CN103547685B

CN103547685B - 用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法

Info

Publication number: CN103547685B
Application number: CN201280024827.5A
Authority: CN
Inventors: J.A.约翰逊
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: JP2014519822A; CN103547685A; US20120301874A1; US9816142B2; EP2714929B1; US20150218622A1; US9034581B2; JP6117775B2; US20150218624A1; US20150218623A1; US9816143B2; CA2831182C; WO2012159768A1; EP2714929A1; US9816144B2; ES2572930T3; CA2831182A1

Abstract

本发明涉及用于快速检测生物或非生物样品中金黄色葡萄球菌的存在或不存在的方法。本发明包括检测方法，其包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，本发明涉及设计用于检测金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒。

Description

用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法

发明领域

本发明涉及微生物诊断领域，并且更具体而言，涉及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）检测领域。

发明背景

金黄色葡萄球菌（“SA”）是兼性厌氧、革兰氏阳性菌，其自然储库包括人皮肤和鼻子，并且还可居住于伤口。大多数携带金黄色葡萄球菌的人未显示感染征兆；然而，如果正常屏障被突破，则金黄色葡萄球菌可以变得侵袭性并且在体内引起感染。金黄色葡萄球菌可以引起许多病，范围从较小的皮肤感染例如丘疹、疔疮和脓肿到重大疾病例如肺炎、脑膜炎和败血症。当屏障被突破时，除皮肤和鼻子外的组织可以受感染，例如皮肤或粘膜衬里，这导致疖和痈。金黄色葡萄球菌感染可以通过与受感染个人的皮肤接触或与由受感染个人使用的物体接触在人之间传播。

金黄色葡萄球菌具有惊人的发展对主要抗生素包括青霉素（甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林）的抗性的能力，其已赢得 “超级细菌”的标记。甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌（MRSA）是已变得对青霉素抗性的细菌，并且它负责几种难以治疗的人感染。MRSA也可以被称为苯唑西林抗性金黄色葡萄球菌（ORSA）和多重抗性金黄色葡萄球菌，而金黄色葡萄球菌的非甲氧西林抗性株有时被称为甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌（MSSA）。

金黄色葡萄球菌感染的诊断可以包括患者症状的医生评估，其通常不是确定性的，因为感染可以已通过另一种细菌例如酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）引起。血液测试、尿分析和有时x射线可以用于诊断金黄色葡萄球菌感染。确定性诊断可能需要培养物测试，其仅可在许多小时或天后获得，延迟患者的治疗。

由于其在医院和社区获得性疾病中增加的临床重要性，设计用于MRSA的特异性检测的某些PCR测定已得到开发。然而，文献指示还存在检测无论它是否是抗生素抗性的金黄色葡萄球菌的显著临床需要。

发明概述

本发明涉及用于快速检测生物或非生物样品中金黄色葡萄球菌的存在或不存在的方法。本发明包括包含执行至少一个循环步骤的检测方法，所述循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤。此外，本发明涉及设计用于检测金黄色葡萄球菌的引物、探针和试剂盒。在本发明的方法中靶向用于检测金黄色葡萄球菌的基因是荚膜多糖酶（CPE）基因。例如，选择CPE基因靶cap5N，因为它测定为对金黄色葡萄球菌是特异性的，并且不存在于其他葡萄球菌属物种中，并且还证实在金黄色葡萄球菌内的良好同源性。CPE基因具有未经证实的作为产生金黄色葡萄球菌荚膜多糖途径中的还原酶的功能（O’Riordan等人，2004，Clin. Microbiol. Rev. 17（1）:218-234）。

在一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的核苷酸序列或其互补体组成。在某些实施方案中，寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸，更优选40个或更少的核苷酸。在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34之一或其互补体具有至少80%序列同一性（例如至少85%、90%或95%等）的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，序列同一性优选是90%，更优选95%。一般地，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸（例如35个或更少的核苷酸，30个或更少的核苷酸等）。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变化。

在另一个方面，本发明提供了一组寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的至少一个包含选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的序列或其互补体。在某些实施方案中，寡核苷酸组包括包含选自SEQ ID NO：2、8、12和14-20的序列或其互补体的第一寡核苷酸，和包含选自SEQ ID NO：3、6、9和21-26的序列或其互补体的第二寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸组还包括包含选自SEQ ID NO：4、10和27-34的序列或其互补体的第三寡核苷酸。在特定实施方案中，第三寡核苷酸是可检测标记的。

在进一步方面，本发明提供了用于检测样品中的SA的方法，该方法包括执行扩增步骤，其包括使样品与一组SA引物接触，如果SA存在于样品中，则产生扩增产物；执行杂交步骤，其包括使扩增产物与一种或多种可检测的SA探针接触；且检测扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中SA的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示样品中SA的不存在。在一个实施方案中，SA引物组的每个引物包含选自SEQ ID NO：2、3、6、8、9、12和14-26的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：2、3、6、8、9、12和14-26的核苷酸序列或其互补体组成，并且一种或多种可检测的SA探针包含选自SEQ ID NO：4、10和27-34的核苷酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：4、10和27-34的核苷酸序列或其互补体组成。在一些实施方案中，杂交步骤包括使扩增产物与由供体荧光部分标记和相应的受体荧光部分标记的探针接触。该方法还包括检测探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移（FRET）的存在或不存在。荧光的存在或不存在指示样品中SA的存在或不存在。在一个方面，扩增可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，第一和第二荧光部分可以沿着探针长度在彼此不超过5个核苷酸内。在另一个方面，SA探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成一般导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。根据这种方法，在探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。

