BR112017007033B1 - Métodos para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo - Google Patents
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Abstract
método para identificação e quantificação relativa da expressão de sequências de ácido nucleico, variante de emenda, translocação, número de cópias, ou alterações por metilação usando reações de nuclease, ligação, e polimerase combinadas com prevenção de transferência. a presente invenção refere-se a métodos e dispositivos para identificar e quantificar, inclusive em pouca abundância, mutações de bases nucleotídicas, inserções, deleções, translocações, variantes de emenda, variantes de mirna, transcritos alternativos, sítios de início alternativos, sequências codificadoras alternativas, sequências não-codificadoras alternativas, emendas alternativas, inserções de éxons, deleções de éxons, inserções de íntrons, ou outro rearranjo no nível do genoma e/ou em bases nucleotídicas metiladas.
Description
[1] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano número de série 62/061,376, depositado em 08 de outubro de 2014, e Pedido de Patente Provisório Norte- Americano número de série 62/103,894, depositado em 15 de janeiro de 2015, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
[2] A presente invenção se refere a métodos para identificar e quantificar sequência de ácido nucleico, expressão, variante de splicing, translocação, número de cópias e/ou alterações por metilação usando reações de nuclease, ligação e polimerase combinadas com a prevenção de transferência.
[3] O sangue carrega oxigênio, nutrientes e sinais fisiológicos para cada célula no corpo, enquanto fornece simultaneamente imunidade e proteção contra patógenos externos. Ainda a mesma capacidade do sangue em espalhar vida também permite a disseminação de doenças, sejam células cancerosas que provocam metástase hepática, o vírus Ebola que destrói os capilares, Streptococcus pyogenes necrosando a carne, ou HIV que evita a detecção dentro das muitas células CD4 que visam eliminar as infecções.
[4] A propensão universal de patógenos e cânceres que tendem igualmente a se espalhar através da corrente sanguínea também cria uma oportunidade para identificação e detecção precoce - permitindo que os médicos tratem e gerenciem melhor os cuidados com o paciente. A evolução dos tratamentos para a AIDS caminhou lado-a-lado com os aperfeiçoamentos no diagnóstico com ácido nucleico, a partir de ensaios de PCR de transcrição reversa iniciais para proteger o suprimento de sangue das nações, para sequenciar variantes resistentes a fármaco, para a quantificação RT-PCR de carga viral para determinar a eficácia do tratamento. Até hoje, aqueles que foram infectados não foram curados, porém sofisticadas ferramentas de diagnóstico guiaram as decisões sobre o tratamento, decisões epidemiológicas e políticas para conter esta epidemia global.
[5] O câncer é a principal causa de morte em países desenvolvidos e a segunda principal causa de morte em países em desenvolvimento. O câncer se tornou a maior causa de mortalidade mundial, com 8,2 milhões de mortes de câncer estimadas em 2012. Se prevê que os casos mundiais de câncer aumentarão em 75% e chegarão próximo a 25 milhões durante as próximas duas décadas. Um relatório recente da Organização Mundial da Saúde conclui: "(A) batalha global contra o câncer não será vencida apenas com tratamento. As medidas eficazes de prevenção (são) são urgentemente necessárias para prevenir (uma) crise do câncer". A detecção de câncer precoce no sangue é o melhor meio de prevenção eficaz. Ela salvará vidas ao permitir tratamento precoce e melhor, assim como reduzir o custo da cura do câncer.
[6] O plasma ou soro a partir de um paciente com câncer contém ácidos nucleicos liberados a partir de células cancerosas que passam por processos fisiológicos anormais. Esses ácidos nucleicos já demonstraram utilidade para diagnóstico (Diaz and Bardelli, J Clin Oncol 32: 579-586 (2014); Bettegowda et al., Sci Transl Med 6: 224 (2014); Newman et al., Nat Med 20: 548-554 (2014); Thierry et al., Nat Med 20: 430-435 (2014)). Uma fonte adicional de ácidos nucleicos está dentro das células tumorais circulantes (CTCs), embora estágio precoce e uma fração significativa de tumores localizados produzem muito poucas ou quase nenhuma CTC por ml. Plasma ou soro normais contém ácidos nucleicos liberados de células normais que sofrem processos fisiológicos normais (isto é, secreção de exosoma, apoptose). Pode haver liberação adicional de ácidos nucleicos sob condições de estresse, inflamação, infecção ou lesão.
[7] O desafio ao se desenvolver testes para o diagnóstico e rastreio confiáveis é distinguir aqueles marcadores que emanam do tumor que são indicativos de doença (por exemplo, câncer precoce) vs. presença dos mesmos marcadores que emanam do tecido normal (o que levaria a um sinal falso-positivo). Também há uma necessidade em se equilibrar o número de marcadores examinados e o custo do teste, com a especificidade e a sensibilidade do ensaio. A caracterização compreensiva de perfil molecular (mRNA, metilação, número de cópias, miRNA, mutações) de milhares de tumores pelo Cancer Genome Atlas Consortium (TCGA), revelou que tumores colorretais são tão diferentes um do outro quanto são dos cânceres de mama, próstata ou outros cânceres epiteliais (TCGA "Comprehensive Molecular Characterization of Human Colon and Rectal Cancer Nature 487: 330-337 (2014)). Além disso, aqueles poucos marcadores que eles têm em comum (por exemplo, mutações em KRAS,) também estão presentes em múltiplos tipos de câncer, dificultando a capacidade em identificar o tecido de origem. Para a detecção precoce de câncer, o ensaio do ácido nucleico deve servir primariamente como uma ferramenta de rastreio, necessitando da disponibilidade de follow-up diagnóstico secundário (por exemplo, colonoscopia para câncer colorretal).
[8] A composição do problema biológico é a necessidade de se quantificar a mutação, promover a metilação, ou número de cópias de DNA ou RNA de forma confiável seja a partir de um número bem pequeno de células iniciais (isto é, a partir de CTCs), ou quando o sinal do câncer é a partir de DNA livre de célula (cfDNA) no sangue e diluído por um excesso de ácido nucleico que aparece das células normais ou é liberado inadvertidamente a partir de células sanguíneas normais durante o processamento de amostras (Mateo et al., Genome Biol 15: 448 (2014)).
[9] Da mesma forma, um problema análogo de identificação de um alvo raro é encontrado quando se usam as técnicas com base em ácido nucleico para detectar doenças infecciosas diretamente no sangue. Em resumo, tanto o patógeno pode estar presente em 1 ou menos unidades formadoras de colônia (cfu)/ml, e/ou existem muitos patógenos potenciais e variações de sequência responsáveis por virulência ou resistência a fármacos. Enquanto esses problemas são exemplificados com o câncer, reconhece-se que as soluções são igualmente aplicáveis a doenças infecciosas.
[10] A maior parte dos esforços atuais em diagnósticos moleculares no câncer se centralizou em: (i) prognóstico e genética preditiva, por exemplo, identificar mutações herdadas nos genes de predisposição do câncer, tais como BrCA1, BrCA2, (Ford et al. Am J Hum Genet 62: 676-689 (1998) ) (ii) tratamento individualizado, por exemplo, mutações no gene EGFR orientando a medicina personalizada (Sequist and Lynch, Ann Rev Med, 59: 429-442 (2008), e (iii) monitoração de recorrência, por exemplo, detectar as mutações emergentes em KRAS em pacientes que desenvolvem resistência a tratamentos com fármaco (Hiley et al., Genome Biol 15: 453 (2014); Amado et al., J Clin Oncol 26: 1626-1634 (2008)). Ainda, isto desperdiça grandes oportunidades na continuidade do diagnóstico molecular do câncer: (i) rastreio mais frequente daqueles com um histórico familiar, (ii) rastreio para a detecção precoce da doença, e (iii) monitoração da eficácia do tratamento. Para atender a estas três necessidades não satisfeitas, um novo sistema de medição para detecção com base no sangue denominado "carga de marcador tumoral", análogo à carga viral é proposto no presente documento para resolver essas três necessidades não atendidas.
[11] O sequenciamento de DNA prove a capacidade suprema para distinguir todas as modificações do ácido nucleico associadas com a doença. No entanto, o processo ainda necessita de múltipla preparação de amostra inicial e modelo e isto é não é sempre econômico. Os microarranjos de DNA podem prover informação substancial sobre múltiplas variantes de sequência, tais como SNPs ou níveis de expressão de RNA diferentes e são menos custosos do que o sequenciamento; no entanto, eles são menos adequados para obter resultados altamente quantitativos, não para detectar mutações pouco abundantes. Na outra ponta do espectro está a reação TaqMan™, a qual fornece quantificação em tempo real de um gene conhecido, porém é menos adequada para distinguir múltiplas variantes de sequência ou mutações pouco abundantes.
[12] É crucial ligar cada necessidade diagnóstica não atendida com o teste diagnóstico adequado - um que combina os objetivos divergentes de alcançar tanto a alta sensibilidade (isto é, poucos falsos- negativos) quanto a alta especificidade (isto é, poucos falsos-positivos) a baixo custo. Por exemplo, o sequenciamento direto de éxons de EGFR a partir de uma biópsia tumoral para determinar o tratamento para câncer pulmonar de células não pequenas (NSCLC) é significativamente mais preciso e mais econômico do que projetar sondas TaqMan™ para as mais de 180 mutações conhecidas cuja resposta ao fármaco já está catalogada (Jia et al. Genome Res 23: 1434-1445 (2013)). A técnica mais sensível para detectar mutações pontuais, BEAMing (Dressman et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 8817-8822 (2003)), se baseia no conhecimento anterior de quais mutações se deve procurar, e assim é melhor adequada para monitoração da recorrência da doença, em vez de ser para a detecção precoce. Da mesma forma, para monitorar os níveis sanguíneos de translocações de Bcr-Abl quando se trata pacientes de CML com Gleevec (Jabbour et al., Câncer 112: 2112-2118 (2008)), um simples ensaio de PCR de transcrição reversa quantitativa é muito melhora para sequenciar o inteiro DNA genômico em 1 ml de sangue (9 milhões de células x 3 GB = 27 milhões de Gb de dados puros).
[13] O sequenciamento de cada 2.1 Gb do DNA livre de células (cfDNA) isolado de pacientes com NSCLC foi usado para fornecer cobertura de 10.000 vezes em 125 kb de DNA direcionado (Kandoth et al. Nature 502: 333-339 (2013)). Esta abordagem identificou corretamente mutações presentes em tumores correspondentes, embora apenas 50% dos tumores de estágio 1 estavam cobertos. A abordagem traz esperança para NSCLC, onde as amostras têm uma média de 5 a 20 mutações/ Mb, no entanto seria mais econômico para os outros cânceres tais como o câncer de mama e de ovário, que têm em média menos do que 1 a 2 mutações por Mb. As etapas de ligação inicial, amplificação e/ou captura necessárias para sequenciamento mais profundamente direcionado são ainda mais complexas do que os ensaios PCR-TaqMan™ ou PCR-LDR multiplexados.
[14] Uma análise de dados compreensiva de mais de 600 amostras de câncer colorretal que leva em consideração a heterogeneidade tumoral, agrupamentos tumorais e falsos-positivos biológicos /técnicos que variam de 3% a 10% por marcador individual mostrou que o rastreio para detecção precoce ideal para o câncer colorretal necessitaria de pelo menos 5 a 6 marcadores positivos dos 24 marcadores testados (Bacolod et al,. Cancer Res 69:723-727 (2009); Tsafrir et al. Cancer Res 66: 2129-2137 (2006), Weinstein et al., Nat Genet 45: 1113-1120 (2013); Navin N.E. Genome Biol 15: 452 (2014); Hiley et al., Genome Biol 15: 453 (2014)); Esserman et al. Lancet Oncol 15: e234-242 (2014)). Além disso, a distribuição de marcador é parcial em diferentes clados tumorais, por exemplo, alguns tumores são altamente metilados, enquanto outros são pouco metilados, e não se pode distinguir a partir da metilação relacionada à idade do tecido adjacente. Consequentemente, uma abordagem multidimensional usando combinações de 3-5 conjuntos de marcadores de mutação, metilação, miRNA, mRNA, variação de cópias, splicing alternativo ou marcadores de translocação é necessária para obter cobertura suficiente de todos os clados tumorais diferentes. De forma análoga ao rastreio pré-natal não invasivo para trissomia, com base no sequenciamento ou realização da detecção de ligação em fragmentos aleatórios de cfDNA (Benn et al., Ultrasound Obstet Gynecol. 42(1):15- 33 (2013); Chiu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105: 20458 - 20463 (2008); Juneau et al., Fetal Diagn Ther. 36(4) (2014)), os marcadores reais classificados em um rastreio tumoral são secundários à quantificação precisa daqueles marcadores positivos no plasma.
[15] Os testes diagnósticos que visam encontrar sequências mutantes muito raras ou pouco abundantes encaram sinal falso-positivo potencial que vem de: (i) erro de polimerase na réplica do alvo do tipo selvagem, (ii) erro no sequenciamento de DNA, (iii) má ligação no alvo do tipo selvagem, (iii) produto do PCR independente do alvo, e (iv) contaminação por transferência dos produtos de PCR que vem de uma amostra positiva anterior. As profundas implicações clínicas de um resultado de teste positivo quando se faz o rastreio para o câncer demanda que tal teste use todos os meios possíveis para virtualmente eliminar os falsos-positivos.
[16] Central ao conceito da detecção através de ácido nucleico é a amplificação ou purificação seletiva dos marcadores específicos de câncer desejados longe dos mesmos ou marcadores muito similares das células normais. Essas abordagens incluem: (i) múltiplas regiões de ligação iniciadoras para amplificação e detecção ortogonal, (ii) seleção por afinidade de CTCs ou exossomas, e (iii) diluição espacial da amostra.
[17] O sucesso de PCR-LDR, que usa 4 regiões de ligação iniciadoras para assegurar a sensibilidade e a especificidade, foi demonstrado anteriormente. As regiões desejadas são amplificadas usando pares ou mesmo pares tandem de iniciadores de PCR, seguidos por pares de iniciadores de LDR encaixados de forma ortogonal para detecção. Uma vantagem do uso de PCR-LDR é a capacidade de realizar amplificação por PCR proporcional de múltiplos fragmentos. Biofire/bioMerieux desenvolveu uma tecnologia similar denominada "arranjo de película"; em que os produtos da reação PCR multiplexados iniciais são redistribuídos em poços individuais, e depois encaixados em PCR de tempo real realizado com a detecção SYBR Green Dye.
[18] A purificação de afinidade das CTCs usando captura de anticorpo ou aptâmeros foi demonstrada (Adams et al., J Am Chem Soc 130: 8633-8641 (2008); Dharmasiri et al., Electrophoresis 30: 32893300 (2009); Soper et al. Biosens Bioelectron 21: 1932-1942 (2006)). A captura de exossomas por afinidade ao peptídeo foi relatada na literatura. O enriquecimento dessas frações específicas tumorais do sangue possibilita a quantificação do número de cópias, assim como simplifica o rastreio e os ensaios de verificação.
[19] A última abordagem, diluição especial da amostra, é empregada em PCR digital assim como seu primo próximo conhecido como BEAMing (Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci U S A. 96(16):9236-41 (1999); Dressman et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 8817-8822 (2003)). A razão para PCR digital é superar o limite de discriminação enzimática quando a amostra compreende muito poucas moléculas alvo contendo uma mutação conhecida em um excesso de 1,000 a 10,000 vezes o DNA do tipo selvagem. Ao diluir DNA inicial em 20,000 ou mais gotículas ou esferas para distribuir menos do que uma molécula de alvo por gotícula, o DNA pode ser amplificado através de PCR, e depois detectado através de hibridização da sonda ou reação TaqMan™, dando em essência uma classificação digital 0/1. A abordagem é atualmente mais sensível para encontrar mutações pontuais no plasma, mas não necessita de conhecimento anterior das mutações que estão sendo classificadas, assim como uma diluição digital separada para cada mutação, o que esgotaria a amostra completa para classificar apenas algumas poucas mutações.
[20] Vários ensaios de PCR / dispositivos microfabricados foram designados para rápida detecção de patógenos e translocações e mutações associadas com doença. Cada ensaio/combinação de hardware tem pontos fortes especiais, porém quando são combinados com o problema do mundo real dos marcadores multidimensionais e multiplexados necessários para a detecção do câncer, a flexibilidade de PCR-LDR com microfluídicos fornece certas vantagens.
[21] A instrumentação, projeto do ensaio e a arquitetura Microfluídica precisam ser perfeitamente integrados. Alguma instrumentação para PCR utiliza fluorescência em tempo real ou fluorescência de ponto final para quantificar moléculas modelo iniciais ao ciclizar as câmaras, poços ou gotículas através de diferentes temperaturas. Ainda outra instrumentação compreende placas microfluídicas que podem ser usadas para a detecção por PCR em tempo real. No entanto, o alto custo de ambos os instrumentos e materiais de consume limitou a ampla utilização dessas máquinas para aplicações clínicas.
[22] Em uma arquitetura diferente, a denominada PCR de fluxo contínuo, a mistura de reação move ao longo dos canais que estão arranjados de modo ordenado em um padrão radiador, e flui sobre os elementos de aquecimento que estão em temperaturas fixadas. Esta arquitetura permite que toda a reação de amplificação seja completada em poucos minutos e é ideal para separação capilar e leitura. Para as reações de detecção da ligase, a leitura pode ser conseguida ao utilizar o LDR-FRET ou detecção eletrônica. Em LDR-FRET, um iniciador tem o grupo doador, o outro tem um grupo aceptor e depois da ligação eles formam um grampo. Isto permite que vários eventos de ligação única obtenham leituras altamente quantitativas do número de cópias do DNA inicial. Alternativamente, ao anexar nanopartículas de ouro em cada iniciador, o produto de ligação conterá duas nanopartículas e essas podem ser distinguidas usando leitura eletrônica.
[23] Ao considerar vários graus de automação, a abordagem descrita no presente documento é orientada pelos princípios de "modularidade" e "escalabilidade". Em primeiro lugar, o processo deve ser separado em etapas modulares que podem ser inicialmente otimizadas em instrumentos separados. Por exemplo, o dispositivo pode ser compreendido de um primeiro módulo para purificação de DNA a partir de cfDNA de plasma assim como RNA a partir de exossomas, um segundo módulo para transcrição reversa multiplexada e/ou amplificação limitada de vários alvos, e um terceiro módulo para gerar e detectar produtos de ligação. Tal arquitetura modular permite trocar em módulos melhorados que acompanham desenvolvimentos tecnológicos. Para tal abordagem de modularidade funcionar, é crucial que os produtos a partir de um módulo possam ser movidos perfeitamente no próximo módulo, sem vazamento ou nenhuma preocupação sobre contaminação cruzada.
[24] Em segundo lugar, o projeto modular deve ser receptivo para a fabricação escalonável em altos volumes em baixo custo. Os custos de fabricação e como os iniciadores / reagentes / amostras são depositados no dispositivo devem ser levados em consideração.
[25] A presente invenção se propõe a superar essas e outras deficiências na técnica.
[26] Um primeiro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados. Este método envolve fornecer uma amostra contendo potencialmente uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra. Um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência adjacente à sequência nucleotídica alvo, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário. A amostra contactada é misturada com um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. O método também envolve misturar os produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica da sequência nucleotídica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica da sequência nucleotídica, e em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligadas na amostra são detectadas e distinguidas para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
[27] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleicocontendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo potencialmente a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados. O método também envolve fornecer uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra, e fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico primário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário comprendendo(a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência adjacente à sequência nucleotídica alvo e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário. A amostra é misturada com um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico na amostra, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase. A mistura da reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas para digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na mistura da reação em cadeia da polimerase, e por um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. O método também envolve misturar os produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, em que cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ iniciador- específica e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo-específica e uma porção 3’ iniciador-específica. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário. A mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pela qual a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação onde cada sequência de produto ligada compreende a porção 5’ iniciador- específica, as porções alvo-específicas, e a porção 3’ iniciador- específica. O método também envolve prover um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo a mesma sequência nucleotídica como a porção 5’ iniciador-específica da sequência de produto ligado e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção 3’ iniciador-específica da sequência de produto ligado, e misturar as sequências de produto ligadas, um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma segunda mistura de reação em cadeia da polimerase. A segunda mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas para digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na segunda mistura de reação em cadeia da polimerase, and um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários. Os produtos de extensão secundários são detectados e distinguidos na amostra para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
[28] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo potencialmente a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados; fornecer uma ou mais enzimas capazes dedigerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra; e fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico primário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário comprendendo(a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primárioque compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência adjacente à sequência nucleotídica alvo e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário. O método também envolve misturar a amostra, um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico primário, uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico na amostra, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase. A mistura da reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas paradigerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na mistura da reação em cadeia da polimerase, e por um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. Os produtos de extensão primários são misturados com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, em que cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo-específica e uma porção 3’, onde a porção 5’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sonda é complementar a uma porção da porção 3’ da segunda sonda oligonucleotídica, onde uma sonda do conjunto de sonda compreende uma porção geradora de sinal detectável, e onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário. O método também envolve subjecting a mistura da reação de ligaçãoto um ou mais ciclos de reação da ligação whereby a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação onde cada sequência de produto ligada compreende uma porção 5’, as porções alvo-específicas, a porção 3’, e uma porção geradora de sinal detectável. A porção 5’ da sequência de produto ligado é hibridizada em sua porção 3’ complementar e o sinal a partir da porção geradora de sinal detectável que é produzido mediante tal hibridização é detectado. As sequências de produto ligado são distinguidas na amostra com base em tal detecção para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
[29] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em um ou mais resíduos metilados. Este método envolve fornecer uma amostra contendo potencialmente uma ou mais moléculas de ácido nucleicocompreendendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais resíduos metilados e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra. O método também envolve contacting a amostra com uma ou mais enzimas sensitivas à metilação para formar uma mistura de reação da enzima de restrição, em que uma ou mais enzimas sensitivas à metilação cliva moléculas de ácido nucleico na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados dentro de pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação. Um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreendendo (a) primeiro iniciador oligonucletídico primário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma região da sequência nucleotídica alvo que está a montante de um ou mais resíduos metilados e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como uma região da sequência nucleotídica alvo que está a jusante de um ou mais resíduos metilados. A mistura de reação da enzima de restrição é misturada com um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura da reação em cadeia da polimerase primária. O método também envolve submeter a mistura da reação em cadeia da polimerase primária a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerasecompreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos encaixados capazes de hibridizar aos produtos de extensão primários. Os produtos de extensão primários são misturados com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar a mistura da reação em cadeia da polimerase secundária, e a mistura da reação em cadeia da polimerase secundária é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários. Os produtos de extensão secundários na amostra são detectados e distinguidos para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais resíduos metilados.
[30] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo em sequência das outras moléculas de ácido nucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo contendo potencialmente uma sequência que difere das outras moléculas de ácido ribonucleico, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. Um ou mais iniciadores oligonucleotídicos são fornecidos, cada iniciador sendo complementar a uma ou mais das moléculas de ácido ribonucleico alvo. A amostra contactada é misturada com um ou mais iniciadores oligonucleotídicos, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de transcrição reversa, e moléculas de ácido desoxirribonucleico (cDNA) complementares são geradas na mistura de transcrição reversa. Cada molécula de cDNA compreende uma sequência nucleotídica que é complementar à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo e contém dU. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção da sequência nucleotídica cDNA adjacenta à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo complementar do cDNA, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico. A mistura de transcrição reversa contendo as moléculas de cDNA é misturada com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, e uma polimerase para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim um ou mais diferentes produtos de extensão primários. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de sonda oligonucletídica. Cada sonda nucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em uma porção complementar de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo. Os produtos de extensão primários são colocados em contato com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação e a primeira e segunda sondas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas in the mistura de reação da ligase. As sequências de produto ligado na amostra são detectadas e distinguidas identificando assim a presença de uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo assim em sequência das outras moléculas de ácido ribonucleico na amostra devido ao splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutatções ou outro rearranjo no nível genômico.
[31] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo em sequência das outras moléculas de ácido nucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo potencialmente em sequência das outras moléculas de ácido ribonucleico, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. Um ou mais iniciadores oligonucleotídicos é fornecido, cada iniciador sendo complementar a uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo, e a amostra contactada é misturada com um ou mais iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de transcrição reversa. As moléculas de ácido desoxirribonucleico (cDNA) complementar são geradas na mistura de transcrição reversa, cada molécula de cDNA compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à molécula de ácido ribonucleico alvo e contém dU. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção da sequência nucleotídica de cDNA adjacente à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo complementar do cDNA, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formada a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico. A mistura de transcrição reversa contendo as moléculas de cDNA é misturada com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma polimerase para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim um ou mais diferentes produtos de extensão primários. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de sonda oligonucletídica, cada sonda nucleotídica compreendendo (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ iniciador-específica e uma porção 3’ de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ de sequência alvo-específica e uma porção 3’ iniciador- específica, onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo. Os produtos de extensão primários são colocados em contato com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, e a mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligase, onde cada sequência de produto ligada compreende a porção 5’ iniciador-específica, as porções alvo-específicas, e a porção 3’ iniciador- específica. O método também envolve prover um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo a mesma sequência nucleotídica como a porção 5’ iniciador-específica da sequência de produto ligado e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção 3’ iniciador-específica da sequência de produto ligado, e misturar as sequências de produto ligadas, um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma segunda mistura de reação em cadeia da polimerase. A segunda mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas para digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na segunda mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários. Os produtos de extensão secundários na amostra são detectados e distinguidos identificando assim a presença de uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico diferindo em sequência das outras moléculas de ácido nucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico.
[32] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo em sequência das outras moléculas de ácido nucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo diferindo potencialmente em sequência das outras moléculas de ácido ribonucleico, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. O método também envolve prover um ou mais iniciadores oligonucleotídicos, cada iniciador sendo complementar a uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico alvo, e misturar a amostra contactada, um ou mais iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de transcrição reversa. As moléculas de ácido desoxirribunucleico (cDNA) complementares são geradas na mistura de transcrição reversa, cada molécula de cDNAcompreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à molécula de ácido ribonucleico alvo e contém dU. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de uma sequência nucleotídica de cDNA adjacente à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo complementar do cDNA, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico. A mistura de transcrição reversa contendo as moléculas de cDNA é misturada com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma polimerase para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim um ou mais diferentes produtos de extensão primários. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de sonda oligonucletídica, cada sonda nucleotídica compreendendo (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo- específica e uma porção 3’, onde a porção 5’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sonda é complementar a uma porção da porção 3’ da segunda sonda oligonucleotídica, onde uma sonda do conjunto de sonda compreende uma porção geradora de sinal detectável, e onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de ácido ribonucleico alvo. Os produtos de extensão primários são colocados em contato com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, e a mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligase, onde cada sequência de produto ligada compreende uma porção 5’, as porções alvo-específicas, a porção 3’, e a porção geradora de sinal detectável. A porção 5’ da sequência de produto ligado é hibridizada em sua porção 3’ complementar, e o sinal a partir da porção geradora de sinal detectável que é produzido mediante tal hibridização é detectado. As sequências de produto ligado na amostra são detectadas com base em tal detecção para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico diferindo em sequência das outras moléculas de ácido nucleico na amostra devido ao splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico.
[33] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA alvo potentially diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA in a amostra em uma ou mais bases, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes naamostra. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 5’ haste-alça, um grupo bloqueador, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, e uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e a porção 5’ iniciador- específica, (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como a porção iniciadora interno-específicado primeiro iniciador oligonucleotídico, e (d) um quarto iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do segundro iniciador oligonucleotídico. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais dos primeiros iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa. O primeiro iniciador oligonucleotídico se hibridiza à sequência de molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, e a transcriptase reversa extende a extremidade 3’ do primeiro iniciador oligonucleotídico hibridizado para gerar um primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo. O método também envolve misturar a mistura da reação de transcrição reversa com o segundo, terceiro e quarto iniciadores oligonucleotídicos do conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase sob condições eficazes para um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para se hibridizar à região do primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo e extender para gerar um produto de extensão primário compreendendo a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência de molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. A mistura de reação em cadeia da polimeraseé submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim uma pluralidade de produtos de extensão primários. O método também envolve misturar a pluralidade de produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica e uma porção complementar a um produto de extensão primário, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligadas na amostra são detectadas e distinguidas identificando assim uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[34] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA alvo potencialmente diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 5’ haste-alça, um grupo bloqueador, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, e uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e a porção 5’ iniciador-específica, (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como a porção iniciadora interno- específicado primeiro iniciador oligonucleotídico, e (d) um quarto iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do segundro iniciador oligonucleotídico. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais dos primeiros iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa onde o primeiro iniciador oligonucleotídico se hibridiza à sequência de molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, e a transcriptase reversa extende a extremidade 3’ do primeiro iniciador oligonucleotídico hibridizado para gerar um primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura de reação da transcrição reversa é misturada com o segundo, terceiro e quarto iniciadores oligonucleotídicos do conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase sob condições eficazes para um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para se hibridizar à região do primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo e extender para gerar um produto de extensão primário compreendendo a porção 5’ iniciador- específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. A mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim uma pluralidade de produtos de extensão primários. A pluralidade de produtos de extensão primários é misturada com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, onde cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo a porção 5’ iniciador-específica e uma porção 3’ de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ de sequência alvo-específica, uma porção complementar a um produto de extensão primário, e a porção 3’ iniciador-específica, e onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura da reação de ligaçãoé submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação em que cada sequência de produto ligado compreende a porção 5’ iniciador-específica, as porções alvo- específicas, e a porção 3’ iniciador-específica. O método também envolve prover um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo a mesma sequência nucleotídica como a porção 5’ iniciador-específica da sequência de produto ligado e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção 3’ iniciador-específica da sequência de produto ligado, e misturar as sequências de produto ligadas, um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formaruma segunda mistura de reação em cadeia da polimerase. A segunda mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas paradigerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na segunda mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerasecompreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produto de extensão secundário. Os produtos de extensão secundários na amostra são detectados e distinguidos identificando assim uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[35] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo potencialmente em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 5’ haste-alça, um grupo bloqueador, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, e uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e a porção 5’ iniciador-específica, (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como a porção iniciadora interno-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico, e (d) um quarto iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do segundo iniciador oligonucleotídico. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais dos primeiros iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa em que o primeiro iniciador oligonucleotídico se hibridiza à sequência de molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, e a transcriptase reversa extende a extremidade 3’ do primeiro iniciador oligonucleotídico hibridizado para gerer um primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura de reação da transcrição reversa é misturada com o segundo, terceiro e quarto iniciadores oligonucleotídicosdo conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase sob condições eficazes para um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para se hibridizar à região do primeiro iniciador oligonucleotídico extendido compreendendo o complemento da sequência da molécula de miRNA alvo e extender para gerar um produto de extensão primário compreendendo a porção 5’ iniciador- específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. O método também envolve submeter a mistura de reação em cadeia da polimerase a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim uma pluralidade de produtos de extensão primários. A pluralidade de produtos de extensão primários é misturada com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, em que cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ e a porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo a porção 5’ sequência nucleotídica alvo-específica e uma porção 3’, onde a porção 5’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sonda é complementar a uma porção da porção 3’ da segunda sonda oligonucleotídica, onde uma sonda do conjunto de sonda compreende uma porção geradora de sinal detectável, e onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação em que cada sequência de produto ligado compreende a porção 5’, as porções alvo-específicas, a porção 3’, e a porção geradora de sinal detectável. A porção 5’da sequência de produto ligado é hibridizada em sua porção 3’ complementar, e sinal a partir da porção geradora de sinal detectável que é produzido mediante tal hibridização é detectado. As sequências de produto ligado na amostra são distinguidas com base em tal detecção para identificar a presença de uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[36] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA alvo potencialmente diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA em uma ou mais diferenças de base, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. A amostra colocada em contato é misturada com uma ligase e uma primeira sonda oligonucleotídica compreendendo um fosfato 5’, uma porção 5’ haste-alça, uma porção iniciadora interno- específica dentro da região da alça, um grupo bloqueador, e uma sequência nucleotídica 3’ que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo para formar uma reação de ligação. O método também envolve ligar a sequência da molécula de miRNA alvo em sua extremidade 3’ ao fosfato 5’ da primeira sonda oligonucleotídica para gerar a molécula de ácido nucleico quimérico compreendendo a sequência da molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, anexada à primeira sonda oligonucleotídica. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo a sequência nucleotídica 3’ que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e uma porção 5’ iniciador-específica, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção de iniciador interno- específica da primeira sonda oligonucleotídica, e (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico. A molécula de ácido nucleico quimérico é misturada com um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa, em que um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador se hibridiza à porção de iniciador interno-específica da molécula de ácido nucleico quimérico, and extends em sua extremidade 3’ para gerar a complement da molécula de ácido nucleico quimérico, caso presente na amostra. O método também envolve misturar a mistura da reação de transcrição reversa com o primeiro e terceiro iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase, e submeter a mistura de reação em cadeia da polimeraseto um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão primários. Os produtos de extensão primários compreendem a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. Os produtos de extensão primários são misturados com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica e uma porção complementar a um produto de extensão primário, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligadas na amostra são detectadas e distinguidas identificando assim uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[37] Um outro aspecto do método presente invenção para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro- ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA potencialmente diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA em uma ou mais diferenças de base, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. A amostra colicada em contato é misturada com uma ligase e uma primeira sonda oligonucleotídica compreendendo um fosfato 5’, uma porção 5’ haste- alça, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, um grupo bloqueador, e uma sequência nucleotídica 3’ que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo para formar uma reação de ligação, e a sequência da molécula de miRNA alvo em sua extremidade 3’ é ligada ao fosfato 5’ da primeira sonda oligonucleotídica para gerar a molécula de ácido nucleico quimérico compreendendo a sequência da molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, anexada à primeira sonda oligonucleotídica. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo a sequência nucleotídica 3’ que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e a porção 5’ iniciador- específica, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção de iniciador interno-específica da primeira sonda oligonucleotídica, e (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico. A molécula de ácido nucleico quimérico é misturada com um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa, onde um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador se hibridizam à porção de iniciador interno-específica da molécula de ácido nucleico quimérico e se estendem em sua extremidade 3’ para gerar um complemento da molécula de ácido nucleico quimérico, caso presente na amostra. A mistura de reação da transcrição reversa é misturada com o primeiro e terceiro iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. Os produtos de extensão primários são misturados com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, em que cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ iniciador-específica e uma porção 3’ de sequência alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ de sequência alvo-específica, uma porção complementar a um produto de extensão primário, e uma porção 3’ iniciador-específica, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, em que cada sequência de produto ligado compreende a porção 5’ iniciador-específica, as porções alvo-específicas, e a porção 3’ iniciador-específica. O método também envolve prover um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo a mesma sequência nucleotídica que a porção 5’ iniciador-específica da sequência de produto ligado e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção 3’ iniciador-específica da sequência de produto ligado. As sequências de produto ligado são ligadas com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil(dU) contendo moléculas de ácido nucleico, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma segunda mistura de reação em cadeia da polimerase. A segunda mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a condições adequadas para digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na segunda mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários. Os produtos de extensão secundários na amostra são detectados e distinguidos identificando assim uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[38] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA potencialmente diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA em uma ou mais diferenças de base, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. A amostra colocada em contato é misturada com uma ligase e uma primeira sonda oligonucleotídica compreendendo um fosfato 5’, uma porção 5’ haste-alça, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, um grupo bloqueador, e uma sequência nucleotídica 3’ que é complementar a uma porção 3’ da sequência da molécula de miRNA alvo para formar uma reação de ligação. A sequência da molécula de miRNA alvo é ligada em sua extremidade 3’ ao fosfato 5’ da primeira sonda oligonucleotídica para gerar a molécula de ácido nucleico quimérico compreendendo a sequência da molécula de miRNA alvo, caso presente na amostra, anexada à primeira sonda oligonucleotídica. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo a sequência nucleotídica 3’ que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da sequência da molécula de miRNA alvo, e a porção 5’ iniciador-específica, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção de iniciador interno-específica da primeira sonda oligonucleotídica, e (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico. A molécula de ácido nucleico quimérico é misturada com um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa, em que um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador se hibridizam à porção de iniciador interno-específica da molécula de ácido nucleico quimérico e se estendem em sua extremidade 3’ para gerar um complemento da molécula de ácido nucleico quimérico, caso presente na amostra. A mistura de reação da transcrição reversa é misturada com o primeiro e terceiro iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. Os produtos de extensão primários são misturados com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação, em que cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo-específica e uma porção 3’, onde a porção 5’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sonda é complementar a uma porção da porção 3’ da segunda sonda oligonucleotídica, onde uma sonda do conjunto de sonda compreende uma porção geradora de sinal detectável, e onde a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, em porções complementares de um produto de extensão primário correspondendo à sequência da molécula de miRNA alvo. A mistura da reação de ligação é submetida a um ou mais ciclos de reação da ligação pelos quais a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação em que cada sequência de produto ligado compreende a porção 5’, as porções alvo-específicas, a porção 3’, e a porção geradora de sinal detectável. A porção 5’ da sequência de produto ligado é hibridizada em sua porção 3’ complementar, e o sinal a partir da porção geradora de sinal detectável que é produzido mediante tal hibridização é detectado. As sequências de produto ligado são distinguidas na amostra com base em tal detecção para identificar a presença de uma ou mais moléculas de miRNA alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[39] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um dispositivo para adicionar líquidos simultaneamente a dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna de uma placa de microtitulação. O dispositivo tem superfícies superiores e inferiores opostas com a superfície superior tendo aberturas que levam aos poços e a superfície inferior definindo extremidades fechadas dos poços. O dispositivo compreende uma primeira camada definida pelo primeiro e segundo limites com câmaras dosadoras que se estendem entre o primeiro e segundo limites da referida primeira camada e em comunicação de fluido uma com a outra. A primeira camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, próxima à placa de microtitulação com o primeiro limite da primeira camada mais próximo da superfície superior da placa de microtitulação e cada uma das câmaras dosadoras estando em comunicação de fluido com um poço individual em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação. A primeira camada ainda compreende uma câmara de preenchimento em comunicação de fluido com uma ou mais das câmaras dosadoras. O dispositivo compreende uma segunda camada definida pelo primeiro e segundo limites com um orifício de preenchimento que se estende entre o primeiro e segundo limites da segunda camada. A segunda camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, na primeira camada com o primeiro limite da segunda camada adjacente ao segundo limite da primeira camada e o orifício de preenchimento estando alinhado com a câmara de preenchimento. Quando a primeira camada, segunda camada, e placa de microtitulação estão posicionadas uma em relação a outra em suas posições operacionais, o líquido que entre no dispositivo através do orifício de preenchimento passará pela câmara de entrada, câmaras dosadoras, e em dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação.
[40] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método de adicionar líquidos a dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna de uma placa de microtitulação tendo superfícies superiores e inferiores opostas com a superfície superior tendo aberturas que levam aos poços e a superfície inferior definindo extremidades fechadas dos poços. Este método envolve fornecer um dispositivo compreendendo uma primeira camada tendo primeiro e segundo limites com câmaras dosadoras que se estendem entre o primeiro e segundo limites da primeira camada e em comunicação de fluido uma com a outra. A primeira camada do dispositivo é configurada para se assentar, em uma posição operacional, próxima à placa de microtitulação com os primeiros limites da primeira camada mais próximos da superfície superior da placa de microtitulação e uma das câmaras dosadoras estando em comunicação de fluido com um poço individual em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação. A primeira camada compreendendo ainda uma câmara de preenchimento em comunicação de fluido com uma ou mais das referidas câmaras dosadoras. O dispositivo compreende uma segunda camada tendo primeiro e segundo limites com um orifício de preenchimento que se estende entre o primeiro e segundo limites da segunda camada. A segunda camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, na primeira camada com o primeiro limite da segunda camada adjacente ao segundo limite da primeira camada e o orifício de preenchimento estando alinhado com a câmara de preenchimento. Quando a primeira camada, segunda camada, e placa de microtitulação são posicionadas uma em relação a outra em suas posições operacionais, o líquido que entra no dispositivo através do orifício de preenchimento passará pela câmara de preenchimento, câmaras dosadoras, e em dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da respectiva placa de microtitulação. O método também envolve preencher o dispositivo com líquido, e descartar o líquido no dispositivo em dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da respectiva placa de microtitulação.
[41] A presente invenção descreve várias abordagens para detectar mutações, expressão, variantes de splicing, translocação, número de cópias e/ou mudanças da metilação em moléculas de ácido nucleico alvo usando reações de nuclease, ligase e polimerase. A presente invenção resolve os problemas da prevenção de carry over, assim como permite a multiplexação espacial para fornecer quantificação relativa, similar ao PCR digital. A referida tecnologia pode ser utilizada para a detecção precoce não invasiva do câncer, prognóstico não invasivo do câncer, e monitoramento da reocorrência do câncer a partir de amostras do plasma ou soro.
[42] A Figura 1 ilustra uma árvore lógica condicional para um teste para detecção precoce do câncer com base na análise de uma amostra de sangue do paciente.
[43] A Figura 2 ilustra um fluxograma para a análise de DNA, mRNA e miRNA a partir de cfDNA de plasma, exossomas e CTC.
[44] A Figura 3 ilustra a análise genérica de DNA, mRNA ou miRNA através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída e distribuída através de 24 tubos para PCR multiplexado ou PCR de transcriptase reversa seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[45] A Figura 4 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 3.
[46] A Figura 5 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 4.
[47] A Figura 6 ilustra o fluxograma para a análise de DNA a partir de cfDNA de plasma ou CTC.
[48] A Figura 7 ilustra a análise de DNA, através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída e distribuída através de 24 tubos para PCR multiplexado ou PCR de transcriptase reversa seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[49] A Figura 8 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 7.
[50] A Figura 9 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 8.
[51] A Figura 10 ilustra um fluxograma para a análise de mRNA ou miRNA a partir de exossomas de plasma e ilustra um fluxograma para a análise de DNA, mRNA e miRNA a partir de cfDNA, exossomas e CTC do plasma
[52] A Figura 11 ilustra a análise de mRNA or miRNA, através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída em série em 24 tubos para PCR de transcriptase reversa multiplexado seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[53] A Figura 12 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 11.
[54] A Figura 13 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 12.
[55] A Figura 14 ilustra o fluxograma para a análise genérica de DNA, mRNA ou miRNA através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída através de 24 tubos para PCR multiplexado ou PCR de transcriptase reversa seguido por LDR com sondas marcadas, para a captura mediada por estreptavidina em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[56] A Figura 15 ilustra a análise genérica de DNA, mRNA ou miRNA através da distribuição de 24 amostras, as quais foram inicialmente diluídas e distribuídas através de 24 tubos para PCR multiplexado ou PCR de transcriptase reversa seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[57] A Figura 16 ilustra a captura mediada por estreptavidina dos amplicons de PCR ou RT-PCR biotinilados nos poços de uma placa de microtitulação a partir da Figura 15.
[58] A Figura 17 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 16.
[59] A Figura 18 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de LDR-FRET em cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 17.
[60] A Figura 19 ilustra o fluxograma para a análise de DNA através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída através de 24 tubos para PCR multiplexado seguido por LDR com sondas marcadas, para a captura mediada por estreptavidina em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[61] A Figura 20 ilustra a análise de DNA através da distribuição de 24 amostras, as quais foram inicialmente diluídas e distribuídas através de 24 tubos para PCR multiplexado seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[62] A Figura 21 ilustra a captura mediada por estreptavidina dos amplicons de PCR ou RT-PCR biotinilados nos poços de uma placa de microtitulação a partir da Figura 20.
[63] A Figura 22 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 21.
[64] A Figura 23 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de LDR-FRET em cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 22.
[65] A Figura 24 ilustra o fluxograma para a análise de mRNA & miRNA através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída através de 24 tubos para PCR multiplexado seguido por LDR com sondas marcadas, para a captura mediada por estreptavidina em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[66] A Figura 25 ilustra a análise de mRNA ou miRNA, através da distribuição de uma amostra, a qual foi inicialmente diluída em série em 24 tubos para PCR de transcriptase reversa multiplexado seguido por LDR com sondas marcadas, em 24 x 16 fileiras de uma placa de microtitulação.
[67] A Figura 26 ilustra a captura mediada por estreptavidina dos amplicons de RT-PCR amplicons nos poços de uma placa de microtitulação a partir da Figura 25.
[68] A Figura 27 ilustra a adição de 16 conjuntos de iniciador de marcador diferentes através de 24 colunas de uma placa de microtitulação a partir da Figura 26.
[69] A Figura 28 ilustra um padrão de sinal hipotético gerado a partir da detecção em tempo real de LDR-FRET em cada poço na placa de microtitulação a partir da Figura 27.
[70] A Figura 29 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 6 a 48 moléculas distribuídas através de 24 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[71] A Figura 30 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 12 a 96 moléculas distribuídas através de 24 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[72] A Figura 31 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 12 a 96 moléculas distribuídas através de 48 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[73] A Figura 32 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 24 a 192 moléculas distribuídas através de 48 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[74] A Figura 33 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 1 a 8 moléculas distribuídas através de 8 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[75] A Figura 34 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 2 a 16 moléculas distribuídas através de 8 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[76] A Figura 35 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 4 a 32 moléculas distribuídas através de 8 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[77] A Figura 36 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 8 a 64 moléculas distribuídas através de 8 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[78] A Figura 37 ilustra uma simulação de uma distribuição de Poisson de 16 a 128 moléculas distribuídas através de 8 poços. Na parte superior está uma forma tabular do número de moléculas iniciais versus moléculas por poço. Na parte inferior está um histograma de # moléculas (x) versus # de poços (y).
[79] A Figura 38 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[80] A Figura 39 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[81] A Figura 40 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[82] A Figura 41 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[83] A Figura 42 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[84] A Figura 43 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[85] A Figura 44 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações.
[86] A Figura 45 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[87] A Figura 46 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[88] A Figura 47 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[89] A Figura 48 ilustra a reação de prevenção de transferência de nuclease-ligação-PCR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[90] A Figura 49 ilustra a reação de prevenção de transferência de nuclease-ligação-PCR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[91] A Figura 50 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[92] A Figura 51 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[93] A Figura 52 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[94] A Figura 53 ilustra a reação da prevenção de transferência de PCR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo.
[95] A Figura 54 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para identificar ou relativamente quantificar translocações no nível de mRNA.
[96] A Figura 55 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar translocações no nível de mRNA.
[97] A Figura 56 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar translocações no nível de mRNA.
[98] A Figura 57 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar translocações no nível de mRNA.
[99] A Figura 58 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para identificar ou relativamente quantificar a splicing alternativo.
[100] A Figura 59 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem.
[101] A Figura 60 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem.
[102] A Figura 61 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem.
[103] A Figura 62 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de nível baixo.
[104] A Figura 63 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de nível baixo.
[105] A Figura 64 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de nível baixo.
[106] A Figura 65 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para identificar ou relativamente quantificar a splicing alternativo.
[107] A Figura 66 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar o sítio inicial do transcrito alternativo e do tipo selvagem.
[108] A Figura 67 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar o sítio inicial do transcrito alternativo e do tipo selvagem.
[109] A Figura 68 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar o sítio inicial do transcrito alternativo e do tipo selvagem.
[110] A Figura 69 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar o baixo nível do sítio inicial do transcrito alternativo.
[111] A Figura 70 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar o baixo nível do sítio inicial do transcrito alternativo.
[112] A Figura 71 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar o baixo nível do sítio inicial do transcrito alternativo.
[113] A Figura 72 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para identificar ou relativamente quantificar a deleção de éxons
[114] A Figura 73 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (deleção de éxons).
[115] A Figura 74 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (deleção de éxons).
[116] A Figura 75 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (deleção de éxons).
[117] A Figura 76 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (deleção de éxons).
[118] A Figura 77 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (deleção de éxons).
[119] A Figura 78 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (deleção de éxons).
[120] A Figura 79 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para identificar ou relativamente quantificar a splicing alternativo com a inserção de íntrons.
[121] A Figura 80 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (inserção de íntrons).
[122] A Figura 81 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (inserção de íntrons).
[123] A Figura 82 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo e do tipo selvagem (inserção de íntrons).
[124] A Figura 83 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (inserção de íntrons).
[125] A Figura 84 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (inserção de íntrons).
[126] A Figura 85 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar transcritos de splicing alternativo de baixo nível (inserção de íntrons).
[127] A Figura 86 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para enumerar o número de cópias de DNA.
[128] A Figura 87 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para enumerar o número de cópias de DNA.
[129] A Figura 88 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com a detecção FRET para enumerar o número de cópias de DNA.
[130] A Figura 89 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para enumerar o número de cópias de RNA.
[131] A Figura 90 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para enumerar o número de cópias de RNA.
[132] A Figura 91 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para enumerar o número de cópias de RNA.
[133] A Figura 92 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[134] A Figura 93 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[135] A Figura 94 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[136] A Figura 95 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[137] A Figura 96 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[138] A Figura 97 ilustra a reação da prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[139] A Figura 98 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção Taqman para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[140] A Figura 99 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR com a detecção UniTaq para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[141] A Figura 100 ilustra a reação da prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-qLDR com a detecção FRET para identificar ou relativamente quantificar miRNA.
[142] A Figura 101 ilustra as dimensões de uma versão de uma placa de microtitulação com 384 poços comercialmente disponível.
[143] A Figura 102 ilustra as dimensões de uma outra versão de uma placa de microtitulação com 384 poços comercialmente disponível.
[144] A Figura 103 mostra uma vista superior e lateral de uma configuração típica de placa de microtitulação com 384 poços.
[145] A Figura 104 mostra uma vista em perspectiva de uma configuração típica de placa de microtitulação com 384 poços.
[146] A Figura 105 ilustra uma vista superior e lateral da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[147] A Figura 106 ilustra uma vista em perspectiva explodida da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[148] A Figura 107 ilustra uma vista superior e lateral das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[149] A Figura 108 ilustra uma vista em perspectiva explodida das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[150] A Figura 109 ilustra uma vista superior e lateral das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[151] A Figura 110 ilustra uma vista em perspectiva explodida das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[152] A Figura 111 ilustra uma vista superior e lateral das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[153] A Figura 112 ilustra uma vista em perspectiva explodida das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras posicionado acima de vários poços de uma placa de microtitulação.
