ES2929367T3 - Amplificación por PCR ultrarrápida cuantitativa usando un dispositivo basado en electrohumectación - Google Patents

Amplificación por PCR ultrarrápida cuantitativa usando un dispositivo basado en electrohumectación Download PDF

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Abstract

La presente invención generalmente se refiere a un método que hace uso de la electrohumectación para automatizar la amplificación de la PCR en el que los reactivos de la PCR están contenidos en gotitas y, además, en el que la cantidad de producto de la PCR se controla en tiempo real, lo que permite detener la amplificación una vez que se alcanza la cantidad deseada de producto de la PCR. ha sido generado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Amplificación por PCR ultrarrápida cuantitativa usando un dispositivo basado en electrohumectación
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a procedimientos de amplificación de ácido nucleico basados en gotículas. Estos procedimientos hacen uso de un dispositivo basado en electrohumectación para automatizar la amplificación de ácido nucleico y permiten que se siga la cantidad del producto de amplificación de ácido nucleico en tiempo real. El uso de un dispositivo basado en electrohumectación permite posteriormente la recuperación de la cantidad deseada de producto de amplificación una vez que se ha generado.
Antecedentes de la invención
Recientemente, se han realizado esfuerzos concertados para desarrollar y fabricar sistemas y dispositivos microfluídicos para realizar diversos análisis y síntesis químicos y bioquímicos, tanto para aplicaciones preparatorias como analíticas. El campo de la microfluídica implica en general la manipulación de nanolitros o volúmenes más pequeños de fluidos en dispositivos, denominados en general chips microfluídicos o dispositivos microfluídicos, que a menudo presentan estructuras de tamaño micrométrico. Como resultado del control preciso posible para manipulaciones de pequeños volúmenes de fluidos, los dispositivos microfluídicos permiten a los investigadores realizar análisis químicos y biológicos complejos con menos volumen y en menos tiempo que los formatos experimentales de sobremesa comparables. Hasta la fecha, se han desarrollado muchos diseños de dispositivos microfluídicos que replican técnicas experimentales a macroescala mientras incrementan la sensibilidad y la densidad de mediciones. Con beneficios tales como una reducción sustancial en los requisitos de tiempo, coste y espacio para los dispositivos utilizados para llevar a cabo un análisis o síntesis deseados, se han diseñado chips microfluídicos para dichas aplicaciones como cristalografía; PCR; electroforesis capilar; diagnóstico inmediato; cromatografía de gases; secuenciación de ácido nucleico; y separación celular, atrapamiento y análisis posteriores, por ejemplo. Adicionalmente, los dispositivos microfluídicos tienen el potencial de adaptarse para su uso con sistemas automatizados, proporcionando de este modo los beneficios adicionales de reducciones de coste adicionales y errores de operario disminuidos debido a la reducción de la participación humana en el procedimiento experimental y, en particular, en las manipulaciones de líquidos, por ejemplo, errores asociado con el pipeteo.
Para promover la mezcla rápida de reactivos y para evitar la dispersión de reactivos, se han desarrollado chips y dispositivos basados en microgotículas que compartimentan las reacciones en gotículas de tamaño de nanolitros a picolitros, a menudo en forma de emulsiones de agua en aceite. Las microgotículas pueden servir como microrreactores individuales, dividiendo mezclas personalizables de reactivos en volúmenes de reacción de nanolitros a picolitros. Debido a su bajo volumen y a su uso como microrreactores, las microgotículas ofrecen un formato ideal para realizar reacciones de manera altamente paralelizada con una intensa sensibilidad de ensayo. Por ejemplo, usando un enfoque basado en microgotículas de agua en aceite, los investigadores demostraron que la amplificación de un producto de adenovirus de 245 pb se puede detectar en 35 minutos a concentraciones de molde de partida tan bajas como una molécula de molde por 167 gotículas (0,003 pg/pl) (Kiss et al., Anal. Chem., 1 de diciembre de 2008; 80(23):8975-81).
Un medio alternativo para el flujo general de fluidos y para la generación de microgotículas implica el uso de fenómenos basados en electrohumectación y manipulaciones de gotículas basadas en electrohumectación en un entorno de dispositivo microfluídico. La electrohumectación se ha establecido como una tecnología de laboratorio en un chip que puede realizar operaciones microfluídicas complejas tales como dosificar, fusionar, mezclar y dividir gotículas de tamaño de microlitros a nanolitros sin la necesidad de estructuras basadas en canales. La tecnología basada en electrohumectación se ha implementado en la automatización de diversos flujos de trabajo de biología molecular, incluyendo diversas etapas de preparaciones de muestras de secuenciación de ácido nucleico tal como PCR. Los dispositivos de electrohumectación diseñados para realizar las diversas etapas necesarias para un ensayo permiten a los investigadores beneficiarse de los ahorros en tiempo, coste, reactivos y espacio del dispositivo conferidos por los chips microfluídicos. La tecnología del estado de la técnica se divulga en el documento US 2008/274513 A1, así como en Zhishan et al. (Analytical Chemistry, vol. 82, n.° 6, pp. 2310-2316, 2010).
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento de amplificación de ácido nucleico automatizada que comprende los siguientes etapas: (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación, opcionalmente en el que dicho dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación; (b) proporcionar al menos dos gotículas en dicho dispositivo basado en electrohumectación, en el que cada gotícula comprende cebadores que se hibridan a un ácido nucleico diana; y un ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en al menos una gotícula; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada del ácido nucleico diana, recuperar al menos una gotícula usando para su análisis o procesamiento posterior dicha al menos una gotícula, en el que el análisis o procesamiento se selecciona de un grupo que consiste en secuenciación de ácido nucleico, secuenciación de segunda generación, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo, secuenciación dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas (mate pair), sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN, secuenciación de transcriptoma y sec. de metilación.
En un modo de realización de la invención, dichas gotículas pueden comprender cada una un ácido nucleico diana diferente. Aún otro modo de realización de la invención engloba un procedimiento en el que dichas gotículas pueden comprender cada una el mismo ácido nucleico diana. Aún otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha gotícula puede comprender una mezcla de gotículas que contienen el mismo ácido nucleico diana y diferentes ácidos nucleicos diana. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una configuración plana de electrodos que efectúa manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos cuadrados, opcionalmente en el que dichos electrodos tienen aproximadamente 5 mm por 5 mm. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos tienen una conformación cuadrada, triangular, rectangular, circular, trapezoidal y/o irregular. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos en el que dichos electrodos pueden comprender dimensiones de electrodo que varían de aproximadamente 100 |jm por 100 |jm a aproximadamente 10 cm por 10 cm. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos intercalados. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos pueden comprender óxido de indio y estaño ("ITO"), óxidos conductores transparentes ("TCO"), polímeros conductores, nanotubos de carbono ("CNT"), grafeno, mallas de nanohilos y/o películas metálicas ultrafinas, por ejemplo, ITO.
Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender gotículas, en el que dichas gotículas pueden comprender un volumen que varía de aproximadamente 1 pl a aproximadamente 5 ml, por ejemplo, de aproximadamente 12,5 jl. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender entre 1 a aproximadamente 400 puertos de entrada/salida para cargar y retirar la misma muestra o muestras diferentes, y/o dicho dispositivo comprende además entre 1 a aproximadamente 100 puertos de entrada/salida para la introducción y retirada de fluido(s) de relleno. Algunos modos de realización se refieren a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender puertos de entrada/salida en los que la separación entre puertos contiguos varía de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 500 mm. Adicionalmente, otro modo de realización se refiere a un procedimiento en el que el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender o puede estar en contacto con al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección. Otro modo de realización se refiere a un procedimiento en el que dicho elemento de calentamiento puede comprender un elemento de calentamiento por inducción. Otro modo de realización se refiere en general a un procedimiento en el que dicho elemento de calentamiento puede comprender un calentador de contacto.
Un aspecto adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la zona de detección puede detectar señales electroquímicas y/o fluorescentes. Aún otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha zona de detección puede detectar la capacitancia de una gotícula. Un modo de realización adicional de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha zona de detección puede ser una localización fija. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha zona de detección puede comprender cualquier localización dentro del dispositivo basado en electrohumectación. Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento de amplificación puede comprender una PCR de inicio en caliente. En otro modo de realización, la invención engloba en general un procedimiento en el que dicha amplificación puede comprender una amplificación isotérmica. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha amplificación puede comprender termociclado. Dicho termociclado puede comprender temperaturas que varían de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 98 °C, por ejemplo, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 72 °C, aproximadamente 95 °C o aproximadamente 98 °C. Dicho termociclado puede comprender tiempos que varían de aproximadamente 1 s a aproximadamente 5 min, por ejemplo, aproximadamente 1 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 20 s, aproximadamente 30 s, aproximadamente 45 s, aproximadamente 1 min y/o aproximadamente 5 min. Además, dicho termociclado puede comprender tres etapas de termociclo, y dichas tres etapas de termociclo se pueden completar en un minuto o menos.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que cada gotícula puede comprender además un agente de detección. En un modo de realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento en el que cada gotícula puede contener el mismo agente de detección. Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que cada gotícula puede contener un agente de detección diferente. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que las gotículas pueden comprender un subconjunto marcado de gotículas en el que cada gotícula dentro del subconjunto contiene un agente para detectar el ácido nucleico diana, y un subconjunto no marcado de gotículas en el que cada gotícula dentro del subconjunto no contiene dicho agente para detectar el ácido nucleico diana. Un modo de realización adicional de la invención engloba en general un procedimiento en el que cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender un agente de detección diferente. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender el mismo agente de detección.
Un aspecto adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que dicho análisis o procesamiento posterior de dicha al menos una gotícula puede comprender un análisis o procesamiento posterior de una o más gotículas de dicho subconjunto no marcado de gotículas. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que cada subconjunto de gotículas puede comprender 1 o más, 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1000 o más, o 10.000 o más gotículas. Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el agente para detectar el ácido nucleico diana puede comprender una sonda de hidrólisis, un tinte de unión a ADN, una sonda de cebador o un análogo de un ácido nucleico. En algunos modos de realización, dicho tinte de unión a ADN puede comprender una concentración que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 |j M, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 1 j M. Algunos modos de realización de la invención se refieren en general a un procedimiento en el que la sonda de hidrólisis puede comprender uno o más cebadores TaqMan, TaqMan-MGB y/o Snake. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha sonda de hidrólisis se puede combinar con un fluoróforo que efectúa la detección de ácido nucleico, por ejemplo, en el que dicho fluoróforo puede comprender FAM, TET, HEX, VIC, Cy3, Cy5, fluoresceína, rodamina, Oregon Green, eosina, Texas Red, cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina, merocianina, hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, Lucifer Yellow, R-ficoeritrina, peridinina-clorofila-proteína, FluorX, BODIPY-fluoresceína, Cy2, Cy3B, Cy3.5, Cy5.5, Cy7, TRITC, Lissamine-rodamina B o aloficocianina.
En otro modo de realización de la invención, dicho tinte de unión a ADN puede comprender bromuro de etidio, Sybr Green, PicoGreen, Sybr Gold, Syto 9, Syto 13, Syto 16, Sytox Blue, cromomicina A3, Os[(bpy)2DPPZ]2+ ("Op D"), BEBO, BETO, BOXTO, Evagreen, yoduro de propidio, cromomicina, mitramicina, naranja tiazol, Cytrak Orange, LDS 751,7-AAD, Sytox Green, Sytox Orange, To To -3, DRAG5, DRAG7, naranja de acridina, ResoLight, Hoechst 33258, TOTO-1, YOYO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-3 o 4',6-diamidino-2-fenilindol ("DAPI"). En algunos modos de realización, dicho tinte de unión a ADN puede comprender OPD, ResoLight, Syto 9 y/o Sybr Green. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la sonda de cebador puede comprender una sonda Scorpion, una sonda Amplifuor, una sonda Sunrise, una sonda Lux, una sonda Cyclicon o una sonda Angler. Un modo de realización adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la sonda de hibridación puede comprender una sonda de hibridación de FRET, una sonda de baliza molecular, una sonda Hybeacon, una sonda MGB tal como MGB-Pleiades y MGB-Eclipse, una sonda Resonsense o una sonda Yin-Yang. Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el análogo de un ácido nucleico puede comprender un PNA, LNA, ZNA, cebador Plexo o sonda de baliza molecular diminuta. Un modo de realización adicional de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicha cuantificación del ácido nucleico diana amplificado puede comprender un ensayo basado en detección, por ejemplo, en el que dicho ensayo basado en detección puede comprender un ensayo Invader, un ensayo de amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos ("NASBA") y/o medición capacitiva de una gotícula. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que se puede usar una ácido nucleico polimerasa para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, dicha polimerasa puede comprender ADN polimerasa Kapa HiFi y/o ADN polimerasa Kapa Sybr Fast. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que la polimerasa se puede proporcionar a partir de las siguientes: arqueas (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent, GenBank: AAA72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: d 12983, BAA02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis KODI (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp., cepa KOD (Pfx, GenBank: AAE68738), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus 9 grados Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: CAA93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; documento WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP143776), Pyrococcus sp. GE23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST700 (GenBank: CAC12847), Thermococcus pacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zilligii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus onnurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jannaschii (GenBank: Q58295), especie TOK de Desulforococcus, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras polimerasas de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)), polimerasas de bacterias termófilas de las especies de Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aquaticus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus, polimerasa de KOD, polimerasa de TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7, phi29, Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, P. sp. GB-D, KOD, Pfu, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis y Thermococcus sp. 9N-7.
Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la ácido nucleico polimerasa puede ser una polimerasa de tipo A natural modificada. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la polimerasa de tipo A modificada se puede seleccionar de cualquier especie del género Meiothermus, Thermotoga o Thermomicrobium. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la polimerasa se puede aislar de cualquiera de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus caldophilus o Thermus filiformis. Otro modo de realización de la invención engloba en general un procedimiento en el que la polimerasa de tipo A modificada se puede aislar de Bacillus stearothermophilus, Sphaerobacter thermophilus, Dictoglomus thermophilum o Escherichia coli. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la polimerasa de tipo A modificada puede ser una polimerasa Taq-E507K mutante. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que se puede usar una polimerasa termoestable para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la polimerasa termoestable se puede seleccionar de las siguientes: Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie Sps17 de Thermus, especie Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus. Aún en otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que se puede usar una polimerasa modificada para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana, por ejemplo, en el que dicha polimerasa modificada se puede seleccionar de las siguientes: ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una A d N polimerasa G46E E678G CS6, ADN polimerasa Z05, polimerasa AZ05, polimerasa AZ05-Gold, polimerasa AZ05R, ADN polimerasa Taq E615G, polimerasa TMA-25 E678G y polimerasa TMA-30 E678G.
Un modo de realización adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la detección del agente de detección se puede producir al final de un ciclo de amplificación. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que la detección del agente de detección se puede producir en cualquier punto durante la amplificación. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que cada gotícula puede comprender en promedio menos de una copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana, una única copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana o una concentración de 0,001 pg/|jl o más, 0,01 pg/|jl o más, 0,1 pg/|jl o más o 1,0 pg/jil o más de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, dicha gotícula puede comprender una concentración diana de material amplificado, por ejemplo, un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico diana, que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 1 jiM, aproximadamente 10 jiM, aproximadamente 100 jiM o aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, dicha gotícula puede comprender una concentración de partida de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico diana, que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 1 jM , aproximadamente 10 jM , aproximadamente 100 jM o aproximadamente 1 mM. Otro modo de realización de la invención se refiere a un procedimiento en el que dicho ácido nucleico diana se puede derivar de una muestra biológica, por ejemplo, en el que dicha muestra biológica puede comprender un tumor, un ganglio linfático, una biopsia, metástasis, un pólipo, un quiste, sangre completa, saliva, esputo, una célula bacteriana, un virus, líquido linfático, suero, plasma, sudor, una lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, semen, excreción vaginal, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, orina, jugo gástrico, líquido intestinal y/o muestras fecales. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que dicho ácido nucleico diana puede comprender un biomarcador. Dicho biomarcador se puede seleccionar de: un inhibidor del punto de control inmunitario, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, ligandos de la familia B-7 o un ligando de un inhibidor del punto de control inmunitario, o una combinación de los mismos. Adicionalmente, dicho biomarcador se puede seleccionar de AKAP4, ALK, APC, AR, BRAF, BRCA1, BRCA2, CCND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CFB, CFH, CFI, DKK1, DPYD, EDNRB, EGFR, ERBB2, EPSTI1, ESRI, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FN14, HER2, HER4, HERC5, IDH1, IDH2, IDO1, KIF5B, KIT, KRAS, LGR5, LIV1, LY6E, LYPD3, MACC1, MET, MRD, MSI, MSLN, MUC16, MYC, NaPi3b, NRAS, PDGFRA, PDCD1LG2, RAFI, RNF43, NTRK1, NTSR1, OX40, PIK3CA, RET, ROS1, Septin9, TERT, TFRC, TROP2, TP53, TWEAK, UGT1A1, P13KCA, p53, MAP2K4, ATR o cualquier otro biomarcador en el que su expresión se correlaciona con un cáncer específico.
Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento puede detectar un polimorfismo mononucleotídico. Un modo de realización adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para la generación de amplicones. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para un análisis de curva de fusión. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para el enriquecimiento de ácido nucleico diana. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para el enriquecimiento de dianas por extensión del cebador ("PETE"). Un modo de realización adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para la amplificación de colecciones. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para cuantificar el número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador durante la preparación de colecciones. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que dicha cuantificación del número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador se puede producir (a) después de la ligación de adaptador para determinar la cantidad de material de entrada convertido en moléculas ligadas al adaptador (tasa de conversión) y/o la cantidad de molde usada para la amplificación de colecciones; (b) después de la amplificación de colecciones, para determinar si se ha generado una cantidad suficiente de cada colección y/o para garantizar una representación equitativa de colecciones indexadas agrupadas para la captura de diana o la amplificación de conglomerados; y/o (c) antes de la amplificación de conglomerados, para confirmar que las colecciones individuales o las agrupaciones de muestras se diluyen hasta la concentración óptima para la carga de la cubeta de lectura de NGS. Adicionalmente, dicha cuantificación del número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador se puede producir después de las etapas de limpieza posteriores a la ligación (antes de la amplificación de colecciones).
Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que después de recuperar al menos una gotícula, dicho análisis o procesamiento posterior de dicha al menos una gotícula puede comprender una reacción de secuenciación de ácido nucleico, una reacción de secuenciación de segunda generación, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo o dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas, sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN, análisis de transcriptoma y/o sec. de metilación. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que las gotículas pueden estar rodeadas por un fluido de relleno, por ejemplo, en el que dicho fluido de relleno puede ser un aceite. En algunos modos de realización, dicho aceite puede comprender un aceite transparente. En algunos modos de realización, dicho aceite puede comprender siloxano polimerizado líquido, aceite de silicona, aceite de vaselina y/o aceite de parafina. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que las gotículas pueden estar rodeadas por un gas, por ejemplo, en el que dicho gas puede ser aire. Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para evitar el sesgo de sobreamplificación. Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para producir una muestra representativa de una población de mutaciones. En otro modo de realización, la invención engloba en general un procedimiento en el que el procedimiento se puede usar para determinar el número de ciclos de amplificación necesarios para generar la concentración deseada de un ácido nucleico diana. En otro modo de realización, la invención se refiere en general a un procedimiento en el que el procedimiento se puede controlar a través de un ordenador en comunicación con el dispositivo basado en electrohumectación. Algunos modos de realización se refieren en general a un procedimiento en el que dicho procedimiento comprende una mezcla maestra. En algunos modos de realización, dicha mezcla maestra puede comprender una polimerasa, dNTP, MgCl2 y/o cebador(es) oligonucleotídico(s). En algunos modos de realización, dicha mezcla maestra puede comprender dNTP en una concentración que comprende de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 100 mM; MgCb a una concentración que comprende de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 100 mM; y/o un cebador(es) oligonucleotídico(s) a una concentración que comprende de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1 |jM o aproximadamente 1 mM.