在进一步方面，本发明提供了用于检测SA的核酸的试剂盒。该试剂盒可以包括包含选自SEQ ID NO：2、8、12和14-20的序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：2、8、12和14-20的序列或其互补体组成的第一寡核苷酸；包含选自SEQ ID NO：3、6、9和21-26的序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：3、6、9和21-26的序列或其互补体组成的第二寡核苷酸；和包含选自SEQ ID NO：4、10和27-34的序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：4、10和27-34的序列或其互补体组成的第三可检测标记的寡核苷酸。在一个方面，试剂盒可以包括已用供体和相应的受体荧光部分标记的探针，或可以包括用于标记探针的荧光部分。在某些实施方案中，受体荧光部分可以是猝灭剂。该试剂盒还可包括三磷酸核苷、核酸聚合酶和/或核酸聚合酶功能所需的缓冲液。该试剂盒还可包括关于使用引物、探针和荧光部分检测样品中SA的存在或不存在的包装说明书和使用说明书。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和例子仅是举例说明性的，并且不意图是限制性的。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。

本发明的一个或多个实施方案的细节在下文附图和说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点根据附图和详述和权利要求是显而易见的。

附图简述

图1显示cap5N金黄色葡萄球菌荚膜多糖酶基因的参考基因序列。

图2A-2D显示关于金黄色葡萄球菌的扩增子序列，各自包括上游引物、下游引物和探针。

图3A-3D显示用于检测金黄色葡萄球菌的扩增曲线。

发明详述

本文描述了用于检测样品中的金黄色葡萄球菌的实时测定。本发明提供了检测无论它是否是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌的方法。提供了用于检测金黄色葡萄球菌的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制造物品或试剂盒。与其他方法相比较用于检测金黄色葡萄球菌的实时PCR增加的灵敏度，以及改善的实时PCR特征包括样品污染（containment）和扩增产物的实时检测，从而使得这种技术用于在临床实验室中常规诊断金黄色葡萄球菌感染的实施可行。

该方法包括执行至少一个循环步骤，其包括使用一对CPE引物扩增来自样品的SA CPE核酸分子的部分。如本文使用的“CPE引物”指对编码CPE的核酸序列特异性退火并在合适条件下起始由其的合成的寡核苷酸引物。CPE引物各自对CPE核酸分子内或邻近的靶退火，从而使得每个扩增产物的至少部分含有对应于CPE的核酸序列。CPE扩增产物产生的条件是CPE核酸存在于样品中，因此CPE扩增产物的存在指示样品中SA的存在。扩增产物应含有与一种或多种可检测的CPE探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测的CPE探针接触，用于检测样品中SA的存在或不存在。

如本文使用的，术语“扩增”指合成与模板核酸分子（例如SA CPE核酸分子）的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子一般包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物对模板核酸退火，并且由引物酶促延长，以生成扩增产物。扩增一般要求脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶（例如Platinum^® Taq）和用于聚合酶的最佳活性的合适缓冲液和/或辅因子（例如MgCl₂和/或KCl）的存在。

术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用，并且指寡聚化合物，主要是寡核苷酸，还指修饰的寡核苷酸，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3'-末端提供游离3’-OH基团，在那里更多的“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶与之附着，建立3’至5’磷酸二酯连接，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能用于预期功能外，在根据本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在基本差异。

术语“杂交”指一种或多种探针对扩增产物的退火。杂交条件一般包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。

术语“5’至3’外切核酸酶活性”指一般与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端去除。

术语“热稳定的聚合酶”指其为热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时，不会不可逆地变性。一般地，合成在每个引物的3'末端处起始，并且沿着模板链以5’至3’方向前进。热稳定的聚合酶已从下述中分离：黄栖热菌（Thermus fiavus）、红栖热菌（T. ruber）、嗜热栖热菌（T. thermophilus）、水生栖热菌（T. aquaticus）、乳栖热菌（T. lacteus）、红色栖热菌（T. rubens）、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus）和炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus fervidus）。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是该酶是补充的。

术语“其互补体”指与给定核酸是相同长度且确切互补的核酸。

当就核酸而言使用时，术语“延伸”或“延长”指当另外的核苷酸（或其他类似分子）掺入核酸内时。例如，核酸任选通过掺入核苷酸的生物催化剂进行延伸，所述生物催化剂例如一般在核酸的3'末端处添加核苷酸的聚合酶。

在两个或更多个核酸序列的背景下，术语“相同的”或 “同一性”百分比指当例如如使用技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，就最大对应性比较且比对时，其为相同或具有其为相同的指定核苷酸百分比的两个或更多个序列或子序列。适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法是BLAST程序，其在例如下述中描述：Altschul等人（1990）“Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410，Gish等人（1993）“Identification of protein coding regions by database similarity search” Nature Genet. 3:266-272，Madden等人（1996）“Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141，Altschul等人（1997）“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，和Zhang等人（1997）“PowerBLAST：A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656。

在寡核苷酸背景下的“修饰的核苷酸”指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸替换为给寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸的改变。可以在本文描述的寡核苷酸中取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮杂-2-脱氧黄苷、吡唑嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基 Ribo-U、2'-0-甲基 Ribo-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在本发明的寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或是本领域另外已知的。在某些实施方案中，相对于相应未修饰的寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代修饰寡核苷酸的解链温度（Tm）。为了进一步举例说明，在本发明的一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增（例如最小化引物二聚体形成等），增加预期靶扩增子的得率，等等。这些类型的核酸修饰的例子在例如美国专利号6,001,611中描述。