[154] A Figura 113 ilustra uma vista superior e lateral das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[155] A Figura 114 ilustra uma vista em perspectiva explodida das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[156] A Figura 115 ilustra uma vista superior e lateral das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[157] A Figura 116 ilustra uma vista em perspectiva explodida das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[158] A Figura 117 ilustra uma vista superior e lateral das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[159] A Figura 118 ilustra uma vista em perspectiva explodida das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que utiliza um orifício de preenchimento alternativo para preencher com pressão os canais e câmaras dosadoras de cada fileira de uma placa de microtitulação.
[160] A Figura 119 ilustra uma vista superior e lateral da camada intermediária na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[161] A Figura 120 ilustra uma vista em perspectiva explodida da camada intermediária na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[162] A Figura 121 ilustra uma vista superior e lateral das primeiras e intermediárias camadas na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[163] A Figura 122 ilustra uma vista em perspectiva explodida das primeiras e intermediárias camadas na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[164] A Figura 123 ilustra uma vista superior e lateral das terceiras, primeiras e intermediárias camadas na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[165] A Figura 124 ilustra uma vista em perspectiva explodida das terceiras, primeiras e intermediárias camadas na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[166] A Figura 125 ilustra uma vista superior e lateral das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas na lateral de saída de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[167] A Figura 126 ilustra uma vista em perspectiva explodida das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas na lateral de saídade um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira de uma placa de microtitulação.
[168] A Figura 127 ilustra uma vista superior e lateral da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[169] A Figura 128 ilustra uma vista em perspectiva explodida da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[170] A Figura 129 ilustra uma vista superior e lateral das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[171] A Figura 130 ilustra uma vista em perspectiva explodida das primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[172] A Figura 131 ilustra uma vista superior e lateral das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[173] A Figura 132 ilustra uma vista em perspectiva explodida das terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[174] A Figura 133 ilustra uma vista superior e lateral das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[175] A Figura 134 ilustra uma vista em perspectiva explodida das segundas, terceiras, primeiras e intermediárias camadas de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira a partir das laterais de uma placa de microtitulação.
[176] A Figura 135 ilustra uma vista superior e lateral da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[177] A Figura 136 ilustra uma vista em perspectiva explodida da camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[178] A Figura 137 ilustra uma vista superior e lateral de uma primeira região da primeira camada e a camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[179] A Figura 138 ilustra uma vista em perspectiva explodida da primeira região da primeira camada e a camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[180] A Figura 139 ilustra uma vista superior e lateral da primeira e segunda regiões da primeira camada e a camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[181] A Figura 140 ilustra uma vista em perspectiva explodida da primeira e segunda regiões da primeira camada e a camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[182] A Figura 141 ilustra uma vista superior e lateral da terceira camada, primeira camada (com a primeira e segunda regiões), e camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[183] A Figura 142 ilustra uma vista em perspectiva explodida da terceira camada, primeira camada (com a primeira e segunda regiões), e camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[184] A Figura 143 ilustra uma vista superior e lateral da segunda camada, terceira camada, primeira camada (com a primeira e segunda regiões), e camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[185] A Figura 144 ilustra uma vista em perspectiva explodida da segunda camada, terceira camada, primeira camada (com a primeira e segunda regiões), e camada intermediária de um dispositivo de dispersão de amostras que independentemente encaminha cada fileira e cada coluna de uma placa de microtitulação.
[186] A Figura 145 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[187] A Figura 146 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura UniTaq para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[188] A Figura 147 ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com leitura FRET para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[189] A Figura 148 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[190] A Figura 149 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura UniTaq para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[191] A Figura 150 ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com leitura FRET para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[192] A Figura 151 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[193] A Figura 152 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR com leitura UniTaq para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[194] A Figura 153 ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR com leitura FRET para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[195] A Figura 154 ilustra a reação de prevenção de transferência de alça-PCR-LDR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar alvo(s) e/ou mutações de baixo nível.
[196] A Figura 155 ilustra uma reação de prevenção de transferência de alça-PCR-qLDR com leitura FRET para identificar ou relativamente quantificar mutações de nível baixo.
[197] A Figura 156 ilustra a reação de prevenção de transferência de alça-PCR-LDR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[198] A Figura 157 ilustra a reação de prevenção de transferência de alça-PCR-qLDR com leitura FRET para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[199] A Figura 158 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qPCR com leitura Taqman para identificar ou relativamente quantificar a metilação alvo de baixo nível.
[200] A Figura 159 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação BRAF V600E em um excesso de DNA do tipo selvagem.
[201] A Figura 160 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação BRAF V600E.
[202] A Figura 161 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação BRAF V600E na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem a partir de plasma.
[203] A Figura 162 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação TP53 R248Q na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[204] A Figura 163 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação TP53 R248Q na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[205] A Figura 164 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação TP53 R248Q na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[206] A Figura 165 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação TP53 R248Q na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem a partir de plasma.
[207] A Figura 166 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação KRAS G12C na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[208] A Figura 167 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação KRAS G12S na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[209] A Figura 168 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação KRAS G12C na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem a partir de plasma.
[210] A Figura 169 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação KRAS G12D na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[211] A Figura 170 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação KRAS G12A na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[212] A Figura 171 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a mutação KRAS G12V na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem.
[213] A Figura 172 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas da mutação KRAS G12V na presença de um excesso de DNA do tipo selvagem no plasma.
[214] A Figura 173 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR para detectar a presença ou ausência de metilação do gene Vimentin.
[215] A Figura 174 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos nos experimentos PCR-LDR-qPCR pixel para enumerar moléculas únicas de DNA metilado na presença de um excesso de DNA não metilado (hgDNA).
[216] A Figura 175 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos no experimento para detectar a metilação do filamento superior VIM_S3, usando a versão da sonda "A" Taqman.
[217] A Figura 176 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos no experimento para detectar a metilação do filamento inferior VIM S3, usando a versão da sonda "A" Taqman.
[218] A Figura 177 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos no experimento para detectar a metilação do filamento superior VIM S3, usando a versão da sonda "B" Taqman.
[219] A Figura 178 ilustra os gráficos de amplificação de PCR em tempo real obtidos no experimento para detectar a metilação do filamento inferior VIM S3, usando a versão da sonda "B" Taqman.
[220] O teste de detecção de doença precoce mais econômico pode combinar um ensaio de amplificação e ligação acoplado multiplexado inicial para determinar a "carga da doença". Para a detecção do câncer, isto alcançaria sensibilidade > 95% para todos os cânceres (pan-oncologia), em especificidade > 97%. Um fluxograma para um ensaio de carga tumoral cancerosa é ilustrado na Figura 1. Um ensaio inicial de rastreio PCR/LDR multiplexado que classifica para mutação, metilação, miRNA, mRNA, splicing alternativo e translocações identifica aquelas amostras com > 5 de 24-48 marcadores positivos. As amostras positivas presumíveis são então testadas usando PCR/LDR "pixel" com marcadores específicos de tecido adicionais para validar o resultado inicial, e identificar o tecido de origem. O medico pode então solicitor sequenciamento direcionado para orientar adicionalmente as decisões de tratamento para o paciente.
[221] A presente invenção se refere a uma abordagem diagnostic universal que busca combinar as melhores características da reação em cadeia da polimerase digital (PCR), reação de detecção da ligação (LDR), e detecção quantitativa de múltiplos marcadores de doença, por exemplo, marcadores de câncer. A família da arquitetura e dispositivos do ensaio compreende três módulos para quantificação PCR-LDR de marcadores de doença pouco abundantes a partir do sangue. Cada módulo pode ser otimizado de forma independente, e pode ser manual, semi-automatizado ou totalmente automatizado. O design possibilita integrar os módulos em conjunto, de tal forma que qualquer módulo possa ser otimizado de forma independente para possibilitar desempenho melhorado para o ensaio completo.
[222] A primeira família de designs de ensaio se baseia emu ma amplificação PCR ou RT-PCR inicial multiplexada seguida por LDR multiplexada usando sondas de LDR que têm marcadores sequenciais únicos contendo porções iniciador-específicas. Os produtos são distribuídos e misturados com conjuntos de iniciador marcador com sondas TaqMan™ alvo-dirigidas, ou alternativamente com conjuntos de iniciador UniTaq, e os ácidos nucleicos alvo iniciais quantificados usando PCR em tempo real
[223] O primeiro módulo coleta uma amostra inicial de sangue, e separa o plasma dos glóbulos vermelhos (RBCs) e glóbulos brancos (WBCs). Ele seára novamente o plasma para remover quaisquer células residuais. Além disso, as frações celulares contendo todos os WBCs e células de tumor circulantes (CTCs) e alguns RBCs são separados. Os exossomas são separados ou capturados por afinidade do plasma. O módulo purifica (i) RNA a partir da fração de WBC e CTC, (ii) miRNA e RNA de exossomas, e (iii) DNA livre de células (cfDNA) a partir do plasma.
[224] O segundo módulo possibilita a distribuição dos componentes acima em 24 ou 48 câmaras ou poços para multiplexação espacial com amplificação PCR ou RT-PCR multiplexada proporcional de regiões direcionadas de gene, promotor, miRNA ou mRNA. Isto inclui: (i) variante de splicing específico ou mRNAs da fusão do gene na CTC contendo fração de WBC, (ii) miRNAs específicos a partir de exossomas, (iii) mRNAs específicos a partir de exossomas, (iv) regiões de DNA do gene do câncer específicas a partir de cfDNA, e (v) regiões de promotor específico (metilado) a partir de cfDNA.
[225] O terceido módulo permite a distribuição especial dos produtos acima em poços de uma placa de microtitulação, por exemplo, em uma configuração 24 x 16 ou 48 x 32. Este módulo permite a detecção e a enumeração de produtos de LDR usando PCR em tempo real para prover resultados quantitativos para cada marcador de doença.
[226] O primeiro e o segundo módulos podem ser configurados para processor múltiplas amostras simultaneamente para o modo de ensaio do rastreio, onde os produtos de LDR contendo marcadores sequenciais proveem resultados quantitativos relativos usando leitura de PCR em tempo real (veja a Figura 2). Nesta configuração, DNA e RNA isolados a partir de várias frações sanguíneas a partir de 24 amostras individuais são submetidos a PCR-LDR e RT-PCR-LDR multiplexados, depois distribuídos para baixo na coluna, por exemplo, 16 poços na placa de microtitulação conforme ilustrado na Figura 3. Conjuntos de iniciador marcador com sondas TaqMan™ alvo-dirigidas, ou alternativamente com conjuntos de iniciador UniTaq são adicionados ao longo das fileiras conforme mostrado na Figura 4, permitindo PCR em tempo real (Figura 5). Nesta ilustração, as amostras #2 & #15 têm forte sinal nas posições >5, assim são consideradas potencialmente positivas (falta a verificação adicional conforme descrito logo abaixo), enquanto que a amostra #8 com 4 sinais fracos também deve ter elaboração adicional.
[227] os dois módulos também podem ser configurados para procesar uma única amostra, com a multiplexação especial permitindo "pixel" PCR/LDR, onde os Produtos de LDR permitem a enumeração das moléculas de alvo original. Isto é análogo ao PCR digital, porém em um nível mais alto de multiplexação (veja a Figura 6). Nesta configuração, o DNA e RNA a partir de uma única amostra são distribuídos em 24 câmaras antes do PCR-LDR multiplex conforme mostrado na Figura 7. Nesta modalidade, algumas câmaras têm uma ou nenhuma molécula alvo. Depois da multiplexação, os produtos de LDR são distribuídos para baixo na coluna, por exemplo, 16 poços na placa de microtitulação (Figura 7). Conjuntos de iniciador marcador com sondas TaqMan™ alvo-dirigidas, ou alternativamente conjuntos de iniciador UniTaq, são adicionados ao longo das fileiras (veja a Figura 8), permitindo PCR em tempo real (veja a Figura 9). Os resultados são interpretados com base na distribuição de Poisson de valor Ct representando um múltiplo integral de uma molécula única na mistura original, isto é, 0, 1, 2 etc. As Figuras 29 e 30 mostram uma distribuição de Poisson de 6 a 48 e 12 a 96 moléculas em 24 poços, respectivamente, e as Figuras 31 e 32 mostram uma distribuição de Poisson de 12 a 96 e 24 a 192 moléculas em 48 poços, respectivamente. Figura 9, fileira A mostra (# direções: # molécula alvo inicial) de (17:0; 6:1; 1:2), que corresponde a 8 moléculas. Figura 9, fileira K mostra (7:0; 10:1; 5:2; 2:4), que corresponde a cerca de 30 moléculas.
[228] Uma forma diferente de diluição e distribuição pode ser usada para enumerar moléculas sobre uma faixa mais ampla, conforme ilustrado para a quantificação de miRNA ou mRNA nas Figuras 10 - 13. Aqui, a amostra inicial é distribuída em 8 câmaras, diluída 10 vezes e distribuída em outras 8 câmaras, etc. (veja a Figura 11). As amostras são submetidas a RT-PCR e LDR multiplexado, e os produtos de LDR são individualmente distribuídos para baixo na coluna (Figura 11). Conjuntos de iniciador marcador com sondas TaqMan™ alvo-dirigidas, ou alternativamente conjuntos de iniciador UniTaq, são adicionados ao longo das fileiras (veja a Figura 12), permitindo PCR em tempo real e detecção (veja a Figura 13). Para o exemplo de 24 câmaras, isto pode quantificar através de 3 ordens de magnitude, porém através de 48 câmaras, ele pode cobrir 6 ordens de diferenças de magnitude. As Figuras 33-37 mostram as distribuições de Poisson de 1 a 128 moléculas em 8 poços. No exemplo ilustrado na Figura 13, fileira G, as primeiras duas diluições proporcionam maior sinal do que os últimos 8 poços (1:0; 3:1; 3:2; 1:4), que corresponde a cerca de 14-16 x 100 x 1.25 = 1,750 a 2,000 moléculas. Em contraste, a fileira N da Figura 13 proporciona sinal apenas na primeira distribuição de 8 poços (4:0; 3:1; 1:2), que corresponde a cerca de 5-6 x 1.25 = 6 a 8 moléculas.
[229] A segunda família de designs do ensaio é baseada na amplificação PCR ou RT-PCR multiplexada inicial seguida pela distribuição e captura de alvos amplificados por PCR nos poços de uma placa de microtitulação. Um único ciclo de LDR permite a captura de produtos de LDR no salvos corretos no suporte sólido, enquanto ligações malfeitas são descartadas. Os produtos de LDR são quantificados, seja através de LDR-FRET, PCR em tempo real, ou outros sistemas reporter.
[230] O primeiro módulo coleta uma amostra inicial de sangue, e separa CTCs caso presentes, separa plasma das células sanguíneas, e exossomas do plasma, e depois purifica (i) DNA e RNA a partir de CTCs caso presentes, (ii) miRNA e RNA a partir de exossomas, e (iii) cfDNA a partir do plasma.
[231] O segundo módulo permite a distribuição dos components acima em 24 ou 48 câmaras ou poços para multiplexação especial com amplificação PCR ou RT-PCR proporcional multiplexada de regiões direcionadas de gene, promotor, miRNA ou mRNA. Estes incluem: (i) regiões cromossômicas específicas para enumeração do número de cópias a partir de CTC’s, (ii) variante de splicing específico ou mRNAs da fusão de gene a partir de CTC’s, (iii) miRNAs específicos a partir de exossomas, (iv) mRNAs específicos a partir de exossomas, (v) regiões de DNA do gene de câncer específicas a partir de cfDNA, e (vi) regiões promotoras específicas (metiladas) a partir de cfDNA.
[232] O terceiro módulo permite a distribuição especial dos produtos acima para baixo na coluna, por exemplo, 16 poços na placa de microtitulação, seguido pela captura do alvo amplificado no suporte sólido, por exemplo, em uma configuração 24 x 16 ou 48 x 32. Este módulo permite a captura de produtos de LDR no suporte sólido, seguido pela detecção e enumeração de produtos de LDR para prover resultados quantitativos para cada marcador.
[233] O primeiro e o segundo módulos podem ser configurados para processar múltiplas amostras simultaneamente para o modo de ensaio de rastreio, em que os produtos de LDR proveem resultados quantitativos relativos, análogos a leitura do PCR em tempo real (veja visão geral esquemática da Figura 14). Nesta configuração, DNA e RNA isolados a partir de várias frações de sangue a partir de 24 amostras individuais são submetidos a PCR e RT-PCR multiplexado, depois distribuídos para baixo na coluna, por exemplo, 16 poços na placa de microtitulação, e capturados no suporte sólido (veja as Figuras 15 e 16). As sondas de LDR são adicionadas ao longo das fileiras, e a ligação em alvo correto captura o produto enquanto o iniciador não reagido é descartado (Figura 17). Os resultados de LDR-FRET ilustrados na Figura 18 são mostrados em seus respectivos poços, embora neste módulo, os produtos também possam ser seletivamente desnaturados e enumerados usando eletroforese capilar para prover resultados quantitativos. Nesta ilustração (Figura 18), as amostras #2 & 15 têm forte sinal nas posições >5, são assim presumíveis positivas, enquanto a amostra 8 com 4 sinais fracos também devem ter elaboração adicional.
[234] Os dois módulos também podem ser configurados para processar uma única amostra, com a multiplexação espacial permitindo PCR/LDR "pixel", em que os produtos de LDR permitem a enumeração das moléculas alvo originais, análogas ao PCR digital, porém em um nível mais alto de multiplexação (Figura 19). Nesta configuração, o DNA e RNA a partir de uma única amostra são distribuídos em 24 câmaras antes do PCR multiplex (Figura 20), de forma que algumas câmaras tenham uma ou nenhuma molécula alvo. Os amplicons são distribuídos para baixo na coluna, por exemplo, 16 poços na placa de microtitulação, e capturados no suporte sólido (Figuras 20 e 21). A adição da sonda de LDR e a detecção do produto de LDR são como acima (Figuras 22 e 23). Os resultados são interpretados com base na distribuição de Poisson do valor de LDR representando um múltiplo integral de uma molécula única na mistura original, isto é, 0, 1, 2 etc. As Figuras 29 e 30 mostram a distribuição de Poisson de 6-48 e 12-96 moléculas em 24 poços, respectivamente, e as Figuras 31 e 32 mostram a distribuição de Poisson de 12-96 e 24-192 moléculas em 48 poços, respectivamente. Figura 23, fileira A mostra (# direções: # molécula alvo inicial) de (17:0; 6:1; 1:2), que corresponde a 8 moléculas. Figura 23, fileira K mostra (7:0; 10:1; 5:2; 2: 4), que corresponde a cerca de 30 moléculas.
[235] Uma diferente forma de diluição e distribuição pode ser usada para enumerar moléculas sobre uma faixa mais ampla, conforme ilustrado para a quantificação de miRNA ou mRNA nas Figuras 24 - 28. Aqui, a amostra inicial é distribuída em 8 câmaras, diluídas 10 vezes e distribuídas em outras 8 câmaras, etc. (Figura 25). As amostras são submetidas a RT-PCR multiplex e distribuídas para baixo na coluna. Os produtos de RT-PCR são capturados em um suporte sólido (Figura 26) e os iniciadores de LDR são adicionados ao longo das fileiras (veja a Figura 27). Para o exemplo de 24 câmaras, isto pode quantificar através de 3 ordens de magnitude, porém através de 48 câmaras, ela pode cobrir 6 ordens de diferenças de magnitude (veja as distribuições de Poisson das Figuras 33-37). No exemplo ilustrado na Figura 28, fileira G, as primeiras duas diluições proporcionam maior sinal do que os últimos 8 poços (1:0; 3:1; 3:2; 1:4), que corresponde a cerca de 14-16 x 100 x 1.25 = 1,750 a 2,000 moléculas. Em contraste, a Figura 28, fileira N proporcionou sinal apenas na primeira distribuição de 8 poços (4:0; 3:1; 1:2), que corresponde a cerca de 5-6 x 1.25 = 6 a 8 moléculas.
[236] Há um desafio técnico para se distinguir o verdadeiro sinal gerado a partir das diferenças de ácido nucleico específicas da doença desejada vs. falso sinal gerado a partir de ácidos nucleicos normais presentes na amostra vs. falso sinal gerado na ausência das diferenças de ácido nucleico específico da doença (isto é, mutações somáticas).
[237] Várias soluções para esses desafios são apresentadas abaixo, porém elas compartilham alguns temas comuns.
[238] O primeiro tema é multiplexação. PCR funciona melhor quando a concentração do iniciador é relativamente alta, de 50nM a 500nM, limitando a multiplexação. Além disso, quanto mais pares de iniciador de PCR adicionados, as chances de amplificação de produtos incorretos ou criar dímeros do iniciador aumentam exponencialmente. Em contraste, para as sondas de LDR, baixas concentrações na ordem de 4nM a 20nM são usadas, e dímeros de sonda são limitados pela necessidade de hibridização adjacente no alvo para permitir um evento de ligação. O uso de concentrações baixas dos iniciadores de PCR específicos do gene ou sondas de LDR contendo "terminações" de sequência do iniciador universal permite a adição subsequente de maiores concentrações de iniciadores universais para alcançar amplificação proporcional do PCR inicial ou de produtos de LDR. Um outro modo de evitar ou minimizar os falsos amplicons de PCR ou dímeros de iniciador é usar iniciadores de PCR contendo algumas bases extras e um grupo bloqueador, que é liberado para formar um 3’OH livre através de clivagem com uma nuclease apenas quando hibridizado no alvo, por exemplo, uma base de ribonucleotídeo como o grupo bloqueador e RNase H2 como a nuclease de clivagem.
[239] O segundo tema é sobre flutuações no sinal devido a baixos ácidos nucleico alvos iniciais. Frequentemente, o ácido nucleico alvo originado a partir de poucas células, seja capturado como CTCs, ou a partir de células tumorais que sofreram apoptose e liberaram seu DNA como pequenos fragmentos (140 - 160 bp) no soro. Sob tais condições, é preferível realizar algum nível de amplificação proporcional para evitar perder o sinal totalmente ou relatar número de cópias impreciso devido a flutuações quando se distribui pequenos números de moléculas iniciais em poços individuais (para quantificação de PCR em tempo real, ou quantificação de PCR em gotículas). À medida que essas amplificações universais iniciais são mantidas em um nível razoável (aproximadamente 12 a 20 ciclos), o risco de contaminação transferência durante a abertura do tubo e a distribuição de amplicons para detecção/quantificação subsequente (usando PCR em tempo real ou de gotículas) é minimizado.
[240] O terceiro tema é sobre o sinal independente de alvo, também conhecido como "sem controle de Modelo" (NTC). Isto aparece tanto a partir das reações de polimerase quanto ligase que ocorrem na ausência do alvo correto. Algum deste sinal pode ser minimizado pelo design ponderado do iniciador. Para as reações de ligação, a atividade da nuclease da polimerase 5’^ 3’ pode ser usada para liberar o fosfato 5’ do iniciador de ligação a jusante (apenas quando hibridizado no alvo), para que seja adequado para a ligação. A especificidade adicional para distinguir a presença de mutação em baixo nível pode ser alcançada ao: (i) usar sondas de LDR a jusante contendo uma incompatibilidade na 2a ou 3a posição a partir de 3’OH, (ii) usar sondas de LDR na sequência do tipo selvage que (opcionalmente) ligam porém não sofrem amplificação adicional, e (iii) usar sondas de LDR a jusante contendo algumas poucas bases extras e um grupo bloqueador, que é liberado para formar um 3’OH livre através da clivagem com uma nuclease apenas quando hibrizidaza no alvo complementar (por exemplo, RNase H2 e uma base de ribonucleotídeo).
[241] O quarto tema é tanto a amplificação suprimida (reduzida) quanto a amplificação incorreta (falsa) devido a iniciadores não usados na reação. Uma abordagem para eliminar os referidos iniciadores não usados é capturar o DNA genômico ou alvo ou amplificado alvo em um suporte sólido, permitir que as sondas de ligação se hibridizem e se liguem e depois remover sondas ou produtos que não estão hibridizados. As soluções alternativas incluem a pré-amplificação, seguida pelas etapas de LDR e/ou PCR, de modo que haja um segundo nível de seleção no processo.
[242] O Quinto tema é sobre a prevenção de transferência. O sinal de transferência pode ser eliminado através de incorporação padrão de uracil durante a etapa de amplificação universal, e uso de UDG (e opcionalmente AP endonuclease) no procedimento de elaboração da pré-amplificação. A incorporação da prevenção de transferência é central para os métodos da presente invenção conforme descrito em maiores detalhes abaixo. A amplificação de PCR inicial é realizada usando a incorporação de uracil. A reação de LDR é realizada com sondas de LDR sem uracil. Sendo assim, quando os produtos de LDR são submetidos a quantificação de PCR em tempo real, a adição de UDG destrói os produtos de PCR iniciais, mas não os produtos de LDR.Além disso, já que LDR é um processo linear e os iniciadores marcadores usam sequências ausentes do genoma humano, a transferência acidental de produtos de LDR de volta ao PCR original não causará amplificação independente de modelo. Os esquemas adicionais para prover a prevenção de transferência com alvos metilados incluem o uso de endonucleases de restrição antes da amplificação ou depois do tratamento com bissulfito caso se use a última abordagem conforme descrita infra.
[243] Um primeiro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados. Este método envolve fornecer uma amostra contendo potencialmente uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra. Um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário comprendendo(a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência adjacente à sequência nucleotídica alvo, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. O método também envolve misturar os produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica da sequência nucleotídica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica da sequência nucleotídica, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, adjacentes uma a outra em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário com uma junção entre elas. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligadas na amostra são detectadas e distinguidas para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópia, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
[244] As Figuras 38-44 ilustram várias modalidades deste aspect da presente invenção.
[245] A Figura 38 (etapas A-F) ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar mutações de cfDNA ou genômico. Este método inicia ao se isolar DNA genômico ou DNA livre de células (cfDNA) conforme mostrado na etapa A. Conforme mostrado na Figura 38 (etapa B), a amostra de DNA é tratada com uma enzima capaz of digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra. As enzimas adequadas incluem, sem limitação, uracil DNA glicolase (UDG) de E. coli, UDG Antártico Temolábil ou uracil DNA glicosilase monofuncional seletivo de filamento único humano (hSMUG1). A amostra é então submetida a uma reação de amplificação, por exemplo, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a mutação contendo regiões de interesse. A reação de amplificação é realizada usando usando iniciadores sítio-específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Em uma modalidade, a amplificação de ciclos limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 2040 ciclos. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 38, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[246] Conforme mostrado na Figura 38 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. A sonda oligonucleotídica a montante contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) e a sonda oligonucleotídica a montante contém a porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que permite a amplificação subsequente do produto de ligação. Em seguida à ligação, os produtos de ligação são colocados em alíquotas em poços separados contendo um ou mais pares de iniciador marcador-específicos, cada par compreendendo iniciadores compatíveis Ai e Ci, tratados com UDG ou enzima similar para remover dU contendo produtos de amplificação ou contaminantes, amplificados com PCR e detectados. Conforme mostrado nas Figuras 38, etapas E & F, a detecção do produto de ligação pode ser realizada usando ensaio de detecção TaqMan™ tradicional (veja a Patente Norte-Americana N° 6,270,967 de Whitcombe et al., e Patente Norte-Americana N° 7,601,821 de Anderson et al., as quais são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade). Para a detecção usando TaqMan™, uma sonda oligonucleotídica transpondo a junção de ligação é usada em conjunto com iniciadores adequados para a hibridização nas porções iniciador-específicas dos produtos de ligação para amplificação e detecção. A sonda TaqMan™ contém um grupo reporter fluorescente em uma extremidade (F1) e uma molécula supressora (Q) na outra extremidade que estão em estreita proximidade uma da outra na sonda intacta que a molécula supressora suprime a fluorescência do grupo reporter. Durante a amplificação, a sonda TaqMan™ e o iniciador a montante se hibridizam em suas regiões complementaresdo produto de ligação. A atividade da nuclease 5’^ 3’ da polimerase estende o iniciador hibridizado e libera o grupo fluorescente da sonda TaqMan™ para gerar um sinal detectável (Figura 38, etapa F). O uso de dUTP durante a reação de amplificação gera produtos contendo dU, o que pode ser subsequentemente destruído ao usar UDG para a prevenção de transferência.
[247] A Figura 39 ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar mutações de cfDNA ou genômico. Este método inicia ao se isolar DNA genômico ou DNA livre de células (cfDNA) conforme mostrado na etapa A. Conforme mostrado na Figura 39, etapa B, a amostra de DNA é tratada com uma enzima para digerir desoxiuracil (dU), tal como UDG, para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra, e depois submeter a uma reação de amplificação, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a mutação contendo regiões de interesse. A reação de amplificação é realizada usando iniciadores sítio-específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que incluidUTP. Em uma modalidade, a amplificação de ciclos limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 2040 ciclos. Nesta modalidade, os iniciadores sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permite uma amplificação de PCR universal subsequente usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma 5’ biotina aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 39, etapa B).
[248] Conforme mostrado na Figura 39, etapa C, os produtos de amplificação incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência, e são capturados em um suporte sólido através da porção da 5’ biotina anexada. A mutação de interesseis detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 39, etapa D. Nesta modalidade, a primeira sonda de ligação contém uma região 3’ alvo- específica e uma sequência 5’ de terminação com uma porção doadora e aceptora e a segunda sonda de ligação em um conjunto de sonda contém uma região 5’ alvo-específica e uma sequência de terminação 3’ com uma porção aceptora ou doadora, respectivamente. As sequências de terminação 5’ e 3’ das sondas de ligação em um conjunto de sonda são complementares uma a outra e os grupos aceptores e doadores são capaze de gerar um sinal detectável através da transferência de energia por ressonância Forster (FRET) quando colocadas em estreita proximidade uma da outra. Em seguida à ligação, as sondas oligonucleotídicas não ligadas são descartadas, e o produto de ligação é desnaturado a partir dos produtos de amplificação imobilizados. Mediante a desnaturação (Figura 39, etapa E), as sequências de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando os grupos doador e aceptor em estreita proximidade um do outro para gerar um sinal FRET detectável.
[249] Os produtos de ligação formados de acordo com este aspecto da presente invenção podem ser can be distinguidos usando uma alternativa à detecção FRET. Por exemplo, a sonda a jusante pode conter um grupo repórter fluorescente na extremidade 5’ seguido pela porção da sequência de terminação, um grupo de supressão (por exemplo, ZEN), e a porção alvo-específica conforme mostrado na Figura 39, etapa F. Aa forma de filamento único, o grupo fluorescente é suprimido pelo grupo Zen. Mediante a ligação das sondas de ligação a jusante e a montante e a desnaturação do produto de ligação resultante, as porções de terminação complementares 5’ e 3’ do produto de ligação se hibridizam para formar uma porção curta de filamento duplo. Nesta formação, o grupo reporter não é mais suprimido pelo grupo de supressão e um sinal detectável é produzido.
[250] A Figura 39 ilustra a abordagem de superfície revestida com estreptavidina do iniciador universal biotinilado para capturar produtos de extensão em um suporte sólido. A referida captura pode ocorrer antes ou de forma subsequente à etapa de ligação. Outras abordagens para ligar o produto ao suporte sólido incluem anexar covalentemente uma porção da maior parte do iniciador universal ao suporte sólido antes da amplificação por PCR.
[251] Além da captura de produtos de extensão da polymerase usando biotina-estreptavidina, os iniciadores podem ser designados para incluir uma sequência de captura na extremidade 5’, um grupo de bloqueio da extensão da polimerase e uma porção alvo-específica na extremidade 3’. Depois da amplificação, a porção da sequência de captura 5’ dos produtos será de filamento único, e ela é uma sequência longa e/ou GC rica, ela pode ser capturada em uma sequência complementar sob condições que permitem a desnaturação do filamento não capturado, ou a remoção por clivagem, por exemplo, clivagem lambda exonuclease. A etapa de captura pode ser aumentada com o uso de PNA, LNA ou outros análogos de nucleotídeo dentro do iniciador, sequência iniciadora de captura ou ambos.
[252] Em uma outra modalidade, o iniciador pode ser anexado covalentemente à superfície sólida usando Dibenzociclooctila (DBCO) para reação química "click" livre de cobre (a uma azida); 5-Octadiinila dU para a reação química "click" (a uma azida); modificador amino C6 dT (para ligação peptídica); ou Azida, para reação química "click" a um alqueno ou DBCO.
[253] A Figura 40 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar mutações. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 40, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra. Nesta modalidade, a amplificação inicial é realizada usando iniciadores de PCR sítio-específicos que contêm um grupo de bloqueio clivável em suas extremidades 3’. O grupo de bloqueio prevents extensão e amplificação de polimerase não alvo-específica. Conforme mostrado na Figura 40, etapa B, um grupo de bloqueio adequado é uma Base RNA (r) que é clivada por RNase-H (símbolo de estrela) apenas mediante a hibridização do iniciador em sua sequência complementar (veja, por exemplo, Dobosy et. al. "RNase H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primers," BMC Biotechnology 11(80): 1011 (2011), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). A clivagem da Base RNA libera um 3’OH adequado para a extensão através de polimerase.
[254] Em seguida à clivagem dos grupos de bloqueio do iniciador, a região de interesse é amplificada e o produto de PCR contém dU que permite a prevenção de transferência (Figura 40, etapa C). Sondas oligonucleotídicas alvo-específicas contendo marcadores de iniciador (Ai e Ci’) são então hibridizadas aos produtos amplificados de uma forma específica para base, e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar (Figura 40, etapa D). Os produtos de ligação são detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligaçãoconforme descrito na Figura 38 (veja a Figura 40, etapas E-F).
[255] A Figura 41 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exempificadoa para detectar mutações. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 41, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 41, etapa B). A região de interesse é amplificada usando iniciadores sítio-específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Em uma modalidade, a amplificação de ciclos limitada (1220 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 41, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[256] Conforme mostrado na Figura 41 etapa D, sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contéma porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequentedo produto de ligação, enquanto que a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a sequência de ácido nucleico do tipo selvagem (não mutada) não contém a porção 5’ iniciador-específica. A sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutantes e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permitem a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidadepode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 41, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito na Figura 38 (veja a Figura41, etapas E-G), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[257] A Figura 42 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar mutações.DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 42, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 42, etapa B). A região de interesse é amplificada usando iniciadores sítio- específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Nesta modalidade, os iniciadores sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais. As referidas sequências permitem uma amplificação de PCR subsequente universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 42, etapa B). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 42, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capaz de detectar a sequência de ácido nucleico (mas não a sequência do tipo selvagem) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo, espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 42, etapa D). Em seguida à ligação (Figura 42, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 42, etapa F).
[258] A Figura 43 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar mutações. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 43, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 43, etapa B). A região de interesse é amplificada usando iniciadores sítio- específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Nesta modalidade, os iniciadores sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais. Essas regiões possibilitam uma amplificação de PCR subsequente universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 43, etapa B). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 43, etapa D. Nesta modalidade, as sondas oligonucleotídicasde um conjunto de sonda são designadas de tal modo que a base 3’-most da primeira sonda oligonucleotídica é sobreposta pela base 5’-most flanqueadora da segunda sonda oligonucleotídica que é complementar à molécula de ácido nucleico alvo conforme mostrado na Figura 43, etapa D. O nucleotídeo sobreposto é referido como um "flap". Quando o nucleotídeo "flap" sobreposto da segunda sonda oligonucleotídica é complementar to the sequência da molécula de ácido nucleico alvo e a mesma sequência como o nucleotídeo de terminação 3’ da primeira sonda oligonucleotídica, a ligação de fosfodiéster que se liga imediatamente a montante da nucleotídeo "flap" da segunda sonda oligonucleotídica é clivada por uma enzima que tem uma endonuclease flap (FEN) ou uma atividade 5’ nuclease (por exemplo, a 5’-3’ exonuclease de Taq polimerase). Aquela atividade FEN específica produz uma extremidade de fosfato 5’ de ligação competente na segunda sonda oligonucleotídica que está precisamente posicionada ao lonfo do 3’ OH adjacente da primeira sonda oligonucleotídica. Como uma consequência de (a) anelamento alvo-específico pelas sondas oligonucleotídicas adjacentes uma da outra, (b) geração seletiva de fosfatos 5’ apenas quando o nucleotídeo "flap" é compatível com o modelo, e (c) adição da ligase que segrega o pareamento não Watson- Crick para a 3’-base da primeira sonda oligonucleotídica, a especificidade e a sensibilidade de detecção de alvo muito alta é alcançada. De acordo com esta modalidade, as sondas oligonucleotídicas para ligação também contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador,respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Em seguida à ligação (Figura 43, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares do produto de ligaçãos se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 43, etapa F).
[259] A Figura 44 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para detectar mutações. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 44, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 44, etapa B). A região de interesse é amplificada usando iniciadores sítio-específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Nesta modalidade, as sondas de ligação são designadas para conter sequências iniciadoras e de marcador UniTaq para facilitar detecções. O sistema UniTaq é totalmente descrito na Publicação do Pedido de Patente Norte- Americano No. 2011/0212846 de Spier, que é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade. O sistema UniTaq envolve o uso de três sequências marcadoras "tag" únicas, onde pelo menos uma das sequências marcadoras únicas (Ai) está presente na primeira sonda oligonucleotídica, e a segunda e terceira porções marcadoras únicas (Bi’ e Ci’) estão na segunda sequência de sonda oligonucleotídica conforme mostrado na Figura 44, etapa D. Mediante a ligação das sondas oligonucleotídicas em um conjunto de sonda, o produto de ligação resultante conterá a sequência Ai—sequências alvo-específicas— sequência Bi’ — sequência Ci’. A essência da abordagem UniTaq é que ambas as sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda de ligação precisam estar corretas de modo a conseguir um sinal positivo, que permite a detecção de ácido nucleico altamente multiplexada. Por exemplo, e conforme descrito no presente documento, isto se alcança ao solicitor a hibridização de duas partes, isto é, dois dos marcadores, um no outro.
[260] Antes de detectar o produto de ligação, a amostra é tratada com UDG para destruir amplicons alvo originais deixando apenas produtos de ligação autênticos a serem detectados. Para a detecção, o produto de ligação contendo Ai (uma primeira porção iniciador- específica), Bi’ (uma porção de detecção UniTaq), e Ci’ (uma segunda porção iniciador-específica) é iniciado em ambos os filamentos usando um primeiro iniciador oligonucleotídico tendo a mesma sequência nucleotídica como Ai, e um segundo iniciador oligonucleotídico que é complementar a Ci’ (isto é, Ci). O primeiro iniciador oligonucleotídico também inclui a sonda de detecção UniTaq (Bi) que tem um marcador detectável F1 em uma extremidade e a molécula supressora (Q) na outra extremidade (F1-Bi-Q-Ai). Opcionalmente posicionada proximal ao suppressor está uma unidade bloqueadora de polimerase, por exemplo, HEG, THF, Sp-18, ZEN, ou qualquer outro bloqueador conhecido na técnica que é suficiente para parar a extensão da polimerase. A amplificação de PCR resulta na formação de produtos de filamento duplo conforme mostrado na Figura 44, etapa F). Neste exemplo, uma unidade bloqueadora de polymerase impede uma polimerase de copier a porção 5' (Bi) do primeiro iniciador universal, de tal modo que o filamento inferior do produto não possa formar um grampo quando ele se torna filamento único. A formação do referido grampo resultaria na extremidade 3' do anelamento da haste ao amplicon de tal forma que a extensão da polimerase desta extremidade 3' terminaria a reação de PCR.
[261] Os produtos de PCR de filamento duplo são desnaturados e quando a temperature é subsequentemente diminuída, o filamento superior do produto forma um grampo que tem uma haste entre a porção 5' (Bi) da primeira porção do iniciador oligonucleotídico Bi’ na extremidade oposta do filamento (Figura 44, etapa G). Ainda durante esta etapa, o segundo iniciador oligonucleotídico se anela à porção 5’ alvo-específica (Ci’) do produto grampeado. Mediante a extensão do segundo iniciador universal na etapa G, a atividade da nuclease 5' da polimerase cliva o marcador detectável D1 ou a molécula supressora da extremidade 5' do amplicon, com isso aumentando a distância entre o marcador e o supressor e permitindo a detecção do marcador.
[262] A Figura 145 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadoa para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 145, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 145, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada usando iniciadores seletivos da mutação a montante, iniciadores a jusante sítio-específicos, e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA específica de mutação RNA (mr), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 145, etapa B). RNaseH vai preferencialmente clivar a base RNA quando ela é perfeitamente compatível com DNA mutante, porém será menos provável clivar a base RNA quando hibrizidado a DNA do tipo selvagem. Quando a reação de clivagem ocorre, a polimerase estende fielmente o 3’OH liberado e copia a base mutante ou do tipo selvagem do alvo. Sendo assim, em contraste ao PCR alelo-específico, o iniciador de PCR não propaga uma mutação derivada do iniciador. Em vez disso, ao copiar a base através de ciclos repetidos de hibridização, clivagem, alongamento e desnaturação, este PCR seletivamente amplifica o alvo mutante sobre o alvo do tipo selvagem durante cada ciclo de amplificação. Os iniciadores opcionais com sequência do tipo selvagem carecem da base RNA e permanecem bloqueados, reduzindo assim a amplificação da sequência do tipo selvagem. Opcionalmente amostra alíquota em 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 145, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[263] Conforme mostrado na Figura 145 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequentedo produto de ligação, enquanto que a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a sequência de ácido nucleico do tipo selvagem (não mutada) não contém a porção 5’ iniciador-específica. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutante e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permitem a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 145, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito na Figura 38 (veja a Figura145, etapas E-G), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[264] A Figura 146 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 146, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 146, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada usando iniciadores a montante seletivos de mutação, iniciadores a jusante sítio-específicos, e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo Espaçador C3), e uma base RNA específica de mutação (mr), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 146, etapa B). RNaseH vai preferencialmente clivar a base RNA quando ela é perfeitamente compatível com DNA mutante, porém será menos provável clivar a base RNA quando hibrizidado a DNA do tipo selvagem. Quando a reação de clivagem ocorre, a polimerase estende fielmente o 3’OH liberado e copia a base mutante ou do tipo selvagem do alvo. Sendo assim, em contraste ao PCR alelo-específico, o iniciador de PCR não propaga uma mutação derivada do iniciador. Em vez disso, ao copiar a base através de ciclos repetidos de hibridização, clivagem, alongamento e desnaturação, este PCR seletivamente amplifica o alvo mutante sobre o alvo do tipo selvagem durante cada ciclo de amplificação. Os iniciadores opcionais com sequência do tipo selvagem carecem da base RNA e permanecem bloqueados, reduzindo assim a amplificação da sequência do tipo selvagem. Opcionalemnte amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 146, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[265] Conforme mostrado na Figura 146 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequente do produto de ligação, enquanto que a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a sequência de ácido nucleico do tipo selvagem (não mutada) não contém a porção 5’ iniciador-específica. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutantes e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Bi’-Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permitem a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 146, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação são amplificados usando iniciadores específicos de UniTaq (isto é, F1-Bi-Q- Ai, Ci) e detectados conforme descrito supra para a Figura 44 (veja a Figura146, etapas E-H), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[266] A Figura 147 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 147, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 147, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada usando iniciadores a montante seletivos de mutação, iniciadores a jusante sítio-específicos, e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado na etapa B desta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo Espaçador C3), e uma base RNA específica de mutação (mr), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 147, etapa B). RNaseH vai preferencialmente clivar a base RNA quando ela é perfeitamente compatível com DNA mutante, porém será menos provável clivar a base RNA quando hibrizidado ao DNA do tipo selvagem. Quando a reação de clivagem ocorre, a polimerase estende fielmente o 3’OH liberado e copia a base mutante ou do tipo selvagem do alvo. Sendo assim, em contraste ao PCR alelo-específico, o iniciador de PCR não propaga uma mutação derivada do iniciador. Em vez disso, ao copiar a base através de ciclos repetidos de hibridização, clivagem, alongamento e desnaturação, este PCR seletivamente amplifica o alvo mutante sobre o alvo do tipo selvagem durante cada ciclo de amplificação. Os iniciadores opcionais com sequência do tipo selvagem carecem da base RNA e permanecem bloqueados, reduzindo assim a amplificação da sequência do tipo selvagem. Nesta modalidade, os iniciadores a jusante sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permite a amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 146, etapa B). Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos de PCR biotiniladossão imobilizados em um suporte sólido e a mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 147, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capazes de detectar a sequência de ácido nucleico (mas não a sequência do tipo selvagem) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 147, etapa D). Em seguida à ligação (Figura 147, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 147, etapa F).
[267] A Figura 148 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 148, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 148, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada usando iniciadores a montante sítio- específicos, iniciadores a jusante sítio-específicos, uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem, e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Nesta modalidade, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma Base RNA (r), no iniciador a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH que está a umas poucas bases a montante da mutação, e adequado para a extensão de polimerase (Figura 148, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante preferencialmente competirá em ligação à sequência do tipo selvagem sobre o iniciador a montante, mas não muito ao DNA mutante, e assim suprime a amplificação do DNA do tipo selvagem durante cada rodada de PCR. Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 148, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[268] Conforme mostrado na Figura 148 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequente do produto de ligação. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem suprime a ligação à sequência alvo do tipo selvagem caso presente depois do enriquecimento da sequência mutante durante a etapa de amplificação de PCR. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutantes e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permite a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 148, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito supra para a Figura 38 (veja a Figura148, etapas E-G), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[269] A Figura 149 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 149, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 149, etapa B). Os iniciadores a jusante sítio-específicos são designados algumas bases a jusante da mutação, e incluem um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r). Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um 3’OH que é adequado para a extensão de polimerase (Figura 149, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante preferencialmente competirá em ligação a sequência do tipo selvagem sobre o iniciador a montante, mas não muito ao DNA mutante, e assim suprime a amplificação do DNA do tipo selvagem durante cada rodada de PCR. Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 148, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[270] Conforme mostrado na Figura 149 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequente do produto de ligação. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem suprime a ligação à sequência alvo do tipo selvagem caso presente depois do enriquecimento da sequência mutante durante a etapa de amplificação de PCR. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutantes e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Bi-Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permitem a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 149, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação são amplificados usando iniciadores específicos de UniTaq (isto é, F1-Bi-Q-Ai, Ci) e detectados conforme descrito supra para a Figura 44 (veja a Figura149, etapas EH), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[271] A Figura 150 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar mutações de nível baixo. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 150, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 150, etapa B). Iniciadores a jusante sítio-específicos são designados algumas bases a montante da mutação, e incluem um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo Espaçador C3), e uma base RNA (r). Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um 3’OH que é adequado para a extensão de polimerase (Figura 150, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante preferencialmente competirá em ligação asequência do tipo selvagem sobre o iniciador a montante, mas não muito ao DNA mutante, e assim suprime a amplificação do DNA do tipo selvagem durante cada rodada de PCR. Nesta modalidade, os iniciadores a jusante sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permitem a amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 150, etapa B). Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 150, etapa D. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência do tipo selvagem suprime a ligação à sequência alvo do tipo selvagem caso presente depois do enriquecimento da sequência mutante durante a etapa de amplificação de PCR. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capaz de detectar a sequência de ácido nucleico (mas não a sequência do tipo selvagem) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 150, etapa D). Em seguida à ligação (Figura 150, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares do produto de ligaçãos se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 150, etapa F).
[272] Em uma outra modalidade deste aspecto da presente invenção, o primeiro iniciador oligonucletídico primário do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreende uma porção 5’ tendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que uma porção da sequência nucleotídica em uma molécula de ácido nucleico do tipo selvagem a qual o iniciador oligonucleotídico primário se hibridiza a, mas tem uma ou mais incompatibilidades de sequência nucleotídica a uma porção da sequência nucleotídica correspondente na molécula alvo do ácido nucleico.
[273] De acordo com esta modalidade, uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar são providos. Opcionalmente, o iniciador oligonucleotídico primário também pode conter um nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo que é clivado durante a etapa de hibridização de PCR para liberar uma extremidade 3’OH livre no iniciador oligonucleotídico antes do referido tratamento de extensão. A mistura de reação em cadeia da polymerase é submetida a um ou mais ciclos adicionais da reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação em que os produtos de extensão da reação são separados um do outro, um tratamento de hibridização em que o primeiro iniciador oligonucletídico primário se hibridiza ao produto de extensão que surge do segundo iniciador oligonucleotídico primário. Os produtos de extensão que surgem do segundo oligonucleotídeo primário são capazes de formar uma alça-grampo intramolecular entre a extremidade 3’ e a sequência complementar dentro do produto de extensão, que (i) compreende uma incompatibilidade na ou perto da extremidade 3’ que inibe a auto- extensão caso hibridizado à sequência alvo mutante ou (ii) compreende uma compatibilidade na extremidade 3’ que melhora a auto-extensão caso auto-hibridizado à sequência alvo do tipo selvagem. O segundo iniciador oligonucleotídico primário se hibridiza ao produto de extensão que surge do primeiro iniciador oligonucletídico primário. O produto de extensão do primeiro iniciador primário forma uma alça-grampo intramolecular entre a porção 5’ e a sequência complementar dentro do produto de extensão. Durante a etapa de extensão do PCR, o primeiro iniciador oligonucletídico primário (i) preferencialmente estende em produto de extensão compreendendo sequência alvo mutante preferencialmente formando produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo mutante ou um complemento do mesmo, ou (ii) é inibida de formar produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo do tipo selvagem ou um complemento do mesmo devido a auto- hibridização anterior e auto-extensão em referido alvo. O segundo iniciador oligonucleotídico primário se estende em produto de extensão independente da sequência alvo, em que a sequência mutante é preferencialmente amplificada devido a diferentes produtos de extensão primários que surgem da hibridização dos primeiros iniciadores oligonucletídicos primários no alvo ou cópias dos mesmos, resultando no enriquecimento do produto de extensão da sequência mutante e complementos dos mesmos durante a reação primária em cadeia da polimerase.
