CN112387317B - 一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片 - Google Patents

一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医疗器械技术领域，具体的讲是一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，从上至下由第一盖片、第一PDMS盖片、第二PDMS盖片、第三PDMS盖片、基片堆叠而成；所述第二PDMS盖片上设有检测结构，所述检测结构包括油相储液池、水相储液池、液滴池，油相储液池利用油液连接通道与流体控制阀相连，水相储液池利用水相连接通道也与流体控制阀相连，所述流体控制阀的另一端与液滴池相连，液滴池利用气孔连接通道与气孔相连，本发明提高了液滴稳定性，保证了离心力芯片中液滴在储存及加热过程中不发生融合，提高检测结果的稳定性，同时在芯片上设置了阴性和阳性对照，保证了结果的可靠性。

Description

一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体的讲是一种快速检测血 清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片。
背景技术
大肠癌传统筛查方法是肠镜检查和粪便潜血检测。结肠镜检 是临床诊断大肠癌的金标准，但属于侵入式检查，患者依从差。 粪便隐血试验是目前广泛应用的筛查方法，安全无创，受检者依 从性较好，但检测灵敏度低，特异性差，易造成误诊。近几年陆 续报道的大肠癌筛查及个体化治疗的分子标志物是肿瘤细胞中发生了突变或者甲基化的基因。肿瘤发生相关基因的突变是肿瘤细 胞特有的，而特定基因启动子区域的异常甲基化则是肿瘤细胞区 别正常细胞的另一个重要特征，因此这基因甲基化可作为肿瘤分 子标志物用于筛查或诊断大肠癌。近期国际多个研究团队报道血 液循环DNA Septin9基因的甲基化检测也可作为大肠癌筛查手段(Song et al.Adv Clin Chem.2015,72:171-204,Yan et al.MedSci Monit.2016,22:3409-3418.)。《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治 指南》明确指出血液循环DNA Septin9基因甲基化检测可实现大肠癌早期诊断的无创检测(中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指 南.中华消化内镜杂志.2015,6(32):345-346.)。
目前，基于实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR， qPCR)的外周血Septin 9基因甲基化检测已在临床上开展，但 qPCR技术存在灵敏度不高、精准度不高、重复性不好等局限性。 因此，本领域迫切需要建立新的具有高灵敏度、高特异性、高稳 定性的人Septin 9基因甲基化的检测技术。微滴式数字PCR系统 在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含 待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR 扩增后通过荧光检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比 例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。
微滴式数字PCR不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单 拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴数字PCR技术具有特异性 强、灵敏度高、快速及设备简单等优点，让数字PCR更低成本， 且更实用。微流控芯片技术能够快速并准确地将样品流体分成若干独立的单元，从而进行多步平行反应，并具有成本低、体积小 和高通量等特点，是理想的液滴PCR平台。目前，已有研究报 道采用微滴式数字PCR用于病原微生物、肿瘤基因突变和拷贝数 变异的检测，但还没有应用微流控液滴数字PCR技术检测人类血 清Septin 9甲基化的相关文献。
