JP6871160B2 - 核酸の発現、スプライス変異体、転座、コピー数、またはメチル化変化を識別及び定量化するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、キャリーオーバーを防止するヌクレアーゼ、ライゲーション、及びポリメラーゼ反応の組み合わせを用いた、核酸配列、発現、スプライス変異体、転座、コピー数、及び/またはメチル化変化を識別及び定量化するための方法に関する。
血液は酸素、栄養素、及び生理学的シグナルを体内の全ての細胞に運搬すると同時に、外の病原体に対する免疫及び防御も提供する。しかし、血液が栄養を拡散するという同じ能力により、病気の伝播もまた可能となり、病気としては肝臓に転移する癌細胞、毛管を破壊するエボラウイルス、筋肉組織を溶かすストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、または、感染症の除去を目的とするCD4陽性細胞内での検出を回避するHIVがある。
癌における現在の分子診断の努力の大多数は、(i)予想及び予言的ゲノム解析、例えばBrCA1、BrCA2等の癌疾病素因遺伝子における遺伝的な変異の識別(Ford et al.Am J Hum Genet 62:676−689(1998)(非特許文献7))、(ii)個別化した治療、例えば個別症状に応じた薬を案内するEGFR遺伝子における変異(Sequist and Lynch,Ann Rev Med,59:429−442(2008)(非特許文献8)、及び(iii)再発の監視、例えば薬剤治療への耐性が進行する患者において現れるKRAS変異の検出(Hiley et al.,Genome Biol 15:453(2014)(非特許文献9); Amado et al.,J Clin Oncol 26:1626−1634(2008)(非特許文献10))に集中している。しかし、この方法は、連続した癌分子診断における主要な機会:(i)家族歴を持つ患者の、より頻繁なスクリーニング、(ii)初期の病気を検出するためのスクリーニング、及び(iii)治療効果の監視を逃している。これら3つの満たされていないニーズに対処するために、ウイルス量に類似した、「癌マーカー量」と称される血液ベースの検出のための新規の測定法が、本明細書で提示される。
非常に希少な、または量の少ない変異配列を発見することを目的とする診断試験は、(i)野生型標的の複製におけるポリメラーゼエラー、(ii)DNA塩基配列決定のエラー、(iii)野生型標的でのミスライゲーション、(iii)標的に依存しないPCR産物、及び、(iv)以前の陽性サンプルから生じる、PCR産物のキャリーオーバー汚染から生じる潜在的な偽陽性シグナルに直面する。癌をスクリーニングする時の、陽性試験結果の重要な臨床的意義は、かかる試験では、事実上偽陽性を排除することが可能なあらゆる手段を用いることを必要とされる。
多数のPCR分析/マイクロデバイスが、病原体、並びに疾患に関係する転座及び変異の迅速な検出のために設計されている。それぞれのアッセイ/ハードウェアの組み合わせは特定の強みを有するが、癌の検出のために必要な多次元的かつ多重化されたマーカーの現実的な問題と組み合わせた際に、マイクロ流体を用いるPCR−LDRの柔軟性は、ある種の利点をもたらす。
[本発明1001]
サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内の前記ヌクレオチド配列とは異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階;
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階;
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’プライマー特異的部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中で前記二次伸長生成物を検出及び区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1002]
サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階;
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階;
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分をその相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階;
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階;並びに
前記検出する段階に基づき、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1003]
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前、またはそれと同時に、前記サンプルを少なくとも第1のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階
を更に含み、
前記第1のメチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中で核酸分子を切断し、これにより、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の検出を含み、前記核酸分子が元々1つ以上のメチル化残基を含有している、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下において、前記制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供す段階
を更に含み、
前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化され切断されていない制限酵素切断部位を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された前記伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する1つ以上の第2のメチル化感受性酵素を提供する段階;及び
前記少なくとも1つの第2のメチル化感受性酵素を、前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第2の制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記第2のメチル化感受性酵素が、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中に潜在的に存在する核酸分子を切断する、前記段階
を更に含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’OH末端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する5’部分
を含むが、前記亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする1つ以上のヌクレオチド配列を有する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記DNAポリメラーゼが、5’ヌクレアーゼ活性、3’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、本発明1008の方法。
[本発明1010]
非メチル化残基を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイゼーション可能な1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する段階;及び
前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記供す段階の前に前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、亜硫酸水素塩で処理した相補的な標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を妨害する、前記接触させる段階
を更に含む、本発明1004の方法。
[本発明1011]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’OH末端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1012]
前記切断可能なヌクレオチドが、1つ以上のRNA塩基を含む、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする野生型核酸分子内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する5’部分
を含むが、前記標的核酸分子内の対応するヌクレオチド配列部分に対してミスマッチする1つ以上のヌクレオチド配列を有する、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記1つ以上の配列ミスマッチが、前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーの5’末端から2つのヌクレオチド塩基、及び/または前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記5’末端から3つのヌクレオチド塩基に位置する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記DNAポリメラーゼが、5’ヌクレアーゼ活性、3’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、本発明1013の方法。
[本発明1016]
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:、
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記1つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階;
前記接触したサンプル、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階;
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸(cDNA)分子を生成する段階であって、各cDNA分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつdUを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)前記cDNAの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するcDNAヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記cDNA分子を含有する前記逆転写混合物、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより1種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
(a)5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的配列特異的部分及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1017]
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる1つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記1つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階;
前記接触したサンプル、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階;
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸(cDNA)分子を生成する段階であって、各cDNA分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつdUを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)前記cDNAの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するcDNAヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記cDNA分子を含有する前記逆転写混合物、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより1種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
(a)5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記形成する段階;
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分をその相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階;
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階;並びに