[274] As Figuras 154 e 155 ilustram a modalidade descrita acima deste aspecto da presente invenção. Conforme mostrado na Figura 154, DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 154, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 154, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada iniciadores a montante sítio-específicos que compreendem uma porção 5’ tendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que uma porção da sequência nucleotídica da molécula de ácido nucleico do tipo selvagem na qual o iniciador se hibridiza de modo que o produto de extensão seja capaz de formar um grampo alça. Em outras palavras, a porção 5’ do iniciador a montante contém uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção da sequência dentro do filamento de DNA do tipo selvagem anti-sentido ou complementar a uma porção de sequência dentro do filamento de DNA do tipo selvagem em sentido. A reação de amplificação também contém iniciadores a jusante sítio-específicos e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado na etapa B desta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 154, etapa B). Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 154, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência. A PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. Figura 154, etapa D ainda ilustra que durante subsequentes rodadas de PCR (i) o filamento inferior do tipo selvagem desnaturado forma uma alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase, (ii) o filamento inferior mutante desnaturado forma uma alça-grampo com pelo menos uma base com incompatibilidade na extremidade 3’, que é em geral não estendida pela polimerase, (iii) o filamento superior desnaturado forma uma alça-grampo na lateral 5’, que desnatura durante a etapa de extensão de PCR a 72oC. Figura 154, etapa E, ainda ilustra que: (i) depois da extensão da alça-grampo no DNA do tipo selvagem, a sequência de grampo desnaturada não desnatura a 72oC e impede o iniciador a montante de gerar filamento superior de comprimento total. No entanto, a sequência alça-grampo de DNA mutante (ii) não se estende por conta da base 3’ não compatível, e assim desnatura a 72oC, permitindo o iniciador a montante gerar filamento superior de comprimento total. Da mesma forma, produto do filamento superio (iii) desnatura a 72oC, permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total. A diferença na preferência de extensão de alça-grampo dos iniciadores a montante com modelo do tipo selvagem (i) e mutante (ii) resulta na remoção preferencial de produtos do tipo selvagem durante cada ciclo de amplificação, e assim resulta na amplificação preferencial de DNA mutante. A eficiência da extensão diferencial da extremidade 3’ para estender a alça grampo quando hibridizado ao DNA mutante vs. DNA do tipo selvagem também pode ser aumentada ao designar a porção 5’ do iniciador a montante para conter uma incompatibilidade no DNA do tipo selvagem na 2a ou 3a posição da extremidade. O produto de extensão do iniciador inferior gerará apenas 1 incompatibilidade na 2a ou 3a posição da extremidade 3’ quando se auto-hibridiza na sequência do tipo selvagem, que facilmente se estenderá com polimerase, porém gerará 2 incompatibilidades na extremidade 3’ quando se auto-hibridiza na sequência mutante, o que não se estenderá com a polimerase.
[275] Conforme mostrado na Figura 154 etapa G, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a mutação de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequente do produto de ligação, enquanto que a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a sequência de ácido nucleico do tipo selvagem (não mutada) não contém a porção 5’ iniciador-específica. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências mutantes e do tipo selvagem contém a porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a mutação, permite a amplificação subsequente e detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado na etapa F desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 154, etapa H). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito na Figura 38 (veja a Figura 154, etapas H-J), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[276] Figura 155 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR exemplificadora para detectar mutações. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 155, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com UDG para digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico que podem estar presentes na amostra (Figura 155, etapa B). A região de interesse é seletivamente amplificada usando (i) iniciadores a montante sítio-específicos que compreendem uma porção da sequência 5’ que é complementar à sequência do tipo selvagem do filamento superior permitindo a formação de alças-grampos depois da extensão, (ii) iniciadores a jusante sítio-específicos, e (iii) uma mistura de desoxinucleotídeo que incluir dUTP. Conforme ilustrado na etapa B desta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo Espaçador C3), e uma base RNA (r), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 155, etapa B). Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 155, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência. A PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. A Figura 155 etapa D ainda ilustra que durante subsequentes rodadas de PCR: (i) o filamento inferior do tipo selvagem desnaturado forma uma alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase, (ii) o filamento inferior mutante desnaturado forma uma alça-grampo com pelo menos uma base com incompatibilidade na extremidade 3’, que é em geral não estendida pela polimerase, (iii) o filamento superior desnaturado forma uma alça-grampo na lateral 5’, que desnatura durante a etapa de extensão de PCR a 72oC. A Figura 155, etapa E ainda ilustra que depois da extensão da alça-grampo no DNA do tipo selvagem (i), a sequência de grampo desnaturada não desnatura a 72oC e previne o iniciador a montante de gerar filamento superior de comprimento total. No entanto, a sequência alça-grampo de DNA mutante (ii) não se estende por conta da base 3’ não compatível, e assim desnatura a 72oC, permitindo ao iniciador a montante gerar filamento superior de comprimento total. Da mesma forma, produto do filamento superio (iii) desnatura a 72oC, permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total. A diferença na preferência de extensão de alça-grampo dos iniciadores a montante com modelo do tipo selvagem (i) e mutante (ii) resulta na remoção preferencial de produtos do tipo selvagem durante cada ciclo de amplificação, e assim resulta na amplificação preferencial de DNA mutante.
[277] Nesta modalidade, os iniciadores a jusante sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permite a amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 155, etapa B). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólidoand A mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 155, etapa G. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capaz de detectar a sequência de ácido nucleico (mas não a sequência do tipo selvagem) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo Espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 155, etapa G). Em seguida à ligação (Figura 155, etapa H), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 155, etapa I).
[278] A reação de ligação usada nos métodos da presente invenção é bem conhecida na técnica. Ligases suitable for ligating sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda together (opcionalmente em seguida à clivagem da 3’ ribose e grupo bloqueador na primeira sonda oligonucleotídica, ou o flap 5’ na segunda sonda oligonucleotídica) incluem, sem limitação ligase de Thermus aquaticus, ligase de E. coli T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, Taq ligase, 9 N° ligase, e ligase de Pyrococcus, ou qualquer outra ligase termoestável conhecida na técnica. De acordo com a presente invenção, o processo de ligação da nuclease da presente invenção pode ser realizado ao se empregar uma reação do ensaio da ligação oligonucleotídica (OLA) (veja Landegren, et al., "A Ligase-Mediated Gene Detection Technique," Science 241:1077-80 (1988); Landegren, et al., "DNA Diagnostics -Molecular Techniques and Automation," Science 242:229-37 (1988); e Patente Norte-Americana N°. 4,988,617 de Landegren, et al.), uma reação da detecção da ligação (LDR) que utiliza um conjunto de sondas oligonucleotídicas complementares (veja por exemplo, a publicação internacional WO 90/17239 de Barany et al, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade), ou uma reação de cadeia de ligação (LCR) que utiliza dois conjuntos de sondas oligonucleotídicas complementares, veja por exemplo, publicação internacional WO 90/17239 de Barany et al, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade).
[279] As sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sondas podem estar na forma de ribonucleotídeos, desoxinucleotídeos, ribonucleotídeos modificados, desoxirribonucleotídeos modificados, análogos de peptídeo nucleotídeo, análogos de peptídeo nucleotídeo modificados, oligonucleotídeos de estrutura principal de açúcar de fosfato modificados, análogos de nucleotídeo e misturas dos mesmos.
[280] A etapa de hibridização na reação de detecção de ligase, que é preferivelmente um tratamento de hibridização térmico, discrimina entre sequências nucleotídicas baseadas em nucleotídeo nas junções de ligação. A diferença entre as sequências nucleotídicas alvo pode ser, por exemplo, uma diferença de base de ácido nucleico única, uma deleção de ácido nucleico, uma inserção de ácido nucleico ou rearranjo. Tais diferenças de sequência que envolvem mais do que uma base também podem ser detectadas. Preferivelmente, os conjuntos de sonda oligonucleotídica têm substancialmente o mesmo comprimento de modo que elas hibridizam para direcionar sequências nucleotídicas alvo em condições de hibridização substancialmente similares.
[281] A discriminação da ligase também pode ser aumentada ao empregar várias características de design de sonda. Por exemplo, uma incompatibilidade intencional ou análogo de nucleotídeo (por exemplo, Inosina, Nitroindol ou Nitropirrol) pode ser incorporada na primeira sonda oligonucleotídica na 2a ou 3a base a partir da extremidade de junção 3’ para desestabilizar a hibridização da extremidade 3’ caso ela seja perfeitamente compatível na extremidade 3’, porém desestabilize a hibridização da extremidade 3’ caso ela não seja compatível na extremidade 3’. Este design reduz ligações malfeitas inapropriadas quando sondas mutantes se hibridizam ao alvo do tipo selvagem. Alternativamente, as RNAs de base que são clivadas por RNases podem ser incorporadas nas sondas oligonucleotídicas para assegurar formação de produto dependente de modelo. Por exemplo, Dobosy et. al. "RNase H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primers," BMC Biotechnology 11(80): 1011 (2011), que é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade, descreve usar uma RNA-base próxima à extremidade 3’ de uma sonda oligonucleotídica com extremidade bloqueada em 3’, e o corte dela com RNase H2 gerando um 3’-OH que pode ser estendido por PCR-extendable e que pode ser ligado. Esta abordagem pode ser usada para gerar seja 3’-OH competente de ligação ou 5’-P competente de ligação ou ambos, contanto que uma ligase que possa ligar 5’-Base RNA seja utilizada.
[282] Otras modificações possíveis incluem sítios abásicos, por exemplo, furan abásico interno ou oxo-G. Essas "bases" anormais são removidas por enzimas específicas para gerar sítios 3’-OH ou 5’P competentes de ligação. Endonuclease IV, Tth EndoIV (NEB) removerá reíduos abásicos depois dos oligonucleotídeos de ligação se anelarem ao ácido nucleico alvo, mas não a partir de um DNA de filamento único. Similarmente, pode-se usar oxo-G com Fpg ou inosina/uracil com EndoV ou Timina glicol com EndoVIII.
[283] A discriminação da ligação também pode ser aumentada ao usar a reação de nuclease-ligase acoplada descrita na Publicação Internacional WO2013/123220 de Barany et al., que é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. Nesta modalidade, a primeira sonda oligonucleotídica carrega um grupo 3’ OH competente de ligação enquanto a segunda sonda oligonucleotídica carrega uma extremidade 5’ incompetente de ligação (isto é, uma sonda oligonucleotídica sem um fosfato 5’). As sondas oligonucleotídicasde um conjunto de sonda são designadas de tal modo que a 3’-most base da primeira sonda oligonucleotídica seja sobreposta pela 5’-most base imediatamente flanqueadora da segunda sonda oligonucleotídica que é complementar à molécula alvo de ácido nucleico. O nucleotídeo sobreposto é referido como um "flap". Quando o nucleotídeo "flap" sobreposto da segunda sonda oligonucleotídica é complementar à sequência da molécula de ácido nucleico alvo e a mesma sequência como o nucleotídeo 3’ de terminação da primeira sonda oligonucleotídica, a ligação de fosfodiéster imediatamente a montante do nucleotídeo "flap" da segunda sonda oligonucleotídica é clivado discriminativamente por uma enzima que tem atividade endonuclease "flap" (FEN) ou 5’ nuclease. Aquela atividade FEN específica produz uma nova extremidade 5’ fosfato de ligação competente na segunda sonda oligonucleotídica que está precisamente posicionada ao longo do 3’ OH adjacente da primeira sonda oligonucleotídica para permitir que a ligação das sondas ocorra. De acordo com esta modalidade, as endonucleases "flap" ou 5’ nucleases que são adequadas para clivar o 5’ flap da segunda sonda oligonucleotídica antes da ligação incluem, sem limitação, polimerases que carregam a atividade 5’ nucleasse tal como polimerase de DNA de E.coli e polimerases de Taq e T. thermophilus, assim como T4 RNase H e TaqExo.
[284] Para inserções ou deleções, a incorporação de uma base compatível ou análogos de nucleotídeo (por exemplo, -amino-dA ou 5- propinil-dC) na primeira sonda oligonucleotídica na 2a ou 3a posição a partir da junção melhora a estabilidade e pode melhorar a discriminação das referidas mutações "frameshift" das sequências do tipo selvagem. Para inserções, o uso de um ou mais nucleotídeos a jusante modificados por tiofosfato a partir da ligação de fosfato desejada da segunda sonda oligonucleotídica prevenirá clivagem inadequada pela enzima 5’ nuclease enzyme quando as sondas são hibridizadas ao DNA do tipo selvagem, e assim reduzem a ligação falsa-positiva em alvo do tipo selvagem. Da mesma forma, para deleções, o uso de um ou mais nucleotídeos a montante modificados por tiofosfato a partir da ligação de fosfato da segunda sonda oligonucleotídica prevenirá clivagem inadequada pela enzima 5’ nuclease quando as sondas são hibridizadas no DNA do tipo selvagem, e assim reduzem a ligação falsa-positiva no alvo do tipo selvagem.
[285] O método da presente invenção também pode ser utilizado para identificar uma ou mais sequências de ácido nucleico alvo que diferem de outras sequências de ácido nucleico em uma amostra por um ou mais resíduos metilados. De acordo com este aspecto da presente invenção, o método ainda compreende colocar a amostra em contato com pelo menos uma primeira enzima sensível à metilação para formar uma mistura de reação da enzima de restrição antes de formar a reação em cadeia da polimerase mixture. De acordo com este aspecto da presente invenção, o primeiro iniciador oligonucletídico primário compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma região da sequência nucleotídica alvo que está a montante de um ou mais resíduos metilados e o segundo iniciador oligonucleotídico primário compreende uma sequência nucleotídica que é a mesma como uma região da sequência nucleotídica alvo que está a jusante de um ou mais resíduos metilados.
[286] A primeira enzima sensível à metilação cliva moléculas de ácido nucleico na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados dentro de pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação. De acordo com esta modalidade, detectar envolve a detecção de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo a sequência nucleotídica alvo, onde a molécula de ácido nucleico originalmente continha um ou mais resíduos metilados.
[287] De acordo com este e todos os aspectos da presente invenção, a "enzima sensível à metilação" é uma endonuclease que não clivará ou tem eficiência de clivagem reduzida de sua sequência de reconhecimento cognata em uma molécula de ácido nucleico quando a sequência de reconhecimento contém um resíduo metilado (isto é, é sensível à presença de um resíduo metilado dentro de sua sequência de reconhecimento). A "sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação" é a sequência de reconhecimento cognata para a enzima sensível à metilação. Em algumas modalidades, o resíduo metilado é um 5-metil-C, dentro da sequência CpG (isto é, 5-metil-CpG). Uma lista não limitante de enzimas endonuclease de restrição sensíveis à metilação que são adequadas para uso nos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, AciI, HinP1I, Hpy99I, HpyCH4IV, BstUI, HpaII, HhaI, ou qualquer combinação das mesmas.
[288] O método da presente invenção ainda pode compreender submeter a mistura de reação da enzima de restriçãoto a tratamento com bissulfeto sob condições adequadas para converter resíduos de citosina não metilada em resíduos de uracil antes de formar uma mistura da reação em cadeia da polimerase. Nesta modalidade, o primeiro iniciador oligonucletídico primário do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreende uma sequência nucleotídica que é complementar à sequência nucleotídica alvo tratada com bissulfeto contendo um ou mais sítios de restrição metilados, não clivados e o segundo iniciador oligonucleotídico primário do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário provido compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção do produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico .
[289] O método da presente invenção pode ainda envolver prover uma ou mais das segundas enzimas sensíveis à metilação que clivam moléculas de ácido nucleico contendo resíduos não metilados dentro da sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação. Pelo menos uma segunda enzima sensível à metilação é misturada com a mistura de reação em cadeia da polimerase compreendendo a mistura de reação da enzima de restrição tratada com bissulfeto para formar uma segunda mistura de reação da enzima de restrição, onde a segunda enzima sensível à metilação cliva moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados dentro de pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação durante o referido tratamento de hibridização.
[290] Em uma modalidade deste aspecto da presente invenção, um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos primários do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário têm uma porção 3’ tendo um nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo e um grupo bloqueador, tal modo que a extremidade 3’ do referido iniciador ou iniciadores seja inadequada para a extensão de polimerase. De acordo com esta modalidade, o método também envolve clivar o nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo de um ou ambos iniciadores oligonucleotídicos durante o tratamento de hibridização com isso liberando as extremidades de 3’OH livres em um ou ambos iniciadores oligonucleotídicos antes do referido tratamento de extensão.
[291] Em uma modalidade deste aspecto da presente invenção, o método também envolve prover um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores capazes de se hibridizar a uma região da sequência nucleotídica alvo tratada com bissulfeto contendo resíduos não metilados. A mistura de reação em cadeia da polimerase compreendendo a mistura de reação da enzima de restrição tratada com bissulfeto é colocada em contato com um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores antes de submeter a mistura a um ou mais ciclos da reação em cadeia da polimerase. Um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores se hibridizam a sequências de ácido nucleico alvo complementares durante o referido tratamento de hibridização e impedem a extensão do iniciador oligonucleotídico primário durante o referido tratamento de extensão.
[292] As Figuras 45-53 ilustram várias modalidades do método da presente invenção para detectar moléculas de ácido nucleico alvo contendo um ou mais resíduos metilados.
[293] A primeira etapa da reação de PCR-LDR-qPCR retratada na Figura 45 envolve o isolamento do DNA genômico ou cfDNA. Opcionalmente, DNA metilado can be enriched usando metilação specific antibodies. A amostra is then treated with endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e/ou HinPII (GACGC), e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 45, etapa A). Conforme mostrado na Figura 45, etapa B, as regiões de interesse metiladas são amplificadas usando PCR na presença de dUTP usando iniciadores sítio-específicos. Em uma modalidade, amplificação de ciclos limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 2040 ciclos. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 45, etapa C), e os produtos carecem de grupos metila, fornecendo proteção adicional. Conforme mostrado na Figura 45, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específica à região metila contêm porções "tag" iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, usando pares de iniciadores tag Ai e Ci’ e sondas TaqMan™.
[294] Em seguida à reação de ligação, a amostra contendo o produto de ligação pode ser aliquotada em poços separados para a detecção. O tratamento com UDG destroi amplicons alvo originais (Figura 45, etapa E), permitindo que apenas produtos de LDR autênticos sejam amplificados e detectados. Os produtos de ligação são detectados nesta modalidade usando um ensaio de detecção TaqMan™ tradicional (Figura 45, etapas E-F) conforme descrito supra.
[295] Figura 46 ilustra another exemplary Reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para detectar metilação. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e/ou HinP1I (GACGC), e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 46, etapa A). Conforme mostrado na Figura 46, etapa B, as regiões de interesse metiladas são amplificadas usando PCR na presença de dUTP usando iniciadores sítio-específicos. Em uma modalidade, a amplificação de ciclos limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR contêm dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 46, etapa C).
[296] As sondas oligonucleotídicas utilizadas nesta modalidade são designadas para conter o iniciador de UniTaq e sequências tag para facilitar a detecção de UniTaq conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à reação de ligação e tratamento com UDG para a prevenção de transferência, os produtos de ligação são amplificados usando iniciadores específicos de UniTaq (isto é, F1-Bi-Q- Ai, Ci) conforme mostrado na Figura 46, etapas E e F, e os produtos amplificados são detectados conforme mostrado na Figura 46, etapa G e descritos supra.
[297] A Figura 47 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar metilação. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e/ou HinPII (GACGC), e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 47, etapa A). Conforme mostrado na Figura 47, etapa B, as regiões de interesse metiladas são amplificadas usando PCR na presença de dUTP usando iniciadores sítio-específicos. Nesta modalidade, os iniciadores sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permitem uma amplificação de PCR universal subsequente usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 47, etapa B). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a mutação de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da mutação conforme ilustrado na Figura 47, etapa D. De acordo com esta modalidade, as sondas oligonucleotídicas para a ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocados em estreita proximidade um do outro conforme descrito supra para a Figura 39. Em seguida à ligação (Figura 47, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 47, etapa E).
[298] A Figura 48 ilustra a reação de prevenção de transferência de nuclease-ligação-PCR-qPCR para detectar metilação. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com HaeIII (GGACC), endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e/ou HinP1I (GACGC), e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 48, etapa A). Conforme mostrado na Figura 48, etapa B, um oligonucleotídeos grampeado contendo sequência tag (Ai’) é ligado ao fosfato recém liberado do DNA alvo digerido no filamento do modelo de amostra. Conforme ilustrado na Figura 48, etapa C, a amostra é tratada com HinP1I e Bsh1236I a 37°C. As enzimas de restrição sensíveis à metila são então inativadas termicamente enquanto se ativa a Taq polimerase para subsequente amplificação com PCR usando iniciadores sítio-específicos contendo sequência tag Ci. Conforme descrito acima, os iniciadores podem conter um grupo de bloqueio clivável, (por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), que é removida antes da amplificação por um tratamento com RNaseH2 (símbolo de estrela) apneas quando o iniciador está ligado a sequência alvo complementar. O iniciador não bloqueado é estendido com polimerase, e a atividade 5’ nuclease da polimerase digere a porção 5’ do grampo ligado para gerar um produto complementar ao alvo contendo a sequência Ci e Ai’. Os oligonucleotídeos de grampo não ligados se estendem neles mesmos.
[299] Conforme mostrado na Figura 48, etapa D, as regiões de interesse contendo metila são amplificadas usando PCR incluindo dUTP com iniciadores marcadores "tag" Ai e Ci. Realiza-se a amplificação de ciclos limitada (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 48, etapa E), e os produtos carecem de grupos metila, fornecendo proteção adicional. Os produtos amplificados são aliquotados em poços separados para a detecção TaqMan™ usando iniciadores sítio-específicos e sonda TaqMan™ conforme descrito supra.
[300] A Figura 49 ilustra a reação de prevenção de transferência de nuclease-ligação-PCR-qPCR para detectar metilação. Os produtos de PCR contendo os resíduos originalmente metilados de interesse e dU são gerados em seguida às etapas A-D conforme ilustrado e descrito acima com relação à Figura 48. Nesta modalidade, a amplificação subsequente usando iniciadores UniTaq e sequências tag é usada para detectar os resíduos metilados de interesse. Conforme mostrado na etapa E da Figura 49, os produtos de PCR contendo dU para a prevenção de transferência, são aliquotados em poços separados e amplificados usando iniciadores sítio-específicos terminados com Aj, e Bj-Cj, assim como iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bj-Q-Aj e Cj). Os produtos de DNA de filamento duplo resultantes são mostrados na Figura 49, etapa F. Conforme mostrado na Figura 49, etapa G, depois da etapa de desnaturação, a temperatura é resfriada para permitir a formação de grampo entre Bj e Bj’. A atividade 5’^3’ nuclease de Taq polimerase (diamantes preenchidos) estende o iniciador Ci e liberate o grupo fluorescente para gerar sinal.
[301] A Figura 50 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para detectar metilação. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 3060 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 50, etapa A). O DNA digeridoo é tratado com bissulfeto para converter resíduos dC não metilados em uracil (dU) com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. Conforme mostrado na Figura 50B, os iniciadores sítio-específicos são hibridizados na presença de BstU1 (CGACG) (triângulos preenchidos), que clivarão o DNA de transferência contendo resíduos não metilados. Os iniciadores sítio-específicos contêm um bloqueador clivável em sua extremidade 3’ para prevenur a extensão específica fora do alvo. Quando hibridizado em sua sequência alvo complementar, o grupo bloqueador (espaçador C3), e uma base RNA é removida com RNaseH2 (símbolo de estrela). A região de interesse contendo metila é amplificada usando PCR na presença de dUTP. Realiza-se a amplificação de ciclos limitada (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons, e opcionalmente amostra digerida em alíquotas em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Conforme mostrado nesta modalidade, um oligonucleotídeo bloqueador (barra escura grossa) pode ser usado para limitar a amplificação do DNA do tipo selvagem.
[302] Os produtos amplificados contêm dU e carecem de grupos metila, permitindo a prevenção de transferência conforme mostrado na Figura 50, etapa C. Conforme mostrado na Figura 50, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específica da região metila contendo sequências específicas de iniciador (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, são hibridizadas na região de interesse alvo. Ligase (círculo preenchidos) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos para formar produtos de ligação contendo porções específicas de iniciador a montante e a jusante e uma porção correspondendo à região de interesse metilada. Os produtos de ligação são colocados em alíquotas em poços separados para a detecção usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ ao lonfo da junção de ligação conforme mostrado na Figura 50 etapas E-F. A mistura da amostra é tratada com UDG para a prevenção de transferência e remoção de amplicons alvo originais (Figura 50, etapa E) de modo que apenas produtos de LDR autênticos sejam amplificados e detectados.
[303] A Figura 51 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para detectar metilação. Os produtos de PCR contendo os resíduos originalmente metilados de interesse e dU são gerados seguindo as etapas A-C conforme ilustrado e descrito acima com relação à Figura 50. Nesta modalidade, os oligonucleotídeos de ligação específica da região metila contêm sequências específicas de iniciador de detecção UniTaq (Ai e Ci’) e sequência tag (Bi’) para subsequente amplificação com detecção de PCR. Os produtos de ligação são amplificados e detectados usando iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito supra (Figura 51, etapas E-G).
[304] A Figura 52 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR para detectar metilação. Similar às modalidades mostradas nas Figuras 50 e 51, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 52, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos não metilados em uracil com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. Conforme mostrado na Figura 52B, os iniciadores sítio-específicos contendo um grupo de bloqueio clivável 3’ são hibridizados na presença de BstUI (CGACG) (triângulos preenchidos), que clivarão o DNA de transferência contendo resíduos não metilados. Quando os iniciadores se hibridizam a sua sequência alvo complementar, o grupo de bloqueio é removido e a região de interesse contendo metila é amplificada usando PCR na presença de dUTP. Nesta modalidade, os iniciadores sítio-específicos contêm terminações universais (com idênticas 8-11 bases para prevenir dímeros de iniciador), o que permite uma amplificação de iniciador universal subsequente para anexar um grupo de biotina 5’. Um iniciador oligonucleotídico bloqueador pode ser usado durante a amplificação para limitar a formação de amplicon do tipo selvagem.
[305] Os produtos de amplificação são capturados em um suporte sólido através do grupo 5’ biotina (Figura 52, etapa C). Conforme mostrado na Figura 52D, os produtos de ligação são formados usando as sondas oligonucleotídicas de ligação específica da região metila, onde a sonda a jusante contém um grupo aceptor 5’ e terminação da sequêcia que é complementar à terminação da sequência 3’ da sonda de ligação a montante. A sonda de ligação a montante também contém um grupo doador 3’ de modo que mediante a formação de um produto de ligação, as regiões complementares 5’ e 3’ do produto se hibridizem colocando os grupos aceptor e doador em estreita proximidade um do outro para gerar sinal FRET para detecção dos resíduos metilados de interesse (Figura 52, etapa E).
[306] A Figura 151 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR exemplificadora para detectar metilação alvo de baixo nível. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 151, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG), e UNG para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 151, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos não metilados em uracil com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. A região de interesse é seletivamente amplificada usando iniciadores a montante sítio-específicos, iniciadores a jusante sítio-específicos, uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência não metilada convertida de bissulfeto ou seu complemento, e uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Nesta modalidade, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), no iniciador a montante, assim como o iniciador a jusante. Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH do iniciador a montante, que está algumas bases a montante do sítio de metilação, and adequado para a extensão de polimerase (Figura 151, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante competirá preferencialmente por ligação à sequência não metilada convertida de bissulfeto sobre o iniciador a montante e sobre o DNA da sequência metilada convertida de bissulfeto, assim suprimindo a amplificação do DNA da sequência não metilada convertida de bissulfeto durante cada rodada de PCR. Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 151, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[307] Conforme mostrado na Figura 151 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar sequência de interesse alvo metilada convertida de bissulfeto ainda contéma porção 5’ iniciador- específica (Ai) para facilitar a detecção subsequentedo produto de ligação. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) suprime a hibridização da sonda de ligação a montante da sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto caso presente depois do enriquecimento da sequência alvo metilada convertida de bissulfetodurante a etapa de amplificação de PCR. A sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências alvo metiladas e não metiladas convertidas em bissulfeto contém uma porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a sequência alvo metilada convertida em bissulfeto. A ligação das sondas oligonucleotídicas a montante e a jusante permite a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma Base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 151, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito supra para a Figura 38 (veja a Figura151, etapas E-G), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[308] A Figura 152 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para detectar metilação alvo de baixo nível. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 152, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG), e UNG para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 152, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos não metilados em uracil com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. Os iniciadores sítio-específicossão a montante e a jusante designados para incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r). Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um 3’OH, e é adequada para a extensão de polimerase (Figura 152, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante competirá preferencialmente por ligação à sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto sobre o iniciador a montante e sobre a sequência alvo metilada convertida em bissulfeto, assim suprimindo a amplificação da sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto durante cada rodada de PCR. Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 152, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência.
[309] Conforme mostrado na Figura 152 etapa D, as sondas oligonucleotídicas alvo-específicas são hibridizadas aos produtos amplificados e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) suprime a ligação à sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto caso presente após o enriquecimento da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto durante a etapa de amplificação de PCR. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar sequência de interesse alvo metilada convertida de bissulfeto ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequentedo produto de ligação. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência comum a ambas as sequências alvo não metiladas e metiladas convertidas em bissulfeto contém uma porção 3’ iniciador- específica (Bi’-Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador-específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar a sequência alvo metilada convertida em bissulfeto, permite amplificação subsequente e detecção de apenas produtos de ligação da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto. Conforme ilustrado na etapa D desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 152, etapa D). Em seguida à ligação, os produtos de ligação são amplificados usando iniciadores específicos de UniTaq (isto é, F1-Bi-Q-Ai, Ci) e detectados conforme descrito supra para a Figura 44 (veja a Figura152, etapas E-H), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[310] A Figura 153 ilustra uma outra reação da prevenção de transferência de PCR-qLDR exemplificadora para detectar metilação alvo de baixo nível. DNA genômico ou cfDNA é isolado (Figura 153, etapa A), e a amostra de DNA isolada é tratada com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG), e UNG para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 153, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos não metilados em uracil com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. Os iniciadores sítio-específicos a montante e a jusante são designadas para incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r). Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um 3’OH, e é adequada para a extensão de polimerase (Figura 153, etapa B). Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante competirá preferencialmente por ligação à sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto sobre o iniciador a montante e sobre a sequência alvo metilada convertida em bissulfeto, assim suprimindo a amplificação da sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto durante cada rodada de PCR. Nesta modalidade, os iniciadores a jusante sítio-específicos também contêm regiões iniciadoras 5’, por exemplo, regiões iniciadoras universais, que permite a amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 153, etapa B). Opcionalmente amostra alíquota em 12, 24, 48, ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 153, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência. Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a sequência de interesse alvo metilada convertida de bissulfeto é detectada usando as sondas de ligação específicas da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto conforme ilustrado na Figura 153, etapa D. Mais uma vez, a presença de sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) suprime a ligação à sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto caso presente após o enriquecimento da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto durante a etapa de amplificação de PCR. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capaz de detectar a sequência de ácido nucleico da sequência alvo metilada convertida de bissulfeto (mas não a sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo- específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 153, etapa D). Em seguida à ligação (Figura 153, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 153, etapa F).
[311] Em uma outra modalidade deste aspecto da presente invenção, o primeiro iniciador oligonucletídico primário do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreende uma porção 5’ tendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que uma porção da sequência nucleotídica na sequência alvo não metilada tratada com bissulfeto para a qual o iniciador oligonucleotídico primário se hibridiza a, mas tem uma ou mais incompatibilidades de sequência nucleotídica a uma porção da sequência nucleotídica correspondente na sequência alvo não metilada tratada com bissulfeto .
[312] De acordo com esta modalidade, a DNA polimerase é uma que carece da 5’ nuclease, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. Opcionalmente, o iniciador oligonucleotídico primário também contém um nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo que é clivado durante a etapa de hibridização da reação em cadeia da polimerase para liberar extremidades 3’OH livres no iniciador oligonucleotídico adequado para a extensão. A mistura de reação em cadeia da polimerase está sujeita a um ou mais ciclos adicionadis da reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação em que os produtos de extensão da reação são separados um do outro, e um tratamento de hibridização em que o primeiro iniciador oligonucletídico primário se hibridiza ao produto de extensão que surge do segundo iniciador oligonucleotídico primário. O produto de extensão que surge do segundo iniciador primário forma uma alça-grampo intramolecular entre a extremidade 3’ e a sequência complementar dentro do produto de extensão, que (i) compreende uma ou mais incompatibilidades na ou perto da extremidade 3’ que inibe a auto-extensão caso auto-hibrizado na sequência metilada tratada com bissulfeto ou (ii) compreende uma compatibilidade na extremidade 3’ que melhora a auto-extensão caso auto-hibrizada na sequência alvo não metilada tratada com bissulfeto. O segundo iniciador oligonucleotídico primário se hibridiza ao produto de extensão que surge do primeiro iniciador oligonucletídico primário. O produto de extensão que surge do primeiro iniciador oligonucletídico primário forma uma alça-grampo intramolecular entre a porção 5’ e a sequência complementar dentro do produto de extensão. Durante a etapa de extensão da PCR, o primeiro iniciador oligonucletídico primário (i) preferencialmente se estende no produto de extensão compreendendo sequência alvo metilada tratada com bissulfeto com isso formando preferencialmente produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo metilada tratada com bissulfeto ou um complemento do mesmo, ou (ii) é inibida de formar produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo não metilada tratada com bissulfeto ou um complemento do mesmo devido a auto-hibridização e auto-extensão em tal alvo. O segundo iniciador oligonucleotídico primário(iii) se estende no produto de extensão independente da sequência alvo, em que a sequência metilada tratada com bissulfeto é preferencialmente amplificada devido a diferentes produtos de extensão primários que surgem da hibridização dos primeiros iniciadores oligonucletídicos primários no alvo ou cópias dos mesmos, resultando no enriquecimento do produto de extensão da sequência metilada tratada com bissulfeto e complementos dos mesmos durante a referida reação primária em cadeia da polimerase
[313] As Figuras 156 e 157 ilustram esta modalidade da presente invenção. Conforme mostrado na Figura 156, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 156, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos dC não metilados em uracil (dU) com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. A região de interesse é seletivamente amplificada usando (i) iniciadores a montante sítio- específicos que também compreendem uma porção da sequência 5’ complementar à sequência não metilada tratada com bissulfeto do filamento superior permitindo a formação de alças-grampos depois da extensão, (ii) iniciadores a jusante sítio-específicos, e (iii) uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado na etapa B desta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), no iniciador a montante específico de mutação. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) removes a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 156, etapa B). Opcionalmente amostra digerida em alíquotas em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 156, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência. PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. Figura 156, etapa D ainda ilustra que em rodadas subsequentes de amplificação: (i) o filamento inferior não metilado tratado com bissulfeto desnaturado forma uma alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase, (ii) o filamento inferior não metilado tratado com bissulfeto desnaturado forma uma alça-grampo com duas ou mais incompatibilidades, que é em geral não estendida pela polimerase, e (iii) o filamento superior desnaturado forma uma alça-grampo em sua lateral 5’, que desnatura durante a etapa de extensão de PCR a 72oC. Figura 156, etapa E further ilustra que: depois da extensão da alça-grampo no DNA não metilado tratado com bissulfeto (i), a sequência de grampo desnaturada não desnatura a 72oC e preveine o iniciador a montante de gerar filamento superior de comprimento total. No entanto, a sequência alça-grampo de DNA metilado tratado com bissulfeto (ii) não se estende em conta das duas ou mais bases incompatíveis, e assim desnatura a 72oC, enabling iniciador a montante para gerar filamento superior de comprimento total. Da mesma forma, o produto do filamento superior (iii) desnatura a 72oC, permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total. A diferença na preferência de extensão de alça- grampo dos iniciadores a montante com modelo (i) não metilado tratado com bissulfeto e (ii) metilado tratado com bissulfeto resulta na remoção preferencial de produtos de amplificação não metilados tratados com bissulfeto durante cada ciclo de amplificação, e assim resulta na amplificação preferencial de DNA metilado tratado com bissulfeto.
[314] Conforme mostrado na Figura 156, etapa G, as sondas oligonucleotídicas específicas para a sequência alvo metilada tratada com bissulfeto são hibridizadas aos produtos amplificados, e ligase (círculo preenchido) covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos quando hibridizados em sua sequência complementar. Nesta modalidade, a sonda oligonucleotídica a montante tendo uma sequência específica para detectar a sequência metilada tratada com bissulfeto de interesse ainda contém a porção 5’ iniciador-específica (Ai) para facilitar a detecção subsequente do produto de ligação, enquanto que a sonda oligonucleotídica a montante opcional tendo uma sequência específica para detectar a sequência de ácido nucleico não metilada tratada com bissulfetonão contém a porção 5’ iniciador-específica. Sonda oligonucleotídica a jusante, tendo uma sequência específica para detectar sequências metiladas tratadas com bissulfeto contém uma porção 3’ iniciador-específica (Ci’) que, junto com a porção 5’ iniciador- específica (Ai) da sonda a jusante tendo uma sequência específica para detectar sequência metilada tratada com bissulfeto de interesse, permitem a amplificação subsequente e a detecção de apenas produtos de ligação mutantes. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 156, etapa H). Em seguida à ligação, os produtos de ligação podem ser detectados usando pares de iniciadores compatíveis Ai e Ci, e sondas TaqMan™ que transpõem a junção de ligação conforme descrito na Figura 38 (veja a Figura156, etapas H-J), ou usando outro meio adequado conhecido na técnica.
[315] A Figura 157 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR para detectar metilação. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 157, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos dC não metilados em uracil (dU) com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. A região de interesse é seletivamente amplificada usando (i) iniciadores a montante sítio-específicos que também compreendem uma porção 5’ tendo uma sequência complementar à sequência não metilada tratada com bissulfeto do filamento superior permitindo a formação de alças- grampos depois da extensão, (ii) iniciadores a jusante sítio-específicos, e (iii) uma mistura de desoxinucleotídeos que inclui dUTP. Conforme ilustrado nesta Figura, uma outra camada de seletividade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’ (Blk 3’, por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), no iniciador a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase (Figura 157, etapa B). Opcionalmente amostra digerida em alíquotas em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos amplificados contêm dU conforme mostrado na Figura 157, etapa C, o que permite tratamento subsequente com UDG ou uma enzima similar para a prevenção de transferência. PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. Figura 157, etapa D ainda ilustra que em rodadas subsequentes de amplificação (i) o filamento inferior não metilado tratado com bissulfeto desnaturado forma uma alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase, (ii) o filamento inferior metilado tratado com bissulfeto desnaturado forma uma alça-grampo com duas ou mais incompatibilidades, que é em geral não estendida pela polimerase, e (iii) o filamento superior desnaturado forma uma alça-grampo na lateral 5’, que desnatura durante a etapa de extensão de PCR a 72oC. Figura 157, etapa E ainda ilustra que depois da extensão da alça-grampo no DNA não metilado tratado com bissulfeto (i), a sequência de grampo desnaturada não desnatura a 72oC e previne o iniciador a montante de gerar filamento superior de comprimento total. No entanto, a sequência alça-grampo de DNA metilado tratado com bissulfeto (ii) não se estende em conta das duas ou mais bases incompatíveis, e assim desnatura a 72oC, permitindo ao iniciador a montante gerar filamento superior de comprimento total. Da mesma forma, o produto do filamento superior desnatura a 72oC, permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total (iii). A diferença na preferência de extensão de alça-grampo dos iniciadores a montante com (i) modelo não metilado tratado com bissulfeto e (ii) modelo metilado tratado com bissulfeto resulta na remoção preferencial de produtos de amplificação não metilados tratados com bissulfeto durante cada ciclo de amplificação, e assim resulta na amplificação preferencial de DNA metilado tratado com bissulfeto.
[316] Nesta modalidade, os iniciadores a jusante sítio-específicos também contêm uma região iniciadora 5’, por exemplo, região iniciadora universal, que permite a amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse (Figura 157, etapa B). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a sequência metilada tratada com bissulfeto de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas para a sequência alvo metilada tratada com bissulfeto conforme ilustrado na Figura 150, etapa G. Nesta modalidade, as sondas de ligação de um par de ligação capaz de detectar a sequência de ácido nucleico metilada tratada com bissulfeto (mas não a sequência não metilada tratada com bissulfeto) contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra para a Figura 39. Conforme ilustrado na etapa G desta Figura, uma outra camada de especificidade pode ser incorporada no método ao se incluir um grupo de bloqueio clivável 3’, (por exemplo espaçador C3), e uma base RNA (r), na sonda de ligação a montante. Mediante a hibridização alvo-específica, RNase H (símbolo de estrela) remove a base RNA para gerar um grupo 3’OH de ligação competente (Figura 150, etapa G). Em seguida à ligação (Figura 157, etapa H), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 157, etapa I).
[317] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo que difere das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou outras amostras, em mais um resíduo metilado. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico potencialmente compreendendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico em um ou mais resíduos metilados e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir desoxiuracil (dU) contendo moléculas de ácido nucleico presentes na amostra. O método também envolve contacting a amostra com uma ou mais enzimas sensitivas à metilação para formar uma mistura de reação da enzima de restrição, em que uma ou mais das referidas enzimas sensíveis à metilação clivam moléculas de ácido nucleico na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados dentro de pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzima sensível à metilação. Um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico primário comprendendo(a) primeiro iniciador oligonucletídico primário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma região da sequência nucleotídica alvo que está a montante de um ou mais resíduos metilados e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como uma região da sequência nucleotídica alvo que está a jusante de um ou mais resíduos metilados. A mistura de reação da enzima de restrição é misturada com um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura da reação em cadeia da polimerase primária. O método também envolve submeter a mistura da reação em cadeia da polimerase primária a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando com isso produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos encaixados capazes de se hibridizar aos produtos de extensão primários Os produtos de extensão primários são misturados com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico secundário, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar a mistura da reação em cadeia da polimerase secundária, e a mistura da reação em cadeia da polimerase secundária é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários. Os produtos de extensão secundários na amostra são detectados e distinguidos para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra em um ou mais resíduos metilados.
[318] De acordo com este aspectoda presente invenção, a mistura da reação em cadeia da polimerase secundária pode ainda compreender uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas, por exemplo, a sonda de detecção oligonucleotídica TaqMan™. A sonda de detecção se hibridiza a uma sequência nucleotídica alvo dentro do produto de extensão primário ou seu complemento, e tem uma molécula supressora e um marcador detectável que são separados um do outro porém estão em estreita proximidade um do outro de modo que molécula supressora suprima o marcador detectável. Durante a etapa de hibridização do processo de reação em cadeia da polimerase secundário, uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas se hibridizam a porções complementares dos produtos de extensão primários e a molécula supressora e o marcador detectável são subsequentemente clivados a partir de uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas durante a etapa de extensão. Mediante a clivagem, o marcador detectável é separado do supressor de modo que o marcador detectável seja detectado.
[319] Em uma modalidade, um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos primários do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário podem opcionalmente ter uma porção 3’compreendendo um nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo e um grupo bloqueador, de modo que na extremidade 3’ do referido iniciador ou iniciadores seja inadequado para a extensão de polimerase até que o nucleotídeo clivável ou análogo de nucleotídeo seja clivado. Mediante a clivagem, uma extremidade de 3’OH livre é liberada em um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos primários antes de permitir a extensão do iniciador.
[320] Em uma outra modalidade, os iniciadores oligonucleotídicos primários do conjunto de iniciador oligonucleotídico primário compreendem uma porção de sequência nucleotídica 5’ idêntica ou substancialmente idêntica que está entre cerca de 6 a 20 bases em comprimento. De acordo com esta modalidade, os produtos de extensão desejados que são gerados são de comprimeto suficiente de modo que os iniciadores primários preferencialmente se hibridizem com eles. No entanto, when quando um produto dímero do iniciador não desejado se forma, ele formará um grampo nele mesmo através de suas extremidades 5’ complementares e será não adequado para amplificação continuada.
[321] Figura 158 ilustra uma reação de prevenção de transferência de PCR-PCR exemplificadora para detectar metilação de acordo com este aspecto da presente invenção. Nesta modalidade, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e/ou HinPII (GACGC), e UNG para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 158, etapa A). Conforme mostrado na Figura 158, etapa B, as regiões de interesse metiladas são amplificadas usando PCR na presença de dUTP usando iniciadores sítio-específicos. Em uma modalidade, amplificação de ciclos limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons sendo produzidas. Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR contêm dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 158, etapa C). Opcionalmente, a amostra é aliquotada em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. As regiões contendo metila são amplificadas usando iniciadores sítio-específicos e um ensaio de detecção tradicional interno TaqMan™. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência.
[322] A Figura 53 ilustra uma outra reação de prevenção de carryoever de PCR-qPCR para detectar metilação. Similar às outras modalidades da presente invenção, DNA genômico ou cfDNA é isolado e tratado com endonucleases de restrição sensíveis a metila, por exemplo, Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência (Figura 53, etapa A). O DNA digerido é tratado com bissulfeto para converter resíduos não metilados em uracil com isso tornando o DNA de filamento duplo não complementar. Conforme mostrado na Figura 53, etapa B, os iniciadores sítio-específicos contendo um grupo de bloqueio clivável 3’ são hibridizados na presença de BstU1 (CGACG) (triângulos preenchidos), que clivarão o DNA de transferência contendo resíduos não metilados. Quando os iniciadores se hibridizam a sua sequência alvo complementar, o grupo de bloqueio é removido. Nesta modalidade, a região de interesse contendo metila é amplificada usando PCR na presença de dNTP. Nesta modalidade, um iniciador oligonucleotídico bloqueador é usado durante a amplificação para limitar a formação de amplicon do tipo selvagem. Conforme mostrado na Figura 53, etapa C, os produtos de PCR são não metilados fornecendo proteção de transferência.
[323] Conforme mostrado na Figura 53, etapas D e E, os produtos de PCR são aliquotados em poços separados para a detecção TaqMan™ usando iniciadores sítio-específicos que são alojado ou semi-alojados no conjunto primário de iniciadores sítio-específicos, e a sonda TaqMan™ (barra escura). Opcionalmente, um oligonucleotídeo bloqueador (barra escura grossa) também pode ser incorporado nesta reação para limitar a formação de amplicons do tipo selvagem. Nesta modalidade, a reação TaqMan™ é realizada na presença de dUTPs, permitindo a prevenção de transferência.
[324] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico contendo uma sequência ribonucleotídica alvo que difere de sequências ribonucleotídicas em outras moléculas de ácido ribonucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico potencialmente contendo uma sequência ribonucleotídica alvo que difere de sequências ribonucleotídicas em outras moléculas de ácido ribonucleico, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. Um ou mais iniciadores oligonucleotídicos são fornecidos, cada iniciador sendo complementar a uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico contendo uma sequência ribonucleotídica alvo. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais iniciadores oligonucleotídicos, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de transcrição reversa, e moléculas de ácido desoxirribonucleico (cDNA) complementares são geradas na mistura de transcrição reversa. Cada molécula de cDNA compreende uma sequência nucleotídica que é complementar à sequência ribonucleotídica alvo e contém dU. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção da sequência nucleotídica de cDNA adjacente à sequência ribonucleotídica alvo complemento do cDNA, e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico. A mistura de transcrição reversa contendo as moléculas de cDNA é misturada com um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico, e uma polimerase para formar uma mistura de reação da polimerase, e a mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim um ou mais diferentes produtos de extensão primários. O método também envolve fornecer um ou mais conjuntos de sonda oligonucletídica. Cada sonda nucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo- específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção de sequência alvo-específica, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, adjacente uma a outra em um produto de extensão primário complementar com uma junção entre eles. Os produtos de extensão primários são colocados em contato com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação e a primeira e segunda sondas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligase. As sequências de produto ligado na amostra são detectadas e distinguidas identificando assim a presença de uma ou mais moléculas de ácido ribonucleico contendo a sequência ribonucleotídica alvo que difere de sequências ribonucleotídicas em outras moléculas de ácido ribonucleico na amostra devido a splicing alternativo, transcrito alternativo, sítio inicial alternativo, sequência codificante alternativa, sequência não codificante alternativa, inserção de éxon, deleção de éxon, inserção de íntron, translocação, mutação ou outro rearranjo no nível genômico.
[325] As Figuras 54-85 ilustram várias modalidades deste aspect da presente invenção.
[326] A Figura 54 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar translocações no nível do mRNA. Uma ilustração de translocações entre dois genes é mostrada no nível do DNA na Figura 54, etapa A. Exemplos das diferentes junções de fusão entre éxons 1-b (mRNA fusão 1), 2-b (mRNA fusão 2), e 3-b (mRNA fusão 3) nos mRNAs são ilustrados (Figura 54, etapa B). Este método envolve isolar mRNA das células sanguíneas totais, exossomas ou células tumorais circulantes (CTCs) e gerar cDNA usando transcriptase reversa e um iniciador complementar ao éxon b. O cDNA gerado é amplificado por PCR usando iniciadores forward nos éxons 1, 2 e 3 e o iniciador no éxon b (Figura 54, etapa B). Independente do ponto de partida da translocação, os iniciadores amplificarão o menor fragmento contendo a região de junção do éxon. Os vários produtos formados durante a amplificação por PCR são mostrados na Figura 54, etapa C.
[327] LDR é realizada usando sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon. As sondas de ligação podem ser designadas para conter porções específicas de iniciador marcador (por exemplo, Ai, Ci’) adequadas para a detecção subsequente usando iniciadores (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (Figura 54, etapas C-D, painel esquerdo). Alternativamente, as sondas de ligação podem ser designadas para conter porções específicas do iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e porções específicas de marcador (Bi’) (Figura 54, etapas C-D, painel direito). Em seguida à formação da formação de produto de ligação específico da junção de éxon, os produtos de ligação são amplificados por PCR e detectados (Figura 54, etapa D). Quando se usam iniciadores específicos de marcador (Ai, Ci) para amplificar os produtos de LDR, cada sonda TaqMan™ atravessa a junção de ligação e pode ser classificada individualmente. Quando se usam iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci), para amplificar produtos de LDR, o mesmo conjunto de iniciador classifica para a dada translocação, independente da junção de éxon específica.
[328] A Figura 55 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar translocações no nível de mRNA. Nesta modalidade, mRNA é isolado (Figura 55, etapa A), e tratado com UDG para a prevenção de transferência (Figura 55, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 55, etapa B). Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dUTP, permitindo a prevenção de transferência (Figura 55, etapa C).
