CN107002145A - 用于使用针对遗留预防的组合核酸酶、连接反应和聚合酶反应鉴定和相对定量核酸序列表达、剪接变体、易位、拷贝数或甲基化变化的方法 - Google Patents

用于使用针对遗留预防的组合核酸酶、连接反应和聚合酶反应鉴定和相对定量核酸序列表达、剪接变体、易位、拷贝数或甲基化变化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于鉴定和定量的方法和装置，包括低丰度的核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基。

Description

用于使用针对遗留预防的组合核酸酶、连接反应和聚合酶反 应鉴定和相对定量核酸序列表达、剪接变体、易位、拷贝数或 甲基化变化的方法
本申请要求2014年10月8日提交的美国临时专利申请序列号62/061,376和2015年1月15日提交的美国临时专利申请序列号62/103,894的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于使用针对遗留预防(carryover prevention)的组合核酸酶、连接和聚合酶反应鉴定和定量核酸序列、表达、剪接变体、易位、拷贝数和/或甲基化变化的方法。
发明背景
血液将氧、营养物和生理信号携带至身体中的每个细胞，同时提供对抗外面病原体的免疫性和保护。但是同样地，血液散布营养的能力也允许疾病传播，正是癌细胞转移至肝脏、埃博拉病毒破坏毛细管、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)液化菌肉或HIV躲避旨在消除感染的特有CD4细胞内的检测。
与通过血液的散布相似，病原体和癌症的普遍性倾向也产生鉴定和早期检测的机会-允许医师更好地治疗患者和管理患者护理。AIDS治疗的发展与核酸诊断的改进齐头并进，从初始的反转录PCR测定，用于保护国家的血供给，到对耐药性变体测序，再到RT-PCR定量病毒载量，用于确定随时间推移的治疗效力。迄今为止，尚未治愈那些受感染的，但是精细的诊断工具已指导治疗决策、流行病学决策和政治决策来遏制这种全球性的传染病。
癌症在发达国家中是主要的致死原因，并且在发展中国家中是第二大致死原因。现在癌症在世界范围内已变成死亡的最大原因，在2012年估计820万例死于癌症。在今后的二十年内，预测世界范围内的癌症病例增加75％并且达到接近2500万例。由世界卫生组织进行的最近报告推断出：“抗癌的全球战通过单一治疗将无法取胜。迫切需要有效的预防措施来预防癌症危机”。在血液中检测早期癌症是最佳的有效预防手段。此举将通过实现较早且较佳的治疗挽救生命并且减少癌症护理费用。
来自癌症患者的血浆或血清含有从经历异常生理过程的癌细胞释放的核酸。这些核酸已展示出诊断效用(Diaz和Bardelli，J Clin Oncol 32：579-586(2014)；Bettegowda等Sci Transl Med 6：224(2014)；Newman等，Nat Med 20：548-554(2014)；Thierry等，NatMed 20：430-435(2014))。核酸的另一来源是在循环肿瘤细胞(CTC)内，但是早期阶段和大部分的局部肿瘤放出每ml非常少的CTC至没有CTC。正常的血浆或血清含有从经历正常生理过程(即，外来体分泌、细胞凋亡)的正常细胞释放的核酸。在应激、炎症、感染或损伤的条件下可存在另外的核酸释放。
开发可靠的诊断和筛选测试的挑战是相对于由正常组织产生的相同标志物的存在(其将导致假阳性信号)区分由肿瘤产生的指示疾病(例如早期癌症)的那些标志物。在测定具有特异性和灵敏度的情况下还需要平衡检查的标志物数目和测试费用。由癌症基因组图谱计划联盟(The Cancer Genome Atlas Consortium，TCGA)对成千上万的肿瘤进行的综合分子概况分析(mRNA、甲基化、拷贝数、miRNA、突变)已揭示结肠直肠肿瘤因其来自乳腺癌、前列腺癌(prostrate)或其他上皮癌而彼此不同(TCGA“Comprehensive MolecularCharacterization of Human Colon and Rectal Cancer Nature 487：330-337(2014))。此外，它们共有的少数标志物(例如KRAS突变)也存在于多种癌症类型中，妨碍了准确定位起源组织的能力。对于早期癌症检测，核酸测定应主要充当筛选工具，需要可获得二次诊断性随访(例如结肠直肠癌的结肠镜检查)。
可靠定量来自非常少数的初始细胞(即来自CTC)的突变、启动子甲基化或DNA或RNA拷贝数的需要，或者当癌症信号来自血液中的无细胞DNA(cfDNA)并且通过由正常细胞产生或在样品处理过程中无意地从正常血细胞释放的过量核酸稀释时使生物学问题更加复杂(Mateo等，Genome Biol 15：448(2014))。
同样地，当使用基于核酸的技术直接在血液中检测感染性疾病时遇到鉴定稀有靶标的类似问题。简而言之，病原体可以1或更小的集落形成单位(cfu)/ml存在并且/或者存在负责毒性或耐药性的许多潜在病原体和序列变异。虽然这些问题用癌症例证，但是应认识到所述解决方案同样适用于感染性疾病。
连续的诊断需要要求连续的诊断测试。
当前大多数的对癌症的分子诊断工作集中于：(i)预后和预测基因组学，例如鉴定癌症易感性基因诸如BrCA1、BrCA2的遗传性突变(Ford等Am J Hum Genet 62：676-689(1998))(ii)个性化治疗，例如EGFR基因的突变，指导个体化用药(Sequist和Lynch，AnnRev Med，59：429-442(2008)，以及(iii)复发监测，例如检测到对药物治疗产生了抗性的患者中出现KRAS突变(Hiley等，Genome Biol 15：453(2014)；Amado等，J Clin Oncol 26：1626-1634(2008))。然而，这在癌症分子诊断学连续统中错失了较多良机：(i)更频繁筛选具有家族史的那些患者，(ii)筛选用于检测早期疾病，以及(iii)监测治疗效力。为了解决这三个未满足的需要，本文提出了用于基于血液的检测的一种新的度量，其被称为“癌症标志物载量”，与病毒载量类似。
DNA测序提供了区分与疾病相关联的所有核酸变化的根本能力。然而，所述方法仍需要多个前期(up-front)样品和模板制备，并且未必是成本有效的。DNA微阵列可提供关于多个序列变体的大量信息，诸如SNP或不同的RNA表达水平，并且比测序花费较少；然而其不太适合用于获得高度定量的结果，也不适合用于检测低丰度突变。另一方面是TaqManTM反应，其提供对已知基因的实时定量，但不太适合用于区分多个序列变体或低丰度突变。
关键的是使每个未满足的诊断需要与适当的诊断测试匹配-将以低成本实现高灵敏度(即假阴性少)和高特异性(即假阳性少)的不同目标相结合。例如，与针对药物应答已被编录(Jia等Genome Res 23：1434-1445(2013))的超过180种已知突变设计TaqManTM探针相比，对来自肿瘤活检的EGFR外显子直接测序以确定用于非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗明显是更准确的并且成本更有效。用于检测点突变的最灵敏的技术BEAMing(Dressman等，Proc Natl Acad Sci USA 100：8817-8822(2003))依赖于所寻找的突变的先前知识，并且由此最适合用于监测疾病复发，而不适合用于早期检测。同样地，相对于对1ml血液中的整个基因组DNA(900万个细胞x3GB＝2700万Gb原始数据)进行测序，用于在用Gleevec(Jabbour等，Cancer 112：2112-2118(2008))治疗CML患者时监测Bcr-Ab1易位的血液水平的简单定量反转录PCR测定是更优选的。
对从NSCLC患者分离的无细胞DNA(cfDNA)中的每个使用2.1Gb测序以对125kb靶向DNA提供10,000倍覆盖度(Kandoth等Nature 502：333-339(2013))。这种方法正确鉴定了存在于匹配肿瘤中的突变，但是仅覆盖了50％的1期肿瘤。所述方法具有用于NSCLC的前景，其中样品平均为5至20个突变/Mb，然而，对于其他癌症诸如乳腺癌和卵巢癌不是成本有效的，平均小于1至2个突变/Mb。当前为高度精确的靶向深度测序所需的前期连接、扩增和/或捕获步骤仍比多重PCR-TaqManTM或PCR-LDR测定更复杂。
对考虑肿瘤异质性、肿瘤簇和生物/技术假阳性(在3％至10％/单个标志物的范围内)的超过600个结肠直肠癌样品的综合的数据分析表明用于结肠直肠癌的最佳早期检测筛选要求在24个测试标志物中有至少5至6个阳性标志物(Bacolod等，.Cancer Res 69：723-727(2009)；Tsafrir等Cancer Res 66：2129-2137(2006)；Weinstein等，Nat Genet45：1113-1120(2013)；Navin N.E.Genome Biol 15：452(2014)；Hiley等，Genome Biol 15：453(2014))；Esserman等Lancet Oncol 15：e234-242(2014))。此外，标志物分布移动到不同的肿瘤进化枝中，例如，一些肿瘤被严重地甲基化，而其他肿瘤几乎没有被甲基化并且与相邻组织的年龄相关性甲基化不能区分。因此，需要使用突变、甲基化、miRNA、mRNA、拷贝变化、可变剪接或易位标志物中的3-5组的组合的多维方法对所有不同的肿瘤进化枝获得足够的覆盖度。与非侵入性产前筛查染色体三体性类似，基于对cfDNA的测序或对cfDNA的随机片段进行连接检测(Benn等，Ultrasound Obstet Gynecol.42(1)：15-33(2013)；Chiu等，Proc Natl Acad Sci USA 105：20458-20463(2008)；Juneau等，Fetal Diagn Ther.36(4)(2014))，癌症筛选中评分的实际标志物仅次于血浆中精确定量的那些阳性标志物。
癌症诊断性测试发展的技术挑战。
旨在查找非常稀有或低丰度的突变序列的诊断性测试面临产生自以下的潜在假阳性信号：(i)复制野生型靶标中的聚合酶错误，(ii)DNA测序错误，(iii)对野生型靶标的误连接，(iii)不依赖靶标的PCR产物，以及(iv)由先前阳性样品引起的PCR产物的遗留污染。筛选癌症时的阳性测试结果的深远临床意义需要这种测试使用可能几乎消除假阳性的所有手段。
对核酸检测概念重要的是选择性扩增或纯化所需癌症特异性标志物与正常细胞相同或非常相似的标志物分离。这些方法包括：(i)用于正交扩增和检测的多个引物结合区，(ii)CTC或外来体的亲和力选择，以及(iii)样品的空间稀释。
先前已证明PCR-LDR的成功，其使用4个引物结合区来确保灵敏度和特异性。使用PCR引物对或甚至PCR引物串联对扩增所需区，接着使用正交嵌套式LDR引物对扩增以供检测。使用PCR-LDR的一个优点是能够进行多个片段的成比例的PCR扩增以富集低拷贝靶标，然后使用定量LDR直接鉴定癌症特异性突变。Biofire/bioMerieux已开发了类似技术，称为“膜阵列”，其中初始的多重PCR反应产物重新分布到单个孔中，然后进行伴随有SYBR绿色染料检测的嵌套式实时PCR。
已经展示了使用抗体或适体捕获进行的CTC亲和纯化(Adams等，J Am Chem Soc130：8633-8641(2008)；Dharmasiri等，Electrophoresis 30：3289-3300(2009)；Soper等Biosens Bioelectron 21：1932-1942(2006))。在文献中已报道对外来体的肽亲和力捕获。富集来自血液的这些肿瘤特异性部分能够实现拷贝数定量并且简化筛选和验证测定。
在数字PCR中采用了最后的方法即样品的空间稀释，并且与其类似的方法被称为BEAMing(Vogelstein和Kinzler，Proc Natl Acad Sci USA.96(16)：9236-41(1999)；Dressman等，Proc Natl Acad Sci USA 100：8817-8822(2003))。数字PCR的合理性是克服了在样品包含含有1,000至10,000倍过量的野生型DNA的已知突变的非常少的靶分子时的酶区分能力的限制。通过将输入DNA稀释为20,000或更多个微滴或珠粒以每个微滴分布有少于一个靶分子，DNA可以通过PCR扩增，然后通过探针杂交或TaqManTM反应检测，本质上给予0/1数字评分。目前所述方法对于在血浆中查找点突变是最灵敏的，但是其确实需要被评分的突变的先前知识以及针对每个突变的单独数字稀释，这将耗尽整个样品来仅对几个突变进行评分。
实时PCR和微流体仪器
已设计了许多PCR测定/微制作装置用于快速检测病原体和疾病相关易位和突变。每种测定/硬件组合具有特定的强项，但是当与癌症检测所需的多维且多重标志物的实际问题结合时，PCR-LDR与微流体的灵活性提供了某些优点。
需要仪器、测定设计和微流体构造无缝地集成。一些PCR仪器使用实时荧光或终点荧光来通过使室、孔或微滴循环通过不同的温度来定量初始模板分子。其他仪器还包括用于实时PCR检测的可寻址的微流体板。然而，仪器和消耗品的高成本限制了这些机器在临床应用中的广泛使用。
在不同的构造(称为连续流式PCR)中，反应混合物移动穿过整齐地布置成辐射体图案的通道，并且流过在固定温度下的加热元件。这种构造允许整个扩增反应在几分钟内完成并且对于毛细管分离和读出是理想的。对于连接酶检测反应，可通过利用LDR-FRET或电子检测实现读出。在LDR-FRET中，一种引物具有供体，另一种具有受体基团，并且在连接后它们形成发夹。这允许计数单一连接事件以获得输入DNA拷贝数的高定量读出。另选地，通过在每种引物上附加金纳米粒子，连接产物将含有两种纳米粒子并且可使用电子读出来区分它们。
在考虑各种自动化程度的情况下，本文所述的方法由“模块性”和“可扩缩性”的原理指导。首先，所述方法应分成模块化步骤，所述模块化步骤可最初在单独的仪器上优化。例如，所述装置可由用于纯化来自血浆cfDNA的DNA和来自外来体的RNA的第一模块、用于多重反转录和/或有限扩增各种靶标的第二模块，以及用于产生和检测连接产物的第三模块。这种模块构造允许切换跟上技术发展的改进模块。对于运行的模块性方法，关键的是来自一个模块的产物可无缝移动到下一个模块中，而没有泄露且没有遗留污染的担心。
第二，模块化设计应易于以低成本大量进行可扩缩制造。必需考虑制造成本和如何将引物/试剂/样品沉积到装置中。
本发明旨在克服本领域中的这些和其他不足。
发明概述
本发明的第一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。所述方法包括提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将所接触的样品与一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。所述方法还包括将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)具有靶核苷酸序列特异性部分的第一寡核苷酸探针和(b)具有靶核苷酸序列特异性部分的第二寡核苷酸探针，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于样品中其他核酸分子中的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。所述方法包括提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列。所述方法还包括提供能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；以及提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将样品与一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物。使聚合酶链式反应混合物经历适于消化聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。所述方法还包括将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’引物特异性部分。探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上。使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’引物特异性部分、靶特异性部分和3’引物特异性部分。所述方法还包括提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；以及将连接产物序列、一个或多个二级寡核苷酸引物组、能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物。使第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。所述方法还包括提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列；提供能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；以及提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。所述方法还包括将样品与一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物。使聚合酶链式反应混合物经历适于消化聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针的5’部分与第二寡核苷酸探针的3’部分的一部分互补，其中探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上。所述方法还包括使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’部分、靶特异性部分、3’部分和产生可检测信号的部分。连接产物序列的5’部分与其互补的3’部分杂交，并且检测在所述杂交后产生的来自产生可检测信号的部分的信号。基于所述检测区分样品中的连接产物序列以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。所述方法包括提供潜在含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子包含因一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触。所述方法还包括使样品与一种或多种甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中一种或多种甲基化敏感性酶裂解样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。提供了一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列。将限制性酶反应混合物与一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成一级聚合酶链式反应混合物。所述方法还包括使一级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。提供了一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括能够与一级延伸产物杂交的第一嵌套式寡核苷酸引物和第二嵌套式寡核苷酸引物将一级延伸产物与一个或多个二级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成二级聚合酶链式反应混合物，并且使二级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有因一个或多个甲基化残基而不同于样品中的其他核酸分子的核苷酸序列的靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述靶核苷酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子潜在含有不同于其他核糖核酸分子的序列；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与一个或多个靶核糖核酸分子互补。将所接触的样品与一种或多种寡核苷酸引物和反转录酶共混以形成反转录混合物，并且在反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。每个cDNA分子包含与靶核糖核酸分子序列互补的核苷酸序列并且含有dU。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近cDNA的靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将含有cDNA分子的反转录混合物与一个或多个寡核苷酸引物组和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸探针组。每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶核糖核酸分子序列的互补部分上。使一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物，并且将一个或多个寡核苷酸探针组的第一探针和第二探针连接在一起以在连接酶反应混合物中形成连接产物序列。对样品中的连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个靶核糖核酸分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述一个或多个靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与一个或多个靶核糖核酸分子互补，并且将所接触的样品与一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物。在反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与靶核糖核酸分子互补并且含有dU的核苷酸序列。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近cDNA的靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将含有cDNA分子的反转录混合物与一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分和3’引物特异性部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶核糖核酸分子序列的互补部分上。使一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物，并且使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一探针和第二探针连接在一起以在连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’引物特异性部分、靶特异性部分和3’引物特异性部分。所述方法还包括提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物其包含与连接产物序列的3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；以及将连接产物序列、一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物。使第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述一个或多个靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。所述方法还包括提供一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与一个或多个靶核糖核酸分子互补，以及将所接触的样品、一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物。在反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与靶核糖核酸分子序列互补并且含有dU的核苷酸序列。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近cDNA的靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将含有cDNA分子的反转录混合物与一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针的5’部分与第二寡核苷酸探针的3’部分的一部分互补，其中探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶核糖核酸分子序列的互补部分上。使一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物，并且使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一探针和第二探针连接在一起以在连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’部分、靶特异性部分、3’部分和产生可检测信号的部分。连接产物序列的5’部分与其互补的3’部分杂交，并且检测在所述杂交后产生的来自产生可检测信号的部分的信号。基于所述检测对样品中的连接产物序列进行检测，以鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与第二寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将所接触的样品与引物组的一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物。第一寡核苷酸引物与靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且反转录酶使杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含靶miRNA分子序列的互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物。所述方法还包括将反转录反应混合物与引物组的第二寡核苷酸引物、第三寡核苷酸引物和第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与延伸的第一寡核苷酸引物的包含靶miRNA分子序列的互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物。所述方法还包括将多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分和与一级延伸产物互补的部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分，和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与第二寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将所接触的样品与引物组的一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中第一寡核苷酸引物与靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且反转录酶使杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含靶miRNA分子序列的互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物。将反转录反应混合物与引物组的第二寡核苷酸引物、第三寡核苷酸引物和第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与延伸的第一寡核苷酸引物的包含靶miRNA分子序列的互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物。将多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’引物特异性部分、靶特异性部分和3’引物特异性部分。所述方法还包括提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；以及将连接产物序列、一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物。使第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分，和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与第二寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将所接触的样品与引物组的一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中第一寡核苷酸引物与靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且反转录酶使杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含靶miRNA分子序列的互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物。将反转录反应混合物与引物组的第二寡核苷酸引物、第三寡核苷酸引物和第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与延伸的第一寡核苷酸引物的包含靶miRNA分子序列的互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。所述方法还包括使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物。将多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针的5’部分与第二寡核苷酸探针的3’部分的一部分互补，其中探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’部分、靶特异性部分、3’部分和产生可检测信号的部分。连接产物序列的5’部分与其互补的3’部分杂交，并且检测在所述杂交后产生的来自产生可检测信号的部分的信号。基于所述检测区分样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。将所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应。所述方法还包括将靶miRNA分子序列在其3’端处连接至第一寡核苷酸探针的5’磷酸以产生包含附加至第一寡核苷酸探针的靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子。提供了一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸探针的内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将嵌合核酸分子与一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与嵌合核酸分子的内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸以产生嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列。所述方法还包括将反转录反应混合物与引物组的第一寡核苷酸引物和第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一级延伸产物。一级延伸产物包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列。将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有靶序列特异性部分和与一级延伸产物互补的部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。将所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应，并且将靶miRNA分子序列在其3’端处连接至第一寡核苷酸探针的5’磷酸以产生包含附加至第一寡核苷酸探针的靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸探针的内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将嵌合核酸分子与一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与嵌合核酸分子的内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸以产生嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列。将反转录反应混合物与引物组的第一寡核苷酸引物和第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’引物特异性部分、靶特异性部分和3’引物特异性部分。所述方法还包括提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与连接产物序列的3’引物特异性部分互补的核苷酸序列。将连接产物序列与一个或多个二级寡核苷酸引物组、能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物。使第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。将所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应。将靶miRNA分子序列在其3’端处连接至第一寡核苷酸探针的5’磷酸以产生包含附加至第一寡核苷酸探针的靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸探针的内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将嵌合核酸分子与一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与嵌合核酸分子的内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸以产生嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列。将反转录反应混合物与引物组的第一寡核苷酸引物和第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含5’引物特异性部分、对应于靶miRNA分子序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中探针组的第一寡核苷酸探针的5’部分与第二寡核苷酸探针的3’部分的一部分互补，其中探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于靶miRNA分子序列的互补部分上。使连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含5’部分、靶特异性部分、3’部分和产生可检测信号的部分。连接产物序列的5’部分与其互补的3’部分杂交，并且检测在所述杂交后产生的来自产生可检测信号的部分的信号。基于所述检测区分样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
本发明的另一方面涉及用于向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔同时添加液体的装置。所述装置具有相对的顶部表面和底部表面，其中顶部表面具有通向孔的开口并且底部表面限定了孔的闭合端。所述装置包括由第一边界和第二边界限定的第一层，其中计量室在所述第一层的第一边界与第二边界之间延伸并且彼此流体连通。第一层被构造成在操作位置中装配成接近微量滴定板，其中第一层的第一边界最靠近微量滴定板的顶部表面并且每个计量室与微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通。第一层还包括填充室，所述填充室与一个或多个计量室流体连通。所述装置包括由第一边界和第二边界限定的第二层，其中填充口在第二层的第一边界与第二边界之间延伸。第二层被构造成在操作位置中装配在第一层上，其中第二层的第一边界与第一层的第二边界相邻并且填充口与填充室对准。当第一层、第二层和微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过填充口进入装置的液体将穿过输入室、计量室并且进入微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
本发明的另一方面涉及向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔添加液体的方法，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中顶部表面具有通向孔的开口并且底部表面限定了孔的闭合端。所述方法包括提供装置，所述装置包括具有第一边界和第二边界的第一层，其中计量室在第一层的第一边界与第二边界之间延伸并且彼此流体连通。所述装置的第一层被构造成在操作位置中装配成接近微量滴定板，其中第一层的第一边界最靠近微量滴定板的顶部表面并且一个计量室与微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通。第一层还包括填充室，所述填充室与一个或多个所述计量室流体连通。所述装置包括具有第一边界和第二边界的第二层，其中填充口在第二层的第一边界与第二边界之间延伸。第二层被构造成在操作位置中装配在第一层上，其中第二层的第一边界与第一层的第二边界相邻并且填充口与装料室对准。当第一层、第二层和微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过填充口进入装置的液体将穿过填充室、计量室并且进入所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。所述方法还包括用液体填充装置，以及将装置中的液体排放到所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔。
本发明描述了用于使用核酸酶、连接酶和聚合酶反应检测靶核酸分子的突变、表达、剪接变体、易位、拷贝数和/或甲基化变化的多种方法。本发明解决了遗留预防问题并且实现空间多路复用法来提供类似于数字PCR的相对定量。这种技术可用于由血浆或血清样品非侵入性地早期检测癌症、非侵入性地预后癌症以及监测癌症复发。
附图简述
图1示出用于基于患者血液样品分析的早期检测泛癌测试(pan cancer test)的条件逻辑树。
图2示出用于分析来自血浆cfDNA、外来体和CTC的DNA、mRNA和miRNA的工作流程。
图3示出通过一个样品的分布对DNA、mRNA或miRNA的广义分析，所述样品初始已被稀释并分布在24个管中以进行多重PCR或反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图4示出在图3的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图5示出由图4的微量滴定板上的每个孔的实时检测产生的假设信号模式。
图6示出用于分析来自血浆cfDNA或CTC的DNA的工作流程。
图7示出通过一个样品的分布对DNA的分析，所述样品初始已被稀释并分布在24个管中以进行多重PCR或反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图8示出在图7的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图9示出由图8的微量滴定板上的每个孔的实时检测产生的假设信号模式。
图10示出用于分析来自血浆外来体的mRNA或miRNA的工作流程并且示出用于分析来自血浆cfDNA、外来体和CTC的DNA、mRNA和miRNA的工作流程。
图11示出通过一个样品的分布对mRNA或miRNA的分析，所述样品初始已被系列稀释到24个管中以进行多重反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图12示出在图11的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图13示出由图12的微量滴定板上的每个孔的实时检测产生的假设信号模式。
图14示出用于通过一个样品的分布广义分析DNA、mRNA或miRNA的工作流程，所述样品初始已被稀释在24个管中以进行多重PCR或反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR，以进行链霉亲和素介导的捕获。
图15示出通过24个样品的分布对DNA、mRNA或miRNA的广义分析，所述样品初始已被稀释并分布在24个管中以进行多重PCR或反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图16示出对图15的微量滴定板孔中的生物素酰化的PCR或RT-PCR扩增子的链霉亲和素介导的捕获。
图17示出在图16的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图18示出由图17的微量滴定板上的每个孔的实时LDR-FRET检测产生的假设信号模式。
图19示出用于通过一个样品的分布分析DNA的工作流程，所述样品初始已被稀释在24个管中以进行多重PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR，以进行链霉亲和素介导的捕获。
图20示出通过24个样品的分布对DNA的分析，所述样品初始已被稀释并分布在24个管中以进行多重PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图21示出对图20的微量滴定板孔中的生物素酰化的PCR或RT-PCR扩增子的链霉亲和素介导的捕获。
图22示出在图21的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图23示出由图22的微量滴定板上的每个孔的实时LDR-FRET检测产生的假设信号模式。
图24示出用于通过一个样品的分布分析mRNA和miRNA的工作流程，所述样品初始已被稀释在24个管中以进行多重PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR，以进行链霉亲和素介导的捕获。
图25示出通过一个样品的分布对mRNA或miRNA的分析，所述样品初始已被系列稀释到24个管中以进行多重反转录PCR，之后在微量滴定板的24x16行中使用标记探针进行LDR。
图26示出对图25的微量滴定板孔中的RT-PCR扩增子的链霉亲和素介导的捕获。
图27示出在图26的微量滴定板的24列上对16种不同的标签引物组的添加。
图28示出由图27的微量滴定板上的每个孔的实时LDR-FRET检测产生的假设信号模式。
图29示出对分布在24个孔中的6至48个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图30示出对分布在24个孔中的12至96个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图31示出对分布在48个孔中的12至96个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图32示出对分布在48个孔中的24至192个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图33示出对分布在8个孔中的1至8个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图34示出对分布在8个孔中的2至16个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图35示出对分布在8个孔中的4至32个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图36示出对分布在8个孔中的8至64个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图37示出对分布在8个孔中的16至128个分子的泊松分布的模拟。上面是起始分子数相对于分子数/孔的表格形式。下面是#分子(x)相对于#孔(y)的直方图。
图38示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应(carryover prevention reaction)。
图39示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-qLDR遗留预防反应。
图40示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图41示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图42示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-qLDR遗留预防反应。
图43示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-qLDR遗留预防反应。
图44示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量靶标和/或突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图45示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图46示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图47示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-qLDR遗留预防反应。
图48示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的核酸酶-连接-PCR-qPCR遗留预防反应。
图49示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的核酸酶-连接-PCR-qPCR遗留预防反应。
图50示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图51示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图52示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-qLDR遗留预防反应。
图53示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量靶甲基化的PCR-qPCR遗留预防反应。
图54示出对用于鉴定或相对定量mRNA水平下的易位的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。
图55示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量mRNA水平下的易位的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图56示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量mRNA水平下的易位的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图57示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量mRNA水平下的易位的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图58示出对用于鉴定或相对定量可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。
图59示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图60示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图61示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图62示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图63示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图64示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图65示出对用于鉴定或相对定量可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。