前記検出する段階に基づいて、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中で、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる1つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1018]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸(miRNA)分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が潜在的に異なる1つ以上の標的miRNA分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)5’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的miRNA分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
(b)前記標的miRNA分子配列の5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列部分、及び5’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプライマー、
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
(d)前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第4のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記1つ以上の第1のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的miRNA分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素が、前記ハイブリダイゼーションした第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記3’末端を伸長して、前記標的miRNA分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階;
プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的miRNA分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記5’プライマー特異的部分、前記標的miRNA分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第2、第3、及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーと混和し、ポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階;
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的miRNA分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的miRNA分子を識別する段階。
[本発明1019]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸(miRNA)分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が潜在的に異なる1つ以上の標的miRNA分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)5’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的miRNA分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
(b)前記標的miRNA分子配列の5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列部分、及び5’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプライマー、
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
(d)前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第4のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記1つ以上の第1のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的miRNA分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素は前記ハイブリダイゼーションした第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記3’末端を伸長して、前記標的miRNA分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階;
プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的miRNA分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記5’プライマー特異的部分、前記標的miRNA分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第2、第3、及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階;
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的miRNA分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分を、その相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階;
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階;並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的miRNA分子の存在を識別する段階。
[本発明1020]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸(miRNA)分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
他のmiRNA分子とは配列の1つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる1つ以上のmiRNA分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに5’リン酸基、5’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的miRNA分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階;
前記標的miRNA分子配列を、その3’末端にて、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的miRNA分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)前記標的miRNA分子配列の前記5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列、及び5’プライマー特異的部分を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
(b)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記キメラ核酸分子、前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その3’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階;
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第1及び第3のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的miRNA分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’プライマー特異的部分及び3’標的配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的miRNA分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記ライゲーション産物配列及び前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼと混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的miRNA分子を識別する段階。
[本発明1021]
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的マイクロリボ核酸(miRNA)分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
他のmiRNA分子とは配列の1つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる1つ以上のmiRNA分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するdU含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに5’リン酸基、5’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的miRNA分子配列の3’部分に相補的な3’ヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階;
前記標的miRNA分子配列を、その3’末端にて、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的miRNA分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階;
1つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
(a)前記標的miRNA分子配列の前記5’末端の相補鎖に相補的な3’ヌクレオチド配列、及び5’プライマー特異的部分を含む第1のオリゴヌクレオチドプライマー、
(b)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーの前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記キメラ核酸分子、前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマー、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記1つ以上の第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その3’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階;
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第1及び第3のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的miRNA分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的miRNA分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分を、その相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階;
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階;並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のmiRNA分子とは1つ以上の塩基配列が異なる1つ以上の標的miRNA分子の存在を識別する段階。
[本発明1022]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分を更に含むことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記unitaq検出部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
以下の段階:
1つ以上のunitaq検出プローブを提供する段階であって、各unitaq検出プローブが相補性unitaq検出部分にハイブリダイゼーションし、かつ前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階;
前記1つ以上のunitaq検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階;及び