Otro aspecto de la invención se refiere en general a un dispositivo para la amplificación de un ácido nucleico diana, en el que dicho dispositivo puede (a) comprender una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación; (b) comprender o estar en contacto con al menos un elemento de calentamiento; y (c) comprender o estar en contacto con al menos una zona de detección. En un modo de realización de la invención, dicho elemento de calentamiento puede comprender un elemento de calentamiento por inducción. Otro aspecto de la invención se refiere en general a un dispositivo para la amplificación de un ácido nucleico diana, en el que dicho dispositivo puede (a) comprender una configuración plana de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación; (b) comprender o estar en contacto con al menos un elemento de calentamiento; y (c) comprender o estar en contacto con al menos una zona de detección. En un modo de realización de la invención, dicho elemento de calentamiento puede comprender un elemento de calentamiento por inducción. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden comprender conformaciones cuadradas, opcionalmente de aproximadamente 5 mm por 5 mm. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden comprender conformaciones cuadradas, triangulares, rectangulares, circulares, trapezoidales y/o irregulares. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden comprender dimensiones de electrodo que varían de aproximadamente 100 |jm por 100 |jm a aproximadamente 10 cm por 10 cm. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden estar intercalados. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden comprender óxido de indio y estaño ("ITO"), óxidos conductores transparentes ("TCO"), polímeros conductores, nanotubos de carbono ("CNT"), grafeno, mallas de nanohilos y/o películas metálicas ultrafinas, por ejemplo, ITO. En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender gotículas que varían en volumen de aproximadamente 1 picolitro a aproximadamente 5 ml, por ejemplo, aproximadamente 12,5 jl. En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender un espacio entre una placa superior y una placa inferior de aproximadamente 0,5 mm. En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender una pluralidad de puertos de entrada/salida. En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender entre 1 a aproximadamente 400 puertos de entrada/salida para cargar y retirar la misma muestra o muestras diferentes, y/o dicho dispositivo comprende además entre 1 a aproximadamente 100 puertos de entrada/salida para la introducción y la retirada de fluido(s) de relleno. En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender puertos de entrada/salida en los que la separación entre puertos contiguos varía de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 500 mm. En otro modo de realización de la invención, dicho elemento de calentamiento puede comprender un calentador de contacto. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un modo de realización en la que dicha amplificación comprende termociclado. Dicho termociclado puede comprender tres etapas de termociclo, y dichas tres etapas de termociclo se pueden completar en un minuto o menos. En otro modo de realización, dicha amplificación puede comprender una amplificación isotérmica. En otro modo de realización de la invención, dicha amplificación puede comprender una PCR de inicio en caliente. Aún en otro modo de realización de la invención, la zona de detección puede detectar señales electroquímicas y/o fluorescentes. Un modo de realización adicional de la invención se refiere a una zona de detección que puede detectar la capacitancia de una gotícula. En otro modo de realización de la invención, dicha zona de detección puede ser una localización fija. En otro modo de realización de la invención, dicha zona de detección puede comprender cualquier localización dentro del dispositivo basado en electrohumectación. En otro modo de realización de la invención, el ácido nucleico diana se puede proporcionar en el dispositivo dentro de al menos tres gotículas. En otro modo de realización de la invención, dichas gotículas pueden comprender cada una el mismo ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, dichas gotículas pueden comprender una mezcla de gotículas que contienen el mismo ácido nucleico diana y diferentes ácidos nucleicos diana. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender además un agente de detección. En un modo de realización adicional de la invención, cada gotícula puede contener el mismo agente de detección. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede contener un agente de detección diferente. Adicionalmente, en otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden comprender un subconjunto marcado de gotículas que contiene cada una un agente para detectar el ácido nucleico diana, y un subconjunto no marcado de gotículas que no contienen ninguna dicho agente para detectar el ácido nucleico diana. En un modo de realización adicional de la invención, cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender un agente de detección diferente. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender el mismo agente de detección. En otro modo de realización de la invención, cada subconjunto de gotículas puede comprender 1 o más, 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1000 o más o 10.000 o más gotículas.
En un modo de realización adicional de la invención, el agente para detectar el ácido nucleico diana puede comprender una sonda de hidrólisis, un tinte de unión a ADN, una sonda de cebador o un análogo de un ácido nucleico. En otro modo de realización de la invención, la sonda de hidrólisis puede comprender uno o más cebadores TaqMan, TaqMan-MGB y/o Snake. En otro modo de realización de la invención, dicha sonda de hidrólisis se puede combinar con un fluoróforo que efectúa la detección de ácido nucleico, por ejemplo, en el que dicho fluoróforo puede comprender FAM, TET, HEX, VIC, Cy3, Cy5, fluoresceína, rodamina, Oregon Green, eosina, Texas Red, cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina, merocianina, hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, amarillo de Lucifer, R-ficoeritrina, peridinina-clorofila-proteína, FluorX, BODIPY-fluoresceína, Cy2, Cy3B, Cy3.5, Cy5.5, Cy7, TRITC, Lissamine-rodamina B o aloficocianina. Aún en otro modo de realización de la invención, el tinte de unión a ADN puede comprender bromuro de etidio, Sybr Green, Picogreen, Sybr Gold, Syto 9, Syto 13, Syto 16, Sytox Blue, cromomicina A3, Os[(bpy)2DPPZ]2+ ("OpD"), BEBO, BETO, BOXTO, Evagreen, yoduro de propidio, cromomicina, mitramicina, naranja tiazol, Cytrak Orange, LDS751, 7-AAD, Sytox Green, Sytox Orange, TOTO-3, DRAG5, DRAG7, naranja de acridina, ResoLight, Hoechst 33258, TOTO-1, YOYO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-3 o 4',6-diamidino-2-fenilindol ("DAPI"). Aún en otro modo de realización de la invención, la sonda de cebador puede comprender una sonda Scorpion, una sonda Amplifuor, una sonda Sunrise, una sonda Lux, una sonda Cyclicon o una sonda Angler. En otro modo de realización de la invención, la sonda de hibridación puede comprender una sonda de hibridación de FRET, una sonda de baliza molecular, una sonda Hybeacon, una sonda m Gb tal como MGB-Pleiades y MGB-Eclipse, una sonda Resonsense o una sonda Yin-Yang. En otro modo de realización de la invención, el análogo de un ácido nucleico puede comprender un PNA, LNA, ZNA, cebador Plexo o sonda de baliza molecular diminuta. Además, en otro modo de realización de la invención, el agente de detección puede comprender un ensayo basado en detección, por ejemplo, en el que dicho ensayo basado en detección puede comprender un ensayo Invader, un ensayo de amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos ("NASBA") y/o medición capacitiva de una gotícula.
En un modo de realización adicional de la invención, se usa una ácido nucleico polimerasa para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa se puede proporcionar a partir de las siguientes: arqueas (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent, GenBank: AAA72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: D12983, BAA02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis k Od I (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp., cepa KOD (Pfx, GenBank: AAE68738)), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus 9 grados Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: CAA93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; documento WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP143776), Pyrococcus sp. GE23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST700 (GenBank: CAC12847), Thermococcus pacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zilligii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus onnurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jannaschii (GenBank: Q58295), especie TOK de Desulforococcus, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras polimerasas de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)), polimerasas de bacterias termófilas de las especies de Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aquaticus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus, polimerasa de KOD, polimerasa de TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7, phi29, Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, P. sp. GB-D, KOD, Pfu, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis y Thermococcus sp. 9N-7. En otro modo de realización de la invención, la ácido nucleico polimerasa puede ser una polimerasa de tipo A natural modificada. En otro modo de realización de la invención, en el que la polimerasa de tipo A modificada se puede seleccionar de cualquier especie del género Meiothermus, Thermotoga o Thermomicrobium. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa de tipo A modificada se puede aislar de cualquiera de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus caldophilus o Thermus filiformis. En un modo de realización adicional de la invención, la polimerasa de tipo A modificada se puede aislar de Bacillus stearothermophilus, Sphaerobacter thermophilus, Dictoglomus thermophilum o Escherichia coli. Aún en otro modo de realización de la invención, la polimerasa de tipo A modificada puede ser una polimerasa Taq-E507K mutante. En otro modo de realización de la invención se puede usar una polimerasa termoestable para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, la polimerasa termoestable se puede seleccionar de las siguientes: Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie Sps17 de Thermus, especie Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus. En otro modo de realización de la invención se puede usar una polimerasa modificada para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa modificada se puede seleccionar de las siguientes: incluyen ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, ADN polimerasa Z05, polimerasa AZ05, polimerasa AZ05-Gold, polimerasa AZ05r , ADN polimerasa Taq E615G, polimerasa TMA-25 E678G y polimerasa TMA-30 E678G.
Aún en otro modo de realización de la invención, las gotículas se pueden termociclar en paralelo. En otro modo de realización de la invención se puede usar el agente para cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana que se ha amplificado. En otro modo de realización de la invención, la detección del agente de detección se puede producir al final de un ciclo de amplificación. En otro modo de realización de la invención, la detección del agente de detección se puede producir en cualquier punto durante la amplificación. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender en promedio menos de una copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender una única copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana, o cada gotícula puede comprender una concentración de 0,001 pg/|jl o más, 0,01 pg/pl o más, 0,1 pg/|jl o más o 1,0 pg/|jl o más de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, dicho ácido nucleico diana se puede derivar de una muestra biológica, por ejemplo, en la que la muestra biológica puede comprender un tumor, un ganglio linfático, una biopsia, metástasis, un pólipo, un quiste, sangre completa, saliva, esputo, una célula bacteriana, un virus, líquido linfático, suero, plasma, sudor, una lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, semen, excreción vaginal, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, orina, jugo gástrico, líquido intestinal y/o muestras fecales. En otro modo de realización de la invención, dicho ácido nucleico diana puede comprender un biomarcador. Dicho biomarcador se puede seleccionar de: un inhibidor del punto de control inmunitario, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, ligandos de la familia B-7 o un ligando de un inhibidor del punto de control inmunitario, o una combinación de los mismos. Adicionalmente, dicho biomarcador se puede seleccionar de AKAP4, ALK, APC, AR, BRAF, BRCA1, BRCA2, CCND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CFB, CFH, CFI, DKK1, DPYD, EDNRB, EGFR, ERBB2, EPSTI1, ESR1, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FN14, HER2, HER4, HERC5, IDH1, IDH2, IDO1, KIF5B, KIT, KRAS, LGR5, LIV1, LY6E, LYPD3, MACC1, MET, MRD, MSI, MSLN, MUC16, MYC, NaPi3b, NRAS, PDGFRA, PDCD1LG2, RAF1, RNF43, NTRK1, NTSR1, OX40, PIK3CA, RET, ROS1, Septin 9, TERT, TFRC, TROP2, TP53, TWEAK, UGT1A1, PI3KCA, p53, MAP2K4, ATR o cualquier otro biomarcador en el que su expresión se correlacione con un cáncer específico.
En otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede detectar un polimorfismo mononucleotídico. Aún en otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede efectuar la generación de amplicones. En un modo de realización adicional de la invención, el dispositivo puede efectuar un análisis de la curva de fusión. Aún en otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede efectuar el enriquecimiento de ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede efectuar PETE. En un modo de realización adicional de la invención, el dispositivo puede efectuar la amplificación de colecciones. En otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede cuantificar el número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador durante la preparación de colecciones. Por ejemplo, dicha cuantificación se puede producir (a) después de la ligación de adaptador para determinar la cantidad de material de entrada convertido en moléculas ligadas al adaptador (tasa de conversión) y/o la cantidad de molde usada para la amplificación de colecciones; (b) después de la amplificación de colecciones, para determinar si se ha generado una cantidad suficiente de cada colección y/o para garantizar una representación equitativa de las colecciones indexadas agrupadas para la captura de diana o la amplificación de conglomerados; y/o (c) antes de la amplificación de conglomerados, para confirmar que las colecciones individuales o las agrupaciones de muestras se diluyen hasta la concentración óptima para la carga de la cubeta de lectura de NGS. Además, dicha cuantificación se puede producir después de las etapas de limpieza posteriores a la ligación (antes de la amplificación de colecciones). Aún en otro modo de realización de la invención, después de que se ha obtenido una cantidad deseada del ácido nucleico diana, se puede recuperar al menos una gotícula de dicho dispositivo antes del análisis o procesamiento adicional de dicha gotícula. Por ejemplo, dicho análisis o procesamiento posterior de dicha al menos una gotícula puede comprender una reacción de secuenciación de ácido nucleico, una reacción de secuenciación de segunda generación, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo o dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas, sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN, análisis de transcriptoma y/o sec. de metilación.
En otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden estar rodeadas por un fluido de relleno, por ejemplo, en el que dicho fluido de relleno puede ser un aceite. Aún en otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden estar rodeadas por un gas, por ejemplo, en el que dicho gas es aire. En otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede evitar el sesgo de sobreamplificación. En otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede producir una muestra representativa de una población de mutaciones. En otro modo de realización de la invención, el dispositivo puede determinar el número de ciclos de amplificación necesarios para generar la concentración deseada de ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, el dispositivo se puede controlar a través de un ordenador en comunicación con el dispositivo basado en electrohumectación.
Otro aspecto de la invención se refiere en general a un sistema de amplificación automatizada de un ácido nucleico diana que puede comprender: (a) un dispositivo basado en electrohumectación; (b) al menos un elemento de calentamiento que comprende o está en contacto con el dispositivo basado en electrohumectación; (c) al menos una zona de detección que comprende o está en contacto con el dispositivo basado en electrohumectación. En un modo de realización de la invención, dicho elemento de calentamiento puede comprender un elemento de calentamiento por inducción. En otro modo de realización de la invención, dicho elemento de calentamiento puede comprender un calentador de contacto. Un aspecto adicional de la invención se refiere a un modo de realización en la que dicha amplificación comprende termociclado. Dicho termociclado puede comprender tres etapas de termociclo, y dichas tres etapas de termociclo se pueden completar en un minuto o menos. En otro modo de realización, dicha amplificación puede comprender una amplificación isotérmica. En otro modo de realización de la invención, dicha amplificación puede comprender una PCR de inicio en caliente. Aún en otro modo de realización de la invención, la zona de detección puede detectar señales electroquímicas y/o fluorescentes. Un modo de realización adicional de la invención se refiere a una zona de detección que puede detectar la capacitancia de una gotícula. En otro modo de realización de la invención, dicha zona de detección puede ser una localización fija. En otro modo de realización de la invención, dicha zona de detección puede comprender cualquier localización dentro del sistema. En otro modo de realización de la invención, el ácido nucleico diana se puede proporcionar en el sistema dentro de al menos tres gotículas. En otro modo de realización de la invención, dichas gotículas pueden comprender cada una el mismo ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, dichas gotículas pueden comprender una mezcla de gotículas que contienen el mismo ácido nucleico diana y diferentes ácidos nucleicos diana. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender además un agente de detección. En un modo de realización adicional de la invención, cada gotícula puede contener el mismo agente de detección. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede contener un agente de detección diferente. Adicionalmente, en otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden comprender un subconjunto marcado de gotículas que contiene cada una un agente para detectar el ácido nucleico diana, y un subconjunto no marcado de gotículas que no contienen ninguna dicho agente para detectar el ácido nucleico diana.
En un modo de realización adicional de la invención, cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender un agente de detección diferente. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula dentro del subconjunto que contiene un agente de detección puede comprender el mismo agente de detección. En otro modo de realización de la invención, cada subconjunto de gotículas puede comprender 1 o más, 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1000 o más o 10.000 o más gotículas.
En un modo de realización adicional de la invención, el agente para detectar el ácido nucleico diana puede comprender una sonda de hidrólisis, un tinte de unión a ADN, una sonda de cebador o un análogo de un ácido nucleico. En otro modo de realización de la invención, la sonda de hidrólisis puede comprender uno o más cebadores TaqMan, TaqMan-MGB y/o Snake. En otro modo de realización de la invención, dicha sonda de hidrólisis se puede combinar con un fluoróforo que efectúa la detección de ácido nucleico, por ejemplo, en el que dicho fluoróforo puede comprender FAM, TET, HEX, VIC, Cy3, Cy5, fluoresceína, rodamina, Oregon Green, eosina, Texas Red, cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina, merocianina, hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, amarillo de Lucifer, R-ficoeritrina, peridinina-clorofila-proteína, FluorX, BODIPY-fluoresceína, Cy2, Cy3B, Cy3.5, Cy5.5, Cy7, TRITC, Lissamine-rodamina B o aloficocianina. Aún en otro modo de realización de la invención, el tinte de unión a ADN puede comprender bromuro de etidio, Sybr Green, Picogreen, Sybr Gold, Syto 9, Syto 13, Syto 16, Sytox Blue, cromomicina A3, Os[(bpy)2DPPZ]2+, BEBO, BETO, BOXTO, Evagreen, yoduro de propidio, cromomicina, mitramicina, naranja tiazol, Cytrak Orange, LDS751, 7-AAD, Sytox Green, Sytox Orange, TOTO-3, DRAG5, DRAG7, naranja de acridina, ResoLight, Hoechst 33258, TOTO-1, YOYO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-3 o 4',6-diamidino-2-fenilindol ("DAPI"). Aún en otro modo de realización de la invención, la sonda de cebador puede comprender una sonda Scorpion, una sonda Amplifuor, una sonda Sunrise, una sonda Lux, una sonda Cyclicon o una sonda Angler. En otro modo de realización de la invención, la sonda de hibridación puede comprender una sonda de hibridación de FRET, una sonda de baliza molecular, una sonda Hybeacon, una sonda m Gb tal como MGB-Pleiades y MGB-Eclipse, una sonda Resonsense o una sonda Yin-Yang. En otro modo de realización de la invención, el análogo de un ácido nucleico puede comprender un PNA, LNA, ZNA, cebador Plexo o sonda de baliza molecular diminuta. Además, en otro modo de realización de la invención, el agente de detección puede comprender un ensayo basado en detección, por ejemplo, en el que dicho ensayo basado en detección puede comprender un ensayo Invader, un ensayo de amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos ("NASBA") y/o medición capacitiva de una gotícula.
En un modo de realización adicional de la invención, se usa una ácido nucleico polimerasa para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa se puede proporcionar a partir de las siguientes: arqueas (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent, GenBank: AAA72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: D12983, BAA02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis k Od I (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp., cepa KOD (Pfx, GenBank: AAE68738)), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus 9 grados Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: CAA93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; documento WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP143776), Pyrococcus sp. GE23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST700 (GenBank: CAC12847), Thermococcus pacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zilligii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus onnurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jannaschii (GenBank: Q58295), especie TOK de Desulforococcus, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras polimerasas de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)), polimerasas de bacterias termófilas de las especies de Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aquaticus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus, polimerasa de KOD, polimerasa de TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7, phi29, Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, P. sp. GB-D, KOD, Pfu, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis y Thermococcus sp. 9N-7. En otro modo de realización de la invención, la ácido nucleico polimerasa puede ser una polimerasa de tipo A natural modificada. En otro modo de realización de la invención, en el que la polimerasa de tipo A modificada se puede seleccionar de cualquier especie del género Meiothermus, Thermotoga o Thermomicrobium. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa de tipo A modificada se puede aislar de cualquiera de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus caldophilus o Thermus filiformis. En un modo de realización adicional de la invención, la polimerasa de tipo A modificada se puede aislar de Bacillus stearothermophilus, Sphaerobacter thermophilus, Dictoglomus thermophilum o Escherichia coli. Aún en otro modo de realización de la invención, la polimerasa de tipo A modificada puede ser una polimerasa Taq-E507K mutante. En otro modo de realización de la invención se puede usar una polimerasa termoestable para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, la polimerasa termoestable se puede seleccionar de las siguientes: Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie Sps17 de Thermus, especie Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus. En otro modo de realización de la invención se puede usar una polimerasa modificada para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, la polimerasa modificada se puede seleccionar de las siguientes: incluyen ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, ADN polimerasa Z05, polimerasa AZ05, polimerasa AZ05-Gold, polimerasa AZ05r , ADN polimerasa Taq E615G, polimerasa TMA-25 E678G y polimerasa TMA-30 E678G.
Aún en otro modo de realización de la invención, las gotículas se pueden termociclar en paralelo. En otro modo de realización de la invención se puede usar el agente para cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana que se ha amplificado. En otro modo de realización de la invención, la detección del agente de detección se puede producir al final de un ciclo de amplificación. En otro modo de realización de la invención, la detección del agente de detección se puede producir en cualquier punto durante la amplificación. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender en promedio menos de una copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, cada gotícula puede comprender una única copia de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana, o cada gotícula puede comprender una concentración de 0,001 pg/|jl o más, 0,01 pg/pl o más, 0,1 pg/|jl o más o 1,0 pg/|jl o más de una muestra de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico diana. En otro modo de realización de la invención, dicho ácido nucleico diana se puede derivar de una muestra biológica, por ejemplo, en la que la muestra biológica puede comprender un tumor, un ganglio linfático, una biopsia, metástasis, un pólipo, un quiste, sangre completa, saliva, esputo, una célula bacteriana, un virus, líquido linfático, suero, plasma, sudor, una lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, semen, excreción vaginal, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, orina, jugo gástrico, líquido intestinal y/o muestras fecales. En otro modo de realización de la invención, dicho ácido nucleico diana puede comprender un biomarcador. Dicho biomarcador se puede seleccionar de: un inhibidor del punto de control inmunitario, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, ligandos de la familia B-7 o un ligando de un inhibidor del punto de control inmunitario, o una combinación de los mismos. Adicionalmente, dicho biomarcador se puede seleccionar de AKAP4, ALK, APC, AR, BRAF, BRCA1, BRCA2, CCND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CFB, CFH, CFI, DKK1, DPYD, EDNRB, EGFR, ERBB2, EPSTI1, ESR1, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FN14, HER2, HER4, HERC5, IDH1, IDH2, IDO1, KIF5B, KIT, KRAS, LGR5, LIV1, LY6E, LYPD3, MACC1, MET, MRD, MSI, MSLN, MUC16, MYC, NaPi3b, NRAS, PDGFRA, PDCD1LG2, RAFI, RNF43, NTRK1, NTSR1, 0X40, PIK3CA, RET, ROS1, Septin 9, TERT, TFRC, TROP2, TP53, TWEAK, UGT1A1, P13KCA, p53, MAP2K4, ATR o cualquier otro biomarcador en el que su expresión se correlacione con un cáncer específico.
En otro modo de realización de la invención, el sistema puede detectar un polimorfismo mononucleotídico. Aún en otro modo de realización de la invención, el sistema puede efectuar la generación de amplicones. En un modo de realización adicional de la invención, el sistema puede efectuar un análisis de la curva de fusión. Aún en otro modo de realización de la invención, el sistema puede efectuar el enriquecimiento de ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, el sistema puede efectuar PETE. En un modo de realización adicional de la invención, el sistema puede efectuar la amplificación de colecciones. En otro modo de realización de la invención, el sistema puede cuantificar el número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador durante la preparación de colecciones. Por ejemplo, dicha cuantificación se puede producir (a) después de la ligación de adaptador para determinar la cantidad de material de entrada convertido en moléculas ligadas al adaptador (tasa de conversión) y/o la cantidad de molde usada para la amplificación de colecciones; (b) después de la amplificación de colecciones, para determinar si se ha generado una cantidad suficiente de cada colección y/o para garantizar una representación equitativa de las colecciones indexadas agrupadas para la captura de diana o la amplificación de conglomerados; y/o (c) antes de la amplificación de conglomerados, para confirmar que las colecciones individuales o las agrupaciones de muestras se diluyen hasta la concentración óptima para la carga de la cubeta de lectura de NGS. Además, dicha cuantificación se puede producir después de las etapas de limpieza posteriores a la ligación (antes de la amplificación de colecciones). Aún en otro modo de realización de la invención, después de que se ha obtenido una cantidad deseada del ácido nucleico diana, se puede recuperar al menos una gotícula de dicho sistema antes del análisis o procesamiento adicional de dicha gotícula. Por ejemplo, dicho análisis o procesamiento posterior de dicha al menos una gotícula puede comprender una reacción de secuenciación de ácido nucleico, una reacción de secuenciación de segunda generación, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo o dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas, sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN, análisis de transcriptoma y/o sec. de metilación.
En otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden estar rodeadas por un fluido de relleno, por ejemplo, en el que dicho fluido de relleno puede ser un aceite. Aún en otro modo de realización de la invención, las gotículas pueden estar rodeadas por un gas, por ejemplo, en el que dicho gas es aire. En otro modo de realización de la invención, el sistema puede evitar el sesgo de sobreamplificación. En otro modo de realización de la invención, el sistema puede producir una muestra representativa de una población de mutaciones. En otro modo de realización de la invención, el sistema puede determinar el número de ciclos de amplificación necesarios para generar la concentración deseada de ácido nucleico diana. Aún en otro modo de realización de la invención, el sistema se puede controlar a través de un ordenador en comunicación con el sistema.
Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo comprende al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) termociclar dichas gotículas en paralelo, en el que dicho termociclado amplifica dicho ácido nucleico diana; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior.
Un modo de realización adicional de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección de dicho agente; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención engloba en general un procedimiento de amplificación automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo comprende al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas, de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN; (c) termociclar dichas gotículas en paralelo, en el que dicho termociclado amplifica dicho ácido nucleico diana; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dichas gotículas a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior.
Otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas, de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación por PCR automatizada que puede comprender (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación con una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección de dicho agente; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo comprende al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) termociclar dichas gotículas en paralelo, en el que dicho termociclado amplifica dicho ácido nucleico diana; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior. Aún otro aspecto de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, en el que dichas gotículas comprenden un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana y un subconjunto de gotículas que no contiene dicho agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección de dicho agente; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dicho subconjunto de gotículas que contiene un agente, recuperar al menos una gotícula de dicho subconjunto de gotículas que no contiene un agente para su análisis o procesamiento posterior. Aún otro aspecto de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo comprende al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas, de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN; (c) termociclar dichas gotículas en paralelo, en el que dicho termociclado amplifica dicho ácido nucleico diana; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dichas gotículas a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior.
Aún otro modo de realización de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas, de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana que comprende un tinte de unión a ADN; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección del tinte de unión a ADN; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior. Aún otro aspecto de la invención se refiere en general a un procedimiento de amplificación por PCR automatizada que comprende (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y además en el que dicho dispositivo contiene al menos un elemento de calentamiento por inducción y al menos una zona de detección; (b) proporcionar en dicho dispositivo al menos 2 gotículas, de las que cada una comprende un ácido nucleico diana diferente, y además en el que dichas gotículas comprenden un agente para la detección de ácido nucleico diana; (c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo; (d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en dicho subconjunto de gotículas que contiene dicho agente a través de la detección de dicho agente; y (e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada de dicho ácido nucleico diana en dichas gotículas, recuperar al menos una gotícula para su análisis o procesamiento posterior.
En algunos modos de realización, dicho dispositivo puede comprender una matriz plana de electrodos. En algunos modos de realización, dichos electrodos pueden ser cuadrados, opcionalmente de 5 mm por 5 mm.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
La FIG. 1A-1B proporciona dos implementaciones de ejemplo de amplificación por qPCR en una plataforma de electrohumectación. La FIG. 1A proporciona una representación de una reacción de amplificación por qPCR en la que solo hay una reacción de gotícula para cada una de cuatro muestras de partida diferentes, marcadas 1-4 en la FIG. 1A. La FIG. 1B proporciona una representación de una reacción de amplificación por qPCR en la que hay dos reacciones de gotículas para cada una de dos muestras de partida diferentes, marcadas 1 y 2 en la FIG. 1B.
La FIG. 2A-2C proporciona una implementación de ejemplo de la amplificación por qPCR en una plataforma de electrohumectación. La FIG. 2A-2C proporciona una representación de una amplificación por qPCR con ocho muestras de partida diferentes, marcadas 1-8 en la FIG. 2A-2C.
La FIG. 3 proporciona un ejemplo de diseño de un dispositivo de electrohumectación que se puede usar con los procedimientos, procesos y sistemas descritos en el presente documento. En la FIG. 3 , las dimensiones se indican en mm y la "," es una coma decimal.
La FIG. 4A-4F proporciona ejemplos no limitantes de conformaciones de electrodos que se pueden usar con un dispositivo basado en electrohumectación como se describe en el presente documento. La FIG. 4A presenta un ejemplo de electrodos con una conformación cuadrada. La FIG. 4B presenta un ejemplo de electrodos con una conformación triangular. La FIG. 4C presenta un ejemplo de electrodos con una conformación trapezoidal. La FIG.
4D, la FIG. 4E y la FIG. 4F presentan ejemplos de electrodos con una conformación irregular. Además, la FIG. 4D, la FIG. 4E y la FIG. 4F presentan ejemplos en los que los electrodos contiguos pueden comprender partes de dichos electrodos que pueden estar intercalados.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc. Todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención a menos que claramente se indique de otro modo.
Se entiende que los términos "gotícula" y "microgotícula" se refieren a la misma entidad y significan un volumen definido de líquido. La gotícula puede estar delimitada por un fluido de relleno, por ejemplo, un aceite, o por un gas tal como el aire, pero se entiende que la gotícula es un volumen definido de un líquido. La gotícula también puede adoptar la forma de diversas conformaciones y tamaños, pero se entiende que la gotícula es un volumen definido de líquido. Las gotículas pueden contener, pero no se limitan a contener, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos diana, agentes de detección, mezclas de reacción, sondas, muestras, productos químicos, proteínas, células, reactivos acuosos, reactivos no acuosos, muestras biológicas y/o muestras biológicas que contienen biomarcadores de interés.
El término "subconjunto de gotículas" se refiere a una agrupación de cualquier cantidad de gotículas que se puede definir por la presencia o ausencia de un componente característico. Por ejemplo, un subconjunto de gotículas puede comprender 1 o más, 2 o más, 10 o más, 100 o más, 1000 o más o 10.000 o más gotículas. Un subconjunto de gotículas se puede definir por la presencia de un agente de detección, o la falta del mismo, por ejemplo.
El término "fluido de relleno" se refiere a un fluido que es suficientemente inmiscible con una gotícula para que la gotícula quede sujeta a manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación. El fluido de relleno puede ser, por ejemplo, un aceite de baja viscosidad, tal como un aceite a base de silicona o un aceite a base de fluorocarbono.
Los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se pueden usar de manera intercambiable a lo largo de la divulgación. El término en general se refiere a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de nucleótidos, etc.) y que comprenden ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN), híbridos de ADN-ARN, oligonucleótidos, polinucleótidos, aptámeros, ácidos peptidonucleicos (PNA), conjugados de PNA-ADN, conjugados de PNA-ARN, etc., que comprenden nucleótidos enlazados covalentemente entre sí, de forma lineal o bien ramificada. Un ácido nucleico es típicamente monocatenario o bicatenario y contendrá en general enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternas, incluyendo, por ejemplo, enlaces de fosforamida (Beaucage et al. (1993), Tetrahedron 49(10):1925); fosforotioato (Mag et al. (1991), Nucleic Acids Res.
19:1437; y la pat. de EE. UU. n.° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989), J. Am. Chem. Soc. 111:2321), O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)) y cadenas principales y enlaces de ácido peptidonucleico (véase Egholm (1992), J. Am. Chem. Soc.
114:1895). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales cargadas positivamente (Denpcy et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097); cadenas principales no iónicas (pat. de EE. UU. n.os 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863) y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las descritas en las pat. de EE. UU. n.os 5.235.033 y 5.034.506. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más glúcidos carbocíclicos también se incluyen en la definición de ácidos nucleicos (véanse Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp. 169-176) y los análogos también se describen, por ejemplo, en Rawls, C & E News, 2 de junio de 1997, página 35. Se pueden realizar estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato para facilitar la adición de restos adicionales tales como marcadores, o para alterar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos.
Además de las bases heterocíclicas naturales que se encuentran típicamente en los ácidos nucleicos (por ejemplo, adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), los análogos de nucleótidos también pueden incluir bases heterocíclicas no naturales, tales como las descritas, por ejemplo, en Seek et al. (1999), Helv. Chim. Acta 82:1640. Determinadas bases usadas en análogos de nucleótidos actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tf). Por ejemplo, algunas de estas incluyen 7-desazapurinas (por ejemplo, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo, propinil-dU, propinil-dC, etc.) y similares, véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 5.990.303. Otras bases heterocíclicas representativas incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-desaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitidina; 5-fluorocitidina; 5-clorocitidina; 5-yodocitidina; 5-bromocitidina; 5-metilcitidina; 5-propinilcitidina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo y similares.
Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico también se pueden referir en general a oligonucleótidos, oligos, polinucleótidos, ADN genómico, ADN mitocondrial (ADNmt), ADN complementario (ADNc), ADN bacteriano, ADN vírico, ARN vírico, ARN, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), a Rn ribosómico (ARNr), ARNip, ARN catalítico, clones, plásmidos, M13, PI, cósmido, cromosoma artificial de bacterias (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC), ácido nucleico amplificado, amplicón, producto de PCR y otros tipos de ácido nucleico amplificado, híbridos de ARN/ADN y PNA, todos los que pueden estar en forma monocatenaria o bien bicatenaria y, a menos que se limiten de otro modo, englobarían análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los nucleótidos naturales y combinaciones y/o mezclas de los mismos. Por tanto, el término "nucleótidos" se refiere tanto a nucleótidos naturales como modificados/no naturales, incluyendo nucleósidos tri, di y monofosfato así como monómeros monofosfato presentes en el ácido polinucleico u oligonucleótido. Un nucleótido también puede ser un ribo; 2'-desoxi; 2',3'-desoxi, así como una amplia gama de otros miméticos nucleotídicos que son bien conocidos en la técnica. Los miméticos incluyen nucleótidos de terminación de cadena, tales como 3'-O-metilo, sustituciones glucídicas o de base halogenada; estructuras glucídicas alternativas incluyendo estructuras de anillo alquilo no glucídicas; bases alternativas incluyendo inosina; modificados con desaza; modificados con conector de chi y psi; modificados con marcador de masa; modificaciones o reemplazos de fosfodiéster incluyendo fosforotioato, metilfosfonato, boranofosfato, amida, éster, éter; y un reemplazo internucleotídico básico o completo, incluyendo enlaces de escisión tales como restos de nitrofenilo fotoescindibles.
Un "nucleósido" se refiere a un componente de ácido nucleico que comprende una base o grupo básico (que comprende al menos un anillo homocíclico, al menos un anillo heterocíclico, al menos un grupo arilo y/o similares) enlazado covalentemente a un resto glucídico (un glúcido ribosa o un glúcido desoxirribosa), un derivado de un resto glucídico o un equivalente funcional de un resto glucídico (por ejemplo, un anillo carbocíclico). Por ejemplo, cuando un nucleósido incluye un resto glucídico, la base está típicamente enlazada a una posición 1' de ese resto glucídico. Como se describe anteriormente, una base puede ser una base natural o una base no natural. Los nucleósidos ejemplares incluyen ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos, didesoxirribonucleósidos y nucleósidos carbocíclicos.
Un "nucleótido de purina" se refiere a un nucleótido que comprende una base de purina, mientras que un "nucleótido de pirimidina" se refiere a un nucleótido que comprende una base de pirimidina.
Un "nucleótido modificado" se refiere a bases de ácido nucleico, nucleótidos y modificaciones infrecuentes o escasas, derivaciones o análogos de bases o nucleótidos convencionales e incluye nucleótidos sintéticos que tienen restos de base modificados y/o restos glúcidos modificados (véanse Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, vol. 26 (Suhier Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N.J., (1994)) y Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).
"Oligonucleótido" como se usa en el presente documento se refiere a oligómeros lineales de monómeros nucleosídicos naturales o modificados unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos. Los oligonucleótidos incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas anoméricas de los mismos, PNA y similares, que se pueden unir específicamente a un ácido nucleico diana. Normalmente, los monómeros se enlazan por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que varían en tamaño de unas pocas unidades monómeras, por ejemplo, 3-4, a varias decenas de unidades monómeras, por ejemplo, 40-60. Cada vez que un oligonucleótido se representa por una secuencia de letras, tal como "ATGCCTG", se entenderá que los nucleótidos están en orden 5'-3' de izquierda a derecha y que "A" indica desoxiadenosina, "C" indica desoxicitidina, "G" indica desoxiguanosina, "T" indica desoxitimidina y "U" indica el ribonucleósido uridina, a menos que se indique de otro modo.
Normalmente, los oligonucleótidos comprenden los cuatro desoxinucleótidos naturales; sin embargo, también pueden comprender ribonucleósidos o análogos nucleotídicos no naturales. Cuando una enzima tiene requisitos de sustratos oligonucleotídicos o polinucleotídicos específicos para su actividad, por ejemplo, ADN monocatenario, dúplex ARN/ADN o similar, entonces la selección de la composición apropiada para los sustratos oligonucleotídicos o polinucleotídicos está bastante dentro del conocimiento de un experto en la técnica.
Como se usa en el presente documento, "cebador oligonucleotídico", o simplemente "cebador", se refiere a una secuencia polinucleotídica que se hibrida a una secuencia en un molde de ácido nucleico diana y puede facilitar la detección o amplificación de un ácido nucleico diana. En procesos de amplificación, un cebador oligonucleotídico sirve como punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico. En procesos distintos de amplificación, se puede usar un cebador oligonucleotídico para crear una estructura que se puede escindir por un agente de escisión. Los cebadores pueden ser de una variedad de longitudes y a menudo son de menos de 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo 12-25 nucleótidos de longitud. La longitud y las secuencias de cebadores para su uso en PCR se pueden diseñar en base a principios conocidos por los expertos en la técnica.
El término "sonda oligonucleotídica" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia polinucleotídica que puede hibridar o aparearse con un ácido nucleico diana de interés y permite la detección específica del ácido nucleico diana.
Los ácidos nucleicos se "extienden" o "alargan" cuando se incorporan nucleótidos adicionales en los ácidos nucleicos, por ejemplo por un biocatalizador que incorpora nucleótidos, en el extremo 3' de un ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, los términos "hibridación" y "apareamiento" y similares se usan de manera intercambiable y se refieren a la interacción de emparejamiento de bases de un polinucleótido con otro polinucleótido (típicamente un polinucleótido antiparalelo) que da como resultado la formación de un dúplex u otra estructura ordenada superior, típicamente denominada complejo de hibridación. La interacción primaria entre las moléculas de polinucleótidos antiparalelos es típicamente específica de base, por ejemplo, A/T y G/C, por enlaces de hidrógeno de tipo Hoogsteen y/o Watson/Crick. No es un requisito que dos polinucleótidos tengan un 100 % de complementariedad en toda su longitud para lograr la hibridación. En algunos aspectos, se puede formar un complejo de hibridación a partir de interacciones intermoleculares o, de forma alternativa, se puede formar a partir de interacciones intramoleculares.
El término "complementario" significa que un ácido nucleico es idéntico a, o se hibrida selectivamente a, otra molécula de ácido nucleico. Existe selectividad de hibridación cuando se produce una hibridación que es más selectiva que la falta total de especificidad. Típicamente, la hibridación selectiva se producirá cuando haya al menos aproximadamente un 55 % de identidad en un tramo de al menos 14-25 nucleótidos, preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 75 % y lo más preferentemente al menos un 90 %. Preferentemente, un ácido nucleico se hibrida específicamente al otro ácido nucleico. Véase M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984).
Un cebador que es "perfectamente complementario" tiene una secuencia completamente complementaria en toda la longitud del cebador y no tiene emparejamientos erróneos. El cebador típicamente es perfectamente complementario a una porción (subsecuencia) de una secuencia diana y/o ácido nucleico diana. Un "emparejamiento erróneo" se refiere a un sitio en el que el nucleótido en el cebador y el nucleótido en el ácido nucleico diana con el que está alineado no son complementarios. El término "sustancialmente complementario" cuando se usa en referencia a un cebador significa que un cebador no es perfectamente complementario a su secuencia diana; en cambio, el cebador solo es suficientemente complementario para hibridarse selectivamente a su hebra respectiva en el sitio de unión al cebador deseado.
El término "ácido nucleico diana", como se usa en el presente documento pretende significar cualquier ácido nucleico con una presencia que se va a detectar, medir, amplificar y/o someter a ensayos y análisis posteriores. El término se refiere en general a un ácido nucleico al que se puede hibridar un ácido nucleico cebador y extenderse en condiciones adecuadas. En el contexto de la amplificación de ácido nucleico, el "ácido nucleico diana" es preferentemente una región de ácido nucleico bicatenario, que consiste en las secuencias al menos parcialmente complementarias a al menos dos secuencias de cebador y la secuencia intermedia. Una diana puede ser también un ácido nucleico monocatenario que consiste en una secuencia al menos parcialmente complementaria de un cebador y una secuencia parcialmente idéntica al segundo cebador. Los ácidos nucleicos diana pueden existir como fragmentos de ácido nucleico aislados o formar parte de un fragmento de ácido nucleico más grande. Los ácidos nucleicos diana se pueden derivar o aislar de esencialmente cualquier fuente, tal como microorganismos cultivados, microorganismos no cultivados, mezclas biológicas complejas, muestras biológicas, tejidos, sueros, tejidos o muestras antiguos o conservados, cultivos aislados ambientales o similares. Además, opcionalmente, los ácidos nucleicos diana incluyen o se derivan de ADNc, ARN, ADN genómico, ADN genómico clonado, colecciones de ADN genómico, ADN o ARN fragmentado enzimáticamente, ADN o ARN fragmentado químicamente, ADN o ARN fragmentado físicamente o similares.
La presencia o ausencia de un ácido nucleico diana se puede medir cuantitativa o cualitativamente. Los ácidos nucleicos diana se pueden presentar en una variedad de formas diferentes, incluyendo, por ejemplo, mezclas simples o complejas, o en formas sustancialmente purificadas. Por ejemplo, un ácido nucleico diana puede ser parte de una muestra que contiene otros componentes o puede ser el componente único o principal de la muestra. Además, un ácido nucleico diana puede tener una secuencia conocida o bien desconocida. El ácido nucleico diana puede o no estar presente en una gotícula antes de que comience la amplificación.
El término "reacción de amplificación" se refiere a cualquier medio in vitro para amplificar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico.
Los términos "amplificación" y "amplificar" y similares se refieren en general a cualquier proceso que da como resultado un incremento en el número de copias de una molécula o conjunto de moléculas relacionadas. Los componentes de una reacción de amplificación pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, cebadores, un molde polinucleotídico, ácido nucleico polimerasa, nucleótidos, dNTP y similares. El término "amplificación" típicamente se refiere a un incremento "exponencial" en el ácido nucleico diana. Sin embargo, "amplificar" como se usa en el presente documento también se puede referir a incrementos lineales en los números de una secuencia diana seleccionada de ácido nucleico. La amplificación típicamente comienza a partir de una pequeña cantidad de un ácido nucleico diana (por ejemplo, una única copia de un ácido nucleico diana), donde el material amplificado es típicamente detectable. La amplificación de un ácido nucleico diana engloba una variedad de procedimientos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de un ácido nucleico diana se puede efectuar por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una PCR de inicio en caliente, una reacción de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), una reacción de amplificación mediada por transcripción (TMA), una reacción de amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR). La amplificación no se limita a la duplicación estricta del ácido nucleico diana de partida. Por ejemplo, la generación de múltiples moléculas de ADNc a partir de una cantidad limitada de ARN vírico en una muestra utilizando RT-PCR es una forma de amplificación. Además, la generación de múltiples moléculas de ARN a partir de una única molécula de ADN durante el proceso de transcripción también es una forma de amplificación. La amplificación puede ir seguida opcionalmente de etapas adicionales, por ejemplo, pero sin limitarse a, marcado, secuenciación, purificación, aislamiento, hibridación, resolución de tamaño, expresión, detección y/o clonación.
El término "ciclo de amplificación" se refiere a las etapas de una reacción de amplificación que son necesarias para incrementar la cantidad de ácido nucleico diana. Por ejemplo, usando un protocolo de termociclado de PCR estándar, un único ciclo de amplificación incluiría las etapas de fusión, hibridación y extensión. En este ejemplo, si se fuera a medir la concentración del ácido nucleico diana al final de este ciclo de amplificación, se mediría después de que se hubiera completado la etapa de extensión.
"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento con lo que un segmento o subsecuencia específico de un ADN bicatenario diana se amplifica en una progresión geométrica. La PCR es bien conocida por los expertos en la técnica; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 4.683.195 y 4.683.202; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990.
Los términos "PCR ultrarrápida" o "PCR cinética" se refieren a la detección y/o cuantificación ultrarrápida del amplicón generado en una PCR.