为了解决基于qPCR技术的人Septin 9基因甲基化检测方法 中所存在的CRC检测灵敏度不高、不能绝对定量的技术瓶颈，弥 补利用微流控液滴检测血清Septin 9甲基化的技术空白，设计一 种基于液滴数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的离心式微 流控液滴芯片是十分有必要的。
发明内容
本发明突破了现有技术的难题，设计了一种基于液滴数字 PCR技术检测人Septin9基因甲基化的离心式微流控液滴芯片， 其目的是为了解决基于qPCR技术的人Septin 9基因甲基化检测方法中所存在的CRC检测灵敏度不高、不能绝对定量的技术瓶 颈，弥补利用微流控液滴检测血清Septin 9甲基化的技术空白。
为了达到上述目的，本发明设计了一种快速检测血清Septin 9 甲基化的微流控液滴芯片，包括盖片、基片，其特征在于：所述微 流控液滴芯片从上至下由第一盖片、第一PDMS盖片、第二PDMS 盖片、第三PDMS盖片、基片堆叠而成；
所述第二PDMS盖片上设有检测结构，所述检测结构包括油 相储液池、水相储液池、液滴池，油相储液池利用油液连接通道与 流体控制阀相连，水相储液池利用水相连接通道也与流体控制阀 相连，所述油液连接通道、水相连接通道相互连通后再与流体控制阀的一端相连，所述流体控制阀的另一端与液滴池相连，液滴池利 用气孔连接通道与气孔相连。
进一步的，所述油液连接通道为半圆型。
进一步的，所述油液连接通道的数量至少为1个。
进一步的，所述第一盖片上开设有通孔。
进一步的，所述第一PDMS盖片为含油PDMS盖片。
进一步的，所述检测结构的数量至少为3个，其中1个为检 测组，1个为阳性对照组，1个为阴性对照组。
进一步的，所述检测机构根据第二PDMS盖片的中点旋转对 称排列。
本发明还设计了一种快速检测血清Septin 9甲基化的方法，其特 征在于：包括如下步骤：
S1制作上述微流控液滴芯片；
S2样本准备及PCR反应试剂配置；
S4进行检测；
S5结果对比：PCR反应结束后，取出芯片直接置于显微镜下 观察结果。
进一步的，S1中制作微流控液滴芯片的步骤为：
S11制作硅片模具；
S12制作聚二甲基硅烷(polydimethylsiloxane)PDMS/玻璃杂合 芯片。
进一步的，S11所述制作硅片模具的具体方法为：采用AutoCAD 软件绘制芯片机构的图形，制作胶片掩模版；以四寸单晶硅片为衬 底，通过光刻，刻蚀出高度为30微米的油液连接通道，连接油相和 液相的通道形成液滴生成结构，液滴池和气孔连接通道等第一层结构；通过双层光刻，进一步刻蚀出高度为2mm深的油相储液池和 水相储液池，从而制作硅片模具。
进一步的，S12所述制作聚二甲基硅烷 (polydimethylsiloxane)PDMS/玻璃杂合芯片的具体方法为：
S121 PDMS预聚物和固化剂混合并搅拌均匀，置于真空干 燥箱中抽真空去除气泡后，将其浇注在硅片模具上，将其放入烘 箱加热后倒入一层含5％(w/w)石蜡油的PDMS，将两层PDMS加热过夜；
S122无色透明PMMA螺丝阀预先包埋于未固化的PDMS 中，螺丝阀底部与芯片流体控制微通道的垂直距离约0.2mm， PDMS加热固化后，采用螺丝刀将螺丝阀旋转取出，形成具有螺 纹的通道；
S123最后将固化好的PDMS层从硅片模具上剥离下来；使 用打孔机在PDMS的油相进样口、液相进样口及通气孔处打孔； 将玻璃盖片和固化PDMS放入等离子清洗机中清洗，玻璃盖片和 PDMS顶层实现不可逆的封接；
S124在玻璃基片上旋涂一层脱气处理后的PDMS，加热，再 将已封接玻璃盖片的PDMS与有PDMS涂层的玻璃基片放入等离 子清洗机中清洗，PDMS结构层与玻璃基片实现不可逆封接。
进一步的，S3中样本准与PCR反应试剂制备包括如下步骤：
S31游离的DNA提取；
S32亚硫酸盐进行转化；
S33 Septin 9基因甲基化检测的数字PCR探针和引物，数字 PCR扩增条件；
S34数字PCR反应体系。