图66示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量野生型和可变转录物起始位点的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图67示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量野生型和可变转录物起始位点的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图68示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量野生型和可变转录物起始位点的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图69示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量低水平的可变转录物起始位点的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图70示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量低水平的可变转录物起始位点的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图71示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量低水平的可变转录物起始位点的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图72示出对用于鉴定或相对定量外显子缺失的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。
图73示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图74示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图75示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图76示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图77示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图78示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(外显子缺失)的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图79示出对用于鉴定或相对定量内含子插入的可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。
图80示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图81示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图82示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量野生型和可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图83示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图84示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图85示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量低水平的可变剪接(内含子插入)的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图86示出使用Taqman检测用于计数DNA拷贝数的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图87示出使用UniTaq检测用于计数DNA拷贝数的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图88示出使用FRET检测用于计数DNA拷贝数的PCR-qLDR遗留预防反应。
图89示出使用Taqman检测用于计数RNA拷贝数的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图90示出使用UniTaq检测用于计数RNA拷贝数的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图91示出使用FRET检测用于计数RNA拷贝数的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图92示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量miRNA的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图93示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量miRNA的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图94示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量miRNA的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图95示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图96示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图97示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图98示出使用Taqman检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图99示出使用UniTaq检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图100示出使用FRET检测用于鉴定或相对定量miRNA的连接-RT-PCR-qLDR遗留预防反应。
图101示出一种型式的可商购获得的384孔微量滴定板的尺寸。
图102示出另一种型式的可商购获得的384孔微量滴定板的尺寸。
图103示出典型的384孔微量滴定板构型的顶视图和侧视图。
图104示出典型的384孔微量滴定板构型的透视图。
图105示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的中间层的顶视图和侧视图。
图106示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的中间层的分解透视图。
图107示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图108示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第一层和中间层的分解透视图。
图109示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图110示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图111示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图112示出定位在微量滴定板的若干个孔之上的样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图113示出样品分散装置的第一层和中间层的顶视图和侧视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图114示出样品分散装置的第一层和中间层的分解透视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图115示出样品分散装置的第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图116示出样品分散装置的第三层、第一层和中间层的分解透视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图117示出样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图118示出样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的分解透视图，所述样品分散装置使用另选的填充口来压力填充微量滴定板的每行的通道和计量室。
图119示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的中间层的顶视图和侧视图。
图120示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的中间层的分解透视图。
图121示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图122示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第一层和中间层的分解透视图。
图123示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图124示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图125示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第二层、第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图126示出独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的出口侧的第二层、第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图127示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的中间层的顶视图和侧视图。
图128示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的中间层的分解透视图。
图129示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图130示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第一层和中间层的分解透视图。
图131示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图132示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图133示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的顶视图和侧视图。
图134示出从两侧独立寻址微量滴定板的每行的样品分散装置的第二层、第三层、第一层和中间层的分解透视图。
图135示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的中间层的顶视图和侧视图。
图136示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的中间层的分解透视图。
图137示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第一层的第一区域和中间层的顶视图和侧视图。
图138示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第一层的第一区域和中间层的分解透视图。
图139示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第一层的第一区域和第二区域和中间层的顶视图和侧视图。
图140示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第一层的第一区域和第二区域以及中间层的分解透视图。
图141示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第三层、第一层(具有第一区域和第二区域)和中间层的顶视图和侧视图。
图142示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第三层、第一层(具有第一区域和第二区域)和中间层的分解透视图。
图143示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第二层、第三层、第一层(具有第一区域和第二区域)和中间层的顶视图和侧视图。
图144示出独立寻址微量滴定板的每行和每列的样品分散装置的第二层、第三层、第一层(具有第一区域和第二区域)和中间层的分解透视图。
图145示出使用Taqman读出器(Taqman readout)用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图146示出使用UniTaq读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图147示出使用FRET读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-qLDR遗留预防反应。
图148示出使用Taqman读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图149示出使用UniTaq读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图150示出使用FRET读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的PCR-qLDR遗留预防反应。
图151示出使用Taqman读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图152示出使用UniTaq读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图153示出使用FRET读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的PCR-qLDR遗留预防反应。
图154示出使用Taqman读出器用于鉴定或相对定量低水平靶标和/或突变的环-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图155示出使用FRET读出器用于鉴定或相对定量低水平突变的环-PCR-qLDR遗留预防反应。
图156示出使用Taqman读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的环-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。
图157示出使用FRET读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的环-PCR-qLDR遗留预防反应。
图158示出使用Taqman读出器用于鉴定或相对定量低水平靶甲基化的PCR-qPCR遗留预防反应。
图159示出在用于检测过量野生型DNA中BRAF V600E突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图160示出在用于计数单分子的BRAF V600E突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图161示出在用于在来自血浆的过量野生型DNA存在下计数单分子的BRAF V600E突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图162示出在用于在过量野生型DNA存在下检测TP53 R248Q突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图163示出在用于在过量野生型DNA存在下检测TP53 R248Q突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图164示出在用于在过量野生型DNA存在下计数单分子的TP53 R248Q突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图165示出在用于在来自血浆的过量野生型DNA存在下计数单分子的TP53 R248Q突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图166示出在用于在过量野生型DNA存在下检测KRAS G12C突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图167示出在用于在过量野生型DNA存在下检测KRAS G12S突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图168示出在用于在来自血浆的过量野生型DNA存在下计数单分子的KRAS G12C突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图169示出在用于在过量野生型DNA存在下检测KRAS G12D突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图170示出在用于在过量野生型DNA存在下检测KRAS G12A突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图171示出在用于在过量野生型DNA存在下检测KRAS G12V突变的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图172示出在用于在血浆中的过量野生型DNA存在下计数单分子的KRAS G12V突变的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图173示出在用于检测波形蛋白基因甲基化的存在或不存在的PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图174示出在用于在过量未甲基化DNA(hgDNA)存在下计数单分子的甲基化DNA的像素PCR-LDR-qPCR实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图175示出在用于使用Taqman探针型式“A”检测VIM_S3顶链的甲基化的实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图176示出在用于使用Taqman探针型式“A”检测VIM S3底链的甲基化的实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图177示出在用于使用Taqman探针型式“B”检测VIM S3顶链的甲基化的实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
图178示出在用于使用Taqman探针型式“B”检测VIM S3底链的甲基化的实验中获得的实时PCR扩增曲线图。
发明详述
用于使用“疾病标志物载量”早期检测疾病的通用设计
最具成本效益的早期疾病检测测试可结合初始的多重偶联扩增和连接测定来确定“疾病载量”。对于癌症检测，此举将对所有癌症(泛肿瘤学)以＞97％特异性实现＞95％的灵敏度。图1中示出癌症肿瘤载量测定的流程图。针对突变、甲基化、miRNA、mRNA、可变剪接和易位进行评分的初始多重PCR/LDR筛选测定鉴定出对于24-48种标志物阳性＞5的那些样品。然后用另外的组织特异性标志物使用“像素”PCR/LDR测定假定阳性样品以证实初始结果并且鉴定起源组织。然后医师可安排靶向测序以进一步指导对于患者的治疗决策。
本发明涉及试图将数字聚合酶链式反应(PCR)、连接检测反应(LDR)的最佳特征与多种疾病标志物(例如癌症标志物)的定量检测相结合的通用诊断方法。测定构造和装置的系列包括用于PCR-LDR定量来自血液的低丰度疾病标志物的三个模块。每个模块可独立优化并且可以是手动的、半自动的或完全自动的。所述设计能够将模块集成在一起，使得任何模块可独立优化以向整个测定带来改善的性能。
测定设计的第一系列是基于初始的多重PCR或RT-PCR扩增，然后是使用具有含有引物特异性部分的独特序列标签的LDR探针的多重LDR。使产物分布并使其与具有靶标定向的TaqManTM探针的标签引物组或者与UniTaq引物组混合，并且使用实时PCR定量输入靶核苷酸
第一模块获取输入的血液样品并且将血浆与红细胞(RBC)和白细胞(WBC)分离。它再次将血浆分离以去除任何残余细胞。此外，分离含有所有WBC和循环肿瘤细胞(CTC)和一些RBC的细胞级分。将外来体从血浆分离或亲和捕获。所述模块(i)从WBC和CTC级分中纯化RNA，(ii)从外来体中纯化miRNA和RNA，以及(iii)从血浆中纯化无细胞DNA(cfDNA)。
第二模块能够将以上组分分布到24或48室或孔中，以实现靶基因、启动子、miRNA或mRNA区成比例的多重PCR或RT-PCR扩增的空间多路复用。所述这些包括：(i)含有CTC的WBC级分中的特异性剪接变体或基因融合mRNA，(ii)来自外来体的特异性miRNA，(iii)来自外来体的特异性mRNA，(iv)来自cfDNA的特异性癌症基因DNA区，以及(v)来自cfDNA的特异性(甲基化)启动子区。
第三模块能够将以上产物空间分布到微量滴定板(例如呈24x16或48x32构造)的孔中。这个模块能够使用实时PCR检测并计数LDR产物以提供针对每种疾病标志物的定量结果。
第一模块和第二模块可被构造成针对筛选测定模式同时处理多个样品，其中含有序列标签的LDR产物使用实时PCR读出器提供相对定量结果(参见图2)。在这种构造中，使从来自24个单独样品的各种血液级分分离的DNA和RNA进行多重PCR-LDR和RT-PCR-LDR，然后将其沿微量滴定板中的列，例如16个孔分布，如图3所示。将具有靶标定向的TaqManTM探针的标签引物组或者UniTaq引物组如图4所示那样添加在各个行中，从而允许实时PCR(图5)。在这个图示中，样品#2和#15在＞5个位置处具有强信号，所以被认为是潜在阳性的(等待如下文更多描述的附加验证)，同时具有4个弱信号的样品#8也应获得另外的检查。
两个模块还可以被构造成处理单个样品，其中空间多路复用实现“像素”PCR/LDR，其中LDR产物能够计数原始靶分子。这与数字PCR类似，但是处于更高的多路复用水平下(参见图6)。在这种构造中，在多重PCR-LDR之前，来自单个样品的DNA和RNA被分布到24个室中，如图7所示。在这个实施方案中，一些室具有一个或没有靶分子。在多路复用之后，将LDR产物沿微量滴定板中的列，例如16个孔分布(图7)。将具有靶标定向的TaqManTM探针的标签引物组或者UniTaq引物组添加在各个行中(参见图8)，从而允许实时PCR(参见图9)。基于表示原始混合物中单分子的整数倍(即0、1、2等)的Ct值的泊松分布解释所述结果。图29和30分别示出在24个孔中6至48个和12至96个分子的泊松分布，并且图31和32分别示出在48孔中的12至96个和24至192个分子的泊松分布。图9行A示出(#寻址(address)：#初始靶分子)为(17∶0；6∶1；1∶2)，其对应于8个分子。图9行K示出(7∶0；10∶1；5∶2；2∶4)，其对应于约30个分子。
不同形式的稀释和分布可用于计数更宽范围内的分子，如图10-13中针对miRNA或mRNA定量所示的。在本文中，将初始样品分布到8个室中，稀释10倍并且分布到另外8个室中等(参见图11)。使样品进行多重RT-PCR和LDR，并且将LDR产物沿列单独分布(图11)。将具有靶标定向的TaqManTM探针的标签引物组或者UniTaq引物组添加在各个行中(参见图12)，从而允许实时PCR和检测(参见图13)。对于24个室的实例，此举可在3个数量级上定量，但是在48个室上，可覆盖6个数量级差异。图33-37示出在8个孔中的1至128个分子的泊松分布。在图13行G中示出的实例中，前两种稀释比最后8个孔产生更高的信号(1∶0；3∶1；3∶2；1∶4)，这对应于约14-16x100x1.25＝1,750至2,000个分子。相比之下，图13的行N仅在前8个孔分布(4∶0；3∶1；1∶2)中产生信号，对应于约5-6x1.25＝6至8个分子。
测定设计的第二系列是基于初始多重PCR或RT-PCR扩增，然后将PCR扩增的靶标分布并捕获在微量滴定板的孔上。LDR的单循环能够将LDR产物捕获在固体支持物上的正确靶标上，同时洗掉错配连接物。通过LDR-FRET、实时PCR或其他报告系统定量LDR产物。
第一模块获取输入的血液样品并且分离CTC(如果存在的话)、将血浆与血细胞分离，将外来体与血浆分离，然后(i)从CTC中纯化DNA和RNA(如果存在的话)，(ii)从外来体中纯化miRNA和RNA，以及(iii)从血浆中纯化cfDNA。
第二模块能够将以上组分分布到24或48室或孔中，以实现靶基因、启动子、miRNA或mRNA区成比例的多重PCR或RT-PCR扩增的空间多路复用。所述这些包括：(i)来自CTC的用于拷贝数计数的特异性染色体区域，(ii)来自CTC的特异性剪接变体或基因融合mRNA，(iii)来自外来体的特异性miRNA，(iv)来自外来体的特异性mRNA，(v)来自cfDNA的特异性癌症基因DNA区，以及(vi)来自cfDNA的特异性(甲基化)启动子区。
第三模块能够将以上产物沿微量滴定板中的列，例如16个孔空间分布，然后将扩增的靶标捕获在固体支持物(例如呈24x16或48x32构造)上。这个模块能够将LDR产物捕获在固体支持物上，然后检测并计数LDR产物以提供针对每种标志物的定量结果。
第一模块和第二模块可被构造成针对筛选测定模式同时处理多个样品，其中LDR产物提供与实时PCR读出类似的相对定量结果(参见图14的示意性概述)。在这种构造中，使从来自24个单独样品的各种血液级分分离的DNA和RNA进行多重PCR和RT-PCR，然后将其沿微量滴定板中的列，例如16个孔分布，并且捕获在固体支持物上(参见图15和16)。将LDR探针添加在各个行中，并且在正确靶标上的连接捕获了产物，同时洗掉了未反应的引物(图17)。图18中所示的LDR-FRET结果在其相应孔中示出，但是在这个模块中，还可选择性地使产物变性并且使用毛细管电泳技术计数产物以提供定量结果。在这个图示中(图18)，样品#2和15在＞5个位置处具有强信号，所以是假定的阳性，同时具有4个弱信号的样品8也应获得另外的检查
两个模块还可以被构造成处理单个样品，其中空间多路复用实现“像素”PCR/LDR，其中LDR产物能够计数原始靶分子这与数字PCR类似，但是处于更高的多路复用水平下(图19)。在这种构造中，在多重PCR之前，来自单个样品的DNA和RNA被分布到24个室中(图20)，使得一些室具有一个或没有靶分子。将扩增子沿微量滴定板中的列，例如16个孔分布，并且捕获在固体支持物上(图20和21)。LDR探针添加和LDR产物检测如上所述(图22和23)。基于表示原始混合物中的单分子的整数倍(即0、1、2等)的LDR值的泊松分布解释所述结果。图29和30分别示出24个孔中的6-48个和12-96个分子的泊松分布，并且图31和32分别示出48孔中的12-96个和24-192个分子的泊松分布。图23，行A示出(#寻址∶#初始靶分子)为(17∶0；6∶1；1∶2)，其对应于8个分子。图23，行K示出(7∶0；10∶1；5∶2；2∶4)，其对应于约30个分子。
不同形式的稀释和分布可用于计数更宽范围内的分子，如图24-28中针对miRNA或mRNA定量所示的。在本文中，将初始样品分布到8个室中，稀释10倍并且分布到另外8个室中等(图25)。使样品进行多重RT-PCR并且将其沿列分布。将RT-PCR产物捕获在固体支持物上(图26)并且将LDR引物组添加在各个行中(参见图27)。对于24个室的实例，此举可在3个数量级上定量，但是在48个室上，可覆盖6个数量级差异(参见图33-37的泊松分布)。在图28中示出的实例中，行G，前两种稀释比最后8个孔(1∶0；3∶1；3∶2；1∶4)产生更高的信号，这对应于约14-16x100x1.25＝1,750至2,000个分子。相比之下，图28行N仅在前8个孔分布(4∶0；3∶1；1∶2)中产生信号，对应于约5-6x1.25＝6至8个分子。
假阳性和遗留预防
相对于由样品中存在的正常核酸产生的假信号、相对于在不存在疾病特异性核酸差异(即体细胞性突变)情况下产生的假信号区分由所需疾病特异性核酸差异产生的真信号具有技术挑战。
下文呈现了针对这些挑战的多种解决方案，但是它们具有共同主题。
第一主题是多路复用。当引物浓度相对较高，为50nM至500nM时PCR工作最佳，限制了多路复用。此外，PCR引物对添加越多，扩增不正确的产物或产生引物二聚体的可能性指数增加。相比之下，对于LDR探针，使用数量级为4nM至20nM的低浓度，并且通过使靶标上的相邻杂交实现连接事件的要求限制探针二聚体。使用低浓度的基因特异性PCR引物或含有通用引物序列“尾”的LDR探针允许后续添加较高浓度的通用引物以实现初始PCR或LDR产物的成比例扩增。避免或最小化假PCR扩增子或引物二聚体的另一方式是使用含有数个附加碱基和阻断基团的PCR引物，所述阻断基团仅当与靶标杂交时通过核酸酶的裂解而释放形成游离3’OH，例如核糖核苷酸碱基作为阻断基团并且RNA酶H2作为裂解核酸酶。
第二主题是由低输入的靶核酸导致的信号波动。通常，靶核酸来源于数种细胞，以CTC形式捕获或来自经历细胞凋亡并且将其DNA以小片段(140-160bp)形式释放在血清中的肿瘤细胞。在此类情况下，优选的是进行一定水平的成比例扩增以避免由于将小数量起始分子分布到单个孔中(用于实时或微滴PCR定量)时的波动导致完全缺失信号或报告不准确的拷贝数。只要这些初始通用扩增保持在合理水平(大约12至20个循环)下打开管和分布扩增子用于后续检测/定量(使用实时或微滴PCR定量)的过程中的遗留污染的风险就被最小化。
第三主题是不依赖靶标的信号，也称为“无模板对照”(NTC)。这产生自在不存在正确靶标的情况下发生的聚合酶或连接酶反应。这种信号的一部分可通过明智的引物设计最小化。对于连接反应，可使用聚合酶的5’→3’核酸酶活性来释放下游连接引物的5’磷酸(仅当与靶标杂交时)，从而所述连接反应适于连接。用于区分低水平突变存在的另外特异性可通过以下项实现：(i)使用含有从3’OH起第2或第3位置的错配的上游LDR探针，(ii)使用针对野生型序列的LDR探针，所述LDR探针(任选地)连接但不经历另外的扩增，以及(iii)使用含有数个额外的碱基和阻断基团的上游LDR探针，所述阻断基团仅当与互补靶标杂交时通过用核酸酶的裂解而释放形成游离3’OH(例如RNA酶H2和核糖核苷酸碱基)。
第四主题是由反应中未使用引物导致的被抑制(减少)的扩增或不准确(假)的扩增。消除此类未使用引物的一种方法是将基因组或靶标或扩增的靶DNA捕获在固体支持物上，使连接探针杂交和连接，然后去除未杂交的探针或产物。另选的解决方案包括预扩增，然后进行后续嵌套式LDR和/或PCR步骤，使得在过程中存在二级选择。
第五主题是遗留预防。可通过在通用扩增步骤过程中掺入标准尿嘧啶和在预扩增检查程序中使用UDG(和任选地AP核酸内切酶)来消除遗留信号。结合遗留预防是本发明方法的关键，如在下文更详细所述。使用尿嘧啶的掺入进行初始PCR扩增。使用缺乏尿嘧啶的LDR探针进行LDR反应。因此，当LDR产物进行实时PCR扩增时，UDG的添加破坏了初始PCR产物，但未破坏LDR产物。此外，因为LDR为线性过程并且标签引物使用人类基因组没有的序列，所以LDR产物意外遗留回至原始PCR也不产生不依赖目标的扩增。在甲基化靶标的情况下提供遗留预防的另外方案包括在扩增之前或在亚硫酸氢盐处理之后使用限制性核酸内切酶，如果使用后者方法，则如下文所述。
鉴定疾病标志物的方法
本发明的第一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子的核苷酸序列。所述方法包括提供潜在地含有一个或过个核酸分子的样品，所述一个或过个核酸分子含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子的核苷酸序列的靶核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将所接触的样品与一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。所述方法还包括将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)具有靶核苷酸序列特异性部分的第一寡核苷酸探针和(b)具有靶核苷酸序列特异性部分的第二寡核苷酸探针，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式彼此相邻地杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上，在所述第一寡核苷酸探针与所述第二寡核苷酸探针之间具有接点。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分以鉴定含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于样品中其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在。
图38-44示出本发明的这个方面的各个实施方案。
图38(步骤A-F)示出用于检测基因组DNA或cfDNA的突变的示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法起始于分离基因组DNA或无细胞DNA(cfDNA)，如步骤A所示。如图38中所示(步骤B)，用能够消化样品中可能存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的酶处理DNA样品。合适的酶包括但不限于大肠杆菌尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、南极热敏UDG或人单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶(hSMUG1)。然后使样品进行扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)以扩增含有突变的目标区。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物进行扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。如图38步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图38步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。上游寡核苷酸探针含有5’引物特异性部分(Ai)并且下游寡核苷酸探针含有允许连接产物的后续扩增的3’引物特异性部分(Ci’)。在连接之后，将连接产物等分到单独的含有一种或多种标签特异性引物对的孔中，每对包含匹配的引物Ai和Ci，用UDG或类似酶处理以去除含有dU的扩增产物或污染物，进行PCR扩增和检测。如图38步骤E和F中所示，可使用传统的TaqManTM检测测定进行连接产物的检测(参见，Whitcombe等的美国专利号6,270,967和Anderson等的美国专利号7,601,821，所述专利以引用的方式整体并入本文)。对于使用TaqManTM的检测，将跨越连接接点的寡核苷酸探针与适于杂交于连接产物的引物特异性部分上以供扩增和检测的引物结合使用。TaqManTM探针在一端含有荧光报告基团(F1)并且在另一端含有淬灭分子(Q)，在完整探针中两者彼此足够紧密接近，以使得淬灭分子淬火报告基团的荧光。在扩增过程中，TaqManTM探针和上游引物与其连接产物的互补区杂交。聚合酶的5’→3’核酸酶活性使杂交引物延伸并且释放TaqManTM探针的荧光基团以产生可检测信号(图38，步骤F)。在扩增反应过程中使用dUTP产生含有dU的产物，所述产物可随后使用UDG破坏以实现遗留预防。
图39示出用于检测基因组DNA或cfDNA的突变的示例性PCR-qLDR遗留预防反应。所述方法起始于分离基因组DNA或无细胞DNA(cfDNA)，如步骤A所示。如图39步骤B中所示，用脱氧尿嘧啶(dU)消化酶(诸如UDG)处理DNA样品，以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子，然后进行扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)以扩增含有突变的目标区。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物进行扩增反应。在一个实施方案中，进行有限循环的扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。在这个实施方案中，基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，这能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图39，步骤B)。
如图39步骤C中所示，扩增产物掺入了dU，从而允许遗留预防，并且通过附加的5’生物素部分捕获在固体支持物上。使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图39步骤D中所示。在这个实施方案中，分别地，第一连接探针含有3’靶特异性区和具有供体或受体部分的5’尾序列，并且探针组中的第二连接探针含有5’靶特异性区和具有受体或供体部分的3’尾序列。探针组中的连接探针的5’和3’尾序列彼此互补并且受体基团和供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的荧光共振能量转移(FRET)产生可检测信号。在连接之后，洗掉未连接的寡核苷酸探针，并且从固定的扩增产物中使连接产物变性。在变性后(图39，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾序列彼此杂交，从而使供体基团和受体基团彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号。
可使用FRET检测的替代形式区分根据本发明的这个方面形成的连接产物。例如，上游探针可含有在5’端处的荧光报告基团，接着是尾序列部分、淬灭基团(例如ZEN)以及靶特异性部分，如图39步骤F中所示。在单链的形式中，荧光基团通过Zen基团淬灭。在连接上游连接探针和下游连接探针并使所得连接产物变性后，连接产物的互补5’和3’尾部分杂交形成短的双链部分。在这种形成中，报告基团不再被淬灭基团淬灭，并且产生可检测信号。
图39示出用于将延伸产物捕获在固体支持物上的生物素酰化的通用引物-链霉亲和素涂覆的表面方法。这种捕获可在连接步骤之前或之后发生。用于将产物连接至固体支持物的其他方法包括在PCR扩增之前将通用引物的一部分或大部分共价附接至固体支持物。
除了使用生物素-链霉亲和素捕获聚合酶延伸产物之外，引物可被设计成包含在5’端上的捕获序列、聚合酶延伸阻断基团和在3’端上的通用或靶特异性部分。在扩增之后，产物的5’捕获序列部分是单链的，并且如果其是长的和/或富含GC序列，则其可在下述条件下被捕获在互补序列上，所述条件使得未被捕获的链的变性或通过裂解例如λ核酸外切酶裂解去除。捕获步骤可通过在引物、捕获探针序列或两者内使用PNA、LNA或其他核苷酸类似物来增强。
在另一实施方案中，可使用以下项将引物共价附接至固体表面：针对无铜点击化学(与叠氮化物)的二苯并环辛基(Dibenzocyclooctyl)(DBCO)；针对点击化学(与叠氮化物)的5-辛二炔基dU；氨基修饰剂C6 dT(针对肽键)或针对与烯烃DBCO的点击化学的叠氮化物。
图40示出用于检测突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图40，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子。在这个实施方案中，使用在其3’端含有可裂解阻断基团的基因座特异性PCR引物进行初始扩增。阻断基团防止非靶特异性聚合酶延伸和扩增。如图40步骤B中所示，合适的阻断基团为RNA碱基(r)，所述RNA碱基仅在引物与其互补序列杂交时被RNA酶-H(星符号)裂解(参见例如，Dobosy等“RNase H-Dependent PCR(rhPCR)：Improved Specificityand Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked CleavablePrimers，”BMC Biotechnology 11(80)：1011(2011)，其以引用的方式整体并入本文)。RNA碱基的裂解释放了适于通过聚合酶进行延伸的3’OH。
在引物阻断基团裂解之后，扩增目标区并且PCR产物含有dU，从而允许遗留预防(图40，步骤C)。然后含有引物标签(Ai和Ci’)的靶标特异性寡核苷酸探针以碱基特异性方式与扩增产物杂交，并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起(图40，步骤D)。使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如图38中所述的连接接点(参见图40，步骤E-F)。
图41示出用于检测突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图41，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图41，步骤B)。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物扩增目标区。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。如图41步骤C所示，扩增产物含有dU，从而允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图41步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测，而具有特异性用于检测野生型(非突变的)核酸序列的序列的上游寡核苷酸探针不含有5’引物特异性部分。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA基以产生能连接的3’OH基团(图41，步骤D)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如图38中所述的连接接点(参见图41，步骤E-G)。
图42示出用于检测突变的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图42，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图42，步骤B)。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物扩增目标区。在这个实施方案中，基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区。此类序列能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图42，步骤B)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图42步骤D中所示。在这个实施方案中，具有能够检测突变型核酸序列(而不检测野生型序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图42，步骤D)。在连接之后(图42，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图42，步骤F)。
图43示出用于检测突变的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图43，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图43，步骤B)。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物扩增目标区。在这个实施方案中，基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区。这些区能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图43，步骤B)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图43步骤D中所示。在这个实施方案中，探针组的寡核苷酸探针被设计成使得第一寡核苷酸探针的最3’碱基与第二寡核苷酸探针的与靶核酸分子互补的紧邻侧接的最5’碱基重叠，如图43步骤D所示。重叠的核苷酸被称之为“侧翼(flap)”。当第二寡核苷酸探针的重叠侧翼核苷酸与靶核酸分子序列互补并且为与第一核苷酸探针的终止3’核苷酸相同的序列时，紧邻第二寡核苷酸探针的侧翼核苷酸上游的磷酸二酯键通过具有侧翼核酸内切酶(FEN)或5’核酸酶活性(例如，Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶)的酶有辨别力地裂解。这种特异性FEN活性在第二寡核苷酸探针上产生能连接的5’磷酸端，所述5’磷酸端沿着第一寡核苷酸探针的相邻3’OH精确定位。由于(a)通过彼此相邻的寡核苷酸探针进行靶特异性退火，(b)仅当裂解的侧翼核苷酸与模板匹配时选择性产生5’磷酸，以及(c)添加针对第一寡核苷酸探针的3’-碱基的非沃森-克里克(Watson-Crick)配对进行辨别的连接酶，所以实现了非常高的靶检测特异性和灵敏度。根据这个实施方案，用于连接的寡核苷酸探针还含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。在连接之后(图43，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图43，步骤F)。
图44示出用于检测突变的另一PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图44，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图44，步骤B)。使用基因座特异性引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物扩增目标区。在这个实施方案中，连接探针被设计成含有UniTaq引物和标签序列以有利于检测。UniTaq系统在Spier的美国专利申请公布号2011/0212846中有全面描述，所述专利以引用的方式整体并入本文。UniTaq系统涉及使用三种独特“标签”序列，其中至少一种独特标签序列(Ai)存在于第一寡核苷酸探针中，并且第二独特标签序列和第三独特标签序列(Bi’和Ci’)在第二寡核苷酸探针中，如图44步骤D中所示。在连接探针组中的寡核苷酸探针后，所得连接产物含有Ai序列-靶特异性序列-Bi’序列-Ci’序列。UniTaq方法的本质在于连接探针组中的两种寡核苷酸探针需要是正确的以获得阳性信号，这从而允许高度多路复用的核酸检测。例如，并且如本文所述，这通过要求两部分即标签中的两个彼此杂交来实现。
在检测连接产物之前，用UDG处理样品以破坏原始靶扩增子，从而仅允许真正的连接产物被检测。对于检测，使用具有与Ai相同的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物和与Ci’互补的第二寡核苷酸引物(即Ci)将含有Ai(第一引物特异性部分)、Bi’(UniTaq检测部分)和Ci’(第二引物特异性部分)的连接产物在两个链上引发。第一寡核苷酸引物还在一端包含具有可检测标记F1的UniTaq检测探针(Bi)并且在另一端包含淬灭分子(Q)(F1-Bi-Q-Ai)。任选地，接近淬灭剂定位的是聚合酶阻断单元，例如HEG、THF、Sp-18、ZEN或本领域已知的足以停止聚合酶延伸的任何其他阻断剂。PCR扩增使得双链产物产生，如图44步骤F中所示)。在这个实例中，聚合酶阻断单元阻止聚合酶拷贝第一通用引物的5′部分(Bi)，使得产物的底链不能在其变为单链时形成发夹。这种发夹的形成将茎的3′端与扩增子退火，使得这个3′端的聚合酶延伸终止PCR反应。
使双链PCR产物变性，并且当随后降低温度时，产物的上链形成具有在第一寡核苷酸引物的5′部分(Bi)与链的相对末端处的部分Bi’之间的茎的发夹(图44，步骤G)。另外，在这个步骤中，第二寡核苷酸引物与发夹状产物的5’-引物特异性部分(Ci’)退火。在步骤G中的第二通用引物延伸后，聚合酶的5′核酸酶活性从扩增子5′端裂解可检测标记D1或淬灭分子从而增加标记与淬灭剂之间的距离并且允许标记的检测。