[329] Conforme mostrado na Figura 55, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porção iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondente de um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 55, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que atravessa a junção de ligação (Figura 55, etapa E). Tratar amostras com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 55, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[330] A Figura 56 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar translocações no nível de mRNA. Nesta modalidade, mRNA é isolado (Figura 56, etapa A), e tratado com UDG para a prevenção de transferência (Figura 56, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 56, etapa B). Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 56, etapa C).
[331] Conforme mostrado na Figura 56, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador-específicas UniTaq (Ai, Ci’) e porção marcadora (Bi’) adequadas para a subsequente amplificação com PCR e detecção, se hibridizam a sequências de ácido nucleico correspondendo à molécula de mRNA alvo a ser detectada (Figuras 56, etapa D). Em seguida à ligação das sondas oligonucleotídicas, a amostra é tratada com UDG para remover amplicons alvo originais, permitindo a amplificação seletiva e a detecção dos produtos de ligação usando iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito supra (Figuras 56, etapas E-F), com isso facilitando a detecção da fusão de mRNA de translocação. Conforme mostrado na Figura 56, etapas E e F, os produtos de ligação amplificados incorporam dUTP para permitir a futura prevenção de transferência.
[332] A Figura 57 ilustra um exemplo de uma reação de prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para detectar translocações no nível de mRNA. Nesta modalidade, mRNA é isolado (Figura 57, etapa A), e tratado com UDG para a prevenção de transferência (Figura 57, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 57, etapa B). Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir uma subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 57, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e uma região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da junção de éxon conforme ilustrado na Figura 57, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 57, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 57, etapa E).
[333] A Figura 58 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar splicing alternativo. Figura 58, etapa A é uma ilustração de um gene com 5 éxons mostrados no nível do DNA, e a Figura 58, etapa B mostra exemplos de mRNAs variantes normais (1-2-3a-4), e de splicing alternativo (1-2-3b- 4). Este método envolve isolar mRNA das células sanguíneas totais, exosomes, or CTCs, e gerar cDNA usando transcriptase reversa com um iniciador complementar ao éxon 4 conforme mostrado na Figura 58, etapa B. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador éxon 4 e um iniciador forward ao exon 2, para gerar amplicons de ambos os variantes de splicing normal e alternativo, caso presentes. Conforme mostrado na Figura 58, etapa C, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo sequências de iniciador marcador(Ai, Ci’; painel esquerdo) ou sequências de iniciador UniTaq e de marcador(Ai, Bi’-Ci’; painel direito) se hibridizam a sua sequência alvo correspondente nos produtos de PCR, and ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos caso haja perfeita complementariedade na junção. Os produtos de ligação são amplificados e detectados usando iniciadores específicos de marcador (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q ou F2-Q, Figura 58, etapa D, painel esquerdo) ou iniciadores UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, F2-Bi-Q-Ai, Ci, Figura 58, etapa D, painel direito), conforme descrito supra.
[334] A Figura 59 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos de mRNA do tipo selvagem e de splicing alternativo. Figura 59, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 3a (superior) alternativamente transcrito de splicing contendo exon 3b (inferior) a serem detectados. Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 59, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 59, etapa B). Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 59, etapa C). Conforme mostrado na Figura 59, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções marcadoras iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 59, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q e F2-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 59, etapa E-F). A variante de splicing do tipo selvagem e alternativo é quantificada e distinguida usando PCR em tempo real e detectando as sondas TaqMan™ marcadas diferentemente. Tratar amostras com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 59, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[335] A Figura 60 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos de mRNA do tipo selvagem e de splicing alternativo. Figura 60, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 3a (superior) e transcrito de splicing alternativo contendo exon 3b (inferior) a serem detectados. Etapas A-D deste método são essencialmente as mesmas que aquelas descritas para a Figura 59, exceto pelo fato de que as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem a uma variante de splicing do tipo selvagem e alternativo são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 60, etapas E-G.
[336] A Figura 61 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para quantificar transcritos de mRNA do tipo selvagem e de splicing alternativo. Figura 61, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 3a (superior) e o transcrito de splicing alternativo contendo exon 3b (inferior) a serem detectados. Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 61, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir a subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 61, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da junção de éxon conforme ilustrado na Figura 61, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 61, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 61, etapa E).
[337] A Figura 62 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar transcritos de nível baixo de splicing alternativo. Figura 62, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 3a (top) e o transcrito de nível baixo de splicing alternativo contendo exon 3b (inferior) a serem detectados. Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 62, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ (isto é to exon 4) e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 62, etapa B). Nesta modalidade, um iniciador específico para a variante de splicing alternativo (isto é, exon 3b), e o qual não se hibridiza à variante do tipo selvagem (isto é, exon 3a), é utilizado para gerar apenas produtos de amplificação correspondentes à variante de splicing alternativo. Os produtos de PCR incorporam dUTP, permitindo a prevenção de transferência (Figura 62, etapa C). Conforme mostrado na Figura 62, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 62, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 62, etapa E-F). A variante de splicing alternativo é detectada durante PCR em tempo real pela liberação do grupo fluorescente da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 62, etapa E). Apenas os produtos de PCR autênticos são amplificados, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[338] As Figuras 63 e 64 ilustram reações de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR e RT-PCR-qLDR similares para detectar transcrito de nível baixo de splicing alternativo conforme descrito e mostrado com relação à Figura 62. Na modalidade da Figura 63, as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação correspondendo à variante de splicing alternativo são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1- Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e conforme ilustrado na Figura 63, etapas E-G. Na modalidade da Figura 64, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 64, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras (D, F2) em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 64, etapa E).
[339] A Figura 65 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar splicing alternativo. Figura 65, etapa A mostra uma ilustração de um gene com 3 exons, e um sítio inicial alternativo e primeiro exon no nível do DNA. Figura 65, etapa B mostra exemplos dos mRNAs normais (1-2-3) e de variantes de splicing alternativo (1a-2-3). Este método envolve isolar mRNA das células sanguíneas totais, exossomas, ou CTCs, e gerar cDNA usando transcriptase reversa com um iniciador complementar ao éxon 2 conforme mostrado na Figura 65, etapa B. O cDNA é amplificado por PCR usando o éxon 2 iniciador e um iniciador forward que é complementar a ambos os exon 1 ou exon 1a para gerar amplicons de ambos os variantes de splicing. Conforme mostrado na Figura 65, etapa C, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo sequências de iniciador marcador (Ai, Ci’; painel esquerdo) ou sequências de iniciador UniTaq e de marcador (Ai, Bi’-Ci’; painel direito) se hibridizam a sua sequência alvo correspondente nos produtos de PCR, e ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos caso haja perfeita complementariedade na junção. Os produtos de ligação são amplificados e detectados usando iniciadores específicos de marcador (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q ou F2-Q; Figura 58, etapa D, painel esquerdo) ou iniciadores UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, F2-Bi-Q-Ai, e Ci, Figura 58, etapa D, painel direito), conforme descrito supra.
[340] A Figura 66 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos contendo o sítio do tipo selvagem e um sítio inicial de transcrição alternativa. Figura 66, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 1 (superior) e o transcrito alternativo tendo exon 1a como o sítio inicial (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 66, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador específico do exon 2 e um iniciador forward que é complementar a ambos exon 1 ou exon 1a para gerar amplicons de ambos os variantes de splicing. A amplificação de PCR limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 66, etapa B). Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 2040 ciclos de PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 66, etapa C). Conforme mostrado na Figura 66, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador-específicas marcadoras (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação de PCR TaqMan™, se hibridizam a sua sequência alvo correspondente de um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 66, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q e F2-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 66, etapa E-F). A variante do sítio inicial do transcrito alternativo e do tipo selvagem é quantificada e distinguida usando PCR em tempo real e detectando as sondas TaqMan™ marcadas diferentemente. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 66, etapa E). Apenas os produtos de LDR autênticos amplificam, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[341] A Figura 67 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos de mRNA do tipo selvagem e de splicing alternativo. Figura 67, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 1 (top) e o transcrito alternativo tendo exon 1a como o sítio inicial (inferior). Etapas A-D deste método são essencialmente as mesmas que aquelas descritas para a Figura 66, exceto pelo fato de que as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq(Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq(Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem aos transcritos do tipo selvagem e variantes são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 67, etapas E-F.
[342] A Figura 68 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para quantificar transcritos de mRNA do tipo selvagem e de splicing alternativo. Figura 68, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 1 (top) e o transcrito alternativo tendo exon 1a como o sítio inicial (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 68, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador do exon 2 e um iniciador forward que é complementar a ambos exon 1 ou exon 1a para gerar amplicons de ambos os variantes de splicing. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir uma subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 68, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da junção de éxon conforme ilustrado na Figura 68, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 68, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 68, etapa E).
[343] A Figura 69 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar o nível baixo do transcrito do sítio inicial alternativo. Figura 69, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exon 1 (top) e o transcrito alternativo tendo exon 1a como o sítio inicial (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 69, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 69, etapa B). Nesta modalidade, um iniciador específico para o transcrito alternativo (isto é, exon 1a), que nã se hibridiza à variante do tipo selvagem (isto é, exon 1), é usado para gerar apenas produtos de amplificação que correspondem ao transcrito alternativo. Os produtos de PCR incorporam dUTP, permitindo a prevenção de transferência (Figura 69, etapa C). Conforme mostrado na Figura 69, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador- específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 69, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separadospara a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 69, etapa E-F). O transcrito alternativo é detectado durante PCR em tempo real pela liberação do grupo fluorescente da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 69, etapa E). Apenas os produtos de PCR autênticos são amplificados, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[344] As Figuras 70 e 71 ilustram reações de prevenção de transferência RT-PCR-LDR-qPCR e RT-PCR-qLDR similares para detectar transcrição do sítio inicial alternativo de nível baixo conforme descrito e mostrado com relação à Figura 69 (etapas A-C), onde apenas iniciadores específicos para a amplificação do transcrito alternativo são utilizados. Na modalidade da Figura 70, as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem ao transcrito do sítio inicial alternativo são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e conforme ilustrado na Figura 70, etapas E-G. Na modalidade da Figura 71, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 71, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras (D, F2) em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 71, etapa E).
[345] A Figura 72 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar deleção de éxons. Figura 72, etapa A mostra uma ilustração de um gene com 5 exons e 4 íntrons no nível do DNA. Figura 72, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo exons 1-5 (superior) e o transcrito alternativo onde exon 4 é deletado (inferior, isto é, éxons 1-3, e 5). Este método envolve isolar mRNA das células sanguíneas totais, exossomas, ou CTCs, e gerar cDNA usando transcriptase reversa com um iniciador complementar ao éxon 5 conforme mostrado na Figura 72, etapa B. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador do éxon 5 em conjunto com iniciadores forward complementares a exon 3 e exon 4 para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e a variante de deleção. Conforme mostrado na Figura 72, etapa C, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo sequências de iniciador marcador (Ai, Ci’; painel esquerdo) ou sequências de iniciador UniTaq e de marcador (Ai, Bi’-Ci’; painel direito), se hibridizam a sua sequência alvo correspondentenos produtos de PCR, e ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos caso haja perfeita complementariedade na junção. Os produtos de ligação são amplificados e detectados usando iniciadores específicos de marcador (Ai, Ci), e sondas TaqMan™ (F1-Q or F2-Q; Figura 72, etapa D, painel esquerdo) ou iniciadores UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, F2-Bi-Q- Ai, e Ci, Figura 72, etapa D, painel direito), conforme descrito supra.
[346] A Figura 73 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos tendo uma deleção de éxons. Figura 73, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exons 1-5 (superior) e o transcrito alternativo tendo apenas éxons 1-3 e 5, onde o éxon 4 está faltando (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 73, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, iniciador específico 5 de éxon) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador 5 de éxon em conjunto com iniciadores forward complementares ao éxon 3 e éxon 4 para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e a variante de deleção. Amplificação de PCR limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 73, etapa B). Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos de PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 73, etapa C). Conforme mostrado na Figura 73, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 73, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separadospara a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q e F2-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 73, etapa E- F). A variante do tipo selvagem e de deleção é quantificada e distinguida usando PCR em tempo real e detectando as sondas TaqMan™ marcadas diferentemente. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 73, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificam, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[347] A Figura 74 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos tendo uma deleção de éxons. Figura 74, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo exons 1-5 (top) e o transcrito alternativo tendo apenas éxons 1-3 e 5, onde o éxon 4 está faltando (inferior). Etapas A-D deste método são essencialmente as mesmas que aquelas descritas para a Figura 73, exceto pelo fato de que as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem aos transcriptos variantes e do tipo selvagem são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 74, etapas E-G.
[348] A Figura 75 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos tendo uma deleção de éxons. Figura 75, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (top) e o transcrito alternativo tendo apenas éxons 1-3 e 5, onde o éxon 4 está faltando (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 75, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, iniciador específico 5 de éxon) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador 5 de éxon em conjunto com iniciadores forward complementares ao éxon 3 e éxon 4 para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e variante de deleção. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir uma subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 75, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da junção de éxon conforme ilustrado na Figura 75, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 75, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 75, etapa E).
[349] A Figura 76 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar transcritos de nível baixo tendo uma deleção de éxons. Figura 76, etapa A ilustra o transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (superior) e o transcrito alternativo tendo apenas éxons 1-3 e 5, onde o éxon 4 está faltando (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 76, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, um iniciador específico 5 de éxon) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador 5 de éxon em conjunto com um iniciador forward complementar ao éxon 3 e um oligonucleotídeo bloqueador. O oligonucleotídeo bloqueador se hibridiza ao éxon 4 no transcrito do tipo selvagem, com isso prevenindo a amplificação de transcritos do tipo selvagem. Consequentemente, apenas produtos de amplificação que correspondem ao transcrito de deleção são gerados. Os produtos de PCR incorporam dUTP, permitindo a prevenção de transferência (Figura 76, etapa C). Conforme mostrado na Figura 76, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções marcadoras iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 76 etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 76, etapa E-F). O transcrito de deleção é detectado durante PCR em tempo real pela liberação do grupo fluorescente da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 76, etapa E). Apenas os produtos de PCR autênticos são amplificados, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[350] As Figuras 77 e 78 ilustram reações de prevenção de transferência similares RT-PCR-LDR-qPCR e RT-PCR-qLDR para detectar transcritos de deleção de nível baixo conforme descrito e mostrado com relação à Figura 76. Na modalidade da Figura 77, as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq(Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem ao transcrito de deleção são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e conforme ilustrado na Figura 77, etapas E-G. Na modalidade da Figura 78, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 78, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras (D, F2) em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 78, etapa E).
[351] A Figura 79 ilustra uma visão geral da reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar splicing alternativo com a inserção de íntrons. Figura 79, etapa A mostra uma ilustração de um gene com 5 éxons e 4 íntrons no nível do DNA. Figura 79, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (top) e o transcrito de splicing alternativo contendo éxons 1-5 com uma inserção de íntron i1 (inferior). Este método envolve isolar mRNA das células sanguíneas totais, exossomas, ou CTCs, e gerar cDNA usando transcriptase reversa com um iniciador complementar ao éxon 2 conforme mostrado na Figura 79, etapa B. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador específico do éxon 2 em conjunto com um iniciador forward ao éxon 1, para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e da inserção de íntrons. Conforme mostrado na Figura 79, etapa C, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo sequências de iniciador marcador (Ai, Ci’; painel esquerdo) ou sequências de iniciador UniTaq e de marcador (Ai, Bi’-Ci’; painel direito) se hibridizam a sua sequência alvo correspondente aos produtos de PCR, e ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos caso haja perfeita complementariedade na junção. Os produtos de ligação são amplificados e detectados usando iniciadores específicos de marcador (Ai, Ci), e sondas TaqMan™ (F1-Q or F2-Q; Figura 79, etapa D, painel esquerdo) ou iniciadores UniTaq (F1- Bi-Q-Ai, F2-Bi-Q-Ai, and Ci, Figura 79, etapa D, painel direito), conforme descrito supra.
[352] A Figura 80 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos de splicing alternativo contendo uma inserção de íntron. Figura 80, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo exons 1-5 (superior) e o transcrito de splicing alternativo contendo exons 1-5 com uma inserção de íntron i1 (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 80, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, exon 2 specific primer) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador específico do exon 2 em conjunto com um iniciador forward no éxon 1 para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e variante de inserção de íntrons. Amplificação de PCR limitada (12-20 ciclos) é realizada para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 80, etapa B). Em uma outra modalidade, as regiões de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 80, etapa C). Conforme mostrado na Figura 80, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções marcadoras iniciador- específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 80, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separadospara a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sondas TaqMan™ (F1-Q and F2-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 80, etapa E-F). A variante do tipo selvagem e a variante de inserção é quantificada e distinguida usando PCR em tempo real e detectando as sondas TaqMan™ marcadas diferentemente. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 80, etapa E). Apenas os produtos de LDR autênticos amplificam, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[353] A Figura 81 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos de splicing alternativo contendo uma inserção de íntron. Figura 81, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (top) e o transcrito de splicing alternativo contendo éxons 1-5 com uma inserção de íntron i1 (inferior). Etapas AD deste método são essencialmente as mesmas que aquelas descritas para a Figura 80, exceto pelo fato de que as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem aos transcritos do tipo selvagem e variantes são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 81, etapas E-G.
[354] A Figura 82 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para quantificar transcritos do tipo selvagem e transcritos de splicing alternativo contendo uma inserção de íntron. Figura 82, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (top) e o transcrito de splicing alternativo contendo éxons 1-5 com uma inserção de íntron i1 (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 82, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, iniciador específico de éxon 2) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador específico do exon 2 em conjunto com um iniciador forward ao éxon 1 para gerar amplicons de ambas a variante do tipo selvagem e variante de inserção de íntrons. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir a subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 82, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da junção de éxon conforme ilustrado na Figura 82, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 82, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 82, etapa E).
[355] A Figura 83 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para detectar transcritos de nível baixo contendo uma inserção de íntron. Figura 83, etapa B mostra exemplos do transcrito do tipo selvagem contendo éxons 1-5 (superior) e o transcrito de splicing alternativo contendo éxons 1-5 com uma inserção de íntrons i1 (inferior). Este método envolve isolar mRNA e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 83, etapa B). cDNA é gerado usando um iniciador específico de transcrito 3’ (por exemplo, um iniciador específico de éxon 2) e transcriptase reversa na presença de dUTP. O cDNA é amplificado por PCR usando o iniciador éxon 2 em conjunto com um iniciador forward específico de íntron. O iniciador específico de íntron não amplifica o transcrito do tipo selvagem, sendo assim apenas transcrito contendo a inserção de íntron i1 é amplificado. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 83, etapa C). Conforme mostrado na Figura 83, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação específicas da junção do éxon contendo porções iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 83, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 83, etapa E-F). O transcrito contendo a inserção de íntrons é detectado durante PCR em tempo real pela liberação do grupo fluorescente da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 83, etapa E). Apenas os produtos de PCR autênticos são amplificados, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[356] As Figuras 84 e 85 ilustram reações de prevenção de transferência similares RT-PCR-LDR-qPCR e RT-PCR-qLDR para detectar transcritos de inserção de íntron de nível baixo conforme descrito e mostrado com relação à Figura 83. Na modalidade da Figura 84, as sondas de ligação específicas da junção de éxon são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação que correspondem ao transcrito da inserção de íntron são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1- Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e conforme ilustrado na Figura 84, etapas E-G. Na modalidade da Figura 85, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 85, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras (D, F1) em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 85, etapa E).
[357] Os métodos da presente invenção são adequados para quantificar ou enumerar a quantidade de ums ou mais sequências nucleotídicas alvo em uma amostra. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para enumerar o número de cópias de uma ou mais moléculas de ácido nucleico alvo em uma amostra conforme ilustrado na Figuras 86-91.
[358] A Figura 86 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR para enumerar o número de cópias de DNA. Este método envolve isolar DNA das CTCs, exossomas específicos tumorais, ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 86, etapa B). As regiões cromossômicas de interesse são amplificadas usando PCR de ciclo limitado (12-20 ciclos) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 86, etapa B). Em uma outra modalidade, as regiões cromossômicas de interesse são amplificadas usando 20-40 ciclos. Para a precisa enumeração, a amostra é dispersada em 12, 24, 48 ou 96 poços antes da amplificação por PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 86, etapa C). Conforme mostrado na Figura 86, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação sítio-específicascontendo porção iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 86, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™ (F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 86, etapa E-F). O número de cópias do DNA é determinado com base na distribuição de Poisson de sinal nos diferentes poços ou câmaras. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 86, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[359] A Figura 87 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de PCR-LDR-qPCR para enumerar o número de cópias de DNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas (isto é, etapas A-D) conforme o método ilustrado na Figura 86; no entanto, nesta modalidade, as sondas de ligação sítio-específicas são designadas para conter Sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 87, etapas E-G. O número de cópias é determinado com base na distribuição de Poisson de signal nos diferentes poços ou câmaras.
[360] a Figura 88 também ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-qLDR para enumerar o número de cópias de DNA. Este método envolve isolar DNA das CTCs, exossomas específicos tumorais, ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 88, etapa B). As regiões de interesse cromossômicassão amplificadas usando PCR de ciclo limitado (12-20 ciclos) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 88, etapa B). Em uma outra modalidade, as regiões de interesse cromossômicas são amplificadas usando 20-40 ciclos. Para enumeração precisa, a amostra é dispersada em 12, 24, 48 ou 96 poços antes da amplificação com PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir uma subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 88, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação sítio- específicas conforme ilustrado na Figura 88, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 88, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam um no outro colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 88, etapa E). O número de cópias é determinado com base na distribuição de Poisson de sinal nos diferentes poços ou câmaras.
[361] A Figura 89 ilustra a reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para enumerar o número de cópias de RNA. Este método envolve isolae RNA das células sanguíneas totais, exossomas, CTCs, ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 89, etapa B). cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 89, etapa B). Para enumeração precisa, a amostra é dispersada em 12, 24, 48 ou 96 poços antes da amplificação com PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 811 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 89, etapa C). Conforme mostrado na Figura 89, etapa D, as sondas oligonucleotídicas de ligação sítio-específicas contendo porções marcadoras iniciador-específicas (Ai, Ci’) adequadas para a subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 89, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separadospara a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que transpõem a junção de ligação (Figura 89, etapa E-F). O número de cópias de RNA é quantificado usando PCR em tempo real com base na distribuição de Poisson de sinal nos diferentes poços ou câmaras. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 89, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[362] A Figura 90 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para enumerar o número de cópias de RNA. Para enumeração precisa, a amostra é dispersada em 12, 24, 48, ou 96 poços antes da amplificação com PCR. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas (isto é, etapas A-D) como o método ilustrado na Figura 89; no entanto, nesta modalidade, as sondas de ligação sítio-específicas são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 90, etapas E-G. O número de cópias é determinado com base na Distribuição de Poisson de sinal nos diferentes poços ou câmaras.
[363] A Figura 91 ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para enumerar o número de cópias de RNA. Este método envolve isolar RNA das células sanguíneas totais, exosomes, CTCs, or uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 91, etapa B). Para enumeração precisa, a amostra é dispersada em 12, 24, 48 ou 96 poços antes da amplificação com PCR. cDNA é gerado usando iniciadores específicos de transcrito 3’ e transcriptase reversa na presença de dUTP. Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) para manter razões relativas de diferentes amplicons (Figura 91, etapa B). Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porções iniciador-específicas universais para permitir a subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 91, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação sítio-específicas conforme ilustrado na Figura 91, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da junção de éxon de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 91, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 91, etapa E). O número de cópias é determinado com base na Distribuição de Poisson de sinal nos diferentes poços ou câmaras. Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, um ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo diferindo das sequências micro- ribonucleotídicas em outras moléculas de miRNAna amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA potencialmente contendo a sequência micro-ribonucleotídica alvo diferindo das sequências micro- ribonucleotídicas em outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 5’ haste-alça, um grupo bloqueador, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, e uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a uma porção 3’ da molécula de miRNA contendo a sequência micro-ribonucleotídica alvo, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico tendo uma porção 3’ de sequência nucleotídica que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da molécula de miRNA contendo a sequência micro- ribonucleotídica alvo, e a porção 5’ iniciador-específica, (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma como a porção iniciadora interno-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico, e (d) um quarto iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do segundro iniciador oligonucleotídico. A amostra colocada em contato é misturada com um ou mais dos primeiros iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa. O primeiro iniciador oligonucleotídico se hibridiza à molécula de miRNA contendo a sequência micro-ribonucleotídica alvo, caso presente na amostra, e a transcriptase reversa estende a extremidade 3’ do primeiro iniciador oligonucleotídico hibridizado para gerar um primeiro iniciador oligonucleotídico estendido compreendendo o complemento da molécula de miRNA contendo a sequência micro-ribonucleotídica alvo. O método também envolve misturar a mistura da reação de transcrição reversa com o segundo, terceiro e quarto iniciadores oligonucleotídicos do conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase sob condições eficazes para um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para se hibridizar à região do primeiro iniciador oligonucleotídico estendido compreendendo o complemento da molécula de miRNA contendo a sequência micro-ribonucleotídica alvo e estender para gerar um produto de extensão primário compreendendo a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica correspondendo a uma sequência micro- ribonucleotídica alvo da molécula de miRNA, e o complemento da porção de iniciador interno-específica. A mistura de reação em cadeia da polimerase é submetida a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim uma pluralidade de produtos de extensão primários. O método também envolve misturar a pluralidade de produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica e uma porção complementar a um produto de extensão primário, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, adjacentes uma a outra em porções alvo-específicas complementares de um produto de extensão primário com uma junção entre eles. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligadas na amostra são detectadas e distinguidas com isso identificando uma ou mais moléculas de miRNA contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo diferindo das sequências micro-ribonucleotídicas em outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[364] A Figura 92 ilustra a reação de prevenção de transferência de PCR-LDR para quantificar miRNA. Este método envolve isolar RNA a partir de exossomas ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 92, etapa B). Um iniciador oligonucleotídico tendo uma porção que é complementar à extremidade 3’ do miRNA alvo, e contendo uma haste-alça, marcador (Tj), e grupo bloqueador (círculo preenchido) é hibridizado na extremidade 3’ do miRNA alvo. A extremidade 3’ do iniciador oligonucleotídico é estendida usando transcriptase reversa (diamante preenchido) na presença de dUTP (Figura 92, etapa B). Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) usando um iniciador de ponte compreendendo uma sequência que é complementar a uma porção do miRNA reverso transcrito e uma porção de sequência a montante iniciador-específica (Ti), e iniciadores de marcador (Ti, Tj) conforme mostrado na Figura 92, etapa B. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Opcionalmente, a amostra pode ser alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos de PCR incorporam dUTP, permitindo a prevenção de transferência (Figura 92, etapa C). Conforme mostrado na Figura 92, etapa D, sondas de ligação específicas da sequência de miRNA contendo porções iniciador- específicas (Ai, Ci’) adequadas para subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondente nos produtos de PCR de um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 92, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que atravessa a junção de ligação (Figura 92, etapa E-F). A presença do miRNA na amostra é quantificada usando PCR em tempo real com base na detecção do marcador liberado da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 92, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[365] A Figura 93 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas (isto é, etapas A-D) como no método ilustrado na Figura 92; no entanto, nesta modalidade, as sondas de ligação específicas de miRNA são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq (Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi- Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 93, etapas E-G.
[366] A Figura 94 também ilustra a reação da prevenção de transferência de RT-PCR-qLDR para quantificar miRNA. Este método envolve isolar RNA a partir de exossomas ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 94, etapa B). Um iniciador oligonucleotídico tendo uma porção que é complementar à extremidade 3’ do miRNA alvo, e contendo uma haste- alça, marcador (Tj), e grupo bloqueador (círculo preenchido) é hibridizado na extremidade 3’ do miRNA alvo. A extremidade 3’ do iniciador oligonucleotídico é estendida usando transcriptase reversa (diamante preenchido) na presença de dUTP (Figura 94, etapa B). Taq polimerase é ativada para realizar amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20) usando um iniciador em ponte compreendendo uma sequência que é complementar a uma porção do miRNA reverso transcrito e uma porção de sequência a montante iniciador-específica (Ti), e iniciadores de marcador (Ti, Tj) conforme mostrado na Figura 94, etapa B. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador e porçõs iniciador-específicas universais para permitir a subsequente amplificação de PCR universal usando iniciadores marcados com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 94, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da sequência de miRNA conforme ilustrado na Figura 94, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da sequência de miRNA de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 94, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 94, etapa E).
[367] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para identificar, em uma amostra, um ou mais moléculas de ácido micro-ribonucleico (miRNA) contendo uma sequência micro- ribonucleotídica alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases. Este método envolve fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de miRNA potencialmente contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA em uma ou mais diferenças de base, e colocar a amostra em contato com uma ou mais enzimas capazes de digerir dU contendo moléculas de ácido nucleico potencialmemte presentes na amostra. A amostra colocada em contato é misturada com uma ligase e uma primeira sonda oligonucleotídica compreendendo um fosfato 5’, uma porção 5’ haste- alça, uma porção iniciadora interno-específica dentro da região da alça, um grupo bloqueador, e uma sequência nucleotídica 3’ que é complementar a uma porção 3’ da molécula de miRNA contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo para formar uma reação de ligação. O método também envolve ligar a molécula de miRNA contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo em sua extremidade 3’ ao fosfato 5’ da primeira sonda oligonucleotídica para gerar a molécula de ácido nucleico quimérico compreendendo a molécula de miRNA molecule contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo, caso presente na amostra, anexada à primeira sonda oligonucleotídica. Um ou mais conjuntos de iniciador oligonucleotídico são fornecidos, cada conjunto de iniciador compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico compreendendo a sequência nucleotídica 3’ que é complementar a um complemento da extremidade 5’ da molécula de miRNA contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo, e a porção 5’ iniciador-específica, (b) um segundo iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção de iniciador interno-específica da primeira sonda oligonucleotídica, e (c) um terceiro iniciador oligonucleotídico compreendendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que a porção 5’ iniciador-específica do primeiro iniciador oligonucleotídico. A molécula de ácido nucleico quimérico é misturada com um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma transcriptase reversa para formar uma mistura de reação de transcrição reversa, em que um ou mais dos segundos iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador se hibridizam à porção de iniciador interno-específica da molécula de ácido nucleico quimérico, e se estende em sua extremidade 3’ para gerar um complemento da molécula de ácido nucleico quimérico, caso presente na amostra. O método também envolve misturar a mistura da reação de transcrição reversa com o primeiro e terceiro iniciadores oligonucleotídicos de um conjunto de iniciador para formar uma mistura de reação da polimerase, e submeter a mistura de reação em cadeia da polimerase a um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão com isso formando produtos de extensão primários. Os produtos de extensão primários compreendem a porção 5’ iniciador-específica, uma sequência nucleotídica que corresponde a uma sequência micro- ribonucleotídica alvo da molécula de miRNA, e a porção de iniciador interno-específica ou complementos dos mesmos. Os produtos de extensão primários são misturados com uma ligase e um ou mais conjuntos de sonda oligonucleotídica para formar uma mistura de reação da ligação. Cada conjunto de sonda oligonucleotídica compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica e uma porção complementar a um produto de extensão primário, em que a primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sonda são configuradas para hibridizar, de uma forma específica para base, adjacentes uma a outra em porções alvo-específicas complementares de um produto de extensão primário com uma junção entre eles. A primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um ou mais dos conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas de forma conjunta para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação da ligação, e as sequências de produto ligado na amostra são detectadas e distinguidas com isso identificando uma ou mais moléculas de miRNA contendo uma sequência micro-ribonucleotídica alvo diferindo em sequência das outras moléculas de miRNA na amostra em uma ou mais bases.
[368] A Figura 95 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve isolar RNA a partir de exossomas e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 95, etapa B). Uma sonda oligonucleotídica tendo uma porção que é complementar à extremidade 3’ do miRNA alvo, e contendo a haste-alça, marcador (Tj’), e grupo bloqueador (círculo preenchido) é ligada a sua extremidade 5’ a uma extremidade 3’ do miRNA alvo. O produto de ligação compreende o miRNA, marcador Tj’, o grupo de bloqueio, e uma sequência complementar a uma porção 3’ do miRNA (Figura 95, etapa B). cDNA é gerado usando a primer to Tj’ and transcriptase reversa. O cDNA é amplificado por Taq polymerase em uma amplificação de PCR de ciclo limitado (12-20 ciclos) usando um iniciador em ponte compreendendo uma sequência que é complementar a uma porção of the reverse transcribed miRNA and an porção de sequência a montante iniciador- específica(Ti) e iniciadores de marcador (Ti, Tj)conforme mostrado na Figura 95, etapa B. Alternativamente, o cDNA é amplificado usando 2040 ciclos de PCR. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Opcionalmente, a amostra pode ser alíquota em 12, 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 95, etapa C).
[369] Conforme mostrado na Figura 95, etapa D sondas de ligação específicas da sequência de miRNA contendo porções iniciador- específicas (Ai, Ci’) adequadas para a subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondentede um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 95, etapa D), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que atravessa a junção de ligação (Figura 95, etapa E-F). A presença do miRNA na amostra é quantificada usando PCR em tempo real com base na detecção do marcador liberado da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 95, etapa E). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[370] A Figura 96 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas (isto é, etapas A-D) como o método ilustrado na Figura 95; no entanto, nesta modalidade, as sondas de ligação específicas de miRNA são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq(Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real com iniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 96, etapas E-G.
[371] A Figura 97 ilustra a reação da prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-qLDR para quantificar miRNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas, isto é, etapas A e B, conforme descrito e ilustrado na Figura 95. No entanto, nesta modalidade, o cDNA que é produzido na etapa B é amplificado usando pelo menos um iniciador marcado com biotina para anexar uma biotina 5’ aos produtos de amplificação contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 97, etapa C). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da sequência de miRNA conforme ilustrado na Figura 97, etapa D. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da sequência de miRNA de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 97, etapa D), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 97, etapa E).
[372] A Figura 98 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve isolar RNA a partir de exossomas ou uma outra amostra biológica, e tratar com UDG para a prevenção de transferência (Figura 98, etapa B). Uma sonda oligonucleotídica tendo uma porção que é complementar à extremidade 3’ do miRNA alvo, e contendo a haste- alça, tag (Tj’), e grupo bloqueador (círculo preenchido) é ligada em sua extremidade 5’ a uma extremidade 3’ do miRNA alvo. O produto de ligação compreende o miRNA, Tj’ tag, o grupo de bloqueio, e uma sequência complementar a uma porção 3’ do miRNA (Figura 98, etapa B). cDNA é gerado usando iniciador Tj e transcriptase reversa. O cDNA é amplificado por Taq polimerase em uma amplificação por PCR de ciclo limitado (12-20 ciclos) usando um iniciador em ponte compreendendo uma sequência que é complementar a uma porção do miRNA transcrito reverseo e uma porção de sequência a montante iniciador-específica (Ti) e iniciadores marcadores (Ti, Tj), onde o iniciador em ponte contém um grupo de bloqueio clivável em sua extremidade 3’ conforme mostrado na Figura 98, etapa C. Alternativamente, o cDNA é amplificado usando 20-40 ciclos de PCR. Conforme descrito supra, o espaçador C3 é um grupo de bloqueio adequado, e uma base RNA (r) é clivada usando RNaseH (símbolo de estrela) apenas quando o iniciador se hibridiza a seu alvo complementar. Os iniciadores contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Opcionalmente, a amostra pode ser alíquota em 24, 48 ou 96 poços antes do PCR. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 98, etapa D).
[373] Conforme mostrado na Figura 98, etapa E, as sondas de ligação específicas da sequência de miRNA contendo porções iniciador- específicas (Ai, Ci’) adequadas para a subsequente amplificação com PCR, se hibridizam a sua sequência alvo correspondente de um modo específico para base. Ligase covalentemente sela os dois oligonucleotídeos juntos (Figura 98, etapa E), e os produtos de ligação são aliquotados em poços separados para a detecção usando iniciadores marcadores (Ai, Ci) e sonda TaqMan™(F1-Q) que atravessa a junção de ligação (Figura 98, etapa F-G). A presença do miRNA na amostra é quantificada usando PCR em tempo real com base na detecção do marcador liberado da sonda TaqMan™. Amostras são tratadas com UDG para a prevenção de transferência, que também destroi os amplicons alvo originais (Figura 98, etapa F). Apenas produtos de LDR autênticos amplificarão, quando se usa PCR na presença de dUTP. Nem os iniciadores de PCR originais nem as sondas de LDR amplificam produtos de LDR, fornecendo proteção de transferência adicional.
[374] A Figura 99 ilustra uma outra reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas (isto é, etapas A-E) como o método ilustrado na Figura 98; no entanto, nesta modalidade, as sondas de ligação específicas de miRNA são designadas para conter sequências de iniciador UniTaq (Ai, Ci’) e uma sequência de marcador UniTaq(Bi’). Consequentemente, nesta modalidade, os produtos de ligação são subsequentemente amplificados, detectados e quantificados usando PCR em tempo real comIniciadores específicos de UniTaq (F1-Bi-Q-Ai, Ci) conforme descrito acima e ilustrado na Figura 99, etapas F-H.
[375] A Figura 100 ilustra a reação de prevenção de transferência de ligação-RT-PCR-LDR-qPCR para quantificar miRNA. Este método envolve essencialmente as mesmas etapas, isto é, etapas A e B, conforme descrito e ilustrado na Figura 98. No entanto, nesta modalidade, o cDNA que é produzido na etapa B é amplificado usando pelo menos um iniciador marcado com biotina para formar produtos biotinilados contendo a região de interesse. Os produtos de PCR incorporam dU, permitindo a prevenção de transferência (Figura 100, etapa D). Os produtos de PCR biotinilados são imobilizados em um suporte sólido e a região de interesse é detectada usando sondas de ligação específicas da sequência de miRNA conforme ilustrado na Figura 100, etapa E. Nesta modalidade, as sondas de ligação específicas da sequência de miRNA de um par de ligação contêm sequências de terminação complementares e um grupo aceptor ou doador, respectivamente, capazes de gerar um sinal detectável via FRET quando colocadas em estreita proximidade uma da outra conforme descrito supra. Consequentemente, em seguida à ligação (Figura 100, etapa E), as extremidades de terminação 5’ e 3’ complementares dos produtos de ligação se hibridizam uma na outra colocando suas respectivas porções doadoras e aceptoras em estreita proximidade uma da outra para gerar um sinal FRET detectável (Figura 100, etapa F).
[376] Conforme descrito em maiores detalhes no presente documento, o método da presente invenção é capaz de detectar moléculas de ácido nucleico pouco abundantes compreendendo uma ou mais mutações de base nucleotídica, inserções, deleções, translocações, variantes de splicing, variantes de miRNA, transcritos alternativos, sítios iniciais alternativos, sequências codificantes alternativas, sequências não codificantes alternativas, variantes alternativas, inserções de éxons, deleção de éxons, inserções de íntrons, outro rearranjo no nível genômico, e/ou bases nucleotídicas metiladas.
[377] Conforme usado no presente documento "molécula de ácido nucleico pouco abundante" se refere a uma molécula de ácido nucleico alvo que está presente em níveis tão baixos quanto 1% a 0.01% da amostra. Em outras palavras, uma molécula de ácido nucleico pouco abundante com uma ou mais mutações de base nucleotídica, inserções, deleções, translocações, variantes de splicing, variantes de miRNA, transcritos alternativos, sítios iniciais alternativos, sequências codificantes alternativas, sequências não codificantes alternativas, variantes alternativas, inserções de éxons, deleção de éxons, inserções de íntrons, outro rearranjo no nível genômico, e/ou bases nucleotídicas metiladas podem ser distinguidas a partir de um excesso de 100 a 10,000 vezes de moléculas de ácido nucleico na amostra (isto é, moléculas de ácido nucleico muito abundantes) tendo uma sequência nucleotídica similar as das moléculas de ácido nucleico pouco abundantes porém sem uma ou mais mutações de base nucleotídica, inserções, deleções, translocações, variantes de splicing, variantes de miRNA, transcritos alternativos, sítios iniciais alternativos, sequências codificantes alternativas, sequências não codificantes alternativas, variantes alternativas, inserções de éxons, deleção de éxons, inserções de íntrons, outro rearranjo no nível genômico, e/ou bases nucleotídicas metiladas.
[378] Em algumas modalidades da presente invenção, the copy number of um ou mais low abundance target nucleotide sequences são quantificados relative to the copy number of moléculas de ácido nucleico muito abundantes na amostra having a sequência nucleotídica similar as the moléculas de ácido nucleico pouco abundantes. In outras modalidades da presente invenção, the um ou mais target nucleotide sequences são quantificados relative to other nucleotide sequences na amostra. In outras modalidades da presente invenção, the relative copy number of um ou mais target nucleotide sequences is quantified. Methods of relative and absolute (isto é, copy number) quantitation are wellconhecida na técnica.
[379] As moléculas de ácido nucleico alvo pouco abundantes a serem detectadas podem estar presentes em qualquer amostra biológica, incluindo, sem limitação, tecido, células, soro, sangue, plasma, líquido amniótico, esputo, urina, fluidos corporais, secreções corporais, excreções corporais, ácidos nucleicos circulantes livres de células, ácidos nucleicos tumorais circulantes livres de células, ácidos nucleicos fetais circulantes livres de células em mulheres grávidas, células tumorais circulantes, tumor, biopsia tumoral e exossomas.
[380] Os métodos da presente invenção são adequados para diagnosticar ou prognosticar um estado de doença e/ou distinguir um genótipo ou predisposição para doença.
[381] Com relação à detecção precoce de câncer, os métodos da presente invenção são adequados para detectar ambas as mutações repetidas em genes conhecidos (por exemplo, CRAF, KRAS), e mutações incomuns em genes conhecidos (por exemplo, p53) quando presentes em 1% a 0.01% da amostra. Os métodos da presente invenção também podem alcançar quantificação precisa do mRNA específico tumoral isolado a partir de exossomas (por exemplo, uma dúzia de marcadores de expressão que diferenciam tecido tumoral no cólon de mucosa normal), e miRNA tumoral específico isolado a partir de exossomas ou proteínas Argonaut (por exemplo, uma dúzia de marcadores microRNA que diferenciam tecido tumoral no cólon de mucosa normal). Os métodos da presente invenção também rendem quantificação precisa de mudanças em cópias tumorais específicas no DNA isolado a partir de células tumorais circulantes (por exemplo, uma dúzia de mudanças na cópia que diferenciam tecido tumoral no cólon de mucosa normal), e a detecção de mutações no DNA isolado a partir de células tumorais circulantes. (por exemplo, genes KRAS, BRAF, AKT, p53, BRCA1).
[382] A presente invenção também é capaz de quantificar precisamente (i) mRNA específico tumoral isolado a partir de exossomas ou células tumorais circulantes, (ii) miRNA específico tumoral isolado a partir de exossomas ou proteínas Argonaut, e (iii) mudanças na cópia específicas tumorais no DNA isolado a partir de células tumorais circulantes que podem prever resultado ou orientar no tratamento. A presente invenção também pode detectar mutações no DNA isolado a partir de células tumorais circulantes, por exemplo genes KRAS, BRAF, AKT, p53, BRCA1 ou outros genes que podem prever resultado ou orientar no tratamento.
[383] Com relação ao diagnóstico pré-natal, os métodos da presente invenção são capazes de detectar aneuploide através da contagem do número de cópias (por exemplo, Trissomia 21), doenças herdadas diseases contendo mutações comuns em genes conhecidos (por exemplo Anemia Falciforme, Fibrose Cística), doenças herdadas contendo mutações incomuns em genes conhecidos (por exemplo, polipose adenomatosa familiar), doenças herdadas que surgem de perda ou ganho de número de cópias conhecido ou esporádico em genes conhecidos (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne), e teste de paternidade.
[384] Um aspecto importante da implementação dos ensaios descritos acima em um teste clínico é a redução na quantidade de trabalho necessário para preencher fileiras e colunas com amostras, reagentes e sondas/iniciadores específicos do ensaio. Placas com noventa e seis poços são o padrão na maior parte dos laboratórios, porém placas com 384 poços rendem uma maior taxa de transferência e redução no custo de cada poço para ensaio. Parte do impedimento de sua adoção foi o trabalho aumentado associado com essas placas, que pode ser resolvido ao se usar robôs para a pipetagem, porém a um considerável gasto de capital. Dependendo da específica configuração de ensaios na placa, acrescenta-se um gasto significativo pelo uso aumentado de pontas de pipeta. Uma modalidade dos ensaios descrita acima requer a dispersão de 24 reações multiplex PCR-LDR nas 24 colunas de uma placa de microtitulação seguido pela dispersão de 16 diferentes conjuntos de sondas marcadoras LDR ao longo das fileiras da placa. Este arranjo para o ensaio necessitaria de 48 liberações por uma pipetador com 8 canais para prencher as colunas e depois 48 liberações por uma pipetador com 8 canais para preencher todas as fileiras. As placas tendo 1536 poços têm a vantagem de reduzir o custo de um ensaio ainda mais, porém demanda preenchimento automático já que elas estão acima das habilidades mecânicas de um operador humano. Os dispositivos que foram comercializados permitem o preenchimento simultâneo de muitas fileiras e colunas com um número reduzido de etapas de pipetagem com o uso de dispositivos microfluídicos que usam poucos canais de volume morto que introduzem líquidos em cada "poço", porém necessitam da complicação adicionada de válvulas e controladores de válvula externos. Claramente se garante uma abordagem diferente.
[385] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um dispositivo para uso em combinação com uma placa de microtitulação para adicionar líquidos simultaneamente a dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação tendo superfícies superiores e inferiores opostas com a superfície superior tendo aberturas que levam aos poços e a superfície inferior definindo extremidades fechadas dos poços. O dispositivo compreende uma primeira camada definida pelo primeiro e segundo limites com câmaras dosadoras que se estendem entre o primeiro e segundo limites da referida primeira camada e em comunicação de fluido uma com a outra. A primeira camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, próxima à placa de microtitulação com o primeiro limite da primeira camada mais próximo da superfície superior da placa de microtitulação e cada uma das câmaras dosadoras estando em comunicação de fluido com um poço individual em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação. A primeira camada ainda compreende uma câmara de preenchimento em comunicação de fluido com uma ou mais das câmaras dosadoras. O dispositivo compreende uma segunda camada definida pelo primeiro e segundo limites com um orifício de preenchimento que se estendem entre o primeiro e segundo limites da segunda camada. A segunda camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, próxima a uma primeira camada com o primeiro limite da segunda camada mais próximo ao segundo limite da primeira camada e o orifício de preenchimento estando alinhado com a câmara de preenchimento. Quando a primeira camada, segunda camada, e placa de microtitulação estão posicionadas uma com relação à outra em suas posições operacionais, o líquido que entra no dispositivo através do orifício de preenchimento passará pela câmara de preenchimento, câmaras dosadoras, e em dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação.
[386] Em algumas modalidades, o dispositivo da presente invenção ainda compreende uma camada intermediária tendo primeiro e segundo limites com passagens da camada intermediária que se estendem entre o primeiro e segundo limites da referida camada intermediária. A camada intermediária é configurada para se assentar, em uma posição operacional, entre a placa de microtitulação e a primeira camada com o primeiro limite da camada intermediária adjacente à superfície superior da placa de microtitulação e o segundo limite da camada intermediária adjacente ao primeiro limite da primeira camada. Uma das passagens da camada intermediária está alinhada com um poço individual em uma fileira e/ou coluna da placa de microtitulação, onde, quando a primeira camada, a segunda camada, a camada intermediária, e a placa de microtitulação estão posicionadas uma com relação à outra em suas posições operacionais, o líquido que entra no dispositivo através do orifício de preenchimento passará pela câmara de preenchimento, câmaras dosadoras, passagens da camada intermediária e nos poços da placa de microtitulação.
[387] O dispositivo da presente invenção pode ainda compreender a terceira camada tendo primeiro e segundo limites com um orifício de preenchimento connector que se estende entre o primeiro e segundo limites da terceira camada. A terceira camada é configurada para se assentar, em uma posição operacional, entre a primeria e a segunda camadas com o primeiro limite da terceira camada adjacente ao segundo limite da primeira camada e o conector do orifício de preenchimento estando alinhado com o orifício de preenchimento. Quando a primeira camada, a segunda camada, a terceira camada, a camada intermediária, e a placa de microtitulação estão posicionadas uma com relação à outra em suas posições operacionais, o líquido que entra no dispositivo através do orifício de preenchimento passará pelo conector do orifício de preenchimento, câmara de preenchimento, câmaras dosadoras, passagens da camada intermediária e nos poços da placa de microtitulação.
[388] As Figuras 103-112 retratam uma modalidade exemplificadora do dispositivo da invenção. A Figura 103 mostra uma vista superior e lateral de uma porção de uma típica placa de microtitulação com 384 poços 100 que é usada em combinação com o dispositivo da presente invenção. A placa de microtitulação é definida por vários poços 103, cada poço tendo uma extremidade aberta, superior 104 que é adequada para receber uma amostra e/ou reagentes de reação e uma extremidade inferior, fechada 102. A Figura 104 mostra uma vista em perspectiva da placa de microtitulação da Figura 103.
[389] As Figuras 105 e 106 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da camada intermediária 106 do dispositivo posicionado adjacente à superfície superior da placa de microtitulação 100. A camada intermediária 106 do dispositivo contém passagens intermediárias 108 que se estendem através da camada intermediária. Cada passagem intermediária 108 da camada intermediária 106 se alinha com um poço individual 103 da fileira ou da coluna da placa de microtitulação 100. Em uma modalidade, as passagens da camada intermediária funcionadm como válvulas de ruptura para controlar ou prevenir o fluxo do líquido a partir da câmara de medição nos poços da placa de microtitulação. O diâmetro do canal vertical das passagens da camada intermediária 108 cria tensão superficial que impede que o líquido vaze para fora da câmara de medição 120 (veja a Figura 107) até que a força centrífuga seja aplicada. Em algumas modalidades, as paredes verticais das passagens da camada intermediária 108 são compostas de ou são revestidas com um material hidrofóbico que aumenta a resistência do fluxo do fluido para fora da câmara de medição 120 até que a força centrífuga seja aplicada. Os materiais hidrofóbicos adequados incluem qualquer material com um ângulo de contato com água de >90o, tal como, por exemplo, copolímero de olefina cíclica, polietileno, polipropileno, polidimetilsiloxano, etileno polipropileno fluorado, politetrafluoroetileno. Alternativamente, a parede das passagens da camada intermediária passages pode ser composta de um material hidrofílico tendo um ângulo de contato com água de <90o, porém tratado com um revestimento hidrofóbico, por exemplo, negro de fumo Teflon, para criar uma superfície super-hidrofóbica tendo ângulos de contato com água de >150o.