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記1つ以上のunitaq検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上の相補性unitaq検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理間に前記1つ以上のunitaq検出プローブから切断され、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1001、1016、1018、または1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、ライゲーション産物の接合部部分またはその相補鎖にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階;
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階;並びに
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上で相補性検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理の間に前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1001、1016、1018、または1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記ライゲーションの前または後に、固体支持体上で各一次伸長生成物の少なくとも1つの鎖を固定化する段階であって、前記ライゲーション産物配列が前記固定化した一次伸長生成物にハイブリダイゼーションする、前記固定化する段階;並びに
前記ライゲーションの後で、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブ及び非標的特異的ライゲーション産物を前記サンプルから取り除く段階;並びに
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記固定化した一次伸長生成物から前記ライゲーション産物配列を変性させる段階
を更に含む、本発明1002、1017、1019、または1021のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分が、前記3’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含み、
以下の段階:
前記プローブが、前記一次伸長生成物の相補性標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする際に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記ライゲーションの前に前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの3’OHを遊離させる段階
を更に含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、その5’末端に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’末端とオーバーラップする同一のヌクレオチドを有し、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置における、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによる接合部の形成の際に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部にてフラップを形成し、
以下の段階:
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドを、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’末端におけるリン酸基を遊離させる段階
を更に含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブを更に含み、プローブセットの前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し、これらの間の接合部とハイブリダイゼーションするように構成されており、前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブの間でのライゲーションにより、プローブセットの前記第1、第2、及び第3のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成することを可能にする、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプルにおいて、前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプルを、前記サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させる段階;
前記サンプルを1種以上のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記1つ以上の前記メチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中の核酸分子を切断する、前記形成する段階;
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記1つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記1つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階;
前記制限酵素反応混合物を、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼと混和して一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、前記一次伸長生成物にハイブリダイゼーション可能な第1及び第2のnestedオリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記提供する段階;
前記一次伸長生成物、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別して、前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは1つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
[本発明1029]
1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、前記一次伸長生成物またはその相補鎖内の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階;
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階;並びに
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記供している間に、前記一次伸長生成物の相補部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び検出可能な標識が、前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記伸長処理の間に、前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
以下の段階:
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの遊離3’OH端を遊離させる段階
を更に含む、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記一次オリゴヌクレオチドプライマーが、長さが約6〜20塩基の、同一または実質的に同一な5’ヌクレオチド配列部分を含む、本発明1028の方法。
[本発明1032]
前記サンプルが、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞血中循環核酸、無細胞血中循環腫瘍核酸、妊娠した女性の無細胞血中循環胎児核酸、血中循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検、及びエクソソームからなる群から選択される、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列は、ゲノムレベル及び/またはメチル化ヌクレオチド塩基での、1つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、miRNA変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を含む少量の核酸分子である、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
1つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び/またはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、miRNA変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有する前記少量の核酸分子を、前記少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、前記1つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び/もしくはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、miRNA変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有しない、前記サンプル中の多量の核酸分子から識別して区別する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
1つ以上の少量の標的ヌクレオチド配列のコピー数を、前記サンプル中の前記多量の核酸分子のコピー数と比較して定量化する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1037]
同一の後の工程を受ける、前記サンプルまたは他のサンプル中の他のヌクレオチド配列と比較して、前記1つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、本発明1036の方法。
[本発明1038]
1つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対的なコピー数を定量化または計算する、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記識別する段階に基づいて、病状を診断または予測する段階
を更に含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記識別する段階に基づいて、遺伝子型または病気の素因を区別する段階
を更に含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1041]
マイクロタイタープレートと組み合わせて使用し、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった2つ以上のウェルに液体を同時に加えるためのデバイスであって、前記マイクロタイタープレートが、対向した上部表面及び底部表面を有し、前記上部表面が前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面が前記ウェルの閉鎖端を画定し、
前記デバイスが、
第1及び第2の境界により画定される第1層であって、計量チャンバが前記第1層の前記第1及び第2の境界の間に延在して互いに流体連通し、前記第1層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第1層の前記第1の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も近く、前記計量チャンバのそれぞれは、マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第1層は、1つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第1層、並びに
第1及び第2の境界により画定される第2層であって、充填ポートが前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第2層は作動可能な位置で、前記第1層に隣接して適合するように構成され、前記第2層の前記第1の境界は前記第1層の前記第2の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第2層
を含み、前記第1層、前記第2層、及び前記マイクロタイタープレートが、互いに作動可能な位置で配置される場合、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった2つ以上のウェルに入る、前記デバイス。
[本発明1042]
前記第2層が、
前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在する通気道であって、前記計量チャンバと連動している、前記通気道
