNA 3，DNA 2序列中包括二硫键。本发明基于目标物的特异性识别，实现trigger的释放，引发HCR，实现荧光强度的放大，从而构建了荧光生物传感器。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点，可以弥补谷胱甘肽现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

Description

一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器。
背景技术
谷胱甘肽是一种含Y-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。：大量研究表明，它是一种抗氧化应激和维持氧化还原稳态的中间体，而氧化还原稳态对细胞生长和功能至关重要，其水平与某些疾病和癌症直接相关。
高灵敏、高效、高特异性检测谷胱甘肽活性对于基础生物医学研究以及相关临床诊断应用具有重要意义，目前报道的检测谷胱甘肽的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、电化学发光(ECL)法和质谱分析法，然而，这些方法往往存在操作繁琐、设备复杂、灵敏度低等不足。因此急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对谷胱甘肽进行检测。近几年，DNA生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注。其中，荧光技术的基础理论研究日益成熟，它在生物学、医学等领域所扮演的角色越来越重要。相对于其他检测手段，荧光技术具有显著的优势，灵敏度高、特异性强、价格低廉。
发明内容
解决以上现有技术检测谷胱甘肽的操作繁琐、设备复杂、灵敏度低的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，包括纳米银簇（AgCN）、序列分别如SEQ ID No: 1-3所示的DNA 1、DNA 2、DNA 3，所述DNA 2序列的第30和31位碱基间通过二硫键连接。
所述纳米银簇通过在溶液中硼氢化钠0-4℃下还原硝酸银获得。
一种上述生物传感器在检测谷胱甘肽中的应用。
一种含有上述生物传感器的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒中还包括系列浓度谷胱甘肽标准溶液。
上述生物传感器或试剂盒检测谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
（1）将DNA 1、DNA 2、DNA 3杂交成三环模板；
（2）将三环模板分别与系列浓度谷胱甘肽标准品的溶液或待测溶液反应，获得反应液；
（3）反应液中依次加入AgNO3溶液和NaHBO4溶液反应，获得DNA-纳米银簇溶液；
（4）检测DNA-纳米银簇溶液的荧光强度，根据系列浓度谷胱甘肽标准品的溶液的荧光强度做标准曲线，计算待测溶液中谷胱甘肽浓度。
步骤（1）中，所述DNA 1、DNA 2、DNA 3按照摩尔比1:1:1在缓冲液中37 ℃，反应90min。
步骤（3）中，AgNO3和NaHBO4的摩尔比为1:1。
步骤（4）中，荧光检测的激发波长为574 nm，发射波长为644 nm。
本发明的检测原理如下：
传感器中使用的DNA 1、DNA 2、DNA 3序列如下所示：
DNA 1（SEQ ID No: 1）：
GAATGCTGCGTGTAATCCGTCTGTCC TTTTTTTTTT GGTGTCTAAGTCCCAGAATTCACTTAGACACCCTT CT；
DNA 2（SEQ ID No: 2）：
GAGTACTAGAGGAACACGCAGCATTCACTTs-sAGAAGGGTGTCTAAGT；
DNA 3（SEQ ID No: 3）：
GGACAGACGGATTTCCTCTAGTACTC TTTTTTTTTTT GAATTCTGGGACTTAGACACCAGAAGGGTGTCTAAGTCCCACCCACCCGCCCAA。
传感器中的DNA1单下划线部分与DNA2单下划线部分互补配对，DNA1双下划线部分与DNA3双下划线部分互补配对，DNA2曲线部分与DNA3曲线部分互补配对，从而形成三环模板。其中DNA1和DNA3斜体部分，是spacer。当有目标物的时候，二硫键断裂，加粗部分会从DNA2上释放下来，形成trigger链，并与DNA1的曲线部分互补配对，从而打开DNA1的发夹部分。DNA1的虚线部分与DNA3的曲线部分互补配对，打开DNA3中的发夹部分；DNA3的加粗部分又与DNA1曲线部分杂交，进而进行HCR反应，HCR产物含DNA3的虚线部分，从而引发银簇的合成，通过检测荧光的强度检测谷胱甘肽的浓度。
本发明具有以下优点：
本发明的传感器利用目标物的特异性识别，实现trigger链的释放，引发HCR。HCR产物暴露出银簇的序列，合成银簇。放大检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物谷胱甘肽的超灵敏检测；检测限可达到2×10-8 M，检测限低。该传感器的构建简单，性能稳定，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有灵敏度高、响应快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中低廉的要求。适用于谷胱甘肽检测和生物传感器产业化的实际应用。
本发明基于目标物的特异性识别，实现trigger的释放，引发HCR。实现荧光强度的放大，从而构建了荧光生物传感器。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点，可以弥补谷胱甘肽现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
图1为本发明生物传感器的原理图；
图2为反应时间优化检测结果图；
图3为DNA1浓度优化检测结果图；
图4为DNA3浓度优化检测结果图；
图5为生物传感器对不同浓度谷胱甘肽荧光扫描；
图6为不同浓度谷胱甘肽的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 反应时间的筛选
（1）在2 μL 无菌水中加入DNA1（2 μL，100 μM）、DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）与5×PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得浓度为20 μM的三环模板；
（2）取6支1mL的EP管，分别依次加入5×PBS buffer（pH 7.4，2 μL），三环模板（5 μL，20μM），谷胱甘肽（1μL，1 mM），混合并在37 ℃下分别孵育40 min、50 min、60 min、70 min、80min、90 min，发生HCR反应，获得产物；
（3）取6支1mL的EP管，依次加入PB缓冲液（76μL，pH 6.5，20mM），15μL步骤（2）产物，AgNO3溶液（4.5μL，2mM），震荡1min，于0-4℃下反应30min；然后分别加入4.5μL NaHBO4溶液（2mM），震荡1min，于0-4℃下反应4h，获得DNA-AgCN；
（4）设定激发波长为574 nm，发射波长为644 nm进行荧光检测。
结果如图2所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应时间的延长而增大，当反应时间超过90 min后，荧光强度趋于稳定，因此选择反应时间为90 min。
实施例2 DNA浓度变化的筛选
（1）在2 μL 无菌水中加入浓度为50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM的DNA1（2μL）分别与DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）、5×PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得不同浓度的三环模板；
（2）取6支1mL的EP管，分别依次加入5×PBS buffer（pH 7.4，2 μL），步骤（1）获得的三环模板（5 μL），谷胱甘肽（1μL，1 mM），混合并在37 ℃下分别孵育90 min，发生HCR反应，获得产物；
（3）取6支1mL的EP管，依次加入PB缓冲液（76μL，pH 6.5，20mM），15μL步骤（2）产物，AgNO3溶液（4.5μL，2mM），震荡1min，于0-4℃下反应30min；然后各管中分别加入4.5μLNaHBO4溶液（2mM），震荡1min，于0-4℃下反应4h，获得DNA-AgCN；
（4）设定激发波长为574 nm，发射波长为644 nm进行荧光检测。
结果如图3所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着DNA1浓度的增大而增大，当DNA1浓度100 μM时，荧光强度趋于稳定。所以最佳的DNA 1浓度为100 μM。
同样的方法，筛选DNA3的最佳浓度，固定步骤（1）中DNA1的浓度为100 μM，结果如如图4所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着DNA 3浓度的增大而增大，当DNA3浓度100 μM时，荧光强度趋于稳定。所以最佳的DNA 3浓度为100 μM。
实施例3 生物传感器对谷胱甘肽的检测
（1）在2 μL 无菌水中加入DNA1（2 μL，100 μM）、DNA2（2 μL，100 μM）、DNA3（2 μL，100 μM）与5×PBS buffer（2 μL）混合，37 ℃，反应90 min，获得浓度为20 μM的三环模板；
（2）取7支1mL的EP管，分别依次加入5×PBS buffer（pH 7.4，2 μL），三环模板（5 μL，20μM），系列浓度谷胱甘肽溶液（1μL，使得在荧光检测体系中的终浓度分别为0 M，1×10-8 M、1×10-7 M、1×10-6 M、1×10-5 M、1×10-4 M、1×10-3 M），混合并在37 ℃下分别孵育40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，发生HCR反应，获得产物；
（3）取7支1mL的EP管，依次加入PB缓冲液（76μL，pH 6.5，20mM），15μL步骤（2）产物，AgNO3溶液（4.5μL，2mM），震荡1min，于0-4℃下反应30min；然后各管中分别加入4.5μLNaHBO4溶液（2mM），震荡1min，于0-4℃下反应4h，获得DNA-AgCN；
（4）设定激发波长为574 nm，发射波长为644 nm进行荧光检测。
结果如图5所示，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着谷胱甘肽浓度增加逐渐增强。以荧光强度为纵坐标，以谷胱甘肽浓度为横坐标作图，如图6所示，获得回归方程为y= 1295.2956+ 120.46x，相关系数为0.9997，由此计算优化后的生物传感器的检测限为2.0×10−8 M。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器
<130> 20200928
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA 1
<400> 1
gaatgctgcg tgtaatccgt ctgtcctttt ttttttggtg tctaagtccc agaattcact 60
tagacaccct tct 73
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA 2
<400> 2
gagtactaga ggaacacgca gcattcactt agaagggtgt ctaagt 46
<210> 3
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA 3
<400> 3
ggacagacgg atttcctcta gtactctttt tttttttgaa ttctgggact tagacaccag 60
aagggtgtct aagtcccacc cacccgccca a 91