[390] A razão da resistência das passagens da camada intermediária 108 ao volume da câmara de medição 120 (veja a Figura 107) é prontamente calculada por um versado na técnica. Outras modalidades de válvulas passivas que liberam o líquido sob a influência de uma força externamente aplicada podem alternativamente ser empregadas.
[391] Conforme retratado nas Figuras 105 e 106, a camada intermediária 106 também contém uma passagem de extravazamento 110 que conecta a câmara de extravazamento 116 da primeira camada com a câmara de preenchimento 118 da primeira camada (veja a Figura107).
[392] O posicionamento e a orientação adequados do dispositivo na superfície superior de uma placa de microtitulação são alcançados ao colocar o dispositivo no perímetro da parte superior das placas de microtitulação conforme mostrado nas Figuras 101 e 102. O alinhamento adicional de cada uma das câmaras dosadoras pode ser alcançado pelo uso de flanges ou saias 112 na camada intermediária 106 que tem ligação com a extremidade aberta 104 de cada poço 103 da placa de microtitulação 100 conforme mostrado na vista lateral da Figura 105. Outras modalidades de posiconamento por um versado na técnica, por exemplo com base em pequenos flanges na parte superior dos poços da placa de microtitulação. Embora não pretenda prover um selo hermético, os flanges ou saias 112 da camada intermediária 106 conforme retratado na Figura 105 provêem alguma medida de controle de contaminação cruzada entre poços adjacentes da placa de microtitulação 100.
[393] As Figuras 107 e 108 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da primeira camada 114 do dispositivo, operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da camada intermediária 106 do dispositivo. A primeira camada 114 do dispositivo contém câmaras dosadoras 120 que estão em comunicação de fluido uma com a outra através de canais de câmara de medição 122, e com poços individuais 103 da placa de microtitulação. As câmaras dosadoras 120 têm um volume fixado para controlar o volume de líquido liberado em cada poço 103 da placa de microtitulação 100. As câmaras dosadoras 120 recebem líquido da câmara de preenchimento 118 através de ação capilar do líquido ou através de força mecânica, por exemplo, a força de uma pipeta empurrando líquido na câmara de preenchimento 118. Em uma modalidade, as câmaras dosadoras 120 do dispositivo têm todas o mesmo volume de medição. Em uma outra modalidade, as câmaras dosadoras 120 têm diferentes volumes de medição por fileira e/ou coluna. As paredes da câmara de preenchimento, câmaras dosadoras, e dos canais da câmara de medição podem ser compostos de ou revestidos com um material hidrofílico.
[394] Conforme ilustrado nas Figuras 107 e 108, cada câmara de medição 120 está em comunicação de fluido com os poços 103 da placa de microtitulação através de passagens da camada intermediária 108. Conforme descrito supra, as passagens da camada intermediária podem funcionar como uma válvula de ruptura para impedir que o líquido na câmara de medição 120 vaze nos poços 103 da placa de microtitulação 100 até que a força adequada seja aplicada, por exemplo, força centrífuga.
[395] A primeira camada 114 do dispositivo também contém uma câmara de extravazamento 116 conforme retratado nas Figuras 107 e 108. Conforme notado acima, a câmara de extravazamento 116 está em comunicação de fluido com a câmara de preenchimento 118 através da passagem de extravazamento 110 da camada intermediária 106.
[396] As Figuras 109 e 110 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da terceira camada 124 do dispositivo operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da primeira camada 114 do dispositivo. A terceira camada 124 do dispositivo contém um conector de orifício de preenchimento 128 que se estende através da terceira camada 124, alinhando e conectando o orifício de preenchimento 132 da segunda camada 130 (mostrado na Figura 111) com a câmara de preenchimento 118 da primeira camada 114. A terceira camada 124 também contém conectores de passagem de ar 126 que se estendem através da terceira camada 124, alinhando e se conectando comcâmaras dosadoras 120 da primeira camada 114 com as passagens de ar 136 da segunda camada 130 (também mostrado na Figura 111). As paredes dos conectores de passagem de ar 126 da terceira camada são compostas ou revestidas com um material hidrofóbico. A terceira camada 124 do dispositivo também contém conectores de passagem de ar de extravazamento 125 que se estendem através the terceira camada, alinhando e se conectando com a câmara de extravazamento 116 da primeira camada 114 às passagens de ar de extravazamento 134 da segunda camada 130 (mostrada na Figura 111).
[397] As Figuras 111 e 112 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da segunda camada 130 do dispositivo operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da terceira camada 124 do dispositivo. A segunda camada 130 do dispositivo contém um orifício de preenchimento 132 que se estende através da segunda camada 130, e se alinha com o conector do orifício de preenchimento 128 da terceira camada 124, ou em algumas modalidades, diretamente com a câmara de preenchimento 118 da primeira camada 114. A segunda camada 130 do dispositivo também contém passagens de ar 136 que se estendem através da segunda camada 130 e se alinham com as câmaras dosadoras 120 da primeira camada 114. As passagens de ar 136 da segunda camada se conectam com as câmaras dosadoras 120 da primeira camada 114 através dos conectores de passagem de ar 126 da terceira camada 124. Conforme adicionalmente ilustrado nas Figuras 111 e 112, a segunda camada 130 do dispositivo também contém uma passagem de ar de extravazamento 134 que se estende através da segunda camada 130 e se alinha com a câmara de extravazamento 116 da primeira camada 114. A passagem de ar de extravazamento 134 se conecta com a câmara de extravazamento 116 através dos conectores da passagem de ar de extravazamento 125 da terceira camada 124.
[398] Embora o dispositivo seja descrito em termos de camadas individuais, as camadas do dispositivo são integrais, dando ao dispositivo uma estrutura monolítica.
[399] Em uma modalidade da presente invenção a primeira camada do dispositivo é fornecida com um par de câmaras de preenchimentos espaçadas em extremidades opostas das câmaras dosadoras e a segunda camada é fornecida com um par de orifícios de preenchimento espaçados, cada um em comunicação de fluido com um do par das câmaras de preenchimento espaçadas. Um par dos orifícios de preenchimento espaçados fornece líquido a um do par das câmaras de preenchimento espaçadas e metade das câmaras dosadoras, enquanto que um do par dos orifícios de preenchimento espaçados fornece líquido ao outro do par de câmaras de preenchimento e a outra metade das câmaras dosadoras.
[400] Em uma outra modalidade da presente invenção, a primeira camada do dispositivo é fornecida com um par de câmaras de preenchimento espaçadas em extremidades opostas das câmaras dosadoras e a segunda camada é fornecida com um par de orifícios de preenchimento espaçados, cada um em comunicação de fluido com um do par das câmaras de preenchimento espaçadas. Um do par dos orifícios de preenchimento espaçados fornece líquido a um do par das câmaras de preenchimento e todas das câmaras dosadoras, enquanto que o outro do par dos orifícios de preenchimento espaçados fornece líquido ao outro do par das câmaras de preenchimento e todas das câmaras dosadoras.
[401] O dispositivo da presente invenção pode ser configurado para preencher duas ou mais fileiras e colunas da referida placa de microtitulação com líquido.
[402] As Figuras no presente documento ilustram diferentes designs compatíveis com uma placa de microtitulação com 384 poços; no entanto os conceitos descritos são da mesma forma aplicáveis a placas com 1536 poços por um versado na técnica. As Figuras 105 a 112 descritas em detalhes acima ilustram um dispositivo para o preenchimento simultâneo de todos os poços em todas as fileiras ao longo das 24 colunas com o uso de orifícios de preenchimento 132 no lado direito da pilha de dispositivo-placa de microtitulação. Esta configuração conta com a ação capilar para preencher cada uma das câmaras dosadoras individuais 120 conectadas por canais 122 conforme mostrado na Figura 111.
[403] As Figuras 113 a 118 são uma série de desenhos em perspectiva superior, lateral e explodida que ilustram uma segunda configuração do dispositivo. Esta segunda configuração do dispositivo conta com a força mecânica do pipetador para empurrar o líquido nos canais e câmaras dosadoras. As Figuras 113-118 retratam todas as mesmas características do dispositivo conforme mostrado nas Figuras 107-112 (numerados de forma correspondente como 200-236), exceto pelo fato de que como o orifício de preenchimento 232 da segunda camada 230 é modificado para facilitar o preenchimento mecânico dos poços com líquido conforme mostrado na Figura 117. As dimensões do orifício de preenchimento 232 são dimensionadas, de tal forma que uma ponta padrão descartável encaixaria perfeitamente no orifício, permitindo uma pressão positiva ser usada para preencher as câmaras dosadoras. As dimensões e o espaçamento dos orifícios de preenchimento são compatíveis com uso de pipetas multicanal manuais ou estações de trabalho robóticas multicanal.
[404] As Figuras 119 a 126 são uma série de desenhos em perspectiva superior, lateral e explodida que mostram uma porção diferente do dispositivo conforme retratado nas Figuras 105 a 118. A porção do dispositivo retratada nas Figuras 119-126 representa as extremidades de saída da fileira e/ou coluna conforme mostrado nas Figuras 105-118, isto é, a porção do dispositivo que é oposta aos orifícios de preenchimento. As características do dispositivo retratadas nas Figuras 119-126, marcadas como 300-336, correspondem às características descritas e marcadas em referência às Figuras 105-112 (isto é, características do dispositivo 100-136).
[405] As Figuras 127 a 134 são uma série de desenhos em perspectiva superior, lateral e explodida que ilustram uma configuração alternativa do dispositivo da presente invenção. Nesta configuração do dispositivo, os orifícios de preenchimento 432 (veja a Figura 133) para carregar reagentes nos poços da placa de microtitulação estão localizados em ambas as laterais da pilha de dispositivo-placa de microtitulação. Esta configuração pode ser usada para adicionar dois diferentes conjuntos de reagentes a todos os poços em cada fileira. Alternativamente, cada lateral dos canais fluídicos pode direcionar 12 das 24 colunas a partir de cada lateral do dispositivo dividindo assim a placa em duas regiões lado-a-lado de 192 poços. Esta configuração retém a capacidade de direcionar de forma independente cada fileira e cada coluna das duas regiões. As características do dispositivo retratadas nas Figuras 127-134, marcadas como 400-436, correspondem às características descritas e marcadas em referência às Figuras105-112 (isto é, características do dispositivo 100-136).
[406] As Figuras 135 a 144 são uma série de desenhos em perspectiva superior, lateral e explodida que ilustram uma configuração alternativa do dispositivo da presente invenção. Esta configuração do dispositivo é adequada para o preenchimento simultâneo de todos os poços por fileiras e todos os poços por colunas. Alternativamente, cada lateral dos canais fluídicos pode direcionar 12 das 24 colunas a partir de cada lateral do dispositivo e 8 das 16 fileiras a partir de cada lateral do dispositivo dividindo assim a placa em quatro regiões diferentes de 96 poços. Esta configuração retém a capacidade de direcionar de forma independente cada fileira e cada coluna das quatro regiões. As características do dispositivo retratadas nas Figuras 135-144, marcadas como 500-536, correspondem às características descritas e marcadas em referência às Figuras105-112 (isto é, características do dispositivo 100-136).
[407] De acordo com esta configuração, as Figuras 135 e 136 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da camada intermediária 506 do dispositivo posicionado adjacente à superfície superior da placa de microtitulação 500. A camada intermediária 506 do dispositivo contém passagens intermediárias 508 que se estendem através a camada intermediária. Nesta modalidade, cada poço da placa de microtitulação se alinha com pelo menos duas passagens intermediárias 508 conforme mostrado na vista superior, lateral e explodida das Figuras 135 and 136, respectivamente. A camada intermediária 506 também contém a passagem de extravazamento 510.
[408] As Figuras 137 a 140 retratam vista lateral, superior e uma vista em perspectiva explodidas, da primeira camada 514 do dispositivo (veja a Figura 139), operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da camada intermediária 506 do dispositivo. De acordo com esta modalidade, a primeira camada 514 do dispositivo da presente invenção tem uma primeira região 513 tendo as câmaras dosadoras 520 em duas ou mais fileiras (veja Figuras 137 e 138), e uma segunda região 515 tendo as câmaras dosadoras 520 em duas ou mais colunas (veja Figuras 139 e 140) com a primeira e segunda regiões sendo deslocadas uma da outra. As câmaras dosadoras 520 da primeira 513 e segunda regiões 515 da primeira camada 514 estão em comunicação de fluido uma com a outra através dos canais da câmara de medição 522, e com poços individuais 503 da placa de microtitulação. Conforme descrito supra, as câmaras dosadoras 520 têm um volume fixado para controlar o volume de líquido liberado em cada poço 503 da placa de microtitulação 500. As câmaras dosadoras 520 recebem líquido da câmara de preenchimento 518 pela ação capilar do líquido ou através de força mecânica empurrando o líquido na câmara de preenchimento 518. O fluxo do líquido para fora das câmaras dosadoras 520 nos poços da placa de microtitulação é controlado, por exemplo, pelas forças hidrofóbicas das passagens da camada intermediária 508. Em uma modalidade, as câmaras dosadoras 520 do dispositivo todas têm o mesmo volume de medição. Em uma outra modalidade, as câmaras dosadoras 520 têm diferentes volumes de medição por fileira e/ou coluna.
[409] A primeira 513 e a segunda 515 regiões da primeira camada 514 do dispositivo cada contêm uma câmara de extravazamento 516 conforme retratado nas Figuras 137-138 e Figuras 139-140, respectivamente. Conforme notado acima, a câmara de extravazamento 516 está em comunicação de fluido com a câmara de preenchimento 518 através da passagem de extravazamento 510 da camada intermediária 506.
[410] As Figuras 141 e 142 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da terceira camada 524 do dispositivo operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da segunda região 515 da primeira camada 514 do dispositivo. A terceira camada 524 do dispositivo contém um conector do orifício de preenchimento 528 que se estende através da terceira camada 524, se alinhando e conectando o orifício de preenchimento 532 da segunda camada 530 (mostrada na Figura 143) com a câmara de preenchimento 518 da primeira camada 514. A terceira camada 524 também contém conectores de passagem de ar 526 que se estendem através da terceira camada 524, alinhando e se conectando com câmaras dosadoras 520 da primeira camada 514 com as passagens de ar 536 da segunda camada 530 (também mostrada na Figura 143). A terceira camada 524 do dispositivo também contém conectores de passagem de ar de extravazamento 525 que se estendem através da terceira camada, alinhando e se conectando com a câmara de extravazamento 516 da primeira camada 514 às passagens de ar de extravazamento 534 da segunda camada 530 (mostrada na Figura 143).
[411] As Figuras 143 e 144 retratam vistas superiores e laterais e uma vista em perspectiva explodida, respectivamente, da segunda camada 530 do dispositivo operacionalmente posicionado adjacente ao segundo limite da terceira camada 524 do dispositivo. Nesta modalidade, a segunda camada 530 do dispositivo contém orifícios de preenchimento 532, um para cada fileira e cada coluna, que se estendem através da segunda camada 530, e se alinham com os conectores do orifício de preenchimento 528 da terceira camada 524, ou em algumas modalidades, diretamente com as câmaras de preenchimento 518 da primeira camada 514. A segunda camada 530 do dispositivo ainda contém passagens de ar 536 que se estendem através da segunda camada 530 e se alinham com as câmaras dosadoras 520 da primeira camada 514. As passagens de ar 536 da segunda camada se conectam às câmaras dosadoras 520 da primeira camada 514 através dos conectores de passagem de ar 526 da terceira camada 524. Conforme ilustrado adicionalmente nas Figuras 143 e 144, a segunda camada 530 do dispositivo também contém uma passagem de ar de extravazamento 534 em cada fileira e coluna que se estende através da segunda camada 530 e se alinha com a câmara de extravazamento 516 da primeira camada 514. A passagem de ar de extravazamento 534 se conecta à câmara de extravazamento 516 através dos conectores da passagem de ar de extravazamento 525 da terceira camada 524.
[412] Enquanto cada uma das diferentes configurações descritas acima é ilustrada por uma série de desenhos que mostram vistas superiores, laterais e explodidas de cada camada do dispositivo, por rezões de fabricação, o dispositivo pode ser moldado de forma monolítica ou montado a partir de camadas individuais conforme determinado por um versado na técnica.
[413] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método de adicionar líquidos a dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna de uma placa de microtitulação tendo superfícies superiores e inferiores opostas com a superfície superior tendo aberturas que levam aos poços e a superfície inferior definindo extremidades fechadas dos poços. Este método envolve fornecer o dispositivo da presente invenção conforme descrito supra, e preencher o dispositivo com líquido. O líquido é descarregado em dois ou mais poços em uma fileira e/ou coluna da referida placa de microtitulação do dispositivo.
[414] Conforme notado acima, o dispositivo da presente invenção pode ser configurado para permitir que os poços sejam preenchidos pela ação capilar ou pela força mecânica.
[415] O dispositivo da presente invenção, o qual permite o preenchimento simultâneo de todas as colunas e todas as fileiras de uma placa de microtitulação tanto sequencialmente ou ao mesmo tempo, é fabricado de um material adequado (por exemplo, poliestireno, policarbonato, etc.) que é compatível com reagentes biológicos e é posicionado sobre os poços da placa de microtitulação. A seguir, os reagentes são introduzidos nos orifícios de preenchimento (por exemplo, 24 e/ou 16 orifícios de preenchimento) e os reagentes são automaticamente dispersados em cada uma das câmaras dosadoras posicionadas acima de cada um dos poços da placa de microtitulação (por exemplo, 384 câmaras dosadoras para 384 poços em uma placa). A pilha carregada do dispositivo-placa de microtitulação é colocada em um rotor de balanço giratório de uma centrífuga de baixa velocidade padrão e submetida a uma breve rotação em uma force suficiente para empurrar o líquido das câmaras dosadoras individuais em cada um dos poços. Depois da centrífuga parar, a pilha do dispositivo-placa de microtitulação é removida da centrífuga, a pilha é separada e o dispositivo é disposto enquanto a placa é então usada para a próxima etapa no processo do ensaio. Sendo assim, o local de trabalho da configuração do ensaio descrito acima para uma placa com 384 poços seria reduzido para 3 de cada uma das liberações do pipetador com 8 canais para carregar os orifícios de preenchimento da coluna e 2 para cada uma das liberações do pipetador com 8 canais para carregar os orifícios de preenchimento da fileira comparado a 96 liberações totais do pipetador com 8 canais usando uma abordagem manual. Além disso, o uso do dispositivo consume apenas 24 pontas de pipeta enquanto uma abordagem manual consumiria 384 pontas de pipeta, para uma considerável economia nos gastos, o que é importante um laboratório clínico de alto rendimento. O dispositivo e o processo descritos acima poderiam ser facilmente aplicados a uma placa de microtitulação com 1536 poços por um versado na técnica e resultaria em benefícios similares conforme descrito para a placa com 384 poços. Um benefício adicional do dispositivo descrito no presente documento, que reduz dramaticamente o número de etapas de pipategem, é o controle da contaminação cruzada por aerossois contendo amplicons de PCR. Isto é especialmente crucial na detecção de representação de baixo número de cópias de alelos mutantes. Durante a introdução de líquidos aos orifícios de preenchimento do dispositivo, cada um dos 384 ou 1536 poços é coberto pelo dispositivo e a combinação dos poços cobertos e a redução no número de etapas de transferência de líquido fornece probabilidade reduzida de contaminação cruzada de amplicons de PCR entre poços.
[416] Já que cada fileira e coluna são acessíveis de forma independente, cada uma pode gerar muitas configurações de ensaio que podem ser preenchidas pelo mesmo dispositivo com a escolha sensata de como os orifícios de preenchimento são preenchidos. Sendo assim, o mesmo líquido pode ser aplicado a todas as 24 colunas em 3 cada das etapas de pipetagem com 8 canais (sem mudanças de ponta) e o mesmo líquido pode ser aplicado a todas as 16 fileiras em 2 de cada das etapas de pipetagem com 8 canais (sem mudanças de ponta); 24 componentes diferentes podem ser aplicados a cada uma das 24 fileiras em 3 de cada uma das etapas de pipetagem com 8 canais (3 mudanças de ponta) e 16 componentes diferentes podem ser aplicados a cada uma das 16 fileiras em 2 de cada uma das etapas de pipetagem com 8 canais (2 mudanças de ponta). Muitas outras configurações de preenchimento são possíveis a um versado na técnica. O líquido dispersado pode ser qualquer fluido biológico, por exemplo, uma amostra biológica, reagentes de reação tais como, por exemplo, iniciadores, sondas, enzimas, produtos de reação, etc.
[417] Em uma modalidade, uma série de dispositivos de dispersão estão disponíveis com uma escolha de volumes de medição fixos, o que antecipa aplicações da biologia molecular particulares em grande volume tais como podem ser encontradas em um laboratório de diagnóstico clínico ou um laboratório para desenvolvimento farmacêutico. Em uma outra modalidade, os dispositivos de dispersão customizados são produzidos com volumes de medição especificados para o usuário para as suas aplicações específicas.
[418] Embora as modalidades preferidas tenham sido retratadas e descritas em detalhes no presente documento, fica aparente para aqueles versados na técnica que várias modificações, adições, substituições e similares podem ser produzidas sem partir do espírito da invenção e estas são assim consideradas estar dentro do escopo da invenção conforme definido nas reivindicações que seguem.
[419] Visão geral da abordagem: Esta abordagem depende na fidelidade de três enzimas: (i) Taq polimerase para copiar de forma fiel cópias de DNA de nível baixo na amostra inicial, (ii) a enzima RNase H2 removendo um grupo bloqueador no iniciador de LDR a montante, e (iii) Ligase discriminando uma compatibilidade a partir de uma incompatibilidade na lateral 3’ do iniciador a montante. O último é ainda aumentado usando uma incompatibilidade intencional ou análogo nucleotídico na 2a ou 3a base a partir da extremidade 3’ que levemente desestabiliza a hibridização da extremidade 3’ caso ela seja perfeitamente compatível na extremidade 3’, porém desestabiliza de forma significativa a hibridização da extremidade 3’ caso ela não seja compatível na extremidade 3’. Finalmente, as abordagens cinéticas, tais como alterar os períodos de ciclização e as condições podem melhorar a discriminação entre modelo do tipo selvagem e modelo mutante.Uma vez que o evento de ligação tenha acontecido, aqueles produtos serão amplificasos em uma etapaa subsequente de amplificação por PCR em tempo real, e assim isso é a etapa discriminatória chave.
[420] Para a etapa de PCR inicial, os iniciadores de PCR contend terminações universais que são parcialmente idênticas são usados em concentrações mais baixas (10 - 50 nM). A região idêntica pode variar de 8 a 11 bases ou mais. Sendo assim, caso algum dímero iniciador independente de alvo tenha se formado, o produto incorreto formará um grampo que irá inibir amplificação adicional. Além disso, as terminações aumentam a subsequente ligação do iniciador de PCR aos corretos amplicons.
[421] Alternativamente, a fidelidade de amplificação e redução de amplicons falsos e dímeros iniciadores é alcançada ao se usar iniciadores de PCR em concentrações mais baixas, porém contendo uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. Apenas quando o iniciador se hibridiza corretamente em seu alvo pretendido o RNaseH2 clivará a Base RNA, liberando um 3’OH livre no iniciador do DNA. Mesmo se um iniciador é acidentalmente ativado em um alvo incorreto, na próxima rodada, as bases a jusante da extremidade do iniciador 3’ não serão pares perfeitos para as bases a ser removidas. Isso significativamente diminui a chance de uma segunda clivagem e extensão. Em resumo, a eficiência da amplificação de alvos incorretos não produzirá histórico significativo. Além disso, a amplificação inicial de PCR é seguida por uma etapa de LDR, essencialmente se encaixando dentro do produto de PCR inicial.
[422] Quando se inicia com cfDNA, o comprimento médido é de 160 bases, sendo assim os iniciadores de PCR devem ser agrupados em dois grupos quando se coloca ao longo de uma região de gene (por exemplo, p53) de tal modo que cada grupo amplifica fragmentos de cerca de 100 bp, que são trocados um com relação à outro em cerca de 50 bases, de tal modo que um tenha a "colocação" ao longo de uma dada região.
[423] Para proteger contra a contaminação por transferência, UNG é adicionado à reação antes da ativação da polimerase, e a amplificação inicial de PCR é realizada com dUTP. As sondas de LDR são compreendidas das bases naturais, assim o produto de LDR é agora resistente à digestão de UNG na segunda etapa de PCR em tempo real. Observe que os produtos de LDR contêm marcadores sequenciais ou sequências de UniTaq em suas extremidades não ligantes, as quais estão em falta no DNA alvo, sendo assim a transferência acidental dos produtos de LDR não resulta em amplificação em larga escala. Diferente da PCR, um produto de LDR inicial não é um substrato para uma segunda reação de LDR.
[424] O caso mais difícil é o das mutações em KRAS, onde 6 mudanças no codon 12 e 1 mudança no codon 13 são todas espaçadas em conjunto. Em geral, para a mais alta fidelidade, a incompatibilidade entre a sonda mutante e a sequência do tipo selvagem deve ser pelo menos C:A para a última base, não G:T. Sendo assim, precisa-se operar ambas as sondas de filamento superior e filamento inferior ou 2 conjuntos de ligação por reação de PCR. No entanto, mais do que uma mutação pode ser dada a mesma sequência de UniTaq, ou marcador de fluorescência com uma sonda TaqMan™, já que o objetivo é achar uma mutação e não necessariamente distinguir diferentes mutações uma da outra.
[425] Já que as sondas diferentes competirão uma com a outran a ligação da (rara) sequência mutante, é importante permitir para que todas as sondas se hibridizem na sequência correta. Haverá 3 iniciadores a montante e 1 iniciador a jusante para as mutações da 1a posição do códon 12 de KRAS. A falsa ligação das sondas de LDR mutantes na sequência alvo do tipo selvagem pode ser ainda suprimida ao se usar sonda de LDR a montante bloqueada com a sequência do tipo selvagem na base discriminatória, porém sem a sequência marcadora adequada. As sondas são designadas para evitar falsa ligação/falso sinal de sondas mutantes na sequência normal, mas também para ligações corretas para ocorrer na presença da sequência mutante.
[426] Para resumir os níveis de discriminação da abordagem acima usando ambos os iniciadores de PCR e sondas de LDR para a detecção de cada mutação:1. Uso de iniciadores de PCR com terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. 2. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência de reação de PCR inicial. 3. Uso da atividade de nuclease de RNaseH2 para liberar um 3’ OH não bloqueado na sonda de LDR a montante, apenas quando hibridizado no alvo. 4. Uso da fidelidade da ligação 3’ da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 5. Uso de incompatibilidade ou análogo de nucleotídeo na 2a ou 3a base a partir da extremidade 3’ da sonda a montante. 6. Use de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 7. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[427] 1.1.a. Incubar DNA genômico na presença de UNG (37°C, 15-30 minutos, para prevenir transferência), dUTP, e outros dNTP’s, AmpliTaq Gold, e iniciadores gene-específicos contendo terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. Esta mistura de reação de PCR-DNA genômico inicial é adequada para amplificação por PCR multiplex em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial), ou em um poço único. Desnaturar DNA genômico do plasma, inativar UNG, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minutos) e PCR multiplex amplificam fragmentos contendo mutação por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 12-20 ciclos). Os iniciadores de PCR são designados para ter valores Tm em torno de 64-66°C, e hibridizarão vigorosamente, mesmo quando usado em concentrações 10 a 50 vezes abaixo da norma para PCR uniplex (10 nM a 50 nM cada iniciador). Os ciclos são limitados para reter equilíbrio proporcional de produtos de PCR um com relação ao outro, enquanto ainda se amplificam sequências pouco abundantes cerca de 100,000 a 1,000,000 vezes. Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[428] 1.1.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagem AK16D), RNaseH2, suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, as sondas a jusante podem ser sintetizadas com 5’ fosfato, ou tornadas quinase em massa antes das reações; sondas a montante compreendem uma Base RNA depois da extremidade 3’ desejada, 4 bases adicionais, e um grupo bloqueador para prevenir ligação independente de alvo.) As sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência alvo-específica com uma incompatibilidade C:A ou G:T na 3a ou penúltima base, a mutação base na extremidade 3’, seguida por uma Base RNA e 4 mais bases de DNA que são compatíveis com o alvo, e um espaçador C3 para bloquear a ligação (ou extensão subsequente por polimerase). As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguidas por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isso permitirá que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR caso DNA mutante esteja presente.
[429] 1.1.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços para as reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nas sondas de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato:UniAi - Alvo a montante-Mutação-Alvo a jusante - UniCi’
[430] Esta abordagem evita gerar sinal antecedente do DNA do tipo selvagem na segunda reação de PCR em tempo real. Primeiro, UNG destruirá o filamento inferior do produto de PCR inicial, de tal modo que a sonda de LDR a montante restante não tenha alvo para se hibridizar e assim a extremidade 3’ permaneça bloqueada e não se estenda. Em segundo lugar, qualquer iniciador de PCR residual da reação de PCR inicial será incapaz de se ligar a qualquer um dos produtos de PCR iniciais (destruídos por UNG) ou produtos de LDR (sem sítios de ligação) e assim a extremidade 3’ pemanece bloqueada e não se estenderá. Finalmente, a sonda TaqMan™ agora tem 2 bases diferindo da sequência do tipo selvagem (a mutação base, e a base na 3a posição a partir da extremidade 3’ da junção de ligação), e assim apenas hibridizará em uma temperatura abaixo de 60°C, porém agora o iniciador de PCR a montante terá se hibridizado primeiro, e consequentemente se estendido, assim impedindo a sonda TaqMan™ de se hibridizar e gerar sinal a partir da atividade 5’-3’ da Taq polimerase.
[431] Um segundo projeto de ensaio é baseado em uma amplificação de PCR multiplexado inicial seguido por distribuição e captura dos alvos amplificados por PCR nos poços de uma placa de microtitulação. Um único ciclo de LDR permite a captura de produtos de LDR nos alvos corretos no suporte sólido, enquanto as más ligações são descartadas. Os produtos de LDR são quantificados, seja através de LDR-FRET, PCR em tempo real, ou outros sistemas reporter.
[432] Para amplificar cfDNA para a detecção de mutação, iniciadores de PCR contendo terminações universais são usados. Os iniciadores gene-específicos são usados em baixas concentrações (10 a 50 nM) e contêm terminações universais que são parcialmente idênticas. Sendo assim, caso haja algum dímero de iniciador independente de alvo formado, o produto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. Para maximizar a capacidade para detectar mutações muito pouco abundantes, depois de produzir uma mistura principal contendo todos os componentes, a mistura de reação é distribuída em 12, 24, 48 ou 96 poços independentes. Já que uma molécula única (com uma mutação) pode apenas ser distribuída a um dado poço, o processo efetivamente enriquecerá a molécula contendo a mutação quando se compara ao DNA do tipo selvagem normal, e assim significativamente melhora o sinal-ao-barulho. Uma abordagem é usar uma amplificação em duas etapas, em que a amplificação inicial usa iniciadores gene-específicoswith terminações universais, e a segunda amplificação usa iniciadores universais para anexar um grupo biotina a um filamento de produto específico. A amplificação inicial (com baixa concentração do iniciador de PCR) ainda será quantitativa, contanto que seja limitada a cerca de 8-20 ciclos. Os produtos de amplificação são então diluídos em dois novos poços para cada um dos poços originais, cada um contendo os dois iniciadores universais (em concentrações mais altas de 0.5 - 1 pmoles), com um ou o outro biotinilado no respectivo poço. A amplificação é agora continuada por outros 8-29 ciclos, por um total de cerca de 15-40 ciclos. Como uma etapa opcional, os produtos podem ser separados (através de eletroforese ou tamanho) dos iniciadores não usados.
[433] Alternativamente, os produtos podem ser amplificados em uma única reação de amplificação ao adicionar os iniciadores universais ao poço da amplificação inicial, onde apenas um iniciador inicial é biotinilado. Alternativamente, os iniciadores gene-específicos biotinilados podem ser usados diretamente em uma única etapa de amplificação. Apenas quando é prudente designar sondas de LDR em oposição a ambos o filament superior e inferior (isto é, para maximizar a discriminação da mutação de LDR) será necessário capturar ambos o filamento direto e inverso de um dado amplicon. Isto pode ser alcançado ao se usar misturas de cada iniciador a 50% de biotinilação na mesma reação ou a 100% de biotinilação em reações separadas. À medida que os produtos biotinilados permanecem serapados durante a captura no suporte sólido, eles podem ambos estar na mesma reação de amplificação. No entanto, caso os filamentos do produto de PCR se re- hibridizem depois da captura, eles podem precisar ser capturados em diferentes direções no suporte sólido. Esta separação inicial pode ser necessária para assegurar que existe produto de PCR de filament único suficiente disponível para identificar mutações através da detecção de LDR subsequente.
[434] Com cfDNA, o comprimento do fragmento é biologicamente limitado a cerca de 160 bp. Sendo assim, de modo a cobrir mutações "hotspot" comuns ao longo de uma região maior, os conjuntos de iniciador serão designados para gerar fragmentos de sobreposição. Como tal, os iniciadores seriam distribuídos entre um agrupamento "A" e "B", dobrando o número de poços mencionados acima. Com o DNA isolado a partir de fragmentos do tamanho de éxon em CTC pode ser frequentemente usado, assim mitigando a necessidade por dois agrupamentos de amplicon. Alguns fragmentos se amplificam mais lentamente do que outros. Este problema pode ser solucionado ao se incluir uma reação multiplexada adicional com alguns mais ciclos de amplificação.
[435] A Figura 38 ilustra a detecção da mutação em DNA genômico ou cfDNA usando o protocolo de detecção básico PCR-LDR- q PCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ designadas ao longo da sequência de junção da ligação.
[436] A Figura 39 ilustra uma variação da Figura 38, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. Os iniciadores de PCR contêm terminações universais para eliminar a formação de dímero de iniciador e para permitir a amplificação com iniciadores universais, um dos quais contém uma biotina, permitindo a captura de produtos em poços cobertos com estreptavidina. As sondas de ligação são hibridizadas para direcionar e apenas formar produto quando há perfeita complementariedade na junção de ligação. As sondas de ligação não reagidas, ou produtos de ligação independentes de alvo são então descartados. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[437] A Figura 40 ilustra uma variação da Figura 38, onde os iniciadores de PCR iniciais específicos do gene contêm uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. Esses iniciadores gene-específicos são desbloqueados a partir da extremidade por RNaseH2 apenas quando hibridizados no alvo, liberando uma extremidade de 3’OH adequada para a extensão de polimerase.
[438] A Figura 41 ilustra uma variação da Figura 38, onde os iniciadores de PCR iniciais específicos do gene contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. As sondas de LDR a montante e a jusante contêm Porções iniciador-específicas UniAi e UniCi’ respectivamente. Além disso, as sondas de LDR a montante específicas de mutação contêm a mutação base na extremidade 3’, seguida por uma Base RNA e 4 mais bases de DNA que são compatíveis com o alvo, e um espaçador C3 para bloquear a ligação (ou extensão subsequente por polimerase). Apenas na presença de RNaseH2 e quando hibridizado no alvo correto o grupo bloqueador a montante será removido, liberando uma extremidade de 3’OH adequada para ligação. Nesta ilustração, a sonda de LDR a montante complementar ao DNA do tipo selvagem também contém um grupo bloqueador, mas nenhuma Base RNA ou marcador 5’. Esta sonda ainda aumentaa especificidade de ligação na discriminação de mutante a partir do alvo do tipo selvagem.
[439] A Figura 42 ilustra uma variação da Figura 41, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. Os iniciadores de PCR contêm terminações universais para eliminar a formação de dímero de iniciador, e as sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[440] A Figura 43 ilustra uma variação da Figura 42, onde a lateral 5’ da sonda de LDR a jusante contém a mesma base que a base discriminatória 3’ na sonda a jusante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente. A nuclease deve apenas clivar quando a sonda a jusante é hibridizada no alvo mutante. Ambas as sondas de LDR específicas de mutação a montante e a jusante contêm sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção. Nesta ilustração, a sonda de LDR a montante complementar ao DNA do tipo selvagem não contém uma sequência complementar, e não geraria um sinal FRET mesmo caso ligado a uma sonda a jusante clivada.
[441] A Figura 44 ilustra uma variação da Figura 43, onde os iniciadores de PCR iniciais específicos do gene contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. As sondas de LDR a montante e a jusante contêm Porções marcadoras de sequência e iniciador-específicas UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’. Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). O filamento de produto formado pelo iniciador marcado com fluorescente vai formar grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’. Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade 5’^3’ da exonuclease da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1, e gerando sinal detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[442] A Figura 145 ilustra uma variação da Figura 41, onde os produtos de PCR são seletivamente amplificados usando iniciadores a montante seletivos de mutação e iniciadores a jusante sítio-específicos. Mediante a hibridização alvo-específica, RNaseH remove a Base RNA específica de mutante para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase. RNaseH vai preferencialmente clivar a base RNA quando ela é perfeitamente compatível com DNA mutante, porém será menos provável clivar a base RNA quando hibrizidado a DNA do tipo selvagem. Isto ocorre durante cada ciclo da amplificação por PCR, assim enriquecendo para a amplificação de alvos mutantes específicos. Os iniciadores opcionais com sequência do tipo selvagem carecem da base RNA e permanecem bloqueados, reduzindo assim a amplificação da sequência do tipo selvagem. Depois da etapa de enriquecimento do PCR inicial, este procedimento continua com protocolo de detecção de LDR-qPCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[443] A Figura 146 ilustra uma variação da Figura 145, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm porções marcadoras de sequência e iniciador-específicas UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’. Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai, e o sinal gerado na PCR é detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[444] A Figura 147 ilustra uma variação da Figura 145, onde os produtos de PCR são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[445] A Figura 148 ilustra uma variação da Figura 41, onde os produtos de PCR são seletivamente amplificados usando iniciadores a montante e a jusante sítio-específicos. Mediante a hibridização alvo- específica, RNaseH remove a base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase. Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo a sequência do tipo selvagem que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante preferencialmente competirá em ligação com a sequência do tipo selvagem sobre o iniciador a montante, mas não muito ao DNA mutante, e assim suprime a amplificação do DNA do tipo selvagem durante cada rodada de PCR. Depois da etapa de enriquecimento do PCR inicial, este procedimento continua com o protocolo de detecção LDR-qPCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[446] A Figura 149 ilustra uma variação da Figura 148, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm porções marcadoras de sequência e iniciador-específicas UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ . Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai, e o sinal gerado na PCR é detectado por um instrimento de PCR em tempo real.
[447] Figura 150 ilustra uma variação da Figura 148, where os produtos de PCRsão capturados em um suporte sólido. The Sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[448] A Figura 154 ilustra uma outra variação onde os produtos de PCR são seletivamente amplificados usando iniciadores a montante sítio-específicos que também compreendem sequências de porção 5’ complementares à sequência do tipo selvagem do filamento superior permitindo a formação de alças-grampos depois da extensão, e iniciadores a jusante sítio-específicos. Mediante a hibridização alvo- específica, RNaseH remove a Base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase. PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. (i) Desnaturação do filamento inferiod do tipo selvagem resulta na formação de uma alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase para formar uma região de grampo mais longa. Isto não desnatura a 72oC e impede o iniciador a montante de gerar um filamento superior de comprimento total. (ii) Desnaturação de filamento inferior mutante resulta na formação de uma alça-grampo com incompatibilidade na extremidade 3’. Isto não se estende pela polimerase, e assim desnatura a 72oC, permitindo ao iniciador a montante gerar filamento superior de comprimento total. (iii) Desnaturação de filament superior resulta em grampo na lateral 5’, que desnatura durante a etapa estendida de PCR (72oC), permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total. A diferença na preferência de extensão do grampo dos iniciadores a montante com modelo do (i) tipo selvagem e (ii) mutante resulta na amplificação preferencial de DNA mutante. Esta seleção em oposição à amplificação do DNA do tipo selvagem ocorre durante cada ciclo da PCR, assim enriquecendo alvos mutantes. Depois da etapa de enriquecimento da PCR inicial, este procedimento continua com protocolo de detecção de LDR-qPCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[449] A Figura 155 ilustra uma variação da Figura 154, onde os produtos de PCR são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[450] Como um exemplo de enumeração da mutação quantitative usando multiplexação espacial em 48 poços, considerar cfDNA total na amostra alvo que está sofrendo a amplificação inicial de PCR é de cerca de 10,000 equiivalentes de genoma, com 12 daqueles contendo uma mutação no códon 12 de KRAS. A distribuição inicial em 48 poços resulta em cerca de 200 equivalentes de genoma por poço, com 1 poço contendo 2 cópias mutantes, 10 poços contendo 1 cópia mutante, e os 37 poços restantes não contendo nenhuma cópia mutante. Depois de cerca de 20 rodadas de amplificação por PCR, (para a simplicidade no cálculo, diga-se 99%, em eficiência da amplificação, ou cerca de 960,000 vezes - completa eficiência renderia amplificação em 1,046,576 vezes), depois o número total de cópias para a mutação será de 960,000, e para o tipo selvagem será de 192 milhões. Assumindo uma eficiência de ligação de 50% no DNA mutante por ciclo, vezes 20 ciclos, e para a ligação no DNA do tipo selvagem, uma fidelidade de ligação de 1,000 vezes, então o DNA mutante renderia 9.6 milhões de moléculas, enquanto que o DNA do tipo selvagem renderia 1.9 milhões de moléculas. A distribuição especial nos 48 poços renderia 200,000 e 40,000 moléculas de produto de LDR por mutante e tipo selvage, respectivamente. Depois da adição de iniciadores marcadores e sonda TaqMan™ com PCR em tempo real, para simplicidade nos cálculos, os produtos de LDR acima se convertem em valores Ct de 10 e 12.5 respectivamente. Para algum sinal derivado de mutação ser classificado como positivo, precisaria aparecer em pelo menos 2 or 3 poços, e também facilmente distinguido a partir do sinal (nível baixo) que surge da má-ligação de sondas no DNA do tipo selvagem. A referida má- ligação no DNA do tipo selvagem pode ser ainda suprimida pela adição de uma sonda de LDR a montante do tipo selvagem, que careceria do reporter fluorescente, de tal modo que os produtos de ligação estariam silenciosos sem nenhum sinal. A provável Distribuição de Poisson (veja por exemplo, Figura 31) mostra que a amostra negativa terá uma faixa de distribuição de (poços: moléculas) (38:0 ; 10:1 ; 1:2) por 12 moléculas Esses números são suficientemente diferentes que a leitura de TaqMan™ dará na enumeração quantitativa de sinal, permitindo que se atribua uma classificação de 0, 1 ou 2 moléculas originais por poço (representado pelos valores Ct de 12.5, 10 e 9 respectivamente), por um total de 12 moléculas mutantes de KRAS na amostra. No caso que o sinal seja apenas capaz de distinguir entre 0 e 1 ou mais moléculas mutantes, dadas umas 12 ou menos moléculas iniciais enumeradas em um mínimo de 24 poços, o número inicial de cópias mutantes pode ser enumerado.
[451] Quando se usa Detecção por LDR-FRET, depois da distribuição nos 48 poços individuais para captura em fase sólida, assumindo apenas 50% da eficiência de captura de produtos biotinilados, cada poço terá capturado 10,000 mutantes e 2 milções de amplicons KRAS do tipo selvagem, respectivamente. Assumindo uma eficiêcia de ligação de apenas 50% no modelo mutante, pelo menos 5,000 produtos de LDR devem ser capturados no suporte sólido caso uma única molécula mutante estivesse originalmente presente. Caso duas moléculas presentes estivessem no poço original, então aproximadamente 10,000 produtos de LDR devem ser capturados. Para os poços com apenas produto do tipo selvagem, assumindo uma fidelidade de ligação de 1:1,000 (sonda de LDR a montante mutante mal ligada no DNA do tipo selvagem), apenas 1,000 produtos de LDR seriam capturados. Para algum sinal derivado de mutação ser classificado como positivo, precisaria aparecer em pelo menos 2 ou 3 poços, e também facilmente distinguido a partir do sinal (nível baixo) que surge da má-ligação de sondas no DNA do tipo selvagem. Tal má ligação ao DNA do tipo selvagem pode ser ainda suprimida pela adição a sonda de LDR a montante do tipo selvagem, que careceria do reporter fluorescente, de modo que os produtos de ligação estariam silenciosos sem nenhum sinal. Esses números são suficientemente diferentes de modo que a leitura LDR-FRET dará enumeração quantitativa de sinal, permitindo atribuição de uma classificação de 0, 1, ou 2 moléculas originais por poço (representado como sinais de LDR-FRET de cerca de 1,000, 5,000, e 10,000, respectivamente), para um total de 12 moléculas mutantes de KRAS na amostra. No caso que o sinal seja apenas capaz de distinguir entre 0 e 1 ou mais moléculas mutantes, dadas umas 12 ou menos moléculas iniciais enumeradas em um mínimo de 24 poços, o número inicial de cópias mutantes pode ser enumerado.
[452] Quando se usa UniTaq contendo sondas de LDR, elas são do formato que segue: Sondas a montante compreendem um marcador de sequência 5’, tal como UniTaqAi, contendo uma porção de iniciador específico, seguido por sequência alvo-específica com uma incompatibilidade C:A ou G:T na 3a ou penúltima base, a mutação base na extremidade 3’, seguida por uma Base RNA e 4 mais bases de DNA que são compatíveis com o alvo, e um grupo de bloqueio- espaçador C3. Os iniciadores a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador de sequência 3’, tal como UniTaq Bi’ - UniCi’, também contendo uma porção de iniciador específico.
[453] The Produtos de LDR podem ser detectados usando iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Alvo a montante-Mutação-Alvo a jusante - UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[454] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’ . Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade 5’^3’ da exonuclease da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[455] Os iniciadores de PCR iniciais ou sondas de LDR a montante também podem conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador (por exemplo, espaçador C3) na extremidade 3’. RNaseH2 é então adicionada à reação. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado.
[456] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnaturação na LDR deve ser a mais curta possível (isto é, 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré- incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ da sonda de LDR a jusante contém a mesma base que a base discriminatória 3’ na sonda a jusante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[457] Visão geral da abordagem v1: DNA genômico isolado ou DNA enriquecido com metila é tratado com um coquetel de enzimas sensíveis à metila cujos elementos de reconhecimento compreendem apenas ou a maioria das bases C e G (por exemplo, Bsh1236I = CGACG; HinPII = GACGC; Acila = CACGC ou GACGG; e Hpy99I = CGWCGA). Os iniciadores de PCR escolhidos de forma judiciosa amplificam fragmentos de DNA não divididos de cerca de100 - 130 bp. O fragmento deve ter pelo menos 2-3 sítios de enzima sensíveis à metila, de modo que a clivagem faria com que esses fragmentos dissipem. Esses sítios são escolhidos de modo que a prevenção de transferência possa funcionar em dois níveis: (i) os sítios ainda são cliváveis em DNA contendo dUTP incorporado, permitindo o uso de UNG para a prevenção de transferência e (ii) depois da amplificação, os sítios são não metilados, de modo que os produtos seriam prontamente reclivados caso eles transferência em uma outra reação. Subsequente à amplificação inicial de PCR, as reações de LDR e UniTaq com proteção de transferência são realizadas conforme descrito acima. Alternativamente, as reações LDR e TaqMan™, ou reações diretas de TaqMan™ podem ser realizadas para identificar e quantificar quantidades relativas de DNA metilado na amostra inicial.
[458] Para sintetizar os níveis de discriminação da abordagem acima usando ambos os iniciadores de PCR e as sondas de LDR para a detecção de metilação pouco abundante: 1. Uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação para clivar o alvo quando não metilado. 2. Uso de iniciadores de PCR com terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. 3. Uso de UNG e enzimas de restrição sensíveis à metilação para prevenir contaminação por transferência da reação de PCR inicial. 4. Uso da fidelidade da ligação 3’ da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 5. Use de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 6. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[459] 2.1.a. Incubar DNA genômico, cfDNA, ou DNA enriquecido com metila na presença de Bsh1236I (CGACG) e HinPII (GACGC), e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência. Adicionar suplemento tampão para otimizadr a amplificação por PCR multiplexada, dUTP, e outras dNTP’s, AmpliTaq Gold, e iniciadores gene-específicos contendo terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. Esta mistura de reação de PCR-DNA genômico inicial é adequada para amplificação por PCR multiplex em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial), ou em um poço único. Desnaturar DNA genômico digerido, inativar UNG e as endonucleases de restrição, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minutos) e amplificação por PCR multiplex da mutação contendo fragmentos por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 16-20 ciclos). Os iniciadores de PCR são designados a ter valores Tm de cerca de 64-66°C, e hibridizarão vigorosamente, mesmo quando usados em concentrações 10 a 50 vezes abaixo da norma para PCR uniplex (10 nM a 50 nM cada iniciador). Os ciclos são limitados para reter relativo equilíbrio dos produtos de PCR um com relação ao outro, enquanto ainda se amplificam sequências pouco abundantes cerca de 100,000 a 1,000,000 vezes. Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[460] 2.1.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagem AK16D), suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, iniciadores a jusante podem ser sintetizados com 5’ fosfato, ou tornados quinase em massa antes das reações. As sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguido por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isso permitirá que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR caso o DNA metilado esteja presente na amostra original.
[461] 2.1.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços para as reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nos iniciadores de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato:UniAi - Alvo a montante- Região de metilação -Alvo a jusante - UniCi’
[462] Dois ou três fragmentos em uma única região promotorapodem ser interrogados ao mesmo tempo usando o mesmo corante fluorescente. O número de fragmentos metilados por promotor pode ser determinado pelo sinal total para aquele corante. Quando se usa multiplexação espacial, a amostra é distribuída a 12, 24, 48 ou 96 poços individuais antes da etapa de incubação a 37°C (porám depois da adição de enzimas). Desta maneira, metilação ao longo de uma região promotora de uma dada molécula de DNA pode ser distinguida a partir da metilação de três diferentes regiões em três diferentes moléculas.