を含む、本発明1041のデバイス。
[本発明1043]
第1及び第2の境界により画定される中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記中間層は、前記マイクロタイタープレートと前記第1層の間の作動可能な位置で適合するように構成され、前記中間層の前記第1の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第2の境界は前記第1の層の前記第1の境界に隣接し、前記中間層流路の1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートのウェルに入る、本発明1041のデバイス。
[本発明1044]
前記中間層流路が疎水性壁を含む、本発明1043のデバイス。
[本発明1045]
前記中間層流路がバーストバルブ(burst valve)である、本発明1043のデバイス。
[本発明1046]
前記第1層が、前記充填チャンバと流体連通しているオーバーフローチャンバを更に含む、本発明1041のデバイス。
[本発明1047]
前記中間層が、前記オーバーフローチャンバを前記充填チャンバと接続するオーバーフロー流路を更に含む、本発明1046のデバイス。
[本発明1048]
前記第2層が、
前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在するオーバーフロー通気道であって、前記オーバーフローチャンバと連動している、前記オーバーフロー通気道
を有する、本発明1046のデバイス。
[本発明1049]
第1及び第2の境界を有する第3層であって、充填ポートコネクタが前記第3層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第3層は、前記第1及び第2層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第3層の前記第1の境界は前記第1層の前記第2の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動している、前記第3層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記第3層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で互いに配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、本発明1043のデバイス。
[本発明1050]
毛管現象により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、本発明1041のデバイス。
[本発明1051]
機械的な力により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、本発明1041のデバイス。
[本発明1052]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの1つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、本発明1041のデバイス。
[本発明1053]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの1つが、前記一対の充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、本発明1041のデバイス。
[本発明1054]
前記マイクロタイタープレートの2つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、本発明1041のデバイス。
[本発明1055]
前記第1層が、
2つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第1領域、並びに、
2つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第2領域であって、前記第1及び第2領域が互いに離間している、前記第2領域
を有する、本発明1041のデバイス。
[本発明1056]
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、本発明1041〜1055のいずれかのデバイス。
[本発明1057]
対向した上部表面及び底部表面を有するマイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった2つ以上のウェルであって、前記上部表面は前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面は前記ウェルの閉鎖端を画定する、前記ウェル
に液体を加える方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
第1及び第2の境界を有する第1層であって、計量チャンバが前記第1層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、互いに流体連通しており、前記第1層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第1層の前記第1の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も隣接し、前記計量チャンバの1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第1層は、1つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第1層
第1及び第2の境界を有する第2層であって、充填ポートが前記第2層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第2層は作動可能な位置で、前記第1層に隣接して適合するように構成され、前記第2層の前記第1の境界は、前記第1層の前記第2の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第2層
を含むデバイスを提供する段階であって、
前記第1層、前記第2層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった2つ以上のウェルに入る、前記段階;
前記デバイスを液体で満たす段階;並びに
前記デバイス内の液体を、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった2つ以上のウェルへ放出する段階。
[本発明1058]
前記デバイスが、
第1及び第2の境界を有する中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記中間層は、作動可能な位置で前記マイクロタイタープレートと前記第1層の間に適合するように構成され、前記中間層の前記第1の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第2の境界は前記第1の層の前記第1の境界に隣接し、前記中間層流路の1つは、前記マイクロタイタープレートの横及び/または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートに入る、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記中間層流路が疎水性壁を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記中間層流路がバーストバルブ(burst valve)である、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記デバイスが、
第1及び第2の境界を有する第3層であって、充填ポートコネクタが前記第3層の前記第1及び第2の境界の間に延在し、前記第3層は、前記第1及び第2層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第3層の前記第1の境界は前記第2層の前記第2の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動する、前記第3層
を更に含み、
前記第1層、前記第2層、前記第3層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置され、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、本発明1058の方法。
[本発明1062]
前記満たす段階が毛管現象により行われる、本発明1057の方法。
[本発明1063]
前記放出する段階が機械的な力により行われる、本発明1057の方法。
[本発明1064]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対側に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの1つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、本発明1057の方法。
[本発明1065]
前記第1層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第2層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、本発明1057の方法。
[本発明1066]
前記デバイスが、前記満たす段階の間に、前記マイクロタイタープレートの2つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、本発明1057の方法。
[本発明1067]
前記第1層が、
2つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第1領域、並びに、
2つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第2領域であって、前記第1及び第2領域が互いに離間している、前記第2領域
を有する、本発明1057の方法。
[本発明1068]
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、本発明1057〜1067のいずれかの方法。
最も費用対効果の高い病気の早期発見試験では、最初の多重結合増幅とライゲーションアッセイを組み合わせて「病気の量」を測定してもよい。癌の検出に関して、この試験は、全ての癌(総合腫瘍学)に関して、>97%の特異性で>95%の感度を達成する。癌腫瘍量のアッセイのフローチャートを図1に示す。突然変異、メチル化、miRNA、mRNA、選択的スプライシング、及び転座をスコアリングする、最初のマルチプレックスPCR/LDRスクリーニングアッセイは、24〜48種類のマーカーのうち>5が陽性であるサンプルを識別する。次に、追加の組織特異的マーカーによる「ピクセル」PCR/LDRを使用して推定上の陽性サンプルをアッセイし、最初の結果を確認して元の組織を識別する。次に医師は、標的化された配列決定を命じ、患者の治療決定を更に手引きしてもよい。
所望の疾病特異的な核酸の相違から生成した正しいシグナルと、サンプル中に存在する通常の核酸から生成した間違ったシグナルと、疾病特異的な核酸の相違の不在下で生成した間違ったシグナル(即ち、体細胞突然変異)とを識別する技術的課題が存在する。
本発明の第1の態様は、サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が該サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を潜在的に含有するサンプルを提供すること、並びに、該サンプルを、サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素と接触させることを含む。1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、(a)標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、(b)第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼと混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和しライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、(a)標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び(b)標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここでプローブセットの第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物に相補的な標的ヌクレオチド配列上で、間に接合部を有して互いに隣接するようにハイブリダイゼーションするように構成される。1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、そしてまたサンプル中のライゲーション産物配列を検出し識別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基がサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する。