进一步的，S33 Septin 9基因甲基化检测的数字PCR探针和引 物，数字PCR扩增条件，分为三个阶段，分别为：第一阶段：94℃ 20min 1个循环；第二阶段：62℃5S 55.5℃35S93℃30S 45个循 环；第三阶段：40℃5S；正向引物：5'-AATAATCCCATCCAACTA-3'； 方向引物：5'-TTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'，探针：5'- TAACCGCGAAATCCGAC-3'。
进一步的，S34数字PCR反应体系为：配置PCR反应液Mix，包 含正向引物和反向引物各1μl，2×数字PCR Supermix 10μl，探针0.5 μl，ddH2O 7.5μl。
本发明与现有技术相比，提高了液滴稳定性，保证了离心力 芯片中液滴在储存及加热过程中不发生融合，提高检测结果的稳 定性，同时在芯片上设置了阴性和阳性对照，保证了结果的可靠 性，而且本发明具有通用性和扩展性，增加反应快，模块可实现 高通量检测，同时调整扩增体系，则可应用与其他肿瘤基因突变、病原微生物核酸的绝对定量检测。
附图说明
图1为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片的爆炸结构图。
图2为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片中检测结构的结构示意图。
图3为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片中第二PDMS盖片的俯视图。
图4为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片在使用中液滴生成的示意图。
图5为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片在使用中生成的液滴的显微镜观察示意图。
图6为一具体实施例中一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片在使用中的检测结果对比示意图，其中A为阴性 对照图，B为检测结果图。
其中，1为第一盖片，2为第二PDMS盖片，3为第一PDMS 盖片，4为第三PDMS盖片，5为基片，21为检测结构，211为 油相储液池，212为水相储液池，213为液滴池，214为油液连接通道，215为流体控制阀，216为水相连接通道，217为气孔连接 通道，218为气孔，219为油液进样口，220为PCR反应液及样 本进样口。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的 限定。
参见图1，本发明设计了一种快速检测血清Septin 9甲基化的 微流控液滴芯片，包括盖片、基片，所述微流控液滴芯片从上至下 由第一盖片1、第一PDMS盖片3、第二PDMS盖片2、第三PDMS 盖片4、基片5堆叠而成；其中第一盖片1为带通孔的玻璃盖片， 第一PDMS盖片3为含油PDMS盖层，第二PDMS盖片2上设有 检测结构21，基片5则为玻璃基片。
参见图3,本实施例中采用了4个检测结构21，其中两个作为 检测组T1、T2，1个作为阴性对照组N，一个为阳性对照组P。
参见图2，检测结构21包括油相储液池211、水相储液池212、 液滴池213，油相储液池211具有一个油液进样口219，并利用油 液连接通道214与流体控制阀215相连，水相储液池212具有一 个PCR反应液及样本进样口220，水相储液池212利用水相连接 通道216也与流体控制阀215相连，所述油液连接通道214、水相 连接通道216相互连通后再与流体控制阀215的一端相连，所述 流体控制阀215的另一端与液滴池213相连，液滴池213利用气孔连接通道217与气孔218相连。
优选的，所述油液连接通道214选择使用Y型通道，Y型通道 的两个分叉段分别从左右两侧环绕在水相储液池212外侧，之后 与水相连接通道216连通，Y型通道上剩余的一端则与油相储液池 211的底端连通。
优选的，水相连接通道216选择使用带有四通连接器的直连 通道，所述四通连接器的的上端通口与直连通道相连，下端通口与 流体控制阀215相连，左侧通口与油液连接通道214的一个分叉 段相连，右侧通口与油液连接通道214的另一个分叉段相连，从而使得PCR反应液+样本与表面活性剂+油在此相聚形成T型液滴 后，进入液滴池213，具体参见图4。