[463] Já que não há a necessidade de se distinguir entre um sinal do tipo selvagem e um sinal mutante, a etapa de LDR pode ser eliminada, com a reação de PCR inicial seguida diretamente por uma reação de PCR secundária em tempo real (por exemplo, TaqMan™). A desvantagem de ir direto a uma PCR secundária é que a proteção de transferência de UNG não seria usada já que os produtos da reação de PCR inicial têm dUTP incorporado, e assim seriam destruídos por UNG. Uma abordagem para resolver este problema seria usar dNTP’s padrão na PCR inicial, e se basear apenas nas endonucleases de restrição para destruir qualquer transferência potencial a partir das reações de PCR iniciais ou subsequentes, já que esses produtos agora são não metilados.
[464] Um segundo projeto de ensaio é baseado em uma digestão de restrição inicial, depois amplificação de PCR multiplexada seguida por distribuição e captura dos alvos amplificados por PCR nos poços de uma placa de microtitulação. Um único ciclo de LDR permite a captura dos produtos de LDR nos alvos corretos no suporte sólido, enquanto as más ligações são descartadas. Os produtos de LDR são quantificados, seja através de LDR-FRET (qLDR), PCR em tempo real (qPCR), ou outros sistemas reporter.
[465] A Figura 45 ilustra a detecção da metilação em DNA genômico ou cfDNA usando a digestão de restrição básica, protocolo de detecção PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[466] A Figura 46 ilustra uma variação da Figura 45, onde os iniciadores de PCR específicos do gene iniciais contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. As sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’, respectivamente. Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). O filamento de produto formado pelo iniciador marcado com fluorescente vai formar grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’. Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1, e gerando sinal detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[467] A Figura 47 ilustra uma variação da Figura 45, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. Os iniciadores de PCR contêm terminações universais para eliminar a formação de dímero de iniciador, e para permitir a amplificação com iniciadores universais, um dos quais contém uma biotina, permitindo a captura de produtos em poços cobertos com estreptavidina. As sondas de ligação são hibridizadas para direcionar e apenas formar produto quando há perfeita complementariedade na junção de ligação. As sondas de ligação não reagidas, ou produtos de ligação independentes de alvo são então descartados. Sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[468] Como um exemplo de enumeração da metilação quantitative usando multiplexação espacial nos 48 poços, considerar uma amostra de cfDNA com 12 equivalentes de genoma de DNA tumoral, usados para classificar a metilação em um marcador no cromossomo 20, que é amplificado em cerca de 4 cópias por célula de câncer. Isto daria 48 cópies de DNA metilado que é resistente para digestão. O DNA não metilado é fragmentado pela enzima de restrição, porém uma minoria do DNA não metilado sobrevive, ~ 12 cópias, para um total de 60 cópias. Além disso, alguma metilação relacionada à idade pode ocorrer, em especial variando em 12 cópias. Consequentemente, as amostras com nenhuma metilação específica de tumor podem ter um sinal na faixa de 12-24 cópias, enquanto aquelas com o marcador no cromossomo 20 metilado em todos os 4 cromossomos podem ter um total na faixa de 60-72 cópias. Caso se observer a provável Distribuição de Poisson (veja Figuras 31 e 32, a amostra negativa terá uma faixa de distribuição de (poços: moléculas) (38:0 ; 10:1 ; 1:2) para 12 moléculas a (29:0 ; 15:1 ; 4:2 ; 1:3) para 24 moléculas, enquanto que as amostras positivas terão uma faixa de distribuição de (14:0 ; 17:1 ; 11:2 ; 4:3 ; 1:4) para 60 moléculas a (11:0 ; 16:1 ; 12:2 ; 6:3 ; 2:4 ; 1:5) para 72 moléculas. A precisão na distinção de sinal de LDR que surge de 2 moléculas (por exemplo, para LDR-TaqMan™, um valor Ct de 9, ou para a detecção por LDR-FRET 10,000 Produtos de LDR) a partir de 3 moléculas (por exemplo, para LDR-TaqMan™, um valor Ct de 8.5, ou para LDR-FRET 15,000 moléculas) dependerá no desvio padrão do sinal de LDR do poço ao poço. Apesar disso, mesmo se o sinal de LDR é variável o suficiente que distinguir os sinais de nível mais altos se torna muito difícil, à medida que o sinal seja claro o suficiente para distinguir 0, 1 e 2 moléculas iniciais (representadas como valores de Ct LDR-TaqMan™ de 12.5, 10, e 9, ou sinais de LDR-FRET de cerca de 1,000, 5,000 e 10,000, respectivamente), esta abordagem não terá nenhuma dificuldade em distinguir e enumerar sinal metiladoarising a partir daqueles indivíduos com DNA tumoral circulante autêntico, a partir daqueles com sinal metilado relacionado à idade (porém não canceroso) no sangue normal. No caso em que o Ct ou o sinal fluorescente é apenas capaz de distinguir 0 de 1 ou mais moléculas metiladas iniciais, dadas umas 12 ou menos equivalentes de genoma de DNA tumoral, e 60 ou mais equivalentes de genoma de DNA metilado para a região específica (por exemplo, cromossomo 20) enumerado em um mínimo de 48 poços, a abordagem deve distinguir e enumerar sinal metilado que surge a partir daqueles indivíduos com DNA tumoral circulante autêntico a partir daqueles com sinal metilado relacionado à idade (porém não canceroso) no sangue normal.
[469] Quando se usa sondas de LDR contendo UniTaq, elas são do formato que segue: Sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniTaqAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguido por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’.
[470] Os produtos de LDR podem ser detectados usando iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Alvo a montante- Região de metilação - Alvo a jusante - UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[471] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’ . Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[472] As sondas de LDR a montante e os iniciadores de PCR também pode conter an Base RNA, 4 bases adicionais and um grupo bloqueador on a extremidade 3’. RNaseH2 é então adicionada à reação. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado. Em alguns projetos, um sítio de restrição sensível à metila está a jusante da extremidade 3’ do iniciador de PCR, de modo que a clivagem com a enzima remove a sequência de ligação para as 4 bases adicionais, e a clivagem da Base RNA pela RNaseH2 é significativamente reduzida.
[473] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnaturação na LDR deve ser a mais curta possível (por exemplo, 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré-incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ da sonda a jusante pode conter a mesma base que a base 3’ discriminatória na sonda a jusante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[474] Visão geral da abordagem v2: Como acima, DNA genômico isolado ou DNA enriquecido com metila é tratado com um coquetel de enzimas sensíveis à metila (HinP1I, Bsh1236I, AciI, Hpy99I e HpyCH4IV), assim como com enzimas insensíveis à metila (HaeIII e MspI). A ideia é gerar um fragmento de DNA de aproximadamente 40 bases ou mais, em que o 5’ fosfato do fragmento originado a partir de uma enzima insensível à metila. O fragmento deve ter pelo menos 2-3 sítios de enzima sensíveis à metila, de modo que a clivagem faria com que esses fragmentos dissipem. Um filamento do fragmento genômico é então hibridizado em um modelo artificial contendo um grampo, com uma região a montante, a qual não está relacionada com o DNA genômico e pode ligar ao fragmento genômico no 5’ fosfato. A porção de filamento único do grampo também contém uma região complementar ao alvo contendo um ou mais sítios de restrição sensíveis à metila. Os mesmos sítios de restrição sensíveis à metila são então adicionados de volta, e caso um filamento alvo não metilado escape acidentalmente da etapa de digestão da restrição inicial, ele será clivado nesta segunda etapa. Um oligonucleotídeo a jusante é adicionado o qual hibridiza ao fragmento genômico, a jusante de onde é hibridizado ao filamento do modelo. quando se estende o iniciador sítio-específico, a atividade da exonuclease 5^3’ da polimerase destroi a porção de modelodo oligonucleotídeo ligado, criando um produto contendo ambos os marcadores a montante e a jusante e adequado para a amplificação. Oligonucleotídeo de grampo não ligado se estenderá em si próprio e não amplificará mais. Ambos os oligonucleotídeos a jusante e a montante têm sequências universais opcionais, assim como sequências específicas de UniTaq, permitindo "pré-amplificação" simultânea por 1220 ciclos, antes do tubo de abertura, e dividindo nos ensaios adequados UniTaq ou TaqMan™. Para cada região promotora, haverá três posições de interrogação, de modo que o sinal parece (valor Ct indicando quantidade relative ou sequência metilada) assim como força de sinal total (isto é = 1, 2 ou 3 sítios metilados para aquele promotor). Esta abordagem também é compatível com o uso de UNG para fornecer proteção de transferência, e a RNaseH2 para fornecer fidelidade extra durante as etapas de amplificação de PCR.
[475] Para resumir os níveis de discriminação da abordagem acima para a detecção de metilação pouco abundante: 1. Uso de enzima de restrição insensível à metilação para gerar um 5’ fosfato único em DNA alvo de filamento duplo. 2. Uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação para clivar alvo de filamento duplo quando não metilado. 3. Uso de UNG e enzimas de restrição sensíveis à metilação para prevenir contaminação por transferência da reação de PCR inicial. 4. Use da fidelidade da ligação da ligase termoestável para ligar marcador correto ao filamento alvo. 5. Use of iniciador sítio-específico e polimerase para amplificar filamentos de alvo ligados. 6. Uso da atividade de nuclease de RNaseH2 para liberar um 3’ OH não bloqueado nos iniciadores de PCR, apenas quando hibridizado no alvo. 7. Uso de sequências na extremidade 3’ de oligonucleotídeos marcadores, de modo que quando eles não estão ligados, formam grampus e se estendem neles mesmos para formar produtos que não amplificam. 8. Uso de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar PCR ou produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real.
[476] 2.2a. Preparar a mistura contendo enzimas de restrição, modelos de grampo artificial (veja abaixo), e ligase termoestável. Clivar o DNA genômico isolado ou DNA enriquecido com metila com um coquetel de enzimas sensíveis à metila (por exemplo HinP1I, Bsh1236I, AciI, Hpy99I e HpyCH4IV), assim como com enzimas insensíveis à metila (HaeIII e MspI). Gerar fragmentos de aproximadamente 40 bases ou mais que têm um fosfato 5’ a partir de um sítio de HaeIII ou MspI, e pelo menos 3 sítios sensíveis à metila (que não são clivados porque não são metilados). Preferivelmente, gerar três referidos fragmentos por promotor. Exterminar termicamente as endonucleases (65°C por 15 minutos) e desnaturar o DNA (94°C 1 minuto). Os modelos artificiais contêm região de iniciador a montante (U1Pm de Iniciador Universal 5’ opcional, seguido por UniTaq Ai) assim como uma região complementar a UniTaq Ai, e uma região complementar ao DNA alvo com Tm de cerca de 72°C, e sobreposição com pelo menos um sítio de restrição sensível à metila). Incubar a 60°C para permitir a hibridização e a ligação de oligonucleotídeos de grampo ao 5’ fosfato do DNA alvo caso e apenas se ele foi metilado e hibridizado no modelo correto. Esta mistura de DNA genômico - produto de ligação inicial é adequada para amplificação por PCR multiplex em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial), ou em um poço único.
[477] 2.2b. Adicionar: As enzimas de restrição sensíveis à metila (incubar a 37°C por 30 minutos), assim como Taq polimerase "hot-start", dNTPs, UniTaqAi, e iniciadores a jusante (contendo 5’ Iniciador Universal U2, seguido por UniTaq Bi, seguido por sequência sítio- específica alvo complementar ao fragmento alvo com sequência que é apenas a jusante da sequência de filamento do modelo artificial). Quando se estende o iniciador sítio-específico, a atividade 5’^3’ da exonuclease da polimerase destroi a porção de modelo do oligonucleotídeo ligado, criando um produto contendo ambos os marcadores a montante e a jusante e adequado para a amplificação. Oligonucleotídeo de grampo não ligado se estenderá em si próprio e não amplificará mais. De forma ideal, as terminações do iniciador universal U1Pm e U2 nos iniciadores compostos de LDR e PCR são levemente mais curtas do que dos iniciadores universais U1 e U2. Isto permite amplificação universal inicial a uma temperatura de ciclização menor (por exemplo, anelamento a 55°C) seguido por temperatura de ciclização maior (por exemplo, anelamento a 65°C) de modo que os iniciadores universais U1Pm e U2 se liguem preferencialmente ao produto desejado (comparado à ligação dos iniciadores compostos aos produtos incorretos). Na variação preferida para minimizar amplificações independents de alvo, os iniciadores de PCR a jusante contêm uma Base RNA e uma extremidade 3’ bloqueada, que é liberada por uma RNase-H que clova a Base RNA quando o iniciador é hibridizado a seu alvo. Essas condições amplificam produtos da sequência:Iniciador Universal U1Pm- UniTaq Ai - Região de metilação - UniTaq Bi’ - Iniciador UniversalU2’ ou simplesmente da sequência:UniTaq Ai - Região de metilação - UniTaq Ci’
[478] 2.2c. Abrir tubo, diluir 10- a 100 vezes e distribuir aliquotas aos poços TaqMan™, cada poço contendo os iniciadores que seguem: Iniciador Universal U2 e iniciadores específicos UniTaq do formato F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará:F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Região de metilação - UniTaq Bi’ - Iniciador Univ. U2’
[479] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’. Quando o Iniciador Universal U2 se liga à sequência do Iniciador Univ. U2’, a atividade 5’^3’ da exonuclease da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[480] Para produtos da sequência UniTaq Ai - DNA alvo – UniTaq Ci’, eles podem ser detectados usando iniciadores de PCR encaixados, com a clivagem de RNaseH2 opcional para remover grupos de bloqueio e uma sonda TaqMan™ interna.
[481] Como um controle para a quantidade total de DNA presente, pode-se escolher um fragmento alvo próximo onde o 5’ fosfato é gerado por uma enzima insensível à metila (HaeIII ou MspI), e o resto do fragmento carece de sítios de enzima sensível à metila. O oligonucleotídeo a montante que é ligado ao fragmento alvo é uma mistura de dois oligos: (i) Um oligonucleotídeo presente a 1 em 100 com a correta sequência específica de UniTaq, e (ii) um oligonucleotídeo presente a 99 em 100 com uma sequência que tem cerca de 8-10 bases complementares a sua extremidade 3’. Depois do evento de ligação e destruição do modelo com UNG e AP endonuclease, os iniciadores universais são adicionados para amplificação por PCR. O produto de ligação contendo as sequências de UniTaq amplifica e dá um sinal equivalente a 1 em 100 do modelo original. O produto de ligação da maior parte carece da sequência universal na extremidade 5’ e não amplifica exponencialmente. A sonda a montante não ligada formará um grampo de volta nele próprio e extenderá sua própria sequência 3’ ao se tornar parte de um outro amplicon de PCR. Alternativamente ou além disso, o controle pode usar uma razão diferente dos dois oligonucleotídeos, por exemplo 1:10 ou 1:1,000 para permitir comparações precisas em níveis baixos do DNA metilado presente no síto promotor de interesse.
[482] Um controle alternativo usa uma mistura de doisoligos: (i) Um oligonucleotídeo de grampo presente a 1 em 100 com a correta sequência específica de UniTaq, e (ii) Um oligonucleotídeo de grampo presente a 99 em 100 sem a sequência de UniTaq. Depois do evento de ligação, os iniciadores universais são adicionados para a amplificação por PCR. Quando se estende o sítio-específico, a atividade exonuclease 5’->3’ da polimerase destroi a porção de modelodo oligonucleotídeo ligado, criando um produto contendo ambos os marcadores a montante e a jusante e adequado para a amplificação. Oligonucleotídeo de grampo não ligado se estenderá em si próprio e não amplificará mais. O produto de ligação contendo as sequências de UniTaq amplifica e dará um sinal equivalente a 1 em 100 do modelo original. O produto de ligação da maior parte carece da sequência universal na extremidade 5’ e não amplifica exponencialmente.
[483] A Figura 48 ilustra detecção da metilação em DNA genômico ou cfDNA usando a digestão de restrição, ligação de grampo, extensão sítio-específica, com protocolo de amplificação por PCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando iniciadores de PCR com sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência metilada.
[484] A Figura 49 ilustra uma variação da Figura 48, onde os iniciadores iniciais de PCR específicos do gene contêm marcadores UniAi e UniCi. Os produtos são diluídos e distribuídos nos poços para uma amplificação encaixada. Os iniciadores de PCR a montante e a jusante enxaixados contêm marcadores UniTaq Aj e UniTaq Bj-UniTaq Cj tags em suas extremidades 5’, respectivamente. Além disso, os iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Cj e F1-UniTaq Bj - Q - UniTaq Aj estão presentes na mistura de amplificação em maior concentração, e assim se tornam os iniciadores dominantes que se incorporam nos produtos de amplificação. O filamento de produto formado pelo iniciador marcado com fluorescente vai formar grampo, de modo que a sequência UniTaq Bj se emparelhe com a sequência UniTaq Bj’. Quando o iniciador UniTaq Cj se liga à sequência UniTaq Cj’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bj, liberando o corante fluorescente F1, e gerando sinal detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[485] Os produtos da sequência UniTaq Ai - Target DNA – UniTaq Ci’ também podem ser detectados usando iniciadores encaixados dentro da sequência UniTaq Ci e UniTaq Ai, e uma sonda TaqMan™ padão.
[486] Dois ou três fragmentos em uma única região promotora podem ser interrogados ao mesmo tempo usando o mesmo corante fluorescente. O número de fragmentos metilados por promotor pode ser determinado pelo sinal total para aquele corante. Quando se usa multiplexação espacial, a amostra é distribuída a 12, 24, 48 ou 96 poços individuais antes da etapa de incubação a 37°C (mas depois da adição de enzimas). Desta maneira, metilação ao longo de uma região promotora de uma dada molécula de DNA pode ser distinguida a partir da metilação de três diferentes regiões em três diferentes moléculas.
[487] Já que há uma etapa de ligação inicial, uma etapa de LDR subsequente não é necessária, com a reação de PCR inicial seguida diretamente por uma reação de PCR secundária em tempo real (por exemplo, TaqMan™). A desvantagem de ir direto a uma PCR secundária é que a proteção transferência de UNG não seria usada já que os produtos da reação de PCR inicial têm dUTP incorporado, e assim seriam destruídos por UNG. Uma abordagem para resolver este problema seria usar dNTP’s padrão na PCR inicial, e se basear apenas nas endonucleases de restrição para destruir qualquer transferência potencial a partir das reações de PCR iniciais ou subsequentes, já que esses produtos agora são não metilados.
[488] Os iniciadores de PCR também podem conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. RNaseH2 é então adicionada à reação. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado com os conjuntos do iniciador de UniTaq. Em alguns projetos, um sítio de restrição sensível à metila está a jusante da extremidade 3’ do iniciador de PCR, de modo que a clivagem com a enzima remove a sequência de ligação para as 4 bases adicionais, e clivagem da Base RNA por RNaseH2 é significaticamente reduzida.
[489] Visão geral da abordagem v3: DNA genômico isolado ou DNA enriquecido com metila é tratado com enzimas sensíveis à metila cujos elementos de reconhecimento compreendem apenas dos pares CpG dinucleotícos (isto é Bsh1236I = CGACG; e Hpy99I = CGWCGA). Tratar com bissulfeto, o que converte "dC" em "dU", e torna os filamentos não complementares. Hibridizar os iniciadores sítio- específicos na presença de BstU1 (CGACG), que clivarão o DNA de transferência. Os iniciadores e alvo que não são clivados são desbloqueados com RNaseH2 apenas quando ligado ao alvo. Os iniciadores de PCR desbloqueados então amplificam os fragmentos de DNA convertidos em bissulfeto de cerca de 100 - 130 bp. O fragmento deve ter pelo menos 2 sítios de enzima sensíveis à metila, de modo que a clivagem faça com que esses fragmentos dissipem. Esses sítios são escolhidos de modo que a prevenção de transferência possa funcionar em dois níveis: (i) os sítios ainda são cliváveis em DNA contendo dUTP incorporado, permitindo o uso de UNG para a prevenção de transferência e (ii) depois da amplificação, os sítios são não metilados, de modo que os produtos seriam prontamente reclivados caso eles transferência em uma outra reação. Além disso, o fragmento deve ter pares de CpG metilados interos adicionais, de modo que um iniciador de bloqueio enriqueceria a amplificação de alvo inicialmente metilado, e além disso as sondas de LDR também selecionariam para a detecção de alvo inicialmente metilado. Subsequente à amplificação inicial de PCR, as reações de LDR e UniTaq com proteção de transferência são realizadas conforme descrito acima. Alternativamente, LDR e TaqMan™, ou reações diretas TaqMan™ podem ser realizadas para identificar e quantificar quantidades relativas de DNA metilado em uma amostra inicial.
[490] Para resumir os níveis de discriminação da abordagem acima usando ambos os iniciadores de PCR e LDR para a detecção de metilação pouco abundante: 1. Uso de enzimas de restrição sensíveis à metilação para clivar o alvo quando não metilado. 2. Uso da atividade de nuclease de RNaseH2 para liberar um 3’ OH não bloqueado nos iniciadores de PCR, apenas quando hibridizado no alvo. 3. Uso de UNG e enzimas de restrição sensíveis à metilação para prevenir contaminação por transferência da reação de PCR inicial. 4. Uso da fidelidade da ligação 3’da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 5. Uso de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 6. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[491] 2.3.a. Incubar DNA genômico, ou DNA enriquecido com metila na presença de Bsh1236I (CGACG) e UNG (37°C, 30-60 minutos) para digerir completamente DNA não metilado e prevenir transferência. Tratar com bissulfeto, o que torna os filamentos não complementares, e purifica os filamentos de DNA usando um kit comercialmente disponível (isto é da Zymo Research ou Qiagen). Adicionar suplemento tampão para otimizar a amplificação por PCR multiplexada, dUTP, e outras dNTP’s, AmpliTaq Gold, RNaseH2, BstU1(CGACG), e iniciadores gene- específicos contendo uma Base RNA depois da extremidade 3’ desejada, 4 bases adicionais, e um grupo bloqueador para prevenir extensão em alvo incorretos. Esta mistura de reação de PCR-DNA genômico inicial é adequada para amplificação por PCR multiplex em 12, 24, 48 ou 96 individual poços (multiplexação espacial), ou em um poço único. BstU1 clivará qualquer DNA de transferência de uma amplificação anterior. Desnaturar DNA genômico digerido e a endonuclease de restrição, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minutos) e mutação contendo fragmentos por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 16-20 ciclos). Os iniciadores de PCR são designados para ter valores Tm em torno de 60°C, mas com as 5 bases extras eles estão mais próximos de 65-68°C, e hibridizarão vigorosamente, mesmo quando usado em concentrações 10 a 50 vezes abaixo da norma para PCR uniplex (10 nM a 50 nM cada iniciador). Além disso, um oligonucleotídeo bloqueador é usado para limitar a amplificação de DNA não metilado. Os ciclos são limitados para reter equilíbrio relativo de produtos de PCR um com relação ao outro, enquanto ainda se amplificam sequências pouco abundantes cerca de 100,000 a 1,000,000 vezes. Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[492] 2.3.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagem AK16D), suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, sondas a jusante podem ser sintetizadas com 5’ fosfato, ou fosforiladas com quinase em massa antes das reações. as sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isso permitirá que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR caso DNA metilado esteja presente na amostra original.
[493] 2.3.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços nas reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nas sondas de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato:UniAi - Alvo a montante- Bissulfeto-Região de metilação convertida - Alvo a jusante - UniCi’
[494] Dois ou três fragmentos em uma única região promotora podem ser interrogados ao mesmo tempo usando o mesmo corante fluorescente. O número de fragmentos metilados por promotor pode ser determinado pelo sinal total para aquele corante. Quando se usa multiplexação espacial, a amostra é distribuída a 12, 24, 48 ou 96 poços individuais antes da etapa de incubação a 37°C (mas depois da adição de enzimas). Desta maneira, a metilação ao longo de uma região promotora de uma dada molécula de DNA pode ser distinguida a partir da metilação de três diferentes regiões em três diferentes moléculas.
[495] A Figura 50 ilustra a detecção da metilação em DNA genômico ou cfDNA usando digestão de restrição e tratamento com bissulfeto. Os iniciadores de PCR da região metilada convertida com bissulfeto iniciais contêm uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. A hibridização desses iniciadores na presença de BstU1 clivará o DNA de transferência. Esses iniciadores gene-específicos são desbloqueados a partir da extremidade por RNaseH2 apenas quando hibridizados no alvo, liberando uma extremidade de 3’OH adequada para a extensão de polimerase. Um oligonucleotídeo bloqueador é usado para limitar a amplificação de DNA não metilado, convertido com bissulfeto. As sondas de LDR para DNA metilado convertido com bissulfeto proveem especificidade adicional. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[496] A Figura 51 ilustra uma variação da Figura 50. As sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’, respectivamente. Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). O filamento de produto formado pelo iniciador marcado com fluorescente vai formar grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’. Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’ , a atividade 5’^3’ da exonuclease da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1, e gerando sinal detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[497] A Figura 52 ilustra uma variação da Figura 50, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. Os iniciadores de PCR contêm terminações universais para eliminar a formação de dímero de iniciador, e para permitir a amplificação com iniciadores universais, um dos quais contém uma biotina, permitindo a captura de produtos em poços cobertos com estreptavidina. As sondas de ligação são hibridizadas para direcionar e apenas formar produto quando há perfeita complementariedade na junção de ligação. As sondas de ligação não reagidas, ou produtos de ligação independentes de alvo são então descartados. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[498] A Figura 151 ilustra uma variação da Figura 50, onde depois da inicial digestão da endonuclease de restrição e conversão em bissulfeto, os produtos de PCR são seletivamente amplificados usando iniciadores a montante e a jusante sítio-específicos. Mediante a hibridização alvo-específica, RNaseH remove a Base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase. Uma sonda de LNA ou PNA bloqueadora compreendendo sequência não metilada convertida de bissulfeto (ou seu complemento) que parcialmente se sobrepõe com o iniciador de PCR a montante preferencialmente competirá em ligação a sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto sobre o iniciador a montante, porém não muito com a sequência alvo metilada convertida em bissulfeto, e assim suprime a amplificação da sequência alvo não metilada convertida de bissulfeto durante cada rodada de PCR. Depois da etapa de enriquecimento do PCR inicial, este procedimento continua com o protocolo de detecção LDR-qPCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[499] A Figura 152 ilustra uma variação da Figura 151, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm porções marcadoras de sequência e iniciador-específicas UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’. Depois da ligação, os produtos são diluídos e distribuídos nos poços contendo iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai, e sinal gerado na PCR é detectado por um instrumento de PCR em tempo real.
[500] A Figura 153 ilustra uma variação da Figura 151, onde os produtos de PCR são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[501] A Figura 156 ilustra uma variação da Figura 50, onde os produtos de PCR são seletivamente amplificados usando iniciadores a montante sítio-específicos que também compreendem sequências de porção 5’ complementares à sequência não metilada tratada com bissulfeto do filamento superior permitindo a formação de alças- grampos depois da extensão, e iniciadores a jusante sítio-específicos. Mediante a hibridização alvo-específica, RNaseH remove a Base RNA para liberar um grupo 3’OH adequado para a extensão de polimerase. PCR é realizada com uma 5’ nuclease sem polimerase, 3’ nuclease, e atividade de deslocamento filamentar. (i) Desnaturação de filamento inferior não metulado tratado com bissulfeto resulta em alça-grampo com perfeita compatibilidade na extremidade 3’, que é estendida pela polimerase para formar uma região de grampo mais longa. Esta não desnatura a 72oC e previne o iniciador a montante de gerar filamento superior de comprimento total. (ii) Desnaturação de filamento inferior metilado tratado com bissulfeto resulta em alça-grampo com duas ou mais incompatibilidades. Esta não se estende por polimerase, e assim desnatura a 72oC, permitindo ao iniciador a montante gerar filamento superior de comprimento total. (iii) Desnaturação de filament superior resulta em grampo na lateral 5’, que desnatura durante a etapa estendida de PCR (72oC), permitindo que a polimerase gere filamento inferior de comprimento total. A diferença na preferência da extensão do grampo dos iniciadores a montante com (i) modelo não metilado tratado com bissulfetoand (ii) modelo metilado tratado com bissulfeto resulta na amplificação preferencial de DNA mutante. Esta seleção em oposição à amplificação de alvo não metilado tratado com bissulfeto ocorre durante cada ciclo da PCR, assim enriquecendo com alvos metilados tratados com bissulfeto. Depois da etapa de enriquecimento da PCR inicial, este procedimento continua com protocolo de detecção de LDR-qPCR com a prevenção de transferência. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[502] A Figura ilustra uma variação da Figura 148, onde os produtos de PCR são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[503] As sondas de LDR a montante e os iniciadores de PCR também pode conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. RNaseH2 é então adicionada à reação. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado. Em alguns projetos, um sítio de restrição sensível à metila está a jusante da extremidade 3’ do iniciador de PCR, de modo que a clivagem com a enzima remove o grupo de bloqueio.
[504] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnaturação na LDR deve ser a mais curta possível (por exemplo, 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré-incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ do iniciador a jusante pode conter a mesma base que a base 3’ discriminatória no iniciador a montante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[505] A Figura 53 ilustra uma variação da Figura 50, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e depois submetidos a uma segunda PCR usando uma sonda TaqMan™ assim como um oligonucleotídeo bloqueador para limitar a amplificação de DNA não metilado, convertido em bissulfeto.
[506] As Figuras 151 - 158 ilustram uma variação da Figura 45, onde os produtos de PCR primários são detectados diretamente usando iniciadores sítio-específicos encaixados e sondas TaqMan™ internas. Os produtos de PCR incorporam dU, e são não metilados, permitindo a prevenção de transferência.
[507] Visão geral da abordagem: Esta abordagem depende na fidelidade de três enzimas: (i) transcriptase reversa e fielmente cópias de nível baixo de transcritos de RNA aberrantes na amostra inicial, (ii) Taq polimerase para amplificar proporcionalmente o cDNA, e (iii) ligase termoestável na discriminação de iniciadores hibridizados adjacentes um ao outro. Quando um evento de ligação acontece, aqueles produtos serão amplificados em uma etapa de amplificação por PCR em tempo real subsequente e assim esta é a etapa discriminatória chave.
[508] Uma vantagem de usar LDR é que ela pode discriminate um evento de translocação independente dos pontos de ruptura precisos. Além disso, quando uma translocação ou splicing alternativo cria novas junções exon-exon, LDR é idealmente adequada para distinguir precisamente essas junções, de volta às bases exatas nas junções.
[509] Existem pelo menos duas fontes de transcritos de splicing de forma aberrante em tumores. Os tumores podem sofrer desregulação global da expressão genética através da hipo-metilação total. Uma consequência da hipo-metilação é a degradação do controle dos sítios iniciais da transcrição em regiões promotoras, permitindo sequências alternativas na extremidade 5’ dos transcritos. As referidas sequências líder de splicing alternativo podem ser então precisamente identificadas e quantificadas usando ensaios baseados em LDR. Uma segunda fonte de transcritos de splicing de forma aberrante surge da desregulação da produção de splicing. Alguns referidos transcritos são traduzidos em proteínas que facilitam ou mesmo gerenciam o crescimento tumoral. Novamente, esses transcritos de splicing alternativo podem ser então precisamente identificados e quantificados usando ensaios baseados em LDR, incluindo fornecer níveis relativos de ambos o transcrito aberrante e transcrito do tipo selvagem na mesma reação de LDR.
[510] Para proteger contra a contaminação por transferência, UNG é adicionado à reação antes da ativação da polimerase, e a amplificação inicial de PCR é realizada com dUTP. As sondas de LDR são compreendidas das bases naturais, assim o produto de LDR é agora resistente à digestão de UNG na segunda etapa de PCR em tempo real. Observe que os Produtos de LDR contêm marcadores ou sequências de UniTaq em suas extremidades não ligantes, as quais estão em falta no DNA alvo, sendo assim a transferência acidental dos Produtos de LDR não resulta em amplificação em larga escala. Diferente da PCR, um produto de LDR inicial não é um substrato para uma segunda reação de LDR.
[511] Para resumir os níveis de discriminação da abordagem acima para a detecção de alta sensibilidade de translocação ou variação do sítio de splicing no mRNA: 1. Uso de iniciadores de PCR com terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. 2. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência de reação de PCR inicial. 3. Uso da fidelidade da ligação 3’da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 4. Uso de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 5. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[512] 3.1.a. Incubar mRNA isolado (ou mesmo ácidos nucleicos isolados) na presença de UNG (37°C, 15-30 minutos, para prevenir transferência), dUTP, e outras dNTP’s, MMLV transcriptase reversa, AmpliTaq Gold, e iniciadores transcrito-específicos. (MMLVtranscriptase reversa pode ser engenheirada para sintetizar cDNA a 5060°C, a partir de RNA total de entrada (Invitrogen Superscript III). Alternativamente, Tth ou Tma DNA polimerases foram engenheiradas para melhorar a sua atividade de transcriptase reversa (pode necessitar da adição do cofator Mn). Finalmente, a DNA polimerase termofílica PyroPhage 3173 tem tanto o deslocamento filamentary quanto a atividade de transcriçao reversa, e também pode ser usada.) Esta mistura de reação de cDNA - PCR inicial é adequada para amplificação por PCR de transcrição reversa multiplex em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial), ou em um poço único. Depois da extensão dos iniciadores reversos em seus transcritos de RNA cognatos para gerar cDNA, inativar UNG e MMLV transcriptase reversa, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minutos) e fragmentos contendo transcrito de amplificação por PCR multiplex PCR por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 16-20 ciclos). Os iniciadores de PCR são designados para ter valores Tm em torno de 6466°C, e hibridizarão vigorosamente, mesmo quando usado em concentrações 10 a 50 vezes abaixo da norma para PCR uniplex (10 nM a 50 nM cada iniciador). Os ciclos são limitados para reter equilíbrio relativo de produtos de PCR um com relação ao outro, enquanto ainda se amplificam sequências pouco abundantes cerca de 100,000 to 1,000,000 vezes. Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[513] 3.1.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagem AK16D), suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, sonda a jusantes podem ser sintetizadas com 5’ fosfato, ou fosforiladas com quinase em massa antes das reações; sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência transcrito-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isto permite que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR de cDNA caso a junção exon-exon desejada esteja presente. Para a detecção de translocações onde a junção precisa é conhecida, três sondas de LDR são usadas. A(s) sonda(s) do meio contém sequência complementar a regiões a montante e a jusante dos (vários) transcritos de splicing. As sondas a montante e a jusante contêm marcadores conforme descrito acima para permitir amplificação de UniTaq ou TaqMan™ subsequente e detecção dos produtos de ligação desejados.
[514] 3.1.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços nas reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nas sondas de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato:UniTaq Ai - Junção Exon a Montante- Exon a Jusante- UniTaq Ci’
[515] Para os produtos usando três Sondas de LDR para detectar transcritos com junções desconhecidas, o produto que segue formará: UniTaq Ai - Exon a Montante - Sequência em Ponte - Exon a Jusante- UniTaq Ci’
[516] A Figura 54 ilustra uma visão geral da abordagem para usar a reação de PCR-LDR com a prevenção de transferência para detectar translocação no nível de mRNA. Uma ilustração de uma translocação entre dois genes é mostrada, com o cruzamento permitindo que os exons 1, 2, ou 3 do gene a montante se fundam com exon b do gene a jusante. As sondas de LDR são designadas para detectar todas as possíveis junções de exon (1-b, 2-b e 3-b).
[517] Figura 55 ilustra um close up da detecção da translocação (visão geral na Figura 54) em um gene de fusão usando o protocolo de detecção básico de RT-PCR-LDR-qPCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação.
[518] A Figura 56 ilustra uma variação da Figura 55, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’, respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciadores de UniTaq fluorescentemente marcados.
[519] A Figura 57 ilustra uma variação da Figura 55, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção.
[520] A Figura 58 ilustra uma visão geral da abordagem para usar a reação de PCR-LDR com a prevenção de transferência para detectar splicing alternativo. Uma ilustração de um exemplo de mRNA variante normal (1-2-3a-4) e de variante de splicing alternativo (1-2-3b-4) são ilustrados. As sondas de LDR são designadas para detectar ambas a variante normal e/ou a variante de splicing alternativo (3a-4, e 3b-4).
[521] A Figura 59 ilustra um close up da detecção da variante de splicing alternativo (visão geral na Figura 58) usando o protocolo de detecção básico de RT- PCR-LDR-qPCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas de TaqMan™ marcadas de forma diferente ao longo das sequências da junção de ligação, para o transcrito normal 3a-4 (F1), e para a variante de splicing alternativo 3b-4 (F2).
[522] A Figura 60 ilustra uma variação da Figura 59, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai ou UniTaq Aj e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciadores de UniTaq marcados fluorescentemente F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai and F2- UniTaq Bi - Q - UniTaq Aj para detectar sinaiss F1 e F2, representando transcrito normal 3a-4, e para a variante de splicing alternativo 3b-4, respectivamente.
[523] A Figura 61 ilustra uma variação da Figura 59, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 e F2 adequado para a detecção, representando transcrito normal 3a-4, e para a variante de splicing alternativo 3b-4, respectivamente.
[524] A Figura 62 ilustra a close up da detecção de variante de splicing alternativo de nível baixo (visão geral na Figura 58) usando o protocolo de detecção básico de RT- PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador, e são designadas para amplificar apenas o transcrito da minoria contendo a junção 3b-4. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para a variante de splicing alternativo pouco abundante 3b-4.
[525] A Figura 63 ilustra uma variação da Figura 62, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal F1, representando a variante de splicing alternativo pouco abundante 3b-4.
[526] A Figura 64 ilustra uma variação da Figura 62, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 adequado para a detecção, representando a variante de splicing alternativo pouco abundante 3b-4.
[527] A Figura 65 ilustra uma visão geral da abordagem para usar a reação de PCR-LDR com a prevenção de transferência para detectar splicing alternativo, com um sítio inicial alternativo para o primeiro exon. Uma ilustração de um exemplo de mRNAs de de variante normal (1-23) e variante de splicing alternativo (1a-2-3) é mostrada. As sondas de LDR são designadas para detectar ambas a variante normal e/ou a variante de splicing alternativo (1-2, e 1a-2).
[528] A Figura 66 ilustra um close up de detecção da variante de splicing alternativo (visão geral na Figura 65) usando o protocolo de detecção básico de RT- PCR-LDR-qPCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ diferentemente marcadas projetadas ao longo das sequências da junção de ligação, para o transcrito normal 1-2 (F1), e para a variante do sítio inicial alternativo 1a-2 (F2).
[529] A Figura 67 ilustra uma variação da Figura 66, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai ou UniTaq Aj e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciadores de UniTaq marcados fluorescentemente F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai e F2- UniTaq Bi - Q - UniTaq Aj para detectar sinais F1 e F2, representando transcrito normal 1-2, e para a variante do sítio inicial alternativo 1a-2, respectivamente.
[530] A Figura 68 ilustra uma variação da Figura 66, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 e F2 adequado para a detecção, representando transcrito normal 1-2, e para a variante do sítio inicial alternativo 1a-2, respectivamente.
[531] A Figura 69 ilustra um close up da detecção de variante de splicing alternativo de nível baixo (visão geral na Figura 58) usando o protocolo de detecção básico de RT-PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador, e são designadas para amplificar apenas o transcrito da minoria contendo a junção 1a-2. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para a variante do sítio inicial alternativo pouco abundante 1a-2.
[532] A Figura 70 ilustra uma variação da Figura 69, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal F1, representando a variante do sítio inicial alternativo pouco abundante 1a-2.
[533] A Figura 71 ilustra uma variação da Figura 69, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 adequado para a detecção, representando a variante do sítio inicial alternativo pouco abundante 1a-2.
[534] A Figura 72 ilustra uma visão geral da abordagem para usar a reação de PCR-LDR com a prevenção de transferência para detectar splicing alternativo com a deleção de éxons. Uma ilustração de um exemplo de mRNA's de variante normal (e1-e2-e3-e4-e5) e variante de splicing alternativo (e1-e2-e3-e5) é ilustrada. As sondas de LDR são designadas para detectar ambas a variante normal e/ou a variante de deleção de exon de splicing alternativo (e4-e5, e e3-e5).
[535] A Figura 73 ilustra um close up da detecção da variante de splicing alternativo (deleção de éxons) (visão geral na Figura 58) usando o protocolo de detecção básico de RT- PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ marcadas de forma diferente projetadas ao longo das sequências da junção de ligação, para o transcrito normal e4-e5 (F1), e para a variante de deleção de éxons de splicing alternativo e3-e5 (F2).
[536] A Figura 74 ilustra uma variação da Figura 73, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai ou UniTaq Aj e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciadores de UniTaq marcados fluorescentemente F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai e F2- UniTaq Bi - Q - UniTaq Aj para detectar sinais F1 e F2, representando transcrito normal e4-e5, e para a variante de deleção de éxons de splicing alternativo e3-e5, respectivamente.
[537] A Figura 75 ilustra uma variação da Figura 73, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 e F2 adequado para a detecção, representando transcrito normal e4-e5, e para a variante de deleção de éxons de splicing alternativo e3-e5, respectivamente.
[538] A Figura 76 ilustra um close up da detecção de variante de splicing alternativo de nível baixo (deleção de éxons) (visão geral na Figura 58) usando o protocolo de detecção básico de RT-PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene- específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador, e são designadas para amplificar apenas o transcrito da minoria contendo a junção e3-e4 usando um oligonucleotídeo bloqueador com sequência e4 para suprimir a amplificação de transcrito do tipo selvagem. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para a variante de deleção de éxons de splicing alternativo pouco abundante e3-e5.
[539] A Figura 77 ilustra uma variação da Figura 76, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal F1, representando a variante de deleção de éxons de splicing alternativo pouco abundante e3-e5.
[540] A Figura 78 ilustra uma variação da Figura 76, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando um sinal FRET F1 adequado para a detecção, representando a variante de deleção de éxons de splicing alternativo pouco abundante e3-e5.
[541] A Figura 79 ilustra uma visão geral da abordagem para usar a reação de PCR-LDR com a prevenção de transferência para detectar splicing alternativo com a inserção de íntrons. Uma ilustração de um exemplo de mRNA's de variante normal (e1-e2-e3-e4-e5) e variante de splicing alternativo (e1-i1-e2-e3-e4-e5) é mostrada. As sondas de LDR são designadas para detectar ambas a variante normal e/ou a variante de splicing alternativo com a inserção de íntrons (e1-e2, e i1-e2).
[542] A Figura 80 ilustra um close up da detecção da variante de splicing alternativo (visão geral na Figura 79) usando o protocolo de detecção em tempo real básico de RT- PCR-LDR-PCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene-específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ marcadas de forma diferente projetadas ao longo das sequências da junção de ligação, para o transcrito normal e1-e2 (F1), e para a variante de splicing alternativo com a inserção de íntrons i1-e2 (F2).
[543] A Figura 81 ilustra uma variação da Figura 80, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai ou UniTaq Aj e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciadores de UniTaq marcados fluorescentemente F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai e F2- UniTaq Bi - Q - UniTaq Aj para detectar sinais F1 e F2, representando transcrito normal e1-e2, e para a variante de splicing alternativo com a inserção de íntrons i1-e2, respectivamente.
[544] A Figura 82 ilustra uma variação da Figura 80, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 e F2 adequado para a detecção, representando transcrito normal e1-e2, e para a variante de splicing alternativo com a inserção de íntrons i1-e2, respectivamente.
[545] A Figura 83 ilustra um close up da detecção de variante de splicing alternativo de nível baixo (inserção de íntrons) (visão geral na Figura 79) usando o protocolo de detecção básico de RT- PCR-LDR- qPCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene- específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador, e são designadas para amplificar apenas o transcrito da minoria contendo a junção i1-e2. Isto pode ser alcançado ao (i) digerir ácidos nucleicos com DNase1 pancreática, para digerir todo o DNA genômico enquanto se deixa o mRNA intacto, ou (ii) usando conjuntos iniciadores que atravessam íntron i2 também, por exemplo, transcrevem de forma reversa a partir de e3, na presença de iniciador de bloqueio para i2. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para a variante de splicing alternativo pouco abundante com a inserção de íntrons i1-e2.
[546] A Figura 84 ilustra uma variação da Figura 83, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal F1, representando a variante de splicing alternativo pouco abundante com a inserção de íntrons i1-e2.
[547] A Figura 85 ilustra uma variação da Figura 83, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET F1 adequado para a detecção, representando a variante de splicing alternativo pouco abundante com a inserção de íntrons i1-e2.
[548] Quando se usa UniTaq contendo sondas de LDR, elas são do formato que segue: sondas a montantes compreendem um marcador 5’, tal como UniTaqAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguido por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’.
[549] Os produtos de LDR podem ser detectados usando iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Junção Exon a Montante- Exon a Jusante- UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[550] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’ . Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[551] Para os produtos usando três sondas de LDR para detectar transcritos com junções desconhecidas, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Exon a Montante- Sequência em Ponte- Exon a Jusante- UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[552] Um dos iniciadores de PCR iniciais ou sondas de LDR a montante também podem conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. RNaseH2 é adicionada à reação depois da etapa de transcrição reversa para a PCR, e/ou durante a reação de LDR. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado.
[553] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnatutação na LDR deve ser a mais curta possível (por exemplo, 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré-incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ da sonda a jusante pode conter a mesma base que a base 3’ discriminatória no iniciador a montante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[554] Visão geral da abordagem: Já que deve haver apenas algumas poucas CTC’s presentes na amostra purificada, é importante usar a multiplexação especial para contar de forma precisa toda a cópia de cromossomo na amostra. Esta abordagem depende na fidelidade de duas enzimas: (i) Taq polimerase para copiar de forma fiel cópias de regiões de DNA de nível baixo na amostra inicial, e (ii) ligase na discriminação de iniciadores que hibridizam um adjacente ao outro. Quando um evento de ligação aconteceu, aqueles produtos serão amplificadoas em uma etapa de amplificação por PCR subsequente em tempo real , e assim esta é a etapa chave discriminatória.
[555] Para proteger contra a contaminação por transferência, UNG é adicionado à reação antes da ativação da polimerase, e a amplificação inicial de PCR é realizada com dUTP. As sondas de LDR são compreendidas das bases naturais, assim o produto de LDR é agora resistente à digestão de UNG na segunda etapa de PCR em tempo real. Observe que os produtos de LDR contêm marcadores ou sequências de UniTaq em suas extremidades não ligantes, as quais estão em falta no DNA alvo, sendo assim a transferência acidental dos produtos de LDR não resulta em amplificação em larga escala. Diferente da PCR, um produto de LDR inicial não é um substrato para uma segunda reação de LDR.
[556] Para resumir os níveis de discriminação da abordagem acima usando ambos os iniciadores de PCR e LDR para a determinação da detecção do número de cópias de regiões específicas: 1. Uso de iniciadores de PCR com terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. 2. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência de reação de PCR inicial. 3. Uso da fidelidade da ligação 3’ da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 4. Uso de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 5. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[557] 4.1.a. Incubar DNA genômico na presença de UNG (37°C, 15-30 minutos, para prevenir transferência), dUTP, e outras dNTP’s, AmpliTaq Gold, e iniciadores gene-específicos contendo terminações universais, de modo que caso qualquer dímero de iniciador independente de alvo se formar, o produto incorreto formará um grampo que inibirá amplificação adicional. Esta mistura de reação de PCR-DNA genômico inicial é distribuída em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial) para a amplificação por PCR multiplez. Desnaturar DNA genômico do plasma, inativar UNG, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minute) e regiões cromossômicas de amplificação por PCR multiplex por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 12-20 ciclos). Os iniciadores de PCR são designados para ter valores Tm em torno de 64-66°C, e hibridizarão vigorosamente, mesmo quando usado em concentrações 10 a 50 vezes abaixo da norma para PCR uniplex (10 nM a 50 nM cada iniciador). Os ciclos são limitados para reter equilíbrio proporcional de produtos de PCR um com relação ao outro, enquanto ainda se amplificam sequências pouco abundantes cerca de 100,000 a 1,000,000 vezes. Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[558] 4.1.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagem AK16D), suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, as sondas a jusante podem ser sintetizadas com 5’ fosfato, ou tornadas quinase em massa antes das reações; as sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isso permitirá que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR caso o DNA cromossômico esteja presente.
[559] 4.1.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços nas reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nos iniciadores de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato:UniAi - Região Alvo Cromossômica - UniCi’
[560] A Figura 86 ilustra a enumeração com número de cópias de DNA com a multiplexação espacial (veja as Figuras 6-9), usando o protocolo de detecção básico de PCR-LDR-q PCR com a prevenção de transferência. Os iniciadores de PCR iniciais específicos do gene contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para cada região cromossômica, e número de cópias total enumerado.
[561] A Figura 87 ilustra uma variação da Figura 86, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal para cada região cromossômica, e número de cópias total enumerado.
[562] A Figura 88 ilustra uma variação da Figura 86, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido (veja as Figuras 19-23). As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção de cada região cromossômica, e número de cópias total enumerado.
[563] A Figura 89 ilustra a enumeração do número de transcrito de mRNA com a multiplexação espacial (veja as Figuras 10-13), usando o protocolo de detecção de transcrição reversa básica de PCR-LDR- qPCR com a prevenção de transferência. A transcrição reversa gene- específica inicial e os iniciadores de PCR contêm terminações de base 8-11 idênticas para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para cada transcrito de mRNA, para permitir a enumeração precisa.
[564] A Figura 90 ilustra uma variação da Figura 89, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal para cada transcrito de mRNA, para permitir a enumeração precisa.
[565] A Figura 91 ilustra uma variação da Figura 89, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido (veja as Figuras 24-28). As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção de cada transcrito de mRNA, para permitir a enumeração precisa.