アプローチの概要:本アプローチは、3つの酵素:(i)開始時のサンプル中において少量のDNAコピーを正確にコピーするためのTaqポリメラーゼ、(ii)上流LDRプライマーのブロック基を取り除くRNase H2酵素、及び(iii)上流プライマーの3’側のミスマッチとマッチを識別するリガーゼの忠実性に依存する。後者は、3’末端から2番目または3番目における意図的なミスマッチまたはヌクレオチド類似体を用いることにより、更に濃縮される(3’末端で完全にマッチする場合、3’末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化させるが、3’末端でミスマッチする場合、3’末端のハイブリダイゼーションを著しく不安定化させる)。最終的に、サイクル時間及び条件の変更といった速度論的アプローチにより、野生型と変異鋳型の識別力を高めることができる。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムPCR増幅工程で増幅されるため、この工程は重要な識別工程である。
1. 任意の標的非依存性プライマー二量体が形成された場合、誤った生成物がヘアピンを形成して更なる増幅を阻害するように、ユニバーサル尾部を有するPCRプライマーを使用する。
2. 最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
3. 標的にハイブリダイゼーションした場合のみ、上流LDRプローブの非ブロック3’OHを遊離させるために、RNaseH2のヌクレアーゼ活性を使用する。
4. 上流LDRプローブで、熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
5. 上流プローブの3’末端から2番目または3番目の塩基において、ミスマッチまたはヌクレオチド類似体を使用する。
6. リアルタイムPCR読出し用のLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
7. リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
1.1.a. 任意の標的非依存性プライマー二量体が形成された場合、誤った生成物がヘアピンを形成して更なる増幅を阻害するように、UNG(キャリーオーバーを防止するため、37℃、15〜30分)、dUTP、及び他のdNTP、AmpliTaq Gold、並びにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーの存在下でゲノムDNAをインキュベーションする。この最初のゲノムDNA−PCR反応混合物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェルでのマルチプレックスPCR増幅(空間的多重化)、または単一のウェルでのマルチプレックスPCR増幅に好適である。血漿由来のゲノムDNAを変性させ、UNGを不活性化させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクルで、変異を含有する断片をマルチプレックスPCR増幅させる(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で12〜20サイクル)。PCRプライマーは、約64〜66℃のTm値を有するように設計され、ユニプレックス(uniplex)PCRの基準の10〜50倍未満の濃度(各プライマーが10nM〜50nM)で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。サイクルは、互いに均衡を保ってPCR産物のバランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約100,000〜1,000,000倍に増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniAi − 上流標的−変異−下流標的 − UniCi’
の形態である。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流標的−変異−下流標的 − UniTaq Bi’ − UniTaq Ci’
を形成する。
アプローチv1の概観:単離ゲノムDNA、またはメチルが増加したDNAを、認識要素がC及びG塩基のみ、または大部分にC及びG塩基を含むものであるメチル感受性酵素(例えば、Bsh1236I=CG^CG;HinP1I=G^CGC;AciI=C^CGCまたはG^CGG;及びHpy99I=CGWCG^)のカクテルで処理する。慎重に選択したPCRプライマーは、約100〜130bpの非切断DNA断片を増幅する。断片は、切断がこれらの断片の離散を引き起こすように、少なくとも2〜3個のメチル感受性酵素部位を有しなければならない。これらの部位は、キャリーオーバー防止が2つのレベルで作用するように選択される:(i)これらの部位が、組み込まれたdUTPを含有するDNAでもなお切断可能であるため、UNGをキャリーオーバー防止に用いることが可能であり、及び、(ii)増幅後、生成物が、別の反応にキャリーオーバーするのであれば、速やか再切断されるようにこれらの部位が非メチル化される。最初のPCR増幅の後で、キャリーオーバーから保護したLDR及びUniTaq反応を、上述のとおり実施する。あるいは、LDR及びTaqMan(商標)、または直線的TaqMan(商標)反応を実施して、最初のサンプル中でのメチル化DNAの相対量を識別し、定量化してもよい。
1.メチル化していない場合に標的を切断する、メチル化感受性制限酵素を使用する。
2.任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するような、ユニバーサル尾部を有するPCRプライマーを使用する。
3.最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNG及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
4.上流LDRプローブで、熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
5.リアルタイムPCR読出しのためのLDR産物の増幅に、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
6.リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
2.1.a. Bsh1236I(CG^CG)及びHinP1I(G^CGC)、並びにUNGの存在下にて(37℃、30〜60分)、ゲノムDNA、cfDNA、またはメチルが増加したDNAをインキュベーションし、非メチル化DNAを完全に分解してキャリーオーバーを防止する。マルチプレックスPCR増幅を最適化するための緩衝液補助成分、dUTP、及び他のdNTP、AmpliTaq Gold、並びに任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するようにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーを加える。この最初のゲノムDNA−PCR反応混合物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェルでのマルチプレックスPCR増幅(空間的多重化)、または単一のウェルでのマルチプレックスPCR増幅に好適である。分解したゲノムDNAを変性させ、UNG及び制限エンドヌクレアーゼ不活性化させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクル(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で16〜20サイクル)で、断片を含有する変異をマルチプレックスPCR増幅する。PCRプライマーは、約64〜66℃のTm値を有するように設計され、ユニプレックスPCRの基準の10〜50倍未満の濃度(各プライマーが10nM〜50nM)で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。サイクルは、互いにPCR産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約100,000〜1,000,000倍に増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniAi − 上流標的−メチル化領域 − 下流標的−UniCi’
の形態である。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流標的−メチル化領域−下流標的 − UniTaq Bi’ − UniTaq Ci’
を形成する。
1. 二本鎖標的DNAに独自の5’リン酸基を生成するために、メチル化非感受性制限酵素を使用する。
2. メチル化されていない場合に二本鎖標的を切断するために、メチル化感受性制限酵素を使用する。
3. 最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNG及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
4. 正しいタグを標的鎖にライゲーションするために、熱安定性リガーゼのライゲーション忠実性を使用する。
5. ライゲーションした標的鎖を増幅するために、遺伝子座特異的プライマー及びポリメラーゼを使用する。
6. 標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、PCRプライマー上のアンブロックした3’OHを遊離させるために、RNaseH2のヌクレアーゼ活性を使用する。
7. タグと標的鎖がライゲーションされていない場合に、ヘアピンを形成してこれら自身を伸長し増幅しない生成物を形成するために、タグオリゴヌクレオチドの3’末端上の配列を使用する。
8. リアルタイムPCR読出しのためにPCRまたはLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
2.2.a. 制限酵素、人工ヘアピン鋳型(以下を参照)、及び熱安定性リガーゼを含有する混合物を調製する。メチル感受性酵素(例えばHinP1I、Bsh1236I、AciI、Hpy99I、及びHpyCH4IV)のカクテルを用いて、並びに、メチル非感受性酵素(HaeIII及びMspI)により、単離ゲノムDNA、またはメチルが増加したDNAを切断する。HaeIIIまたはMspI部位からの5’リン酸基、及び、少なくとも3個のメチル感受性部位(これらはメチル化されているため、切断されない)を有する、およそ40塩基以上の断片を生成する。プロモーター1つあたりで、かかる断片を3個生成するのが好ましい。エンドヌクレアーゼを加熱して失活させ(65℃で15分間)、DNAを変性させる(94℃で1分間)。人工鋳型は、上流プライマー領域(任意の5’ユニバーサルプライマーU1Pm、続いてUniTaq Ai)及びUniTaq Aiに相補的な領域、並びに、約72℃のTmを有する標的DNAに相補的な領域、並びに、少なくとも1つのメチル感受性制限酵素切断部位とのオーバーラップを含有する。60℃でインキュベーションし、断片がメチル化され、正しい鋳型にハイブリダイゼーションした場合、かつその場合に限り、ヘアピンオリゴヌクレオチドが、標的DNAの5’リン酸基へハイブリダイゼーション及びライゲーションすることを可能にする。この最初のゲノムDNA−ライゲーション産物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェルでのマルチプレックスPCR増幅(空間的多重化)、または単一のウェルでのマルチプレックスPCR増幅に好適である。
ユニバーサルプライマーU1Pm−UniTaq Ai − メチル化領域 − UniTaq Bi’ − ユニバーサルプライマーU2’
の生成物、または、単に配列:
UniTaq Ai − メチル化領域 − UniTaq Ci’
を増幅する。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − メチル化領域 − UniTaq Bi’ − ユニバーサルプライマーU2’
を形成する。
1. メチル化していない場合に標的を切断するために、メチル化感受性制限酵素を使用する。
2. 標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、PCRプライマー上の非ブロック3’OHを遊離させるために、RNaseH2のヌクレアーゼ活性を使用する。
3. 最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNG及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
4. 上流LDRプローブで、熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
5. リアルタイムPCR読出しのためにLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
6. リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