El término "amplificación de inicio en caliente" se refiere a una forma modificada de PCR que puede evitar la amplificación no específica del ADN al inactivar la ácido nucleico polimerasa, por ejemplo, la polimerasa Taq, a menores temperaturas. La actividad de la ácido nucleico polimerasa se puede inhibir a estas temperaturas a través de diferentes mecanismos, incluyendo la interacción de anticuerpos, la modificación química y la tecnología de aptámeros. A temperaturas de reacción propicias alcanzadas durante el ciclado de PCR, la ácido nucleico polimerasa se disocia de su inhibidor y comienza la polimerización. Además, la PCR de inicio en caliente se puede lograr omitiendo la ácido nucleico polimerasa de la reacción, colocando todos los tubos en la máquina de p Cr y a continuación añadiendo la ácido nucleico polimerasa solo cuando la reacción haya alcanzado los 95 °C. Adicionalmente, otros procedimientos de PCR de inicio en caliente intentan mantener uno o más componentes de la PCR separados entre sí. Esto se puede lograr congelando una mezcla de PCR que contenga cebadores, molde, nucleótidos y agua. Una vez congelados, los componentes de PCR restantes, la ácido nucleico polimerasa, el tampón y el MgCh se pipetean en la parte superior y el tubo se transfiere a una máquina de PCR que ya está a la temperatura de desnaturalización. A medida que la capa congelada se funde, los componentes se mezclan por las corrientes térmicas. Adicionalmente, se pueden usar microesferas de cera para formar una capa que separa las dos mitades de una mezcla de PCR. Esto se puede lograr pipeteando una mezcla de cebador, molde, nucleótido y agua en un tubo de PCR, añadiendo una microesfera de cera, fundiendo la microesfera de cera y permitiendo que la mezcla se enfríe formando una barrera de cera impenetrable por encima de la mezcla de PCR. El pipeteo posterior de los componentes de PCR restantes sobre la capa de cera completa la PCR mientras mantiene los componentes separados. Solo cuando se funde la cera por encima de la temperatura de hibridación de cebador, se mezclan las dos mitades y permiten que se produzca la PCR. La PCR de inicio en caliente puede reducir significativamente el cebado no específico, la formación de dímeros de cebador y, a menudo, incrementa el rendimiento de producto.
Una "reacción de amplificación isotérmica" se refiere a una reacción de amplificación en la que la temperatura no cambia significativamente durante la reacción de amplificación.
Dependiendo del procedimiento de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, se requieren diferentes enzimas para la reacción de amplificación. Los procedimientos isotérmicos conocidos para la amplificación de ácidos nucleicos son, por ejemplo, la amplificación dependiente de helicasa (HDA) (Vincent et al.; "Helicase-dependent isothermal DnA amplification", EMBO Reports 5(8): 795-800 (2004)), HdA termoestable (tHDA) (An, et al., "Characterization of a Thermostable UvrD Helicase and Its Participation in Helicase-dependent Amplification", J. Biol. Chem. 280(32): 28952-28958(2005)), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) (Walker, et al., "Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique", Nucleic Acids Res. 20(7): 1691-6 (1992)), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) [Dean, et al., "Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification", PNAS 99(8): 5261-5266 (2002)), amplificación en círculo rodante (Liu, et al., "Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases", J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 (1996)), amplificación isotérmica de cebador único (SPIA) [Dafforn, et al., "Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis", Biotechniques 37(5):854-7 (2004)] RCA asistida por restricción [Wang et al., "DNA amplification method tolerant to sample degradation", Genome Res. 14:2357-2366 (2004)], amplificación mediada por transcripción (TMA) [Vuorinen, et al., "Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory specimens by Gen-Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test and Roche Amplicor PCR Mycobacterium Tuberculosis Test. J. Clin. Microbiol33:1856-1859 (1995)], amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) [Kievits, et al., "NASBA, isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J.Virol. Methods 35:273-286 (1991)] y reacciones de amplificación usando enzimas de corte, reacción de amplificación de enzimas de corte (NEAR) [Maples, et al., "Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids", documento US2009017453], reacciones de amplificación usando proteínas de recombinación, amplificación de polimerasa-recombinasa (RPA) [Piepenburg, et al., "DNA Detection Using Recombination Proteins", PLoS Biol. 4(7): e204 (2004)] y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) [Notomi, et al., "Loop-mediated isothethial amplification of DNa ", NAR 28(12): e63 (2000)] en la que la al menos una enzima mesófila para amplificar ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas se selecciona del grupo que consiste en helicasa, polimerasas mesófilas, polimerasas mesófilas que tienen actividad de desplazamiento de hebra, enzimas de corte, proteínas de recombinación, ligasas, glucosilasas y nucleasas.
Las "helicasas" son conocidas por los expertos en la técnica. Son proteínas que se mueven direccionalmente a lo largo de una cadena principal de fosfodiéster de ácido nucleico, separando dos hebras de ácido nucleico hibridado (por ejemplo, ADN, ARN o híbrido ARN-ADN) usando energía derivada de la hidrólisis de NTP o dNTP, preferentemente ATP o dATP. En base a la presencia de motivos helicasa definidos, es posible atribuir una actividad helicasa a una proteína dada. Una helicasa se puede seleccionar del grupo que comprende, pero sin limitarse a, helicasas de diferentes familias (helicasas de la superfamilia I (por ejemplo, dda, perA, helicasa de proteína tral del plásmido F, uvrD, helicasas de la superfamilia II (por ejemplo, recQ, helicasa NS3), helicasas de la superfamilia III (por ejemplo, helicasa de AAV rep), helicasas de la superfamilia similar a dnaB (por ejemplo, helicasa del fago T7) o helicasas de la superfamilia similar a rho
Una "polimerasa mesófila" se refiere a una polimerasa que se puede usar para efectuar amplificación isotérmica. Una polimerasa mesófila se puede seleccionar del grupo que comprende, pero sin limitarse a, polimerasa phi29, polimerasa Bst, polimerasa Gst, polimerasa PyroPhage, polimerasa Klenow, polimerasa DisplaceAce. Todas las enzimas se pueden modificar, por ejemplo, eliminando actividades nucleasas o modificaciones químicas.
El término "PCR cuantitativa ultrarrápida" ("qPCR") se refiere a procedimientos que se pueden utilizar para determinar la cantidad de un ácido nucleico diana presente en una muestra midiendo la cantidad de producto de amplificación formado durante o después de cualquier etapa del proceso de amplificación por sí mismo. La cuantificación puede transcurrir a través del uso de diversos agentes de detección, de los que muchos se describen en el presente documento.
Una "ácido nucleico polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la incorporación de nucleótidos a un ácido nucleico. Las ácido nucleico polimerasas ejemplares incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, ADN polimerasa quiméricas transferasas terminales, retrotranscriptasas, telomerasas y similares. Una polimerasa para su uso con el dispositivo y procedimiento descritos en el presente documento incluye la ADN polimerasa KAPA HiFi y la ADN polimerasa RMS Z05 de la especie Z05 de Thermus. Una ADN polimerasa puede ser una polimerasa de tipo A natural modificada seleccionada de cualquier especie del género Meiothermus, cualquier especie del género Thermotoga o cualquier especie del género Thermomicrobium. En algunos modos de realización, una polimerasa natural adecuada para la presente invención se aísla de Bacillus stearothermophilus, Sphaerobacter thermophilus, Dictoglomus thermophilum o Escherichia coli. En algunos modos de realización, una polimerasa natural adecuada para la presente invención se aísla de Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus caldophilus o Thermus filiformis. La modificación puede incluir uno o más cambios de aminoácidos seleccionados por determinadas propiedades mejoradas como se describe en el presente documento (documento US9315787). En algunos modos de realización, la polimerasa es una polimerasa de Thermus aquaticus (Taq). En algunos modos de realización, la polimerasa es la polimerasa Taq/-E507K mutante.
Se pueden genomanipular ADN polimerasas quiméricas de acuerdo con la presente invención a partir de cualquier ADN polimerasa, en particular, polimerasas termoestables. Típicamente, las ADN polimerasas se agrupan en seis familias: A, B, C, D, X e Y. Las familias A, B, C se agrupan en base a sus homologías de secuencia de aminoácidos con las polimerasas I, II, y III de E. coli, respectivamente. La familia X no tiene polimerasas de E. co lihomólogas. En algunos modos de realización, las ADN polimerasas adecuadas para la presente invención son ADN polimerasas de la familia B. Las polimerasas de la familia B incluyen, pero no se limitan a, pol II de E. coli, polimerasas de arqueas, PRD1, phi29, M2, ADN polimerasas de bacteriófago T4, polimerasas a, A, £ de eucariotas, y muchas polimerasas víricas. En algunos modos de realización, las ADN polimerasas adecuadas para la invención son polimerasas de arqueas (por ejemplo, polimerasas de euriarqueas).
Las polimerasas de arqueas ejemplares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas de arqueas (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent™, GenBank: AAA72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: Dl2983, BAA02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent™, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis KODI (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp., cepa Ko D (Pfx, GenBank: AAE68738)), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus 9 grados Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: Ca A93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; documento WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP143776), Pyrococcus sp. GE23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST7O0 (GenBank: CAC12847), Thermococcus pacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zilligii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus onnurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jannaschii (GenBank: Q58295), especie TOK de Desulforococcus, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras polimerasas de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)). Las polimerasas de la familia A y B estables a la temperatura representativas adicionales incluyen, por ejemplo, polimerasas extraídas de las bacterias termófilas de la especie Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aquaticus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus.
Las ADN polimerasas ejemplares caracterizadas con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a la sal o potenciadores de PCR incluyen, pero no se limitan a, polimerasa KOD, polimerasa TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7 o phi29. Las ADN polimerasas ejemplares caracterizadas con alta fidelidad incluyen, pero no se limitan a, polimerasas aisladas de Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT o P. sp. GB-D.
Como ejemplos no limitantes, las polimerasas KOD, Pfu, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis y Thermococcus sp.
9N-7 se usan para genomanipular ADN polimerasas quiméricas, véanse los ejemplos en el presente documento (documento US9023633).
El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable a temperaturas elevadas, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión de polinucleótido posteriores y no se desnaturaliza (inactiva) de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie Sps17 de Thermus, especie Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus. En algunos modos de realización, la polimerasa es la ADN polimerasa de la especie Z05 de Thermus o Thermus thermophilus.
Una "polimerasa modificada" se refiere a una polimerasa en la que al menos un monómero difiere de la secuencia de referencia, tal como una forma natural de la polimerasa u otra forma modificada de la polimerasa. Las modificaciones incluyen inserciones, deleciones y sustituciones de monómeros. Las polimerasas modificadas también incluyen polimerasas quiméricas que tienen secuencias de componentes identificables (por ejemplo, dominios estructurales o funcionales, etc.) derivadas de dos o más originales. También se incluyen dentro de la definición de polimerasas modificadas las que comprenden modificaciones químicas de la secuencia de referencia. Los ejemplos de polimerasas modificadas incluyen ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una a Dn polimerasa G46E E678G CS6, ADN polimerasa Z05, polimerasa AZ05, polimerasa AZ05-Gold, polimerasa AZ05R, ADN polimerasa Taq E615G, polimerasa TMA-25 E678G, polimerasa TMA-30 E678G y similares.
Los términos "agente", "agente de detección" y "agente para detectar un ácido nucleico diana" se refieren en general a cualquier reactivo, compuesto, procedimiento, ensayo, sonda o fluoróforo, por ejemplo, que se puede usar para la detección o la presencia, ausencia y/o cantidad de un ácido nucleico diana. Los ejemplos de dichos agentes se definen a continuación, pero sin limitarse a los agentes definidos a continuación e incluyen otros agentes y procedimientos conocidos en la técnica, tal como sondas de hidrólisis, agentes intercalantes, sondas de cebador, sondas de hibridación, análogos de ácidos nucleicos y ensayos basados en detección, por ejemplo.
El término "sonda de hidrólisis" se refiere a un agente para detectar un ácido nucleico diana con un mecanismo de acción que implica en general actividad nucleasa en dirección 5' a 3'. El término "actividad nucleasa en dirección 5' a 3'" o "actividad nucleasa 5'-3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebra de ácido nucleico, con lo que los nucleótidos se retiran del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico, por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli tiene esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no. Algunas enzimas que tienen actividad nucleasa en dirección 5' a 3' son exonucleasas en dirección 5' a 3'. Los ejemplos de dichas exonucleasas en dirección 5' a 3' incluyen: exonucleasa de B. subtilis, fosfodiesterasa de bazo, exonucleasa A, exonucleasa II de levadura, exonucleasa V de levadura y exonucleasa de Neurospora crassa.
Además, la detección de un ácido nucleico diana utilizando la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' se puede realizar por un "TaqMan®" o "ensayo de nucleasa 5'", como se describe en las patentes de EE. UU. n.os 5.210.015; 5.487.972; y 5.804.375; y Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. En el ensayo TaqMan®, las sondas de detección marcadas que se hibridan dentro de la región amplificada están presentes durante la reacción de amplificación. Las sondas se modifican para evitar que las sondas actúen como cebadores para la síntesis de ADN. La amplificación se realiza usando una ADN polimerasa que tiene actividad exonucleasa en dirección 5' a 3'. Durante cada etapa de síntesis de la amplificación, cualquier sonda que se hibrida al ácido nucleico diana en dirección 3' desde el cebador que se extiende se degrada por la actividad exonucleasa en dirección 5' a 3' de la ADN-polimerasa. Por tanto, la síntesis de una nueva hebra diana también da como resultado la degradación de una sonda, y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de secuencias diana.
Cualquier procedimiento adecuado para detectar el producto de degradación se puede usar en un ensayo de nucleasa en dirección 5'. A menudo, la sonda de detección se marca con dos tintes fluorescentes, de los que uno puede extinguir la fluorescencia del otro tinte. Los tintes se fijan a la sonda, típicamente con el tinte indicador o detector fijado al extremo 5' y el tinte de extinción fijado a un sitio interno, de modo que la extinción se produce cuando la sonda está en un estado no hibridado y de modo que la escisión de la sonda por la actividad exonucleasa en dirección 5' a 3' de la ADN polimerasa se produce entre los dos tintes. La amplificación da como resultado la escisión de la sonda entre los tintes con una eliminación concomitante de la extinción y un incremento en la fluorescencia observable del tinte inicialmente extinguido. Se sigue la acumulación del producto de degradación midiendo el incremento en la fluorescencia de reacción. Las patentes de EE. UU. n.os 5.491.063 y 5.571.673 describen procedimientos alternativos para detectar la degradación de una sonda que se produce concomitante con la amplificación. Los ejemplos de tintes fluorescentes para su uso con sondas de hidrólisis incluyen, pero no se limitan a, FAM™, TET™, HEX™, VIC™, CY3™, CY5™, fluoresceína, rodamina, OREGON GREEN®, eosina, TEXAS RED™, cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina, merocianina, hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, CASCADE BUJE™, PACIFIC BUJE™, PACIFIC ORANGE™, LUCIFER YELLOW™, R-ficoeritrina, peridinina-clorofila-proteína, FLUORX™, BODIPY-fluoresceína, CY2™, CY3B™, CY3.5™, CY5.5™, CY7™, TRITC™, Lissamine-rodamina B o aloficocianina.
Los tintes fluorescentes pueden incluir tintes que están cargados negativamente, tales como tintes de la familia de la fluoresceína, o tintes que tienen carga neutra, tales como tintes de la familia de la rodamina, o tintes que están cargados positivamente, tales como tintes de la familia de la cianina. Los tintes de la familia de la fluoresceína incluyen, por ejemplo, 6-carboxi-fluoresceína (FAM), 2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, JOE, NAN y ZOE. Los tintes de la familia de la rodamina incluyen, por ejemplo, Texas Red, ROX, R1 1O, R6G y TAMRA o el derivado de rodamina JA270 (véase la patente de EE. UU. n.° 6.184.379). FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R1 1O, R6G y TAMRA están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Perkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, EE. UU.) y Texas Red está disponible comercialmente en, por ejemplo, Molecular Probes, Inc. (Eugene, o R). Los tintes de la familia de la cianina incluyen, por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7, y están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, EE. UU.).
Un ensayo de nucleasa en dirección 5' para la detección de un ácido nucleico diana puede emplear cualquier polimerasa que tenga una actividad exonucleasa en dirección 5' a 3'. Por tanto, en algunos casos, las polimerasas con actividad nucleasa en dirección 5' son ácido nucleico polimerasas termoestables y termoactivas. Dichas polimerasas termoestables incluyen, pero no se limitan a, formas naturales y recombinantes de polimerasas de una variedad de la especie de los géneros eubacterianos de Thermus, Thermatoga y Thermosipho, así como formas quiméricas de las mismas. Por ejemplo, las polimerasas de la especie de Thermus que se pueden usar incluyen la ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), la ADN polimerasa de la especie Z05 de Thermus (Z05), la especie sps17 de Thermus (sps17) y la especie Z05 de Thermus (por ejemplo, descritas en las patentes de EE. UU. n.os 5.405.774; 5.352.600; 5.079.352; 4.889.818; 5.466.591; 5.618.711; 5.674.738 y 5.795.762). Las polimerasas de Thermatoga que se pueden incluir, por ejemplo, ADN polimerasa de Thermatoga marítima y ADN polimerasa de Thermatoga neapolitana, mientras que un ejemplo de una polimerasa de Thermosipho que se puede usar es ADN polimerasa de Thermosipho africanus. Las secuencias de las ADN polimerasas de Thermatoga marítima y Thermosipho africanus están publicadas en la publicación de patente internacional n.° WO 92/06200. La secuencia de Thermatoga neapolitana se puede encontrar en la publicación de patente internacional n.° WO 97/09451.
En el ensayo de nucleasa en dirección 5', la detección de amplificación es típicamente concurrente con la amplificación (es decir, "ultrarrápida"). En algunos casos, la detección de amplificación es cuantitativa, y la detección de amplificación es ultrarrápida. En algunos casos, la detección de amplificación es cualitativa (por ejemplo, detección de punto final de la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana). En algunos casos, la detección de amplificación es posterior a la amplificación. En algunos casos, la detección de amplificación es cualitativa, y la detección de amplificación es posterior a la amplificación.
Un "marcador" se refiere a un resto fijado (covalente o no covalentemente) a una molécula y que puede proporcionar información sobre la molécula. Los marcadores ejemplares incluyen marcadores fluorescentes, marcadores colorimétricos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores radioactivos, grupos modificadores de masa, anticuerpos, antígenos, biotina, haptenos y enzimas (incluyendo peroxidasa, fosfatasa, etc.).
El término "tinte de unión a ADN" o "agente de unión al ADN" se refiere en general a una molécula con una señal fluorescente que se potencia tras su unión a o interacción con el ADN. El agente de unión a ADN produce una señal detectable directa o indirectamente. La señal es detectable directamente, tal como por fluorescencia o absorbancia, o indirectamente por medio de un resto marcador sustituido o un ligando de unión fijado al agente de unión a ADN. Para la detección indirecta es adecuado cualquier resto o ligando que se vea afectado de forma detectable por la proximidad a ADN bicatenario. Los tintes de unión a ADN engloban tanto "agentes intercalantes" como "agentes no intercalantes".
Como se usa en el presente documento, un "agente intercalante" es un agente o resto que puede realizar una inserción no covalente entre pares de bases apiladas en la doble hélice del ácido nucleico. Los agentes intercalantes, tales como bromuro de etidio, emiten una fluorescencia más intensa cuando se intercalan en ADN bicatenario que cuando se unen a ADN o ARN monocatenario o en solución. Otros agentes intercalantes presentan un cambio en los espectros de fluorescencia cuando se unen a ADN bicatenario. Por ejemplo, la actinomicina D emite fluorescencia roja cuando se une a ácidos nucleicos monocatenarios y verde cuando se une a un molde bicatenario. Ya sea que la señal detectable se incremente, disminuya o se desplace, como es el caso de la actinomicina D, cualquier agente intercalante que proporcione una señal detectable que sea distinguible cuando el agente está unido a ADN bicatenario o no unido es adecuado para su uso con cualquiera de los procedimientos o dispositivos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se ha descrito la interacción entre el ADN y otro psoraleno fotorreactivo, 4-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT) (véase Johnson et al., 1981, Photochem, & Photobiol., 33:785-791). De acuerdo con la referencia, tanto la absorción a longitudes de onda largas como la fluorescencia disminuyen tras la intercalación de AMT en la hélice de ADN.
También son adecuados los "agentes no intercalantes". Por ejemplo, Hoechst 33258 (Searle & Embrey, 1990, Nuc. Acids Res. 18(13):3753-3762) presenta una fluorescencia alterada con una cantidad creciente de diana. Hoechst 33258 es miembro de una clase de compuestos de unión a ADN comúnmente denominados "aglutinantes de surco". Este grupo incluye fármacos como la distamicina, la netropsina y otros. Estos compuestos reconocen y se unen al surco menor del ADN dúplex.
Los ejemplos de agentes de unión a ADN, que incluyen tanto agentes intercalantes como agentes no intercalantes, incluyen pero no se limitan a bromuro de etidio, Sy Br ™ Green, PICOGREEN®, SYBR™ Gold, SYTO® 9, SYTO® 13, SYTO® 16, SYTOX ® Blue, cromomicina A3, Os[(bpy)2DPPZ]2+, BEBO, BOXTO, EVAGREEN®, yoduro de propidio, cromomicina, mitramicina, naranja tiazol, Cy TRa K o Ra NGE™, LDS751, 7-AAD, SYTOX® Green, SYTOX® Orange, TOTO-3, DRAG5, DRAG7, ResoLight, naranja de acridina, Hoechst 33258, TOTO-1, YOYO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-3 y 4',6-diamidino-2-fenilindol ("DAPI").
El término "sonda de cebador" se refiere en general a una clase de agentes de detección de ácidos nucleicos diana que combinan un cebador y un agente de detección en una única molécula. La fluorescencia emitida por las sondas-cebador en general se detecta y mide durante la fase de desnaturalización o extensión de la qPCR, dependiendo del tipo de sonda-cebador usado. Algunos ejemplos de sondas de cebador incluyen, pero no se limitan a, sondas Scorpion, sondas AMPLIFLUOR®, sondas Sunrise, sondas LUX™, sondas Cyclicon y sondas ANGLER®.