Claims (9)

1.一种基于DNA纳米机器检测谷胱甘肽的生物传感器，其特征在于，包括纳米银簇，序列分别如SEQ ID No: 1-3所示的DNA 1、DNA 2、DNA 3，所述DNA 2序列的第30和31位碱基间通过二硫键连接。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述纳米银簇通过在溶液中硼氢化钠0-4℃下还原硝酸银获得。
3.一种权利要求1或2所述的生物传感器在检测谷胱甘肽中的应用。
4.一种含有权利要求1或2所述的生物传感器的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括系列浓度谷胱甘肽标准溶液。
6.一种利用权利要求1或2所述的生物传感器或权利要求4-5任一所述的试剂盒检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将DNA 1、DNA 2、DNA 3杂交成三环模板；
（2）将三环模板分别与系列浓度谷胱甘肽标准品的溶液或待测溶液反应，获得反应液；
（3）反应液中依次加入AgNO3溶液和NaHBO4溶液反应，获得DNA-纳米银簇溶液；
（4）检测DNA-纳米银簇溶液的荧光强度，根据系列浓度谷胱甘肽标准品的溶液的荧光强度做标准曲线，计算待测溶液中谷胱甘肽浓度。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA 1、DNA 2、DNA 3按照摩尔比1:1:1在缓冲液中37 ℃反应90 min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，AgNO3和NaHBO4的摩尔比为1:1。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，荧光检测的激发波长为574nm，发射波长为644 nm。
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