[566] Como um exemplo de multiplexação especial ao longo de 48 poços, considerar DNA isolado de 12 CTC’s, com sondas preparadas para várias regiões de cópia com o valor prognóstico ou terapêutico, tal como perda de heterozigosidade de ramo cromossômico 8p (LOH em 8p; prevê resultado pior), ou a amplificação do gene Her2 em 17q12 (prevê receptividade à terapia com Herceptin). Múltiplos conjuntos de sonda de LDR podem ser empregados para determinar o número de cópias ao longo do genoma, com pares adicionais nos pontos focais conhecidos por sofrer amplificação significativa. Para este exemplo, as regiões diploides do genoma produziriam sinal a partir de 24 cópias (isto é 2 x 12 células), um evento LOH a 8p produziria 12 cópias, e por exemplo caso o gene Her2 tenha sido amplificado 8 vezes, ele produziria sinal a partir de 96 cópias (isto é 8 x 12). A provável Distribuição de Poisson (Figuras 31 & 32) mostra que a região LOH terá uma distribuição de cerca de (poços: moléculas) (38:0 ; 10:1 ; 1:2) para 12 moléculas, as regiões diploides terão uma distribuição de cerca de (29:0 ; 15:1 ; 4:2 ; 1:3) para 24 moléculas, enquanto que a região amplificada terá uma distribuição de cerca de (6:0 ; 13:1 ; 13:2 ; 9:3 ; 4:4 ; 2:5 ; 1:6) para 96 moléculas. Observe que mesmo caso uma região tenha sofrido apenas amplificação leve, por exemplo a partir de 2 cópias por célula a 3 cópias, as regiões de trissomia terão uma distribuição de cerca de (23:0 ; 17:1 ; 6:2 ; 2:3) para 36 moléculas, e assim distinguíveis a partir das regiões diploides. Como antes, mesmo se o sinal de LDR em LDR-TaqMan™ variável o suficiente distinguindo os sinais de nível maior se tornar muito difícil, à medida que o sinal seja claro o suficiente para distinguir 0, 1, e 2 moléculas iniciais (representadas como valores Ct de LDR-TaqMan™ de 12.5, 10 e 9, ou sinais de LDR de cerca de 1,000, 5,000 e 10,000, respectivamente), esta abordagem não terá dificuldade em distinguir e enumerar as regiões que sofreram LOH, regiões que são diploides, e regiões que sofreram a amplificação. O sinal CT ou sinal fluorescente é variável o suficiente apenas para distinguir entre 0 e 1 ou mais moléculas cromossômicas iniciais, dadas as 24 cópias de cromossomos diploides em um mínimo de 48 poços, esta abordagem deve distinguir e enumerar regiões que sofreram LOH,regiões que são diploides, e regiões que sofreram amplificação.
[567] Para as amostras de cfDNA com maior carga de DNA tumoral ou com mRNA ou miRNA, onde o alvo inicial está presente em quantidades maiores, o sinal de LDR será proporcionalmente mais forte. Uma grande faixa dinâmica de moléculas iniciais também pode ser alcançada usando uma diferente estratégia para diluir o sinal inicial. Por exemplo, depois de uma etapa de transcrição reversa para mRNA isolado a partir de exossomas, em vez de dividir a amostra igualmente entre 48 poços, a amostra é distribuída em 10 aliquotas, as primeiras 8 são distribuídas nos poços, e uma das alíquotas restantes é diluída em 10 alíquotas, com 8 distribuídas nos poços, etc. Isto permite 6 ordens de magnitude de diluição: (isto é 8 x 6 = 48). Examinação das Distribuições de Poissons mostra que à medida que 1 poço da última diluição represente 0 molécula, um dado conjunto de 8 poços pode fornecer uma estimativa semi-quantitativa de moléculas iniciais sobre uma faixa dinâmica de 2 ordens de magnitude, de 1 a 128 moléculas, mesmo quando a leitura de LDR precisa apenas prover uma faixa dinâmixa de 20 vezes, ou faixa Ct de 4-5 (veja as Figuras 33-37 que mostram a Distribuição de Poisson de 1 a 128 moléculas em 8 poços). Já que as diluições são apenas de 10 vezes, pelo menos 2 conjuntos de 8 poços podem ser usados para determinar o número de moléculas originais de múltiplos transcritos diferentes na amostra, mesmo se algumas moléculas de mRNA fossem da ordem de 10 moléculas, enquanto outras eram da ordem de 1 x 106 moléculas.
[568] A mesma abordagem pode ser usada para quantificar a cópia de RNA, porém a transcriptase reversa é adicionada na primeira etapa, e a distribuição especial da mistura da reação inicial pode ser diluição & distribuição como retratado acima.
[569] Quando se usa UniTaq contendo sondas de LDR, elas são do formato que segue: sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniTaqAi seguido por sequência alvo-específica com uma incompatibilidade C:A ou G:T na 3a ou penúltima base, a mutação base na extremidade 3’, seguida por uma Base RNA e 4 mais bases de DNA que são compatíveis com o alvo, e um grupo bloqueador-espaçador C3. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniTaq Bi’ - UniCi’.
[570] Os produtos de LDR podem ser detectados usando iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - Região alvo cromossômica - UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[571] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’ . Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[572] Um dos iniciadores de PCR iniciais (com RNA) ou ambos os iniciadores de PCR iniciais (com DNA) ou sondas de LDR a montante também pode conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. Quando se quantifica a cópia de DNA, RNaseH2 é adicionada com a reação de PCR, e/ou com a reação de LDR. Quando se quantifica o RNA, RNaseH2 é adicionada à reação depois da etapa de transcrição reversa com a reação de PCR, e/ou com a reação de LDR. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado.
[573] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnaturação na LDR deve ser a mais curta possível (por exemplo 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré- incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ do iniciador a jusante pode conter a mesma base que a base 3’ discriminatória no iniciador a montante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[574] Visão geral da abordagem: Esta abordagem depende na fidelidade de duas enzimas: (i) Transcriptase reversa e Taq polymerase para fielmente copier cópias de nível baixo de miRNA na amostra inicial, e (ii) a ligase em sondas discriminatórias hibridizadas adjacentes uma a outra. Quando um evento de ligação acontece, aqueles produtos serão amplificados em uma etapa de amplificação subsequente por PCR em tempo real, e assim esta é a etapa discriminatória chave.
[575] MicroRNA (miRNA) foi identificado como marcadores tecido- específicos potenciais da presença de tumores, a sua classificação e prognóstico. miRNA existe no soro e plasma seja como complexos com proteínas Ago2 ou em encapsulamento como exossomas.
[576] Para proteger contra contaminação por transferência, UNG é adicionado à reação antes da transcrição reversa por MMLV, e a amplificação inicial de PCR é realizada com dUTP. As sondas de LDR são compreendidas das bases naturais, assim o produto de LDR é agora resistente à digestão de UNG na segunda etapa de PCR em tempo real. Observe que os Produtos de LDR contêm marcadores ou sequências de UniTaq em suas extremidades não ligantes, os quais são faltantes no miRNA alvo, sendo assim a transferência acidental dos Produtos de LDR não resulta em amplificação em larga escala. Diferente da PCR, um produto de LDR inicial não é um substrato para uma segunda reação de LDR.
[577] Um grampo-alça específico de miRNA contendo uma região de iniciador reverso universal e uma região específica de miRNA com 6-8 bases é hibridizado na extremidade 3’ do miRNA e estendido com MMLV na presença de dUTP. Sob as condições certas, MMLV adicionará 2-3 nucleotídeos C depois da extremidade 5’ do modelo de miRNA tem uma reação de extensão independente de modelo.
[578] Depois da geração de cDNA inicial, adicionar um iniciador reverso universal e iniciador avançado de terminação universal que se hibridizam aos 2-3 nucleotídeos C adicionais e a partir de 12 a 14 bases específicas do miRNA. Taq polymerase é usada para realizar 16-20 ciclos de amplificação universal; o iniciador reverse universal está localizado para eliminar a maior parte da região de grampo durante a geração de cDNA.
[579] Para resumir os níveis de discriminaçãoda abordagem acima para a detecção de alta sensibilidade de miRNA: 1. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência de reações de transcrição reversa inicial e PCR. 2. Uso da fidelidade da ligação 3’da ligase termoestável na sonda de LDR a montante. 3. Uso de UniTaq ou iniciadores marcadores para amplificar produtos de LDR para a leitura de PCR em tempo real. 4. Uso de UNG para prevenir a contaminação de transferência na reação de PCR em tempo real.
[580] 5.1.a. Incubar miRNA isolado (ou mesmo ácidos nucleicos totais isolados) na presença de UNG (37°C, 15-30 minutos, para prevenir transferência), dUTP, e outras dNTP’s, MMLV transcriptase reversa, AmpliTaq Gold, e iniciadores transcrito-específicos. Esta mistura de reação de cDNA - PCR inicial é adequada para amplificação por PCR de transcrição reversa multiplex em 12, 24, 48 ou 96 poços individuais (multiplexação espacial), ou em um poço único. Depois da extensão dos iniciadores reversos de grampo em seu miRNA cognato para gerar cDNA, inativar UNG e MMLV transcriptase reversa, e ativar AmpliTaq Gold (94°C, 5-10 minutos) e iniciadores marcadores Ti, and Tj por um número limitado de ciclos (94°C, 10 seg., 60°C 30 seg., 72°C 30 seg. por 16-20 ciclos). Depois da amplificação por PCR, Taq polimerase é inativada (em incubação a 99°C por 30 minutos.)
[581] 5.1.b. Adicionar ligase termoestável (preferivelmente a partir da linhagemAK16D), suplemento tampão em condições de ligação otimizadas, e sondas de LDR a montante e a jusante adequadas (10 nM a 20 nM cada, as sondas a jusante podem ser sintetizadas com 5’ fosfato, ou tornadas quinase em massa antes das reações; Sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguido por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniCi’. Realizar 20 ciclos de LDR, (94°C, 10 seg., 60°C 4-5 minutos). Isso permitirá que eventos de ligação ocorram nos produtos de PCR caso o DNA cromossômico esteja presente.
[582] 5.1.c. Abrir tubo/poços, diluir (10 a 100 vezes) e distribuir alíquotas aos poços nas reações de PCR em tempo real, cada poço contendo a mistura principal TaqMan™ adequada com UNG para a prevenção de transferência, e os iniciadores que seguem: UniCi e UniAi, e uma sonda TaqMan™ que cobre a sequência ao longo da junção de ligação. Sob tais condições, as sequências marcadoras nas sondas de LDR seriam UniAi e UniCi respectivamente, e os produtos seriam do formato: UniAi -miRNA a Montante - Junção de miRNA a Jusante - UniCi’
[583] EM uma variação do tema acima, o oligonucleotídeos de grampo está ligado à extremidade 3’ do miRNA de um modo específico para base, anexando uma sequência de alça artificial, que contém um sítio de ligação marcador-iniciador (Tj). Isto permite a extensão para copier a sequência inteira de miRNA, assim como iniciar uma reação de PCR usando iniciadores em ponte de miRNA alvo-específicos (compreendendo de (Ti) e sequência específica de miRNA), e os dois iniciadores marcadores (Ti, Tj). O produto de PCR é agora adequado para a etapa de LDR subsequente conforme descrito acima.
[584] A Figura 92 ilustra a detecção de miRNA, usando transcrição reversa de um iniciador de alça, seguido protocolo de PCR de iniciador e marcador com a prevenção de transferência. O protocolo de detecção subsequente de LDR-q PCR é usado com a prevenção de transferência. Os iniciadores de PCR de miRNA específicos contêm terminações de base 8-11 idênticas como parte dos iniciadores marcadores para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para cada miRNA detectado.
[585] A Figura 93 ilustra uma variação da Figura 92, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar signal para cada miRNA.
[586] A Figura 94 ilustra uma variação da Figura 92, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção de cada miRNA.
[587] A Figura 95 ilustra a detecção de miRNA, usando ligação de um iniciador de alça diretamente no miRNA, seguida de transcrição reversa usando um iniciador marcador complementar à alça com a prevenção de transferência. O procedimento usa um iniciador marcador e um iniciador em ponte para a detecção de PCR em PCR- LDR-q, com a prevenção de transferência. Os iniciadores de PCR específicos de miRNA contêm terminações de base 8-11 idênticas como parte dos iniciadores marcadores para prevenir dímeros de iniciador. Os produtos são detectados usando sondas TaqMan™ projetadas ao longo da sequência da junção de ligação para cada miRNA detectado.
[588] A Figura 96 ilustra uma variação da Figura 95, onde os iniciadores de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal para cada miRNA.
[589] A Figura 97 ilustra uma variação da Figura 95, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção de cada miRNA.
[590] A Figura 98 ilustra uma variação da Figura 95, onde o iniciador de PCR em ponte contém uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. RNaseH2 é adicionada à reação depois da etapa de transcrição reversa para desbloquear o iniciador de PCR. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado.
[591] A Figura 99 ilustra uma variação da Figura 98, onde as sondas de LDR a montante e a jusante contêm marcadores UniTaq Ai e UniTaq Bi’-UniTaq Ci’ respectivamente, e os produtos são detectados usando iniciador UniTaq fluorescentemente marcado F1- UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai para detectar sinal para cada miRNA.
[592] A Figura 100 ilustra uma variação da Figura 98, onde os produtos de PCR são distribuídos (multiplexação espacial), e são capturados em um suporte sólido. As sondas de LDR são designadas para conter sequências curtas complementares que apenas se hibridizam uma na outra quando ligadas juntas, gerando sinal FRET adequado para a detecção de cada miRNA.
[593] Quando se usa UniTaq contendo sondas de LDR, elas são do formato que segue: sondas a montante compreendem um marcador 5’, tal como UniTaqAi seguido por sequência alvo-específica. As sondas a jusante compreendem uma extremidade 5’ fosforilada, seguida por sequência alvo-específica, e um marcador 3’, tal como UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’.
[594] Os produtos de LDR podem ser detectados usando iniciadores específicos de UniTaq do formato UniTaq Ci e F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai. (onde F1 é um corante fluorescente que é suprimido pelo supressor Q). Sob estas condições, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai - miRNA a Montante - Junção de miRNA a Jusante - UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[595] Este construto formará um grampo, de tal forma que a sequência UniTaq Bi se emparelhe com a sequência UniTaq Bi’. Quando o iniciador Ci UniTaq se liga à sequência UniTaq Ci’, a atividade da exonuclease 5’->3’ da polimerase digere a sequência UniTaq Bi, liberando o corante fluorescente F1.
[596] Para os produtos usando três Sondas de LDR para detector transcritos com junções desconhecidas, o produto que segue formará: F1-UniTaq Bi - Q - UniTaq Ai -Exon a Montante- Sequência em Ponte- Exon a Jusante- UniTaq Bi’ - UniTaq Ci’
[597] Um dos iniciadores de PCR iniciais ou sondas de LDR a montante também pode conter uma Base RNA, 4 bases adicionais e um grupo bloqueador na extremidade 3’. RNaseH2 é adicionada à reação depois da etapa de transcrição reversa para a PCR, e/ou durante a reação de LDR. Isto assegura que nenhum produto independente de modelo seja formado.
[598] As sondas de LDR a jusante também podem ser fosforiladas durante a reação de ligação usando quinase de fago termofílico (derivada do bacteriófago RM378 que infecta Rhodothermus marinus). Sob estas condições, a etapa de desnaturação na LDR deve ser a mais curta possível (por exemplo, 94°C ou ainda menor por 1 segundo), já que a quinase termofílica não é totalmente termoestável - ou apenas pré-incubar a 65°C por 15 minutos para alcançar fosforilação do iniciador total. Alternativamente, a lateral 5’ da sonda a jusante pode conter a mesma base que a base 3’ discriminatória na sonda a jusante, a referida base removida pela atividade da nuclease 5’ a 3’ de Fen nuclease ou Taq polimerase para liberar um fosfato 5’ adequado para uma ligação subsequente.
[599] As linhagens de célula usadas foram: linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon HT-29, que carrega a mutação heterozigótica de BRAF V600E (1799>A); HEC-2 (A) linhagem de célula de adenocarcinoma do endométrio, que carrega a mutação heterozigótica de R248Q (743G>A) TP53 e a mutação heterozigótica de G12D (35G>A) KRAS; linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon LS123, que carrega a mutação heterozigótica de G12S (34G>A) KRAS; linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon SW1463, que carrega a mutação homozigótica de G12C (34G>T) KRAS; linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon SW480, que carrega a mutação homozigótica de G12V (35G>T) KRAS; e linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon SW1116, que carrega a mutação heterozigótica de G12A (35G>C) KRAS. Todas as linhagens de célula foram semeadas em placas de cultura de 60 cm2 em meio 5a da McCoy contendo 4,5 g/l de glicose, suplementado com soro bovino fetal 10% e mantido em uma atmosfera umidificada contendo CO2 5%. Uma vez as células tendo atingido 89-90% de confluência, elas foram lavadas em Solução Salina Tamponada com Fosfato (x 3) e coletadas através de centrifugação (500 x g). DNA foi isolado usando o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen; Valência, CA). Concentração de DNA foi determinada com Quant-iT Picogreen Assay Life Technologies/ThermoFisher; Waltham, Ma). DNA Genômico Humano (0,2 mg/ml) contendo DNA genômico de peso molecular alto (> 50 kb) isolado de sangue humano (camada leucoplaquetárias) (hgDNA Roche) foi comprado da Roche (Indianápolis, IN). Sua concentração precisa foi determinada ser 39 ng/μl através do Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit.
[600] Plasma humano (com K2 EDTA como um anticoagulante) de doadores sem câncer, 21-61 anos de idade, foi comprado da BioreclamationIVT (Nassau, NY). DNA foi isolado de amostras de plasma individuais (5 mL) usando o QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit de acordo com as instruções do fabricante e quantificado com Quant-iT Picogreen Assay Life Technologies/ThermoFisher; Waltham, Ma).
[601] Todos os iniciadores usados são listados na Tabela 1. Todos os iniciadores foram comprados da Integrated DNA Technologies Inc. (IDT, Coralville, IA), exceto o iniciador iCDx-315-BRAF_FLW, que foi comprado da Exiqon Inc. (Woburn, MA).Tabela 1. Iniciadores para detecção por PCR-LDR-qPCR de mutação de BRAF V600E /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.
[602] Experimentos de diluição. A etapa de PCR foi realizada em um reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,58 μl de água livre de nuclease (IDT), 2 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 0,8 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 0,2 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 0,25 μl de iniciador avançado iCDx-328- Braf_PF_WT_blk2 a 2 μM, 0,25 μl de iniciador reverso iCDx-284-Br600- PR a 2 μM, 1,25 μl de iniciador de bloqueio de LNA iCDx-284-Br600-PR a 2 μM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 0,2 μl de Antarctica thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 0,22 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturada com Platinum Taq Antibody (Invitrogen/ThermoFisher Waltham, Ma) (a mistura é preparada adicionando 0,02 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 0,2 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para o NTC - Controle Não Modelo -, hgDNA Roche a 11,7 ng/μl (então, 35 ng ou 10000 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e WcDNA HT-29 misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,047 ng/μl de wcDNA HT-29 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,14 ng de wcDNA HT-29 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 40 GE de HT-29 (apenas 20 GE são mutados) e 10000 GE de DNA genômico da Roche (isto é 1 mutante (mt) em 500 tipo selvagem (wt)); 2) 0,023 ng/μl de wcDNA HT-29 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA HT-29 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de HT-29 (apenas 10 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche; (isto é 1 mt em 1000 wt) 3) 0,0117 ng/μl de wcDNA HT-29 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA HT-29 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE de HT-29 (apenas 5 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 2000 wt); 4) 0,006 ng/μl de wcDNA HT-29 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,00175 ng de wcDNA HT-29 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 5 GE de HT-29 (apenas 2 ou 3 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 5000 wt). Nota: após preparação do 0,047 ng/μl de wcDNA HT-29 em 11,7 ng/μl de mistura de hgDNA Roche (40 GE de mutante em 10000 GE de hgDNA Roche), resto de mutante mais misturas de hgDNA Roche são preparados através de diluições em série misturando 0,5 volume da mistura de mutante anterior-hgDNA Roche mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 11,7 ng/μl, então os GE mutantes são diluídos ^ enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (10000 GE). Reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 40 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C.
[603] A etapa de LDR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 5,82 μl de água livre de nuclease (IDT), 1 μl de tampão de reação de ligase 10X AK16D [tampão 1X contém Tris-HCl 20 mM pH 8,5 (Bio-Rad, Hercules, CA), MgCl2 5 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), KCl 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), DTT 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e 20 ug/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)], 0,25 μl de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de NAD+ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl, 0,2 μl de iniciador a montante iCDx-308-Br600_(3)-L_Up_Rm a 500 nM, 0,2 μl de iniciador a jusante iCDx-276-Br600-L_Dn_P a 500 nM, 0,028 μl de AK16D ligase purificada a 8,8 μM e 2 μl de reação de PCR. Reações de LDR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de Sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 20 ciclos de (10 seg a 94°C e 4 min a 60°C) seguido por uma retenção final em 4°C.
[604] A etapa de qPCR foi realizada em uma reação de 10 μl através da adição de: 1,5 μl de água livre de nuclease (IDT), 5 μl de 2X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (amplitaq rápida, UDG e dUTP) da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), 1 μl de iniciador avançado iCDx-277_A4 a 2,5 μM, 1 μl de iniciador reverso iCDx-279_C4 a 2,5 μM, 0,5 μl de sonda Tampam iCDx-281-Br600_(3)_Probe a 5 μM e 1 μl de reação de LDR. Reações de qPCR foram realizadas em um termociclizador em tempo real ViiA7 da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando placas Fast-96-Well Reaction de 0,1 ml MicroAmp® vedadas com película adesiva MicroAmp® Optical da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma, e o ajuste que segue: bloqueio rápido, Curva padrão como tipo de experimento, ROX como referência passiva, Ct como método de quantificação (limiar automático, mas ajustado para 0,04 quando necessário), TAMRA como repórter e NFQ-MGB como supressor; usando o programa que segue: 2 min a 50°C e 40 ciclos de (1 seg a 95°C e 20 seg a 60°C). Os resultados são mostrados na Figura 159 e Tabela 2.Tabela 2. Resultados de experimentos de diluição para detectar BRAF V600E.Mt = BRAF V600E mutante. WT = BRAF tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[605] Experimentos de pixel usando hgDNA da Roche. A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 56,54 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-328-Braf_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-284-Br600-PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio de LNA iCDx-284-Br600-PR a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para o NTC - Controle Não Modelo -, hgDNA Roche a 2,925 ng/μl (então, 8,75 ng de hgDNA Roche ou 2500 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e WcDNA HT-29 misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,023 ng/μl de wcDNA HT-29 em 2,925 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA HT-29 e 8,75 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de HT-29 (apenas 10 GE são mutados) e 2500 GE de hgDNA Roche; 2) 0,0117 ng/μl de wcDNA HT-29 em 2,925 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA HT-29 e 8,75 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE de HT-29 (apenas 5 GE são mutados) e 2500 GE de hgDNA Roche. Nota: o 0,0117 ng/μl de wcDNA HT-29 em 2,925 ng/μl de mistura de hgDNA Roche é preparado através de mistura de diluição em série de 0,5 volume do 0,023 ng/μl de wcDNA HT-29 em 2,925 ng/μl de mistura de hgDNA Roche (20 GE de mutante, 10 GE mutados, em 2500 GE de hgDNA Roche) mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 2,925 ng/μl, então o mutante é diluído para 10 GE (5 GE mutado) enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (2500 GE).
[606] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada um, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 40 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4° C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição. Os resultados são mostrados na Figura 160 e Tabela 3. Tabela 3. Resultados de experimentos de pixel para detectar BRAF V600E diluído em hgDNA Roche.Mt = BRAF V600E mutante. wt = BRAF tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[607] Experimentos de pixel usando DNA de plasma humano (plasma No. 8). A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 46,54 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-328- Braf_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-284-Br600- PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio de LNA iCDx-284-Br600- PR a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 13 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para NTC - Controle Não modelo -, DNA de plasma (preparado como com 6,9 μl de H2O livre de nuclease mais 6,1 μl de DNA de plasma a 0,714 ng/μl, então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) na reação de PCR) - tipo selvagem-, e WcDNA HT-29 misturado com DNA de plasma como segue: 1) 4,9 μl de H2O livre de nuclease, mais 6,1 μl de DNA de plasma a 0,714 ng/μl, mais 2 μl de 0,035 ng/μl de wcDNA HT-29, então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,07 ng de wcDNA HT-29 que corresponde a 20 GE de HT-29 (apenas 10 GE são mutados) na reação de PCR; 2) 5,9 μl de H2O livre de nuclease, mais 6,1 μl de DNA de plasma a 0,714 ng/μl, mais 1 μl de 0,035 ng/μl de wcDNA HT-29, então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA HT-29 que corresponde a 10 GE de HT-29 (apenas 5 GE são mutados) na reação de PCR. Nota: a mistura com 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA (10 GE de mutante, 5 mutados) é preparada através de mistura em diluição em série de 0,5 volume da mistura anterior com 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) e 0,07 ng de wcDNA (20 GE de mutante, 10 mutados com 0,5 volume de 4,375 ng de mistura de DNA de plasma.
[608] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 40 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4° C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição. Os resultados são mostrados na Figura 161 e Tabela 4. Tabela 4. Resultados de experimentos de pixel para detectar BRAF V600E diluído em DNA de plasma humano.Mt = BRAF V600E mutante. wt = BRAF tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[609] Todos os iniciadores usados são listados na Tabela 5. Todos os iniciadores foram comprados da Integrated DNA Technologies Inc. ((IDT), Coralville, IA), excetos os iniciadores de PNA, que foram comprados da PNABio Inc. (Thousand Oaks, CA). Tabela 5. Iniciadores para detecção por PCR-LDR-qPCR de mutação de TP53 R248QPNA = Ácido nucleico de peptídeo, /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante fluorescente 5' Fam, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina
[610] Experimentos de diluição. A etapa de PCR foi realizada em um reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,58 μl de água livre de nuclease (IDT), 2 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 0,8 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 0,2 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 0,25 μl de iniciador avançado iCDx-326-p53- 248_PF_WT_blk2 a 2 μM, 0,25 μl de iniciador reverso iCDx-248-p53- 248_PR a 2 μM, 1,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA-p53-248- 10 (ou PNA-p53-248-11L nos últimos experimentos) a 2 μM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 0,2 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 0,22 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturada com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,02 μl de polimerase Klentaq1 (estoque a 50 U/μl) a 0,2 μl de Platinum Taq Antibody (estoque a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para o NTC - Controle Não Modelo -, hgDNA Roche a 11,7 ng/μl (então, 35 ng ou 10000 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e wcDNA HEC-1(A) misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,047 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,14 ng de wcDNA HEC-1(A) e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 40 GE de HEC-1(A) (apenas 20 GE são mutados) e 10000 GE de DNA genômico da Roche (isto é 1 mt em 500 wt); 2) 0,023 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA HEC-1(A) e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de HEC-1(A) (apenas 10 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche; (isto é 1 mt em 1000 wt); 3) 0,0117 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA HEC-1(A) e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE de HEC- 1(A) (apenas 5 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 2000 wt); 4) 0,006 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,00175 ng de wcDNA HEC-1(A) e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 5 GE de HEC-1(A) (apenas 2 ou 3 GE são mutados) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 5000 wt). Nota: após preparação do 0,047 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 11,7 ng/μl de mistura de hgDNA Roche (40 GE de mutante em 10000 GE de hgDNA Roche), resto de mutante mais misturas de hgDNA Roche são preparados através de mistura em diluições em série de 0,5 volume de mutante precedente-mistura de hgDNA Roche mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 11,7 ng/μl, então os GE mutantes são diluídos ^ enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (10000 GE). Reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 35 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C.
[611] A etapa de LDR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 5,82 μl de água livre de nuclease (IDT), 1 μl de tampão de reação de ligase 10X AK16D [tampão 1X contém Tris-HCl 20 mM pH 8,5 (Bio-Rad, Hercules, CA), MgCl2 5 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), KCl 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), DTT 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e 20 ug/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)], 0,25 μl de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de NAD+ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl, 0,2 μl de iniciador a montante iCDx-305-P53-248(3)-L_Up_Rm a 500 nM, 0,2 μl de iniciador a jusante iCDx-202-P53-248-L_Dn_P, 0,028 μl de AK16D ligase purificada a 8,8 μM e 2 μl de reação de PCR. Reações de LDR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de Sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 20 ciclos de (10 seg a 94°C e 4 min a 60°C) seguido por uma retenção final em 4°C.
[612] A etapa de qPCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,5 μl de água livre de nuclease (IDT), 5 μl de 2X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (amplitaq rápida, UDG e dUTP) da Applied Biosystems (AppliedBiosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), 1 μl de iniciador avançado iCDx-82_GTT-GCGC_A2 a 2,5 μM, 1 μl de iniciador reverso iCDx-244- C2 a 2,5 μM, 0,5 μl de sonda Taqman iCDx-228-p53-248_Probe_s a 5 μM e 1 μl de reação de LDR. Reações de qPCR foram realizadas em um termociclizador em tempo real ViiA7 da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando placas Fast-96-Well Reaction de 0,1 MicroAmp® ml vedadas com Película adesiva óptica MicroAmp® da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma, e o ajuste que segue: bloqueio rápido, Curva padrão como tipo de experimento, ROX como referência passiva, Ct como método de quantificação (limiar automático, mas ajustado para 0,04 quando necessário), FAM como repórter e NFQ-MGB como supressor; usando o programa que segue: 2 min a 50° C e 40 ciclos de (1 seg a 95°C e 20 seg a 60°C). Os resultados para o experimento usando iniciador de bloqueio PNA-p53-248-10 na etapa de PCR são mostrados na Figura 162 e Tabela 6, e os resultados para o experimento usando iniciador de bloqueio PNA-p53-248-11L na etapa de PCR são mostrados na Figura 163 e Tabela 7.Tabela 6. Resultados de experimentos de diluição para detectar TP53 R248Q usando PNA-p53-248-10 como iniciador de bloqueio na etapa de PCR. Mt = TP53 R248Q mutante. WT = TP53 tipo se vagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36). Tabela 7. Resultados de experimentos de diluição para detectar TP53 R248Q usando PNA-p53-248-11L como iniciador de bloqueio na etapa de PCR
Mt = TP53 R248Q mutante. WT = TP53 tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[613] Experimentos de pixel usando hgDNA da Roche. A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 56,54 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-326-p53-248_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-248-p53-248_PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA-p53-248-10 a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Bio-labs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl), e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos são: água livre de nuclease para NTC - Controle Não modelo -, hgDNA Roche a 2,925 ng/μl (então, 8,75 ng de hgDNA Roche ou 2500 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e wcDNA HEC-1(A) misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,023 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 2,925 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA HEC-1(A) e 8,75 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de HEC- 1(A) (apenas 10 GE são mutados) e 2500 GE de hgDNA Roche; 2) 0,0117 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 2,925 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA HEC-1(A) e 8,75 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE de HEC-1(A) (apenas 5 GE são mutados) e 2500 GE de hgDNA Roche. Nota: o 0,0117 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 2,925 ng/μl de mistura de hgDNA Roche é preparado através de mistura de diluição em série de 0,5 volume do 0,023 ng/μl de wcDNA HEC-1(A) em 2,925 ng/μl de mistura de hgDNA Roche (20 GE de mutante, 10 GE mutados, em 2500 GE de hgDNA Roche) mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 2,925 ng/μl, então o mutante é diluído para 10 GE (5 GE mutados) enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (2500 GE).
[614] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 35 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4° C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição. Os resultados são mostrados na Figura 164 e Tabela 8. Tabela 8. Resultados de experimentos de pixel para detectar TP53 R248Q diluído em hgDNA Roche. Mt = TP53 R248Q mutante. WT = TP53 tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[615] Experimentos de pixel usando DNA de plasma humano (plasma No. 10). A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 46,54 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-326-p53- 248_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-248-p53- 248_PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA-p53- 248-10 a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 13 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para NTC - Controle Não modelo -, DNA de plasma (preparado como 7,6 μl de H2O livre de nuclease mais 5,4 μl de DNA de plasma a 0,811 ng/μl, então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) na reação de PCR) - tipo selvagem -; e wcDNA HEC-1(A) misturado com DNA de plasma como segue: 1) 5,6 μl de H2O livre de nuclease, mais 5,4 μl de DNA de plasma a 0,811 ng/μl, mais 2 μl de 0,035 ng/μl de wcDNA HEC-1(A), então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,07 ng de wcDNA HEC-1(A) que corresponde a 20 GE de HEC-1(A) (apenas 10 GE são mutados) na reação de PCR; 2) 6,6 μl de H2O livre de nuclease, mais 5,4 μl de DNA de plasma a 0,811 ng/μl, mais 1 μl de 0,035 ng/μl de wcDNA HEC- 1(A), então 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 de Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA HEC-1(A) que corresponde a 10 GE HEC-1(A) (apenas 5 GE são mutados) na reação de PCR. Nota: a mistura com 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA (10 GE de mutante, 5 mutados) é preparada através de mistura em diluição serial de 0,5 volume da mistura anterior com 4,375 ng de DNA de plasma ou 1250 Equivalentes de Genoma (GE) e 0,07 ng de wcDNA (20 GE de mutante, 10 mutados) com 0,5 volume do 4,375 ng de mistura de DNA de plasma.
[616] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 35 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4° C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição. Os resultados são mostrados na Figura 165 e Tabela 9. Tabela 9. Resultados de experimentos de pixel para detectar TP53 R248Q diluído em DNA de plasma humano.Mt = TP53 R248Q mutante. WT = TP53 tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[617] Todos iniciadores usados são listados na Tabela 10. Todos os iniciadores foram comprados da Integrated DNA Technologies Inc. ((IDT), Coralville, IA), exceto o iniciador de PNA, que foi comprado da PNABio Inc. (Thousand Oaks, CA).Tabela 10. Iniciadores para detecção por PCR-LDR-qPCR de mutações de G12C e G12S de KRASPNA = Ácido nucleico de peptídeo, /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante fluorescente 5' Fam, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina
[618] Experimentos de diluição: A etapa de PCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,58 μl água livre de nuclease (IDT), 2 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 0,8 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 0,2 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 0,25 μl de iniciador avançado iCDx-327- Kr_12_2_PF_WT_blk2 a 2μM, 0,25 μl de iniciador reverso iCDx-303-Kr- 12_1&2_PR a 2 μM, 1,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11L (ou PNA-Kras 12_2-11R) a 2 μM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 0,2 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 0,22 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturado com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,02 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 0,2 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos foram: água livre de nuclease para o NTC - Controle Não Modelo -, hgDNA Roche a 11,7 ng/μl (então, 35 ng ou 10000 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e wcDNA SW1463 (G12C, 34G>T, homozigótico) ou LS123 (G12S, 34G>A, heterozigótico) misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,047 ng/μl de wcDNA SW1463 ou LS123 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,14 ng de wcDNA SW1463 ou LS123 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 40 GE de wcDNA SW1463 ou LS123 (40 GE são mutados para SW1463 e 20 GE são mutados para LS123) e 10000 GE de DNA genômico humano Roche (isto é 1 mt em 250 wt para SW1463 e 1 mt em 500 wt para LS123); 2) 0,023 ng/μl de wcDNA SW1463 ou LS123 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA SW1463 ou LS123 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de wcDNA SW1463 ou LS123 (20 GE são mutados para SW1463 e 10 GE são mutados para LS123) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 500 wt para SW1463 e 1 mt em 1000 para LS123); 3) 0,0117 ng/μl de wcDNA SW1463 ou LS123 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA SW1463 ou LS123 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE wcDNA de SW1463 ou LS123 (10 GE são mutados para SW1463 e 5 GE são mutados para LS123) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 1000 wt para SW1463 e 1 mt em 2000 wt para LS123); 4) 0,006 ng/μl de wcDNA SW1463 ou LS123 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,00175 ng de wcDNA SW1463 ou LS123 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 5 GE de wcDNA SW1463 ou LS123 (5 GE são mutados para SW1463 e 2 ou 3 GE são mutados para LS123) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 2000 wt para SW1463 e 1 mt em 5000 wt para LS123). Nota: após preparação do 0,047 ng/μl de wcDNA SW1463 ou LS123 em 11,7 ng/μl de mistura de hgDNA Roche (40 GE de mutante em 10000 GE de hgDNA Roche), resto de mutante mais misturas de hgDNA Roche são preparados através de mistura em diluições em série de 0,5 volume do mutante anterior-mistura de hgDNA Roche mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 11,7 ng/μl, então os GE mutantes são diluídos 54 enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (10000 GE). Reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de Sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 50 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C.
[619] A etapa de LDR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 5,82 μl de água livre de nuclease (IDT), 1 μl de tampão de reação de ligase 10X AK16D [1X tampão contém Tris- HCl a 20 mM pH 8,5 (Bio-Rad, Hercules, CA), MgCl2 5 mM (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), KCl 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), DTT 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e 20 ug/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)], 0,25 μl de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de NAD+ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl, 0,2 μl de iniciador a montante iCDx-393-Kr- 12_1(3)-L_Up_Rm a 500 nM, 0,2 μl de iniciador a jusante iCDx-222-Kr- 12_1-L_Dn_P a 500 nM, 0,028 μl de AK16D ligase purificada a 8,8μM e 2 μl de reação de PCR. As reações de LDR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex PCR da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e seguindo o programa que segue: 20 ciclos de (10 seg a 94°C e 4 min a 60°C) seguido por uma retenção final a 4°C.
[620] A etapa de qPCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,5 μl de água livre de nuclease (IDT), 5 μl de 2X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (amplitaq rápida, UDG e dUTP) da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), 1 μl de iniciador avançado iCDx-245_A3 a 2,5μM, 1 μl de iniciador reverso iCDx-246-C3 a 2,5 μM, 0,5 μl de sonda Taqman iCDx-259-T-Kr-12_1_Probe a 5 μM e 1 μl de reação de LDR. Reações de qPCR foram realizadas em um termociclizador em tempo real ViiA7 da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando placas Fast-96-Well Reaction de 0,1 ml da MicroAmp® vedadas com Película adesiva óptica MicroAmp® da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma, e o ajuste que segue: bloqueio rápido, curva padrão como tipo de experimento, ROX como referência passiva, Ct como método de quantificação (limiar automático, mas ajustado para 0,04 quando necessário), HEX como repórter e NFQ-MGB como supressor; e usando o programa que segue: 2 min a 50° C e 40 ciclos de (1 seg a 95° C e 20 seg a 60° C). Os resultados do experimento usando iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11L na etapa de PCR são mostrados na Figura 166 e Tabela 11. Resultados do experimento usando iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11R na etapa de PCR são mostrados na Figura 167 e Tabela 12.Tabela 11. Resultados de experimentos de diluição para detectar mutação de KRAS G12C (34G>T) usando iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11L na etapa de PCR.Mt = KRAS G12C mutante. WT = KRAS tipo selvagem. Hom = homozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36). Tabela 12. Resultados de experimentos de diluição para detectar uma mutação de KRAS G12S (34G>A) usando iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11R na etapa de PCR.Mt = KRAS G12C mul tante. WT = KRAS tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[621] Experimentos de pixel usando DNA de plasma humano (plasma No. 9). A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 46,54 μl água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-303-Kr-12_1&2_PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA-Kras 12_2-11L a 2μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada através da adição de 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 13 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para NTC - Controle Não Modelo -; DNA de Plasma (preparado como 8,3 μl de H2O livre de nuclease mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) na reação de PCR) - tipo selvagem -; e wcDNA SW1463 misturado com DNA de plasma como segue: 1) 6,3 μl de H2O livre de nuclease mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, mais 2 μl de 0,0175 ng/μl de wcDNA SW1463, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA SW1463 que corresponde a 10 GE de SW1463 (todos 10 GE são mutados) na reação de PCR; 2) 7,3 μl de H2O livre de nuclease, mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, mais 1 μl de 0,0175 ng/μl de wcDNA SW1463, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 de Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,0175 ng de wcDNA SW1463 que corresponde a 5 GE de SW1463 (todos os 5 GE são mutados) na reação de PCR. Nota: a mistura com 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 de Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,0175 ng de wcDNA (5 GE de mutante, 5 mutados) é preparada através de mistura com diluição em série de 0,5 volume da mistura anterior com 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) e 0,035 ng de wcDNA (10 GE de mutante, 10 mutados) com 0,5 volume do 3,5 ng de mistura de DNA de plasma.
[622] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 50 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição. Os resultados são mostrados na Figura 168 e Tabela 13. Tabela 13. Resultados de experimentos de pixel para detectar KRAS G12C diluído em DNA de plasma humano.Mt = KRAS G12 mutante. WT = KRAS tipo selvagem. Hom = Homozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[623] Todos os iniciadores são listados na Tabela 14. Todos os iniciadores foram comprados da Integrated DNA Technologies Inc. ((IDT), Coralville, IA), exceto o iniciador de PNA, que foi comprado da PNABio Inc. (Thousand Oaks, CA).Tabela 14. Iniciadores para detecção por PCR-LDR-qPCR de mutações de KRAS G12D, G12A e G12VPNA = Ácido nucleico de peptídeo, /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante fluorescente 5' Fam, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina
[624] Experimentos de diluição. A etapa de PCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,58 μl água livre de nuclease (IDT), 2 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 0,8 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 0,2 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 0,25 μl de iniciador avançado iCDx-327- Kr_12_2_PF_WT_blk2 a 2 μM, 0,25 μl de iniciador reverso iCDx-303- Kr-12_1&2_PR a 2 μM, 1,25 μl de iniciador de bloqueio de PNA PNA- Kras 12_2-11L a 2 μM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 0,2 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 0,22 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,02 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 0,2 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para o NTC - Controle Não Modelo -, hgDNA Roche a 11,7 ng/μl (então, 35 ng ou 10000 Equivalentes de Genoma (GE) em 3 μl) - tipo selvagem -, e wcDNA HEC-1(A) (G12D, 35G>A, heterozigótico) ou SW1116 (G12A, 35G>C, heterozigótico) ou SW480 (G12V, 35G>T, homozigótico) misturado com hgDNA Roche como segue: 1) 0,047 ng/μl de HEC-1(A), SW1116 ou wcDNA SW480 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,14 ng de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 40 GE de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 (20 GE são mutados para HEC-1(A) ou SW1116 e 40 GE são mutados para SW480) e 10000 GE de DNA genômico humano Roche (isto é 1 mt em 500 wt para HEC-1(A) ou SW1116 e 1 mt em 250 para SW480; 2) 0,023 ng/μl de wcDNA de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,07 ng de wcDNA HEC-1(A), SW1116 ou SW480 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 20 GE de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 (10 GE são mutados para HEC-1(A) ou SW1116 e 20 GE são mutados para SW480) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 1000 wt para HEC-1(A) ou SW1116 e 1 mt em 500 wt para SW480); 3) 0,0117 ng/μl de wcDNA de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,0035 ng de wcDNA de HEC- 1(A), SW1116 ou SW480 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 10 GE de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 (5 GE são mutados para HEC-1(A) ou SW1116 e 10 GE são mutados para SW480) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 2000 para HEC-1(A) ou SW1116 e 1 mt em 1000 para SW480); 4) 0,006 ng/μl de wcDNA de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 em 11,7 ng/μl de hgDNA Roche, então 0,00175 ng de wcDNA de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 e 35 ng de hgDNA Roche em 3 μl, que corresponde a 5 GE de HEC-1(A), SW1116 ou SW480 (2 ou 3 GE são mutados para HEC-1(A) ou SW1116, e 5 GE são mutados para SW480) e 10000 GE de hgDNA Roche (isto é 1 mt em 5000 wt para HEC-1(A) ou SW1116 e 1 mt em 2000 wt para SW480). Nota: após preparação do 0,047 ng/μl de wcDNA de HEC-1(A), SW116 ou SW480 em 11,7 ng/μl de mistura hgDNA Roche (40 GE de mutante em 10000 GE de hgDNA Roche), resto de mutante mais misturas de hgDNA Roche são preparados através de mistura em diluições em série de 0,5 volume do mutante anterior-mistura de hgDNA Roche mais 0,5 volume de hgDNA Roche a 11,7 ng/μl, então os GE mutantes são diluídos ^ enquanto GE de hgDNA Roche permanece não diluído (10000 GE). Reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de Sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 50 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C.
[625] A etapa de LDR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 5,82 μl de água livre de nuclease (IDT), 1 μl de tampão de reação de ligase 10X AK16D [1X tampão contém Tris- HCl 20 mM pH 8,5 (Bio-Rad, Hercules, CA), MgCl2 5 mM (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), KCl 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), DTT 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e 20 ug/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)], 0,25 μl de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de NAD+ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl, 0,2 μl de iniciador a montante iCDx-307-Kr- 12_2(3)-L_Up_Rm ou iCDx-394-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm a 500 nM, 0,2 μl de iniciador a jusante iCDx-269-Kr-12_2-L_Dn_P a 500 nM, 0,028 μl de AK16D ligase purificada a 8,8 μM e 2 μl de reação de PCR. Reações de LDR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bristol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex PCR da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma e seguindo o programa que segue: 20 ciclos de (10 seg a 94°C e 4 min a 60°C) seguido por uma retenção final a 4°C.
[626] A etapa de qPCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 1,5 μl de água livre de nuclease (IDT), 5 μl de 2X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (amplitaq rápida, UDG e dUTP) da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), 1 μl de iniciador avançado iCDx-245_A3 a 2,5μM, 1 μl de iniciador reverso iCDx-246-C3 a 2,5 μM, 0,5 μl de sonda Taqman iCDx-270-Kr-12_2(3)_Probe a 5 μM e 1 μl de reação de LDR. Reações de qPCR foram realizadas em um termociclizador em tempo real ViiA7 da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando placas Fast-96-Well Reaction de 0,1 ml MicroAmp® vedadas com Película adesiva óptica MicroAmp® da Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma, e o ajuste que segue: bloqueio rápido, curva padrão como tipo de experimento, ROX como referência passiva, Ct como método de quantificação (limiar automático, mas ajustado para 0,04 quando necessário), HEX como repórter e NFQ-MGB como supressor; e usando o programa que segue: 2 min a 50° C e 40 ciclos de (1 seg a 95° C e 20 seg a 60° C). Os resultados do experimento para detectar mutação de KRAS G12D (35G>A) usando iniciador de LDR a montante iCDx-307- Kr-12_2(3)-L up Rm são mostrados na Figura 169 e Tabela 15. Os resultados do experimento para detectar mutações de KRAS G12A (G>C) usando iniciador de LDR a montane iCDx-307-Kr-12_2(3)-L up Rm são mostrados na Figura 170 e Tabela 16. Os resultados do experimento para mutação de KRAS G12V (35G>T) usando iniciador de LDR a montante iCDx-307-Kr-12_2(3)-L up Rm são mostrados na Figura 171 e Tabela 17.Tabela 15. Resultados de experimentos de diluição para detectar mutação de KRAS G12D (35G>A) usando iniciador de LDR a montante iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm
Mt = KRAS G12C mutante. WT = KRAS tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36). Tabela 16. Resultados de experimentos de diluição para detectar mutação de KRAS G12 (35G>C) usando iniciador de LDR a montante iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_RmMt = KRAS G12C mutante. WT = KRAS tipo selvagem. Het = heterozigoto. UD = Não determinado. Valores de Ct em negrito correspondem a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondem a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).Tabela 17. Resultados de experimentos de diluição para detectar mutação de KRAS G12V (35G>T) usando iniciador de LDR a montante iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm
[627] Experimentos de pixel usando DNA de plasma humano (plasma No. 9). A etapa de PCR foi realizada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 46,54 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2 a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-303- Kr-12_1&2_PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio PNA-Kras 12_2-11L a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada adicionando 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 13 μl de modelo correspondente. Os modelos eram: água livre de nuclease para NTC - Controle Não modelo -, DNA de plasma (preparado como 8,3 μl de H2O livre de nuclease mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 10050 Equivalentes de Genoma (GE) na reação de PCR) - tipo selvagem -; e wcDNA SW480 misturado com DNA de plasma como segue: 1) 6,3 μl de H2O livre de nuclease, mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, mais 2 μl de 0,0175 ng/μl de wcDNA SW480, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,035 ng de wcDNA SW480 que corresponde a 10 GE de SW480 wcDNA (todos os 10 GE são mutados) na reação de PCR; 2) 7,3 μl de H2O livre de nuclease, mais 4,7 μl de DNA de plasma a 0,743 ng/μl, mais 1 μl de 0,0175 ng/μl de wcDNA SW480, então 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,0175 ng de wcDNA SW480 que corresponde a 5 GE de SW480 (todos os 5 GE são mutados) na reação de PCR. Nota: a mistura com 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) mais 0,0175 ng de wcDNA SWE480 (10 GE de mutante, 5 mutados) preparada através de mistura em diluição em série de 0,5 volume da mistura anterior com 3,5 ng de DNA de plasma ou 1000 Equivalentes de Genoma (GE) e 0,035 ng de wcDNA SW480 (10 GE de mutante, 10 mutados) com 0,5 volume do 3,5 ng de mistura de DNA de plasma.
[628] Cada 130 μl de mistura de PCR foi dividido em 12 tubos, 10 μl cada um, e então as reações de PCR foram realizadas em placas de PCR de 96 Poços Transparentes de 0,2 ml BioExcell (Worldwide Medical Products, Inc., Bris-tol, PA) vedadas com película adesiva transparente MicroAmp® da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando um termociclizador de sistema de PCR ProFlex da Applied Biosys-tems/ThermoFisher; Waltham, Ma e o programa que segue: 30 min a 37°C, 2 min a 95°C, 50 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final em 4°C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como descrito acima, na seção Experimentos de diluição usando iCDx-394-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm como iniciador a montante. Os resultados são mostrados na Figura 172 e Tabela 18. Tabela 18. Resultados de experimentos de pixel para detectar KRAS G12V diluído em DNA de plasma humano.Mt = KRAS G12V mutante. WT = KRAS tipo selvagem. Hom = Homozigoto. UD = Não determinado. Colunas 1-12 correspondem a Cts obtidos dos tubos 1-12, respectivamente, com valores em negrito correspondendo a Cts obtidos de "curvas verdadeiras" e valores em tipo de fonte normal correspondendo a valores obtidos de "curvas planas", isto é, curvas não linha basal que aparecem nos ciclos de amplificação finais (geralmente após um valor de Ct de 36).
[629] Métodos Gerais. As linhagens de célula usadas foram: LS-174T, HCT-15, HT-29, WiDi, SW1116, linhagem de célula de adenocarcinoma de cólon. Todas as linhagens de célula foram semeadas em placas de cultura de 60 cm2 em meio 5a da McCoy contendo 4,5 g/l de glicose, suplementadas com soro bovino fetal 10% e mantidas em uma atmosfera umidificada contendo CO2 5%. Uma vez as células tendo atingido 80-90% de confluência, elas foram lavadas em Solução Salina Tamponada com Fosfato (x 3) e coletadas através de centrifugação (500 x g). DNA foi isolado usando o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen; Valência, CA). Concentração de DNA foi determinada com Quant-iT Picogreen Assay (Life Technologies/ThermoFisher; Waltham, Ma).