Las sondas Scorpion se usan en general de acuerdo con la siguiente metodología. Este procedimiento se describe, por ejemplo, por Thelwell N., et al. Nucleic Acids Research, 28:3752-3761, 2000, en el que el mecanismo de sondeo de Scorpion es como sigue. Etapa 1: desnaturalización inicial de la diana y la secuencia del tallo Scorpion. Etapa 2: hibridación del cebador Scorpion a la diana. Etapa 3: la extensión del cebador Scorpion produce ADN bicatenario. Etapa 4: desnaturalización del ADN bicatenario producido en la etapa 3. Esto da una molécula diana monocatenaria con el cebador Scorpion fijado. Etapa 5: al enfriarse, la secuencia de la sonda Scorpion se une a su diana de manera intramolecular. Esto se ve favorecido sobre la unión intermolecular de la hebra diana complementaria. Una Scorpion consiste en una secuencia de sonda específica que se mantiene en una configuración de bucle en horquilla por secuencias de tallo complementarias en los lados 5' y 3' de la sonda. El fluoróforo fijado al extremo 5' se inactiva por un resto (habitualmente rojo de metilo) unido al extremo 3' del bucle. El bucle de horquilla se enlaza al extremo 5' de un cebador por medio de una secuencia de parada de PCR (finalizadora). Después de la extensión del cebador durante la amplificación por PCR, la secuencia de sonda específica se puede unir a su complemento dentro de la misma hebra de ADN. Este acontecimiento de hibridación abre el bucle en horquilla de modo que la fluorescencia ya no se inactiva y se observa un incremento en la señal. La secuencia de parada de PCR evita la ultralectura que podría dar lugar a la apertura del bucle en horquilla en ausencia de la secuencia diana específica. Dicha ultralectura daría lugar a la detección de productos de PCR no específicos, por ejemplo, dímeros de cebadores o acontecimientos de cebado incorrecto.
Las sondas Sunrise, conocidas por su nombre comercial sondas AMPLIFLUOR™, son similares a las sondas Scorpion en su mecanismo de acción. Cuando la sonda-cebador no está unida, la estructura de horquilla está intacta y el indicador transfiere energía al extintor por medio de extinción de FRET. La amplificación de ADN se produce después de la unión de la sonda-cebador a la secuencia diana. En la siguiente etapa de desnaturalización, se separan el indicador y el extintor y, como resultado, se mide la fluorescencia emitida por el donante.
Las sondas de cebador LUX™ actúan a través de un mecanismo con lo que la estructura de horquilla confiere la capacidad de disminuir la señal de fluorescencia cuando la sonda-cebador está libre e incrementa la señal exponencialmente cuando se une a su secuencia diana. La máxima emisión de fluorescencia se genera después de la incorporación de las sondas-cebador LUX™ en el ADN bicatenario. La fluorescencia se mide durante la fase de extensión.
Las sondas de cebador Cyclicon actúan a través de un mecanismo con lo que en ausencia de la secuencia diana, las moléculas indicadoras y extintoras están en estrecha proximidad y la transferencia de energía se produce por medio de extinción de FRET. La unión de las sondas Cyclicon al a Dn abre la estructura cíclica y da lugar a la extensión de la sonda-cebador de extremo 3' por la a Dn polimerasa sin ninguna interferencia del extintor. El extremo 3' del oligonucleótido modificado no es extensible puesto que no se une al ADN diana y porque su extremo 3' está bloqueado por un indicador. La separación entre las moléculas donantes y aceptoras da como resultado la emisión de fluorescencia, que se mide durante la fase de extensión.
Las sondas-cebador ANGLER® funcionan a través de un mecanismo con lo que, en solución, la sonda-cebador no emite fluorescencia puesto que no hay un resto fluorescente donante lo suficientemente cerca para FRET. Cuando la sonda-cebador ANGLER se une a su ADN diana durante la etapa de hibridación, la ADN polimerasa comienza la extensión del cebador inverso de extremo 3'. Posteriormente, durante la fase de desnaturalización, la secuencia específica de la sonda se une a la región complementaria del ADN recién amplificado, produciendo un fragmento de ADNbc en el que se puede intercalar el tinte SYBR Gold para generar fluorescencia. Por consiguiente, la fluorescencia emitida se mide durante la etapa de desnaturalización en cada ciclo.
El término "sonda de hibridación" se refiere en general a un procedimiento de detección que implica un agente o agente que se puede unir a y/o reconocer una secuencia específica y/o un rasgo característico estructural específico de un ácido nucleico diana. Las sondas de hibridación pueden adoptar la forma de, pero no se limitan a, sondas de hibridación de FRET, sondas de baliza molecular, sondas HYBEACON™, una sonda MGB tal como MGB-Pleiades y MGB-Eclipse, una sonda RESONSENSE® o una sonda Yin-Yang.
El formato de prueba de sonda de hibridación de FRET es especialmente útil para diversos ensayos de hibridación homogénea (Matthews, J. A. y Kricka, L. J., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25). Se caracteriza por un par de dos sondas de hibridación monocatenarias que se usan simultáneamente y son complementarias a los sitios contiguos de la misma hebra del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con diferentes componentes fluorescentes. Cuando se excita con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente de acuerdo con el principio de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, de modo que se puede medir una emisión de fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas de hibridación se unen en posiciones contiguas de la molécula diana que se va a detectar.
Cuando se hibridan a la secuencia diana, las sondas de hibridación se deben colocar muy cerca unas de otras, en una disposición de cabeza a cola. Normalmente, el espacio entre el extremo 3' marcado de la primera sonda y el extremo 5' marcado de la segunda sonda es lo más pequeño posible, es decir, 1-5 bases. Esto permite una proximidad estrecha del compuesto donante de FRET y el compuesto aceptor de FRET, que típicamente es de 10-100 A.
Como alternativa al seguimiento del incremento de fluorescencia del componente aceptor de FRET, también es posible seguir la disminución de fluorescencia del componente donante de FRET como medición cuantitativa de un acontecimiento de hibridación.
En particular, se puede usar el formato de sonda de hibridación de FRET en qPCR para detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los formatos de detección conocidos en la técnica de qPCR, se ha demostrado que el formato de sonda de hibridación de FRET es altamente sensible, exacto y fiable (documento WO 97/46707; documento WO 97/46712; documento WO 97/46714).
Como alternativa al uso de dos sondas de hibridación de FRET, también es posible usar un cebador marcado con fluorescencia y solo una sonda oligonucleotídica marcada (Bernard, P. S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107). A este respecto, se puede elegir arbitrariamente si se marca el cebador con el compuesto donante de FRET o el aceptor de FRET.
Además de PCR y qPCR, las sondas de hibridación de FRET se usan para un "análisis de curva de fusión". En un ensayo de este tipo, el ácido nucleico diana se amplifica en primer lugar en una reacción de PCR típica con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de hibridación pueden estar ya presentes durante la reacción de amplificación o añadirse posteriormente. Después de completarse la reacción de PCR, la temperatura de la muestra se incrementa de forma constitutiva y se detecta la fluorescencia siempre que la sonda de hibridación se haya unido al ADN diana. A la temperatura de fusión, las sondas de hibridación se liberan de su diana y la señal fluorescente disminuye de inmediato hasta el nivel de fondo. Esta disminución se sigue con una curva apropiada de fluorescencia frente a temperatura-tiempo de modo que se pueda determinar un valor de la primera derivada, en el que se observa el máximo de la disminución de fluorescencia.
También se pueden usar las "balizas moleculares" como componente de un agente de detección. Con las balizas moleculares, un cambio en la conformación de la sonda a medida que se hibrida a una región complementaria del producto amplificado da como resultado la formación de una señal detectable. La sonda por sí misma incluye dos secciones: una sección en el extremo 5' y la otra sección en el extremo 3'. Estas secciones flanquean la sección de la sonda que se hibrida al sitio de unión de sonda y son complementarias entre sí. Una sección de extremo típicamente se fija a un tinte indicador y la otra sección de extremo normalmente se fija a un tinte extintor.
En solución, las dos secciones de extremo se pueden hibridar entre sí para formar un bucle en horquilla. En esta conformación, el tinte indicador y extintor están suficientemente en estrecha proximidad como para que la fluorescencia del tinte indicador se extinga eficazmente por el tinte extintor. Una sonda hibridada, por el contrario, da como resultado una conformación linealizada en la que se disminuye el grado de extinción. Por tanto, siguiendo los cambios de emisión de los dos tintes, es posible seguir indirectamente la formación del producto de amplificación. Las sondas de este tipo y los procedimientos para su uso se describen además, por ejemplo, por Piatek, A. S., et al., Nat. Biotecnología. 16:359-63 (1998); Tyagi, S. y Kramer, F. R., Nature Biotechnology 14:303-308 (1996); y Tyagi, S. et al., Nat. Biotecnología. 16:49-53 (1998).
Las sondas HYBEACON™, como se describe por French et al., consisten en secuencias de oligonucleótidos monocatenarios que contienen restos de fluoróforo fijados a nucleótidos internos, y un bloqueador del extremo 3' (3'-fosfato u octanodiol), que evita su extensión por PCR. La cantidad de fluorescencia emitida por HYBEACON™ hibridados cuando se unen a su diana es considerable, y la señal fluorescente en general se mide durante la fase de extensión. Este sistema permite llevar a cabo el análisis de curva de fusión para abordar la especificidad del producto amplificado y la eficacia de la reacción.
Las sondas de unión al surco menor ("MGB") en general consisten en una sonda tal como Pleiades (Navarro et al.
89) o Eclipse (Navarro et al. 90) fijada a través de sus extremos 3' o 5' a un ligando de MGB. Los ligandos de MGB son en general tripéptidos de molécula pequeña, incluyendo el tripéptido de dihidrociclopirooloindol ("DIP") o 1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3.2-e]indol-7-carboxilato ("CDPI") que forman una unión no covalente con el surco menor del ADN bicatenario. Este tipo de ligando se une selectivamente a secuencias ricas en AT, favoreciendo la inclusión de anillos aromáticos por interacciones de van der Waals y electrostáticas. Esta interacción produce una distorsión mínima en la cadena principal de fosfodiéster, pero estabiliza en gran medida la estructura del ADN.
Las sondas RESONSENSE tienen un flúor fluorescente CY5.5® en el extremo 5' como resto fluorescente aceptor y un grupo fosfato en el extremo 3' para evitar la polimerización del ADN. La reacción de qPCR en general también contiene el tinte de unión SYBR® Gold como donante de fluorescencia, que se intercala en el dúplex de ADN formado por la sonda y su diana. En solución, la sonda no emite fluorescencia debido a la ausencia de un donante fluorescente lo suficientemente cerca del aceptor. Durante la fase de hibridación, la transferencia de energía por FRET se produce como resultado de la unión simultánea de la sonda a la diana y la intercalación del tinte de ADN en el dúplex sonda-diana. La señal de fluorescencia es proporcional a la concentración de las secuencias de ADN diana.
Las sondas Yin-Yang son sondas bicatenarias que se componen de dos oligonucleótidos complementarios de diferentes longitudes. El extremo 5' de la hebra positiva más larga se marca con un indicador de fluoróforo y se bloquea con un grupo fosfato en su extremo 3', mientras que el extremo 3' de la hebra negativa más corta contiene un extintor de fluoróforo. En solución, el oligonucleótido negativo más corto, que actúa como competidor, forma un dúplex de ADN estable con la sonda más larga. Esta interacción evita la emisión de fluorescencia debido al hecho de que el indicador y el extintor permanecen en estrecha proximidad. Durante la fase de hibridación, la hebra más corta se desplaza por la diana dando lugar a la emisión de fluorescencia.
También se pueden usar "análogos de ácidos nucleicos" para la detección de un ácido nucleico diana. Los análogos de ácidos nucleicos son compuestos que son análogos (estructuralmente similares) al ARN y ADN naturales. Un análogo puede tener alteraciones en su cadena principal de fosfato, glúcido pentosa (ribosa o bien desoxirribosa) o nucleobases. Habitualmente, los análogos incorporan todas las ventajas del ADN natural, pero son más estables en líquidos biológicos y tienen una afinidad incrementada por las dianas de ácidos nucleicos complementarios. Algunos ejemplos de análogos de ácidos nucleicos que se pueden usar para detectar un ácido nucleico diana incluyen pero no se limitan a PNA, ácidos nucleicos bloqueados ("LNA"), ácidos nucleicos de cremallera ("ZNA™"), cebadores Plexo o sondas de baliza molecular diminutas. Los análogos de ácido nucleico en general se insertan en una sonda-cebador para efectuar la detección del ácido nucleico diana.
El término "ensayo basado en detección" se refiere en general a un ensayo o formato en el que se puede detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana. Los ejemplos de ensayos basados en detección incluyen, pero no se limitan a, ensayos Invader, ensayos NASBA y detección de capacitancia de una gotícula y/o el ácido nucleico diana contenido dentro de una gotícula. Los "ensayos Invader" (Third Wave Technologies, (Madison, Wis.)) se usan para el genotipado de SNP y utilizan un oligonucleótido, denominado sonda de señal, que es complementario al ácido nucleico (ADN o ARN) diana o al sitio de polimorfismo. Un segundo oligonucleótido, denominado oligonucleótido Invader, contiene la misma secuencia de nucleótidos en dirección 5', pero la secuencia de nucleótidos en dirección 3' contiene un polimorfismo nucleotídico. El oligonucleótido Invader interfiere con la unión de la sonda de señal al ácido nucleico diana, de modo que el extremo 5' de la sonda de señal forma una "aleta" en el nucleótido que contiene el polimorfismo. Este complejo se reconoce por una endonucleasa específica de estructura, llamada enzima Cleavase. Cleavase escinde la aleta en dirección 5' de los nucleótidos. La aleta liberada se une con una tercera sonda que lleva las marcas de FRET, formando de este modo otra estructura dúplex reconocida por la enzima Cleavase. Esta vez, la enzima Cleavase escinde un fluoróforo de un extintor y produce una señal de fluorescencia. Para el genotipado de SNP, la sonda de señal se diseñará para hibridarse con el alelo de referencia (natural) o bien con el alelo variante (mutante). A diferencia de la PCR, hay una amplificación lineal de la señal sin amplificación del ácido nucleico. Otros detalles suficientes para guiar a un experto en la técnica se proporcionan, por ejemplo, en Neri, B. P., et al., Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826:117-125, 2000.
Otro ejemplo de un ensayo basado en detección puede ser un ensayo de amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos ("NASBA"). NASBA es un procedimiento de detección que usa ARN como molde. Un cebador complementario al ARN contiene la secuencia para el sitio de promotor de T7. Se permite que este cebador se una con el ARN molde y la retrotranscriptasa (Rt ) añadida para generar la hebra complementaria de 3' a 5'. Posteriormente se añade RNasa H para digerir el ARN, dejando atrás el ADNc monocatenario. Una segunda copia del cebador se puede unir a continuación al ADNc monocatenario y producir ADNc bicatenario. Se añade la ARN polimerasa de T7 para generar muchas copias del ARN del sitio de promotor de T7 que se incorporó a la secuencia de ADNc por el primer cebador. Todas las enzimas mencionadas pueden funcionar a 41 °C (véase, por ejemplo, Compton, J. Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature 350:91-91, 1991).
Un ensayo basado en la detección también puede adoptar la forma de detección capacitiva del ácido nucleico diana dentro de una gotícula. Por ejemplo, existe una relación lineal entre la concentración de ADN y el cambio de capacitancia provocado por el paso de ácidos nucleicos a través de un campo eléctrico de 1 kHz. Se ha descubierto que esta relación es independiente de la especie. (Véase, por ejemplo, Sohn, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 97:10687-10690). Por tanto, en determinados dispositivos, los ácidos nucleicos dentro del canal de flujo (por ejemplo, el canal de flujo sustancialmente circular de la FIG. 1 o las cámaras de reacción de la FIG. 2) se someten a un campo de este tipo para determinar la concentración del producto amplificado. De forma alternativa, la solución que contiene el producto amplificado se extrae y a continuación se somete al campo eléctrico.
Los términos "zona de detección" y "región de detección" se refieren a una localización en la que se puede detectar la señal de uno o más agentes de detección. Dicha detección de un agente o múltiples agentes se puede producir simultánea o secuencialmente. La zona de detección se puede diseñar para detectar una serie de tipos de señales diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, señales de radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, partículas densas en electrones, partículas magnéticas, marcadores de espín, moléculas que emiten quimioluminiscencia, moléculas electroquímicamente activas, enzimas, cofactores, enzimas enlazadas a sondas de ácido nucleico y sustratos enzimáticos. Las metodologías de detección ilustrativas adecuadas para su uso con el presente dispositivo incluyen, pero no se limitan a, dispersión de luz, detección de fluorescencia multicanal, absorción de longitud de onda visible y UV, luminiscencia, reflectancia diferencial y barrido láser confocal. Los procedimientos de detección adicionales que se pueden usar en determinadas aplicaciones incluyen técnicas de ensayo de proximidad de centelleo, detección radioquímica, polarización de fluorescencia, espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), transferencia de energía resuelta en el tiempo (TRET), transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y variaciones tales como la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET). Las opciones de detección adicionales incluyen detección de resistencia eléctrica, resistividad, impedancia y voltaje.
La zona de detección puede estar en comunicación con uno o más microscopios, diodos, dispositivos estimuladores de luz (por ejemplo, láseres), tubos fotomultiplicadores, procesadores y combinaciones de los anteriores, que cooperan para detectar una señal asociada con un acontecimiento y/o agente particular. A menudo, la señal que se detecta es una señal óptica que se detecta en la sección de detección por un detector óptico. El detector óptico puede incluir uno o más fotodiodos (por ejemplo, fotodiodos de avalancha), una guía de luz de fibra óptica que da lugar, por ejemplo, a un tubo fotomultiplicador, un microscopio y/o una cámara de vídeo (por ejemplo, una cámara CCD).
Las zonas de detección se pueden microfabricar dentro del dispositivo o pueden ser un elemento separado. Si el detector existe como un elemento separado y el dispositivo incluye una pluralidad de zonas de detección, la detección se puede producir dentro de una única zona de detección en cualquier momento dado. De forma alternativa, se pueden usar sistemas de barrido. Por ejemplo, determinados sistemas automatizados realizan un barrido con la fuente de luz en relación con el dispositivo basado en electrohumectación; otros sistemas realizan un barrido con la luz emitida sobre un detector, o incluyen un detector multicanal. El dispositivo se puede fijar a una fase traducible y realizar un barrido bajo un objetivo de microscopio. Una señal así adquirida a continuación se dirige a un procesador para la interpretación y el procesamiento de la señal. También se pueden utilizar matrices de tubos fotomultiplicadores. Adicionalmente, se pueden utilizar sistemas ópticos que tienen la capacidad de recopilar señales desde todas las diferentes secciones de detección simultáneamente mientras se determina la señal de cada sección.
Un detector puede incluir una fuente de luz para estimular un indicador que genera una señal detectable. El tipo de fuente de luz utilizada depende en parte de la naturaleza del indicador que se activa. Las fuentes de luz adecuadas incluyen, pero no se limitan a, láseres, diodos láser y lámparas de alta intensidad. Si se utiliza un láser, el láser se puede utilizar para realizar un barrido de un conjunto de secciones de detección o una única sección de detección. Los diodos láser se pueden microfabricar en el propio dispositivo. De forma alternativa, los diodos láser se pueden fabricar en otro dispositivo que se coloca contiguo al dispositivo microfluídico que se utiliza para llevar a cabo una reacción de termociclado de modo que la luz láser del diodo se dirija hacia la sección de detección.
La detección también puede implicar una serie de enfoques no ópticos. Por ejemplo, el detector también puede incluir, por ejemplo, un sensor de temperatura, un sensor de conductividad, un sensor potenciométrico (por ejemplo, un electrodo de pH) y/o un sensor amperométrico (por ejemplo, para seguir las reacciones de oxidación y reducción).
El término "elemento de calentamiento" se refiere en general a cualquier medio por el que se puede lograr un cambio de temperatura, en particular calentamiento, en un dispositivo. Por ejemplo, dichos elementos de calentamiento pueden comprender un calentador en el chip o un calentador separado del dispositivo basado en electrohumectación. Además, el calentamiento se puede lograr a través del uso de calentadores de contacto que son un elemento separado del propio dispositivo basado en electrohumectación, o a través de elementos de calentamiento que se fabrican como parte del dispositivo basado en electrohumectación. Un elemento de calentamiento también puede ser un elemento de calentamiento por inducción o un elemento de calentamiento conductor, de los que cualquiera puede ser un elemento separado del dispositivo basado en electrohumectación o fabricado como parte del dispositivo basado en electrohumectación.
El término "mezcla de reacción" se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción dada. Una "mezcla de reacción de amplificación", que se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, típicamente contiene cebadores oligonucleotídicos y una ADN polimerasa o ligasa en un tampón adecuado. Una "mezcla de reacción de PCR" típicamente contiene cebadores oligonucleotídicos, una ADN polimerasa termoestable, dNTP y un catión de metal divalente en un tampón adecuado. Una mezcla de reacción se denomina completa si contiene todos los reactivos necesarios para posibilitar la reacción e incompleta si contiene solo un subconjunto de los reactivos necesarios. Se entenderá por un experto en la técnica que los componentes de reacción se almacenan de forma rutinaria como soluciones separadas, conteniendo cada uno un subconjunto de los componentes totales, por motivos de comodidad, almacenamiento, estabilidad o para permitir un ajuste de las concentraciones de componentes dependiente de la aplicación, y que los componentes de reacción se combinan antes de la reacción para crear una mezcla de reacción completa.
Un "marcador polimórfico" o "sitio polimórfico" es el locus en el que se produce la divergencia. Los marcadores preferentes tienen al menos dos alelos, de los que cada uno aparece con una frecuencia mayor de un 1 %, y más preferentemente mayor de un 10 % o un 20 % de una población seleccionada. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, mini-satélites, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, repeticiones de tetranucleótidos, repeticiones de secuencias simples y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada se designa arbitrariamente como la forma de referencia y otras formas alélicas se designan como alelos alternativos o variantes. La forma alélica que aparece con más frecuencia en una población seleccionada a veces se denomina forma natural. Los organismos diploides pueden ser homocigotos o heterocigotos para las formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas.