2.3.a. Bsh1236I(CG^CG)及びUNGの存在下でゲノムDNA、またはメチルが増加したDNAをインキュベーションし(37℃、30〜60分)、非メチル化DNAを完全に分解してキャリーオーバーを防止する。亜硫酸水素塩で処理して鎖を非相補性にし、市販されているキット(例えばZymo ResearchまたはQiagen製のもの)を使用してDNA鎖を精製する。マルチプレックスPCR増幅を最適化するための緩衝液補助成分、dUTP、並びに他のdNTP、AmpliTaq Gold、RNaseH2、BstU1(CG^CG)、並びに所望の3’末端の後のRNA塩基、4つの追加の塩基、及び誤った標的での伸長を防止するためのブロック基を含有する遺伝子特異的プライマーを加える。この最初のゲノムDNA−PCR反応混合物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェルでのマルチプレックスPCR増幅(空間的多重化)、または単一のウェルでのマルチプレックスPCR増幅に好適である。BstU1は、以前の増幅でのあらゆるキャリーオーバーDNAを切断する。分解したゲノムDNA及び制限エンドヌクレアーゼを変性させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクル(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で16〜20サイクル)で、断片を含有する変異をマルチプレックスPCR増幅する。PCRプライマーは約60℃のTm値を有するように設計されるが、5個の過剰の塩基を用いるとTm値は65〜68℃に近づき、ユニプレックスPCRの基準の10〜50倍未満の濃度(各プライマーが10nM〜50nM)で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。更に、ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して非メチル化DNAの増幅を制限する。サイクルは、互いにPCR産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約100,000〜1,000,000倍に増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniAi − 上流標的−亜硫酸水素塩により変換したメチル化領域−下流標的 − UniCi’
の形態である。
アプローチの概要:本アプローチは、(i)最初のサンプル中において異常なRNA転写産物の少量のコピーを正確にコピーするための逆転写酵素、(ii)cDNAを比例的に増幅するためのTaqポリメラーゼ、及び(iii)互いに隣接してハイブリダイゼーションしたプライマーを識別する熱安定性リガーゼ、の3つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムPCR増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
1. 任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、ユニバーサル尾部を有するPCRプライマーを使用する。
2. 最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
3. 上流LDRプローブで、熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
4. リアルタイムPCR読出しのためにLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
5. リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
3.1.a. 単離mRNA(あるいは全ての単離核酸)を、UNG(37℃、15〜30分、キャリーオーバーを防止するために)、dUTP、及び他のdNTP、MMLV逆転写酵素、AmpliTaq Gold、並びに転写物特異的プライマーの存在下において、インキュベーションする。(MMLV逆転写酵素は、全ての投入RNAから、50〜60℃にてcDNAを合成するものを設計してもよい(Invitrogen Superscript III)。あるいは、逆転写活性を向上させるためのTthまたはTma DNAポリメラーゼが設計されてきた(Mn補助因子の追加が必要となる場合がある)。最後に、好熱性PyroPhage 3173 DNAポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有しており、これもまた用いてもよい。この最初のcDNA−PCR反応混合物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェル(空間的多重化)、または単一のウェルでの多重逆転写転写物PCR増幅に好適である。同種のRNA転写物上でのリバースプライマーの伸長によりcDNAを生成した後、UNG及びMMLV逆転写酵素を不活性化させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクル(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で16〜20サイクル)で、転写物含有断片をマルチプレックスPCR増幅する。PCRプライマーは、約64〜66℃のTm値を有するように設計され、ユニプレックスPCRの基準の10〜50倍未満の濃度(各プライマーが10nM〜50nM)で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションように設計される。サイクルは、互いにPCR産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約100,000〜1,000,000倍に増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniTaq Ai − 上流エクソン−下流エクソン接合部 − UniTaq Ci’
の形態である。
UniTaq Ai − 上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン − UniTaq Ci’
を形成する。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流エクソン−下流エクソン接合部 − UniTaq Bi’ −UniTaq Ci’
を形成する。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン−UniTaq Bi’ − UniTaq Ci’
を形成する。
アプローチの概要:精製サンプル中にはほんのわずかのCTCしか存在しないため、空間的多重化を使用して、サンプル中の各染色体コピーの数を正確に数えることが重要である。本アプローチは、(i)最初のサンプル中においてDNA領域の少量のコピーを正確にコピーするためのTaqポリメラーゼ、及び(ii)互いに隣接してハイブリダイゼーションするプライマーを識別するリガーゼ、の2つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムPCR増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
1. 任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、ユニバーサル尾部を有するPCRプライマーを使用する。
2. 最初のPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
3. 上流LDRプローブで、熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
4. リアルタイムPCR読出しのためにLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
5. リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
4.1.a. 任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、UNG(キャリーオーバーを防止するため、37℃、15〜30分)、dUTP、及び他のdNTP、AmpliTaq Gold、並びにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーの存在下でゲノムDNAをインキュベーションする。この最初のゲノムDNA−PCR反応混合物は、マルチプレックスPCR増幅のために12,24、48、または96個の個別のウェル(空間的多重化)に分配される。血漿からゲノムDNAを変性させ、UNGを不活性化させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクル(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で12〜20サイクル)で、染色体領域をマルチプレックスPCR増幅する。PCRプライマーは、約64〜66℃のTm値を有し、ユニプレックスPCRの基準の10〜50倍未満の濃度(各プライマーが10nM〜50nM)で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションするように設計する。サイクルは、互いに均衡を保ってPCR産物のバランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約100,000〜1,000,000倍に増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniAi − 染色体標的領域 −UniCi’
の形態である。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 染色体標的部位 − UniTaq Bi’ −UniTaq Ci’
を形成する。
アプローチの概要:本アプローチは、(i)最初のサンプル中においてmiRNAの少量のコピーを正確にコピーするための逆転写酵素及びTaqポリメラーゼ、並びに(ii)互いに隣接してハイブリダイゼーションしたプローブを識別するためのリガーゼ、の2つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムPCR増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
1. 最初の逆転写及びPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
2. 上流LDRプローブ上で熱安定性リガーゼの3’ライゲーション忠実性を使用する。
3. リアルタイムPCR読出しのためにLDR産物を増幅するために、UniTaqまたはタグプライマーを使用する。
4. リアルタイムPCR反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、UNGを使用する。
5.1.a. UNG(37℃、15〜30分、キャリーオーバーを防止するために)、dUTP、及び他のdNTP、MMLV逆転写酵素、AmpliTaq Gold、並びに転写物特異的プライマーの存在下にて単離miRNA(あるいは全ての単離核酸)をインキュベーションする。この最初のcDNA−PCR反応混合物は、12、24、48、もしくは96個の個別のウェル(空間的多重化)、または単一のウェルでの多重逆転写物PCR増幅に好適である。同種のmiRNA上でのヘアピンリバースプライマーの伸長によりcDNAを生成した後、UNG及びMMLV逆転写酵素を不活性化させ、AmpliTaq Goldを活性化させ(94℃、5〜10分)、回数を制限したサイクル(94℃・10秒、60℃・30秒、72℃・30秒で16〜20サイクル)で、ブリッジ及びタグプライマーTi、及びTjを使用して、転写物含有断片をマルチプレックスPCR増幅する。PCR増幅の後、(99℃で30分間インキュベーションすることにより)Taqポリメラーゼを不活性化させる。
UniAi − 上流miRNA − 下流miRNA接合部 −UniCi’
の形態である。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流miRNA − 下流miRNA接合部 UniTaq Bi’ − UniTaq Ci’
を形成する。
F1−UniTaq Bi − Q−UniTaq Ai − 上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン−UniTaq Bi’ − UniTaq Ci’
を形成する。
実証用実施例1〜4についての一般的な方法
使用した細胞株は、V600E(1799T>A)BRAFヘテロ接合変異を有するHT−29結腸腺癌細胞株;R248Q(743G>A)TP53及びG12D(35G>A)KRASヘテロ接合変異を有するHEC−1(A)子宮内膜腺癌細胞株;G12S(34G>A)KRASヘテロ接合変異を有するLS123結腸腺癌細胞株;G12C(34G>T)KRASホモ接合変異を有するSW1463結腸腺癌細胞株;G12V(35G>T)KRASホモ接合変異を有するSW480結腸腺癌細胞株;並びにG12A(35G>C)KRASヘテロ接合変異を有するSW1116結腸腺癌細胞株であった。全ての細胞株を、10%ウシ胎児血清を補充し、4.5g/Lグルコースを含有するマッコイ5A内の60cm2培養皿に播種し、5% CO2を含有する加湿雰囲気に維持した。細胞が80〜90%コンフルエンスに達したら、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し(x3)、遠心分離(500xg)により収集した。DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen;Valencia,CA)を使用してDNAを単離した。Quant−iT Picogreen Assay Life Technologies/ThermoFisher;Waltham,Ma)により、DNAの濃度を測定した。ヒトの血液(軟膜)から単離した高分子量(>50kb)のゲノムDNA(Roche hgDNA)を含有するヒトゲノムDNA(0.2mg/mL)を、Roche(Indianapolis,IN)から購入した。ヒトゲノムDNAの正確な濃度をQuant−iT PicoGreen dsDNA Assay Kitにより測定すると、39ng/μLであった。
使用した全てのプライマーを表1に示す。Exiqon Inc.(Woburn,MA)から購入したプライマーiCDx−315−BRAF_FLWを除いて、全てのプライマーをIntegrated DNA Technologies Inc.(IDT,Coralville,IA)から購入した。