金黄色葡萄球菌核酸和寡核苷酸

本发明提供了通过扩增例如SA CPE基因核酸的部分来检测SA的方法。来自SA的核酸序列是可获得的（参见例如GenBank登记号NC_002745）。具体地，本发明提供了扩增且检测SA CPE核酸分子的引物和探针。

对于SA的检测，提供了扩增CPE核酸分子的引物和探针。除本文例示那些外的CPE核酸也可以用于检测样品中的SA。例如，功能变体可以通过本领域技术人员使用常规方法就特异性和/或灵敏度进行评估。代表性功能变体可以包括例如本文公开的CPE核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。

更具体而言，本发明的寡核苷酸各自包括具有选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中该变体与SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34之一，或SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的互补体和变体具有至少例如80%，优选90%或更优选95%的序列同一性。

表I：上游引物

表II：下游引物

表III：探针

表IV：扩增子

在一些实施方案中，包含根据表I的上游引物或由根据表I的上游引物组成的寡核苷酸与包含根据表II的下游引物或由根据表II的下游引物组成的寡核苷酸组合，以形成在合适的条件下能够扩增SA的一组寡核苷酸。在某些实施方案中，其中使用包含根据表I的上游引物或由根据表I的上游引物组成的寡核苷酸的互补体，以及选择包含根据表II的下游引物或由根据表II的下游引物组成的寡核苷酸的互补体，以形成在合适的条件下能够扩增SA的一组寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸组还包括包含根据表III的探针或由根据表III的探针组成的第三寡核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，使用CPE引物和探针的特定组，以便提供怀疑含有SA的生物样品中的SA检测。引物和探针组可以包含对于CPE特异性的至少一个引物和探针，其包含选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的核酸序列或其互补体，或由选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的核酸序列或其互补体组成。

在本发明的另一个实施方案中，对于CPE特异性的至少一个引物和探针包含选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的引物中的任何的功能活性变体，或由选自SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的引物中的任何的功能活性变体组成。SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的引物和/或探针中的任何的功能活性变体可以通过在本发明的方法中使用引物和/或探针进行鉴定。SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的任何的引物和/或探针中的功能活性变体与引物有关，与SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的各自序列相比较，所述引物在本发明的方法或试剂盒中提供相似或更高的特异性和灵敏度。

通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，例如在SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的各自序列的5'末端和/或3'末端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，变体可以例如与SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34的序列不同。如上所详述，引物（和/或探针）可以是化学修饰的，即引物和/或探针可以包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针（或引物）随后是修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”（或“核苷酸类似物”）通过一些修饰而不同于天然“核苷酸”，但仍由碱基或碱基样化合物、呋喃戊糖或呋喃戊糖样化合物、磷酸盐部分或磷酸盐样部分、或其组合组成。例如，“标记”可附着至“核苷酸”的碱基部分，由此获得“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可替换为例如7-脱氮杂嘌呤，由此同样获得“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。以如上文对于“修饰的核苷酸”（或“核苷酸类似物”）概述的方式，“修饰的核苷”（或“核苷类似物”）通过一些修饰不同于天然核苷。特定核酸序列的“保守修饰的变化”指这样的核酸，其编码相同或基本上相同的氨基酸序列，或当核酸不编码氨基酸序列时，其编码基本上相同的序列。技术人员将认识到在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸（一般小于5%，更一般小于4%、2%或1%）的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变化”，其中改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸由化学上相似的氨基酸的取代。

扩增编码SA的核酸分子，例如编码CPE的可替代部分的核酸的寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物，可以使用例如计算机程序例如OLIGO（Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.）进行设计。当设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于合适大小的扩增产物以促进检测（例如通过电泳），关于一对引物成员相似的解链温度，和每个引物的长度（即，引物需要足够长以具有序列特异性退火且起始合成，但不是如此长，使得保真度在寡核苷酸合成期间减少）。一般地，寡核苷酸引物是长度8 – 50个核苷酸（例如长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸）。

除了一组引物外，本发明的方法还可以使用一种或多种探针，以便检测SA的存在或不存在。术语“探针”指合成或生物产生的核酸（DNA或RNA），其通过设计或选择而含有特定核苷酸序列，这允许其在限定的预定严格性下与“靶核酸”；在本文情况下，与SA CPE（靶）核酸特异性（即优先）杂交。“探针”可以被称为“检测探针”，意指它检测靶核酸。

根据本发明，CPE探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，CPE探针可以用供体荧光部分例如荧光染料和相应的受体荧光部分例如猝灭剂进行标记。

在本发明的一个实施方案中，至少一个探针包含荧光部分和核酸序列或由荧光部分和核酸序列组成，所述核酸序列选自SEQ ID NO：4、10和27-34（不含标记显示）。

设计待用作杂交探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式执行。本发明的实施方案可以使用单个探针或一对探针用于检测扩增产物。取决于实施方案，使用的探针可以包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以使序列特异性杂交发生，但不如此长，使得保真度在合成期间减少。一般地，寡核苷酸探针是长度15 - 30（例如16、18、20、21、22、23、24或25）个核苷酸。

本发明的构建体包括含有SA CPE核酸分子（例如SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34）的载体。本发明的构建体可以用作例如对照模板核酸分子。适合于在本发明中使用的载体是商购可得的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生。SA CPE核酸分子可以例如通过化学合成、由SA直接克隆、或通过PCR扩增而获得。

除了SA CPE核酸分子（例如含有SEQ ID NO：2-4、6、8-10、12和14-34中的一个或多个序列的核酸分子）外，适合于在本发明的方法中使用的构建体一般还包括用于选择所需构建体和/或转化体的可选标记（例如抗生素抗性基因）的编码序列、和复制起点。载体系统的选择通常取决于几个因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、可选择性、可诱导性和易于回收。