图145示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图145，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图145，步骤B)。使用突变选择性上游引物、基因座特异性下游引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物选择性扩增目标区。如这个图中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和突变特异性RNA碱基(mr)来将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图145，步骤B)。RNA酶H在所述引物与突变型DNA完全匹配时将优先裂解RNA碱基，但是在与野生型DNA杂交时不太可能裂解RNA碱基。一旦发生裂解反应，聚合酶就如实地延伸释放的3’OH并且拷贝靶标的突变型或野生型碱基。因此，与等位基因特异性PCR不同，PCR引物不使引物衍生的突变增殖。相反，通过经由杂交、裂解、延长和变性的重复循环拷贝碱基，这种PCR在每个扩增循环过程中相对于野生型靶标选择性地扩增突变型靶标。具有野生型序列的任选引物缺乏RNA碱基并且仍保持阻断，因此进一步减少了野生型序列的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到24、48或96个孔中。如图145步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图145步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测，而具有特异性用于检测野生型(非突变的)核酸序列的序列的上游寡核苷酸探针不含有5’引物特异性部分。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图145，步骤D)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如图38中所述的连接接点(参见图145，步骤E-G)。
图146示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图146，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图146，步骤B)。使用突变选择性上游引物、基因座特异性下游引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物选择性扩增目标区。如这个图中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和突变特异性RNA碱基(mr)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图146，步骤B)。RNA酶H在所述引物与突变型DNA完全匹配时将优先裂解RNA碱基，但是在与野生型DNA杂交时不太可能裂解RNA碱基。一旦发生裂解反应，聚合酶就如实地延伸释放的3’OH并且拷贝靶标的突变型或野生型碱基。因此，与等位基因特异性PCR不同，PCR引物不增殖引物衍生的突变。相反，通过经由杂交、裂解、延长和变性的重复循环拷贝碱基，这种PCR在每个扩增循环过程中相对于野生型靶标选择性地扩增突变型靶标。具有野生型序列的任选引物缺乏RNA碱基并且仍保持阻断，因此进一步减少了野生型序列的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图146步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图146步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测，而具有特异性用于检测野生型(非突变的)核酸序列的序列的上游寡核苷酸探针不含有5’引物特异性部分。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Bi’-Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图146，步骤D)。在连接之后，使用UniTaq特异性引物(即F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连接产物并且如以上针对图44所述那样(参见图146，步骤E-H)或使用本领域已知的其他合适手段进行检测。
图147示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图147，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图147，步骤B)。使用突变选择性上游引物、基因座特异性下游引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物选择性扩增目标区。如这个图步骤B中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和突变特异性RNA碱基(mr)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图147，步骤B)。RNA酶H在所述引物与突变型DNA完全匹配时将优先裂解RNA碱基，但是在与野生型DNA杂交时不太可能裂解RNA碱基。一旦发生裂解反应，聚合酶就如实地延伸释放的3’OH并且拷贝靶标的突变型或野生型碱基。因此，与等位基因特异性PCR不同，PCR引物不增殖引物衍生的突变。相反，通过经由杂交、裂解、延长和变性的重复循环拷贝碱基，这种PCR在每个扩增循环过程中相对于野生型靶标选择性地扩增突变型靶标。具有野生型序列的任选引物缺乏RNA碱基并且仍保持阻断，因此进一步减少了野生型序列的扩增。在这个实施方案中，下游基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，从而能够使用生物素标记的引物进行通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图146，步骤B)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图147步骤D中所示。在这个实施方案中，具有能够检测突变型核酸序列(而不检测野生型序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图147，步骤D)。在连接之后(图147，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图147，步骤F)。
图148示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图148，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图148，步骤B)。使用基因座特异性上游引物、基因座特异性下游引物、包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针以及包含dUTP的脱氧核苷酸混合物选择性扩增目标区。在这个实施方案中，可通过在上游引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放为突变上游的数个碱基并适于聚合酶延伸的3’OH基团(图148，步骤B)。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物优先竞争结合野生型序列，但对突变型DNA并非如此，由此抑制野生型DNA在每轮PCR过程中的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图148步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图148步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测。再次，在PCR扩增步骤过程中，在富集突变型序列之后，包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针的存在抑制了与野生型靶序列(如果存在的话)的连接。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图148，步骤D)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或使用本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如以上针对图38所述的连接接点(参见图148，步骤E-G)。
图149示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图149，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图149，步骤B)。上游基因座特异性引物被设计为在突变上游的数个碱基，并且包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH(图149步骤B)。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物优先竞争结合野生型序列，但对突变型DNA并非如此，由此抑制野生型DNA在每轮PCR过程中的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图148步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图149步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测。再次，在PCR扩增步骤过程中，在富集突变型序列之后，包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针的存在抑制了与野生型靶序列(如果存在的话)的连接。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Bi-Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图149，步骤D)。在连接之后，使用UniTaq特异性引物(即F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连接产物并且如以上针对图44所述那样(参见图149，步骤E-H)或使用本领域已知的其他合适手段进行检测。
图150示出用于检测低水平突变的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图150，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图150，步骤B)。上游基因座特异性引物被设计为在突变上游的数个碱基，并且包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH(图150，步骤B)。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物优先竞争结合野生型序列，但对突变型DNA并非如此，由此抑制野生型DNA在每轮PCR过程中的扩增。在这个实施方案中，下游基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，从而能够使用生物素标记的引物进行通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图150，步骤B)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图150步骤D中所示。再次，在PCR扩增步骤过程中，在富集突变型序列之后，包含野生型序列的阻断LNA或PNA探针的存在抑制了与野生型靶序列(如果存在的话)的连接。在这个实施方案中，具有能够检测突变型核酸序列(而不检测野生型序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图150，步骤D)。在连接之后(图150，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图150，步骤F)。
在本发明的这个方面的另一实施方案中，一级寡核苷酸引物组的第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与野生型核酸分子中的与一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与靶核酸分子中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
根据这个实施方案，提供了缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶。任选地，一级寡核苷酸引物还可含有可裂解核苷酸或核苷酸类似物，其在PCR的杂交步骤过程中被裂解以在所述延伸处理之前释放寡核苷酸引物上的游离3’OH端。使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理的一个或多个附加的聚合酶链式反应循环，在变性处理中，将来自反应的延伸产物彼此分开，在杂交处理中，第一一级寡核苷酸引物与产生自第二一级寡核苷酸引物的延伸产物杂交。产生自第二一级寡核苷酸的延伸产物能够在延伸产物内的3’端与互补序列之间形成分子内环-发夹，所述环-发夹(i)包含在与突变型靶序列杂交情况下抑制自延伸的3’端处或附近的错配或(ii)包含在与野生型靶序列自杂交的情况下增强自延伸的3’端处的匹配。第二一级寡核苷酸引物与产生自第一一级寡核苷酸引物的延伸产物杂交。第一一级引物的延伸产物在延伸产物内的5’部分与互补序列之间形成分子内环-发夹。在PCR的延伸步骤中，第一一级寡核苷酸引物(i)优先在包含突变型靶序列的延伸产物上延伸，从而优先形成包含突变型靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物，或(ii)由于先前在所述靶标上的自杂交和自延伸而抑制形成包含野生型靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。第二一级寡核苷酸引物在不依赖靶序列的延伸产物上延伸，其中优先扩增突变型序列，这归因于产生自第一一级寡核苷酸引物与靶标或其拷贝的杂交的不同的一级延伸产物，从而在一级聚合酶链式反应过程中富集突变型序列延伸产物及其互补序列。
图154和155示出本发明的这个方面的以上所述的实施方案。如图154中所示，将基因组DNA或cfDNA分离(图154，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图154，步骤B)。使用包含5’部分的基因座特异性上游引物选择性地扩增目标区，所述5’部分具有与野生型核酸分子的与引物杂交的核苷酸序列部分相同的核苷酸序列，使得延伸产物能够形成环发夹。换句话讲，上游引物的5’部分含有与反义野生型DNA链内的序列部分相同或与正义野生型DNA链内的序列部分互补的核苷酸序列。扩增反应还含有基因座特异性下游引物和包含dUTP的脱氧核苷酸混合物。如这个图步骤B中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图154，步骤B)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图154步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。图154，步骤D进一步示出：在后续轮的PCR过程中，(i)变性的野生型底链形成在3’端处具有完全匹配、被聚合酶延伸的环-发夹，(ii)变性的突变型底链形成在3’端处具有至少一个错配碱基、通常不被聚合酶延伸的环-发夹，(iii)变性的顶链在5’侧形成环-发夹，所述环-发夹在72℃下的PCR的延伸步骤过程中变性。图154步骤E进一步示出：(i)在野生型DNA上的环-发夹延伸后，延伸的发夹序列在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。然而，突变型DNA的环-发夹序列(ii)由于3’错配碱基而未延伸，并且由此在72℃下变性，从而能够使上游引物产生全长的顶链。同样地，顶链产物(iii)在72℃下变性，从而允许聚合酶产生全长的底链。在存在野生型(i)和突变型(ii)模板的情况下上游引物的环-发夹延伸偏好性的差异导致在每个扩增循环过程中优先去除野生型产物，并且由此使得优先扩增突变型DNA。当与突变型相对于野生型DNA杂交时延伸环发夹的3’端的延伸效率差别可通过设计上游的5’部分含有与从末端起第2或第3位置的野生型DNA的错配来进一步增加。来自底引物的延伸产物在与野生型序列自杂交时仅在从3’端开始的第2或第3位置产生1个错配，其易于通过聚合酶延伸，但当与突变型序列自杂交时在3’端处产生2个错配，其不通过聚合酶延伸。
如图154步骤G中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标突变的序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测，而具有特异性用于检测野生型(非突变的)核酸序列的序列的上游寡核苷酸探针不含有5’引物特异性部分。具有为突变型序列和野生型序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测突变的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许仅对突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤F中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图154，步骤H)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或使用本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如图38中所述的连接接点(参见图154，步骤H-J)。
图l55示出用于检测突变的另一示例性PCR-LDR遗留预防反应。将基因组DNA或cfDNA分离(图155，步骤A)，并且用UDG处理分离的DNA样品以消化样品中可能存在的含有dU的核酸分子(图155，步骤B)。使用以下项选择性地扩增目标区：(i)也包含5’序列部分的基因座特异性上游引物，所述5’序列部分与顶链的野生型序列互补从而允许在延伸之后形成环-发夹，(ii)基因座特异性下游引物，以及(iii)包含dUTP的脱氧核苷酸混合物。如这个图步骤B中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图155，步骤B)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图155步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。图155步骤D进一步示出，在后续轮的PCR过程中：(i)变性的野生型底链形成在3’端处具有完全匹配、被聚合酶延伸的环-发夹，(ii)变性的突变型底链形成在3’端处具有至少一个错配碱基、通常不被聚合酶延伸的环-发夹，(iii)变性的顶链在5’侧形成环-发夹，所述环-发夹在72℃下的PCR的延伸步骤过程中变性。图155步骤E进一步示出：在野生型DNA上的环-发夹延伸后，(i)延伸的发夹序列在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。然而，突变型DNA的环-发夹序列(ii)由于3’错配碱基而未延伸，并且由此在72℃下变性，从而能够使上游引物产生全长的顶链。同样地，顶链产物(iii)在72℃下变性，从而允许聚合酶产生全长的底链。在存在野生型(i)和突变型(ii)模板的情况下上游引物的环-发夹延伸偏好性的差异导致在每个扩增循环过程中优先去除野生型产物，并且由此使得优先扩增突变型DNA。
在这个实施方案中，下游基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，其能够使用生物素标记的引物进行通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图155，步骤B)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图155步骤G中所示。在这个实施方案中，具有能够检测突变型核酸序列(而不检测野生型序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图155步骤G)。在连接之后(图155，步骤H)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图155，步骤I)。
本发明的方法中使用的连接反应在本领域中是熟知的。适于将探针组的寡核苷酸探针连接在一起(任选地在第一寡核苷酸探针上的3’核糖和阻断基团，或第二寡核苷酸探针上的5’侧翼裂解之后)的连接酶包括但不限于水生栖热菌连接酶、大肠杆菌连接酶、T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、Taq连接酶、9N°连接酶和火球菌属(Pyrococcus)连接酶或本领域中已知的任何其他耐热性连接酶。根据本发明，本发明的核酸酶连接方法可通过采用以下项进行：寡核苷酸连接测定(OLA)反应(参见Landegren等，″A Ligase-Mediated GeneDetection Technique，″Science 241：1077-80(1988)；Landegren等，″DNA Diagnostics--Molecular Techniques and Automation，″Science 242：229-37(1988)；以及Landegren等的美国专利号4,988,617)；利用一组互补寡核苷酸探针的连接检测反应(LDR)(参见例如，Barany等的WO 90/17239，其以引用的方式整体并入本文)，或利用两组互补寡核苷酸探针的连接链式反应(LCR)，参见例如，Barany等的WO 90/17239，其以引用的方式整体并入本文)。
探针组的寡核苷酸探针可以呈以下形式：核糖核苷酸、脱氧核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、肽核苷酸类似物、经修饰的肽核苷酸类似物、经修饰的磷酸-糖-主链寡核苷酸、核苷酸类似物及其混合物。
连接酶检测反应中的杂交步骤(优选为热杂交处理)基于连接接点处的有区别的核苷酸来区分核苷酸序列。靶核苷酸序列之间的差异可例如为单个核酸碱基差异、核酸缺失、核酸插入或重排。还可检测涉及多于一个的碱基的此类序列差异。优选地，寡核苷酸探针组具有基本上相同的长度，使得其在基本上类似的杂交条件下与靶核苷酸序列杂交。
连接酶区分能力可通过采用各种探针设计特征进一步增强。例如，可将有意错配或核苷酸类似物(例如，肌苷、硝基吲哚或硝基吡咯)掺入到第一寡核苷酸探针中的从3’接点端起第2或第3碱基处，从而如果3’端处完全匹配则使3’端的杂交稍微不稳定，但是如果3’端处错配则使3’端的杂交显著不稳定。这种设计减少了突变型探针与野生型靶标杂交时的不适当的错误连接。另选地，通过RNA酶裂解的RNA碱基可掺入到寡核苷酸探针中以确保模板依赖性产物形成。例如，Dobosy等“RNase H-Dependent PCR(rhPCR)：ImprovedSpecificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using BlockedCleavable Primers，”BMC Biotechnology 11(80)：1011(2011)(其以引用的方式整体并入本文)描述了靠近具有3’-阻断端的寡核苷酸探针的3’端使用RNA碱基，并且用RNA酶H2切割所述RNA碱基，从而产生PCR可延伸的和可连接的3’-OH。可使用这种方法产生能连接的3’OH或5’-P或两者，前提是利用了可连接5’-RNA碱基的连接酶。
其他可能的修饰包括脱碱基位点，例如内部脱碱基呋喃或氧代-G。这些异常“碱基”通过特异性酶去除以产生能连接的3’-OH或5’P位点。在连接寡核苷酸与靶核酸退火之后，核酸内切酶IV，Tth EndoIV(NEB)去除脱碱基残基，而不是从单链DNA去除。类似地，可使用具有Fpg的氧代-G或具有EndoV的肌苷/尿嘧啶或具有EndoVIII的胸腺嘧啶二醇。
连接区分能力还可通过使用在Barany等的WO2013/123220中所述的偶联的核酸酶-连接酶反应增强，所述专利以引用的方式整体并入本文。在这个实施方案中，第一寡核苷酸探针具有能连接的3’OH基团，而第二寡核苷酸探针具有不能连接的5’端(即，不具有5’磷酸的寡核苷酸探针)。探针组的寡核苷酸探针被设计成使得第一寡核苷酸探针的最3’碱基与第二寡核苷酸探针的与靶核酸分子互补的紧邻侧接的最5’碱基重叠。重叠的核苷酸被称之为“侧翼”。当第二寡核苷酸探针的重叠侧翼核苷酸与靶核酸分子序列互补并且为与第一寡核苷酸探针的终止3’核苷酸相同的序列时，紧邻第二寡核苷酸探针的侧翼核苷酸上游的磷酸二酯键通过具有侧翼核酸内切酶(FEN)或5’核酸酶活性的酶有辨别力地裂解。这种特异性FEN活性在第二寡核苷酸探针上产生新的能连接的5’磷酸端，所述5’磷酸端在第一寡核苷酸探针的相邻3’OH旁边精确定位以允许发生两个探针的连接。根据这个实施方案，适于在连接之前裂解第二寡核苷酸探针的5’侧翼的侧翼核酸内切酶或5’核酸酶包括但不限制具有5’核酸酶活性的聚合酶，诸如大肠杆菌DNA聚合酶和来自Taq和嗜热栖热菌的聚合酶，以及T4RNA酶H和TaqExo。
对于插入或缺失，将匹配的碱基或核苷酸类似物(例如，-氨基-dA或5-丙炔基-dC)掺入在第一寡核苷酸探针中的从接点起第2或第3位置处改善了稳定性并且可改善从野生型序列中对此类移码突变的区分能力。对于插入，在第二寡核苷酸探针的所需易裂开的磷酸键的下游使用一个或多个硫代磷酸酯修饰的核苷酸将防止在探针与野生型DNA杂交时通过5’核酸酶进行的不适当裂解，并且由此减少野生型靶标上的假阳性连接。同样地，对于缺失，在第二寡核苷酸探针的所需易裂开的磷酸键的上游使用一个或多个硫代磷酸酯修饰的核苷酸将防止在探针与野生型DNA杂交时通过5’核酸酶进行的不适当裂解，并且由此减少野生型靶标上的假阳性连接。
还可利用本发明的方法鉴定因一个或多个甲基化残基而不同于样品中的其他核酸序列的一种或多种靶核酸序列。根据本发明的这个方面，所述方法还包括在形成聚合酶链式反应混合物之前使样品与至少第一甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物。根据本发明的这个方面，第一一级寡核苷酸引物包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列，并且第二一级寡核苷酸引物包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列。
第一甲基化敏感性酶裂解样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。根据这个实施方案，检测包括检测含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子，其中核酸分子初始含有一个或多个甲基化残基。
根据本发明的这个和所有方面，“甲基化敏感性酶”是一种核酸内切酶，当其在核酸分子中的同源识别序列含有甲基化残基时，所述核酸内切酶将不裂解识别序列或降低所述识别序列的裂解效率(即，所述核酸内切酶对其识别序列内的甲基化残基的存在敏感)。“甲基化敏感性酶识别序列”是针对甲基化敏感性酶的同源识别序列。在一些实施方案中，在序列CpG(即5-甲基-CpG)内，甲基化残基为5-甲基-C。适于在本发明的方法中使用的甲基化敏感性限制性内切核酸酶的非限制性列表包括但不限于AciI、HinP1I、Hpy99I、HpyCH4IV、BstUI、HpaII、HhaI或其任何组合。
本发明的方法还可包括在形成聚合酶链式反应混合物之前使限制性酶反应混合物在适于将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基的条件下经历亚硫酸氢盐处理。在这个实施方案中，一级寡核苷酸引物组的第一一级寡核苷酸引物包含与含有一个或多个甲基化未裂解限制性位点的亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且提供的一级寡核苷酸引物组的第二一级寡核苷酸引物包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。
本发明的方法还可包括提供裂解在甲基化敏感性酶识别序列内含有未甲基化残基的核酸分子的一种或多种第二甲基化敏感性酶。将至少一种第二甲基化敏感性酶与包含亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的聚合酶链式反应混合物共混，以形成第二限制性酶反应混合物，其中在所述杂交处理过程中，第二甲基化敏感性酶裂解样品中潜在存在的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。
在本发明的这个方面的一个实施方案中，一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分具有可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸。根据这个实施方案，所述方法还包括在杂交处理过程中裂解一种或两种寡核苷酸引物的可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
在本发明的这个方面的一个实施方案中，所述方法还包括提供能够与亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列的含有未甲基化残基的区杂交的一种或多种阻断寡核苷酸。在使包含亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的聚合酶链式反应混合物经历一个或多个聚合酶链式反应循环之前，使所述混合物与一种或多种阻断寡核苷酸接触。一种或多种阻断寡核苷酸在所述杂交处理过程中与互补靶核酸序列杂交并且在所述延伸处理过程中阻止一级寡核苷酸引物延伸。
图45-53示出用于检测含有一个或多个甲基化残基的靶核酸分子的本发明方法的各个实施方案。
图45中描绘的PCR-LDR-qPCR反应的第一步骤包括分离基因组DNA或cfDNA。任选地，甲基化DNA可使用甲基化特异性抗体富集。然后用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和/或HinP1I(G^CGC)和UNG(37℃，30-60分钟)处理样品以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图45，步骤A)。如图45步骤B中所示，使用基因座特异性引物在dUTP存在下使用PCR扩增目标甲基化区。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图45，步骤C)，并且产物缺乏甲基，提供了另外的保护。如图45步骤D中所示，甲基区特异性连接寡核苷酸探针含有适于使用标签引物对Ai和Ci’和TaqManTM探针进行后续PCR扩增的标签引物特异性部分(Ai，Ci’)。
在连接反应之后，将含有连接产物的样品等分到不同的孔中以供检测。使用UDG的处理破坏了原始靶扩增子(图45，步骤E)，从而仅允许真正的LDR产物被扩增和检测。在这个实施方案中如上所述那样使用传统的TaqManTM检测测定来检测连接产物(图45，步骤E-F)。
图46示出用于检测甲基化的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和/或HinP1I(G^CGC)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图46，步骤A)。如图46步骤B中所示，使用基因座特异性引物在dUTP存在下使用PCR扩增目标甲基化区。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物含有dU，从而允许遗留预防(图46，步骤C)。
在这个实施方案中利用的寡核苷酸探针如上所述那样被设计成含有UniTaq引物和标签序列以有利于UniTaq检测。因此，在连接反应和使用UDG处理以实现遗留预防之后，使用UniTaq特异性引物(即F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连接产物，如图46步骤E和F中所示，并且检测扩增产物，如图46步骤G所示并且如上所述。
图47示出用于检测甲基化的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和/或HinP1I(G^CGC)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图47，步骤A)。如图47步骤B中所示，使用基因座特异性引物在dUTP存在下使用PCR扩增目标甲基化区。在这个实施方案中，基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，其能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图47，步骤B)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用突变特异性连接探针检测目标突变，如图47步骤D中所示。根据这个实施方案，用于连接的寡核苷酸探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。在连接之后(图47，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图47，步骤E)。
图48示出用于检测甲基化的核酸酶-连接-PCR-qPCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA，并且用HaeIII(GG^CC)甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和/或HinP1I(G^CGC)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图48，步骤A)。如图48步骤B中所示，含有标签序列(Ai’)的发夹状寡核苷酸被连接至样品模板链中消化的靶DNA的新释放的磷酸。如图48步骤C中所示，在37℃下用HinP1I和Bsh1236I处理样品。然后热灭活甲基敏感性限制性酶，同时激活Taq聚合酶以使用含有Ci标签序列的基因座特异性引物进行后续PCR扩增。如上所述，引物可含有可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)，所述RNA碱基仅在引物与互补靶序列结合时通过RNA酶H2(星符号)在扩增之前去除。用聚合酶延伸未阻断的引物，并且聚合酶的5’核酸酶活性消化连接的发夹的5’部分以产生与含有Ci和Ai’序列的靶标互补的产物。未连接的发夹状寡核苷酸在其自身上延伸。
如图48步骤D中所示，使用包含dUTP和标签引物Ai和Ci的PCR扩增目标含甲基的区。进行有限循环扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图48，步骤E)，并且产物缺乏甲基，从而提供了另外的保护。如上所述，将扩增产物等分到单独孔中以使用基因座特异性引物和TaqManTM探针进行TaqManTM检测。
图49示出用于检测甲基化的核酸酶-连接-PCR-qPCR遗留预防反应。如以上关于图48所示和所述的，在步骤A-D之后产生了含有目标原始甲基化残基和dU的PCR产物。在这个实施方案中，使用UniTaq引物和标签序列的后续扩增用于检测目标甲基化残基。如图49的步骤E中所示，含有dU以实现遗留预防的PCR产物等分到单独孔中并且使用以Aj和Bj-Cj结尾的基因座特异性引物以及UniTaq特异性引物(F1-Bj-Q-Aj和Cj)扩增。所得双链DNA产物在图49步骤F中示出。如图49步骤G中所示，在变性步骤之后，将温度冷却以允许Bj与Bj’之间形成发夹。Taq聚合酶的5’→3’核酸酶活性(实心方块)使引物Ci延伸并且释放荧光基团以产生信号。
图50示出用于检测甲基化的PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图50，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化的dC残基转化为尿嘧啶(dU)，从而使得双链DNA为非互补的。如图50B中所示，在将裂解含有未甲基化残基的遗留DNA的BstU1(CG^CG)(实心三角形)存在下使基因座特异性引物杂交。基因座特异性引物在其3’端含有可裂解阻断剂以防止非靶特异性延伸。一旦与其互补靶序列杂交，就用RNA酶H2(星符号)去除阻断基团(C3间隔子)和RNA碱基。在dUTP存在下使用PCR扩增目标含甲基的区。进行有限循环扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率，并且在PCR之前任选地将消化样品等分到12、24、48或96个孔中。如在这个实施方案中所示的，可使用阻断寡核苷酸(粗黑线)来限制野生型DNA的扩增。
扩增产物含有dU并且缺乏甲基，从而允许遗留预防，如图50步骤C中所示。如图50步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性序列(Ai，Ci’)的甲基区特异性连接寡核苷酸探针与靶目标区杂交。连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起以形成含有上游和下游引物特异性部分和对应于目标甲基化区的部分的连接产物。将连接产物等分到单独孔中以使用匹配的引物对Ai和Ci和横跨连接接点的TaqManTM探针进行检测，如图50步骤E-F中所示。用UDG处理样品混合物以实现遗留预防并且去除原始靶扩增子(图50，步骤E)，使得仅扩增和检测真正的LDR产物。
图51示出用于检测甲基化的另一PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。如以上关于图50所示和所述的，在步骤A-C之后产生了含有目标原始甲基化残基和dU的PCR产物。在这个实施方案中，甲基区特异性连接寡核苷酸含有UniTaq检测引物特异性序列(Ai和Ci’)和标签序列(Bi’)以进行后续PCR扩增检测。如上所述使用UniTaq特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增并检测连接产物(图51，步骤E-G)。
图52示出用于检测甲基化的另一PCR-qLDR遗留预防反应。与图50和51中所示的实施方案类似，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图52，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化残基转化为尿嘧啶，从而使得双链DNA为非互补的。如图52B中所示，在将裂解含有未甲基化残基的遗留DNA的BstU1(CG^CG)(实心三角形)存在下使含有3’可裂解阻断基团的基因座特异性引物杂交。一旦引物与其互补靶序列杂交，就去除阻断基团并且在dUTP存在下使用PCR扩增目标含甲基的区。在这个实施方案中，基因座特异性引物含有通用尾(具有相同的8-11个碱基以防止引物二聚体)，这能够进行后续通用引物扩增以附加5’生物素基团。在扩增过程中可使用阻断寡核苷酸引物以限制野生型扩增子的形成。
通过5’生物素基团将扩增产物捕获在固体支持物上(图52，步骤C)。如图52D中所示，使用甲基区特异性连接寡核苷酸探针形成连接产物，其中下游探针含有5’受体基团和与上游连接探针的3’序列尾互补的序列尾。上游连接探针还含有3’供体基团，使得在形成连接产物后，产物的5’和3’互补区杂交，从而使受体基团和供体基团彼此亲密接近以产生用于检测目标甲基化残基的FRET信号(图52步骤E)。
图151示出用于检测低水平靶甲基化的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。分离基因组DNA或cfDNA(图151，步骤A)，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG处理分离的DNA样品以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图151，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化残基转化为尿嘧啶，从而使得双链DNA为非互补的。使用基因座特异性上游引物、基因座特异性下游引物、包含亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列或其互补序列的阻断LNA或PNA探针以及包含dUTP的脱氧核苷酸混合物选择性扩增目标区。在这个实施方案中，可通过在上游引物以及下游引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放上游引物的为甲基化位点上游的数个碱基并适于聚合酶延伸的3’OH基团(图151，步骤B)。包含与上游PCR引物部分地重叠的亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物和相对于亚硫酸氢盐转化的甲基化序列DNA优先竞争结合亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列，从而抑制亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列DNA在每轮PCR过程中的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图151步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图151步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测。再一次，在PCR扩增步骤过程中，在富集亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列之后，包含亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针的存在抑制上游连接探针与亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列(如存在的话)的杂交。具有为亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列和亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)。上游和下游寡核苷酸探针的连接允许仅对亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图151，步骤D)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或使用本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如以上针对图38所述的连接接点(参见图151，步骤E-G)。
图152示出用于检测低水平靶甲基化的另一示例性PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。分离基因组DNA或cfDNA(图152，步骤A)并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG处理分离的DNA样品以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图152，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化残基转化为尿嘧啶，从而使得双链DNA为非互补的。上游和下游基因座特异性引物被设计成包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放3’OH并且适于聚合酶延伸(图152，步骤B)。包含与上游PCR引物部分地重叠的亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物和相对于亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列优先竞争结合亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列，从而抑制亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列在每轮PCR过程中的扩增。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图152步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。
如图152步骤D中所示，靶特异性寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。再一次，在PCR扩增步骤过程中，在富集亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列之后，包含亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针的存在抑制与亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列(如存在的话)的杂交。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测。具有为亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列和亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列共有的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Bi’-Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列的序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许对仅亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列连接产物进行后续扩增和检测。如这个图的步骤D中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图152，步骤D)。在连接之后，使用UniTaq特异性引物(即F1-Bi-Q-Ai，Ci)扩增连接产物并且如以上针对图44所述那样或使用本领域已知的其他合适手段进行检测(参见图152，步骤E-H)。
图153示出用于检测低水平靶甲基化的另一示例性PCR-qLDR遗留预防反应。分离基因组DNA或cfDNA(图153，步骤A)，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG处理分离的DNA样品以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图153，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化残基转化为尿嘧啶，从而使得双链DNA为非互补的。上游和下游基因座特异性引物被设计成包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放3’OH并且适于聚合酶延伸(图153，步骤B)。包含与上游PCR引物部分地重叠的亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物和相对于亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列优先竞争结合亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列，从而抑制亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列在每轮PCR过程中的扩增。在这个实施方案中，下游基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，其能够使用生物素标记的引物进行通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图153，步骤B)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。如图153步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列特异性连接探针检测目标亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列，如图153步骤D中所示。再一次，在PCR扩增步骤过程中，在富集亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列之后，包含亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针的存在抑制与亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列(如存在的话)的连接。在这个实施方案中，具有能够检测亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列核酸序列(而不检测亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图153步骤D)。在连接之后(图153，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图153，步骤F)。
在本发明的这个方面的另一实施方案中，一级寡核苷酸引物组的第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶序列中的与一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