优选的，所述第一PDMS盖片3为含油PDMS盖片。
在具体实施中，将油相与液相可通过进样孔加入到油相储液 池211和水相储液池212，微流控芯片绕离心轴O做离心运动， 液滴生成结构单元为T型结构，参见图5。
在具体实施中，按如下步骤进行：
S1制作硅片模具；
S2制作聚二甲基硅烷(polydimethylsiloxane)PDMS/玻璃杂合 芯片；
S3样本准备及PCR反应试剂配置；
S4进行检测；
S5结果对比：PCR反应结束后，取出芯片直接置于显微镜下 观察结果。
优选的，在S1中，采用AutoCAD软件绘制芯片机构的图 形，制作胶片掩模版；以四寸单晶硅片为衬底，通过光刻，刻蚀 出高度为30微米的油液连接通道214，连接油相和液相的通道形 成液滴生成结构，液滴池213和气孔连接通道217等第一层结 构。
通过双层光刻，进一步刻蚀出高度为2mm深的油相储液池 211和水相储液池212，从而制作硅片模具。
其中液滴池213的长×宽×高尺寸为10000μm×15000μm ×30μm，理论上可容纳直径为30μm的液滴15000个。
优选的，S2的芯片参见图1，包括顶层带孔口的玻璃盖片 (厚度0.2mm)，底层玻璃基片(厚度0.8mm)，含油PDMS 层，PDMS层和带芯片结构的PDMS层，具体制作步骤如下：
S21 PDMS预聚物和固化剂按重量比10：1混合并搅拌均 匀，置于真空干燥箱中抽真空去除气泡后，将其浇注在硅片模具 上，将其放入烘箱85℃加热20分钟后倒入一层含5％(w/w)石 蜡油的PDMS，将两层PDMS置85℃加热过夜。
其中，PDMS预聚物和固化剂按重量比10：1混合，加入5％ 石蜡油搅拌均匀，真空去除气泡。
S22无色透明PMMA螺丝阀(直径2mm,高5mm，螺距 0.5mm)预先包埋于未固化的PDMS中，螺丝阀底部与芯片流体 控制微通道的垂直距离约0.2mm，PDMS加热固化后，采用螺丝刀将螺丝阀旋转取出，形成具有螺纹的通道。
S23最后将固化好的PDMS层从硅片模具上剥离下来；使用 打孔机在PDMS的油相进样口、液相进样口及通气孔处打孔；将 玻璃盖片和固化PDMS放入等离子清洗机中清洗45s后，玻璃盖 片和PDMS顶层实现不可逆的封接。
S24在玻璃基片上旋涂一层脱气处理后的PDMS，置85℃加 热1小时，再将已封接玻璃盖片的PDMS与有PDMS涂层的玻璃 基片放入等离子清洗机中清洗45s，PDMS结构层与玻璃基片实现 不可逆封接。
现有数字PCR微流控芯片的液滴在温度变化时存在的缩小、 挥发、变形等现象导致反应不均一，甚至实验失败。
而上述的制作方法具有防蒸发的作用，将具有芯片结构的 PDMS层顶部与含油的PDMS层连接，再与带孔透明载玻片不可 逆封接，再将PDMS结构层与涂油PDMS层的玻璃基片不可逆封 接，从而在PDMS膜层及结构层表面形成不透气的透明结构层， 从而起到具有防蒸发性能的效果，解决了数字PCR芯片中的液滴 在温度变化过程中产生的蒸发问题。
优选的，S3中样本准与PCR反应试剂制备包括如下步骤：
S31游离的DNA提取；
S32亚硫酸盐进行转化；
S33 Septin 9基因甲基化检测的数字PCR探针和引物，数字 PCR扩增条件；
S34数字PCR反应体系。
其中，S31游离的提取方式为：在15ml离心管内依次加入 3.5ml血浆样本和3.5ml裂解吸附液，涡流混匀后把离心管在室 温(15-30℃)中放置10分钟，然后在离心管中加入90μl磁珠 和2.5ml无水乙醇，混匀，室温旋转(20rpm)45分钟，将离 心管放置于磁性试管架上吸附5分钟；小心倒掉上清，加入 1.5ml洗涤液，涡流混匀确保磁珠彻底重悬；一次性移液管将悬 浮磁珠移至标记的2.0ml的微量离心管，短暂离心，将离心管放 置于磁性试管架上吸附2分钟，吸除残余液体；加入50μl洗脱 液，混匀后恒温振荡孵育器中震荡10分钟；置磁力架上5分 钟，转移洗脱液至新离心管中。
其中，S32亚硫酸盐进行转化为：在含有50μl洗脱液的 离心管中加入70μl亚硫酸盐溶液和25μl保护液，混匀，加 入1000μl洗涤液和20μl混匀磁珠。微量离心管置于25℃的恒温振荡孵育器中，转速调为1000rpm，孵育45分钟，短暂离 心后，置磁力架上，移除上清液。洗液洗三次后加入50μl洗脱 液，重悬磁珠，混匀后恒温振荡孵育器中震荡10分钟；置磁力 架上2分钟，转移洗脱液至新离心管中。如果提取后的DNA不 立即使用，可将其置于2-8℃储存24小时；在-20℃可以储存72 小时。