本发明含有CPE核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文使用的，术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物，例如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌（E. coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。真核宿主包括酵母例如酿酒酵母（S. cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（S. pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），哺乳动物细胞例如COS细胞或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，昆虫细胞和植物细胞例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）。本发明的构建体可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术引入宿主细胞内。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞内的常见方法。此外，裸露DNA可以直接递送给细胞（参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466）。

聚合酶链反应（PCR）

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规PCR技术。PCR一般采用两个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板（例如DNA或RNA）结合。在本发明中有用的引物包括能够充当在SA CPE核酸序列（例如SEQ ID NO：2、3、6、8、9、12和14-27）内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优选是单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性，即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它占优势地变性（例如大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性）。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度和变性核酸的长度和核苷酸组成，但一般范围为约90℃ - 约105℃一段时间，所述时间取决于反应特征例如温度和核酸长度。变性一般执行约30秒 - 4分钟（例如1分钟 - 2分钟30秒，或1.5分钟）。

如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物对其在CPE核酸上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常是约35℃ - 约65℃（例如约40℃ - 约60℃；约45℃ - 约50℃）。退火时间可以是约10秒 – 约1分钟（例如约20秒 – 约50秒；约30秒 – 约40秒）。随后将反应混合物调整至在其下聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以由对核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以便使来自其互补模板的延伸产物变性（例如用于延伸的温度一般范围为约40℃ - 约80℃（例如约50℃ - 约70℃；约60℃）。延伸时间可以是约10秒 – 约5分钟（例如约30秒 – 约4分钟；约1分钟 – 约3分钟；约1分钟30秒 – 约2分钟）。

PCR测定可以采用SA核酸例如RNA或DNA（cDNA）。模板核酸无需纯化；它可以是复杂混合物的较小部分，例如人细胞中含有的SA核酸。SA核酸可以通过常规技术从生物样品中提取，所述常规技术例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications（Persing等人（编辑），1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.）中所述的那些。核酸可以得自任何许多（any number of）来源例如质粒，或天然来源包括细菌、酵母、病毒、细胞器，或高等生物例如植物或动物。

寡核苷酸引物（例如SEQ ID NO：2、3、6、8、9、12和14-27）与PCR试剂在诱导引物延伸的反应条件下组合。例如，链延伸反应一般包括50 mM KCl、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、15 mM MgCl₂、0.001%（w/v）明胶、0.5-1.0 µg变性模板DNA、50 pmoles每个寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10％DMSO）。反应通常含有各150 - 320 µM的每种dATP、dCTP、dTTP、dGTP，或其一种或多种类似物。

新近合成的链形成可以在反应的以后步骤中使用的双链分子。链分离、退火和延长步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于靶CPE核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和三磷酸核苷的量。循环步骤（即变性、退火和延伸）优选重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶序列。一般地，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

荧光共振能量转移（FRET）

FRET技术（参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603）基于下述概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分置于彼此一定距离内时，能量转移在两个荧光部分之间发生，其可以显现或另外检测和/或定量。当供体通过光放射用合适波长激发时，供体一般将能量转移给受体。受体一般用不同波长再发射以光放射形式的转移能量。

在一个例子中，寡核苷酸探针可以含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，其消散以除光以外形式的转移能量。当探针完整时，能量转移一般在两个荧光部分之间发生，从而使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针通过例如Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性切割，从而使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于这个目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™（BHQ）（Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.）、Iowa Black™（Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa）、BlackBerry™猝灭剂650（BBQ-650）（Berry & Assoc.，Dexter，Mich.）。

在另一个例子中，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置处与扩增产物杂交，所述特定位置通过寡核苷酸探针与CPE靶核酸序列的互补性决定。在寡核苷酸探针在合适位置处与扩增产物核酸杂交后，生成FRET信号。杂交温度可以范围为约35℃到约65℃共约10秒到约1分钟。

荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统（含有合适的二色镜和滤器用于监控在特定范围上的荧光发射）、光子计数光电倍增管系统或荧光计执行。起始能量转移的激发可以用氩离子激光器、高强度汞（Hg）弧光灯、光导纤维光源或对于所需范围中的激发适当过滤的其他高强度光源进行。

如本文就供体和相应的受体荧光部分使用的，“相应的”指具有重叠供体荧光部分的激发光谱的发射光谱的受体荧光部分。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100 nm。相应地，有效的非放射性能量转移可以在两者之间产生。

荧光供体和相应的受体部分一般就下述进行选择：（a）高效率福斯特能量转移；（b）大的最终斯托克斯位移（>100 nm）；（c）发射尽可能进入可见光谱的红色部分内的转变（>600 nm）；和（d）发射向高于通过在供体激发波长处的激发产生的拉曼水荧光发射波长的转变。例如，可以选择供体荧光部分，其具有接近激光线的最大激发（例如氦-镉442 nm或氩488 nm）、高消光系数、高量子产率、及其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可以选择相应的受体荧光部分，其具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠、和在可见光谱的红色部分中的发射（>600 nm）。

可以在FRET技术中与多个受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-（4’-异硫氰酸苯基）-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯、或镧系元素离子（例如铕或铽）的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以例如得自Molecular Probes（Junction City，Oreg.）或Sigma Chemical Co.（St. Louis，Mo.）。