根据这个实施方案，DNA聚合酶是缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的一种DNA聚合酶。任选地，一级寡核苷酸引物还含有可裂解核苷酸或核苷酸类似物，其在聚合酶链式反应的杂交步骤过程中被裂解以释放寡核苷酸引物上的游离3’OH端，从而适于延伸。使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理和杂交处理的一个或多个附加的聚合酶链式反应循环，在变性处理中，将来自反应的延伸产物彼此分开，在杂交处理中，第一一级寡核苷酸引物与产生自第二一级寡核苷酸引物的延伸产物杂交。产生自第二一级引物的延伸产物在延伸产物内的3’端与互补序列之间形成分子内环-发夹，所述环-发夹(i)包含在与亚硫酸氢盐处理的甲基化序列杂交情况下抑制自延伸的3’端处或附近的一个或多个错配或(ii)包含在与亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶序列自杂交的情况下增强自延伸的3’端处的匹配。第二一级寡核苷酸引物与产生自第一一级寡核苷酸引物的延伸产物杂交。产生自第一一级寡核苷酸引物的延伸产物在延伸产物内的5’部分与互补序列之间形成分子内环-发夹。在PCR的延伸步骤中，第一一级寡核苷酸引物(i)优先在包含亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列的延伸产物上延伸，从而优先形成包含亚硫酸氢盐处理的甲基化靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物，或(ii)由于先前在所述靶标上的自杂交和自延伸而抑制形成包含亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。第二一级寡核苷酸引物(iii)在不依赖靶序列的延伸产物上延伸，其中优先扩增亚硫酸氢盐处理的甲基化序列，这归因于产生自第一一级寡核苷酸引物与靶标或其拷贝的杂交的不同的一级延伸产物，从而在所述一级聚合酶链式反应过程中富集亚硫酸氢盐处理的甲基化序列延伸产物及其互补序列。
图156和图157示出本发明的这个实施方案。如图156中所示，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG(37℃，30-60分钟)处理样品以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图156，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化的dC残基转化为尿嘧啶(dU)，从而使得双链DNA为非互补的。使用以下项选择性地扩增目标区：(i)也包含5’序列部分的基因座特异性上游引物，所述5’序列部分与顶链的亚硫酸氢盐处理的未甲基化序列互补从而允许在延伸之后形成环-发夹，(ii)基因座特异性下游引物，以及(iii)包含dUTP的脱氧核苷酸混合物。如这个图步骤B中所示的，可通过在上游突变特异性引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图156，步骤B)。任选地，在PCR之前将消化的样品等分到12、24、48或96个孔中。如图156步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。图156步骤D进一步示出，在后续轮的扩增中中：(i)变性的亚硫酸氢盐处理的未甲基化底链形成在3’端处具有完全匹配、被聚合酶延伸的环-发夹，(ii)变性的亚硫酸氢盐处理的甲基化底链形成具有两个或更多个错配、通常不被聚合酶延伸的环-发夹，并且(iii)变性的顶链在其5’侧形成环-发夹，所述环-发夹在72℃下的PCR的延伸步骤过程中变性。图156步骤E进一步示出：在亚硫酸氢盐处理的未甲基化DNA上的环-发夹延伸后，(i)延伸的发夹序列在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。然而，亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA的环-发夹序列(ii)由于两个或更多个错配碱基而未延伸，并且由此在72℃下变性，从而能够使上游引物产生全长的顶链。同样地，顶链产物(iii)在72℃下变性，从而允许聚合酶产生全长的底链。在存在亚硫酸氢盐处理的未甲基化(i)和亚硫酸氢盐处理的甲基化(ii)模板的情况下上游引物的环-发夹延伸偏好性的差异导致在每个扩增循环过程中优先去除亚硫酸氢盐处理的未甲基化扩增产物，并且由此使得优先扩增亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA。
如图156步骤G中所示，对亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列具有特异性的寡核苷酸探针与扩增产物杂交并且当与其互补序列杂交时连接酶(实心圆圈)将两种寡核苷酸共价封接在一起。在这个实施方案中，具有特异性用于检测目标亚硫酸氢盐处理的甲基化序列的上游寡核苷酸探针还含有5’引物特异性部分(Ai)以有利于连接产物的后续检测，而具有特异性用于检测亚硫酸氢盐处理的未甲基化核酸序列的序列的任选上游寡核苷酸探针不含有5’引物特异性部分。具有特异性用于检测亚硫酸氢盐处理的甲基化序列的序列的下游寡核苷酸探针含有3’引物特异性部分(Ci’)，所述3’引物特异性部分连同具有特异性用于检测目标亚硫酸氢盐处理的甲基化序列的上游探针的5’引物特异性部分(Ai)允许对仅突变型连接产物进行后续扩增和检测。如这个图中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(Blk3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图156，步骤H)。在连接之后，可使用匹配的引物对Ai和Ci和TaqManTM探针或使用本领域中已知的其他合适手段检测连接产物，所述TaqManTM探针跨越如图38中所述的连接接点(参见图156，步骤H-J)。
图157示出用于检测甲基化的另一PCR-qLDR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图157，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化的dC残基转化为尿嘧啶(dU)，从而使得双链DNA为非互补的。使用以下项选择性地扩增目标区：(i)也包含5’部分的基因座特异性上游引物，所述5’部分具有与顶链的亚硫酸氢盐处理的未甲基化序列互补的序列从而允许在延伸之后形成环-发夹，(ii)基因座特异性下游引物，以及(iii)包含dUTP的脱氧核苷酸混合物。如这个图中所示的，可通过在上游引物中包含3’可裂解阻断基团(Blk 3’，例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层选择性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团(图157，步骤B)。任选地，在PCR之前将消化的样品等分到12、24、48或96个孔中。如图157步骤C所示，扩增产物含有dU，这允许用UDG或类似酶进行后续处理以实现遗留预防。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。图157，步骤D进一步示出：在后续轮的扩增中，(i)变性的亚硫酸氢盐处理的未甲基化底链形成在3’端处具有完全匹配、被聚合酶延伸的环-发夹，(ii)变性的亚硫酸氢盐处理的甲基化底链形成具有两个或更多个错配、通常不被聚合酶延伸的环-发夹，并且(iii)变性的顶链在其5’侧形成环-发夹，所述环-发夹在72℃下的PCR的延伸步骤过程中变性。图157步骤E进一步示出：在亚硫酸氢盐处理的未甲基化DNA上的环-发夹延伸后，(i)延伸的发夹序列在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。然而，亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA的环-发夹序列(ii)由于两个或更多个错配碱基而未延伸，并且由此在72℃下变性，从而能够使上游引物产生全长的顶链。同样地，顶链产物在72℃下变性，从而允许聚合酶产生全长的底链(iii)。在存在(i)亚硫酸氢盐处理的未甲基化和(ii)亚硫酸氢盐处理的甲基化模板的情况下上游引物的环-发夹延伸偏好性的差异导致在每个扩增循环过程中优先去除亚硫酸氢盐处理的未甲基化扩增产物，并且由此使得优先扩增亚硫酸氢盐处理的甲基化DNA。
在这个实施方案中，下游基因座特异性引物也含有5’引物区，例如通用的引物区，其能够使用生物素标记的引物进行通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物(图157，步骤B)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用对亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列具有特异性的连接探针检测目标亚硫酸氢盐处理的甲基化序列，如图150步骤G中所示。在这个实施方案中，具有能够检测亚硫酸氢盐处理的甲基化核酸序列(而不检测亚硫酸氢盐处理的未甲基化序列)的连接对的连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上对图39所述的。如这个图的步骤G中所示的，可通过在上游连接探针中包含3’可裂解阻断基团(例如C3间隔子)和RNA碱基(r)将另一层特异性结合到方法中。在靶特异性杂交后，RNA酶H(星符号)去除RNA碱基以产生能连接的3’OH基团(图150，步骤G)。在连接之后(图157，步骤H)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图157，步骤I)。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。所述方法包括提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触。所述方法还包括使样品与一种或多种甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中一种或多种所述甲基化敏感性酶裂解样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。提供了一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与靶核苷酸序列中位于一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列。将限制性酶反应混合物与一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成一级聚合酶链式反应混合物。所述方法还包括使一级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物。提供了一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括能够与一级延伸产物杂交的第一嵌套式寡核苷酸引物和第二嵌套式寡核苷酸引物将一级延伸产物与一个或多个二级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成二级聚合酶链式反应混合物，并且使二级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物。对样品中的二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有因一个或多个甲基化残基而不同于样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在。
根据本发明的这个方面，二级聚合酶链式反应混合物还可包含一种或多种寡核苷酸检测探针，例如TaqManTM寡核苷酸检测探针。检测探针与一级延伸产物内的靶核苷酸序列或其互补序列杂交，并且具有淬灭分子和可检测标记，所述淬灭分子和可检测标记彼此分开但彼此又紧密接近使得淬灭分子淬灭可检测标记。在二级聚合酶链式反应过程的杂交步骤过程中，一种或多种寡核苷酸检测探针与一级延伸产物的互补部分杂交，并且在延伸步骤过程中淬灭分子和可检测标记随后从一种或多种寡核苷酸检测探针裂解。在裂解后，可检测标记与淬灭剂分离，使得可检测标记被检测。
在一个实施方案中，一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物可任选地具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，直到可裂解核苷酸或核苷酸类似物被裂解。在裂解后，一种或两种一级寡核苷酸引物上的游离3’OH端被释放，之后允许引物延伸。
在另一个实施方案中，一级寡核苷酸引物组的一级寡核苷酸引物包含相同的或基本相同的5’核苷酸序列部分，所述5’核苷酸序列部分的长度在约6至20个碱基之间。根据这个实施方案，产生的所需延伸产物具有足够的长度，使得一级引物优先与其杂交。然而，当形成不需要的引物二聚体产物时，所述产物将通过其互补5’端自身形成发夹并且不适于继续扩增。
图158示出根据本发明的这个方面的用于检测甲基化的示例性PCR-PCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离基因组DNA或cfDNA并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和/或HinP1I(G^CGC)和UNG处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图158，步骤A)。如图158步骤B中所示，使用基因座特异性引物在dUTP存在下使用PCR扩增目标甲基化区。在一个实施方案中，进行有限循环扩增(12-20个循环)以维持产生的不同扩增子的相对比率。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物含有dU，从而允许遗留预防(图158，步骤C)。任选地，在PCR之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。使用嵌套式或半嵌套式基因座特异性引物和内部的传统TaqManTM检测测定扩增含甲基的区。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防。
图53示出用于检测甲基化的另一PCR-qPCR遗留预防反应。与本发明的其他实施方案类似，分离基因组DNA或cfDNA，并且用甲基敏感性限制性核酸内切酶例如Bsh1236I(CG^CG)和UNG(37℃，30-60分钟)处理以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留(图53，步骤A)。将消化的DNA经亚硫酸氢盐处理以将未甲基化残基转化为尿嘧啶，从而使得双链DNA为非互补的。如图53步骤B中所示，在将裂解含有未甲基化残基的遗留DNA的BstU1(CG^CG)(实心三角形)存在下使含有3’可裂解阻断基团的基因座特异性引物杂交。一旦引物与其互补靶序列杂交，就去除阻断基团。在这个实施方案中，在dNTP存在下使用PCR扩增目标含甲基的区。在这个实施方案中，在扩增过程中使用阻断寡核苷酸引物以限制野生型扩增子的形成。如图53步骤C中所示，PCR产物是未甲基化的，从而提供了遗留预防。
如图53步骤D和E中所示，将PCR产物等分到单独孔中以使用基因座特异性引物和TaqManTM探针(黑条)进行TaqManTM检测，所述基因座特异性引物任选地与基因座特异性引物的一级组成嵌套式或半嵌套式。任选地，还可在这个反应中掺入阻断寡核苷酸(粗黑条)以限制野生型扩增子的形成。在这个实施方案中，在dUTP存在下进行TaqManTM反应，以允许遗留预防。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中含有靶核糖核苷酸序列的一个或多个核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核苷酸序列由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而不同于样品中其他核糖核酸分子中的核糖核苷酸序列。所述方法包括提供含有一个或多个核糖核酸分子的样品，所述一个或多个核糖核酸分子潜在含有不同于其他核糖核酸分子中的核糖核苷酸序列的靶核糖核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与含有靶核糖核苷酸序列的一个或多个核糖核酸分子互补。将所接触的样品与一种或多种寡核苷酸引物和反转录酶共混以形成反转录混合物，并且在反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。每个cDNA分子包含与靶核糖核苷酸序列互补的核苷酸序列并且含有dU。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近cDNA的靶核糖核苷酸序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。将含有cDNA分子的反转录混合物与一个或多个寡核苷酸引物组和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物。所述方法还包括提供一个或多个寡核苷酸探针组。每个探针组包括(a)具有靶序列特异性部分的第一寡核苷酸探针和(b)具有靶序列特异性部分的第二寡核苷酸探针其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式彼此相邻地杂交于互补一级延伸产物上，在所述第一寡核苷酸探针与所述第二寡核苷酸探针之间具有接点。使一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物，并且将一个或多个寡核苷酸探针组的第一探针和第二探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列。对样品中的连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而不同于样品中其他核糖核酸分子中的核糖核苷酸序列的靶核糖核苷酸序列的一个或多个核糖核酸分子的存在。
图54-85示出本发明的这个方面的各个实施方案。
图54示出对用于检测mRNA水平上的易位的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。在图54步骤A中在DNA水平上示出两个基因之间的易位图示。示出了mRNA中外显子1-b(mRNA融合物1)、2-b(mRNA融合物2)和3-b(mRNA融合物3)之间的不同融合接点的实例(图54，步骤B)。所述方法包括从全血细胞、外来体或循环肿瘤细胞(CTC)中分离mRNA，以及使用反转录酶和与外显子b互补的引物产生cDNA。使用针对外显子1、2和3的正向引物和针对外显子b的引物PCR扩增产生的cDNA(图54，步骤B)。不依赖于易位断裂点，引物扩增含有外显子接点区的最小片段。在图54步骤C中示出PCR扩增过程中形成的各种产物。
使用外显子接点特异性连接寡核苷酸探针进行LDR。连接探针可被设计成含有适于使用引物(Ai，Ci)和TaqManTM探针进行后续检测的标签引物特异性部分(例如，Ai，Ci’)(图54，步骤C-D，左图)。另选地，连接探针可被设计成含有UniTaq引物特异性部分(Ai，Ci’)和标签特异性部分(Bi’)(图54，步骤C-D，右图)。在形成外显子接点特异性连接产物之后，PCR扩增并检测连接产物(图54，步骤D)。当使用标签特异性引物(Ai，Ci)用于扩增LDR产物时，每种TaqManTM探针跨越连接接点，并且可单独评分。当使用UniTaq特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)用于扩增LDR产物时，相同引物组不依赖于特异性外显子接点对给定易位进行评分。
图55示出用于检测mRNA水平上的易位的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离mRNA(图55，步骤A)，并且用UDG对其处理以实现遗留预防(图55，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图55，步骤B)。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dUTP，从而允许遗留预防(图55，步骤C)。
如图55步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图55，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图55，步骤E)。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图55，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图56示出用于检测mRNA水平上的易位的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。在这个实施方案中，分离mRNA(图56，步骤A)，并且用UDG对其处理以实现遗留预防(图56，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图56，步骤B)。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图56，步骤C)。
如图56步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增和检测的UniTaq引物特异性部分(Ai，Ci’)和标签部分(Bi’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针与对应于待检测的靶mRNA分子的核酸序列杂交(图56，步骤D)。在连接寡核苷酸探针之后，将样品进行UDG处理以去除原始靶扩增子，从而允许使用如上所述的UniTaq特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)选择性扩增和检测连接产物(图56，步骤E-F)，从而有利于mRNA易位mRNA融合的检测。如图56步骤E和F中所示，扩增的连接产物掺入有dUTP，以允许将来的遗留预防。
图57示出对用于检测mRNA水平上的易位的RT-PCR-qLDR遗留预防反应的实例。在这个实施方案中，分离mRNA(图57，步骤A)，并且用UDG对其处理以实现遗留预防(图57，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图57，步骤B)。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图57，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用外显子接点特异性连接探针检测目标区，如图57步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图57，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图57，步骤E)。
图58示出对用于检测可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。图58步骤A为在DNA水平上示出的具有5个外显子的基因的图示，并且图58步骤B示出正常(1-2-3a-4)和可变剪接(1-2-3b-4)的变体mRNA的实例。所述方法包括从全血细胞、外来体或CTC中分离mRNA，以及使用反转录酶和与外显子4互补的引物产生cDNA，如图58步骤B中所示。使用外显子4引物和针对外显子2的正向引物PCR扩增cDNA，以产生正常和可变剪接的变体(如果存在的话)的扩增子。如图58步骤C中所示，含有标签-引物序列(Ai，Ci’；左图)或UniTaq引物和标签序列(Ai，Bi’-Ci’；右图)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针与其在PCR产物中的对应靶序列杂交，并且如果在接点处存在完全互补性，则连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起。如上所述，使用标签特异性引物(Ai，Ci)和TaqManTM探针(F1-Q或F2-Q，图58步骤D，左图)或UniTaq引物(F1-Bi-Q-Ai，F2-Bi-Q-Ai，Ci，图58步骤D，右图)扩增并检测连接产物。
图59示出用于定量野生型和可变剪接的mRNA转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图59步骤A示出含有外显子3a的野生型转录物(上方)和含有待检测的外显子3b的可变剪接转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图59，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图59，步骤B)。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图59，步骤C)。如图59步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的标签-引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图59，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q和F2-Q)进行检测(图59，步骤E-F)。使用实时PCR和检测不同标记的TaqManTM探针来定量和区分野生型变体和可变剪接变体。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图59，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图60示出用于定量野生型和可变剪接的mRNA转录物的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图60步骤A示出含有外显子3a的野生型转录物(上方)和含有待检测的外显子3b的可变剪接转录物(下方)。所述方法的步骤A-D基本上与针对图59所述的相同，不同之处是外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于野生型和可变剪接变体的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图60步骤E-G中示出的。
图61示出用于定量野生型和可变剪接的mRNA转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。图61步骤A示出含有外显子3a的野生型转录物(上方)和含有待检测的外显子3b的可变剪接转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图61，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图61，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用外显子接点特异性连接探针检测目标区，如图61步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图61，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图61，步骤E)。
图62示出用于检测低水平的可变剪接转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图62步骤A示出含有外显子3a的野生型转录物(上方)和含有待检测的外显子3b的低水平的可变剪接转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图62，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(即针对外显子4)和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图62，步骤B)。在这个实施方案中，利用对可变剪接变体(即外显子3b)具有特异性并且不与野生型变体(即外显子3a)杂交的引物，以仅产生对应于可变剪接变体的扩增产物。PCR产物掺入了dUTP，从而允许遗留预防(图62，步骤C)。如图62步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图62，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图62，步骤E-F)。在实时PCR过程中通过释放TaqManTM探针的荧光基团来检测可变剪接变体。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图62，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图63和64示出用于检测低水平的可变剪接转录物的类似RT-PCR-LDR-qPCR和RT-PCR-qLDR遗留预防反应，如关于图62所述和示出的。在图63的实施方案中，外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于可变剪接变体的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和如在图63步骤E-G中示出的。在图64的实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图64，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分(D、F2)彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图64，步骤E)。
图65示出对用于检测可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。图65步骤A在DNA水平上示出具有3个外显子以及可变起始位点和第一外显子的基因的图示。图65步骤B示出正常(1-2-3)和可变剪接变体(1a-2-3)mRNA的实例。所述方法包括从全血细胞、外来体或CTC中分离mRNA，以及使用反转录酶和与外显子2互补的引物产生cDNA，如图65步骤B中所示。使用外显子2引物和与外显子1或外显子1a互补的正向引物PCR扩增cDNA以产生两种剪接变体的扩增子。如图65步骤C中所示，含有标签-引物序列(Ai，Ci’；左图)或UniTaq引物和标签序列(Ai，Bi’-Ci’；右图)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针与其在PCR产物中的对应靶序列杂交，并且如果在接点处存在完全互补性，则连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起。如上所述，使用标签特异性引物(Ai，Ci)和TaqManTM探针(F1-Q或F2-Q；图58步骤D，左图)或UniTaq引物(F1-Bi-Q-Ai，F2-Bi-Q-Ai和Ci，图58步骤D，右图)扩增并检测连接产物。
图66示出用于定量含有野生型起始位点和可变转录起始位点的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图66步骤A示出含有外显子1的野生型转录物(上方)和具有外显子1a作为起始位点的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图66，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。使用外显子2特异性引物和与外显子1或外显子1a互补的正向引物PCR扩增cDNA以产生两种剪接变体的扩增子。进行有限的PCR扩增(12-20个循环)以维持不同扩增子的相对比率(图66，步骤B)。在另一实施方案中，使用20-40个PCR循环扩增目标区。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图66，步骤C)。如图66步骤D中所示，含有适于后续TaqManTM PCR扩增的标签-引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图66，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q和F2-Q)进行检测(图66，步骤E-F)。使用实时PCR和检测不同标记的TaqManTM探针来定量和区分野生型和可变转录物起始位点变体。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图66，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图67示出用于定量野生型和可变剪接的mRNA转录物的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图67步骤A示出含有外显子1的野生型转录物(上方)和具有外显子1a作为起始位点的可变转录物(下方)。所述方法的步骤A-D基本上与针对图66所述的相同，不同之处是外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于野生型和变体转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图67步骤E-F中示出的。
图68示出用于定量野生型和可变剪接的mRNA转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。图68步骤A示出含有外显子1的野生型转录物(上方)和具有外显子1a作为起始位点的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图68，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。使用外显子2引物和与外显子1或外显子1a互补的正向引物PCR扩增cDNA以产生两种剪接变体的扩增子。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图68，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用外显子接点特异性连接探针检测目标区，如图68步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图68，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图68，步骤E)。
图69示出用于检测低水平的可变起始位点转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图69步骤A示出含有外显子1的野生型转录物(上方)和具有外显子1a作为起始位点的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图69，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图69步骤B)。在这个实施方案中，利用对可变转录物(即外显子1a)具有特异性并且不与野生型变体(即外显子1)杂交的引物，以仅产生对应于可变转录物的扩增产物。PCR产物掺入了dUTP，从而允许遗留预防(图69，步骤C)。如图69步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图69，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图69，步骤E-F)。在实时PCR过程中通过释放TaqManTM探针的荧光基团来检测可变转录物。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图69，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图70和71示出用于检测低水平的可变起始位点转录物的类似RT-PCR-LDR-qPCR和RT-PCR-qLDR遗留预防反应，如关于图69(步骤A-C)所述和示出的，其中利用仅对可变转录的扩增具有特异性的引物。在图70的实施方案中，外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于可变起始位点转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和如在图70步骤E-G中示出的。在图71的实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图71，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分(D、F2)彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图71，步骤E)。
图72示出对用于检测外显子缺失的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。图72步骤A示出在DNA水平上具有5个外显子和4个内含子的基因的图示。图72步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和其中缺失外显子4的可变转录物(下方，即外显子1-3和5)的实例。所述方法包括从全血细胞、外来体或CTC中分离mRNA，以及使用反转录酶和与外显子5互补的引物产生cDNA，如图72步骤B中所示。使用外显子5引物结合与外显子3和外显子4互补的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和缺失变体的扩增子。如图72步骤C中所示，含有标签-引物序列(Ai，Ci’；，左图)或UniTaq引物和标签序列(Ai，Bi’-Ci’；右图)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针与其在PCR产物中的对应靶序列杂交，并且如果在接点处存在完全互补性，则连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起。如上所述，使用标签特异性引物(Ai，Ci)和TaqManTM探针(F1-Q或F2-Q；图72步骤D，左图)或UniTaq引物(F1-Bi-Q-Ai，F2-Bi-Q-Ai和Ci，图72步骤D，右图)扩增并检测连接产物。
图73示出用于定量野生型转录物和具有外显子缺失的转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图73步骤A示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和仅具有外显子1-3和5、丢失外显子4的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图73，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子5特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子5引物结合与外显子3和外显子4互补的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和缺失变体的扩增子。进行有限的PCR扩增(12-20个循环)以维持不同扩增子的相对比率(图73，步骤B)。在另一实施方案中，使用20-40个PCR循环扩增目标区。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图73，步骤C)。如图73步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图73，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q和F2-Q)进行检测(图73，步骤E-F)。使用实时PCR和检测不同标记的TaqManTM探针来定量和区分野生型和缺失变体。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图73，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图74示出用于定量野生型转录物和具有外显子缺失的转录物的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图74步骤A示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和仅具有外显子1-3和5、丢失外显子4的可变转录物(下方)。所述方法的步骤A-D基本上与针对图73所述的相同不同之处是外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于野生型和变体转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图74步骤E-G中示出的。
图75示出用于定量野生型转录物和具有外显子缺失的转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。图75步骤A示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和仅具有外显子1-3和5、丢失外显子4的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图75，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子5特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子5引物结合与外显子3和外显子4互补的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和缺失变体的扩增子。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图75，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用外显子接点特异性连接探针检测目标区，如图75步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图75，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图75，步骤E)。
图76示出用于检测具有外显子缺失的低水平转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图76步骤A示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和仅具有外显子1-3和5、丢失外显子4的可变转录物(下方)。所述方法包括分离mRNA以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图76，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子5特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子5引物结合与外显子3互补的正向引物和阻断寡核苷酸来PCR扩增cDNA。阻断寡核苷酸与野生型转录物中的外显子4杂交，从而防止野生型转录物扩增。因此，产生仅对应于缺失转录物的扩增产物。PCR产物掺入了dUTP，从而允许遗留预防(图76，步骤C)。如图76步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的标签引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图76步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图76，步骤E-F)。在实时PCR过程中通过释放TaqManTM探针的荧光基团来检测缺失转录物。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图76，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图77和78示出用于检测低水平的缺失转录物的类似RT-PCR-LDR-qPCR和RT-PCR-qLDR遗留预防反应，如关于图76所述和示出的。在图77的实施方案中，外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于缺失转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和如在图77步骤E-G中示出的。在图78的实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图78，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分(D、F2)彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图78，步骤E)。
图79示出对用于检测内含子插入的可变剪接的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应的概述。图79步骤A示出在DNA水平上具有5个外显子和4个内含子的基因的图示。图79步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和含有外显子1-5和内含子i1插入的可变剪接转录物(下方)的实例。所述方法包括从全血细胞、外来体或CTC中分离mRNA，以及使用反转录酶和与外显子2互补的引物产生cDNA，如图79步骤B中所示。使用外显子2特异性引物结合针对外显子1的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和内含子插入变体的扩增子。如图79步骤C中所示，含有标签-引物序列(Ai，Ci’；左图)或UniTaq引物和标签序列(Ai，Bi’-Ci’；右图)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针与其在PCR产物中的对应靶序列杂交，并且如果在接点处存在完全互补性，则连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起。如上所述，使用标签特异性引物(Ai，Ci)和TaqManTM探针(F1-Q或F2-Q；图79步骤D，左图)或UniTaq引物(F1-Bi-Q-Ai，F2-Bi-Q-Ai和Ci，图79步骤D，右图)扩增并检测连接产物。
图80示出用于定量野生型转录物和含有内含子插入的可变剪接转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图80步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和含有外显子1-5和内含子i1插入的可变剪接转录物(下方)的实例。所述方法包括分离mRNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图80，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子2特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子2特异性引物结合针对外显子1的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和内含子插入变体的扩增子。进行有限的PCR扩增(12-20个循环)以维持不同扩增子的相对比率(图80，步骤B)。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标区。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图80，步骤C)。如图80步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的标签引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图80，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q和F2-Q)进行检测(图80，步骤E-F)。使用实时PCR和检测不同标记的TaqManTM探针来定量和区分野生型和插入变体。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图80，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图81示出用于定量野生型转录物和含有内含子插入的可变剪接转录物的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图81步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和含有外显子1-5和内含子i1插入的可变剪接转录物(下方)的实例。所述方法的步骤A-D基本上与针对图80所述的相同，不同之处是外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于野生型和变体转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图81步骤E-G中示出的。
图82示出用于定量野生型转录物和含有内含子插入的可变剪接转录物的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。图82步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和含有外显子1-5和内含子i1插入的可变剪接转录物(下方)的实例。所述方法包括分离mRNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图82，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子2特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子2特异性引物结合针对外显子1的正向引物来PCR扩增cDNA，以产生野生型和内含子插入变体的扩增子。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图82，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用外显子接点特异性连接探针检测目标区，如图82步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图82，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图82，步骤E)。