Un "polimorfismo mononucleotídico" (SNP) aparece en un sitio polimórfico ocupado por un único nucleótido, que es el sitio de variación entre las secuencias alélicas. El sitio normalmente está precedido y seguido de secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de {(1/100) de fracción} o {(1/1000) de fracción} de miembros de las poblaciones). Un polimorfismo mononucleotídico normalmente surge debido a la sustitución de un nucleótido por otro en el sitio polimórfico. Una transición es el reemplazo de una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina. Una transversión es el reemplazo de una purina por una pirimidina o viceversa. Los polimorfismos mononucleotídicos también pueden surgir a partir de una deleción de un nucleótido o una inserción de un nucleótido en relación con un alelo de referencia.
Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador" o "biomarcador de interés" se refiere a una molécula biológica que se encuentra en la sangre, otros líquidos corporales o tejidos que es un signo de un proceso normal o anómalo, o de una afección o enfermedad (tal como cáncer). Se puede usar un biomarcador para ver qué tan bien responde el cuerpo a un tratamiento para una enfermedad o afección. En el contexto del cáncer, un biomarcador se refiere a una sustancia biológica que indica la presencia de cáncer en el cuerpo. Un biomarcador puede ser una molécula secretada por un tumor o una respuesta específica del cuerpo a la presencia de cáncer. Los biomarcadores genéticos, epigenéticos, proteómicos, glucómicos y de formación de imágenes se pueden usar para el diagnóstico, el pronóstico y la epidemiología del cáncer. Dichos biomarcadores se pueden someter a ensayo en humores corporales extraídos de forma no traumática, como sangre o suero. Ya se han usado varios biomarcadores basados en genes y proteínas en la asistencia sanitaria, incluyendo, pero sin limitarse a, AFP (cáncer de hígado), BCR-ABL (leucemia mielógena crónica), BRCA1/BRCA2 (cáncer de mama/ovario), BRAF V600E (melanoma/cáncer colorrectal), CA-125 (cáncer de ovario), CA19.9 (cáncer de páncreas), CEA (cáncer colorrectal), EGFR (carcinoma de pulmón no microcítico), HER-2 (cáncer de mama), KIT (tumor del estroma gastrointestinal), PSA (antígeno prostático específico) (cáncer de próstata), S100 (melanoma) y muchos otros. Los biomarcadores pueden ser útiles como diagnósticos (para identificar cánceres en fase precoz) y/o pronósticos (para pronosticar la malignidad de un cáncer y/o predecir cómo responderá un sujeto a un tratamiento particular y/o qué probabilidad hay de que el cáncer recidive). Los biomarcadores de interés incluyen, pero no se limitan a, dichos biomarcadores oncológicos como AKAP4, a Lk , APC, AR, BRAF, BRCA1, BRCA2, Cc ND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CFB, CFH, CFI, DKK1, DPYD, EDNRB, EGFR, ERBB2, EPSTI1, ESR1, FCRL5, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FN14, HER2, HER4, HERC5, IDH1, IDH2, IDO1, KIF5B, KIT, KRAS, LGR5, LIV1, LY6E, LYPD3, MACC1, MET, MRD, MSI, MSLN, MUC16, MYC, NaPi3b, NRAS, PDGFRA, PDCD1LG2, RAF1, RNF43, NTRK1, NTSR1, OX40, PIK3CA, RET, ROS1, Septin 9, TERT, TFRC, TROP2, TP53, TWEAK y UGT1A1.
Los términos "dispositivo basado en electrohumectación" y "dispositivo de electrohumectación" se refieren a un dispositivo para manipular gotículas usando manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación que se basan en la propiedad de electrohumectación. Para un ejemplo de un dispositivo basado en electrohumectación de este tipo, véase la FIG. 3. Para ejemplos adicionales de dispositivos basados en electrohumectación y/o un dispositivo de electrohumectación, véanse la pat. de EE. UU. n.° 8.409.417, titulada "Electrowetting based digital microfluidics", otorgada el 2 de abril de 2013 a Wu y la patente de EE. UU. n.° 8.926.811, titulada "Digital microfluidics based apparatus for heat-exchanging chemical processes", otorgada el 6 de enero de 2015 a Wu.
En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una matriz plana de electrodos. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una matriz biplanar de electrodos. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos con una conformación cuadrada, por ejemplo, en el que dichos electrodos pueden tener aproximadamente 5 mm por 5 mm. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos pueden comprender dimensiones que varían de aproximadamente 100 |jm por 100 |jm a aproximadamente 10 cm por 10 cm. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos de cualquier conformación y dimensión. Por ejemplo, dichos electrodos pueden comprender, pero no se limitan a comprender, conformaciones de electrodos rectangulares, circulares, triangulares, trapezoidales y/o irregulares. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una conformación de electrodo como se presenta en la FIG. 4A-4F. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que los electrodos contiguos pueden estar intercalados entre sí, por ejemplo, FIG. 4D-FIG. 4 F. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que los electrodos contiguos pueden no estar intercalados entre sí. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos pueden comprender óxido de indio y estaño ("ITO"). En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos pueden comprender ITO, óxidos conductores transparentes ("TCO"), polímeros conductores, nanotubos de carbono ("CNT"), grafeno, mallas de nanohilos y/o películas metálicas ultrafinas. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender electrodos, en el que dichos electrodos pueden comprender cualquier material conductor eléctrico transparente. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender un espacio entre la placa superior y la placa inferior de modo que el volumen de una gotícula puede ser un volumen deseado, por ejemplo, la separación entre la placa superior y la placa inferior puede tener un volumen de 0,5 mm, lo que puede dar como resultado un volumen de gotícula de aproximadamente 12,5 jl. En algunos modos de realización, el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender gotículas que tienen un volumen de aproximadamente 1 j l o menos, aproximadamente 1 j l o más, aproximadamente 2 j l o más, aproximadamente 3 j l o más, aproximadamente 4 j l o más, aproximadamente 5 j l o más, aproximadamente 10 j l o más, aproximadamente 12,5 j l o más, aproximadamente 15 j l o más o aproximadamente 20 j l o más. En algunos modos de realización, el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender gotículas que tienen un volumen de aproximadamente 12,5 jl. En algunos modos de realización, el dispositivo basado en electrohumectación puede comprender gotículas que tienen un volumen de aproximadamente 1 picolitro a aproximadamente 5 ml. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender un elemento de calentamiento, por ejemplo, un elemento de calentamiento por inducción. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender una pluralidad de puertos de entrada/salida para cargar y retirar muestras diferentes o la misma muestra y para la introducción y retirada de fluido(s) de relleno, por ejemplo, ocho puertos de entrada/salida para cargar y retirar ocho muestras diferentes y dos puertos de entrada/salida dedicados para fluido(s) de relleno. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender un único puerto de entrada/salida para cargar y retirar la misma muestra o muestras diferentes y para la introducción y retirada de fluido(s) de relleno. En algunos modos de realización, un dispositivo basado en electrohumectación puede comprender entre 1 a aproximadamente 400 puertos de entrada/salida para cargar y retirar la misma muestra o muestras diferentes, y/o dicho dispositivo puede comprender además entre 1 a aproximadamente 100 puertos de entrada/salida para la introducción y retirada de fluido(s) de relleno. En algunos modos de realización, el paso entre dos puertos de entrada/salida de muestra contiguos puede ser de modo que cada puerto se puede cargar con una muestra por una pipeta manual multicanal o un procedimiento de pipeteo asistido por robot de manipulación de líquidos, por ejemplo, el paso entre dos puertos de entrada/salida de muestra contiguos puede ser de 9 mm. En algunos modos de realización, el paso entre dos puertos de entrada/salida de muestra contiguos puede ser de aproximadamente 9 mm. En algunos modos de realización, el paso entre dos puertos de entrada/salida de muestra contiguos puede variar de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 500 mm.
El término "manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación" se refiere al uso de electrohumectación para mover gotículas dentro del contexto del dispositivo de electrohumectación descrito en el presente documento, por ejemplo, usando medios eléctricos para afectar la hidrofobia de una superficie y una gotícula para inducir el movimiento de dicha gotícula a través de dicha superficie. Los ejemplos de manipulaciones incluyen pero no se limitan a mover gotículas, mezclar gotículas, dividir gotículas y fusionar gotículas.
El término "enriquecimiento de dianas por extensión del cebador" ("PETE") se refiere a un procedimiento de enriquecimiento de ácido nucleico diana de la siguiente descripción general. PETE implica en general las siguientes etapas: (a) proporcionar una sonda oligonucleotídica bicatenaria que tiene una secuencia de cebador en cada extremo 5', en la que una hebra incluye una región que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana e incluye una secuencia de cebador que tiene un marcador recuperable y una caperuza de fosforotioato en su extremo 5', y en la que la secuencia de cebador en el extremo 5' de la otra hebra está fosforilada; (b) amplificar la sonda usando una reacción de amplificación, por ejemplo, PCR, amplificación en círculo rodante, etc.; (c) escindir la hebra que tiene la fosforilación en 5' para generar una sonda monocatenaria que tiene un marcador recuperable en 5' (d) hibridar la sonda monocatenaria que tiene un marcador recuperable en 5' a una secuencia de ácido nucleico diana de interés; (e) enriquecer la secuencia de ácido nucleico diana de interés uniendo el marcador recuperable en 5' de la sonda monocatenaria hibridada que tiene un marcador recuperable en 5' a un sustrato; y (f) liberar la secuencia de ácido nucleico de interés del sustrato por desnaturalización. El marcador recuperable puede ser una biotina, por ejemplo. Adicionalmente, la etapa de enriquecimiento se puede realizar uniendo el marcador a la estreptavidina fijada a un sustrato, por ejemplo, el sustrato puede ser una microesfera magnética. Además, se puede usar una exonucleasa, tal como la exonucleasa A u otra exonucleasa, para escindir la hebra que tiene la fosforilación en 5'.
El término "colección" se refiere en general a una colección de fragmentos de ácido nucleico y, en particular, fragmentos de ADN. Las colecciones pueden incluir, pero no se limitan, a colecciones de ADNc, por ejemplo, colecciones formadas a partir de ARN retrotranscrito, colecciones genómicas, por ejemplo, colecciones formadas a partir de ADN genómico derivado de un organismo, y colecciones de mutantes aleatorizadas, por ejemplo, colecciones formadas por síntesis génica de novo donde se incorporan nucleótidos o codones alternativos. Las colecciones de ADNc son útiles a menudo para el análisis de transcriptomas de un organismo. Las fuentes de ácido nucleico para colecciones incluyen, pero no se limitan a, células individuales, poblaciones heterogéneas de células y muestras biológicas, por ejemplo.
Los términos "adaptador", "ligando adaptador" y "oligonucleótido adaptador" se refieren a oligonucleótidos específicos que se ligan a fragmentos de ácido nucleico, en general fragmentos de ADN, para futuros procesos de secuenciación de ADN.
El término "reparación de extremo" se refiere al proceso que garantiza que cada molécula de ácido nucleico, en general en forma de ADN, esté libre de salientes y contenga grupos fosfato en 5' e hidroxilo en 3' como fragmentación de ácido nucleico, en particular fragmentación de ADN, en general no dé como resultado fragmentos homogéneos de extremos romos.
El término "ligación" se refiere en general a la unión covalente de los extremos de dos fragmentos de ácido nucleico. Un procedimiento ejemplar de ligación puede ser un procedimiento con lo que los extremos 5' y 3' de dos fragmentos de ácido nucleico se unen a través del uso de una enzima.
El término "ligación de adaptador" se refiere a cualquier medio por el que un adaptador se puede ligar a un fragmento de ácido nucleico. La ligación de adaptador se puede producir a través de cualquier técnica de ligación conocida en la técnica, tal como ligación de extremos romos, ligación de cola A o ligación de tablilla monocatenaria, por ejemplo.
El término "ligación de tablilla monocatenaria" se refiere en general a un proceso por el que una ADN ligasa cataliza la ligación de ADN monocatenario contiguo entablillado por una hebra de ARN complementaria.
Los términos "ligación de extremo romo" y "ligación de extremos romos" se refieren en general al proceso por el que se unen entre sí fragmentos de ADN que tienen extremos romos, es decir, que no contienen salientes, siendo dichos salientes en general complementarios.
El término "ligación de extremo cohesivo" se refiere en general al proceso por el que se unen entre sí los salientes de ADN que en general son complementarios entre sí.
El término "ligación TA" se refiere en general a un proceso por el que se pueden unir fragmentos de ADN que conlleva la siguiente descripción. La amplificación basada en PCR normalmente genera productos de PCR con extremos romos, pero la p Cr que usa una polimerasa Taq, por ejemplo, puede añadir una adenina adicional al extremo 3'de un producto de p Cr . Esta propiedad se puede aprovechar en la ligación TA en la que los extremos del producto de PCR se pueden hibridar al extremo T de otro fragmento de ADN. La ligación TA es, por lo tanto, una forma de ligación de extremo cohesivo. En algunos casos, los vectores de extremos romos se pueden convertir en un vector para la ligación TA con trifosfato de didesoxitimidina ("ddTTP") usando transferasa terminal, por ejemplo.
Los términos "ligación de cola A" y "ligación de cola dA" se refieren a la incorporación de 5'-monofosfato de desoxiadenosina (dAMP) sin molde en el extremo 3' de fragmentos de ADN romos. Las colas dA evitan la formación de concatámeros durante las etapas de ligación en dirección 3' y posibilitan ligar fragmentos de ADN a adaptadores con salientes dT complementarios
Los términos "reacción de secuenciación de ácido nucleico" y "reacción de secuenciación de segunda generación" ("NGS") se refieren en general a un proceso de determinación del orden preciso de los nucleótidos dentro de una molécula de ácido nucleico. Los ejemplos de técnicas de secuenciación incluyen pero no se limitan a la secuenciación de molécula única verdadera Helicos, la tecnología de molécula única ultrarrápida ("SMRT") de Pacific Biosciences, la matriz de transistores de efecto de campo sensible a productos químicos ("chemFET") para secuenciar ADN (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20090026082), la secuenciación de nanoesferas de ADN, la secuenciación distintiva masivamente paralela (MPSS), la secuenciación de colonia de polimerasa, la secuenciación Solexa, las plataformas y procedimientos de secuenciación basados en ILLUMINA™, la tecnología SOLiD y la secuenciación Ion Torrent™, por ejemplo.
Una técnica de secuenciación que se puede usar con los procedimientos de la invención proporcionada incluye, por ejemplo, la secuenciación de molécula única verdadera (tSMS) Helicos (Harris T. D. et al. (2008) Science 320:106-109). En la técnica tSMS, una muestra de ADN se escinde en hebras de aproximadamente 100 a 200 nucleótidos y se añade una secuencia poliA al extremo 3' de cada hebra de ADN. Cada hebra se marca por la adición de un nucleótido de adenosina marcado con fluorescencia. A continuación, las hebras de ADN se hibridan a una cubeta de lectura, que contiene millones de sitios de captura de oligo-T que se inmovilizan en la superficie de la cubeta de lectura. Los moldes pueden tener una densidad de aproximadamente 100 millones de moldes/cm. A continuación, la cubeta de lectura se carga en un instrumento, por ejemplo, un secuenciador HeliScope, y un láser ilumina la superficie de la cubeta de lectura, revelando la posición de cada molde. Una cámara CCD puede cartografiar la posición de los moldes en la superficie de la cubeta de lectura. A continuación, el marcador fluorescente de molde se escinde y se elimina por lavado. La reacción de secuenciación comienza introduciendo una ADN polimerasa y un nucleótido marcado con fluorescencia. El ácido nucleico oligo-T sirve como cebador. La polimerasa incorpora los nucleótidos marcados al cebador de manera dirigida por el molde. Se retiran la polimerasa y los nucleótidos no incorporados. Los moldes que han dirigido la incorporación del nucleótido marcado con fluorescencia se detectan por formación de imágenes de la superficie de la cubeta de lectura. Después de la formación de imágenes, una etapa de escisión retira el marcador fluorescente y el proceso se repite con otros nucleótidos marcados con fluorescencia hasta que se logra la longitud de lectura deseada. La información de secuencia se recopila con cada etapa de adición de nucleótidos. Se muestra otra descripción de tSMS, por ejemplo, en Lapidus et al. (patente de EE. UU. número 7.169.560), Lapidus et al. (solicitud de patente de EE. Uu . número 2009/0191565), Quake et al. (patente de EE. UU. número 6.818.395), Harris (patente de EE. UU. número 7.282.337), Quake et al. (solicitud de patente de EE. UU. número 2002/0164629) y Braslavsky et al., PNAS (EE. UU.), 100: 3960-3964 (2003).
Otro ejemplo de una tecnología de secuenciación que se puede usar con los procedimientos de la invención proporcionada incluye la tecnología SMRT de Pacific Biosciences para secuenciar tanto ADN como ARN. En SMRT, cada una de las cuatro bases de ADN se fija a uno de cuatro tintes fluorescentes diferentes. Estos tintes están fosfo-enlazados. Una única ADN polimerasa se inmoviliza con una única molécula de ADN monocatenario molde en la parte inferior de una guía de ondas de modo cero ("ZMW"). Una ZMW es una estructura de confinamiento que posibilita la observación de la incorporación de un único nucleótido por la ADN polimerasa en el contexto de nucleótidos fluorescentes que se difunden rápidamente dentro y fuera de la ZMW (en microsegundos). Se necesitan varios milisegundos para incorporar un nucleótido en una hebra en crecimiento. Durante este tiempo, el marcador fluorescente se excita y produce una señal fluorescente y la marca fluorescente se separa por escisión. La detección de la fluorescencia correspondiente del tinte indica qué base se incorporó. El proceso se repite. Para secuenciar ARN, la ADN polimerasa se reemplaza con una retrotranscriptasa en la ZMW y el proceso se sigue en consecuencia.
Otro ejemplo de una técnica de secuenciación que se puede usar con los procedimientos de la invención proporcionada implica el uso de una matriz chemFET para secuenciar ADN (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20090026082). En un ejemplo de la técnica, las moléculas de ADN se pueden colocar en cámaras de reacción y las moléculas de molde se pueden hibridar a un cebador de secuenciación unido a una polimerasa. La incorporación de uno o más trifosfatos a una nueva hebra de ácido nucleico en el extremo 3' del cebador de secuenciación se puede detectar por un cambio de corriente por un chemFET. Una matriz puede tener múltiples sensores chemFET. En otro ejemplo, se pueden fijar ácidos nucleicos individuales a microesferas, y se pueden amplificar los ácidos nucleicos en la microesfera, y se pueden transferir las microesferas individuales a cámaras de reacción individuales en una matriz chemFET, teniendo cada cámara un sensor chemFET, y se pueden secuenciar los ácidos nucleicos.
Otro ejemplo de una técnica de secuenciación que se puede usar con los procedimientos de la invención proporcionada implica el uso de un microscopio electrónico (Moudrianakis E. N. y Beer M. Proc Natl Acad Sci USA. Marzo de 1965; 53:564-71). En un ejemplo de la técnica, las moléculas de ADN individuales se marcan con marcadores metálicos que son distinguibles usando un microscopio electrónico. A continuación, estas moléculas se estiran sobre una superficie plana y se forman imágenes usando un microscopio electrónico para medir las secuencias.
La secuenciación de nanoesferas de ADN es un tipo de tecnología de secuenciación de alto rendimiento usado para determinar toda la secuencia genómica de un organismo. El procedimiento usa la replicación en círculo rodante para amplificar pequeños fragmentos de ADN genómico en nanoesferas de ADN. A continuación, se usa la secuenciación no encadenada por ligación para determinar la secuencia de nucleótidos. Este procedimiento de secuenciación de ADN permite secuenciar un gran número de nanoesferas de ADN por experimento. Véanse el documento WO2014122548 y Drmanac et al., Science. 1 de enero de 2010; 327(5961):78-81; Porreca, Nat Biotechnol. Enero de 2010; 28(l):43-4.
La secuenciación distintiva masivamente paralela (MPSS) fue una de las primeras tecnologías de secuenciación de segunda generación. MPSS usa un enfoque complejo de ligación de adaptador seguido de decodificación de adaptador, leyendo la secuencia en incrementos de cuatro nucleótidos.
La secuenciación de colonia de polimerasa combina una colección de marcas emparejadas in vitro con PCR en emulsión, un microscopio automatizado y química de secuenciación basada en ligación para secuenciar un genoma de E. coli. La tecnología también se incorporó a la plataforma SOLiD de Applied Biosystems.
En la secuenciación de Solexa, las moléculas de ADN y los cebadores se fijan en primer lugar en un portaobjetos y se amplifican con polimerasa de modo que se formen colonias clonales locales, inicialmente denominadas "colonias de ADN". Para determinar la secuencia, se añaden cuatro tipos de bases finalizadoras reversibles (bases RT) y se eliminan por lavado los nucleótidos no incorporados. A diferencia de la pirosecuenciación, las cadenas de ADN se extienden un nucleótido a la vez y la adquisición de imágenes se puede realizar en un momento retrasado, lo que permite capturar grandes matrices de colonias de ADN por imágenes secuenciales tomadas desde una única cámara.
La tecnología SOLiD emplea la secuenciación por ligación. Aquí, una agrupación de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud fija se marca de acuerdo con la posición secuenciada.
Los oligonucleótidos se hibridan y ligan; la ligación preferencial por la ADN ligasa para emparejar secuencias da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica por PCR en emulsión. Las microesferas resultantes, conteniendo cada una copias individuales de la misma molécula de ADN, se depositan en un portaobjetos de vidrio. El resultado son secuencias de cantidades y longitudes comparables a la secuenciación de Solexa.