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
Mt=変異BRAF V600E。WT=野生型BRAF。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異BRAF V600E。wt=野生型BRAF。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
Mt=変異BRAF V600E。wt=野生型BRAF。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
使用した全てのプライマーを表5に示す。PNABio Inc.(Thousand Oaks,CA)から購入したPNAプライマーを除いて、全てのプライマーをIntegrated DNA Technologies Inc.((IDT),Coralville,IA)から購入した。
PNA=ペプチド核酸、/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
Mt=変異TP53 R248Q。WT=野生型TP53。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異TP53 R248Q。WT=野生型TP53。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異TP53 R248Q。WT=野生型TP53。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
Mt=変異TP53 R248Q。WT=野生型TP53。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
使用した全てのプライマーを表10に示す。PNABio Inc.(Thousand Oaks,CA)から購入したPNAプライマーを除いて、全てのプライマーをIntegrated DNA Technologies Inc.((IDT),Coralville,IA)から購入した。
PNA=ペプチド核酸、/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
Mt=変異KRAS G12C。WT=野生型KRAS。Hom=ホモ接合。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異KRAS G12S。WT=野生型KRAS。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異KRAS G12C。WT=野生型KRAS。Hom=ホモ接合。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
使用した全てのプライマーを表14に示す。PNABio Inc.(Thousand Oaks,CA)から購入したPNAプライマーを除いて、全てのプライマーをIntegrated DNA Technologies Inc.((IDT),Coralville,IA)から購入した。
PNA=ペプチド核酸、/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
Mt=変異KRAS G12D。WT=野生型KRAS。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異KRAS G12A。WT=野生型KRAS。Het=ヘテロ接合体。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異KRAS G12V。WT=野生型KRAS。Hom=ホモ接合。UD=未測定。太字のCt値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
Mt=変異KRAS G12V。WT=野生型KRAS。Hom=ホモ接合。UD=未測定。縦列1〜12はそれぞれ、チューブ1〜12で得たCtに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たCtに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル(通常は36のCt値の後)で現れる非ベースライン曲線に対応する。
通常の方法。使用した細胞株は、LS−174T、HCT−15、HT−29、WiDi、SW1116、結腸腺癌細胞株であった。全ての細胞株を、10%ウシ胎児血清を添加した、4.5g/Lグルコースを含有するマッコイ5A培地の入った60cm2培養皿に播種し、5% CO2を含有する加湿雰囲気に維持した。細胞がコンフルエンスの80〜90%に達した後に、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し(x3)、遠心分離(500xg)により収集した。DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen;Valencia,CA)を使用してDNAを単離した。Quant−iT Picogreenアッセイ(Life Technologies/ThermoFisher;Waltham,Ma)によりDNA濃度を測定した。
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
まず、ビメンチン(VIM)及びTMEM90B遺伝子のゲノムDNA配列のコンピューター解析を行い、予想される高度にメチル化されたCG部位を識別することにより、メチル化アッセイ設計を行った。複数のメチル化部位のコンピューター解析及び識別の後、各遺伝子内の3つないし4つの部位をアッセイ開発のために選択した。アッセイ開発を補助するために、コンピューターによる亜硫酸水素塩変換を、それぞれの遺伝子の亜硫酸水素塩により変換されたゲノムDNA上で実施する。この変換をトップ及びボトム鎖の両方で実施し、想定される亜硫酸水素塩により変換された配列のオリゴヌクレオチドを設計する。コンピューターによる変換を、トップ鎖上では直接5’C塩基の直後に続かないG塩基をA塩基に変換し(CGでない全てのGについて、G−A変換)、ボトム鎖については、直接3’G塩基に隣接するC塩基をT塩基に変換する(CGでない全てのC塩基について、C−T変換)ことにより実施する。亜硫酸水素塩による変換の後で非常に高いGC含有量を有する配列を避けることを含む、設計基準を補助する配列における多数の追加の特徴の識別として、ライゲーションアッセイの設計基準は、メチル化Cまたは隣接G(相補鎖のCはメチル化されている)のいずれかである識別する塩基を同定することから始まる。アッセイ開発用のメチル化部位が選択されると、トップ及びボトム鎖の両方における同じ部位がアッセイされる。4工程のアプローチを利用し、本アッセイ用のオリゴヌクレオチドを設計した。第1の工程は、上流及び下流リガーゼ検出反応(LDR)オリゴヌクレオチドを設計することである。次に、遺伝子特異的フォワード及びリバースオリゴヌクレオチドを設計して、全長が100〜140塩基の遺伝子特異的単位複製配列内のLDR部位及びLDRオリゴヌクレオチドをカバーする。3番目に、ライゲーション部位をカバーし、ライゲーションしたLDR産物に特異的に結合する、蛍光染色標識プローブ(FAM及びHEX(商標))を設計する。そして、最終工程は対応するWT固定核酸(LNA(商標))プローブを設計し、亜硫酸水素塩により変換した非メチル化プロモーター領域の増幅をブロックすることである。
亜硫酸水素塩変換前、及び亜硫酸水素塩変換後のトップVIM部位3(S3)ゲノム配列(赤色の太字ヌクレオチドは、メチル化のS3部位を表す)。
上流LDRプローブ配列:
5’タグ配列+上流LDRプローブ配列:
5’タグ配列+5’スペーサー、並びに第4及び第5の切断位置におけるミスマッチを有する上流LDRプローブ配列:
5’タグ配列+5’スペーサー、並びに第3及び第5の切断位置におけるミスマッチを有する上流LDRプローブ配列
VIM S3の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムDNA上流LDR位置は太字とし、小文字「a」は第3の位置のミスマッチ部位であり、RNA切断部位には下線を引いた。
下流LDRプローブ配列:
下流LDRプローブ+3’相補性タグプライマー配列:
第4の位置におけるミスマッチ、及びqPCR配列からの亜硫酸水素塩により変換されたゲノム配列と離間した更なる塩基を有する下流オリゴヌクレオチド:
VIM S3の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムDNA下流(Dn)LDRの位置は太字とし、メチル化のCG部位には下線を引いた。
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
リバースプライマー+10個の塩基尾部:
プライマーのRNA切断部分に1個の塩基ミスマッチ(小文字かつ太字)を含有するフォワード及びリバースプライマー:
VIM S3の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムDNA遺伝子特異的フォワード(FP)及びリバース(RP)プライマーは太字にし、メチル化のCG部位は拡大し、RNA切断部位領域には下線を引いた。
第3の位置でのミスマッチ(太字)とマッチするリアルタイムプローブ:
第3の位置のミスマッチ(太字)、及び2つの更なる塩基とマッチするリアルタイムプローブ:
VIM S3の、亜硫酸水素塩により変換された、リアルタイムプローブゲノムのDNA部位、小文字「a」は、第3の位置のミスマッチ上流の部位、及び、下線を引いたAは、第4の位置のミスマッチ下流の部位。
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
iCDx−308−Br600_(3)−L_Up_Rm:
上流LDRオリゴヌクレオチドの例(5’から:大文字かつ太字のタグ、小文字斜体字の短いリンカー配列、変異(太字)の前の位置3におけるミスマッチを有する、大文字の上流LDRプローブ配列、並びに、太字かつ小文字の、5つの塩基尾部の最後の位置におけるミスマッチ)。
iCDx−276−Br600_L_Dn_P:
下流LDRオリゴヌクレオチドの例(5’から:大文字の上流LDRプローブ配列、小文字斜体字の短いリンカー配列、続いて大文字かつ太字のリアルタイムPCR用タグ)。
iCDx−328−Braf_PF_WT_blk2(5塩基RNaseH2(商標)切断法による、3’末端がミスマッチした遺伝子特異的FP):
iCDx−284−Br600−PR(10塩基の尾部(太字)、1個の余分なリンカー塩基(斜体字)、及び遺伝子特異的配列(大文字)を有する遺伝子特異的RP):
遺伝子特異的フォワード及びリバースPCRプライマーの例。
iCDx−277_A4:
iCDx−279_C4:
iCDx−281−Br600_(3)_Probe:
リアルタイムPCR実験で使用したオリゴヌクレオチドの例。
iCDx−315−BRAF_FLW:
野生型シグナルをブロックするために使用したLNAオリゴヌクレオチドの例(LNA塩基は、+の記号が前にある塩基である)。
PNA−p53−248−11L:
野生型シグナルをブロックするために使用したPNAオリゴヌクレオチドの例(識別する塩基は太字であり、野生型標的にマッチする)。
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
/5SpC3/ − 5’ C3スペーサー、/3SpC3/ − 3’ C3スペーサー、/5Phos/ − 5’リン酸基、/56−FAM/ − 5’FAM蛍光染料、/5HEX/ − HEX(商標)蛍光染料、/ZEN/ − ZEN(商標)Flourescent Quencher(商標)、/3IABkFQ/ − 3’Iowa Black(登録商標)Flourescent Quencher、緑からピンクのスペクトル範囲、「+」 − 固定された核酸塩基、「rA」 − リボヌクレオチド塩基リボアデノシン;「rT」 − リボヌクレオチド塩基リボチミジン;「rG」 − リボヌクレオチド塩基リボグアノシン;「rC」 − リボヌクレオチド塩基リボシトシン
Claims (16)
- サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内の前記ヌクレオチド配列とは異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階;
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階;
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’プライマー特異的部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含む、前記段階;
1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記ライゲーション産物配列の前記5’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第1の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記ライゲーション産物配列の前記3’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列、前記1つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和して第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する段階;並びに