图83示出用于检测含有内含子插入的低水平转录物的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。图83步骤B示出含有外显子1-5的野生型转录物(上方)和含有外显子1-5和内含子i1插入的可变剪接转录物(下方)的实例。所述方法包括分离mRNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图83，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物(例如外显子2特异性引物)和反转录酶产生cDNA。使用外显子2引物结合内含子特异性正向引物来PCR扩增cDNA。内含子特异性引物不扩增野生型转录物，由此扩增仅含有内含子i1的转录物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图83，步骤C)。如图83步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的外显子接点特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图83，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图83，步骤E-F)。在实时PCR过程中通过释放TaqManTM探针的荧光基团来检测含有内含子插入的转录物。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图83，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，提供了附加的遗留预防。
图84和85示出用于检测低水平的内含子插入转录物的类似RT-PCR-LDR-qPCR和RT-PCR-qLDR遗留预防反应，如关于图83所述和示出的。在图84的实施方案中，外显子接点特异性连接探针被设计成含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对对应于内含子插入转录物的连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和如在图84步骤E-G中示出的。在图85的实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图85，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分(D、F1)彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图85，步骤E)。
本发明的方法适于定量或计数样品中的一种或多种靶核苷酸序列的量。例如，可利用本发明的方法来计数样品中的一个或多个靶核酸分子的相对拷贝数，如图86-91中所示。
图86示出用于计数DNA拷贝数的PCR-LDR遗留预防反应。所述方法包括从CTC、肿瘤特异性外来体或另一生物样品中分离DNA，以及用UDG处理以实现遗留预防(图86，步骤B)。使用有限循环的PCR(12-20个循环)扩增目标染色体区以维持不同扩增子的相对比率(图86，步骤B)。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标染色体区。对于准确的计数，在PCR扩增之前将样品分散到12、24、48或96个孔中。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图86，步骤C)。如图86步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的基因座特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图86，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图86，步骤E-F)。基于不同孔或室中信号的泊松分布确定DNA拷贝数。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图86，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图87示出用于计数DNA拷贝数的另一PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括与如图86中所示的方法基本上相同的步骤(即步骤A-D)；然而，在这个实施方案中，基因座特异性连接探针被设计含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图87步骤E-G中示出的。基于不同孔或室中信号的泊松分布确定拷贝数。
图88还示出用于计数DNA拷贝数的PCR-qLDR遗留预防反应。所述方法包括从CTC、肿瘤特异性外来体或其他生物样品中分离DNA，以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图88，步骤B)。使用有限循环的PCR(12-20个循环)扩增目标染色体区以维持不同扩增子的相对比率(图88，步骤B)。在另一实施方案中，使用20-40个循环扩增目标染色体区。对于准确的计数，在PCR扩增之前将样品等分到12、24、48或96个孔中。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图88，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用基因座特异性连接探针检测目标区，如图88步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图88，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图88，步骤E)。基于不同孔或室中信号的泊松分布确定拷贝数。
图89示出用于计数RNA拷贝数的RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括从全血细胞、外来体、CTC或其他生物样品中分离RNA，以及用UDG处理以实现遗留预防(图89，步骤B)。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图89，步骤B)。对于准确的计数，在PCR扩增之前将样品分散到12、24、48或96个孔中。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图89，步骤C)。如图89步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的标签引物特异性部分(Ai，Ci’)的基因座特异性连接寡核苷酸探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图89，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图89，步骤E-F)。基于不同孔或室中信号的泊松分布使用实时PCR定量RNA拷贝数。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图89，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图90示出用于计数RNA拷贝数的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。对于准确的计数，在PCR扩增之前将样品分散到12、24、48或96个孔中。所述方法包括与如图89中所示的方法基本上相同的步骤(即步骤A-D)；然而，在这个实施方案中，基因座特异性连接探针被设计含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图90步骤E-G中示出的。基于不同孔或室中信号的泊松分布确定拷贝数。
图91示出用于计数RNA拷贝数的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。所述方法包括从全血细胞、外来体、CTC或另一生物样品中分离RNA，以及用UDG处理以实现遗留预防(图91，步骤B)。对于准确的计数，在PCR扩增之前将样品分散到12、24、48或96个孔中。在dUTP存在下使用3’转录物特异性引物和反转录酶产生cDNA。激活Taq聚合酶以进行有限循环的PCR扩增(12-20个)以维持不同扩增子的相对比率(图91，步骤B)。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图91，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用基因座特异性连接探针检测目标区，如图91步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的外显子接点特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图91，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图91，步骤E)。基于不同孔或室中信号的泊松分布确定拷贝数。本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶微核糖核苷酸序列的一个或多个微核糖核苷酸(miRNA)分子的方法，所述靶微核糖核苷酸序列因一个或多个碱基而不同于所述样品中的其他miRNA分子中的微核糖核苷酸序列。所述方法包括提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子潜在含有因一个或多个碱基而不同于所述样品中的其他miRNA分子中的微核糖核苷酸序列的靶微核糖核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。提供了一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与第二寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将所接触的样品与引物组的一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物。第一寡核苷酸引物与含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子(如果样品中存在的话)杂交，并且反转录酶使杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物。所述方法还包括将反转录反应混合物与引物组的第二寡核苷酸引物、第三寡核苷酸引物和第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与延伸的第一寡核苷酸引物的包含含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含5’引物特异性部分、对应于miRNA分子的靶微核糖核苷酸序列的核苷酸序列和内引物特异性部分的互补序列的一级延伸产物。使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物。所述方法还包括将多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)具有靶特异性部分的第一寡核苷酸探针和(b)具有靶特异性部分和与一级延伸产物互补的部分的第二寡核苷酸探针，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式彼此相邻地杂交于一级延伸产物的互补靶特异性部分上，在所述第一寡核苷酸探针与所述第二寡核苷酸探针之间具有接点。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定含有因一个或多个碱基而不同于所述样品中的其他miRNA分子的微核糖核苷酸序列的靶微核糖核苷酸序列一个或多个miRNA分子。
图92示出用于定量miRNA的PCR-LDR遗留预防反应。所述方法包括从外来体或另一生物样品中分离RNA，以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图92，步骤B)。具有与靶miRNA的3’端互补的部分并且含有茎-环、标签(Tj)和阻断基团(实心圆圈)的寡核苷酸引物与靶miRNA的3’端杂交。在dUTP存在下使用反转录酶(实心方块)延伸寡核苷酸引物的3’端(图92，步骤B)。激活Taq聚合酶以使用包含与反转录miRNA的部分和上游引物特异性序列部分(Ti)互补的序列的搭桥引物和标签(Ti，Tj)引物进行有限循环的PCR扩增(12-20个)，如图92步骤B所示。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。任选地，在PCR之前可将样品等分到12、24、48或96个孔中。PCR产物掺入了dUTP，从而允许遗留预防(图92，步骤C)。如图92步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的miRNA序列特异性连接探针以碱基特异性方式与其在PCR产物中的对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图92，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图92，步骤E-F)。基于检测TaqManTM探针的释放标签，使用实时PCR定量样品中miRNA的存在。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图92，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图93示出用于定量miRNA的另一RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括与如图92中所示的方法基本上相同的步骤(即步骤A-D)；然而，在这个实施方案中，miRNA特异性连接探针被设计含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图93步骤E-G中示出的。
图94还示出用于定量miRNA的RT-PCR-qLDR遗留预防反应。所述方法包括从外来体或另一生物样品中分离RNA，以及用UDG对其处理以实现遗留预防(图94，步骤B)。具有与靶miRNA的3’端互补的部分并且含有茎-环、标签(Tj)和阻断基团(实心圆圈)的寡核苷酸引物与靶miRNA的3’端杂交。在dUTP存在下使用反转录酶(实心菱形)延伸寡核苷酸引物的3’端(图94，步骤B)。激活Taq聚合酶以使用包含与反转录miRNA的部分和上游引物特异性序列部分(Ti)互补的序列的搭桥引物和标签(Ti，Tj)引物进行有限循环的PCR扩增(12-20个)，如图94步骤B所示。引物含有相同的8-11个碱基的尾，以防止引物二聚体，和通用的引物特异性部分，以能够使用生物素标记的引物进行后续通用PCR扩增以将5’生物素附加至含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图94，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用miRNA序列特异性连接探针检测目标区，如图94步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的miRNA序列特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图94，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图94，步骤E)。
本发明的另一方面涉及用于鉴定样品中的含有靶微核糖核苷酸序列的一个或多个微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述靶微核糖核苷酸序列因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子。所述方法包括提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子潜在含有因一个或多个碱基差异而在序列上不同于其他miRNA分子的靶微核糖核苷酸序列；以及使样品与能够消化样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触。将所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应。所述方法还包括将含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子在其3’端处连接至第一寡核苷酸探针的5’磷酸以产生包含附加至第一寡核苷酸探针的含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子。提供了一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与含有靶微核糖核苷酸序列的miRNA分子的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸探针的内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与第一寡核苷酸引物的5’引物特异性部分相同的核苷酸序列。将嵌合核酸分子与一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的一种或多种第二寡核苷酸引物与嵌合核酸分子的内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸以产生嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列。所述方法还包括将反转录反应混合物与引物组的第一寡核苷酸引物和第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物，并且使聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一级延伸产物。一级延伸产物包含5’引物特异性部分、对应于miRNA分子的靶微核糖核苷酸序列的核苷酸序列和内引物特异性部分或其互补序列。将一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物。每个寡核苷酸探针组包括(a)具有靶特异性部分的第一寡核苷酸探针和(b)具有靶特异性部分和与一级延伸产物互补的部分的第二寡核苷酸探针，其中探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式彼此相邻地杂交于一级延伸产物的互补靶特异性部分上，在所述第一寡核苷酸探针与所述第二寡核苷酸探针之间具有接点。将一个或多个寡核苷酸探针组的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针连接在一起以在连接反应混合物中形成连接产物序列，并且对样品中连接产物序列进行检测和区分，从而鉴定含有因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的靶微核糖核苷酸序列一个或多个miRNA分子。
图95示出用于定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括从外来体中分离RNA以及用UDG处理以实现遗留预防(图95，步骤B)。具有与靶miRNA的3’端互补的部分并且含有茎-环、标签(Tj’)和阻断基团(实心圆圈)的寡核苷酸探针在其5’端与靶miRNA的3’端连接。连接产物包含miRNA、Tj’标签、阻断基团和与miRNA的3’部分互补的序列(图95，步骤B)。使用针对Tj’的引物和反转录酶产生cDNA。使用包含与反转录miRNA的部分和上游引物特异性序列部分(Ti)互补的序列的搭桥引物和标签(Ti，Tj)引物通过Taq聚合酶以有限循环的PCR扩增(12-20个循环)扩增cDNA，如图95步骤B所示。另选地，使用20-40个PCR循环扩增cDNA。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。任选地，在PCR之前可将样品等分到12、24、48或96个孔中。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图95，步骤C)。
如图95步骤D中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的miRNA序列特异性连接探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图95，步骤D)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图95，步骤E-F)。基于检测TaqManTM探针的释放标签，使用实时PCR定量样品中miRNA的存在。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图95，步骤E)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图96示出用于定量miRNA的另一连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括与如图95中所示的方法基本上相同的步骤(即步骤A-D)；然而，在这个实施方案中，miRNA特异性连接探针被设计含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图96步骤E-G中示出的。
图97示出用于定量miRNA的连接-RT-PCR-qLDR遗留预防反应。所述方法包括与图95中所述和所示出的基本上相同的步骤，即步骤A和B。然而，在这个实施方案中，使用至少一种生物素标记的引物扩增步骤B中产生的cDNA以将5’生物素附加于含有目标区的扩增产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图97，步骤C)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用miRNA序列特异性连接探针检测目标区，如图97步骤D中所示。在这个实施方案中，连接对的miRNA序列特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图97，步骤D)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图97，步骤E)。
图98示出用于定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括从外来体或另一生物样品中分离RNA，以及用UDG处理以实现遗留预防(图98，步骤B)。具有与靶miRNA的3’端互补的部分并且含有茎-环、标签(Tj’)和阻断基团(实心圆圈)的寡核苷酸探针在其5’端与靶miRNA的3’端连接。连接产物包含miRNA、Tj’标签、阻断基团和与miRNA的3’部分互补的序列(图98，步骤B)。使用引物Tj和反转录酶产生cDNA。使用包含与反转录miRNA的部分和上游引物特异性序列部分(Ti)互补的序列的搭桥引物和标签(Ti，Tj)引物通过Taq聚合酶以有限循环的PCR扩增(12-20个循环)扩增cDNA，其中搭桥引物在其3’端含有可裂解阻断基团，如图98步骤C所示。另选地，使用20-40个PCR循环扩增cDNA。如上所述，C3间隔子是合适的阻断基团，并且仅当引物与其互补靶标杂交时使用RNA酶H(星符号)裂解RNA碱基(r)。引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。任选地，在PCR之前可将样品等分到24、48或96个孔中。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图98，步骤D)。
如图98步骤E中所示，含有适于后续PCR扩增的引物特异性部分(Ai，Ci’)的miRNA序列特异性连接探针以碱基特异性方式与其对应靶序列杂交。连接酶将两种寡核苷酸共价封接在一起(图98，步骤E)，并且将连接产物等分到单独孔中以使用标签引物(Ai，Ci)和跨越连接接点的TaqManTM探针(F1-Q)进行检测(图98，步骤F-G)。基于检测TaqManTM探针的释放标签，使用实时PCR定量样品中miRNA的存在。用UDG处理样品以实现遗留预防，这还破坏原始靶扩增子(图98，步骤F)。当在dUTP存在下使用PCR时，将仅扩增真正的LDR产物。原始PCR引物和LDR探针都不扩增LDR产物，从而提供了附加的遗留预防。
图99示出用于定量miRNA的另一连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括与如图98中所示的方法基本上相同的步骤(即步骤A-E)；然而，在这个实施方案中，miRNA特异性连接探针被设计含有UniTaq引物序列(Ai，Ci’)和UniTaq标签序列(Bi’)。因此，在这个实施方案中，随后利用使用UniTaq-特异性引物(F1-Bi-Q-Ai，Ci)的实时PCR对连接产物进行扩增、检测和定量，如以上所述和在图99步骤F-H中示出的。
图100示出用于定量miRNA的连接-RT-PCR-LDR-qPCR遗留预防反应。所述方法包括与图98中所述和所示出的基本上相同的步骤，即步骤A和B。然而，在这个实施方案中，使用至少一种生物素标记的引物扩增步骤B中产生的cDNA以形成含有目标区的生物素酰化的产物。PCR产物掺入了dU，从而允许遗留预防(图100，步骤D)。将生物素酰化的PCR产物固定至固体支持物并且使用miRNA序列特异性连接探针检测目标区，如图100步骤E中所示。在这个实施方案中，连接对的miRNA序列特异性连接探针含有互补尾序列并且分别含有受体基团或供体基团，所述受体基团或供体基团能够通过彼此紧密接近时发生的FRET产生可检测信号，如以上所述的。因此，在连接之后(图100，步骤E)，连接产物的互补5’和3’尾端彼此杂交，从而使其相应的供体部分和受体部分彼此亲密接近以产生可检测的FRET信号(图100，步骤F)。
如本文更详细描述的，本发明方法能够检测包含以下的低丰度核酸分子：一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基。
如本文所用的“低丰度核酸分子”是指以低至样品的1％至0.01％的水平存在的靶核酸分子。换句话说，具有一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的低丰度核酸分子与样本中的具有与低丰度核酸分子类似的核苷酸序列，但没有一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的核酸分子(即高丰度核酸分子)的区别超过100至10,000倍。
在本发明的一些实施方案中，相对于样品中的具有与低丰度核酸分子类似的核苷酸序列的高丰度核酸分子的拷贝数，对一种或多种低丰度靶核苷酸序列的拷贝数进行定量。在本发明的其他实施方案中，相对于样品中的其他核苷酸序列对一种或多种靶核苷酸序列进行定量。在本发明的其他实施方案中，对一种或多种靶核苷酸序列的相对拷贝数进行定量。相对和绝对的(即拷贝数)定量的方法在本领域中是熟知。
待检测的低丰度靶核酸分子可存在于任何生物样品中，包括但不限于于组织、细胞、血清、血液、血浆、羊水、痰、尿液、体液、身体分泌物、身体排泄物、无细胞循环核酸、无细胞循环肿瘤核酸、妊娠女性的无细胞循环胎儿核酸、循环肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤活检和外来体。
本发明的方法适于诊断或预后疾病状态和/或区分基因型或疾病易感性。
对于早期癌症检测，本发明的方法适于检测已知基因(例如，CRAF、KRAS)中的重复突变和已知基因(例如，p53)中的以样品的1％至0.01％存在时的罕见突变。本发明的方法还可实现分离自外来体的肿瘤特异性mRNA(例如区分结肠肿瘤组织与配对的正常粘膜的十几重表达标志物)和分离自外来体或Argonaut蛋白的肿瘤特异性miRNA(例如区分结肠肿瘤组织与配对的正常粘膜的十几种微小RNA标志物)的准确定量。本发明的方法还提供分离自循环肿瘤细胞的DNA中肿瘤特异性拷贝变化(例如区分结肠肿瘤组织与配对的正常粘膜的十几个拷贝变化)的准确定量以及对分离自循环肿瘤细胞的DNA中的突变的检测。(例如KRAS、BRAF、AKT、p53、BRCA1基因)。
本发明还能够准确定量(i)分离自外来体或循环肿瘤细胞的肿瘤特异性mRNA，(ii)分离自外来体或Argonaut蛋白的肿瘤特异性miRNA，以及(iii)分离自循环肿瘤细胞的DNA中肿瘤特异性拷贝变化，其可预测结果或指导治疗。本发明还可检测分离自循环肿瘤细胞的DNA中的突变，例如KRAS、BRAF、AKT、p53、BRCA1或预测结果或指导治疗的其他基因。
对于产前诊断，本发明的方法能够检测非整倍性(例如，三体性21)(通过计数拷贝数)、含有已知基因中常见突变的遗传性疾病(例如镰状细胞贫血、囊性纤维化)、含有已知基因中罕见突变的遗传性疾病(例如家族性腺瘤样息肉病)、由已知基因中已知的或突发的拷贝数的减少或增加引起的遗传性疾病(例如杜氏(Duchenne’s)肌肉营养不良)，和亲子鉴定。
在临床环境中实施以上所述的测定的重要方面是用样品、试剂和测定特异性探针/引物填充行和列所需的劳动量的减少。在大多数实验室中96孔板是标准的，但是384孔板提供了较高的产量并且使每个测定孔成本减少。妨碍其采用的部分是与这些板相关联的增加的劳动，这可通过移液机器人装置解决，但是成本花费相当多。取决于板中测定的具体构造，增加移液管吸头的使用也带来显著的花费。以上所述的测定的一个实施方案需要将24个多重PCR-LDR反应分散到微量滴定板的24列中，然后将16种不同的LDR标签探针组分散在板的各行中。这种测定安排将需要8个吸头式移液器进行48次递送来填充列，然后需要8个吸头式移液器进行48次递送来填充所有行。具有1536个孔的板具有降低测定成本的优点，但在它们超出人操作员的机械能力之外时甚至进一步需要自动式填充。装置已经商业化，其允许通过使用微流体装置以减少的移液步骤数同时填充许多行和列，所述微流体装置使用将液体引入到每个“孔”中的低死体积通道，但是需要增加复杂化的阀和外部阀驱动器。显然地，不同的方法是允许的。
本发明的另一方面涉及与微量滴定板组合使用以向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔同时添加液体的装置，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中顶部表面具有通向孔的开口并且底部表面限定了孔的闭合端。所述装置包括由第一边界和第二边界限定的第一层，其中计量室在所述第一层的第一边界与第二边界之间延伸并且彼此流体连通。第一层被构造成在操作位置中装配成接近微量滴定板，其中第一层的第一边界最靠近微量滴定板的顶部表面并且每个计量室与微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通。第一层还包括填充室，所述填充室与一个或多个计量室流体连通。所述装置包括由第一边界和第二边界限定的第二层，其中填充口在第二层的第一边界与第二边界之间延伸。第二层被构造成在操作位置中装配成接近第一层，其中第二层的第一边界最靠近第一层的第二边界并且填充口与填充室对准。当第一层、第二层和微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过填充口进入装置的液体将穿过填充室、计量室并且进入微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
在一些实施方案中，本发明的装置还包括具有第一边界和第二边界的中间层，其中中间层通路在所述中间层的第一边界与第二边界之间延伸。中间层被构造成在操作位置中装配在微量滴定板与第一层之间，其中中间层的第一边界与微量滴定板的顶部表面相邻并且中间层的第二边界与第一层的第一边界相邻。一个中间层通路与微量滴定板的行和/或列中的单个孔对准，其中当第一层、第二层、中间层和微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过填充口进入装置的液体将穿过填充室、计量室、中间层通路，并且进入微量滴定板的孔中。
本发明的装置还可包括具有第一边界和第二边界的第三层，其中填充口连接器在第三层的第一边界与第二边界之间延伸。第三层被构造成在操作位置中装配在第一层与第二层之间，其中第三层的第一边界与第一层的第二边界相邻并且填充口连接器与填充口对准。当第一层、第二层、第三层、中间层和微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过填充口进入装置的液体穿过填充口连接器、填充室、计量室、中间层通路，并且进入微量滴定板的孔中。
图103-112绘示出本发明的装置的一个示例性实施方案。图103示出与本发明装置组合使用的典型的384孔微量滴定板100的一部分的顶视图和侧视图。微量滴定板由若干个孔103限定，每个孔具有适于接收样品和/或反应试剂的顶部开口端104和底部闭合端102。图104示出图103的微量滴定板的透视图。
图105和106分别绘示出邻近微量滴定板100的顶部表面定位的装置的中间层106的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的中间层106含有延伸通过中间层的中间通路108。中间层106的每个中间通路108与微量滴定板100的行或列的单个孔103对准。在一个实施方案中，中间层通路起爆破阀的作用以控制或防止液体从计量室流到微量滴定板的孔中。中间层通路108的垂直通道的直径产生表面张力，所述表面张力防止液体流出计量室120(参见图107)，直到施加离心力。在一些实施方案中，中间层通路108的垂直壁由疏水性材料组成或涂覆有疏水性材料，这增加了对流体在施加离心力之前流出计量室120的抵抗性。合适的疏水性材料包括具有≥90°水接触角的任何材料，诸如例如环状烯烃共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚二甲硅氧烷、氟化的乙烯聚丙烯、聚四氟乙烯。另选地，中间层通路的壁可由具有＜90°水接触角亲水性材料组成，但用疏水性涂层例如Teflon-炭黑处理以产生具有＞150°水接触角的超疏水性表面。
中间层通路108的抵抗性与计量室120体积的比率(参见图107)可由本领域技术人员是容易计算得到。可另选地采用在外部施加力影响下释放液体的被动阀的其他实施方案。
如图105和106中所绘示，中间层106还含有将第一层的溢流室116与第一层的填充室118连接的溢流通路110(参见图107)。
通过将装置用键固定到微量滴定板的顶部的周界实现装置在微量滴定板的顶部表面上的适当定位和取向，如图101和102中所示。可通过在中间层106中使用凸缘或裙缘112实现每个计量室的另外对准，所述凸缘或裙缘与微量滴定板100的每个孔103的开口端104界面连接，如图105的侧视图中所示的。可由本领域中技术人员例如基于微量滴定板的孔的顶部处的小凸缘设想定位的其他实施方案。虽然不意在提供气密密封，但是如图105中绘示的中间层106的凸缘或裙缘112在微量滴定板100的相邻孔之间提供交叉污染控制的一些手段。
图107和108分别绘示出装置的邻近装置的中间层106的第二边界可操作地定位的第一层114的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的第一层114含有通过计量室通道122而彼此流体连通并且与微量滴定板的单个孔103流体连通的计量室120。计量室120具有固定的体积以控制递送到微量滴定板100每个孔103中的流体的体积。计量室120通过液体的毛细管作用或通过机械力(例如移液器将液体推挤到填充室118中的力)从填充室118接收液体。在一个实施方案中，装置的计量室120全部具有相同的计量体积。在另一实施方案中，计量室120每行和/或每列具有不同的计量体积。填充室、计量室和计量室通道的壁可由亲水性材料组成或涂覆有亲水性材料。
如图107和108中所示，每个计量室120通过中间层通路108与微量滴定板的孔103流体连通。如上所述，中间层通路可起爆破阀的作用以防止计量室120中的液体流到微量滴定板100的孔103中，直到施加适当的力例如离心力。
装置的第一层114还含有溢流室116，如图107和108中所示。如上所指出的，溢流室116通过中间层106的溢流通路110与填充室118流体连通。
图109和110分别绘示出装置的邻近装置的第一层114的第二边界可操作地定位的第三层124的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的第三层124含有填充口连接器128，所述填充口连接器延伸穿过第三层124，使第二层130的填充口132(如图111中所示)与第一层114的填充室118对准并且相连接。第三层124还含有空气通路连接器126，所述空气通路连接器126延伸穿过第三层124，与第一层114的计量室120和第二层130的空气通路136对准并且将所述计量室与所述空气通路相连接(也如图111中所示)。第三层的空气通路连接器126的壁由疏水性材料组成或涂覆有疏水性材料。装置的第三层124还含有溢流空气通路连接器125，所述溢流空气通路连接器125延伸穿过第三层，与第一层114的溢流室116和第二层130的溢流空气通路134对准并且使所述溢流室连接至所述溢流空气通路(如图111中所示)。
图111和112分别绘示出装置的邻近装置的第三层124的第二边界可操作地定位的第二层130的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的第二层130含有填充口132，所述填充口132延伸穿过第二层130，并且与第三层124的填充口连接器128对准，或者在一些实施方案中，直接与第一层114的填充室118对准。装置的第二层130还含有空气通路136，所述空气通路136延伸穿过第二层130并且与第一层114的计量室120对准。第二层的空气通路136通过第三层124的空气通路连接器126连接至第一层114的计量室120。如图111和112中进一步所示的，装置的第二层130还含有溢流空气通路134，所述空气通路延伸穿过第二层130并且与第一层114的溢流计量室116对准。溢流空气通路134通过第三层124的溢流空气通路连接器125连接至溢流室116。
虽然根据单个层来描述装置，但是装置的层是集成的，从而赋予装置单片结构。
在本发明的一个实施方案中，装置的第一层在计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室，并且第二层设置有一对间隔开的填充口，每个填充口与一对间隔开的填充室中的一个填充室流体连通。一对间隔开的填充口中的一个填充口向一对间隔开的填充室中的一个填充室和一半计量室提供液体，而一对间隔开的填充口中的另一个填充口向一对填充室中的另一个填充室和另一半计量室提供液体。
在本发明的另一个实施方案中，装置的第一层在计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室，并且第二层设置有一对间隔开的填充口，每个填充口与一对间隔开的填充室中的一个填充室流体连通。一对间隔开的填充口中的一个填充口向一对填充室中的一个填充室和全部的计量室提供液体，而一对间隔开的填充口中的另一个填充口向一对填充室中的另一个填充室和全部的计量室提供液体。
本发明的装置可被构造成用液体填充所述微量滴定板的两个或更多个行和列。
本文的附图示出与384孔微量滴定板兼容的不同设计；然而，所述的概念通过本领域中技术人员同样适用于1536孔板。以上详细描述的图105至112示出用于通过在装置-微量滴定板堆的右侧使用填充口132同时填充横跨24列的所有行中的所有孔。这种构造依赖于毛细管作用来填充由通道122所连接的每个单独计量室120，如图111中所示。
图113至118是示出装置的第二构造的一系列顶视图、侧视图和分解透视图。装置的这种第二构造依赖于移液器的机械力来将液体驱动到通道和计量室中。图113-118绘示了如图107-112中所示的所有相同装置特征(对应地编号为200-236)，不同的是第二层230的填充口232进行修改以有利于用液体机械填充孔，如图117中所示。填充口232尺寸是锥形的，使得标准的一次性吸头贴合地配合到口中，从而允许使用正压填充计量室。填充口的尺寸和间隔与使用的手持式多通道移液管或多通道机器人工作台是兼容的。
图119至126是示出如图105至118中绘示的装置的不同部分的一系列顶视图、侧视图和分解透视图。图119-126中绘示的装置的部分表示图105-118中示出的行和/或列的出口端，即装置的与填充口相对的部分。图119-126中绘示的标记为300-336的装置特征对应于参考图105-112(即装置特征100-136)所述和标记的特征。
图127至134是示出本发明装置的替代性构造的一系列顶视图、侧视图和分解透视图。在装置的这种构造中，用于将试剂装载到微量滴定板的孔中的填充口432(参见图133)位于装置-微量滴定板堆的两侧。这种构造可用于向每行的所有孔添加两种不同组的试剂。另选地，流体通道的每侧可从装置的每侧可寻址24列中的12列，从而将板分为两个192孔的并排区域。这种构造保留了独立地寻址两个区域的每行和每列的能力。图127-134中绘示的标记为400-436的装置特征对应于参考图105-112(即装置特征100-136)所述和标记的特征。
图135至144是示出本发明装置的替代性构造的一系列顶视图、侧视图和分解透视图。装置的这种构造适于同时填充按行的所有孔和按列的所有孔。另选地，流体通道的每侧可从装置的每侧寻址24列中的12列并且从装置的每侧寻址16行中的8行，从而将板分为四个不同的96孔区域。这种构造保留了独立地寻址四个区域的每行和每列的能力。图135-144中绘示的标记为500-536的装置特征对应于参考图105-112(即装置特征100-136)所述和标记的特征。
根据这种构造，图135和136分别绘示出邻近微量滴定板500的顶部表面定位的中间层506的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的中间层506含有延伸通过中间层的中间通路508。在这个实施方案中，微量滴定板的每个孔与至少两个中间通路508对准，如在图135和136中的顶视图、侧视图和分解透视图中分别所示的。中间层506还含有溢流通路510。
图137至140绘示出装置的邻近装置的中间层506的第二边界可操作地定位的第一层514的顶视图、侧视图以及分解透视图(参见图139)。根据这个实施方案，本发明装置的第一层514具有第一区域513和第二区域515，所述第一区域513具有在两个或更多个行中的计量室520(参见图137和138)，所述第二区515具有在两个或更多个列中的计量室520(参见图139和140)其中第一区域和第二区域彼此移位。第一层514的第一区513和第二区515的计量室520通过计量室通道522而彼此流体连通并且与微量滴定板的单个孔503流体连通。如上所述，计量室520具有固定的体积以控制递送到微量滴定板500每个孔503中的流体的体积。计量室520通过液体的毛细管作用或将液体推挤到填充室518中的机械力从填充室518接收液体。通过例如中间层通路508的疏水力控制从计量室520流出进入微量滴定板的孔中的流体流量。在一个实施方案中，装置的计量室520全部具有相同的计量体积。在另一实施方案中，计量室520每行和/或每列具有不同的计量体积。
装置的第一层514的第一区域513和第二区域515各自含有溢流室516，分别如图137-138和图139-140中所示。如上所指出的，溢流室516通过中间层506的溢流通路510与填充室518流体连通。
图141和142分别绘示出装置的邻近装置的第一层514的第二区域515第二边界可操作地定位的第三层524的顶视图和侧视图以及分解透视图。装置的第三层524含有填充口连接器528，所述填充口连接器528延伸穿过第三层524，使第二层530的填充口532与第一层514的填充室518对准并且相连接(如图143中所示)。第三层524还含有空气通路连接器526，所述空气通路连接器延伸穿过第三层524，与第一层514的计量室520和第二层530的空气通路536对准并且将所述计量室与所述空气通路相连接(也如图143中所示)。装置的第三层524还含有溢流空气通路连接器525，所述溢流空气通路连接器延伸穿过第三层，与第一层514的溢流室516和第二层530的溢流空气通路534对准并且使所述溢流室连接至所述溢流空气通路(如图143中所示)。
图143和144分别绘示出装置的邻近装置的第三层524的第二边界可操作地定位的第二层530的顶视图和侧视图以及分解透视图。在这个实施方案中，装置的第二层530含有填充口532，每行和每列各一个，所述填充口532延伸穿过第二层530，并且与第三层524的填充口连接器528对准，或者在一些实施方案中，直接与第一层514的填充室518对准。装置的第二层530还含有空气通路536，所述空气通路536延伸穿过第二层530并且与第一层514的计量室520对准。第二层的空气通路536通过第三层524的空气通路连接器526连接至第一层514的计量室520。如图143和144中进一步所示的，装置的第二层530还在每行和每列中含有溢流空气通路534，所述空气通路延伸穿过第二层530并且与第一层514的溢流计量室516对准。溢流空气通路534通过第三层524的溢流空气通路连接器525连接至溢流室516。
虽然通过示出装置每层的顶视图、侧视图和分解图的一系列附图说明以上所述的不同构造中的每种构造，但是出于制造的目的，装置可被模制成单片形式或由单个层进行组装，如本领域中技术人员所决定的。
本发明的另一方面涉及向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔添加液体的方法，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中顶部表面具有通向孔的开口并且底部表面限定了孔的闭合端。这种方法包括提供如上所述的本发明装置，以及用液体填充装置。将液体排放到装置的所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
如上所提出，本发明的装置可被构造成允许通过毛细管作用或通过机械力填充孔。
允许同时对微量滴定板的所有列和所有行依序或同时地填充的本发明的装置由与生物试剂相容的合适的材料(例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯等)制造并且定位在微量滴定板的孔上。接下来，将试剂引入到填充口(例如24和/或16个填充口)中，并且试剂自动分散到定位在每个微量滴定板孔之上的每个计量室(例如针对板中384个孔的384个计量室)中。将负载的装置-微量滴定板堆放置于标准低速离心机的吊桶式转头中并且以足以将液体从单个计量室中驱动到每个孔中的力进行短暂旋转。在离心机停止后，将装置-微量滴定板堆从离心机取出，分离堆并且处置掉装置，而板接着用于测定过程中的下一步骤。因此，与使用人工方法的共96次8个吸头式移液器递送相比，以上针对384孔板所述的测定构造的劳动安排将减少成用于装载列填充口的3次各8个吸头式移液器递送和用于装载行填充口的2次各8个吸头式移液器递送。此外，使用所述装置仅消耗24个移液管吸头，而人工方法消耗384个移液管吸头，实现了相当大的费用节省，这在高产量临床实验室中是重要的。以上所述的装置和方法可容易地由本领域中技术人员应用至1536孔微量滴定板并且将产生与针对384孔板所述的类似的益处。显著减少移液步骤数的本文所述的装置的另外益处是控制了含有PCR扩增子的气雾剂产生的交叉污染。这在检测低拷贝数表示的突变体等位基因中是特别关键的。在将液体引入到装置的装载口的过程中，384或1536个孔中的每个被装置覆盖并且孔的覆盖和液体转移步骤数的减少的组合使得孔之间的PCR扩增子交叉污染的可能性有一定程度的降低。
因为每行和每列是可独立寻址的，可设想到根据对装载口填充方式的审慎选择可由同一装置实现的许多测定构造。因此，可通过3次各8个吸头的移液步骤(没有吸头更换)将相同液体施加至所有的24列，并且可通过2次各8个吸头的移液步骤(没有吸头更换)将相同液体施加至所有的16行；可通过3次各8个吸头的移液步骤(3次吸头更换)将24种不同的组分施加至24行中的每行并且可通过2次各8个吸头的移液步骤(2次吸头更换)将16种不同的组分施加至16行中的每行。许多其他填充构造对本领域中技术人员是可能的。分散的液体可以是任何生物液体，例如生物样品、反应试剂例如像引物、探针、酶、反应产物等。
在一个实施方案中，可利用固定的计量体积的选择获得一系列的分散装置，从而预期特定的高体积分子学生物应用，诸如可见于临床诊断实验室或药物开发实验室中。在另一实施方案中，定制的分散装置被制备有用户针对其特定应用而特定的计量体积。
尽管本文已经详细示出和描述了优选实施方案，但相关领域技术人员显而易见的是可在不脱离本发明的精神的情况下进行各种修改、添加、替换等，因此，这些修改、添加、替换等被认为在如以下权利要求书中限定的本发明的范围内。
实施例
预测性实施例1-总血浆cfDNA中高敏感性突变标志物(以1％至0.01％存在时)、已知基因中的单一碱基突变、小插入和小缺失突变。
方法概述：此方法取决于三种酶的保真度：(i)用于如实地拷贝初始样品中的低水平的DNA拷贝的Taq聚合酶，(ii)将上游LDR引物上的阻断基团去除的RNA酶H2，以及(iii)区分上游引物3’侧的匹配和错配的连接酶。所述区分可通过在从3’端起第2或第3碱基处使用有意的错配或核苷酸类似物进一步增强，从而如果3’端处完全匹配则使3’端的杂交稍微不稳定，但是如果3’端处错配则使3’端的杂交显著不稳定。最终，动力学方法诸如改变循环时间和条件可增强对野生型模板和突变型模板的区分能力。一旦连接事件发生，将在后续实时PCR扩增步骤中扩增那些产物，因此这是关键的区分步骤。