供体和受体荧光部分可以经由接头臂附着至合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度是重要的，因为接头臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本发明目的的接头臂长度是从核苷酸碱基到荧光部分以埃（Å）表示的距离。一般而言，接头臂是约10 Å – 约25 Å。接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂附着至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分附着至接头臂的方法。

受体荧光部分例如LC Red 640-NHS-酯可以与C6-亚磷酰胺（可得自ABI（Foster City，Calif.）或Glen Research（Sterling，Va.））组合，以产生例如LC Red 640-亚磷酰胺。频繁使用的将供体荧光部分例如荧光素偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头（FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene（Ashland，Mass.）的荧光素-CPG's）、酰胺接头（荧光素-NHS-酯衍生的，例如来自BioGenex（San Ramon，Calif.）的荧光素-CPG）、或在寡核苷酸合成后需要荧光素-NHS-酯偶联的3’-氨基-CPGs。

金黄色葡萄球菌的检测

本发明提供了用于检测生物或非生物样品中SA的存在或不存在的方法。由本发明提供的方法避免样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括执行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，所述循环步骤包括使用一对CPE引物从样品中扩增SA CPE核酸分子的部分。执行多个循环步骤，优选在热循环仪中。本发明的方法可以使用CPE引物和探针执行，以检测CPE的存在，并且CPE的检测指示样品中SA的存在。

如本文描述的，扩增产物可以使用利用FRET技术的标记的杂交探针进行检测。一个FRET形式利用TaqMan^®技术，以检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测SA的存在或不存在。TaqMan^®技术利用由两个荧光部分标记的一个单链杂交探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分一般是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA（即扩增产物）结合，并且在后续延长期过程中通过Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。因此，激发的荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。例如，ABI PRISM^® 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems，Foster City，CA）使用TaqMan^®技术，并且适合于执行本文描述的方法用于检测样品中SA的存在或不存在。

与FRET结合的分子信标也可以用于使用本发明的实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用由第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂，并且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成（例如发夹）的序列的探针寡核苷酸。由于在探针内的二级结构形成，当探针在溶液中时，两个荧光部分处于空间接近。在与靶核酸（即扩增产物）杂交后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测到第一荧光部分的发射。

另一个常见形式的FRET技术利用两个杂交探针。每个探针可以由不同荧光部分标记，并且一般设计为在靶DNA分子（例如扩增产物）彼此紧密接近杂交。供体荧光部分例如荧光素在470 nm处通过LightCycler® Instrument的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移给受体荧光部分例如LightCycler®-Red 640（LC Red 640）或LightCycler®-Red 705（LC Red 705）。受体荧光部分随后发出更长波长的光，其通过LightCycler®仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分处于直接局部接近时，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才可发生。发出信号的强度可以与原始靶DNA分子数目（例如SA基因组数目）关联。如果发生CPE核酸的扩增，并且产生扩增产物，则杂交步骤导致基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

一般地，FRET的存在指示样品中SA的存在，并且FRET的不存在指示样品中SA的不存在。然而，不足够的样本收集、转运延迟、不合适的转运条件或特定收集拭子的使用（海藻酸钙或铝柄）都是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文公开的方法，在例如45个循环步骤内的FRET检测指示SA感染。

可以在实践本发明的方法中使用的代表性生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养、皮肤和软组织感染。生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。生物样品可以进行处理（例如通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒），以释放SA核酸，或在一些情况下，生物样品可以直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。

解链曲线分析是可以包括在循环概况中的另外步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度（Tm）的特征温度下解链的事实，所述解链温度定义为在其下一半DNA双链体已分离成单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有比具有丰富A和T核苷酸的那些更高的Tm。通过检测在其下丧失信号的温度，可以测定探针的解链温度。类似地，通过检测在其下生成信号的温度，可以测定探针的退火温度。来自CPE扩增产物的CPE探针的解链温度可以证实样品中SA的存在或不存在。

在每个热循环运行内，同样使对照样品循环。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针来扩增SA核酸对照模板（除CPE以外）。阳性对照样品还可扩增例如含有SA CPE核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以在内部（例如在样品内）或在分开的样品运行中与患者样品一起扩增。每个热循环仪运行也可包括阴性对照，其例如缺乏SA模板DNA。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指示剂。因此，对照反应可以容易地测定例如引物以序列特异性退火且起始延长的能力，以及探针以序列特异性杂交和FRET发生的能力。

在一个实施方案中，本发明的方法包括避免污染的步骤。例如，利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述，以减少或消除一个热循环仪运行和下一个之间的污染。

与FRET技术结合的常规PCR方法可以用于实践本发明的方法。在一个实施方案中，使用LightCycler^®仪器。下述专利申请描述如在LightCycler^®技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

LightCycler^®可以使用PC工作站进行操作，并且可以利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管顺次置于光学单位上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时展示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒（msec）。在每个循环步骤后，可以对于所有样品不断更新荧光相对于循环数目的数量展示。生成的数据可以保存用于进一步分析。

作为FRET的替代，扩增产物可以使用双链DNA结合染料例如荧光DNA结合染料（例如SYBR^® Green或SYBR^® Gold（Molecular Probes））进行检测。在与双链核酸相互作用后，此类荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发出荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料例如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

应当理解本发明并不受一种或多种商购可得仪器的配置限制。

制造物品/试剂盒

本发明还提供了检测SA的制造物品或试剂盒。根据本发明的制造物品可以包括用于检测SA的引物和探针，连同合适的包装材料。用于检测SA的代表性引物和探针能够与SA CPE核酸分子杂交。此外，该试剂盒还可包括合适包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。设计引物和探针的方法在本文中公开，并且提供了扩增SA CPE核酸分子且与SA CPE核酸分子杂交的引物和探针的代表性例子。