En la secuenciación Ion Torrent™, el ADN se cizalla en fragmentos de aproximadamente 300-800 pares de bases y los fragmentos tienen extremos romos. A continuación, los adaptadores de oligonucleótidos se ligan a los extremos de los fragmentos. Los adaptadores sirven como cebadores para la amplificación y secuenciación de los fragmentos. Los fragmentos se pueden fijar a una superficie y se fijan a una resolución de modo que los fragmentos se pueden resolver individualmente. La adición de uno o más nucleótidos libera un protón (H+), con una señal que se detecta y registra en un instrumento de secuenciación. La intensidad de señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados. Los datos de Ion Torrent también se pueden generar como un archivo FASTQ. Véanse los números de publicación de EE. UU. 2009/0026082, 2009/0127589, 2010/0035252, 2010/0137143, 2010/0188073, 2010/0197507, 2010/0282617, 2010/0300559, 2010/0300895, 2010/0301398 y 2010/0304982.
El término "muestra" como se usa en el presente documento incluye una muestra o cultivo (por ejemplo, cultivos microbiológicos) que incluye ácidos nucleicos y/o un ácido nucleico diana. El término "muestra" también pretende incluir muestras tanto biológicas como ambientales. Una muestra puede incluir una muestra de origen sintético. Una "muestra biológica" puede incluir, pero no se limita a, sangre completa, suero, plasma, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquido de lavado (por ejemplo, broncoalveolar, gástrico, peritoneal, ductal, ótico, artroscópico), muestra de biopsia, orina, heces, esputo, saliva, mucosa nasal, líquido prostático, semen, líquido linfático, bilis, lágrimas, sudor, leche materna, líquido mamario, células embrionarias y células fetales. La muestra biológica puede ser sangre y puede ser plasma. Como se usa en el presente documento, el término "sangre" engloba sangre completa o cualquier fracción de sangre, tal como suero y plasma como se define convencionalmente. Plasma sanguíneo se refiere a la fracción de sangre completa resultante de centrifugación de sangre tratada con anticoagulantes. Suero sanguíneo se refiere a la porción acuosa de líquido restante después de que se haya coagulado una muestra de sangre. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como material de superficie, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables de procesamiento de alimentos y productos lácteos.
El término "análisis" se refiere en general a un procedimiento o etapa que implica análisis físico, químico, bioquímico o biológico que incluye caracterización, pruebas, medición, optimización, separación, síntesis, adición, filtración, disolución o mezcla.
El término "producto químico" se refiere a una sustancia, compuesto, mezcla, solución, emulsión, dispersión, molécula, ion, dímero, macromolécula tal como un polímero o proteína, biomolécula, precipitado, cristal, resto o grupo químico, partícula, nanopartícula, reactivo, producto de reacción, disolvente o fluido, de los que uno cualquiera puede existir en estado sólido, líquido o gaseoso, y que típicamente es objeto de un análisis.
El término "proteína" se refiere en general a un conjunto de aminoácidos enlazados entre sí normalmente en una secuencia específica. Una proteína puede ser natural o artificial. Como se usa en el presente documento, el término "proteína" incluye secuencias de aminoácidos que se han modificado para contener restos o grupos tales como glúcidos, polímeros, grupos organometálicos, grupos fluorescentes o emisores de luz, restos o grupos que potencian o participan en un proceso tal como transferencia de electrones intramolecular o intermolecular, restos o grupos que facilitan o inducen a una proteína a asumir una conformación particular o una serie de conformaciones, restos o grupos que impiden o inhiben que una proteína asuma una conformación particular o una serie de conformaciones, restos o grupos que inducen, potencian o inhiben el plegamiento de proteínas u otros restos o grupos que se incorporan a la secuencia de aminoácidos y que están destinados a modificar las propiedades químicas, bioquímicas o biológicas de la secuencia. Como se usa en el presente documento, una proteína incluye, pero no se limita a, enzimas, elementos estructurales, anticuerpos, hormonas, transportadores de electrones y otras macromoléculas que están implicadas en procesos tales como procesos o actividades celulares. Las proteínas típicamente tienen hasta cuatro niveles estructurales que incluyen estructuras primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias.
Una "sonda" se define en general como un ácido nucleico que se puede unir a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, normalmente a través del emparejamiento de bases complementarias, normalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno, formando por tanto una estructura dúplex. La sonda se une o se hibrida a un "sitio de unión de sonda". La sonda se puede marcar con un marcador detectable para permitir una fácil detección de la sonda, en particular una vez que la sonda se ha hibridado a su diana complementaria. El marcador fijado a la sonda puede incluir cualquiera de una variedad de diferentes marcadores conocidos en la técnica que se pueden detectar por medios químicos o físicos, por ejemplo. Los marcadores adecuados que se pueden fijar a las sondas incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, marcadores de masa, partículas densas en electrones, partículas magnéticas, marcadores de espín, moléculas que emiten quimioluminiscencia, moléculas electroquímicamente activas, enzimas, cofactores y sustratos enzimáticos. Las sondas pueden variar significativamente en tamaño. Algunas sondas son relativamente cortas. En general, las sondas tienen una longitud de al menos 7 a 15 nucleótidos. Otras sondas tienen una longitud de al menos 20, 30 o 40 nucleótidos. Todavía otras sondas son algo más largas, teniendo una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90 nucleótidos. Aún otras sondas son todavía más largas y tienen una longitud de al menos 100, 150, 200 o más nucleótidos. Las sondas pueden tener cualquier longitud específica que también se encuentre dentro de los intervalos anteriores.
Para los propósitos de la presente divulgación, se entenderá que cuando se hace referencia en el presente documento a que un componente dado tal como una capa, una región, un líquido o un sustrato está dispuesto o formado "sobre", "dentro" o "en" otro componente, ese un componente dado puede estar directamente sobre el otro componente o, de forma alternativa, también pueden estar presentes componentes intermedios (por ejemplo, una o más capas amortiguadoras, capas intermedias, electrodos o contactos). Se entenderá además que los términos "dispuesto sobre" y "formado sobre" se usan de manera intercambiable para describir cómo se sitúa o ubica un componente dado en relación con otro componente. Por consiguiente, los términos "dispuesto sobre" y "formado sobre" no pretenden introducir ninguna limitación relacionada con procedimientos particulares de transporte, depósito o fabricación de material.
El término "comunicar" se usa en el presente documento para indicar una relación estructural, funcional, mecánica, eléctrica, óptica, térmica o fluídica, o cualquier combinación de las mismas, entre dos o más componentes o elementos. Como tal, el hecho de que se diga que un componente se comunica con un segundo componente no pretende excluir la posibilidad de que puedan estar presentes componentes adicionales entre, y/o asociados de forma funcional o acoplados con, el primer y el segundo componente.
Un dispositivo basado en electrohumectación para qPCR automatizada
Se ha establecido la qPCR como un procedimiento estándar para la cuantificación de ácidos nucleicos en todas las áreas de la biología molecular. El procedimiento en general implica la amplificación de un ácido nucleico diana usando una reacción de amplificación, tal como PCR, y el producto de la amplificación se sigue en tiempo real a través del uso de un agente de detección. Es una reacción de amplificación cuantitativa, lo que significa que se puede determinar la concentración (relativa o absoluta) del ácido nucleico diana amplificado. Por el contrario, en la PCR convencional, solo se puede medir el resultado final de la amplificación solo después de que se completa la PCR (detección de punto final), y la sobreamplificación a menudo puede dar lugar a un sesgo de mutación.
Aunque realizar una reacción de qPCR usando protocolos convencionales puede ayudar a evitar problemas asociados con la sobreamplificación, realizar una qPCR fuera de línea usando formatos convencionales puede llevar mucho tiempo y puede requerir cantidades mayores a las deseadas de lo que a menudo es una cantidad de partida limitada de ácido nucleico diana. Convencionalmente, se usa una muestra que contiene el ácido nucleico diana para qPCR de formato convencional para determinar el número apropiado de ciclos necesarios para obtener la concentración deseada de ácido nucleico diana amplificado. Después de la determinación del número de ciclos necesarios para la amplificación óptima de ácido nucleico diana, se realiza una qPCR basada en detección de punto final en una segunda muestra que contiene el ácido nucleico diana que se va a amplificar. En general, las reacciones tanto para la primera como para la segunda muestras pueden ser tan grandes como decenas de microlitros cada una, lo que a menudo representa un gran volumen de valiosas muestras de partida de ácido nucleico diana. Adicionalmente, la qPCR convencional usa un formato basado en pocillo, lo que a menudo dificulta la recuperación de reacciones individuales. Como se describe en el presente documento, un dispositivo basado en electrohumectación presenta una plataforma alternativa útil para ensayos basados en qPCR, así como cualquier forma de amplificación de ácido nucleico diana en la que se desea la cuantificación del ácido nucleico diana o se va a medir el grado de acumulación de producto durante la amplificación. En general, una gotícula o múltiples gotículas que comprenden un ácido nucleico diana y los componentes necesarios para realizar y para cuantificar una reacción de amplificación se proporcionan en un dispositivo basado en electrohumectación, y dicha gotícula o múltiples gotículas a menudo tendrán un nanolitro o menos en volumen total cada una, permitiendo de este modo un gran ahorro de reactivos, en particular de valiosas muestras de partida de ácido nucleico diana. Adicionalmente, se pueden amplificar dos o más muestras en paralelo usando un dispositivo basado en electrohumectación. Por ejemplo, el procedimiento de qPCR convencional descrito anteriormente que comprende dos muestras para dos reacciones separadas, en el que una reacción se usa para determinar el número de ciclos de amplificación necesarios para generar la concentración deseada de ácido nucleico diana amplificado, y una reacción se usa para aplicar el número predeterminado de ciclos de amplificación para la segunda muestra se pueden producir simultáneamente en el dispositivo basado en electrohumectación ya que cualquiera de las gotículas de reacción se puede cuantificar y se puede recuperar después de cualquier ciclo de amplificación.
Puesto que la qPCR es una técnica muy sensible y el intervalo dinámico de este ensayo se extiende a un número de copias de molde muy bajo, la fiabilidad de los resultados es altamente dependiente de la manipulación exacta de líquido. Un dispositivo basado en electrohumectación como se describe en el presente documento permite la realización de manipulaciones y dosificaciones de líquido altamente exactas a través de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, disminuyendo de este modo la posibilidad de inexactitudes de amplificación relacionadas con la manipulación de líquidos e incrementando la exactitud de las mediciones cuantitativas.
Un procedimiento de uso del dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento se refiere en general a su uso para efectuar la amplificación de un ácido nucleico diana. En general, las manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación pueden permitir la creación de gotículas y/o subconjuntos de gotículas que contienen todos los componentes necesarios para realizar una reacción de amplificación a partir de gotículas de partida que contienen cualquier combinación de los componentes necesarios para la reacción. Por ejemplo, se pueden proporcionar en el dispositivo las gotículas que comprenden un ácido nucleico diana, y/o se puede formar en el dispositivo una gotícula que comprende un ácido nucleico diana a través del uso de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación. A través de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, se pueden formar gotículas más pequeñas a partir de la gotícula inicial que comprende dicho ácido nucleico diana. También se puede proporcionar en el dispositivo una gotícula o gotículas separadas que contienen una mezcla de reacción, o componentes de la misma, que son necesarios para realizar una reacción de amplificación. Las manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación pueden permitir la creación de gotículas de volumen más pequeño a partir de la gotícula de partida inicial, y se pueden usar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación adicionales para fusionar y mezclar una gotícula que comprende dicha mezcla de reacción con dicha gotícula que contiene ácido nucleico diana. Se puede proporcionar un agente de detección en una gotícula en el dispositivo basado en electrohumectación y, usando un procedimiento similar al descrito anteriormente, las gotículas de volumen más pequeño que comprenden dicho agente de detección se pueden fusionar y mezclar con una gotícula que comprende dicho ácido nucleico y/o dicha mezcla de reacción. De forma alternativa, se pueden proporcionar en el dispositivo el ácido nucleico diana, la mezcla de reacción y el agente de detección como una única gotícula, y se pueden crear muchas gotículas de volumen más pequeño a partir de la gotícula inicial usando manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación. En un modo de realización de la invención, se pueden usar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación para crear dos subconjuntos de gotículas para una reacción de amplificación posterior. Ambos subconjuntos de gotículas pueden comprender todos los componentes necesarios para realizar una reacción de amplificación, incluyendo un ácido nucleico diana; sin embargo, un subconjunto de gotículas puede contener un agente de detección y un subconjunto de gotículas puede no contener un agente de detección. En otros modos de realización de la invención, múltiples subconjuntos de gotículas pueden contener cada uno el mismo ácido nucleico diana o uno diferente y/o el mismo agente de detección o uno diferente.
Después de la generación de gotículas o subconjuntos de gotículas que contienen los componentes necesarios para realizar una reacción de amplificación, se puede producir la amplificación del ácido nucleico diana en el dispositivo basado en electrohumectación. La amplificación se puede producir a través de procedimientos tales como termociclado por PCR estándar, amplificación isotérmica, amplificación de inicio en caliente o cualquier procedimiento que dé como resultado la amplificación de un ácido nucleico diana. Para efectuar un cambio de temperatura que se puede requerir para un procedimiento de amplificación deseado, se pueden mover las gotículas que comprenden el ácido nucleico diana usando manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, por ejemplo, usando medios eléctricos para afectar la hidrofobia de una superficie y una gotícula para inducir movimiento de dicha gotícula a través de dicha superficie, a una parte del dispositivo que se puede calentar a través del uso de elementos de calentamiento. Dichos elementos de calentamiento pueden comprender un calentador en el chip o un calentador separado del chip. Por ejemplo, el calentamiento se puede lograr a través del uso de calentadores de contacto que son un elemento separado del propio dispositivo, o a través de elementos de calentamiento que se fabrican como parte del dispositivo. Además, el calentamiento se puede lograr a través del uso de elementos de calentamiento por inducción que son un elemento separado del propio dispositivo, o a través de elementos de calentamiento por inducción que se fabrican como parte del dispositivo. A través del uso de cualquiera de dichos elementos de calentamiento, las gotículas se pueden termociclar como sea necesario para el procedimiento de amplificación deseado. Debido a las eficaces propiedades de transferencia de calor que están presentes cuando se realiza el termociclado en un dispositivo basado en electrohumectación, se logra un gran ahorro de tiempo necesario para amplificar un ácido nucleico diana. Por ejemplo, las etapas de termociclado en general asociadas con amplificación basada en PCR, por ejemplo, temperaturas diseñadas para dar como resultado las etapas generales de termociclado de fusión, hibridación y extensión, se pueden efectuar a través del uso de elementos de calentamiento por inducción presentes dentro del dispositivo basado en electrohumectación. Debido a la alta eficacia de la transferencia de calor, se pueden producir 30 ciclos de un termociclo de tres etapas en tan solo diez minutos. Para efectuar la amplificación de inicio en caliente en el dispositivo basado en electrohumectación, uno o más componentes de la PCR se pueden mantener separados entre sí dividiendo los diversos componentes en diferentes gotículas o diferentes subconjuntos de gotículas. Por ejemplo, este tipo de metodología se puede lograr dividiendo una mezcla que contiene cebadores, molde, nucleótidos y agua en una primera gotícula o un primer subconjunto de gotículas, a continuación dividiendo los componentes de PCR restantes, tales como una ácido nucleico polimerasa, tampón y MgCh, en una segunda gotícula o subconjunto de gotículas. Dicha división se puede lograr a través del uso de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, por ejemplo. Tanto la primera como la segunda gotículas, o el primer y el segundo subconjuntos de gotículas, a continuación se pueden calentar en paralelo a través del uso de elementos de calentamiento, y a continuación dichas primera y segunda gotículas o subconjuntos de gotículas se pueden fusionar y mezclar después de que se ha alcanzado la temperatura deseada.
La amplificación y cuantificación de un ácido nucleico diana dentro de las gotículas proporcionadas o formadas a través de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación en un dispositivo basado en electrohumectación en general pueden transcurrir con lo que todas las gotículas proporcionadas o formadas en el dispositivo contienen un agente para la detección de ácido nucleico. Dichas gotículas pueden comprender subconjuntos de gotículas en las que cada subconjunto de gotículas comprende un ácido nucleico diana diferente para su amplificación posterior, o dichas gotículas pueden comprender todas el mismo ácido nucleico diana para su amplificación posterior. Por el contrario, se pueden proporcionar o formar dos subconjuntos de gotículas en el dispositivo, en los que un subconjunto de gotículas contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana y en los que el otro subconjunto de gotículas no contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana. Las condiciones necesarias para efectuar la amplificación de ácido nucleico, basándose en el procedimiento de amplificación deseado, se crean a través del uso de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación y de los elementos de calentamiento presentes en el dispositivo. Dichas condiciones se pueden aplicar a todas las gotículas y/o subconjuntos de gotículas en paralelo, independientemente del número absoluto de gotículas o de la presencia o ausencia de distintos subconjuntos de gotículas. A medida que transcurre la amplificación del ácido nucleico diana, se puede medir la cantidad de ácido nucleico diana generado en diversas fases del ciclo de amplificación, preferentemente al final de cada ciclo del ciclo de amplificación, a través de la medición y cuantificación de un agente de detección presente dentro de algunas o todas las gotículas y/o subconjuntos de gotículas. Las gotículas se pueden mover a un área de detección a través de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y la concentración de un ácido nucleico diana se puede medir a través del uso de un agente de detección. De forma alternativa, el dispositivo basado en electrohumectación puede tener un área de detección dinámica, por ejemplo, un cabezal de barrido para detectar la señal de un agente de detección, con lo que la cantidad de ácido nucleico diana dentro de una gotícula se puede medir en diversas localizaciones en todo el chip a través de la detección de un agente de detección.
En el caso en el que se proporcionan al menos dos subconjuntos de gotículas en el dispositivo basado en electrohumectación, un subconjunto de gotículas que no contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana y al menos un subconjunto de gotículas que contiene un agente para la detección de ácido nucleico diana, una vez que se ha obtenido una cantidad deseada de ácido nucleico como se determina a través de la cuantificación del agente de detección en el subconjunto de gotículas que contiene el agente de detección, el subconjunto de gotículas que no contiene un agente de detección se puede recuperar del dispositivo a través de manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación para etapas de procesamiento corriente abajo posteriores. Si así se desea, el subconjunto de gotículas que contiene el agente de detección también se puede recuperar del dispositivo para cualquier procesamiento y/o ensayo corriente abajo posterior. Ambos subconjuntos de gotículas deben contener una concentración equivalente de ácido nucleico diana, ya que ambos subconjuntos de gotículas se sometieron a amplificación en paralelo. Cuando todas las gotículas contienen un agente para la detección, cualquier cantidad o combinación de gotículas individuales se puede manipular usando el dispositivo basado en electrohumectación para recuperar cada una de dichas gotículas una vez que la cantidad de ácido nucleico diana amplificado haya alcanzado la concentración deseada. Si se desea, cualquiera o todas de dichas gotículas o subconjuntos de gotículas se pueden mezclar con otros reactivos y/o mezclas de reacción para preparar las gotículas para su procesamiento posterior, por ejemplo, reacciones de secuenciación de ácido nucleico.
El ácido nucleico diana amplificado que resulta de la amplificación por qPCR usando un dispositivo basado en electrohumectación como se describe en el presente documento se puede usar para aplicaciones corriente abajo tales como, pero sin limitarse a, secuenciación NGS usando diversas plataformas de secuenciación NGS, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo o dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas, sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN (en general comenzando a partir de ADNc) y/o sec. de metilación, por ejemplo, después de la recuperación de las gotículas que contienen la cantidad deseada de ácido nucleico diana amplificado. El dispositivo de electrohumectación descrito en el presente documento se puede usar adicionalmente para procesos tales como los procesos basados en amplificación generales, que incluyen generación de amplicones y enriquecimiento de dianas, además de diversas aplicaciones durante las diferentes fases de amplificación y cuantificación de colecciones. El enriquecimiento de ácido nucleico diana se puede producir a través del enriquecimiento de dianas por extensión del cebador ("PETE"), donde PETE se puede realizar usando el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento. PETE implica en general las siguientes etapas: (a) proporcionar una sonda oligonucleotídica bicatenaria que tiene una secuencia de cebador en cada extremo 5', en la que una hebra incluye una región que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana e incluye una secuencia de cebador que tiene un marcador recuperable y una caperuza de fosforotioato en su extremo 5', y en la que la secuencia de cebador en el extremo 5' de la otra hebra está fosforilada; (b) amplificar la sonda usando una reacción de amplificación, por ejemplo, PCR, amplificación en círculo rodante, etc.; (c) escindir la hebra que tiene la fosforilación en 5' para generar una sonda monocatenaria que tiene un marcador recuperable en 5'; (d) hibridar la sonda monocatenaria que tiene un marcador recuperable en 5' a una secuencia de ácido nucleico diana de interés; (e) enriquecer la secuencia de ácido nucleico diana de interés uniendo el marcador recuperable en 5' de la sonda monocatenaria hibridada que tiene un marcador recuperable en 5' a un sustrato; y (f) liberar la secuencia de ácido nucleico de interés del sustrato por desnaturalización. El proceso descrito anteriormente se puede realizar en el contexto de las gotículas proporcionadas en el dispositivo basado en electrohumectación que comprende los elementos de reacción necesarios, y en el que las etapas anteriores se logran a través del uso de manipulaciones de gotículas basadas en electrohumectación y a través del uso de una zona de detección y/o o, si es necesario, un elemento de calentamiento asociado con el dispositivo basado en electrohumectación.