对于初始的PCR步骤，以较低浓度(10-50nM)使用部分相同的含有通用尾的PCR引物。相同的区的变化范围可为8至11个碱基或更多个。因此，如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。此外，所述尾增强PCR引物与正确的扩增子的随后的结合。
另选地，扩增的保真性和假扩增子和引物二聚体的减少通过以较低浓度使用PCR引物，而是在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团来实现。仅当引物与其期望靶标正确地杂交时，RNA酶H2才裂解RNA碱基，从而释放DNA引物上的游离3’OH。即使引物在不正确的靶标上意外激活，但是在下一轮，引物3’端下游的碱基也不完全匹配于待去除的碱基。这显著降低了第二次裂解和延伸的可能性。简而言之，不正确靶标的扩增效率不产生显著的本底。此外，初始PCR扩增之后是LDR步骤，其基本上是嵌套在初始PCR产物内。
当开始于cfDNA时，平均长度为160个碱基，因此当在基因区(例如p53)上分块(tiling)时，应当将PCR引物合并在两组中，使得每组扩增约100bp的片段，使所述片段相对于彼此移位约50个碱基，从而在给定区上实现“分块”。
为了预防遗留污染，在聚合酶激活之前将UNG添加至反应并且在dUTP存在下进行初始PCR扩增。LDR探针由天然碱基组成，因此现在LDR产物对第二实时PCR步骤中的UNG消化具有抗性。注意LDR产物在其非连接末端上含有靶DNA中不存在的序列标签或UniTaq序列，因此LDR产物的意外遗留不导致大规模的扩增。与PCR不同，初始LDR产物不是用于第二LDR反应的底物。
最困难的情况是对于KRAS突变，其中密码子12上的6个变化和密码子13上1个变化被全部间隔在一起。通常，对于最高保真度，突变探针与野生型序列之间的错配对于最后一个碱基应当至少为C:A，而非G:T。因此，需要运行上链和下链两种探针，或每个PCR反应设定2次连接。然而，一个以上的突变可被给予相同的UniTaq序列或具有TaqManTM探针的荧光标记，因为目标是找到突变，而不必区别彼此不同的突变。
因为不同探针将彼此竞争结合(稀有)突变序列，所以重要的是允许所有探针与正确的序列杂交。对于KRAS密码子12的第1位突变，将存在3种上游引物和1种下游引物。可通过使用在区分碱基处具有野生型序列但缺乏适当的标签序列的阻断上游LDR探针进一步抑制突变型LDR探针在野生型靶序列上的错误连接探针被设计成避免突变探针与正常序列的错误连接/错误信号，但在突变型序列存在下还具有正确的连接发生。
总结使用PCR引物和LDR探针检测每个突变的以上方法的区分水平：
1.使用具有通用尾的PCR引物，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。
2.使用UNG以预防初始PCR反应的遗留污染。
3.仅当与靶标杂交时，使用RNA酶H2的核酸酶活性释放上游LDR探针上的未阻断的3’OH。
4.使用耐热性连接酶在上游LDR探针上的3’连接保真性。
5.从上游探针的3’端起第2或第3碱基处使用错配或核苷酸类似。
6.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
7.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
用于高灵敏度检测突变标志物(以1％至0.01％存在时)、已知基因中的重复突变的详细方案：
1.1.a.在UNG(37℃，15-30分钟，以预防遗留)、dUTP和其他dNTP、AmpliTaq Gold和含有通用尾的基因特异性引物存在下孵育基因组DNA，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。这种初始的基因组DNA-PCR反应混合物适于12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重PCR扩增。将来自血浆的基因组DNA变性、使UNG失活并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且多重PCR扩增含有突变的片段，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行12-20个循环)。将PCR引物设计成具有约64-66℃的Tm值，并且甚至当以低于用于单重PCR的正常浓度10至50倍的浓度(每种引物10nM至50nM)下使用时将稳健地杂交。循环是受限制的以保持PCR产物相对于彼此的比例平衡，而仍使低丰度序列扩增约100,000至1,000,000倍。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
1.1.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、RNA酶H2、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游探针合成有5’磷酸或将其整体激酶化；上游探针包含在所需3’端之后的RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团以防止不依赖靶标的连接。)上游探针包含5’标签(诸如UniAi)，接着是在第3或倒数第二碱基处具有C：A或G：T错配、在3’端处具有突变碱基的靶特异性序列，接着是RNA碱基和与靶标匹配的4个额外的DNA碱基以及C3间隔子以阻断连接(或通过聚合酶进行的后续延伸)。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果存在突变型DNA，这将允许在PCR产物上发生连接事件。
1.1.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物(master mix)以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR探针上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniAi-上游靶标-突变-下游靶标-UniCi’
这种方法避免在第二实时PCR反应中产生出自野生型DNA的本底信号。首先，UNG将破坏初始PCR产物的底链，使得剩余的上游LDR探针没有进行杂交的靶标，因此3’端保持阻断并且将不会延伸。第二，来自初始PCR反应的任何残余PCR引物将不能结合初始PCR产物(被UNG破坏)或LDR产物(没有结合位点)，因此3’端保持阻断并且将不会延伸。最终，现在TaqManTM探针具有不同于野生型序列的2个碱基(突变碱基和从连接接点的3’端起第3位处的碱基)，因此仅在60℃以下的温度下杂交，并且现在上游PCR引物首先进行杂交，并随后进行延伸，从而防止TaqManTM探针杂交和产生来自聚合酶的5’-3’活性的信号。
第二测定设计是基于初始多重PCR扩增，然后将PCR扩增的靶标分布并捕获在微量滴定板的孔上。单循环的LDR能够将LDR产物捕获在固体支持物上的正确靶标上，同时洗掉错配连接物。通过LDR-FRET、实时PCR或其他报告系统定量LDR产物。
对于扩增cfDNA以用于突变检测，使用了含有通用尾的PCR引物。基因特异性引物以低浓度使用(10至50nM)并且含有部分相同的通用尾。因此，如果存在形成的任何不依赖靶标的引物二聚体，则产物将形成抑制进一步扩增的发夹。为了最大化检测极低丰度突变的能力，在制备含有所有组分的预混合物之后，将反应混合物分布到12、24、48或96个单独孔中。因为仅单分子(具有突变)可被分布到给定孔中，所以所述方法相比于正常野生型DNA有效地富集含突变的分子，并且由此显著提高信噪比。一种方法是使用两步扩增，其中初始扩增使用具有通用尾的基因特异性引物，并且第二扩增使用通用引物以将生物素基团附加至特异性产物链。初始扩增(具有低PCR引物浓度)仍是定量的，前提条件是其被限制至约8-20个循环。然后针对每个初始孔将扩增产物稀释到两个新孔中，各自含有两种通用引物(以0.5-1pmol的较高浓度)，其中使一种通用引物或另一种通用引物在相应孔中生物素酰化。现在再将扩增继续8-29个循环，一共进行约15-40个循环。作为任选步骤，可将产物与未使用引物分离(通过电泳或根据尺寸)。
另选地，可通过将通用引物添加至初始扩增孔来以单一扩增反应扩增产物，其中仅使一种通用引物生物素酰化。另选地，可在单一扩增步骤中直接使用生物素酰化的基因特异性引物。仅当谨慎设计针对顶链和底链的LDR探针(即，以最大化突变的LDR区分)时，需要捕获给定扩增子的正向链和反向链。这可通过在同一反应中使用各50％生物素酰化下的每种引物的混合物，或在单独反应中使用100％生物素酰化的每种引物来实现。只要在捕获在固体支持物上的过程中生物素酰化产物保持分离，它们就可均在同一扩增反应中。然而，如果PCR产物链在捕获后重新杂交，则它们可能需要被捕获在固体支持物上的单独位置上。这种空间分离可能是需要的，以确保存在足以可供用于通过后续LDR检测鉴定突变的单链PCR产物。
使用cfDNA，在生物学上片段长度限制为约160bp。因此，为了横跨较大区域覆盖常见的热点突变，引物组将被设计成产生重叠片段。这样，引物将分布在“A”池与“B”集合之间，使以上提及的孔数加倍。使用分离自CTC的DNA，常常可使用外显子大小片段，从而减轻对两个扩增子集合的需要。一些片段比其他片段扩增的更缓慢。这个问题可通过包括具有数个另外的扩增循环的附加多重反应来克服。
图38示出使用针对遗留预防的基本PCR-LDR-q PCR检测方案对基因组DNA或cfDNA的突变检测。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图39示出图38的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。PCR引物含有通用尾以消除引物二聚体形成，并且允许使用通用引物扩增，其中一种引物含有生物素，从而使得产物捕获在链霉亲和素涂覆的孔中。连接探针与靶标杂交并且仅在连接接点处存在完全互补性的情况下形成产物。然后洗掉未反应的连接探针或不依赖靶标的连接产物。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图40示出图38的变型，其中初始基因特异性PCR引物在3’端上含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。这些基因特异性引物仅当与靶标杂交时通过RNA酶H2从末端解除阻断，从而释放适于聚合酶延伸的3’OH端。
图41示出图38的变型，其中初始基因特异性PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniAi和UniCi’引物特异性部分。此外，上游突变特异性LDR探针含有在3’端处的突变碱基，接着是RNA碱基和与靶标匹配的4个另外DNA碱基以及用于阻断连接(或通过聚合酶进行后续延伸)的C3间隔子。仅在RNA酶H2存在下和当与正确靶标杂交时，上游阻断基团被去除，从而释放适于连接的3’OH端。在这个图示中，与野生型DNA互补的上游LDR探针也含有阻断基团，但不含有RNA碱基或5’标签。这种探针进一步增强在区分突变型靶标和野生型靶标时的连接特异性。
图42示出图41的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。PCR引物含有通用尾以消除引物二聚体形成，并且LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图43示出图42的变型，其中下游LDR探针的5’侧含有与上游探针上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。核酸酶应当仅在下游探针与突变型靶标杂交时裂解。上游突变特异性LDR探针和下游突变特异性LDR探针含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。在这个图示中，与野生型DNA互补的上游LDR探针不含有互补序列，并且即使与裂解的下游探针连接也不产生FRET信号。
图44示出图43的变型，其中初始基因特异性PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。上游LDR探针和下游LDR探针含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’引物特异性部分和序列标签部分。在连接之后，将产物稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物的孔中。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。通过荧光标记引物形成的产物链将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaqBi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料，并且产生通过实时PCR仪器检测的信号。
图145示出图41的变型，其中使用突变选择性上游引物和基因座特异性下游引物选择性地扩增PCR产物。在靶特异性杂交后，RNA酶H去除突变型特异性RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团。RNA酶H在所述引物与突变型DNA完全匹配时将优先裂解RNA碱基，但是在与野生型DNA杂交时不太可能裂解RNA碱基。这在PCR扩增的每个循环过程发生，从而富集特定突变型靶标的扩增。具有野生型序列的任选引物缺乏RNA碱基并且仍保持阻断，因此进一步减少了野生型序列的扩增。在初始PCR富集步骤之后，根据针对遗留预防的LDR-qPCR检测方案继续这个程序。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图146示出图145的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’引物特异性部分和序列标签部分。在连接之后，将产物稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物的孔中，并且通过实时PCR仪器检测PCR中产生的信号。
图147示出图145的变型，其中PCR产物被捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图148示出图41的变型，其中使用基因座特异性上游引物和基因座特异性下游引物选择性地扩增PCR产物。在靶特异性杂交后，RNA酶H去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团。包含与上游PCR引物部分重叠的野生型序列的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物优先竞争结合野生型序列，但对突变型DNA并非如此，由此抑制野生型DNA在每轮PCR过程中的扩增。在初始PCR富集步骤之后，根据针对遗留预防的LDR-qPCR检测方案继续这个程序。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图149示出图148的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’引物特异性部分和序列标签部分。在连接之后，将产物稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物的孔中，并且通过实时PCR仪器检测PCR中产生的信号。
图150示出图148的变型，其中PCR产物被捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图154示出另一变型，其中使用基因座特异性上游引物和基因座特异性下游引物选择性扩增PCR产物，所述上游产物还包含与顶链的野生型序列互补的5’部分序列，从而在延伸后形成环-发夹。在靶特异性杂交后，RNA酶H去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。(i)野生型底链的变性使得形成在3’端处具有完全匹配的环-发夹，所述环-发夹通过聚合酶延伸形成较长的发夹区。这个发夹区在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。(ii)突变型底链的变性使得形成在3’端处具有错配的环-发夹。这个环-发夹不通过聚合酶延伸，因此在72℃下变性，能够使上游引物产生全长顶链。(iii)顶链的变性使得形成在5’侧的发夹，所述发夹在PCR的延伸步骤(72℃)过程中变性，从而允许聚合酶产生全长底链。在(i)野生型模板和(ii)突变型模板存在下上游引物的发夹延伸偏好性的差异使得优先扩增突变型DNA。这种排除野生型DNA的扩增的选择在PCR的每个循环过程中发生，从而富集突变型靶标。在初始PCR富集步骤之后，根据针对遗留预防的LDR-q PCR检测方案继续这个程序。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图155示出图154的变型，其中PCR产物被捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
作为使用空间多路复用到48个孔中定量突变计数的实例，考虑靶样品中经历初始PCR扩增的总cfDNA是约10,000个基因组当量，其中这些中有12个含有KRAS密码子12的突变。初始分布到48个孔中产生约200个基因组当量/孔，其中1个孔含有2个突变体拷贝，10个孔含有1个突变体拷贝，并且剩余的37个孔不含有突变体拷贝。在约20轮PCR扩增之后(为了计算简单，假定99％的扩增效率，或约960,000倍-完成效率将产生1,046,576倍的扩增)，则突变的拷贝总数是960,000，并且野生型的拷贝总数是1.92亿。假设每次循环在突变型DNA上的连接效率为50％、次数是20个循环，并且对于在野生型DNA上的连接，连接保真度为1,000倍，则突变型DNA产生960万个分子，而野生型DNA产生190万个分子。空间分布到48个孔针对突变型和野生型分别产生200,000个和40,000个LDR产物分子。在实时PCR条件下添加标签引物和TaqManTM探针之后，为了计算简单，将以上LDR产物分别转换为10和12.5的Ct值。对于评分为阳性的任何衍生自突变的信号，需要在至少2个或3个孔中出现，并且还容易与产生自探针在野生型DNA上的错连接的(低水平)信号区分。这种与野生型DNA的错连接甚至可通过添加野生型上游LDR探针来进一步抑制，所述野生型上游LDR探针缺乏荧光报告蛋白，使得连接产物是沉默的，没有信号产生。合理的泊松分布(参见，例如图31)显示，对于12个分子，阴性样品具有(孔∶分子)(38∶0；10∶1；1∶2)的分布范围对于样品中的总共12个突变型KRAS分子，这些数字的不同足以使得TaqManTM读出器将给出信号的定量计数，从而允许我们分配0、1或2个原始分子/孔的评分(分别通过12.5、10和9的Ct值表示)。在信号仅能够区分0和1或更多个突变体分子的情况下，假定在最少24个孔中计数初始12个或更少的分子，则可计数初始的突变体拷贝数。
当使用LDR-FRET检测时，在分布到单独48个孔中用于固相捕获之后，假设捕获生物素酰化产物的效率仅为50％，则每个孔分别捕获10,000个突变型KRAS扩增子和200万个野生型KRAS扩增子。假设在突变型模板上的连接效率仅为50％，如果原始存在单一突变体分子，则至少5,000个LDR产物应当捕获在固体支持物上。如果在原始孔中具有两个突变体分子，则应当捕获大约10,000个LDR产物。对于仅具有野生型产物的孔，假设保真度为1∶1,000(在野生型DNA上错连接的突变型上游LDR探针)，则将仅捕获1,000个LDR产物。对于评分为阳性的任何衍生自突变的信号，需要在至少2个或3个孔中出现，并且还容易与产生自探针在野生型DNA上的错连接的(低水平)信号区分。这种与野生型DNA的错连接甚至可通过添加野生型上游LDR探针来进一步抑制，所述野生型上游LDR探针缺乏荧光报告蛋白，使得连接产物是沉默的，没有信号产生。对于样品中的总共12个突变型KRAS分子，这些数字的不同足以使得LDR-FRET读出器将给出信号的定量计数，从而允许分配0、1或2个原始分子/孔的评分(分别表示为约1,000、5,000和10,000个的LDR-FRET信号)。在信号仅能够区分0和1或更多个突变体分子的情况下，假定在最少24个孔中计数初始12个或更少的分子，则可计数初始的突变体拷贝数。
当使用含有LDR探针的UniTaq时，它们具有以下形式：上游探针包含含有引物特异性部分的5’序列标签(诸如UniTaqAi)，接着是在第3或倒数第二碱基处具有C：A或G：T错配、在3’端处具有突变碱基的靶特异性序列，接着是RNA碱基和与靶标匹配的4个另外的DNA碱基以及C3间隔子阻断基团。下游引物包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和也含有引物特异性部分的3’序列标签(诸如UniTaq Bi’-UniCi’)。
可使用UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物检测LDR产物(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，将形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游靶标-突变-下游靶标-UniTaq Bi’-UniTaq Ci’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
初始PCR引物或上游LDR探针还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团(例如C3间隔子)。然后将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的噬菌体RM378)磷酸化下游LDR探针。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(即，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游LDR探针的5’侧含有与上游探针上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
预测性实施例2-在总血浆DNA中的针对启动子过度甲基化的高敏感性甲基化标志物(以1％至0.01％存在时)。(例如p16和其他肿瘤抑制基因CpG“岛”以及Sept9、波形蛋白等)
方法概述v1：将分离的基因组DNA或富含甲基的DNA用甲基敏感性酶的混合物处理，所述甲基敏感性酶的识别元件仅包含或主要包含C和G碱基(例如，Bsh1236I＝CG^CG；HinP1I＝G^CGC；AciI＝C^CGC或G^CGG；并且Hpy99I＝CGWCG^)。审慎选择的PCR引物扩增约100-130bp的未切割的DNA片段。片段应当具有至少2-3个甲基敏感性酶位点，使得裂解导致这些片段分散。这些位点被选择使得遗留预防可以两个水平起作用：(i)在含有掺入的dUTP的DNA中，位点仍是可裂解的，从而允许使用UNG用于遗留预防，以及(ii)在扩增之后，位点是未甲基化的，使得如果其遗留至另一反应，则产物易于被重新裂解。在初始PCR扩增之后，如上所述进行针对遗留预防的LDR和UniTaq反应。另选地，可进行LDR和TaqManTM或直接的TaqManTM反应以鉴定并定量初始样品中的甲基化DNA的相对量。
总结使用PCR引物和LDR探针检测低丰度甲基化的以上方法的区分水平：
1.使用甲基化敏感性限制性酶裂解未甲基化时的靶标。
2.使用具有通用尾的PCR引物，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。
3.使用UNG和甲基化敏感性限制性酶以预防初始PCR反应的遗留污染。
4.在上游LDR探针上使用耐热性连接酶的3’连接保真性。
5.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
6.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
高灵敏度检测启动子甲基化的详细方案v1：
2.1.a.在Bsh1236I(CG^CG)和HinP1I(G^CGC)以及UNG存在下孵育基因组DNA、cfDNA或富含甲基的DNA(37℃，30-60分钟)以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留。添加用于优化多重PCR扩增的缓冲液补充剂、dUTP和其他dNTP、AmpliTaq Gold和含有通用尾的基因特异性引物，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。这种初始的基因组DNA-PCR反应混合物适于在12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重PCR扩增。将消化的基因组DNA变性、使UNG和限制性核酸内切酶失活并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且多重PCR扩增含有突变的片段，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行16-20个循环)。将PCR引物设计成具有约64-66℃的Tm值，并且甚至当以低于用于单重PCR的正常浓度10至50倍的浓度(每种引物10nM至50nM)下使用时将稳健地杂交。循环是受限制的以保持PCR产物相对于彼此的相对平衡，而仍使低丰度序列扩增约100,000至1,000,000倍。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
2.1.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游引物合成有5’磷酸或将其整体激酶化。上游探针包含5’标签，诸如UniAi，接着是靶标特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果原始样品中存在甲基化DNA，这将允许在PCR产物上发生连接事件。
2.1.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR引物上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniAi-上游靶标-甲基化区-下游靶标-UniCi’
可使用相同荧光染料同时查询单一启动子区中的两个或三个片段。可通过针对所述染料的总信号确定每个启动子的甲基化片段数。当使用空间多路复用时，在37℃孵育步骤之前(但在添加酶之后)将样品分布到12、24、48或96个单独孔。以此方式，给定的DNA分子的启动子区上的甲基化可与三个不同分子上的三个不同区的甲基化区分开。
因为不需要区分野生型信号和突变型信号，所以可消除LDR步骤，其中初始PCR反应之后直接进行二级实时PCR(例如TaqManTM)反应。直接进行二级PCR的缺点是未使用UNG遗留预防，因为初始PCR反应产物已掺入dUTP，并且因此将被UNG破坏。解决这个问题的一种方法是在初始PCR中使用标准dNTP，并且仅仅取决于限制性核酸内切酶以破坏来自初始或随后PCR反应的任何潜在遗留，因为这些产物现在是未甲基化的。
第二测定设计基于初始限制酶切消化，接着是多重PCR扩增，然后将PCR扩增的靶标分布并捕获在微量滴定板的孔上。LDR的单循环能够将LDR产物捕获在固体支持物上的正确靶标上，同时洗掉错配连接物。通过LDR-FRET(qLDR)、实时PCR(qPCR)或其他报告系统定量LDR产物。
图45示出使用针对遗留预防的基本限制酶切消化、PCR-LDR-qPCR检测方案对基因组DNA或cfDNA的甲基化检测。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图46示出图45的变型，其中初始基因特异性PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaqCi’标签。在连接之后，将产物稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi形式的UniTaq特异性引物的孔中。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。通过荧光标记引物形成的产物链将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料，并且产生通过实时PCR仪器检测的信号。
图47示出图45的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。PCR引物含有通用尾以消除引物二聚体形成，并且允许使用通用引物扩增，其中一种引物含有生物素，从而使得产物捕获在链霉亲和素涂覆的孔中。连接探针与靶标杂交并且仅在连接接点处存在完全互补性的情况下形成产物。然后洗掉未反应的连接探针或不依赖靶标的连接产物。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
作为使用空间多路复用到48个孔中定量甲基化计数的实例，考虑使用具有12个基因组当量的肿瘤DNA的cfDNA样品用于对20号染色体上标志物上的甲基化进行评分，对所述样品进行扩增以使每个癌细胞有约4个拷贝。这将给予我们耐消化的甲基化DNA的48个拷贝。未甲基化DNA通过限制性酶分段，但是少数的未甲基化DNA存在约12个拷贝，共60个拷贝。另外，可发生一些年龄相关的甲基化，使得所述甲基化变化至12个拷贝。因此，具有非肿瘤特异性甲基化的样品可具有在12-24个拷贝的范围内的信号，而在全部4个染色体中具有甲基化的20号染色体上的标志物的那些可具有在60-72个拷贝的范围内的总信号。如果查看合理的泊松分布(参见图31和32，阴性样品具有针对12个分子的(孔∶分子)(38∶0；10∶1；1∶2)至针对24个分子的(29∶0；15∶1；4∶2；1∶3)的分布范围，而阳性样品具有针对60个分子的(14∶0；17∶1；11∶2；4∶3；1∶4)至针对72个分子的(11∶0；16∶1；12∶2；6∶3；2∶4；1∶5)分布范围。区分产生自2个分子(例如，针对LDR-TaqManTM，Ct值为9，或针对LDR-FRET检测10,000个LDR产物)的LDR信号与产生自3个分子(例如针对LDR-TaqManTM，Ct值为8.5，或针对LDR-FRET15,000个分子)的LDR信号的准确性将取决于不同孔的LDR信号的标准差。尽管如此，即使LDR信号的可变性足以使得区分较高水平的信号变得太困难，但是只要信号干净的足以区分0个、1个和2个初始分子(分别表示为12.5、10和9的LDR-TaqManTM Ct值，或约1,000、5,000和10,000个的LDR-FRET信号)，这种方法在将产生自具有真正循环肿瘤DNA的那些个体的甲基化信号与产生自具有正常血液中的年龄相关性(但非癌性的)甲基化信号的那些个体的甲基化信号区分开并对其计数方面没有困难。在Ct或荧光信号仅能够区分0个与1个或更多个初始甲基化分子的情况下，假定在最少48个孔中计数初始12个或更少的基因组当量的肿瘤DNA以及60个或更多个基因组当量的特定区(例如20号染色体)的甲基化DNA，所述方法应当将产生自具有真正循环肿瘤DNA的那些个体的甲基化信号与产生自具有正常血液中的年龄相关性(但非癌性的)甲基化信号的那些个体的甲基化信号区分开并对其计数。
当使用含有UniTaq的LDR探针时，它们具有以下形式：上游探针包含5’标签，诸如UniTaqAi，接着是靶标特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniTaq Bi’-UniTaq Ci’)。
可使用UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物检测LDR产物。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，将形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游靶标-甲基化区-下游靶标-UniTaq Bi’-UniTaqCi’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
上游LDR探针和PCR引物还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。然后将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。在一些设计中，甲基敏感性限制性位点在PCR引物的3’端的下游，使得使用酶的切割移除对于4个另外的碱基的结合序列，并且显著降低了RNA酶H2对RNA碱基的裂解。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌的噬菌体RM378)磷酸化下游LDR探针。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(例如，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游探针的5’侧可含有与上游探针上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
方法概述v2：如上所述，将分离的基因组DNA或富含甲基的DNA用甲基敏感性酶的混合物(HinP1I、Bsh1236I、AciI、Hpy99I和HpyCH4IV)处理，并且通过甲基非敏感性酶(HaeIII和MspI)处理。理想的是产生大约40个碱基或更多碱基的DNA片段，其中片段的5’磷酸来源于甲基非敏感性酶。片段应当具有至少2-3个甲基敏感性酶位点，使得裂解导致这些片段分散。然后将基因组片段的一条链杂交至含有发夹的人工模板上，其中上游区与基因组DNA不相关，并且可连接至基因组片段的5’磷酸处。发夹的单链部分还含有与含有一个或多个甲基敏感性限制性酶位点的靶标互补的区。然后将相同的甲基敏感性酶添加回来，并且如果未甲基化靶链意外逃逸出初始限制酶切消化步骤，则所述未甲基化靶链将在第二步骤中被裂解。将与基因组片段杂交的下游寡核苷酸添加在所述基因组片段与模板链杂交处的下游。当延伸基因座特异性引物时，聚合酶的5→3’核酸外切酶活性破坏连接的寡核苷酸的模板部分，从而产生含有上游标签和下游标签的产物，所述产物适于扩增。未连接的发夹寡核苷酸将自身延伸并且不进一步扩增。上游寡核苷酸和下游寡核苷酸具有任选的通用序列以及UniTaq特异性序列，从而允许实现同时“预扩增”12-20个循环，之后打开管并且分到适当的UniTaq或TaqManTM测定中。对于每个启动子区，存在三个查询位置，使得信号如总信号强度(即＝所述启动子的1、2或3个甲基化位点)一样呈现(Ct值指示甲基化序列的相对量)。这种方法还与在PCR扩增步骤过程中使用用于提供遗留预防的UNG和用于提供额外保真度的RNA酶H2是相容的。
总结用于检测低丰度甲基化的以上方法的区分水平：
1.使用甲基化非敏感性限制性酶以在双链靶DNA上产生独特的5’磷酸。
2.使用甲基化敏感性限制性酶裂解未甲基化时的双链靶标。
3.使用UNG和甲基化敏感性限制性酶以预防初始PCR反应的遗留污染。
4.使用耐热性连接酶的连接保真性以将正确的标签连接至靶链。
5.使用基因座特异性引物和聚合酶以扩增连接的靶链。
6.仅当与靶标杂交时，使用RNA酶H2的核酸酶活性释放PCR引物上的未阻断的3’OH。
7.使用标签寡核苷酸的3’端上的序列，使得当其未被连接时形成发夹并且自身延伸以形成不扩增的产物。
8.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的PCR或LDR产物。
高灵敏度检测启动子甲基化的详细方案v2：
2.2a.制备含有限制性酶、人工发夹模板(参见下文)和耐热性连接酶的混合物。将分离的基因组DNA或富含甲基的DNA用甲基敏感性酶的混合物(例如HinP1I、Bsh1236I、AciI、Hpy99I和HpyCH4IV)裂解，并且通过甲基非敏感性酶(HaeIII和MspI)裂解。产生大约40个碱基或更多个碱基的片段，其具有来自HaeIII或MspI位点的5’磷酸以及至少3个甲基敏感性位点(其未被裂解，因为其是甲基化的)。优选地，每个启动子产生三个这样的片段。热灭活核酸内切酶(65℃，持续15分钟)并且使DNA变性(94℃，1分钟)。人工模板含有上游引物区(任选的5’通用引物U1Pm，接着是UniTaq Ai)以及与UniTaq Ai互补的区和与靶DNA互补的具有约72℃Tm的区，并且与至少一个甲基敏感性限制性位点重叠)。在60℃下孵育以允许发夹寡核苷酸当且仅当其被甲基化且与正确的模板杂交时与靶DNA的5’磷酸的杂交和连接。这种初始的基因组DNA-连接产物混合物适于12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重PCR扩增。
2.2b.添加：甲基敏感性限制性酶(在37℃下孵育30分钟)以及热启动Taq聚合酶、dNTP、UniTaqAi和下游引物(含有5’通用引物U2，接着是UniTaq Bi，接着是与具有恰好在人工模板链序列下游的序列的靶片段互补的靶基因座特异性序列)。当延伸基因座特异性引物时，聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性破坏连接的寡核苷酸的模板部分，从而产生含有上游标签和下游标签的产物，所述产物适于扩增。未连接的发夹寡核苷酸将自身延伸并且不进一步扩增。理想地，LDR和PCR化合物引物上的通用引物尾U1Pm和U2比通用引物U1和U2稍短。这允许在较低的循环温度(例如，55℃退火)下进行初始通用扩增，接着在较高循环温度(例如，65℃退火)下进行初始通用扩增，使得通用引物U1Pm和U2优先结合所需产物(与结合不正确产物的复合引物相比)。在最小化不依赖靶标的扩增的优选变型中，下游PCR引物含有RNA碱基和阻断的3’端，所述阻断的3’端通过在引物与其靶标杂交时由裂解RNA碱基的RNA酶H而得以释放。这些条件扩增的产物具有以下序列：
通用引物U1Pm-UniTaq Ai-甲基化区-UniTaq Bi’-通用引物U2’
或以下简单的序列：
UniTaq Ai-甲基化区-UniTaq Ci’
2.2c.打开管，稀释10至100倍并等份分布至TaqManTM孔，每个孔含有以下引物：通用引物U2和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，将形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-甲基化区-UniTaq Bi’-通用引物U2’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当通用引物U2结合通用引物U2’序列时，聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
对具有序列UniTaq Ai-靶DNA-UniTaq Ci’的产物，它们可使用嵌套式PCR引物(伴随任选的RNA酶H2裂解以去除阻断基团)和内TaqManTM探针检测。
作为对存在的DNA总量的对照，可选择附近的靶片段，其中5’磷酸通过甲基非敏感性酶(HaeIII或MspI)产生，并且剩余的片段缺乏甲基敏感性酶位点。连接至靶片段的上游寡核苷酸是两种寡核苷酸的混合物：(i)与正确的UniTaq特异性序列以1/100存在的寡核苷酸，和(ii)与具有与其3’端互补的约8-10个碱基的序列以99/100存在的寡核苷酸。在连接事件和用UNG和AP核酸内切酶破坏模板之后，添加通用引物用于PCR扩增。扩增含有UniTaq序列的连接产物并且生成等效于原始模板1/100的信号。大部分连接产物在5’端上缺乏通用序列并且不指数扩增。未连接的上游探针自身回折形成发夹，并自身延伸其3’序列，而不竞争成为另一个PCR扩增子的一部分。另选地或此外，对照可使用两种寡核苷酸的不同的比率，例如1∶10或1∶1,000以实现与目标启动子位点处存在的低水平的甲基化DNA的准确对照。
另选的对照使用两种寡核苷酸的混合物：(i)与正确的UniTaq特异性序列以1/100存在的发夹寡核苷酸，和(ii)在不存在UniTaq序列下以99/100存在的发夹寡核苷酸。在连接事件之后，添加通用引物用于PCR扩增。当延伸基因座特异性引物时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性破坏连接的寡核苷酸的模板部分，从而产生含有上游标签和下游标签的产物，所述产物适于扩增。未连接的发夹寡核苷酸将自身延伸并且不进一步扩增。扩增含有UniTaq序列的连接产物并且将生成等效于原始模板1/100的信号。大部分连接产物在5’端上缺乏通用序列并且不指数扩增。
图48示出根据针对遗留预防的PCR扩增方案使用限制酶切消化、发夹连接、基因座特异性延伸对基因组DNA或cfDNA的甲基化检测。使用嵌套式PCR引物和被设计成横跨甲基化序列的TaqManTM探针检测产物。
图49示出图48的变型，其中初始基因特异性PCR引物含有标签UniAi和UniCi。将产物进行稀释并分布到孔中以用于嵌套式扩增。上游嵌套式PCR引物和下游嵌套式PCR引物分别在其5’端含有UniTaq Aj和UniTaq Bj-UniTaq Cj标签。此外，UniTaq Cj和F1-UniTaqBj-Q-UniTaq Aj形式的UniTaq特异性引物以较高浓度存在于扩增混合物中，因此变成掺入到扩增产物中的主要引物。通过荧光标记引物形成的产物链将形成发夹，使得UniTaq Bj序列与UniTaq Bj’序列配对。当UniTaq引物Cj结合UniTaq Cj’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bj序列，从而释放F1荧光染料，并且产生通过实时PCR仪器检测的信号。
序列UniTaq Ai-靶DNA-UniTaq Ci’的产物还可使用嵌套在UniTaq Ci和UniTaqAi序列内的引物和标准TaqManTM探针进行检测。
可使用相同荧光染料同时查询单一启动子区中的两个或三个片段。可通过针对所述染料的总信号确定每个启动子的甲基化片段数。当使用空间多路复用时，在37℃孵育步骤之前(但在添加酶之后)将样品分布到12、24、48或96个单独孔。以此方式，给定的DNA分子的启动子区上的甲基化可与三个不同分子上的三个不同区的甲基化区分开。
因为存在初始连接步骤，所以不需要后续LDR步骤，其中初始PCR反应之后直接进行二级实时PCR(例如TaqManTM)反应。直接进行二级PCR的缺点是不能使用UNG遗留预防，因为初始PCR反应产物已掺入dUTP，因此将被UNG破坏。解决这个问题的一种方法是在初始PCR中使用标准dNTP，并且仅仅取决于限制性核酸内切酶以破坏来自初始或随后PCR反应的任何潜在遗留，因为这些产物现在是未甲基化的。
PCR引物还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。然后将RNA酶H2添加至反应。这确保用UniTaq引物组没有形成不依赖模板的产物。在一些设计中，甲基敏感性限制性位点在PCR引物的3’端的下游，使得使用酶的切割移除对于4个另外的碱基的结合序列，并且显著降低了RNA酶H2对RNA碱基的裂解。
方法概述v3：将分离的基因组DNA或富含甲基的DNA用甲基敏感性酶处理，所述甲基敏感性酶的识别元件仅包含CpG二核苷酸对(即Bsh1236I＝CG^CG；并且Hpy99I＝CGWCG^)。用亚硫酸氢盐处理，将“dC”转化为“dU”，并且使得链为非互补性的。在BstU1(CG^CG)存在下杂交基因座特异性引物，从而裂解遗留DNA。未被裂解的引物和靶标仅当与靶标结合时用RNA酶H2解除阻断。然后解除阻断的PCR引物扩增约100-130bp的未切割的亚硫酸氢盐转化的DNA片段。片段应当具有至少2个甲基敏感性酶位点，使得裂解导致这些片段分散。这些位点被选择使得遗留预防可以两个水平起作用：(i)在含有掺入的dUTP的DNA中，位点仍是可裂解的，从而允许使用UNG用于遗留预防，以及(ii)在扩增之后，位点是未甲基化的，使得如果其遗留至另一反应，则产物易于被重新裂解。此外，片段应具有另外的内部甲基化CpG对，使得阻断引物富集初始甲基化靶标的扩增，并且此外，LDR探针也选择性检测初始甲基化靶标。在初始PCR扩增之后，如上所述进行针对遗留预防的LDR和UniTaq反应。另选地，可进行LDR和TaqManTM或直接的TaqManTM反应以鉴定并定量初始样品中的甲基化DNA的相对量。
总结使用PCR引物和LDR引物检测低丰度甲基化的的以上方法的区分水平：
1.使用甲基化敏感性限制性酶裂解未甲基化时的靶标。
2.仅当与靶标杂交时，使用RNA酶H2的核酸酶活性释放PCR引物上的未阻断的3’OH。
3.使用UNG和甲基化敏感性限制性酶以预防初始PCR反应的遗留污染。
4.使用耐热性连接酶在上游LDR探针上的3’连接保真性。
5.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
6.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
高灵敏度检测启动子甲基化的详细方案v3
2.3.a.在Bsh1236I(CG^CG)和UNG存在下孵育基因组DNA或富含甲基的DNA(37℃，30-60分钟)以完全消化未甲基化DNA并且预防遗留。用亚硫酸氢盐处理，使得链为非互补性的，并且使用可商购的试剂盒(即来自Zymo Research或Qiagen)纯化DNA链。添加用于优化多重PCR扩增的缓冲液补充剂、dUTP和其他dNTP、AmpliTaq Gold、RNA酶H2、BstU1(CG^CG)以及含有在所需3’端之后RNA碱基、4个另外的碱基、阻断基团以防止在不正确靶标上的延伸的基因特异性引物。这种初始的基因组DNA-PCR反应混合物适于12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重PCR扩增。BstU1将裂解来自早期扩增的任何遗留DNA。将消化的基因组DNA和限制性核酸内切酶变性，并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且多重PCR扩增含有突变的片段，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行16-20个循环)。将PCR引物设计成具有约60℃的Tm值，但具有5个额外的碱基，所以Tm值更接近于65-68℃，并且甚至当以低于用于单重PCR的正常浓度10至50倍的浓度(每种引物10nM至50nM)下使用时将稳健地杂交。此外，使用阻断寡核苷酸限制未甲基化DNA的扩增。循环是受限制的以保持PCR产物相对于彼此的相对平衡，而仍使低丰度序列扩增约100,000至1,000,000倍。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
2.3.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游探针合成有5’磷酸或将其整体用激酶磷酸化。上游探针包含5’标签，诸如UniAi，接着是靶标特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果原始样品中存在甲基化DNA，这将允许在PCR产物上发生连接事件。
2.3.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR探针上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniAi-上游靶标-亚硫酸氢盐转化的甲基化区-下游靶标-UniCi’
可使用相同荧光染料同时查询单一启动子区中的两个或三个片段。可通过针对所述染料的总信号确定每个启动子的甲基化片段数。当使用空间多路复用时，在37℃孵育步骤之前(但在添加酶之后)将样品分布到12、24、48或96个单独孔。以此方式，给定的DNA分子的启动子区上的甲基化可与三个不同分子上的三个不同区的甲基化区分开。
图50示出使用限制酶消化和亚硫酸氢盐处理对基因组DNA或cfDNA的甲基化检测。初始亚硫酸氢盐转化的甲基化区PCR引物在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。在BstU1存在下杂交这些引物将裂解遗留DNA。这些基因特异性引物仅当与靶标杂交时通过RNA酶H2从末端解除阻断，从而释放适于聚合酶延伸的3’OH端。使用阻断寡核苷酸限制亚硫酸氢盐转化的未甲基化DNA的扩增。针对亚硫酸氢盐转化的未甲基化DNA的LDR探针提供另外的特异性。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图51示出图50的变型。上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaqBi’-UniTaq Ci’标签。在连接之后，将产物进行稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物的孔中(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。通过荧光标记引物形成的产物链将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料，并且产生通过实时PCR仪器检测的信号。
图52示出图50的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。PCR引物含有通用尾以消除引物二聚体形成，并且允许使用通用引物扩增，其中一种引物含有生物素，从而使得产物捕获在链霉亲和素涂覆的孔中。连接探针与靶标杂交并且仅在连接接点处存在完全互补性的情况下形成产物。然后洗掉未反应的连接探针或不依赖靶标的连接产物。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图151示出图50的变型，其中在初始限制性内切核酸酶消化和亚硫酸氢盐转化之后，使用基因座特异性上游引物和基因座特异性下游引物选择性地扩增PCR产物。在靶特异性杂交后，RNA酶H去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团。包含与上游PCR引物部分地重叠的亚硫酸氢盐转化的未甲基化序列(或其互补序列)的阻断LNA或PNA探针相对于上游引物优先竞争结合亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列，但对亚硫酸氢盐转化的甲基化靶序列并非如此，从而抑制亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶序列在每轮PCR过程中的扩增。在初始PCR富集步骤之后，根据针对遗留预防的LDR-qPCR检测方案继续这个程序。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图152示出图151的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’引物特异性部分和序列标签部分。在连接之后，将产物稀释并且分布到含有UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物的孔中，并且通过实时PCR仪器检测PCR中产生的信号。