[630] DNA humano genômico (0,2 mg/ml) contendo DNA genômico de peso molecular alto (>50 kb) isolado de sangue humano (camada leucoplaquetária) (DNA humano genômico da Roche) foi comprado da Roche (Indianápolis, IN). Sua concentração foi determinada ser 39 ng/μl através do Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit.
[631] Digestão por Restrição de DNA Genômico com Enzima Bsh1236I. DNA genômico (500 ng) das linhagens de célula listadas acima foi digerido com 10 unidades da enzima de restrição Bsh1236I em 20 μl de mistura de reação contendo tampão IxCutSmart (Acetato de Potássio 50 mM, Tris-Acetato 20 mM, Acetato de Magnésio 10 mM, BSA 100 μg/ml, pH 7,9 @ 25° C). As reações de digestão foram realizadas a 37° C por 1 hora e inativação de enzima subsequente através de aquecimento para 80° C por 20 min.
[632] Conversão em bissulfeto de DNA genômico digerido. Conversão em bissulfeto foi realizada usando o EZ DNA Methylation- Lightning kit da Zymo Research Corporation (Irvine, CA). 130 μl de Lightning Conversion Reagent foram adicionados a 20 μl do DNA genômico digerido Bsh236I. A reação de conversão foi incubada a 98°C por 8 minutos, seguido por 54°C por uma hora e então esfriada para 4°C. 600 μl de Tampão de Ligação M foram adicionados a uma Coluna Zymo-Spin® seguido por colocação da coluna em um tubo de coleta. A mistura de reação 150 μl contendo DNA digerido e reagente de conversão rápido foi carregada na Coluna Zymo-Spin IC contendo os 600 μl de Tampão de Ligação M. A tampa da coluna foi vedada e a solução foi misturada invertendo a coluna várias vezes. A coluna foi centrifugada em velocidade total (>10.000 x g) por 30 seg com o fluxo descartado. 100 μl de tampão de lavagem M foram adicionados à coluna e a coluna foi centrifugada em velocidade total por 30 segundos e o fluxo foi descartado. 200 μl de Tampão de L-Dessulfonação foram adicionados à coluna, e a coluna foi deixada permanecer em temperatura ambiente por 15-20 minutos. Após a incubação, a coluna foi centrifugada em velocidade total por 30 segundos. 200 μl de Tampão de Lavagem M foram adicionados à coluna e a coluna foi centrifugada em velocidade total por 30 segundos com o fluxo descartado. Esta etapa de lavagem foi repetida mais uma vez. Finalmente, a coluna foi posta em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e 10 μl de Tampão de Eluição M foram adicionados à matriz de coluna e centrifugados em velocidade total por 30 segundos para eluir o DNA convertido em Bissulfeto.
[633] Iniciadores de PCR e LDR. Todos os iniciadores usados são listados na Tabela 19. Todos os iniciadores foram comprados da Integrated DNA Technologies Inc. ((IDT), Coralville, IA), exceto LNA1 e LNA2, que foram comprados da Exiqon Inc. (Woburn, MA), e PNA, que foi comprado da PNA Bio (Thousand Oaks, CA). Tabela 19. Iniciadores para metilação de PCR-LDR-qPCR/5SpC3/ - Espaçador C3 5', /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.
[634] Experimentos de PCR-LDR-qPCR. A etapa de PCR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 2 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 0,8 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 0,2 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 0,25 μl de iniciador avançado iCDx-2031-Vim-S3-FP a 2 μM, 0,25 μl de iniciador reverso iCDx-2032A-Vim-S3-RP a 2 μM, 1,25 μl de iniciador de bloqueio VIM-S3-LNA ou VIM-S3-PNA2 a 2 μM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT) e 0,22 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com anticorpo Platinum Taq Antibody (Invitrogen/Thermo Fisher, Waltham, Ma) (a mistura é preparada através da adição de 0,02 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 0,2 μl de Platinum Taq Antibody at5 U/μl) e 4,78 μl de modelo correspondente contendo 35 ng de DNA genômico. Os modelos eram: DNA genômico de linhagem de célula LS-174T, HCT-15, HT-29, WiDr, SW1116 e DNA genômico humano da Roche. As reações de PCR foram realizadas em um termociclizador de sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher, Waltham, Ma) e realizadas com o programa que segue: 2 min a 95°C, 40 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final a 4°C.
[635] A etapa de LDR foi realizada em uma reação de 10 μl preparada através da adição de: 5,82 μl de água livre de nuclease (IDT), 1 μl de tampão de reação de 10X AK16D ligase [tampão 1X contém Tris- HCl 20 mM pH 8,5 (Bio-Rad, Hercules, CA), MgCl2 5 mM (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), KCl 50 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo), DTT 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e 20 ug/ml de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)], 0,25 μl de DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de NAD+ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) a 40 mM, 0,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl, 0,2 μl de iniciador iCDx-2033A-Vim-S3-Up a 500 nM, 0,2 μl de iniciador iCDx-2034A-Vim-S3-Dn a 500 nM, 0,028 μl AK16D ligase purificada a 8,8 μM e 2 μl de reação de PCR. As reações de LDR foram realizadas em um termociclizador de Sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 20 ciclos de (10 seg a 94°C e 4 min a 60°C) seguido por uma retenção final a 4°C.
[636] A etapa de qPCR foi realizada em uma mistura de reação de (IDT), 5 µl de 2X TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (amplitaq rápida, UDG e dUTP) da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), 1 µl de iniciador avançado iCDx-2036-Vim-S3-RT-FP a 2,5 µM, 1 µl de iniciador reverso iCDx- 2037-Vim-S3-RT-RP a 2,5µM, 0,5 µl de sonda Taqman iCDx-2035AVim-S3-RT-Pb a 5 µM e 1 µl de produtos de reação de LDR. As reações de qPCR foram realizadas em um termociclizador em tempo real ViiA7 da Applied Biosystems (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma), usando placas Fast-96-Well Reaction de 0,1 ml MicroAmp® vedadas com Película adesiva óptica MicroAmp® (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o ajuste que segue: bloqueio rápido, Curva padrão como tipo de experimento, ROX como referência passiva, Ct como método de quantificação (limiar automático, mas ajustado para 0,05 quando necessário). TAMRA como repórter e NFQ-MGB como supressor; e usando o programa que segue: 2 min a 50ºC e 40 ciclos de 1 (1 seg a 95ºC e 20 seg a 60ºC). Os resultados são mostrados na Figura 173 e Tabela 20. Tabela 20. Resultados de experimentos para detectar metilação em DNA genômico de linhagem celular.
[637] Experimentos de pixel. A etapa de PCR foi configurada em uma mistura de 130 μl preparada através da adição de: 59,14 μl de água livre de nuclease (IDT), 26 μl de tampão Gotaq Flexi 5X sem Magnésio (Promega, Madison, WI), 10,4 μl de MgCl2 a 25 mM (Promega, Madison, WI), 2,6 μl de dNTPs (com dATP, dCTP, dGTP e dUTP, 10 mM cada) (Promega, Madison, WI), 3,25 μl de iniciador avançado iCDx- 2031-VIM-S3-FP a 2 μM, 3,25 μl de iniciador reverso iCDx-2032-VIM- S3-PR a 2 μM, 16,25 μl de iniciador de bloqueio iCDx-VIM-S3-LNA2 a 2 μM, 3,25 μl de RNAseH2 (IDT) a 20 mU/μl (diluído em tampão de diluição de RNAseH2 da IDT), 2,6 μl de Antarctic thermolabile UDG (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) a 1 U/μl e 2,86 μl de polimerase Klentaq1 (DNA Polymerase Technology, St. Louis, MO) misturados com Platinum Taq Antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA) (a mistura é preparada através da adição de 0,3 μl de polimerase Klentaq1 a 50 U/μl a 3 μl de Platinum Taq Antibody a 5 U/μl) e 3 μl de modelo correspondente. 3 μl de modelos contêm: (1) 0,070 ng (20 GE) de DNA de HT-29 misturados com 9 ng (2500 GE) de hgDNA Roche. (2) 0,035 ng (10 GE) de DNA de linhagem de célula HT-29 misturados com 9 ng (2500 GE) de hgDNA Roche. (3) 9 ng (2500 GE) de Roche DNA, (4) água livre de nuclease do Controle Não Modelo (NTC).
[638] Cada mistura de PCR 130 μl foi dividida em 12 tubos, 10 μl cada, e então as reações de PCR foram realizadas em um termociclizador de sistema de PCR ProFlex (Applied Biosystems/ThermoFisher; Waltham, Ma) e o programa que segue: 2 min a 95°C, 40 ciclos de (10 seg a 94°C, 30 seg a 60°C e 30 seg a 72°C), 10 min a 99,5°C e uma retenção final a 4°C. As etapas de LDR e qPCR subsequentes foram realizadas como acima descrito. Os resultados são mostrados na Figura 174 e Tabela 25.
[639] O procedimento de PCR-LDR-qPCR para detecção de metilação em filamentos superiores e inferiores de VIM-S3 foi repetido como acima descrito usando uma versão modificada das sondas de LDR e Taqman (isto é, versão B). Uma comparação de resultados para detecção de metilação é mostrada nos gráficos de amplificação das Figuras 175-178. A Figura 175 provê os gráficos de PCR em tempo real par DNA de linhagem de célula e tipo selvagem (Roche) usando o projeto de iniciador de filamento superior de VIM-S3 e a versão "A" da sonda Taqman (Tabela 21). Os resultados mostram um valor de Ct de cerca de 10 e 11,5 para DNA de linhagem de célula WiDr e HT-29, respectivamente, indicando metilação no sítio S3 na região de promotor de VIM. As linhagens de célula SW1116, DNA Roche, controle não modelo (NTC) para a etapa de PCR inicial, a etapa de LDR que segue e a etapa de Taqman final são todos linha basal (isto é, plana). O mesmo experimento foi repetido usando sondas de versão "A" projetadas para o filamento inferior (Figura 176 e Tabela 22). Como esperado, os resultados mostram um valor de Ct de cerca de 11 e 9 para DNA de linhagem de célula WiDr e HT-29, respectivamente, indicando metilação no sítio S3 na região de promotor de VIM. No entanto, resultados com SW1116, DNA Roche, controle não modelo (NTC) para a etapa de PCR inicial e NTC para a etapa de LDR que segue fornecem valor de Ct em torno de 28,5 a 31, embora seja conhecido do experimento anterior que não há nenhuma metilação no sítio S3 na região de promotor de VIM. Esta discrepância foi solucionada através do projeto das sondas Taqman em se sobrepor à porção de sonda de LDR a montante do produto de LDR em cerca de 9 bases e a porção de sonda de LDR a jusante do produto de LDR pelas bases restantes na sonda. Ainda, duas bases complementares no lado 5’ foram adicionadas à sonda Taqman para assegurar que qualquer extensão de polimerase cruzada acidental não fosse capaz de se estender sobre a sonda de LDR a montante em uma rodada subsequente. A Figura 177 provê os gráficos de PCR em tempo real para DNA de linhagem de célula e tipo selvagem (Roche) usando o projeto de iniciador de filamento superior WIM-3 e a versão "B" de sonda Taqman (Tabela 23). Os resultados mostram um valor de Ct de cerca de 12 e 13,5 para DNA de linhagem de célula WiDr e HT- 29, respectivamente, indicando metilação no sítio S3 na região de promotor de VIM. As linhagens de célula SW1116, DNA Roche, controle não modelo (NTC) para a etapa de PCR inicial, a etapa de LDR que segue e a etapa de Taqman final são todos linha basal (isto é, plana). O mesmo experimento foi repetido usando as sondas versão "B" projetadas para o filamento inferior (Figura 178 e Tabela 24). Como esperado, os resultados mostram um valor de Ct de cerca de 11,5 e 9,5 para DNA de linhagem de célula WiDr e HT-29, respectivamente, indicando metilação no sítio S3 na região de promotor de VIM. Agora, resultados com as linhagens de celula SW1116, DNA Roche, controle não modelo (NTC) para a etapa de PCR inicial, a etapa de LDR que segue e a etapa de Taqman final são todos de linha basal (isto é, plana), indicando que a nova versão de projeto de sonda "B" resolveu o problema de sinal falso de NTC ou amostras sem metilação na região de sítio 3 de VIM.Tabela 21. Iniciadores de Metilação para Filamento VIM_S3_Top usando versão "A" da Sonda Taqman
/5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ -Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.Tabela 22. Iniciadores de Metilação para Filamento VIM_S3_Bottom usando versão "A" da Sonda Taqman/5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.Tabela 23. Iniciadores de Metilação para Filamento VIM_S3_Top Usando Sonda Taqman Versão "B" /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina. Tabela 24. Iniciadores de Metilação para Filamento VIM_S3_Bottom usando versão "B" da Sonda Taqman /5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina. Tabela 25. Resultados de experimentos de pixel para detectar metilação em DNA de HT-29 na base de hgDNA da Roche
[640] Projeto de Ensaio de Metilação foi efetuado primeiro realizando análise computadorizada da sequência de DNA genômico dos genes de Vimentina (VIM) e TMEM90B para identificar sítios de CG altamente metilados prospectivos. Após a análise por computador e identificação de sítios de metilação múltiplos, três a quatro sítios dentro de cada gene foram selecionados para desenvolvimento de ensaio. Para auxiliar no desenvolvimento do ensaio, uma conversão em bissulfeto computadorizada é realizada no DNA genômico convertido em bissulfeto dos respectivos genes. Isto é feito para ambos o filamento superior e inferior para projetar oligonucleotídeos fora das sequências convertidas em bissulfeto esperadas. A conversão computadorizada é realizada no filamento superior através da conversão das bases G que não estão seguindo uma base 5’C imediata em bases A (conversão de G-A para todos os G’s que não são CG) e para o filamento inferior convertendo uma base C próximo a uma base 3’G imediata em bases T (conversão C-T para todas as bases C que não são CG). Os critérios de projeto para o ensaio de ligação começam pela identificação da base de discriminação que é ou o C metilado ou G adjacente (onde o C do filamento complementar é metilado), como a identificação de várias características adicionais na sequência que auxiliariam nos critérios de projeto da requerente, incluindo evitar sequências com teor de GC muito alto após conversão em bissulfeto. Uma vez os sítios metilados para desenvolvimento de ensaio tendo sido selecionados, o mesmo sítio em ambos os filamento superior e inferior é ensaiado. Uma abordagem de quatro etapas foi utilizada para projetar oligonucleotídeos para este ensaio. A primeira etapa é projetar os oligonucleotídeos de Reação de Detecção de Ligase (LDR) a montante e a jusante. Segundo, projetar um oligonucleotídeo avançado e reverso específico de gene para cobrir o sítio de LDR e os oligonucleotídeos de LDR dentro de um amplicon específico de gene entre 100 e 140 bases em comprimento total. Terceiro, projetar sondas marcadas com corante fluorescente (FAM e HEX®) que cobrem o sítio de ligação e se ligam especificamente ao produto de LDR ligado. E a etapa final é projetar uma sonda de Ácido Nucleico Bloqueado WT (LNA®) para bloquear a amplificação da região de promotor não metilada convertida em bissulfeto. ... AGCCGGCCGAGCTCCAGCCGGAGCTACGTGACTACGTCCACC CGCACCTACAGCCTGGGCAGCGCGCTGCGCCCCAGCACCAGCC GCAGCCTCTACGCCTCGTCCCCGGGCGGCGTGTATGCCACGCGC TCCTCTGC... (SEQ ID NO: 137) .AACCGACCGAACTCCAACCGAAACTACGTAACTACGTCCACCC GCACCTACAACCTAAACAACGCGCTACGCCCCAACACCAACCGCA ACCTCTACGCCTCGTCCCCGAACGACGTATATACCACGCGCTCCT CTAC... (SEQ ID NO: 131) Sequência genômica do Sítio 3 (S3) de VIM superior antes da conversão em bissulfeto e após conversão em bissulfeto. (Nucleotídeo em negrito vermelho representa o sítio S3 de metilação)
[641] As sondas de oligonucleotídeo a montante (Up) de LDR são projetadas com uma Tm de 64-66°C, com a extremidade 3’ na base de discriminação de interesse ou C ou G no CG metilado. Uma vez a sequência de iniciador sendo selecionada e dentro da faixa de Tm requerida, uma técnica de bloqueio de extensão não específica, sem base no método de clivagem de RNaseH2® da IDT (Coralville, Ia), é utilizada para adicionar uma base de RNA complementar imediata ao lado 3’ da base de discriminação seguido por duas bases de DNA compatíveis nas segunda e terceira posições e duas bases de DNA incompatíveis (preferivelmente incompatibilidades ou G-T ou A-C) nas quarta e quinta posições (ou as terceira e quinta) seguido pela adição de um Espaçador C3 3’. A cauda de cinco bases inteira e espaçador são usados para bloquear extensão não específica fora da sonda de LDR a montante. Para a sonda de oligonucleotídeo de LDR a montante, uma incompatibilidade adicional (preferivelmente incompatibilidade ou G-T ou A-C) é também utilizada na posição adjacente, segunda ou terceira no lado 5’ da base de discriminação. Modificações adicionais incluem um Espaçador C3 5’ opcional para bloquear digestão por lambda exonuclease de produtos de ligação. Após a seleção e modificação do oligonucleotídeo a montante, uma sequência marcadora correspondendo a um oligonucleotídeo avançado para um experimento de PCR em tempo real subsequente é adicionada ao lado 5’ da sequência. As sequências marcadoras são escolhidas de uma lista de pares de iniciador avançado e reverso de oligonucleotídeo de qPCR que foram projetados previamente. Sequências de sonda de LDR a montante: AACTCCAACCGAAACTACGTAACTGCGrUCCgt/3SpC3/ (SEQ ID NO: 132) Sequência marcadora 5’ + sequência de sonda de LDR a montante: TAGACACGAGCGAGGTCACAACTCCAACCGAAACTACGTAACTG CGrUCCgt/3SpC3/ (SEQ ID NO: 133) Sequência Marcadora 5’ + Sequência de sonda de LDR a montante com Espaçador 5’ e incompatibilidade nas quarta e quinta posições de clivagem: /5SpC3/TAGACACGAGCGAGGTCACAACTCCAACCGAAACTACGTA ACTGCGrUCCgt/3SpC3/ (SEQ ID NO: 36) Sequência Marcadora 5’ + Sequência de sonda de LDR a montante com Espaçador 5’ e incompatibilidade nas terceira e quinta posições de clivagem: /5SpC3/TAGACACGAGCGAGGTCACAACTCCAACCGAAACTACGTA ACTGCGrUCtAt/3SpC3/ (SEQ ID NO: 42) Iniciador Avançado de qPCR: 5’- TAGACACGAGCGAGGTCAC 3’ (SEQ ID NO: 39) .. .AACCGACCGAACTCCAACCGAAACTACGTAACTaCGTÇÇACCC GCACCTACAACCTAAACAACGCGCTACGCCCCAACACCAACCGCA ACCTCTACGCCTCGTCCCCGAACGACGTATATACCACGCGCTCCT CTAC... (SEQ ID NO: 131) DNA genômico convertido em bissulfeto de S3VIM -Localização de LDR a montante em Negrito, letra minúscula "a" sítio de incompatibilidade de terceira posição e o sítio de clivagem de RNA não sublinhado.
[642] A sonda de oligonucleotídeo de LDR (Dn) a jusante foi projetada na base seguindo imediatamente o lado 3’ da base de discriminação. As sondas de oligonucleotídeo foram projetadas com uma Tm de 70-72°C. Tal como a sonda a montante, uma sequência marcadora selecionada é adicionada à extremidade 3’ da sequência. Modificações adicionais feitas no projeto envolvem a adição de uma incompatibilidade na quarta posição mais próxima do lado 5’ e a inclusão de bases incompatíveis adicionais à extremidade 3’ do oligonucleotídeo um pouco antes da sequência de marcação em tempo real. Sequência de sonda de LDR a jusante: /5Phos/TCCACCCGCACCTACAACCTAAACAACGC (SEQ ID NO: 134) Sonda de LDR a jusante + sequência marcadora-iniciador complementar 3’: /5Phos/TCCACCCGCACCTACAACCTAAACAACGCGTGCAAAATTC AGGCTGTGCA (SEQ ID NO: 37)
[643] Oligo a jusante com incompatibilidade na quarta posição e bases adicionais espaçando a sequência genômica convertida em bissulfeto da sequência de qPCR: /5Phos/TCCaCCCGCACCTACAACCTAAACAACGCGCTGTGCAAAA TTCAGGCTGTGCA (SEQ ID NO: 135) Iniciador Reverso de qPCR: 5’- TGCACAGCCTGAATTTTGCAC -3’ (SEQ ID NO: 40) .. .AACCGACCGAACTCCAACCGAAACTACGTAACTAÇGTCCACCC GCACCTACAACCTAAACAACGCGCTACGCCCCAACACCAACCGC AACCTCTACGCCTCGTCCCCGAACGACGTATATACCACGCGCTCC TCTAC... (SEQ ID NO: 131) DNA genômico convertido em bissulfeto de S3 VIM-Localização de LDR a Jusante (Dn) em negrito sítio de metilação está sublinhado
[644] Iniciadores de oligonucleotídeo avançados (FP) e reversos (RP) específicos de gene foram projetados imediatamente a montante das sondas de oligonucleotídeo de LDR com sobreposição significante da sonda de oligonucleotídeo de LDR a montante com um comprimento de amplicon total entre cerca de 100-140 bases. Os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de gene avançados e reversos foram projetados com uma Tm de 62-64° C. O iniciador reverso foi projetado mais a jusante e sem nenhuma sobreposição da sonda de oligonucleotídeo de LDR Dn para incorporar sítios de restrição de CGCG adicionais quando presentes para discriminação adicional de sítios metilados. Preferivelmente, um ou mais sítios de restrição Bsh1236I (CGCG) estão presentes no DNA alvo para permitir uma clivagem opcional do DNA não metilado antes da conversão em bissulfeto. Opcionalmente, o iniciador reverso tem um cauda de 10 bases não específica adicionada à extremidade 5’ para prevenir formação de dímero de iniciador com os outros iniciadores reversos. Ambos os iniciadores avançados e reversos também utilizam a habilidade de clivagem de RNA na extremidade 3’ do iniciador, mas diferente das sondas de oligonucleotídeo de LDR, os iniciadores têm apenas uma incompatibilidade na extremidade 3’ adjacente ao grupo de bloqueio. Iniciador avançado: 5’- GAACTCCAACCGAAACTACGTAArCTACa/3SpC3/ (SEQ ID NO: 31) Iniciador reverso: 5’-ACGAGGCGTAGAGGTTGCrGGTTa/3SpC3/ (SEQ ID NO: 136) Iniciador reverso + Cauda com 10 bases 5’ GGTGTCGTGGACGAGGCGTAGAGGTTGCrGGTTA/3SpC3/ (SEQ ID NO: 32) Iniciador Avançado e Reverso contendo a incompatibilidade de uma base (caixa baixa e negrito) na porção de clivagem de RNA do iniciador .. .AACCGACCGAACTCCAACCGAAACTACGTAACTACGTCCACCC GCACCTACAACCTAAACAACGCGCTACGCCCCAACACCAACCGCA ACCTCTACGCCTCGTCCCCGAACGACGTATATACCACGCGCTCCT CTAC... (SEQ ID NO: 131) DNA genômico convertido em bissulfeto de S3 VIM-Iniciadores Avançados (FP) e Reversos (RP) específicos de gene em negrito, sítio de metilação CG é aumentado, regiões de sítio de clivagem de RNA estão sublinhadas
[645] Dos três a quatro sítios identificados pela análise acima, dois sítios foram selecionados para desenvolvimento de ensaio em ambos os filamentos superior e inferior. Para diferenciar entre os dois sítios, sondas em tempo real específicas de filamento foram projetadas para cobrir o produto de ligação com sondas marcadas com 5’-FAM- ou 5’ HEX® específicas de sítio. Sondas em tempo real foram projetadas para incorporar a incompatibilidade na terceira posição que foi incorporada à sonda de LDR a montante no lado 5’ da base de discriminação, e uma sonda adicional foi projetada para cobrir a incompatibilidade 5’ e a incompatibilidade na quarta posição opcional no lado 3’ da base de discriminação na sonda a jusante. As Tm das sondas são projetadas para 68-70°C. Inicialmente, as sondas foram projetadas para ter cobertura igual dos lados 5’ e 3’ do sítio de ligação, mas sondas adicionais foram projetadas com um viés de cobertura de 1/3 no lado (5’) seguido por 2/3 no lado a jusante (3’) do sítio de ligação, que era na maioria dos casos 7 bases a montante e 15 bases a jusante do sítio de ligação para a maioria das sondas. Para evitar problemas com fluorescência de corante FAM baixa quando acoplada a uma base G, todas as sondas foram projetadas evitando uma base G em sua primeira base 5’ de maneira que corantes podem ser intercomutados conforme necessário sem a necessidade de modificação de sequência. Modificações adicionais envolvem a adição de incompatibilidades seguindo imediatamente o corante fluorescente. As sondas foram sintetizadas da IDT e utilizam um supressor ZEN® (IDT) nove bases a partir do lado 5’ e supressor fluorescente Iowa Black® FQ (IDT) na extremidade 3’. Sonda em tempo real com incompatibilidade na terceira posição de compatibilidade (Negrito): /5HEX/TAACTGCGT/ZEN/CCACCCGCACCTAC/3IABkFQ/ (SEQ ID NO: 38) Sonda em tempo real com compatibilidade na terceira posição de compatibilidade (Negrito) e duas bases adicionais: /5HEX/ttTAACTGC/ZEN/GTCCACCCGCACCTAC/3IABkFQ/ (SEQ ID NO: 44) /5HEX/ttTAACTGC/ZEN/GTCCGCCCGCACCTAC/3IABkFQ/ (SEQ ID NO: 45) .. .AACCGACCGAACTCCAACCGAAACTACGTAACTaCGTCCACCC GCACCTACAACCTAAACAACGCGCTACGCCCCAACACCAACCGC AACCTCTACGCCTCGTCCCCGAACGACGTATATACCACGCGCTCC TCTAC... (SEQ ID NO: 131) DNA genômico convertido em bissulfeto de S3 VIM-Sítio da sonda em tempo real, sítio "a" em caixa baixa da compatibilidade na terceira posição a montante e sítio A sublinhado da compatibilidade na quarta posição a jusante
[646] Iniciadores de bloqueio de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA®) foram projetados para reduzir amplificação de alvo não metilado convertido em bissulfeto, ao ter uma sonda de LNA perfeitamente compatível que se liga ao alvo não metilado convertido em bissulfeto e utilizando entre 5-10 bases bloqueadas (LNA) para prevenir amplificação. As sondas de bloqueio de LNA são sintetizadas pela Exiqon (Woburn, Ma) com uma Tm de 72-75° C. Tabela 26. Lista de Oligo de Detecção de Metilação
/5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.
[647] Detecção de mutação foi realizada em vários oncogenes de câncer e supressores de tumor carregando mutações significantes conhecidas diferentes incluindo KRAS (G12A, G12D, G12S, G12C e G12V), BRAF (V600E, 1799T>A) e Tp53 (R248Q, 743G>A). O ensaio realizado similarmente ao ensaio de metilação usando uma abordagem de Reações de Detecção de Ligase (LDR) quantitativa exceto que a base de discriminação está localizada na mutação de interesse.
[648] As sondas de oligonucleotídeo a montante de LDR (Up) são projetadas com uma Tm de 64-66° C 5’ a montante de uma extremidade na mutação (base de discriminação de interesse). Uma vez selecionado o iniciador fora desta base e dentro da faixa de Tm requerida, a técnica de bloqueio de extensão não específica não baseada no método de clivagem de RNaseH2® da IDT (Coralville, Ia) é utilizada para adicionar uma base de RNA complementar imediata ao lado 3’ da base de discriminação seguido por duas bases de DNA compatíveis nas segunda e terceira posições e duas bases de DNA incompatíveis (G-A, C-T) nas quarta e quinta posições seguido pela adição do espaçador 3’ C3. A cauda de cinco bases inteira e espaçador são usados para bloquear extensão não específica fora da sonda de LDR a montante. Para a sonda de oligonucleotídeo de LDR a montante, uma incompatibilidade adicional (preferivelmente ou incompatibilidade G-T ou A-C) é também utilizada na posição adjacente, segunda ou preferivelmente terceira no lado 5’ da base de discriminação. Após a seleção e modificação do oligonucleotídeo a montante, uma sequência marcadora correspondendo a um iniciador avançado para um experimento de PCR em tempo real subsequente é adicionada ao lado 5’ da sequência de sonda de LDR a montante. As sequências marcadoras são escolhidas de uma lista de pares de iniciador avançado e reverso de oligonucleotídeo de qPCR que foram previamente projetados. iCDx-308-Br600_(3)-L_Up_Rm: 5’TAGCGATAGTACCGACAGTCACGtcctAAATAGGTGATTTTGGTC TAGCTACGGArGAAAc/3SpC3/ (SEQ ID NO: 4)
[649] Exemplo de um Oligo de LDR a Montante (de 5’: marcador em caixa alta e negrito, sequência de ligante curta em caixa baixa itálico, sequência de sonda de LDR a montante em caixa alta com incompatibilidade na posição 3 antes da mutação em negrito e incompatibilidade na última posição de cauda de cinco bases em negrito e caixa baixa).
[650] Sondas de LDR a montante adicionais foram projetadas como descrito acima, com as modificações que seguem: para sondas de LDR versão "A", a base de RNA imediata ao lado 3’ da base de discriminação seguido por três bases de DNA compatíveis nas segunda, terceira e quarta posições e uma base de DNA incompatível (G-A, C-T) na quinta posição seguido pela adição de um Espaçador C3 3’; para sondas de LDR versão "B", a base de RNA imediata ao lado 3’ da base de discriminação seguido por duas bases de DNA compatíveis nas segunda e terceira posições e duas bases de DNA incompatíveis (G-A, C-T) nas quarta e quinta posições seguido pela adição de um espaçador C3 3’; para versões "D" das sondas de LDR, a base de RNA imediata ao lado 3’ da base de discriminação seguido por duas bases de DNA compatíveis nas segunda e quarta posições e duas bases de DNA incompatíveis (G-A, C-T) nas terceira e quinta posições seguido pela adição de um Espaçador C3 3’. Ainda, as versões "A", "B" e "C" das sondas de LDR a montante tinham uma base de DNA incompatível (GA, C-T) na terceira posição a partir da junção de ligação (isso é, extremidade 3’ após clivagem com RNaseH) e a versão "D" das sondas de LDR a jusante tinham uma base de DNA incompatível (G-A, C-T) na quarta posição a partir da junção de ligação (isto é, extremidade 5’).
[651] A sonda de oligonucleotídeo de LDR a jusante (Dn) foi projetada na base seguindo imediatamente o lado 3’ da base de discriminação. Os oligonucleotídeos foram projetados com uma Tm de 68° C. Uma sequência marcadora correspondendo ao complemento reverso do iniciador reverso para um experimento de PCR em tempo real subsequente é adicionada ao lado 3’ da sequência específica de LDR. Tal como a sonda de oligonucleotídeo de LDR a montante, essas sequências também foram selecionadas de uma lista predeterminada de pares de iniciador de qPCR ótimos. iCDx-276-Br600-L_Dn_P: /5Phos/GAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATttggtGTGCGGAAACCT ATCGTCGA (SEQ ID NO: 5)
[652] Exemplo de um Oligo de LDR a Jusante (de 5’: sequência de sonda de LDR a montante em caixa alta, sequência ligante curta em caixa baixa itálico e seguido por Marcador para PCR em tempo real em caixa alta e negrito).
[653] Iniciadores avançados (FP) e reversos (RP) específicos de gene para a etapa de PCR foram projetados imediatamente a montante ou a jusante, respectivamente, das sondas de oligonucleotídeo de LDR. Há uma sobreposição significante entre o FP e a sonda de oligonucleotídeo de LDR a montante, e não há nenhuma sobreposição entre o RP e a sonda de LDR a jusante. Os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de gene avançados e reversos foram projetados com uma Tm de 64-66° C e com um comprimento de amplicon total de 74-94 bases. Ainda, o iniciador reverso tem uma cauda de 10 bases não específica adicionada à extremidade 5’ para prevenir formação de dímero de iniciador dos iniciadores a jusante. Opcionalmente, ambos os iniciadores avançados e reversos também utilizam o método de clivagem de RnaseH2® de 5 bases na extremidade 3’ do iniciador, mas diferente das sondas de oligonucleotídeo de LDR, eles tinham zero ou uma incompatibilidade na extremidade 3’ (quando esta extremidade 3’ é a base mutada a ser discriminada, ela era compatível com a sequência do tipo selvagem e incompatível com a sequência mutante). iCDx-328-Braf_PF_WT_blk2 (FP específico de gene com método de clivagem de RNaseH2® de 5 bases e incompatibilidade na extremidade 3’): CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTArGCTAt/3SpC3/ (SEQ ID NO: 1)
[654] iCDx-284-Br600-PR (RP específico de gene com cauda de 10 bases em negrito, uma base ligante extra em itálico e sequência específica de gene em caixa alta): ggtgtcgtggTCAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAAC (SEQ ID NO: 2)
[655] Exemplo de iniciadores de PCR avançados e reversos específicos de gene
[656] Para a etapa de PCR em tempo real, sondas em tempo real específicas de filamento marcadas com FAM, HEX® ou TAMRA na extremidade 5’ foram projetadas para cobrir o produto de ligação através da junção ente os iniciadores de LDR a montante e a jusante. Sondas diferentes foram projetadas para incorporar a incompatibilidade ou na posição adjacente, segunda ou terceira posicionada no lado 5’ da base de discriminação que era incorporada aos oligos a montante correspondentes. As sondas foram projetada com uma Tm de 68° C. Para evitar problemas com fluorescência de corante FAM baixa quando acopladas a uma base G, todas as sondas foram projetadas sem uso de uma base G em sua primeira base de partida 5’ de maneira que corantes podem ser intercomutados conforme necessário sem a necessidade de modificação de sequência. Modificações adicionais envolvem a adição de incompatibilidades imediatamente seguindo a sonda fluorescente. As sondas foram sintetizadas da IDT e a maioria utiliza um supressor ZEN® nove bases a partir do lado 5’ e supressor fluorescente Iowa Black® FQ ou Iowa Black® RQ (IDT) na extremidade 3’. iCDx-277_A4:TAGCGATAGTACCGACAGTCAC (SEQ ID NO: 6) iCDx-279_C4: TCGACGATAGGTTTCCGCAC (SEQ ID NO: 7) iCDx-281-Br600_(3)_Probe: 5'- /56-TAMN/TA CGG AGA AAT CTC GAT GGA GTG GGT /3IAbRQSp/ -3' (SEQ ID NO: 8)
[657] Iniciadores de bloqueio de Ácido Nucleico Bloqueado (LNA®) foram projetados para reduzir amplificação de alvo do tipo selvagem, bem como ligação de sondas de LDR a montante e a jusante em alvo do tipo selvagem amplificado. Para conseguir isso um perfeitamente compatível com sonda de LNA do Tipo selvagem utilizando entre 3-6 bases bloqueadas foi sintetizado pela Exiqon (Woburn, Ma) com uma Tm de 71-76° C. Os LNAs também contêm um grupo fosfato 5’ e um Espaçador C3 de três iniciadores para prevenir resultados falso positivos se originando de extensão de sonda em DNA do tipo selvagem.iCDx-315-BRAF_FLW:/5Phos/GCTA+C+AG+T+G+AAAT+CTCG/3SpC3/ (SEQ ID NO: 3)
[658] Alternativamente, iniciadores de bloqueio de Ácido nucleico de peptídeo (PNA®) foram projetados para reduzir amplificação de alvo do tipo selvagem, bem como ligação de sondas de LDR a montante e a jusante em alvo do tipo selvagem amplificado. Para fazer isso, um perfeitamente compatível com oligo de PNA do tipo selvagem foi projetado incluir 4-8 bases em cada lado da base de discriminação e ter uma Tm de 70-76° C. Oligos de PNA foram sintetizados pela PNA Bio (Thousand Oaks, CA). PNA-p53-248-11L: TGAACCGGAGG (SEQ ID NO: 12) Exemplo de um oligo de PNA usado para bloquear sinal do tipo selvagem (a base de discriminação está em negrito e é compatível com o alvo do tipo selvagem) Tabela 27. Lista de Iniciador de Detecção de Mutação
/5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina. Tabela 28. Oligonucleotídeos de Detecção de Metilação
/5SpC3/ - Espaçador C3 5’, /3SpC3/ - Espaçador C3 3’, /5Phos/ - Fosfato 5’, /56-FAM/ - Corante Fluorescente Fam 5’, /5HEX/ - Corante Fluorescente HEX®, /ZEN/ - Supresssor Fluorescente® ZEN®, /3IABkFQ/ - Supresssor Fluorescente Iowa Black® 3’, faixa espectral verde a rosa, "+" - base de Ácido Nucleico Bloqueado, "rA" - base de ribonucleotídeo riboadenosina; "rT" - base de ribonucleotídeo ribotimidina; "rG" - base de ribonucleotídeo riboguanosina; "rC" - base de ribonucleotídeo ribocitosina.
Claims (16)
1. Método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou em outras amostras, por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados, caracterizado por compreender: fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico potencialmente contendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados; fornecer uma ou mais enzimas capazes de digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na amostra; fornecer um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, cada conjunto de iniciadores oligonucleotídicos primários compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência nucleotídica adjacente à sequência nucleotídica alvo e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário; misturar a amostra, o um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, a uma ou mais enzimas capazes de digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na amostra, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase; submeter a mistura de reação em cadeia da polimerase a condições adequadas para digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando assim produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma; misturar os produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sondas oligonucleotídicas para formar uma mistura de reação de ligação, onde cada conjunto de sondas oligonucleotídicas compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ iniciador-específica e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo- específica e uma porção 3’ iniciador-específica, e onde as primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sondas são configuradas para hibridizar, de forma específica para base, em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário; submeter a mistura de reação de ligação a um ou mais ciclos de reação de ligação com o que as primeira e segunda sondas oligonucleotídicas do um ou mais conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas uma à outra para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação de ligação onde cada sequência de produto ligada compreende a porção 5’ iniciador-específica, as porções alvo-específicas, e a porção 3’ iniciador-específica; fornecer um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos secundários, cada conjunto de iniciadores oligonucleotídicos secundários compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo a mesma sequência nucleotídica que a porção 5’ iniciador-específica da sequência de produto ligada e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico secundário compreendendo uma sequência nucleotídica que é complementar à porção 3’ iniciador-específica da sequência de produto ligada; misturar as sequências de produto ligadas, o um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos secundários, a uma ou mais enzimas capazes de digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU), uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma segunda mistura de reação em cadeia da polimerase; submeter a segunda mistura de reação em cadeia da polimerase a condições adequadas para digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na segunda mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão formando assim produtos de extensão secundários; e detectar e distinguir os produtos de extensão secundários na amostra para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
2. Método para identificar, em uma amostra, uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra, ou em outras amostras, por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados, caracterizado por compreender: fornecer uma amostra contendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico potencialmente contendo a sequência nucleotídica alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados; fornecer uma ou mais enzimas capazes de digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na amostra; fornecer um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, cada conjunto de iniciadores oligonucleotídicos primários compreendendo (a) um primeiro iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência nucleotídica adjacente à sequência nucleotídica alvo e (b) um segundo iniciador oligonucleotídico primário que compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção de um produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico primário; misturar a amostra, o um ou mais conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos primários, a uma ou mais enzimas capazes de digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na amostra, uma mistura de desoxinucleotídeos incluindo dUTP, e uma DNA polimerase para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase; submeter a mistura de reação em cadeia da polimerase a condições adequadas para digerir moléculas de ácido nucleico contendo desoxiuracil (dU) presentes na mistura de reação em cadeia da polimerase, e um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase compreendendo um tratamento de desnaturação, um tratamento de hibridização, e um tratamento de extensão, formando assim produtos de extensão primários compreendendo a sequência nucleotídica alvo ou um complemento da mesma; misturar os produtos de extensão primários com uma ligase e um ou mais conjuntos de sondas oligonucleotídicas para formar uma mistura de reação de ligação, onde cada conjunto de sondas oligonucleotídicas compreende (a) uma primeira sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ e uma porção 3’ sequência nucleotídica alvo-específica, e (b) uma segunda sonda oligonucleotídica tendo uma porção 5’ sequência nucleotídica alvo-específica e uma porção 3’, onde a porção 5’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sondas é complementar a uma porção da porção 3’ da segunda sonda oligonucleotídica, onde uma sonda do conjunto de sondas compreende uma porção geradora de sinal detectável, e onde as primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sondas são configuradas para hibridizar, de forma específica para base, em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário; submeter a mistura de reação de ligação a um ou mais ciclos de reação de ligação com o que as primeira e segunda sondas oligonucleotídicas do um ou mais conjuntos de sondas oligonucleotídicas são ligadas uma à outra para formar sequências de produto ligadas na mistura de reação de ligação onde cada sequência de produto ligada compreende a porção 5’, as porções alvo-específicas, a porção 3’, e a porção geradora de sinal detectável; hibridizar a porção 5’ da sequência de produto ligada em sua porção 3’ complementar; detectar sinal proveniente da porção geradora de sinal detectável que é produzido mediante a referida hibridização; e distinguir sequências de produto ligadas na amostra com base na referida detecção para identificar a presença de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo sequências nucleotídicas alvo diferindo das sequências nucleotídicas em outras moléculas de ácido nucleico na amostra por um ou mais nucleotídeos, um ou mais números de cópias, uma ou mais sequências de transcrito, e/ou um ou mais resíduos metilados.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender ainda: colocar a amostra em contato com pelo menos uma primeira enzima sensível à metilação para formar uma mistura de reação de enzima de restrição antes da, ou concomitantemente com, referida mistura para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase, onde a referida primeira enzima sensível à metilação cliva moléculas de ácido nucleico na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados em pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzimas sensíveis à metilação, e com isso a referida detecção envolve a detecção de uma ou mais moléculas de ácido nucleico contendo a sequência nucleotídica alvo, onde as referidas moléculas de ácido nucleico originalmente continham um ou mais resíduos metilados.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador oligonucleotídico primário compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma região da sequência nucleotídica alvo que fica a montante do um ou mais resíduos metilados e o segundo iniciador oligonucleotídico primário compreende uma sequência nucleotídica que é a mesma que uma região da sequência nucleotídica alvo que fica a jusante do um ou mais resíduos metilados.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender ainda: submeter a mistura de reação de enzima de restrição a um tratamento com bissulfito em condições adequadas para converter resíduos citosina não metilados em resíduos uracil antes da referida mistura para formar uma mistura de reação em cadeia da polimerase, onde o primeiro iniciador oligonucleotídico primário do conjunto de iniciadores nucleotídicos primários oferecido compreende uma sequência nucleotídica que é complementar à sequência nucletídica alvo tratada com bissulfito contendo o um ou mais sítios de restrição não clivados metilados e o segundo iniciador oligonucleotídico primário do conjunto de iniciadores nucleotídicos primários oferecido compreende uma sequência nucleotídica que é complementar a uma porção do produto de extensão formado a partir do primeiro iniciador oligonucleotídico.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender ainda: oferecer uma ou mais segundas enzimas sensíveis à metilação que clivam moléculas de ácido nucleico contendo resíduos não metilados em uma sequência de reconhecimento de enzimas sensíveis à metilação; e misturar pelo menos uma segunda enzima sensível à metilação com a mistura de reação em cadeia da polimerase compreendendo a mistura de reação de enzima de restrição tratada com bissulfito para formar uma segunda mistura de reação de enzima de restrição, onde a referida segunda enzima sensível à metilação cliva moléculas de ácido nucleico potencialmente presentes na amostra que contêm um ou mais resíduos não metilados em pelo menos uma sequência de reconhecimento de enzimas sensíveis à metilação durante o referido tratamento de hibridização.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos primários do conjunto de iniciadores oligonucleotídicos primários têm uma porção 3’ compreendendo um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável e um grupo bloqueador, de modo que a extremidade 3’ do referido iniciador ou iniciadores é inadequado para extensão da polimerase, que compreende ainda: clivar nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável de um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos durante o referido tratamento de hibridização, dessa forma liberando as extremidades 3’OH livres em um ou ambos iniciadores oligonucleotídicos antes do referido tratamento de extensão.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o primeiro iniciador oligonucleotídico primário do conjunto de iniciadores oligonucleotídicos primários compreende uma porção 5’ tendo uma sequência nucleotídica que é a mesma que uma porção de sequência nucleotídica em uma sequência alvo não metilada tratada com bissulfito para a qual o iniciador oligonucleotídico primário hibridiza, mas tem uma ou mais incompatibilidades de sequência nucleotídica com uma porção de sequência nucleotídica correspondente na sequência alvo metilada tratada com bissulfito.
9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda; fornecer um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores capazes de hibridizar para uma região da sequência nucleotídica alvo tratada com bissulfito contendo resíduos não metilados; e colocar a mistura de reação em cadeia da polimerase contendo a mistura de reação de enzima de restrição tratada com bissulfito em contato com os referidos um ou oligonucleotídeos bloqueadores antes da referida submissão, onde os referidos um ou mais oligonucleotídeos bloqueadores hibridizam para sequências aminoacídicas alvo tratadas com bissulfito complementares durante o referido tratamento de hibridização e impedem a extensão do iniciador oligonucleotídico primário durante o referido tratamento de extensão.
10. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos do conjunto de iniciadores oligonucleotídicos primários têm uma porção 3’ compreendendo um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável e um grupo bloqueador, de modo que a extremidade 3’ do referido iniciador ou iniciadores é inadequada para extensão da polimerase, que compreende ainda: clivar o nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável de um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos durante o referido tratamento de hibridização, dessa forma liberando as extremidades 3’OH livres em um ou ambos os iniciadores oligonucleotídicos antes do referido tratamento de extensão.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda sonda oligonucleotídica do conjunto de sondas oligonucleotídicas compreende ainda uma porção de detecção unitaq, formando assim sequências de produto ligadas compreendendo a porção 5’ iniciador-específica, as porções alvo-específicas, a porção de detecção unitaq, e a porção 3’ iniciador-específica, que compreende ainda: fornecer uma ou mais sondas de detecção unitaq, onde cada sonda de detecção unitaq hibridiza para uma porção de detecção unitaq complementar e referida sonda de detecção compreende uma molécula extintora e um marcador detectável que estão separados um do outro; adicionar uma ou mais sondas de detecção unitaq à segunda mistura de reação em cadeia da polimerase; e hibridizar a uma ou mais sondas de detecção unitaq para porções de detecção unitaq complementares na sequência de produto ligada ou no complemento da mesma durante a referida submissão da segunda mistura de reação em cadeia da polimerase em condições adequadas para um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase, e com isso a molécula extintora e o marcador detectável são clivados a partir de uma ou mais sondas de detecção unitaq durante o tratamento de extensão, e com isso a referida detecção envolve a detecção do marcador detectável clivado.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda: fornecer uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas, onde cada sonda de detecção oligonucleotídica hibridiza para uma porção de junção do produto de ligação ou seu complemento, e a referida sonda de detecção compreende uma molécula extintora e um marcador detectável que estão separados um do outro; adicionar a uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas à segunda mistura de reação em cadeia da polimerase; e hibridizar a uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas para porções de detecção complementares na sequência de produto ligada ou no complemento da mesma durante a referida submissão da segunda mistura de reação em cadeia da polimerase em condições adequadas para um ou mais ciclos de reação em cadeia da polimerase, e com isso a molécula extintora e o marcador detectável são clivados a partir da uma ou mais sondas de detecção oligonucleotídicas durante o referido tratamento de extensão, e com isso a referida detecção envolve a detecção do marcador detectável clivado.
13. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender ainda: imobilizar pelo menos uma fita de cada produto de extensão primário sobre um suporte sólido antes ou depois da referida ligação, onde a referida sequência do produto ligado é hibridizada para o produto de extensão primário imobilizado; e remover as sondas oligonucleotídicas não ligadas e os produtos de ligação não-alvo-específicos da amostra depois da referida ligação; e desnaturar a sequência do produto de ligação do produto de extensão primário imobilizado antes da referida hibridização.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a porção 3’ da primeira sonda oligonucleotídica do conjunto de sondas oligonucleotídicas compreende um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável e um grupo bloqueador, de modo que a extremidade 3’ é inadequada para extensão ou ligação da polimerase, e que compreende ainda: clivar o nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo clivável da primeira sonda oligonucleotídica quando a referida sonda for hibridizada para sua sequência nucleotídica alvo complementar do produto de extensão primário, dessa forma liberando uma 3’OH na primeira sonda oligonucleotídica antes da referida ligação.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a segunda sonda oligonucleotídica tem, em sua extremidade 5’, um nucleotídeo idêntico sobreposto com a extremidade 3’ da primeira sonda oligonucleotídica, e, com a hibridização das primeira e segunda sondas oligonucleotídicas de uma conjunto de sondas em posições adjacentes em uma sequência nucleotídica alvo complementar de um produto de extensão primário para formar uma junção, o nucleotídeo idêntico sobreposto da segunda sonda oligonucleotídica forma um retalho na junção com a primeira sonda oligonucleotídica, que compreende ainda:clivar o nucleotídeo idêntico sobreposto da segunda sonda oligonucleotídica com uma enzima tendo atividade de 5’ nuclease dessa forma liberando um fosfato na extremidade 5’ da segunda sonda oligonucleotídica antes da referida ligação.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o um ou mais conjuntos de sondas oligonucleotídicas compreendem ainda uma terceira sonda oligonucleotídica tendo uma porção alvo-específica, onde as segunda e terceira sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sondas são configuradas para hibridizar adjacentes uma à outra na sequência nucleotídica alvo com uma junção entre elas para permitir a ligação entre as segunda e terceira sondas oligonucleotídicas para formar uma sequência de produto ligado compreendendo as primeira, segunda, e terceira sondas oligonucleotídicas de um conjunto de sondas.
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