La preparación de colecciones para la secuenciación de segunda generación en general implica la ligación de oligonucleótidos adaptadores específicos a fragmentos de ácido nucleico que se van a secuenciar. La ligación de adaptadores se puede producir a través de diversos procedimientos conocidos en la técnica, tales como ligación de tablilla monocatenaria, ligación de adaptadores de extremos romos, ligación de extremos cohesivos, ligación TA y/o ligación de cola dA de adaptadores. Cuando el ácido nucleico diana inicial es ADN, en primer lugar, el ADN se fragmenta a la longitud óptima determinada por el procedimiento de secuenciación n Gs en dirección 3'. La fragmentación de ADN en general no da como resultado fragmentos homogéneos de extremos romos, así que es necesaria la reparación de extremos para garantizar que cada molécula esté libre de salientes y contenga grupos fosfato en 5' e hidroxilo en 3'. A continuación, se puede producir la ligación de adaptador usando procedimientos tales como ligación de tablilla monocatenaria, ligación de adaptadores de extremos romos, ligación de extremos cohesivos, ligación TA y/o ligación de cola dA de adaptadores. Las colecciones que se van a usar en la ligación de adaptadores de extremos romos, incluyendo la construcción de colecciones Ion Torrent™ o SOLiD™ 4, se pueden usar directamente en la etapa de ligación. Para las colecciones de Illumina® y algunas colecciones destinadas a la plataforma 454™, puede ser necesaria la incorporación de un 5'-monofosfato de desoxiadenosina (dAMP) sin molde en el extremo 3' de los fragmentos de ADN romos, un proceso conocido como cola dA. Las colas dA evitan la formación de concatámeros durante las etapas de ligación en dirección 3' y posibilitan ligar fragmentos de ADN a adaptadores con salientes dT complementarios. El tamaño de ADN ligado al adaptador deseado para las plataformas Illumina, SOLiD e Ion Torrent se puede seleccionar por medio de electroforesis en gel antes de la amplificación siguiendo cualquier procedimiento de ligación de adaptador.
En un modo de realización de la invención, se puede usar un dispositivo basado en electrohumectación para cuantificar el número de moléculas de ácido nucleico diana ligadas al adaptador en diversas etapas de la preparación de colecciones, en la que la colección está destinada para su uso con una plataforma de secuenciación de segunda generación ("NGS"). Cualquiera de los procedimientos y reacciones descritos a continuación se puede realizar usando gotículas que comprenden los componentes de reacción necesarios, en los que las gotículas se proporcionan en un dispositivo basado en electrohumectación y las manipulaciones de gotículas basadas en electrohumectación combinadas con el dispositivo basado en electrohumectación permiten que se produzca la reacción y el análisis deseados. La qPCR ha demostrado su utilidad como procedimiento para la amplificación y cuantificación de colecciones de ácidos nucleicos antes de cualquier secuenciación de ácido nucleico, en particular los procedimientos que usan una plataforma o técnica NGS. En general, las etapas principales en la preparación de ácidos nucleicos para el análisis de NGS son como sigue: (a) fragmentar y/o dimensionar las secuencias de ácido nucleico diana hasta una longitud deseada; (b) convertir el ácido nucleico diana en ADN bicatenario; (c) fijar adaptadores oligonucleotídicos a los extremos de fragmentos diana; y (d) cuantificar el producto de colección final para su secuenciación, en general a través del proceso de qPCR. Más específicamente, las etapas que habitualmente se usan para la preparación de colecciones son como sigue: (a) fragmentación del material fuente de ácido nucleico; (b) reparación de extremos; (c) fosforilación de los extremos 5'; (d) cola A de los extremos 3' para facilitar la ligación a los adaptadores de secuenciación; (e) ligación de adaptadores; y (f) algún número de ciclos de PCR para enriquecer el producto que tiene adaptadores ligados a ambos extremos. La qPCR que usa el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento puede permitir la cuantificación del número de moléculas ligadas al adaptador en una colección preparada para NGS en diversas fases de los flujos de trabajo de secuenciación, que incluyen: (a) después de la ligación de adaptador para determinar la cantidad de material de entrada convertido en moléculas ligadas al adaptador (tasa de conversión) y/o la cantidad de molde usado para la amplificación de colecciones; (b) después de la amplificación de colecciones, para determinar si se ha generado una cantidad suficiente de cada colección y/o para garantizar una representación equitativa de las colecciones indexadas agrupadas para la captura de diana o la amplificación de conglomerados; y/o (c) antes de la amplificación de conglomerados, para confirmar que las colecciones individuales o las agrupaciones de muestras se diluyen hasta la concentración óptima para la carga de la cubeta de lectura de NGS, como la sobreestimación o subestimación de la concentración de colecciones puede dar como resultado una utilización subóptima de la capacidad de secuenciación, se puede usar la qPCR después de las etapas de limpieza posteriores a la ligación (antes de la amplificación de colecciones) para proporcionar datos útiles para la optimización. La cuantificación en esta fase le permite a un usuario valorar la eficacia del proceso de construcción de colecciones central (reparación de extremos, cola A y ligación) determinando el porcentaje de ADN de entrada convertido en moléculas ligadas al adaptador, así como la amplificación de colecciones con el número de ciclos seleccionado, en base a la cantidad real de ADN molde usado en la reacción de amplificación por PCR. Adicionalmente, si la selección de tamaño se realiza en cualquier fase, la cuantificación por qPCR antes y después de la selección de tamaño también puede ser útil para definir el beneficio relativo de la selección de tamaño, y para determinar la pérdida de material asociada con el proceso.
Un aspecto de la invención se refiere en general a un procedimiento de uso del dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para evitar el sesgo de sobreamplificación de colecciones que se puede producir durante la amplificación de ácido nucleico diana. La amplificación de colecciones excesiva puede dar lugar a otros artefactos no deseados tales como sesgo de amplificación, duplicados de PCR, inserciones de colecciones quiméricas y sustituciones de nucleótidos. Por lo tanto, el grado de la amplificación de colecciones se debe limitar tanto como sea posible. La capacidad de amplificar gotículas que comprenden un ácido nucleico diana en paralelo mientras se sigue la cantidad de ácido nucleico diana presente dentro de cualquiera de dichas gotículas permite la determinación de los parámetros de amplificación ideales y el número de ciclos de amplificación necesarios para obtener la cantidad deseada de ácido nucleico diana. Adicionalmente, si se desea, se puede someter una muestra de ácido nucleico diana a una reacción de qPCR usando un enfoque basado en qPCR estándar para determinar el número óptimo de ciclos de amplificación necesarios para obtener la concentración deseada de ácido nucleico diana. Una vez que se ha determinado el número de ciclos, dicho número de ciclos se puede aplicar para realizar una reacción de qPCR en el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento.
Se puede usar cualquier ácido nucleico diana deseado como molde para qPCR en un dispositivo basado en electrohumectación. Por ejemplo, se puede usar ARN como molde (por ejemplo, en el caso de estudios de expresión génica o detección de virus de ARN) para qPCR usando un dispositivo basado en electrohumectación como se describe en el presente documento. En este caso, el ARN se debe retrotranscribir en ADN (también denominado ADN complementario o ADNc) antes de que se amplifique con qPCR. El término para este procedimiento combinado es "PCR de retrotranscripción ultrarrápida" ("qRT-PCR" o "RT-qPCR"). Adicionalmente, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación para efectuar análisis basados en transcriptomas, en particular que se originan del ARNm de una única célula.
Se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para la amplificación de una concentración de partida de una única copia de un ácido nucleico diana. Si se desea, se puede proporcionar una gotícula en el dispositivo basado en electrohumectación que contenga una concentración de ácido nucleico diana mayor que una única copia. Las operaciones de gotículas mediadas por electrohumectación se pueden usar para dividir la gotícula hasta que esté presente en cada gotícula una única copia, o, en promedio, menos de una única copia, del ácido nucleico diana. Dicha gotícula que contiene una copia o, en promedio, menos de una copia del ácido nucleico diana se puede fusionar y mezclar con una gotícula que contiene los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación y para detectar la cantidad de ácido nucleico producido como resultado de la reacción de amplificación. Dicha detección se puede producir dentro del contexto de dos subconjuntos de gotículas, de las que ambas contienen en promedio menos de una copia de ácido nucleico diana por gotícula, pero en las que solo un subconjunto de gotículas contiene un agente de detección.
El dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento también se puede usar para realizar un análisis de curva de fusión. Típicamente, se incluye un análisis de curva de fusión al final de los ensayos de qPCR basados en SYBR® Green I para proporcionar información sobre la especificidad de la reacción. Se ha descubierto que el análisis de curva de fusión es útil para la identificación del dímero-adaptador remanente en colecciones ILLUMINA™. Los dímeros-adaptador, formados durante la construcción de colecciones con adaptadores de longitud completa, se amplifican muy eficazmente, y darán lugar a una sobreestimación de la concentración de colecciones si están presentes en cantidades significativas.
El dispositivo basado en electrohumectación que se describe en el presente documento puede realizar reacciones de qPCR completamente automatizadas con gotículas proporcionadas en el dispositivo. Usando un ordenador que está en comunicación con el dispositivo basado en electrohumectación y todos los componentes asociados con el dispositivo basado en electrohumectación, por ejemplo, los elementos de calentamiento y las zonas de detección, se pueden ejecutar programas que se escribieron de antemano para realizar todas las manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación necesarias, procedimientos de reacción de amplificación, mediciones de cuantificación de ácido nucleico diana efectuadas a través de la detección del agente de detección en una zona de detección y recuperación posterior de cualquiera y/o todas las gotículas que contienen el resultado deseado de la reacción de amplificación. Después de la recuperación, el producto deseado de la reacción de amplificación de ácido nucleico diana se puede someter a más ensayos según se desee por el usuario. Para realizar la reacción deseada en el dispositivo, es posible que un usuario simplemente deba introducir la muestra que contiene el ácido nucleico diana bajo investigación en el dispositivo. Una vez en el dispositivo basado en electrohumectación, se pueden ejecutar protocolos automatizados que pueden detectar la cantidad de partida de ácido nucleico diana presente y, posteriormente que pueden realizar las manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación necesarias para generar gotículas y/o subconjuntos de gotículas que contienen la concentración deseada de ácido nucleico diana junto con cualquier otro componente de reacción y agente de detección deseados. Basándose en las condiciones de entrada, se pueden ejecutar protocolos para obtener la cantidad deseada de amplificación de ácido nucleico diana, y las gotículas que contienen la cantidad deseada de ácido nucleico diana se pueden recuperar además del dispositivo para etapas de procesamiento posteriores, por ejemplo, reacciones de secuenciación.
En general, el uso de un dispositivo basado en electrohumectación para realizar la amplificación de ácido nucleico diana y la cuantificación posterior puede incrementar en gran medida la velocidad, la eficacia y la sensibilidad con las que se pueden detectar los biomarcadores en forma de ácidos nucleicos. En particular, dicho dispositivo puede representar un poderoso recurso de diagnóstico inmediato, que permite la detección de biomarcadores que representan la presencia de una enfermedad en un paciente a partir de menos de un microlitro de muestra biológica, y/o para la generación de colecciones de ácidos nucleicos diana para reacciones de secuenciación posteriores.
En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de ADN polimerasa KAPA HiFi. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de una polimerasa diseñada para su uso con química SYBR Green I, por ejemplo, ADN polimerasa KAPA SYBR FAST. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de ADN polimerasa KAPA SYBR FAST. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de tintes intercalantes, por ejemplo, SYBR Green I, SYTO9, OPD y/o tinte LIGh Tc YCLER® 480 ResoLight de Roche. Dichos tintes intercalantes pueden comprender una concentración que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 |j M, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 1 j M. En algunos modos de realización, dicho tinte intercalante puede comprender una sonda de oxidorreducción, por ejemplo, OPD. Dicha sonda de oxidorreducción, por ejemplo, OPD, puede comprender una concentración que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 j M, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 1 j M. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de termociclos en los que las temperaturas de dichos termociclos varían de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 98 °C, por ejemplo, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 72 °C, aproximadamente 95 °C o aproximadamente 98 °C. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende los tiempos de reacción, en el que dicho tiempo de reacción puede comprender la cantidad de tiempo en una única etapa de un termociclo, cualquier combinación de etapas de termociclo, o la cantidad de tiempo para una reacción de amplificación completa, que varía entre 1 s a aproximadamente 5 min, por ejemplo, aproximadamente 1 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 20 s, aproximadamente 30 s, aproximadamente 45 s, aproximadamente 1 min y/o aproximadamente 5 min.
En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de una mezcla maestra, por ejemplo, una mezcla que comprende polimerasa, dNTP, MgCl2 y cebadores oligonucleotídicos. Dicha mezcla maestra puede comprender dNTP, y la concentración de dicho(s) dNTP puede comprender un intervalo de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 100 mM. Dicha mezcla maestra puede comprender MgCh, y la concentración de MgCh puede comprender un intervalo de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 100 mM. Dicha mezcla maestra puede comprender cebador(es) oligonucleotídico(s), y la concentración de cebador(es) oligonucleotídico(s) puede comprender un intervalo de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1 |jM o aproximadamente 1 mM.
En algunos modos de realización, se puede usar un dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende el uso de fluido de relleno, por ejemplo, un aceite transparente. En algunos modos de realización, dicho fluido de relleno puede ser un aceite transparente, por ejemplo, siloxano polimerizado líquido, por ejemplo, aceite de silicona, por ejemplo, aceite de vaselina, por ejemplo, aceite de parafina. En algunos modos de realización, dicho fluido de relleno puede comprender siloxano polimerizado líquido, aceite de silicona, aceite de vaselina y/o aceite de parafina.
En algunos modos de realización, se puede usar un dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende una concentración diana de material amplificado, por ejemplo, un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico diana, que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 1 j M, aproximadamente 10 j M, aproximadamente 100 j M o aproximadamente 1 mM. En algunos modos de realización, se puede usar el dispositivo basado en electrohumectación descrito en el presente documento para realizar un procedimiento de amplificación, por ejemplo, un procedimiento de amplificación automatizada, por ejemplo, una reacción de amplificación, en el que dicho procedimiento de amplificación comprende una concentración de partida de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico diana, que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 1 j M, aproximadamente 10 j M, aproximadamente 100 j M o aproximadamente 1 mM.
Ejemplos
Como se presenta en la FIG. 1A-1B, las reacciones de gotículas se mueven entre diferentes zonas de calentamiento por inducción usando manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y dichas zonas de calentamiento se usan para realizar cambios de temperatura requeridos por un procedimiento de reacción de amplificación deseado. En la FIG. 1A, solo hay una reacción de gotícula para cada una de cuatro muestras de partida diferentes (marcadas 1-4 en la FIG. lA ). Cada reacción de gotícula contiene un agente de detección en forma de agente intercalante. Cualquiera o todas las reacciones de gotículas se recuperan del dispositivo una vez que se ha generado una cantidad deseada de producto de PCR como se indica por las lecturas electroquímicas o de fluorescencia a través de la detección y cuantificación usando un agente de detección y la zona de detección del dispositivo. En la FIG. 1B, hay dos reacciones de gotículas para cada una de dos muestras de partida diferentes (marcadas 1-2 en la FIG. 1B), una que contiene un agente de detección y una que no. Los pares de reacciones de gotículas se termociclan en paralelo. Cualquiera o todas las reacciones de gotículas que no contienen un agente de detección se recuperan del dispositivo una vez que se ha generado una cantidad deseada de producto de PCR como se indica por las lecturas electroquímicas o de fluorescencia de la reacción de gotícula que contiene el agente de detección.
En la FIG. 2A, la mitad de un par de reacciones de gotículas para cada una de ocho muestras de partida diferentes (marcadas 1-8 en la FIG. 2A) se carga en el dispositivo a través del puerto de entrada/salida de muestra, y se mueve a un extremo del carril de electrodo. Las ocho gotículas que contienen ocho muestras diferentes de la FIG.
2A comprenden un primer subconjunto de gotículas. En la FIG. 2B, la otra mitad de un par de reacciones de gotículas para cada una de dichas ocho muestras de partida diferentes (marcadas como otro conjunto de 1-8 en la FIG. 2B) se carga en el dispositivo a través del puerto de entrada/salida, y se mueve al otro extremo del carril de electrodo. Dichas ocho gotículas diferentes de la FIG. 2B comprenden un segundo subconjunto de gotículas. Cada gotícula de cada subconjunto, por ejemplo, la gotícula 1 del subconjunto 1 y la gotícula 1 del subconjunto 2, son idénticas excepto que cada gotícula del segundo subconjunto de gotículas contiene un agente de detección en forma de agente intercalante, mientras que cada gotícula del primer subconjunto de gotículas no contiene un agente de detección en forma de agente intercalante. En la FIG. 2C, las dieciséis reacciones de gotículas se mueven entre diferentes zonas de calentamiento por inducción usando manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y dichas zonas de calentamiento se usan para realizar cambios de temperatura requeridos por un procedimiento de reacción de amplificación deseado. Cualquiera o todas las reacciones de gotículas se recuperan del dispositivo una vez que se ha generado una cantidad deseada de producto de PCR como se indica por las lecturas electroquímicas o de fluorescencia a través de la detección y cuantificación usando un agente de detección y la zona de detección del dispositivo.
La FIG. 3 muestra un ejemplo de diseño de un dispositivo para reacciones de ocho muestras de partida diferentes, en el que cada muestra se divide en dos gotículas cuando se carga, del que un ejemplo se presenta en la FIG.
2A-C. En la FIG. 3 , las dimensiones se indican en mm y la , es una coma decimal. En el dispositivo, cada electrodo en el que se coloca una gotícula está diseñado para ser un cuadrado con una dimensión de 5 por 5 mm, y el espacio entre la placa superior e inferior es de 0,5 mm, de modo que el volumen de cada gotícula en un electrodo eléctricamente activado se estima que es 12,5 pl. En este dispositivo, el paso entre dos puertos de entrada/salida de muestra contiguos en la placa superior está diseñado para ser de 9 mm, de modo que se puedan cargar y descargar ocho muestras diferentes dentro y fuera del dispositivo a través de los puertos usando una pipeta manual multicanal o usando pipeteo asistido por robot de manipulación de líquidos. Se usan dos puertos de entrada de fluido de relleno para llenar el dispositivo con fluido de relleno, por ejemplo, aceites de baja viscosidad como un aceite a base de silicona o un aceite a base de fluorocarbono. Además de la conformación de electrodo cuadrada presentada en la FIG. 3 , en las FIG. 4A-4F se presentan ejemplos adicionales de conformación de electrodo de los electrodos de un dispositivo basado en electrohumectación. Los ejemplos de conformaciones de electrodos pueden ser cuadrados (FIG. 4A), triángulos (FIG. 4B), trapezoides (FlG. 4C) y/o cualquiera de las conformaciones irregulares presentadas en la FIG. 4D, la FIG. 4E y/o la FIG. 4F.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de amplificación de ácido nucleico automatizada que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un dispositivo basado en electrohumectación;
(b) proporcionar al menos dos gotículas en dicho dispositivo basado en electrohumectación, en el que cada gotícula comprende cebadores que se hibridan a un ácido nucleico diana; y un ácido nucleico diana;
(c) amplificar el ácido nucleico diana en cada una de dichas gotículas en paralelo;
(d) cuantificar el ácido nucleico diana amplificado en al menos una gotícula; y
(e) después de que se ha obtenido una cantidad deseada del ácido nucleico diana, recuperar al menos una gotícula y usar dicha al menos una gotícula para analizar o procesar adicionalmente dicha al menos una gotícula, caracterizado por que el análisis o procesamiento se selecciona de un grupo que consiste en secuenciación de ácido nucleico, secuenciación de segunda generación, secuenciación indiscriminada de genoma completo, secuenciación de exoma completo, secuenciación dirigida, secuenciación de amplicón, secuenciación de par de parejas, sec. RIP/sec. CLIP, sec. ChIP, sec. de ARN, secuenciación de transcriptoma y sec. de metilación.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
(i) dichas gotículas comprenden cada una un ácido nucleico diana diferente;
(ii) cada una de dichas gotículas comprende el mismo ácido nucleico diana;
(iii) dicho dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación;
(iv) dichas gotículas comprenden una mezcla de gotículas que contienen el mismo ácido nucleico diana y diferentes ácidos nucleicos diana;
(v) el dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración plana de electrodos que efectúa manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación;
(vi) dichas gotículas comprenden un volumen de gotículas que varía de aproximadamente 1 picolitro a aproximadamente 5 ml, en el que opcionalmente dichas gotículas comprenden un volumen de gotícula de aproximadamente 12,5 ml;
(vii) el dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos o una configuración plana de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y en el que dichos electrodos comprenden dimensiones de electrodo que varían de aproximadamente 100 |jm por 100 |jm a aproximadamente 10 cm por 10 cm;
(viii) el dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos o una configuración plana de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y en el que dichos electrodos están intercalados;
(ix) el dispositivo basado en electrohumectación comprende una configuración biplanar de matrices paralelas de electrodos o una configuración plana de electrodos para efectuar manipulaciones de gotículas mediadas por electrohumectación, y en el que dichos electrodos comprenden óxido de indio y estaño ("ITO"), óxidos conductores transparentes ("TCO"), polímeros conductores, nanotubos de carbono ("CNT"), grafeno, mallas de nanohilos y/o películas metálicas ultrafinas, en el que opcionalmente dichos electrodos comprenden ITO;
(x) dicho dispositivo comprende puertos de entrada/salida en los que la separación entre puertos contiguos varía de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 500 mm; o
(xi) el dispositivo basado en electrohumectación comprende o está en contacto con al menos un elemento de calentamiento y al menos una zona de detección.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, modo de realización (v) en el que:
dicho dispositivo de electrohumectación está en contacto con o comprende un elemento de calentamiento y una zona de detección; y en el que
(i) dicho dispositivo basado en electrohumectación comprende electrodos cuadrados, en el que opcionalmente dichos electrodos tienen aproximadamente 5 mm por 5 mm; o
(ii) dicho dispositivo basado en electrohumectación comprende electrodos, en el que dichos electrodos tienen conformación cuadrada, triangular, rectangular, circular, trapezoidal y/o irregular.
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