图153示出图151的变型，其中PCR产物被捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图156示出图50的变型，其中使用基因座特异性上游引物和基因座特异性下游引物选择性扩增PCR产物，所述上游产物还包含与顶链的亚硫酸氢盐处理的未甲基化序列互补的5’部分序列，从而允许在延伸后形成环-发夹。在靶特异性杂交后，RNA酶H去除RNA碱基以释放适于聚合酶延伸的3’OH基团。使用缺乏5’核酸酶、3’核酸酶和链置换活性的聚合酶进行PCR。(i)亚硫酸氢盐处理的未甲基化底链的变性产生在3’端处具有完全匹配的环-发夹，所述环-发夹通过聚合酶延伸形成较长的发夹区。这个发夹区在72℃下不变性并且防止上游引物产生全长的顶链。(ii)亚硫酸氢盐处理的甲基化底链的变性产生具有两个或更多个错配的环-发夹。这个环-发夹不通过聚合酶延伸，因此在72℃下变性，从而能够使上游引物产生全长顶链。(iii)顶链的变性产生在5’侧的发夹，所述发夹在PCR的延伸步骤(72℃)过程中变性，从而允许聚合酶产生全长底链。在(i)亚硫酸氢盐处理的未甲基化模板和(ii)亚硫酸氢盐处理的甲基化模板存在下上游引物的发夹延伸偏好性的差异使得优先扩增突变型DNA。这种排除亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶标的扩增的选择在PCR的每个循环过程中发生，从而富集亚硫酸氢盐处理的甲基化靶标。在初始PCR富集步骤之后，根据针对遗留预防的LDR-q PCR检测方案继续这个程序。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图示出图148的变型，其中PCR产物被捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
上游LDR探针和PCR引物还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。然后将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。在一些设计中，甲基敏感性限制性位点在PCR引物的3’端的下游，使得使用酶的裂解去除阻断基团。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌的噬菌体RM378)使下游LDR探针磷酸化。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(例如，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游引物的5’侧可含有与上游引物上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
图53示出图50的变型，其中对PCR产物进行分布(空间多路复用)，并且使其进行第二嵌套式PCR，使用了TaqManTM探针以及阻断寡核苷酸以限制亚硫酸氢盐转化的未甲基化DNA的扩增。
图151 158示出图45的变型，其中使用嵌套式基因座特异性引物和内部TaqManTM探针直接检测一级PCR产物。PCR产物掺入了dU并且是未甲基化的，从而允许遗留预防。
预测性实施例3-高灵敏度检测分离自总血浆mRNA、外来体、循环肿瘤细胞(CTC)或含有CTC的总血细胞的mRNA的基因易位或剪接位点变化。
方法概述：此方法取决于三种酶的保真度：(i)反转录酶并且如实地拷贝初始样品中低水平的异常RNA转录物拷贝，(ii)成比例地扩增cDNA的Taq聚合酶，以及(iii)区分彼此相邻杂交的引物的耐热性连接酶。一旦连接事件发生，将在后续实时PCR扩增步骤中扩增那些产物，因此这是关键的区分步骤。
使用LDR的一个优点是其可区分不依赖于精确断点的易位事件。此外，当易位或可变剪接产生新的外显子-外显子接点时，LDR理想地适于精确区分这些接点，直到接点处的准确碱基。
在肿瘤中存在异常剪接的转录物的至少两种来源。肿瘤可通过总体低甲基化经历基因表达的整体调节异常。低甲基化的一个后果是劣化对启动子区中转录起始位点的控制，从而使得转录物的5’端中产生可变序列。然后可使用基于LDR的测定准确鉴定并定量此类可变剪接的前导序列。异常剪接的转录物的第二来源产生自剪接机构的调节异常。一些此类转录物被翻译成有利于或甚至驱动肿瘤生长的蛋白质。同样，然后可使用基于LDR的测定准确鉴定并定量这些可变剪接的转录物，包括提供同一LDR反应中异常转录物与野生型转录物的相对水平。
为了预防遗留污染，在聚合酶激活之前将UNG添加至反应并且在dUTP存在下进行初始PCR扩增。LDR探针由天然碱基组成，因此现在LDR产物对第二实时PCR步骤中的UNG消化具有抗性。注意LDR产物在其非连接末端上含有靶DNA中不存在的标签或UniTaq序列，因此LDR产物的意外遗留不导致大规模的扩增。与PCR不同，初始LDR产物不是用于第二LDR反应的底物。
总结用于高灵敏度检测mRNA中的易位或剪接位点变化的以上方法的区分水平：
1.使用具有通用尾的PCR引物，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。
2.使用UNG以预防初始PCR反应的遗留污染。
3.使用耐热性连接酶在上游LDR探针上的3’连接保真性。
4.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
5.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
用于高灵敏度检测mRNA中的基因易位或剪接位点变化的详细方案
3.1.a.在UNG(37℃，15-30分钟，用于预防遗留)、dUTP和其他dNTP、MMLV反转录酶、AmpliTaq Gold以及转录物特异性引物存在下孵育分离的mRNA(或甚至总的分离的核酸)。(MMLV反转录酶可被工程化用于在50-60℃下由总输入RNA合成cDNA(InvitrogenSuperscript III)。另选地，Tth或Tma DNA聚合酶已被工程化以改善其反转录酶活性(可能需要添加Mn辅因子)。最终，嗜热PyroPhage 3173 DNA聚合酶具有链置换活性和反转录活性，并且还可被使用)。这种初始的cDNA-PCR反应混合物适于12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重反转录PCR扩增。在反向引物在其同源RNA转录物上延伸产生cDNA之后，使UNG和MMLV反转录酶失活并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且多重PCR扩增含有转录物的片段，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行16-20个循环)。将PCR引物设计成具有约64-66℃的Tm值，并且将稳健地杂交，甚至当以低于用于单重PCR的正常浓度10至50倍的浓度(每种引物10nM至50nM)下使用时。循环是受限制的以保持PCR产物相对于彼此的相对平衡，而仍使低丰度序列扩增约100,000至1,000,000倍。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
3.1.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游探针合成有5’磷酸或将其整体用激酶磷酸化；上游探针包含5’标签，诸如UniAi，接着是转录物特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果存在所需外显子-外显子接点，这将允许在cDNA PCR产物上发生连接事件。对于未知精确接点的易位检测，使用三种LDR探针。中间探针含有与(各种)剪接转录物的已知上游区和下游区互补的序列。上游探针和下游探针含有如上所述的标签以实现后续的UniTaq或TaqManTM扩增和所需连接产物的检测。
3.1.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR探针上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniTaq Ai-上游外显子-下游外显子接点-UniTaq Ci’
对于使用三个LDR探针检测具有未知接点的转录物的产物，将形成以下产物：
UniTaq Ai-上游外显子-搭桥序列-下游外显子-UniTaq Ci’
图54示出使用针对遗留预防的PCR-LDR反应检测mRNA水平上的易位的概述。示出了两个基因之间的易位的图示，其中交叉使得上游基因的外显子1、2或3与下游基因的外显子b融合。LDR探针被设计用于检测所有可能的外显子接点(1-b、2-b和3-b)。
图55示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-qPCR检测方案对融合基因的易位检测(图54中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图56示出图55的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用荧光标记的UniTaq引物检测产物。
图57示出图55的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号。
图58示出使用针对遗留预防的PCR-LDR反应检测可变剪接的概述。示出了正常(1-2-3a-4)和可变剪接变体(1-2-3b-4)mRNA的实例的图示。LDR探针被设计用于检测正常和/或可变剪接变体(3a-4和3b-4)。
图59示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-qPCR检测方案的可变剪接变体检测(图58中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对正常转录物3a-4(F1)和针对可变剪接变体3b-4(F2)被不同地标记的被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图60示出图59的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai或UniTaq Aj和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaqBi-Q-UniTaq Ai和F2-UniTaq Bi-Q-UniTaq Aj检测产物，以检测分别代表正常转录物3a-4和针对可变剪接变体3b-4的信号F1和F2。
图61示出图59的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1和F2，所述F1和F2分别代表正常转录物3a-4和针对可变剪接变体3b-4。
图62示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-q PCR检测方案的低水平可变剪接变体检测(图58中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体，并且被设计成仅扩增含有3b-4接点的少数转录物。使用针对低丰度可变剪接变体3b-4被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图63示出图62的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测代表低丰度可变剪接变体3b-4的信号F1。
图64示出图62的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1，所述F1代表低丰度可变剪接变体3b-4。
图65示出使用针对遗留预防的PCR-LDR反应检测可变剪接的概述，其中可变起始位点针对第一外显子。示出了正常(1-2-3)和可变剪接变体(1a-2-3)mRNA的实例的图示。LDR探针被设计用于检测正常和/或可变剪接变体(1-2和1a-2)。
图66示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-qPCR检测方案的可变剪接变体检测(图65中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对正常转录物1-2(F1)和针对可变起始位点变体1a-2(F2)被不同地标记的被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图67示出图66的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai或UniTaq Aj和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaqBi-Q-UniTaq Ai和F2-UniTaq Bi-Q-UniTaq Aj检测产物，以检测分别代表正常转录物1-2和针对可变起始位点变体1a-2的信号F1和F2。
图68示出图66的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1和F2，所述F1和F2分别代表正常转录物1-2和针对可变起始位点变体1a-2。
图69示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-q PCR检测方案的低水平可变剪接变体检测(图58中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体，并且被设计成仅扩增含有1a-2接点的少数转录物。使用针对低丰度可变起始位点变体1a-2被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图70示出图69的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测代表低丰度可变起始位点变体1a-2的信号F1。
图71示出图69的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1，所述F1代表低丰度可变起始位点变体1a-2。
图72示出使用针对遗留预防的PCR-LDR反应检测外显子缺失的可变剪接的概述。示出了正常(e1-e2-e3-e4-e5)和可变剪接变体(e1-e2-e3-e5)mRNA的实例的图示。LDR探针被设计用于检测正常和/或可变剪接外显子缺失变体(e4-e5和e3-e5)。
图73示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-q PCR检测方案的可变剪接变体(外显子缺失)检测(图58中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对正常转录物e4-e5(F1)和针对可变剪接外显子缺失变体e3-e5(F2)被不同地标记的被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图74示出图73的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai或UniTaq Aj和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaqBi-Q-UniTaq Ai和F2-UniTaq Bi-Q-UniTaq Aj检测产物，以检测分别代表正常转录物e4-e5和针对可变剪接外显子缺失变体e3-e5的信号F1和F2。
图75示出图73的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1和F2，所述F1和F2分别代表正常转录物e4-e5和针对可变剪接外显子缺失变体e3-e5。
图76示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-q PCR检测方案的低水平可变剪接变体(外显子缺失)检测(图58中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体，并且通过使用具有e4序列的阻断寡核苷酸抑制野生型转录物的扩增被设计成仅扩增含有e3-e4接点的少数转录物。使用针对低丰度的可变剪接外显子缺失变体e3-e5被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图77示出图76的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测代表低丰度的可变剪接外显子缺失变体e3-e5的信号F1。
图78示出图76的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1，所述F1代表低丰度的可变剪接外显子缺失变体e3-e5。
图79示出使用针对遗留预防的PCR-LDR反应检测内含子插入的可变剪接的概述。示出了正常(e1-e2-e3-e4-e5)和可变剪接变体(e1-i1-e2-e3-e4-e5)mRNA的实例的图示。LDR探针被设计用于检测正常和/或内含子插入的可变剪接变体(e1-e2和i1-e2)。
图80示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-实时PCR检测方案的可变剪接变体检测(图79中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对正常转录物e1-e2(F1)和针对内含子插入的可变剪接变体i1-e2(F2)被不同地标记的被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图81示出图80的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai或UniTaq Aj和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaqBi-Q-UniTaq Ai和F2-UniTaq Bi-Q-UniTaq Aj检测产物，以检测信号F1和F2，所述信号F1和F2分别代表正常转录物e1-e2和针对内含子插入的可变剪接变体i1-e2。
图82示出图80的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1和F2，所述F1和F2分别代表正常转录物e1-e2和针对内含子插入的可变剪接变体i1-e2。
图83示出使用针对遗留预防的基本RT-PCR-LDR-qPCR检测方案的低水平可变剪接变体(内含子插入)检测(图79中的概述)的特写图。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体，并且被设计成仅扩增含有i1-e2接点的少数转录物。这可通过以下方式实现：(i)用胰DNA酶1消化核酸以消化所有基因组DNA，同时完整保留mRNA，或(ii)在针对i2的阻断引物存在下使用还跨越例如反转录自e3的内含子i2的引物组。使用针对低丰度的内含子插入的可变剪接变体i1-e2被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图84示出图83的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测代表低丰度的内含子插入的可变剪接变体i1-e2的信号F1。
图85示出图83的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测的FRET信号F1，所述F1代表低丰度的内含子插入的可变剪接变体i1-e2。
当使用含有UniTaq的LDR探针时，它们具有以下形式：上游探针包含5’标签，诸如UniTaqAi，接着是靶标特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniTaq Bi’-UniTaq Ci’)。
可使用UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物检测LDR产物。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游外显子-下游外显子接点-UniTaq Bi’-UniTaqCi’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
对于使用三个LDR探针检测具有未知接点的转录物的产物，将形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游外显子-搭桥序列-下游外显子-UniTaq Bi’-UniTaq Ci’
一种初始PCR引物或上游LDR探针还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。在PCR的反转录步骤之后和/或在LDR反应过程中将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌的噬菌体RM378)使下游LDR探针磷酸化。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(例如，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游探针的5’侧可含有与上游引物上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
预测性实施例4-准确定量分离自循环肿瘤细胞的DNA的肿瘤特异性拷贝变化
方法概述：因为在纯化的样品中可能仅存在少量CTC，所以重要的是使用空间多路复用准确地计数样品中的每个染色体拷贝。此方法取决于两种酶的保真度：(i)用于如实地拷贝初始样品中的低水平的DNA区拷贝的Taq聚合酶，和(ii)区分彼此相邻杂交的引物的连接酶。一旦连接事件发生，将在后续实时PCR扩增步骤中扩增那些产物，因此这是关键的区分步骤。
为了预防遗留污染，在聚合酶激活之前将UNG添加至反应并且在dUTP存在下进行初始PCR扩增。LDR探针由天然碱基组成，因此现在LDR产物对第二实时PCR步骤中的UNG消化具有抗性。注意LDR产物在其非连接末端上含有靶DNA中不存在的标签或UniTaq序列，因此LDR产物的意外遗留不导致大规模的扩增。与PCR不同，初始LDR产物不是用于第二LDR反应的底物。
总结使用PCR引物和LDR引物确定特异性区的拷贝数检测的以上方法的区分水平：
1.使用具有通用尾的PCR引物，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。
2.使用UNG以预防初始PCR反应的遗留污染。
3.使用耐热性连接酶在上游LDR探针上的3’连接保真性。
4.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
5.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
高度准确地定量分离自循环肿瘤细胞的DNA或RNA的肿瘤特异性拷贝变化的详细方案。
4.1.a.在UNG(37℃，15-30分钟，以预防遗留)、dUTP和其他dNTP、AmpliTaq Gold和含有通用尾的基因特异性引物存在下孵育基因组DNA，使得如果形成了任何不依赖靶标的引物二聚体，则不正确的产物将形成抑制进一步扩增的发夹。将这种初始的基因组DNA-PCR反应混合物分布在12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)以进行多重PCR扩增。将来自血浆的基因组DNA变性、使UNG失活并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且多重PCR扩增染色体区，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行12-20个循环)。将PCR引物设计成具有约64-66℃的Tm值，并且甚至当以低于用于单重PCR的正常浓度10至50倍的浓度(每种引物10nM至50nM)下使用时将稳健地杂交。循环是受限制的以保持PCR产物相对于彼此的比例平衡，而仍使低丰度序列扩增约100,000至1,000,000倍。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
4.1.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游探针合成有5’磷酸或将其整体激酶化；上游探针包含5’标签，诸如UniAi，接着是靶特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果存在染色体DNA，这将允许在PCR产物上发生连接事件。
4.1.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR引物上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniAi-染色体靶区-UniCi’
图86示出利用针对遗留预防的基本PCR-LDR-q PCR检测方案使用空间多路复用(参见图6-9)的DNA拷贝数计数。初始基因特异性PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对每个染色体区被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物，并且计数总拷贝数。
图87示出图86的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测针对每个染色体区的信号，并且计数总拷贝数。
图88示出图86的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上(参见图19-23)。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测每个染色体区的FRET信号，并且计数总拷贝数。
图89示出利用针对遗留预防的基本反转录PCR-LDR-qPCR检测方案使用空间多路复用(参见图10-13)的mRNA转录物数目计数。初始基因特异性反转录和PCR引物含有相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对每种mRNA转录物被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物，以实现准确计数。
图90示出图89的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测针对每种mRNA转录物的信号，从而实现准确计数。
图91示出图89的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上(参见图24-28)。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测每种mRNA转录物的FRET信号，以实现准确计数。
作为在48个孔上的空间多路复用的实例考虑分离自12个CTC的DNA，使用针对具有预后或治疗价值的各种拷贝区制备的探针，诸如染色体臂8p的杂合性丢失(8p处的LOH；预测差的结果)，或17q12处Her2基因的扩增(预测对赫赛汀治疗的反应性)。可采用多个LDR探针组来确定整个基因组上的拷贝数，其中已知焦点处的另外对经历显著扩增。对于这个实例，基因组的二倍体区将产生来自24个拷贝(即2x12细胞)的信号，8p处的LOH事件将产生12个拷贝，并且例如，如果使Her2基因扩增8倍，则产生来自96个拷贝(即8x12)的信号。合理的泊松分布(图31和32)显示，LOH区将具有针对12个分子的(孔∶分子)(38∶0；10∶1；1∶2)的分布，二倍体区具有针对24个分子的约(29∶0；15∶1；4∶2；1∶3)的分布，而扩增区将具有针对96个分子的约(6∶0；13∶1；13∶2；9∶3；4∶4；2∶5；1∶6)的分布。注意，即使区仅经历温和的扩增，例如每细胞2个拷贝至3个拷贝，三体性区也将具有针对36个分子的约(23∶0；17∶1；6∶2；2∶3)的分布，并且因此可与二倍体区区分。如前所述，即使LDR-TaqManTM LDR信号的可变性足以使得区分较高水平的信号变得太困难，但是只要信号干净的足以区分0个、1个和2个初始分子(分别表示为12.5、10和9的LDR-TaqManTM Ct值，或约1,000、5,000和10,000个的LDR信号)，这种方法在区分并计数已经历LOH的区、二倍体的区和已经历扩增的区的方面没有困难。CT或荧光信号的可变性仅足以区分0和1或更多个初始染色体分子，考虑在最少48个孔中的24个二倍体染色体拷贝，这种方法应当区分并计数已经历LOH的区、二倍体的区和已经历扩增的区。
对于具有较高的肿瘤DNA负载或具有mRNA或miRNA的cfDNA样品，其中起始靶标以较高量存在，LDR信号将成比例地增强。初始分子的大的动态范围还可通过使用稀释初始信号的不同策略来实现。例如，在对分离自外来体的mRNA进行反转录步骤之后，不是将样品等分在48个孔中，而是将样品分为10等份，将前8份分布到孔中，并且将剩余的等份中的一份稀释为10等份，其中将8份分布到孔中等等。这实现6个数量级的稀释：(即8x6＝48)。泊松分布的检查显示，只要最后稀释的1个孔代表0个分子，则给定的8孔组可对在2个数量级的动态范围内的1至128个起始分子提供半定量估计，甚至同时LDR读出仅需要提供20倍的动态范围或4-5的Ct范围(参见示出在8个孔中的1至128个分子的泊松分布的图33-37)。因为稀释度仅为10倍，所以可使用8个孔中的至少2组测定样品中的多种不同转录物的原始分子的数目，即使一些mRNA分子大约为10个分子，而其他mRNA分子大约为1x106个分子。
可使用相同方法用于定量RNA拷贝，但在第一步骤中添加反转录酶，并且初始反应混合物的空间分布可如上概述的那样进行稀释和分布。
当使用含有UniTaq的LDR探针时，它们具有以下形式：上游探针包含5’标签(诸如UniTaqAi)，接着是在第3或倒数第二碱基处具有C：A或G：T错配、在3’端处具有突变碱基的靶特异性序列，接着是RNA碱基和与靶标匹配的4个额外的DNA碱基以及C3间隔子阻断基团。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniTaq Bi’-UniCi’)。
可使用UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物检测LDR产物。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-染色体靶区-UniTaq Bi’-UniTaq Ci’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
一种初始PCR引物(具有RNA)或两种初始PCR引物(具有DNA)或上游LDR探针还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。当定量DNA拷贝时，在PCR反应的条件下和/或在LDR反应的条件下添加RNA酶H2。当定量RNA时，在PCR的反转录步骤之后和/或在LDR反应的条件下将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌的噬菌体RM378)使下游LDR探针磷酸化。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(例如，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游引物的5’侧可含有与上游引物上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
预测性实施例5-准确定量分离自外来体或分离自循环肿瘤细胞的miRNA、lncRNA或mRNA变化
方法概述：此方法取决于两种酶的保真度：(i)用于如实地拷贝初始样品中的低水平的miRNA拷贝的反转录酶和Taq聚合酶，和(ii)区分彼此相邻杂交的探针的连接酶。一旦连接事件发生，将在后续实时PCR扩增步骤中扩增那些产物，因此这是关键的区分步骤。
微RNA(miRNA)已被鉴定为肿瘤存在、其分类和预后的潜在组织特异性标志物。miRNA作为与Ago2蛋白质的复合物或通过包封为外来体存在于血清和血浆中。
为了预防遗留污染，在通过MMLV进行反转录之前将UNG添加至反应并且在dUTP存在下进行初始PCR扩增。LDR探针由天然碱基组成，因此现在LDR产物对第二实时PCR步骤中的UNG消化具有抗性。注意LDR产物在其非连接末端上含有靶miRNA中不存在的标签或UniTaq序列，因此LDR产物的意外遗留不导致大规模的扩增。与PCR不同，初始LDR产物不是用于第二LDR反应的底物。
含有通用反向引物区和6-8个碱基miRNA特异性区的miRNA特异性发夹环与miRNA的3’端杂交并且在dUTP存在下用MMLV延伸。在正确的条件下，在不依赖模板的延伸反应中，MMLV将越过miRNA模板的5’端添加2-3C核苷酸。
在初始cDNA产生之后，添加与miRNA的2-3个另外的C核苷酸和12至14个特异性碱基杂交的通用反向引物和具有通用尾的正向引物。使用Taq聚合酶进行16-20个循环的通用扩增；通用反向引物被定位成在cDNA产生过程中消除大多数的发夹区。
总结用于高灵敏度检测miRNA的以上方法的区分水平：
1.使用UNG以预防初始反转录和PCR反应的遗留污染。
2.使用耐热性连接酶在上游LDR探针上的3’连接保真性。
3.使用UniTaq或标签引物扩增用于实时PCR读出的LDR产物。
4.使用UNG以预防实时PCR反应的遗留污染。
高灵敏度检测miRNA的详细方案：
5.1.a.在UNG(37℃，15-30分钟，用于预防遗留)、dUTP和其他dNTP、MMLV反转录酶、AmpliTaq Gold以及转录物特异性引物存在下孵育分离的miRNA(或甚至总的分离的核酸)。这种初始的cDNA-PCR反应混合物适于12、24、48或96个单独孔中(空间多路复用)或单一孔中的多重反转录PCR扩增。在发夹反向引物在其同源miRNA上延伸产生cDNA之后，使UNG和MMLV反转录酶失活并激活AmpliTaq Gold(94℃，5-10分钟)，并且使用搭桥引物和标签引物(Ti和Tj)多重PCR扩增含有转录物的片段，进行有限数量的循环(94℃，10秒；60℃30秒；72℃30秒；进行16-20个循环)。在PCR扩增后，使Taq聚合酶失活(通过在99℃下孵育30分钟)。
5.1.b.添加耐热性连接酶(优选来自菌株AK16D)、用于优化连接条件的缓冲液补充剂以及合适的上游LDR探针和下游LDR探针(各自10nM至20nM，在反应之前可以使下游探针合成有5’磷酸或将其整体激酶化；上游探针包含5’标签，诸如UniAi，接着是靶特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniCi’)。进行20个LDR循环(94℃，10秒，60℃4-5分钟)。如果存在染色体DNA，这将允许在PCR产物上发生连接事件。
5.1.c.打开管/孔，进行稀释(10至100倍)并等份分布至孔以用于实时PCR反应，每孔含有具有UNG的适当的TaqManTM预混合物以实现遗留预防，以及以下引物：UniCi和UniAi以及横跨连接接点覆盖序列的TaqManTM探针。在此类条件下，LDR探针上的标签序列分别是UniAi和UniCi，并且产物将具有以下形式：
UniAi-上游miRNA-下游miRNA接点-UniCi’
在以上主题的一个变型中，发夹寡核苷酸以碱基特异性方式连接至miRNA的3’端，从而附加了含有标签-引物结合位点(Tj)的人工环序列。这能够实现拷贝整个miRNA序列的延伸，并且使用miRNA靶特异性搭桥引物(包含(Ti)和miRNA特异性序列)和两种标签引物(Ti，Tj)引发PCR反应。现在PCR产物适于如上所述的后续LDR步骤。
图92示出miRNA检测，利用了环引物的反转录，接着是针对遗留预防的标签引物和搭桥引物PCR方案。使用了针对遗留预防的后续LDR-q PCR检测方案。初始miRNA特异性PCR引物含有与标签引物部分相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对检测的每种miRNA被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图93示出图92的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测针对每种miRNA的信号。
图94示出图92的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测每种miRNA的FRET信号。
图95示出miRNA检测，利用了环引物与miRNA的直接连接，接着是针对遗留预防使用与环互补的标签引物的反转录。针对遗留预防，所述程序使用标签引物和搭桥引物用于PCR-LDR-q PCR检测。初始miRNA特异性PCR引物含有与标签引物部分相同的8-11个碱基的尾以防止引物二聚体。使用针对检测的每种miRNA被设计成横跨连接接点序列的TaqManTM探针检测产物。
图96示出图95的变型，其中上游LDR引物和下游LDR引物分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测针对每种miRNA的信号。
图97示出图95的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测每种miRNA的FRET信号。
图98示出图95的变型，其中搭桥PCR引物在3’端上含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。在反转录步骤之后将RNA酶H2添加至反应以对PCR引物解除阻断。这确保了不形成不依赖模板的产物。
图99示出图98的变型，其中上游LDR探针和下游LDR探针分别含有UniTaq Ai和UniTaq Bi’-UniTaq Ci’标签，并且使用被荧光标记的UniTaq引物F1-UniTaq Bi-Q-UniTaqAi检测产物，以检测针对每种miRNA的信号。
图100示出图98的变型，其中PCR产物被分布(空间多路复用)，并且捕获在固体支持物上。LDR探针被设计成含有仅当连接在一起时彼此杂交的短互补序列，从而产生适于检测每种miRNA的FRET。
当使用含有UniTaq的LDR探针时，它们具有以下形式：上游探针包含5’标签，诸如UniTaqAi，接着是靶标特异性序列。下游探针包含5’磷酸化末端，接着是靶标特异性序列和3’标签(诸如UniTaq Bi’-UniTaq Ci’)。
可使用UniTaq Ci和F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai形式的UniTaq特异性引物检测LDR产物。(其中F1为通过淬灭剂Q淬灭的荧光染料)。在这些条件下，形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游 miRNA-下游 miRNA接点-UniTaq Bi’-UniTaqCi’
这种构建体将形成发夹，使得UniTaq Bi序列与UniTaq Bi’序列配对。当UniTaq引物Ci结合UniTaq Ci’序列时，聚合酶的5’-＞3’核酸外切酶活性消化UniTaq Bi序列，从而释放F1荧光染料。
对于使用三个LDR探针检测具有未知接点的转录物的产物，将形成以下产物：
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上游外显子-搭桥序列-下游外显子-UniTaq Bi’-UniTaq Ci’
一种初始PCR引物或上游LDR探针还可在3’端含有RNA碱基、4个另外的碱基和阻断基团。在PCR的反转录步骤之后和/或在LDR反应过程中将RNA酶H2添加至反应。这确保了不形成不依赖模板的产物。
还可在连接反应过程中使用嗜热噬菌体激酶(衍生自感染海洋红嗜热盐菌的噬菌体RM378)使下游LDR探针磷酸化。在这些条件下，LDR中的变性步骤应当尽可能地短(例如，94℃或甚至更低，持续1秒)，因为嗜热激酶不是完全耐热的-或者仅在65℃下预孵育15分钟来实现完全的引物磷酸化。另选地，下游探针的5’侧可含有与上游探针上的3’区别碱基相同的碱基，所述碱基通过Fen核酸酶或Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性去除以释放适于后续连接的5’磷酸。
经验实施例-通过PCR-LDR-qPCR检测癌症相关的突变和甲基化
用于经验实施例1-4的一般方法。
使用的细胞系是：HT-29结肠腺癌细胞系，其具有V600E(1799T＞A)BRAF杂合型突变；HEC-1(A)子宫内膜腺癌细胞系，其具有R248Q(743G＞A)TP53杂合型突变和G12D(35G＞A)KRAS杂合型突变；LS123结肠腺癌细胞系，其具有G12S(34G＞A)KRAS杂合型突变；SW1463结肠腺癌细胞系，其具有G12C(34G＞T)KRAS纯合型突变；SW480结肠腺癌细胞系，其具有G12V(35G＞T)KRAS纯合型突变；以及SW1116结肠腺癌细胞系，其具有G12A(35G＞C)KRAS杂合型突变。将所有细胞系接种在60em2培养皿中的含有4.5g/l葡萄糖、补充有10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中，并且保持在含有5％CO2的湿润气氛中。一旦细胞达到80-90％汇合，就将它们在磷酸盐缓冲盐水中洗涤(x 3)并且通过离心(500xg)收集。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)分离DNA。用Quant-iT Picogreen Assay LifeTechnologies/ThermoFisher；Waltham，Ma)确定DNA浓度。从Roche(Indianapolis，IN)购买含有分离自人血(血沉棕黄层)的高分子量(＞50kb)基因组DNA(Roche hgDNA)的人基因组DNA(0.2mg/ml)。它的准确浓度通过Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒确定为39ng/μl。
从BioreclamationIVT(Nassau，NY)购买来自21-61岁的无癌症捐献者的人血浆(具有作为抗凝剂的K2EDTA)。根据制造者的说明书，使用QIAamp Circμlating核酸试剂盒从个体血浆样品(5mL)中分离DNA，并且使用Quant-iT Picogreen Assay LifeTechnologies/The rmoFisher；Waltham，Ma)对其定量。
经验实施例1-检测V600E(1799T＞A)BRAF突变
使用的所有引物在表1中列出。所有引物购自Integrated DNA TechnologiesInc.(IDT，Coralville，IA)，除了引物iCDx-315-BRAF_FLW购自Exiqon Inc.(Woburn，MA)。
表1.用于PCR-LDR-qPCR检测BRAF V600E突变的引物
/5SPC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
稀释实验。在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行PCR步骤：1.58μl无核酸酶水(IDT)、2μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、0.8μl 25mM的MgCl2(Promega，Ma dison，WI)、0.2μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、0.25μl 2μM的iCDx-328-Braf_P F_WT_blk2正向引物、0.25μl2μM的iCDx-284-Br600-PR反向引物、1.25μl 2μM的iCDx-284-Br600-PR LNA阻断引物、0.25μl 20mU/μlRNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、0.2μl 1U/μl的南极热敏UDG(NewEngland Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen/ThermoFisherWalt ham，Ma)混合的0.22μl Klentaq1聚合酶(DNA Polymerase Technol ogy，St.Louis，MO)(混合物通过将0.02μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至0.2μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，11.7ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有35ng或10000个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与Roche hgDNA混合的HT-29wc DNA：1)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.047ng/μl wcDNAHT-29，由此3μl中具有0.14ng wcDNA HT-29和35ng Roche hgDN A，其对应于40个GE HT-29(仅20个GE是突变的)和10000个GE Roche人基因组DNA(即，1个突变型(mt)/500个野生型(wt))；2)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.023ng/μl wcDNA HT-29，由此3μl中具有0.07ngwcDNA HT-29和35ng Roche hgDNA，其对应于20个GE HT-29(仅10个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA；(即，1个mt/1000个wt)；3)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.0117ng/μlwcDNA HT-29，由此3μl中具有0.0035ng wcDN A HT-29和35ng Roche hgDNA，其对应于10个GE HT-29(仅5个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，1个mt/2000个wt)；4)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.006ng/μl wcDNA HT-29，由此3μl中具有0.00175ng wcDNAHT-29和35ng Roche hgDNA，其对应于5个GE HT-29(仅2或3个GE是突变的)和10000个GERoche hgDNA(即，1个mt/5000个wt)。注意：在制备0.047ng/μl wcDNA HT-29于11.7ng/μlRoche hgDNA的混合物(10000个GE Roche hgDNA中有40个GE突变体)之后，通过将0.5体积的前突变体-Roche hgDNA混合物和0.5体积的11.7ng/μl Roche hgDN A连续稀释混合制备剩余的突变体加Roche hgDNA混合物，那么突变体GE被1/2稀释，而Roche hgDNA GE保持未稀释(10000个GE)。PCR反应在用来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，40个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行LDR步骤：5.82μl无核酸酶水(IDT)、1μl 10X AK16D连接反应缓冲液[1X缓冲液含有20mM Tris-HCl pH 8.5(Bio-Rad，Hercules，CA)、5mM MgCl2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、50mM KCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、10mM DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)和20ug/ml BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)]、0.25μl 40mM的DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 40mM的NAD+(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)、0.2μl 500nM的iCDx-308-Br600_(3)-L_Up_Rm上游引物、0.2μl 500nM的iCDx-276-Br600-L_Dn_P下游引物、0.028μl 8.8μM的纯化的AK16D连接酶以及2μl PCR反应物。LDR反应在用来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Prof lex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：20个循环(在94℃下10s及在60℃下4min)，然后最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行qPCR步骤：1.5μl无核酸酶水(IDT)、来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的5μl 2X快速通用PCR预混合物(快速amplitaq、UDG和dUTP)、1μl 2.5μM的iCDx-277_A4正向引物、1μl 2.5μM的iCDx-279_C4反向引物、0.5μl 5μM的iCDx-281-Br600_(3)_ProbeTaqman探针以及1μl LDR反应物。qPCR反应在来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的ViiA7实时热循环仪中进行，使用了用AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma的MicroAmpTM光学粘合剂膜密封的快速-96-孔反应0.1ml板和以下设定：快速封闭，标准曲线作为实验类型，ROX作为被动参考，Ct作为定量方法(自动阈值，但需要时调整至0.04)，TAMRA作为报告蛋白并且NFQ-MGB作为淬灭剂；以及使用以下程序：在50℃下2min，以及40个循环(在95℃下1s及在60℃下20s)。结果在图159和表2中示出。