其中，S33 Septin 9基因甲基化检测的数字PCR探针和引物， 数字PCR扩增条件，分为三个阶段，分别为：第一阶段：94℃ 20min 1个循环；第二阶段：62℃5S 55.5℃35S 93℃30S 45个 循环；第三阶段：40℃5S；正向引物：5'- AATAATCCCATCCAACTA-3'；方向引物：5'- TTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'，探针：5'-TAACCGCGAAATCCGAC-3 '。
其中，S34数字PCR反应体系为：配置PCR反应液Mix，包 含正向引物和反向引物各1μl，2×数字PCR Supermix 10μl，探 针0.5μl，ddH2O 7.5μl。
优选的，S4进行检测的方法为：将10μl油加入到油相储液 池211，然后分别将配置好的5μl PCR反应液与1μl模板DNA 混合通过液相进样口加入到液相储液池，将芯片固定在离心平 台，调整转速1500转/分钟，利用液滴生成结构开始产生液滴。
待液滴充满液滴池213，即可停止离心，然后在油相进样口 注入石蜡油，充满油相池，密封油相进样口，同样在对液相储液 池进行相同处理并密封。
拧紧阀门，并封堵气孔218，保证整个芯片的密封效果。
将芯片放入PCR仪进行反应。
反应结束后进入结果对比阶段，参见图6，A为阴性对照(图中点为红色)，B为大肠癌患者血清Septin 9甲基化的检测结 果(图中点为绿色，显示阳性)，结果与PCR荧光探针法一致。

Claims (7)

1.一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，包括盖片、基片，其特征在于：所述微流控液滴芯片从上至下由第一盖片(1)、第一PDMS盖片(3)、第二PDMS盖片(2)、第三PDMS盖片(4)、基片(5)堆叠而成；
所述第二PDMS盖片(2)上设有检测结构(21)，所述检测结构包括油相储液池(211)、水相储液池(212)、液滴池(213)，油相储液池(211)利用油液连接通道(214)与流体控制阀(215)相连，水相储液池(212)利用水相连接通道(216)也与流体控制阀(215)相连，所述油液连接通道(214)、水相连接通道(216)相互连通后再与流体控制阀(215)的一端相连，所述流体控制阀(215)的另一端与液滴池(213)相连，液滴池(213)利用气孔连接通道(217)与气孔(218)相连；
所述油相储液池(211)位于所述水相储液池(212)与离心轴O之间；
所述水相连接通道(216)使用带有四通连接器的直连通道，所述四通连接器的上端通口与直连通道相连，下端通口与流体控制阀(215)相连，左侧通口与油液连接通道(214)的一个分叉段相连，右侧通口与油液连接通道(214)的另一个分叉段相连；所述四通连接器的四个通口宽度一致；
所述油液连接通道(214)连接油相和液相形成液滴生成结构，所述液滴生成结构为T型。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述油液连接通道(214)为半圆型。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述油液连接通道(214)的数量至少为1个。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述第一盖片(1)上开设有通孔。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述第一PDMS盖片(3)为含油PDMS盖片。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述检测结构的数量至少为3个，其中1个为检测组，1个为阳性对照组，1个为阴性对照组。
7.根据权利要求6所述的一种快速检测血清Septin 9甲基化的微流控液滴芯片，其特征在于：所述检测结构根据第二PDMS盖片(2)的中点旋转对称排列。
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