本发明的制造物品还可包括一种或多种荧光部分用于标记探针，或可替代地，可以标记由试剂盒供应的探针。例如，制造物品可以分别包括供体荧光部分用于标记CPE探针之一，和受体荧光部分用于标记另一个CPE探针。合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的例子在上文提供。

本发明的制造物品还可含有包装说明书或包装标签，在其上具有关于使用CPE引物和探针检测样品中的SA的指导。制造物品可以另外包括用于执行本文公开的方法的试剂（例如缓冲液、聚合酶、辅因子、或预防污染的试剂）。此类试剂可以对于本文描述的商购可得的仪器之一是特异性的。

本发明还将在下述实施例中描述，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。

实施例

提供下述实施例和附图以帮助本发明的理解，本发明的真实范围在附加权利要求中阐述。应当理解可以在所述程序中作出修改，而不背离本发明的精神。

实施例 1

荚膜多糖酶基因靶的选择

通过使用对于金黄色葡萄球菌和几个其他葡萄球菌属物种公众可获得的全基因组的BLAST序列分析，靶向的CPE基因测定为对于金黄色葡萄球菌是特异性的，并且不存在于其他葡萄球菌属物种中。

选择在CPE基因内的引物位点，其将获得长度小于250 bp的扩增子，并且在3'末端上不具有双重dA或双重dC核苷酸（如果可能的话）。引物还选择为具有大于64℃的Tm，并且用3-叔丁基苄基改性剂制备，以在PCR期间减少引物二聚体且增加特异性。在选择起始引物位点后，它们进行BLAST搜索以检查对于金黄色葡萄球菌的特异性，并且使用Oligo 6 引物分析软件评估以检查引物二聚体形成的可能性和CPE基因其他地方的假引发位点。

CPE基因在金黄色葡萄球菌内的同源性通过测序来自20个独特金黄色葡萄球菌分离物的CPE基因，以及通过BLAST搜索公众序列数据库进行确认。每个引物组的排他性通过用其他葡萄球菌属物种（头状葡萄球菌（S. captis）、人葡萄球菌（S. hominis）、溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、里昂葡萄球菌（S. ludgunensis）、肉葡萄球菌（S. carnosus）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）和松鼠葡萄球菌（S. scirui））扩增进行确认。

在金黄色葡萄球菌内的CPE基因cap5N长约880个碱基对，并且由于其在金黄色葡萄球菌中的独特存在和高同源性，它是对于这种生物体的特异性和排他性的理想靶。设计几个潜在的PCR扩增子且就这个基因内的最佳表现进行测试，并且下述四个寡核苷酸组选项获得最多产物（通过凝胶电泳观察到），以及通过TaqMan^®分析观察到的最高荧光和最早肘部（elbow）值。

CPE寡核苷酸组#1

上游引物：（J=叔丁基苄基dC）（SEQ ID NO：2）

下游引物：（J=叔丁基苄基dA）（SEQ ID NO：3）

探针：（E=thFAM，Q=BHQ2，P=3'磷酸盐）（SEQ ID NO：4）

由寡核苷酸组#1生成的扩增子：

CPE寡核苷酸组#2:

上游引物：（J=叔丁基苄基dC）（SEQ ID NO：2）

下游引物：（J=叔丁基苄基dA）（SEQ ID NO：6）

探针：（E=thFAM，Q=BHQ2，P=3'磷酸盐）（SEQ ID NO：4）

由寡核苷酸组#2生成的扩增子：

CPE寡核苷酸组#3:

上游引物：（J=叔丁基苄基dA）（SEQ ID NO：8）

下游引物：（J=叔丁基苄基dC）（SEQ ID NO：9）

探针：（E=thFAM，Q=BHQ2,P=3'磷酸盐）（SEQ ID NO：10）

由寡核苷酸组#3生成的扩增子：

CPE寡核苷酸组#4:

上游引物：（J=叔丁基苄基dC）（SEQ ID NO：12）

下游引物：（J=叔丁基苄基dC）（SEQ ID NO：9）

探针：（E=thFAM，Q=BHQ2，P=3'磷酸盐）（SEQ ID NO：10）

由寡核苷酸组#4生成的扩增子：

PCR条件：在30 mM Tris，pH 8.5中稀释的25 µL金黄色葡萄球菌基因组DNA，加上18 µL主要混合物（154 mM三甲基甘氨酸、110 mM氢氧化钾、190 mM乙酸钾、19%甘油（v/v）、2.3% DMSO、1.16 mM dATP、1.16 mM dCTP、1.16 mM dGTP、1.16 mM dUTP、1.0 µM上游测定引物、1.0 µM下游测定引物、0.185 µM探针、308 U/mL ZO5 DNA聚合酶、150 U/mL UNG、0.09%叠氮化钠（w/v），pH 8.50，加上7 µL活化混合物（50 mM氯化镁）。

PCR仪器：具有Cobas^® z480滤波器配置的LightCycler^® 480

实施例 2

CPE寡核苷酸性能评估方法

参考图3A-3D，通过评估来自12个独特的培养金黄色葡萄球菌生物体发生CPE寡核苷酸组#1-4的评估。来自每个金黄色葡萄球菌生物体的基因组DNA在30 mM Tris，pH 8.5中稀释至~105c/PCR，并且将25 µL基因组DNA加入18 µL预配制的主要混合物加上7µL活化试剂中。预配制的主要混合物含有下述组分浓度：154 mM三甲基甘氨酸、110 mM氢氧化钾、190 mM乙酸钾、19%甘油（v/v）、2.3% DMSO、1.16 mM dATP、1.16 mM dCTP、1.16 mM dGTP、1.16 mM dUTP、1.0 µM上游测定引物、1.0 µM下游测定引物、0.185 µM探针、308 U/mL ZO5 DNA聚合酶、150 U/mL UNG、0.09%叠氮化钠（w/v），pH 8.50。活化试剂含有50 mM氯化镁。