前記サンプル中で前記二次伸長生成物を検出及び区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。 - サンプルにおいて、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法:
1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する1つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階;
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な1種以上の酵素を提供する段階;
1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
(a)前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第1の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
(b)前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階;
前記サンプル、前記1つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解可能な前記1種以上の酵素、dUTPを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びDNAポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階;
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル(dU)含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階;
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
(a)5’部分及び3’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
(b)5’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び3’部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’部分が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの1つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階;
前記ライゲーション反応混合物を1回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記5’部分、前記標的特異的部分、前記3’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階;
前記ライゲーション産物配列の前記5’部分をその相補的3’部分にハイブリダイゼーションする段階;
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階;並びに
前記検出する段階に基づき、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、1つ以上のヌクレオチド、1つ以上のコピー数、1つ以上の転写配列、及び/または1つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。 - 前記混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前、またはそれと同時に、前記サンプルを少なくとも第1のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階
を更に含み、
前記第1のメチル化感受性酵素が、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中で核酸分子を切断し、これにより、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含有する1つ以上の核酸分子の検出を含み、前記核酸分子が元々1つ以上のメチル化残基を含有している、請求項1または2に記載の方法。 - 前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下において、前記制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供す段階
を更に含み、
前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記1つ以上のメチル化され切断されていない制限酵素切断部位を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された前記伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の方法。 - メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する1つ以上の第2のメチル化感受性酵素を提供する段階;及び
前記少なくとも1つの第2のメチル化感受性酵素を、前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第2の制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記第2のメチル化感受性酵素が、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも1つのメチル化感受性酵素認識配列内に1つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中に潜在的に存在する核酸分子を切断する、前記段階
を更に含む、請求項5に記載の方法。 - 前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’OH末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項5に記載の方法。 - 前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第1の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する5’部分
を含むが、前記亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする1つ以上のヌクレオチド配列を有する、請求項7に記載の方法。 - 非メチル化残基を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイゼーション可能な1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する段階;及び
前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記供す段階の前に、前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、前記1つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、亜硫酸水素塩で処理した相補的な標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を妨害する、前記接触させる段階
を更に含む、請求項4に記載の方法。 - 前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの3’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む3’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離3’OH末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分を更に含むことにより、前記5’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記unitaq検出部分、及び前記3’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
以下の段階:
1つ以上のunitaq検出プローブを提供する段階であって、各unitaq検出プローブが相補性unitaq検出部分にハイブリダイゼーションし、かつ前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階;
前記1つ以上のunitaq検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階;及び
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供している間に、前記1つ以上のunitaq検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上の相補性unitaq検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理間に前記1つ以上のunitaq検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項1に記載の方法。 - 1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、ライゲーション産物の接合部部分またはその相補鎖にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階;
前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階;並びに
前記第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、1回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供している間に、前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上で相補性検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理の間に前記1つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ライゲーションの前または後に、固体支持体上で各一次伸長生成物の少なくとも1つの鎖を固定化する段階であって、前記ライゲーション産物配列が前記固定化した一次伸長生成物にハイブリダイゼーションする、前記固定化する段階;並びに
前記ライゲーションの後で、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブ及び非標的特異的ライゲーション産物を前記サンプルから取り除く段階;並びに
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記固定化した一次伸長生成物から前記ライゲーション産物配列を変性させる段階
を更に含む、請求項2に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’部分が、前記3’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含み、
以下の段階:
前記プローブが、前記一次伸長生成物の相補性標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする際に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの3’OHを遊離させる段階
を更に含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、その5’末端に、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの前記3’末端とオーバーラップする同一のヌクレオチドを有し、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置における、プローブセットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによる接合部の形成の際に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部にてフラップを形成し、
以下の段階:
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドを、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記5’末端におけるリン酸基を遊離させる段階
を更に含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブを更に含み、プローブセットの前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し、これらの間の接合部とハイブリダイゼーションするように構成されており、前記第2及び第3のオリゴヌクレオチドプローブの間でのライゲーションにより、プローブセットの前記第1、第2、及び第3のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成することを可能にする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
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