实施例 3

排他性评估方法

CPE寡核苷酸组#4的排他性评估通过下述发生：组合在30 mM Tris，pH 8.5中稀释至~10⁶c/µL的1 µL葡萄球菌属物种基因组DNA，加上50 µL重构的主要混合物。重构的主要混合物由下述组成：在25 µL 30 mM Tris，pH 8.5中的基因组DNA，加上18 µL预配制的主要混合物，加上7µL活化试剂（50 µL总体积）。预配制的主要混合物含有下述组分浓度：154 mM三甲基甘氨酸、110 mM氢氧化钾、190 mM乙酸钾、19%甘油（v/v）、2.3% DMSO、1.16 mM dATP、1.16 mM dCTP、1.16 mM dGTP、1.16 mM dUTP、1.0 µM上游CPE引物、1.0 µM下游CPE引物、6.0µM其他测定探针（非CPE靶）、0.185 µM CPE靶探针、1.0 µM其他测定探针（非CPE靶）、308 U/mL ZO5 DNA聚合酶、150 U/mL UNG、0.09%叠氮化钠（w/v），pH 8.50。活化试剂含有50 mM氯化镁。

虽然本发明已为了明确和理解的目的略为详细地描述，但根据本公开内容的阅读对本领域技术人员明确的是，可以作出形式和细节中的多种变化。例如，上文描述的所有技术和器械可以多种组合使用。

序列表

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Diagnostics GmbH

<120> 用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法

<130> 27414 WO-HS

<150> US 13/116975

<151> 26.05.2011

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 888

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 1

atgagaaaaa atattttaat tacaggcgta catggatata tcggtaatgc tttaaaagat 60

aagcttattg aacaaggaca tcaagtagat caaattaatg ttaggaatca attatggaag 120

tcgacctcgt tcaaagatta tgatgtttta attcatacag cagctttggt tcacaacaat 180

tcacctcaag caaggctatc tgattatatg caagtgaata tgttgctgac gaaacaattg 240

gcacaaaagg ctaaagctga agacgttaaa caatttattt ttatgagtac tatggcagtt 300

tatggaaaag aaggtcatgt tggtaaatca gatcaagttg atacacaaac accaatgaac 360

cctacgacca actatggtat ttccaaaaag ttcgctgaac aagcattaca agaattgatt 420

agtgattcgt ttaaagtagc aattgtgaga ccaccaatga tttatggtgc acattgccca 480

ggaaatttcc aacggttaat gcaattgtca aagcgattgc caatcattcc caatattaac 540

aatcagcgca gtgcattata tattaaacat ctgacagcat ttattgatca attaatatca 600

ttagaagtga caggtgtgta ccatcctcaa gatagttttt actttgatac atcgtcagta 660

atgtatgaaa tacgtcgcca atcacatcgt aaaacggtat tgatcaacat gccttcaatg 720

ctaaataagt attttaataa gttgtcggtc tttagaaaat tattcggcaa tttaatatac 780

agcaatacgt tatatgaaaa taataatgca cttgaaatta ttcctggaaa aatgtcactt 840

gttattgcgg acatcatgga tgaaacgaca accaaagata aggcataa 888

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 2

acaccaatga accctacgac c 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 3

taattgatca ataaatgctg tcaga 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 4

ttgcccagga aatttccaac ggtt 24

<210> 5

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 5

acaccaatga accctacgac caactatggt atttccaaaa agttcgctga acaagcatta 60

caagaattga ttagtgattc gtttaaagta gcaattgtga gaccaccaat gatttatggt 120

gcacattgcc caggaaattt ccaacggtta atgcaattgt caaagcgatt gccaatcatt 180

cccaatatta acaatcagcg cagtgcatta tatattaaac atctgacagc atttattgat 240

caatta 246

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 6

gatcaataaa tgctgtcaga tgtttaa 27

<210> 7

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

acaccaatga accctacgac caactatggt atttccaaaa agttcgctga acaagcatta 60

caagaattga ttagtgattc gtttaaagta gcaattgtga gaccaccaat gatttatggt 120

gcacattgcc caggaaattt ccaacggtta atgcaattgt caaagcgatt gccaatcatt 180

cccaatatta acaatcagcg cagtgcatta tatattaaac atctgacagc atttattgat 240

c 241

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

gataagctta ttgaacaagg acatcaa 27

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

cttgaggtga attgttgtga acc 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 10

ttaggaatca attatggaag tcgacctcgt 30

<210> 11

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 11

gataagctta ttgaacaagg acatcaagta gatcaaatta atgttaggaa tcaattatgg 60

aagtcgacct cgttcaaaga ttatgatgtt ttaattcata cagcagcttt ggttcacaac 120

aattcacctc aag 133

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 12

aagataagct tattgaacaa ggacatc 27

<210> 13

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 13

aagataagct tattgaacaa ggacatcaag tagatcaaat taatgttagg aatcaattat 60

ggaagtcgac ctcgttcaaa gattatgatg ttttaattca tacagcagct ttggttcaca 120

acaattcacc tcaag 135

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 14

aggcgtacat ggatatatcg gtaa 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 15

gcttattgaa caaggacatc aa 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 16

gataagctta ttgaacaagg acatc 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 17

acaccaatga accctacgac 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 18

acaccaatga accctacga 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 19

accaatgaac cctacgacc 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 20

atacacaaac accaatgaac cctac 25

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 21

tgcttgaggt gaattgttgt gaa 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 22

agatagcctt gcttgaggtg aa 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 23

cttgaggtga attgttgtga a 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 24

tgaggtgaat tgttgtgaac c 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 25

caataaatgc tgtcagatgt ttaa 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 26

taattgatca ataaatgctg tca 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 27

tggtgcacat tgcccaggaa attt 24

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 28

cattgcccag gaaatttcca acggtt 26

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 29

cccaggaaat ttccaacggt t 21

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 30

cgaggtcgac ttccataatt gattcct 27

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 31

acgaggtcga cttccataat tgattcctaa 30

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 32

aaatttcctg ggcaatgtgc acca 24

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 33

aaccgttgga aatttcctgg gcaatg 26

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 34

aaccgttgga aatttcctgg gcaa 24

Claims

1.一种用于检测cap5N金黄色葡萄球菌的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：2-3、6、8-9、12和14-26的序列，和SEQ ID NO：4、10、27-34的序列或其互补体，其中所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。

2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。

3.权利要求1或2中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个保守修饰的变化。

4.权利要求1-2中任一项的寡核苷酸，其还包含一个或多个可检测标记。

5.权利要求1-2中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个标记部分和/或至少一个猝灭剂部分。

6.用于检测cap5N金黄色葡萄球菌的寡核苷酸组，其包含：

-第一寡核苷酸，其具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：2和17-20的序列；和

-第二寡核苷酸，其具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：3、6和25-26的序列；

或

-第一寡核苷酸，其具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：8、12和14-16的序列；和

-第二寡核苷酸，其具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：9和21-24的序列。

7.权利要求6的寡核苷酸组，其进一步包含可检测标记的第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸并且：

-如果所述第一寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：2和17-20的序列以及所述第二寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：3、6和25-26的序列，所述第三寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：4、27-29和32-34的序列或其互补体；

或

-如果所述第一寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：8、12和14-16的序列以及所述第二寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：9和21-24的序列，所述第三寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：10、30和31的序列或其互补体。

8.一种检测样品中的金黄色葡萄球菌（SA）的非诊断性方法，所述方法包括：

-执行扩增步骤，其包括使所述样品与一组SA引物接触，如果SA存在于所述样品中，则产生扩增产物；

-执行杂交步骤，其包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的SA探针接触；和

-检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中SA的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中SA的不存在；

其中所述SA引物组包含具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：2和17-20的序列的第一寡核苷酸和具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：3、6和25-26的序列的第二寡核苷酸；并且其中所述一种或多种可检测的SA探针具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：4、27-29和32-34的序列或其互补体；或

其中所述SA引物组包含具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：8、12和14-16的序列的第一寡核苷酸和具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：9和21-24的序列的第二寡核苷酸；并且其中所述一种或多种可检测的SA探针包含选自SEQ ID NO：10、30和31的序列或其互补体。

9.权利要求8的方法，其中：

-所述杂交步骤包括使所述扩增产物与由供体荧光部分标记和相应的受体荧光部分标记的探针接触；和

-所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移（FRET）的存在或不存在，其中所述荧光的存在或不存在指示所述样品中SA的存在或不存在。

10.权利要求8或9中任一项的方法，其中所述扩增采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。

11.权利要求9的方法，其中第一和第二荧光部分在所述探针上彼此不超过5个核苷酸内。

12.权利要求9的方法，其中所述SA探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。

13.一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸的试剂盒，其包括：

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：2和17-20的序列的第一寡核苷酸；

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：3、6和25-26的序列的第二寡核苷酸；和

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：4、27-29和32-34的序列或其互补体的第三可检测标记的寡核苷酸；或

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：8、12和14-16的序列的第一寡核苷酸；

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：9和21-24的序列的第二寡核苷酸；和

-具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：10、30和31的序列或其互补体的第三可检测标记的寡核苷酸。

14.权利要求13的试剂盒，其中所述第三可检测标记的寡核苷酸包含供体荧光部分和相应的受体荧光部分。

15.权利要求13或14中任一项的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种另外组分：三磷酸核苷、核酸聚合酶和所述核酸聚合酶功能所需的缓冲液。

16.由正向引物和反向引物组成的SA引物组在制备用于检测样品中的金黄色葡萄球菌（SA）的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：

-执行扩增步骤，其包括使所述样品与一组包含正向引物和反向引物的SA引物接触，如果SA存在于所述样品中，则产生扩增产物；

其中包含正向引物和反向引物的SA引物组包含具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：2和17-20的序列的第一寡核苷酸引物和具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：3、6和25-26的序列的第二寡核苷酸；并且其中所述一种或多种可检测的SA探针具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：4、27-29和32-34的序列或其互补体；或

其中所述SA引物组包含具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：8、12和14-16的序列的第一寡核苷酸引物和具有40个或更少的核苷酸并包含选自SEQ ID NO：9和21-24的序列的第二寡核苷酸；并且其中所述一种或多种可检测的SA探针包含选自SEQ ID NO：10、30和31的序列或其互补体。

17.权利要求16的用途，其中在所述方法中：

18.权利要求16或17中任一项的用途，其中所述扩增采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。

19.权利要求17的用途，其中第一和第二荧光部分在所述探针上彼此不超过5个核苷酸内。

20.权利要求17的用途，其中所述SA探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。