表2.用于检测BRAF V600E的稀释实验的结果。
Mt＝突变型BRAF V600E。WT＝野生型BRAF。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
使用来自Roche的hgDNA进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：56.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-328-Braf_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-284-Br600-PR反向引物、16.25μl 2μM的iCDx-284-Br600-PRLNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNA PolymeraseTechnology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，2.925ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有8.75ng Roche hgDNA或2500个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与Roche hgDNA混合的HT-29wcDNA：1)在2.925ng/μlRoche hgDNA中的0.023ng/μl wcDNA HT-29，由此3μl中具有0.07ng wcDNA HT-29和8.75ngRoche hgDNA，其对应于20个GE HT-29(仅10个GE是突变的)和2500个GE Roche hgDNA；2)在2.925ng/μl Roche hgDNA中的0.0117ng/μl wcDNA HT-29，由此3μl中具有0.0035ng wcDNAHT-29和8.75ng Roche hgDNA，其对应于10个GE HT-29(仅5个GE是突变的)和2500个GERoche hgDNA。注意：0.0117ng/μl wcDNA HT-29在2.925ng/μl Roche hgDNA中的混合物通过将0.5体积的0.023ng/μl wcDNA HT-29在2.925ng/μl Roche hgDNA中的混合物(20个GE突变体，10个GE突变的，在2500个GE Roche hgDNA中)和0.5体积的2.925ng/μl RochehgDNA连续稀释混合制备，因此将突变体稀释至10个GE(5个GE突变的)，而Roche hgDNA GE保持未稀释(2500个GE)。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，40个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图160和表3中示出。
使用人血浆DNA(血浆#8)进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：46.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-328-Braf_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-284-Br600-PR反向引物、16.25μl 2μM的iCDx-284-Br600-PRLNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNA PolymeraseTechnology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及13μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，血浆DNA(如6.9μl无核酸酶H2O加6.1μl 0.714ng/μl的血浆DNA所制备的，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与血浆DNA混合的HT-29wcDNA：1)4.9μl无核酸酶H2O，加6.1μl 0.714ng/μl的血浆DNA，加2μl0.035ng/μl的wcDNA HT-29，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加对应于20个GE HT-29(仅10个GE是突变的)的0.07ng wcDNA HT-29；2)5.9μl无核酸酶H2O，加6.1μl 0.714ng/μl的血浆DNA，加1μl 0.035ng/μl的wcDNA HT-29，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加对应于10个GE HT-29(仅5个GE是突变的)的0.035ng wcDNA HT-29。注意：通过将0.5体积的具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)和0.07ng wcDNA(20个GE突变体，10个突变的)的先前混合物与0.5体积的4.375ng血浆DNA混合物连续稀释混合来制备具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加0.035ng wcDNA(10个GE突变体，5个突变的)的混合物。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFishe r；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，45个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图161和表4中示出。
经验实施例2-检测R248Q(743G＞A)TP53突变
使用的所有引物在表5中列出。所有引物购自Integrated DNA TechnologiesInc.(IDT，Coralville，IA)，除了PNA引物购自PNABio Inc.(Thousand Oaks，CA)。
表5.用于PCR-LDR-qPCR检测TP53 R248Q突变的引物
PNA＝肽核酸；/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
稀释实验。在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行PCR步骤：1.58μl无核酸酶水(IDT)、2μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、0.8μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、0.2μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、0.25μl 2μM的iCDx-326-p53-248_PF_WT_blk2正向引物、0.25μl 2μM的iCDx-248-p53-248_PR反向引物、1.25μl 2μM的PNA-p53-248-10PNA阻断引物(或在最新实验中的PNA-p53-248-11L)、0.25μl 20mU/μl RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、0.2μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与PlatinumTaq抗体(InVitrogen/ThermoFisher Waltham，Ma)混合的0.22μl Klentaq1聚合酶(DNAPolymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.02μl Klentaq1聚合酶(50U/μl的原液)添加至0.2μl Platinum Taq抗体(5U/μl的原液)制备，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，11.7ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有35ng或10000个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与Roche hgDNA混合的HEC-1(A)wcDNA：1)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.047ng/μl wcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.14ng wcDNAHEC-1(A)和35ng Roche hgDNA，其对应于40个GE HEC-1(A)(仅20个GE是突变的)和10000个GE Roche人基因组DNA(即，1个mt/500个wt)；2)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.023ng/μlwcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.07ng wcDNA HEC-1(A)和35ng Roche hgDNA，其对应于20个GEHEC-1(A)(仅10个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA；(即，1个mt/1000个wt)；3)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.0117ng/μl wcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.0035ngwcDNA HEC-1(A)和35ng Roche hgDNA，其对应于10个GE HEC-1(A)(仅5个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，1个mt/2000个wt)；4)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.006ng/μl wcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.00175ng wcDNA HEC-1(A)和35ng RochehgDNA，其对应于5个GE HEC-1(A)(仅2或3个GE是突变的)和10000个GE R0che hgDNA(即，1个mt/5000个wt)。注意：在制备0.047ng/μl的wcDNA HEC-1(A)于11.7ng/μl Roche hgDNA的混合物(10000个GE Roche hgDNA中有40个GE突变体)之后，通过将0.5体积的前突变体-Roche hgDNA混合物加0.5体积的11.7ng/μl的Roche hgDNA连续稀释混合制备剩余的突变体加Roche hgDNA混合物，那么突变体GE被1/2稀释，而Roche hgDNA GE保持未稀释(10000个GE)。PCR反应在用来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，35个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行LDR步骤：5.82μl无核酸酶水(IDT)、1μl 10X AK16D连接反应缓冲液[1X缓冲液含有20mM Tris-HCl pH 8.5(Bio-Rad，Hercules，CA)、5mM MgCl2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、50mM KCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、10mM DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)和20ug/ml BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)]、0.25μl 40mM的DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 40mM的NAD+(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)、0.2μl 500nM的iCDx-305-P53-248(3)-L_Up_Rm上游引物、0.2μl 500nM的iCDx-202-P53-248-L_Dn_P下游引物、0.028μl 8.8μM的纯化的AK16D连接酶以及2μl PCR反应物。LDR反应在用来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：20个循环(在94℃下10s及在60℃下4min)，然后最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行qPCR步骤：1.5μl无核酸酶水(IDT)、来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的5μl 2X快速通用PCR预混合物(快速amplitaq、UDG和dUTP)、1μl2.5μM的iCDx-82_GTT-GCGC_A2正向引物、1μl 2.5μM的iCDx-244-C2反向引物、0.5μl 5μM的iCDx-228-p53-248_Probe_s Taqman探针以及1μl LDR反应物。qPCR反应在来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)ViiA7实时热循环仪中进行，使用了用AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma的MicroAmpTM光学粘合剂膜密封的快速-96-孔反应0.1ml板和以下设定：快速阻断，标准曲线作为实验类型，ROX作为被动参考，Ct作为定量方法(自动阈值，但需要时调整至0.04)，FAM作为报告蛋白并且NFQ-MGB作为淬灭剂；以及使用以下程序：在50℃下2min，以及40个循环(在95℃下1s及在60℃下20s)。在PCR步骤中使用PNA-p53-248-10阻断引物的实验结果在图162和表6中示出，并且在PCR步骤中使用PNA-p53-248-11L阻断引物的实验结果在图163和表7中示出。
表6.在PCR步骤中使用PNA-p53-248-10作为阻断引物来检测TP53 R248Q的稀释实验的结果。
Mt＝突变型TP53 R248Q。WT＝野生型TP53。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
表7.在PCR步骤中使用PNA-p53-248-11L作为阻断引物来检测TP53 R248Q的稀释实验的结果。
Mt＝突变型TP53 R248Q。WT＝野生型TP53。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
使用来自Roche的hgDNA进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：56.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-326-p53-248_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-248-p53-248_PR反向引物、16.25μl 2μM的PNA-p53-248-10PNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNAPolymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，2.925ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有8.75ng Roche hgDNA或2500个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与Roche hgDNA混合的HEC-1(A)wcDNA：1)在2.925ng/μl Roche hgDNA中的0.023ng/μl wcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.07ng wcDNAHEC-1(A)和8.75ng Roche hgDNA，其对应于20个GE HEC-1(A)(仅10个GE是突变的)和2500个GE Roche hgDNA；2)在2.925ng/μl Roche hgDNA中的0.0117ng/μl wcDNA HEC-1(A)，由此3μl中具有0.0035ng wcDNA HEC-1(A)和8.75ng Roche hgDNA，其对应于10个GE HEC-1(A)(仅5个GE是突变的)和2500个GE Roche hgDNA。注意：0.0117ng/μl wcDNA HEC-1(A)在2.925ng/μl Roche hgDNA中的混合物通过将0.5体积的0.023ng/μl wcDNA HEC-1(A)在2.925ng/μl Roche hgDNA中的混合物(20个GE突变体，10个GE突变的，在2500个GE RochehgDNA中)和0.5体积的2.925ng/μl Roche hgDNA连续稀释混合制备，那么突变体稀释至10个GE(5个GE突变的)，而Roche hgDNA GE保持未稀释(2500个GE)。
将每种130 μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，35个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图164和表8中示出。
使用人血浆DNA(血浆#10)进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：46.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-326-p53-248_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-248-p53-248_PR反向引物、16.25μl 2μM的PNA-p53-248-11L PNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNAPolymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及13μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-；血浆DNA(如7.6μl无核酸酶H2O加5.4μl 0.811ng/μl的血浆DNA所制备的，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE))-野生型-；以及如下与血浆DNA混合的HEC-1(A)wcDNA：1)5.6μl无核酸酶H2O，加5.4μl 0.811ng/μl的血浆DNA，加2μl 0.035ng/μl的wcDNA HEC-1(A)，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加对应于20个GE HEC-1(A)(仅10个GE是突变的)的0.07ng wcDNA HEC-1(A)；2)6.6μl无核酸酶H2O，加5.4μl 0.811ng/μl的血浆DNA，加1μl 0.035ng/μl的wcDNA HEC-1(A)，由此，在PCR反应中具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加对应于10个GEHEC-1(A)(仅5个GE是突变的)的0.035ng wcDNA HEC-1(A)。注意：通过将0.5体积的具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)和0.07ng wcDNA(20个GE突变体，10个突变的)的先前混合物与0.5体积的4.375ng血浆DNA混合物连续稀释混合来制备具有4.375ng血浆DNA或1250个基因组当量(GE)加0.035ng wcDNA(10个GE突变体，5个突变的)的混合物。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFishe r；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，35个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图165和表9中示出。
经验实施例3-检测KRAS密码子12第一位置突变：G12C(34G＞T)和G12S(34G＞A)
使用的所有引物在表10中列出。所有引物购自Integrated DNA TechnologiesInc.(IDT，Coralville，IA)，除了PNA引物购自PNABio Inc.(Thousand Oaks，CA)。
表10.用于PCR-LDR-qPCR检测KRAS G12C和G12S突变的引物
PNA＝肽核酸；/5SPC3/-5′C3间隔子；/3SPC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
稀释实验。在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行PCR步骤：1.58μl无核酸酶水(IDT)、2μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、0.8μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、0.2μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、0.25μl 2μM的iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2正向引物、0.25μl 2μM的iCDx-303-Kr-12_1和2_PR反向引物、1.25μl 2μM的PNA-Kras 12_2-11L(或PNA-Kras 12_2-11R)PNA阻断引物、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、0.2μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的0.22μl Klentaq1聚合酶(DNA PolymeraseTechnology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.02μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至0.2μl5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，11.7ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有35ng或10000个基因组当量(GE))-野生型-，以及如下与Roche hgDNA混合的SW1463(G12C，34G＞T，纯合型)或LS123(G12S，34G＞A，杂合型)wcDNA：1)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.047ng/μl SW1463或LS123 wcDNA，由此3μl中具有0.14ng SW1463或LS123 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于40个GESW1463或LS123 wcDNA(对于SW1463，40个GE是突变的并且对于LS123，20个GE是突变的)和10000个GE Roche人基因组DNA(即，对于SW1463，1个mt/250个wt并且对于LS123，1个mt/500个wt)；2)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.023ng/μl SW1463或LS123wcDNA，由此3μl中具有0.07ng SW1463或LS123 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于20个GE SW1463或LS123wcDNA(对于SW1463，20个GE是突变的并且对于LS123，10个GE是突变的)和10000个GE RochehgDNA(即，对于SW1463，1个mt/500个wt并且对于LS123，1个mt/1000个wt)；3)在11.7ng/μlRoche hgDNA中的0.0117ng/μl SW1463或LS123 wcDNA，由此3μl中具有0.0035ng SW1463或LS123 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于10个GE SW1463或LS123 wcDNA(对于SW1463，10个GE是突变的并且对于LS123，5个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，对于SW1463，1个mt/1000个wt并且对于LS123，1个mt/2000个wt)；4)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.006ng/μl SW1463或LS123 wcDNA，由此3μl中具有0.00175ng SW1463或LS123 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于5个GE SW1463或LS123 wcDNA(对于SW1463，5个GE是突变的并且对于LS123，2或3个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，对于SW1463，1个mt/2000个wt并且对于LS123，1个mt/5000个wt)。注意：在制备0.047ng/μl SW1463或LS123wcDNA于11.7ng/μl Roche hgDNA的混合物(10000个GE Roche hgDNA中有40个GE突变体)之后，通过将0.5体积的前突变体-Roche hgDNA混合物加0.5体积的11.7ng/μl的Roche hgDNA连续稀释混合制备剩余的突变体加Roche hgDNA混合物，那么突变体GE被1/2稀释，而RochehgDNA GE保持未稀释(10000个GE)。PCR反应在用来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的 透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(World wide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，50个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行LDR步骤：5.82μl无核酸酶水(IDT)、1μl 10X AK16D连接反应缓冲液[1X缓冲液含有20mM Tris-HCl pH 8.5(Bio-Rad，Hercules，CA)、5mM MgCl2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、50mM KCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、10mM DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)和20ug/ml BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)]、0.25μl 40mM的DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 40mM的NAD+(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)、0.2μl 500nM的iCDx-393-Kr-12_1(3)-L_Up_Rm上游引物、0.2μl 500nM的iCDx-222-Kr-12_1-L_Dn_P下游引物、0.028μl 8.8μM的纯化的AK16D连接酶以及2μl PCR反应物。LDR反应在用来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：20个循环(在94℃下10s及在60℃下4min)，然后最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行qPCR步骤：1.5μl无核酸酶水(IDT)、来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的5μl 2X快速通用PCR预混合物(快速amplitaq、UDG和dUTP)、1μl 2.5μM的iCDx-245_A3正向引物、1μl 2.5μM的iCDx-246-C3反向引物、0.5μl 5μM的iCDx-259-T-Kr-12_1_ProbeTaqman探针以及1μl LDR反应物。qPCR反应在来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的ViiA7实时热循环仪中进行，使用了用AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma的MicroAmpTM光学粘合剂膜密封的快速-96-孔反应0.1ml板和以下设定：快速阻断，标准曲线作为实验类型，ROX作为被动参考，Ct作为定量方法(自动阈值，但需要时调整至0.04)，HEX作为报告蛋白并且NFQ-MGB作为淬灭剂；以及使用以下程序：在50℃下2min，以及40个循环(在95℃下1s及在60℃下20s)。在PCR步骤中使用PNA-Kras 12_2-11L PNA阻断引物的实验结果在图166和表11中示出。在PCR步骤中使用PNA-Kras 12_2-11R PNA阻断引物的实验结果在图167和表12中示出。
表11.在PCR步骤中使用PNA-Kras 12_2-11L PNA阻断引物来检测KRAS G12C(34G＞T)突变的稀释实验的结果。
Mt＝突变型KRAS G12C。WT＝野生型KRAS。Hom＝纯合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
表12.在PCR步骤中使用PNA-Kras 12_2-11R PNA阻断引物来检测KRAS G12S(34G＞A)突变的稀释实验的结果。
Mt＝突变型KRAS G12S。WT＝野生型KRAS。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
使用人血浆DNA(血浆#9)进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：46.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-303-Kr-12_1和2_PR反向引物、16.25μl 2μM的PNA-Kras12_2-11L PNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNAPolymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及13μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-；血浆DNA(如8.3μl无核酸酶H2O加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA所制备的，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE))-野生型-；以及如下与血浆DNA混合的SW1463 wcDNA：1)6.3μl无核酸酶H2O，加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA，加2μl 0.0175ng/μl的wcDNA SW1463，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加对应于10个GE SW1463(所有10个GE是突变的)的0.035ng wcDNA SW1463；2)7.3μl无核酸酶H2O，加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA，加1μl 0.0175ng/μl的wcDNA SW1463，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加对应于5个GE SW1463(所有5个GE是突变的)的0.0175ng wcDNA SW1463。注意：通过将0.5体积的具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)和0.035ng wcDNA(10个GE突变体，10个突变的)的先前混合物与0.5体积的3.5ng血浆DNA混合物连续稀释混合来制备具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加0.0175ng wcDNA(5个GE突变体，5个突变的)的混合物。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，50个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图168和表13中示出。
经验实施例4-检测KRAS密码子12第二位置突变：G12D(35G＞A)、G12A(35G＞C)和G12V(35G＞T)
使用的所有引物在表14中列出。所有引物购自Integrated DNA TechnologiesInc.(IDT，Coralville，IA)，除了PNA引物购自PNABio Inc.(Thousand Oaks，CA)。
表14.用于PCR-LDR-qPCR检测KRAS G12D、G12A和G12V突变的引物
PNA＝肽核酸；/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
稀释实验。在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行PCR步骤：1.58μl无核酸酶水(IDT)、2μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、0.8μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、0.2μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、0.25μl 2μM的iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2正向引物、0.25μl 2μM的iCDx-303-Kr-12_1和2_PR反向引物、1.25μl 2μM的PNA-Kras 12_2-11L PNA阻断引物、0.25μl20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、0.2μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的0.22μl Klentaq1聚合酶(DNA Polymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.02μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至0.2μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-，11.7ng/μl的Roche hgDNA，(由此，在3μl中具有35ng或10000个基因组当量(GE))-野生型-，如下与RochehgDNA混合的HEC-1(A)(G12D，35G＞A，杂合型)或SW1116(G12A，35G＞C，杂合型)或SW480(G12V，35G＞T，纯合型)wcDNA：1)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.047ng/μl HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA，由此3μl中具有0.14ng HEC-1(A)、SW1116或SW480和35ng RochehgDNA，其对应于40个GE HEC-1(A)、SW1116或SW480(对于HEC-1(A)或SW1116，20个GE是突变的并且对于SW480，40个GE是突变的)和10000个GE Roche人基因组DNA(即，对于HEC-1(A)或SW1116，1个mt/500个wt并且对于SW480，1个mt/250个wt)；2)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.023ng/μl HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA，由此3μl中具有0.07ng HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于20个GE HEC-1(A)、SW1116或SW480(对于HEC-1(A)或SW1116，10个GE是突变的并且对于SW480，20个GE是突变的)和10000个GE RochehgDNA(即，对于HEC-1(A)或SW1116，1个mt/1000个wt并且对于SW480，1个mt/500个wt)；3)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.0117ng/μl HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA，由此3μl中具有HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于10个GE HEC-1(A)、SW1116或SW480(对于HEC-1(A)或SW1116，5个GE是突变的并且对于SW480，10个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，对于HEC-1(A)或SW1116，1个mt/2000个wt并且对于SW480，1个mt/1000个)；4)在11.7ng/μl Roche hgDNA中的0.006ng/μl HEC-1(A)、SW1116或SW480wcDNA，由此3μl中具有0.00175ng HEC-1(A)、SW1116或SW480wcDNA和35ng Roche hgDNA，其对应于5个GE HEC-1(A)、SW1116或SW480(对于HEC-1(A)或SW1116，2或3个GE是突变的并且对于SW480，5个GE是突变的)和10000个GE Roche hgDNA(即，对于HEC-1(A)或SW1116，1个mt/5000个wt并且对于SW480，1个mt/2000个wt)。注意：在制备0.047ng/μl HEC-1(A)、SW1116或SW480 wcDNA于11.7ng/pl Roche hgDNA的混合物(10000个GE Roche hgDNA中有40个GE突变体)之后，通过将0.5体积的前突变体-Roche hgDNA混合物加0.5体积的11.7ng/μl Roche hgDNA连续稀释混合制备剩余的突变体加Roche hgDNA混合物，那么突变体GE被1/2稀释，而Roche hgDNA GE保持未稀释(10000个GE)。PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，50个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行LDR步骤：5.82μl无核酸酶水(IDT)、1μl 10X AK16D连接反应缓冲液[1X缓冲液含有20mM Tris-HCl pH 8.5(Bio-Rad，Hercules，CA)、5mM MgCl2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、50mM KCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、10mM DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)和20ug/ml BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)]、0.25μl 40mM的DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 40mM的NAD+(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)、0.2μl 500nM的iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm或iCDx-394-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm上游引物、0.2μl 500nM的iCDx-269-Kr-12_2-L_Dn_P下游引物、0.028μl 8.8μM的纯化的AK16D连接酶以及2μl PCR反应物。LDR反应在用来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：20个循环(在94℃下10s及在60℃下4min)，然后最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行qPCR步骤：1.5μl无核酸酶水(IDT)、来自Applied Biosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的5μl 2X快速通用PCR预混合物(快速amplitaq、UDG和dUTP)、1 μl 2.5μM的iCDx-245_A3正向引物、1μl 2.5μM的iCDx-246-C3反向引物、0.5μl 5μM的iCDx-270-Kr-12_2(3)_ProbeTaqman探针以及1μl LDR反应物。qPCR反应在来自Applied Biosystems(AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的ViiA7实时热循环仪中进行，使用了用AppliedBiosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma的MicroAmpTM光学粘合剂膜密封的快速-96-孔反应0.1ml板和以下设定：快速阻断，标准曲线作为实验类型，ROX作为被动参考，Ct作为定量方法(自动阈值，但需要时调整至0.04)，HEX作为报告蛋白并且NFQ-MGB作为淬灭剂；以及使用以下程序：在50℃下2min，以及40个循环(在95℃下1s及在60℃下20s)。使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L up Rm UP LDR引物检测KRAS G12D(35G＞A)突变的实验结果在图169和表15中示出。使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L up Rm UP LDR引物检测KRAS G12A(G＞C)突变的实验结果在图170和表16中示出。使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L up Rm UP LDR引物检测KR AS G12V(35G＞T)突变的实验结果在图171和表17中示出。
表15.使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm UP LDR引物检测KRAS G12D(35G＞A)突变的稀释实验的结果。
Mt＝突变型KRAS G12D。WT＝野生型KRAS。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
表16.使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm UP LDR引物检测KRAS G12A(35G＞C)突变的稀释实验的结果。
Mt＝突变型KRAS G12A。WT＝野生型KRAS。Het＝杂合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
表17.使用iCDx-307-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm UP LDR引物检测KRAS G12V(35G＞T)突变的稀释实验的结果。
Mt＝突变型KRAS G12V。WT＝野生型KRAS。Hom＝纯合体。UD＝未定的。粗体的Ct值对应于由“真实曲线”获得的Ct，并且正常字体的数值对应于由“平直曲线”即后期扩增循环中出现的非基线曲线获得的值(通常在36的Ct值之后)。
使用人血浆DNA(血浆#9)进行的像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中进行PCR步骤：46.54μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-327-Kr_12_2_PF_WT_blk2正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-303-Kr-12_1和2_PR反向引物、16.25μl 2μM的PNA-Kras12_2-11L PNA阻断引物、3.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNAPolymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及13μl对应的模板。模板为：无核酸酶水，用于NTC-无模板对照-；血浆DNA(如8.3μl无核酸酶H2O加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA所制备的，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE))-野生型-；以及如下与血浆DNA混合的SW480wcDNA：1)6.3μl无核酸酶H2O，加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA，加2μl0.0175ng/μl的SW480 wcDNA，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加对应于10个GE SW480 wcDNA(所有10个GE是突变的)的0.035ng SW480 wcDNA；2)7.3μl无核酸酶H2O，加4.7μl 0.743ng/μl的血浆DNA，加1μl 0.0175ng/μl的SW480 wcDNA，由此，在PCR反应中具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加对应于5个GE SW480(所有5个GE是突变的)的0.0175ng SW480 wcDNA。注意：通过将0.5体积的具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)和0.035ng SW480 wcDNA(10个GE突变体，10个突变的)的先前混合物与0.5体积的3.5ng血浆DNA混合物连续稀释混合来制备具有3.5ng血浆DNA或1000个基因组当量(GE)加0.0175ng SW480 wcDNA(5个GE突变体，5个突变的)的混合物。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl，然后PCR反应在用来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的透明粘合剂膜密封的BioExcell透明96孔PCR 0.2ml板(Worldwide Medical Products，Inc.，Bristol，PA)中运行，使用了Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)和以下程序：在37℃下30min，在95℃下2min，50个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上在稀释实验部分中所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤，使用iCDx-394-Kr-12_2(3)-L_Up_Rm作为LDR步骤的上游引物。结果在图172和表18中示出。
经验实施例5-检测细胞系基因组DNA的甲基化
一般方法。使用的细胞系是：LS-174T、HCT-15、HT-29、WiDi、SW1116、结肠腺癌细胞系。将所有细胞系接种在60cm2培养皿中的含有4.5g/l葡萄糖、补充有10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中，并且保持在含有5％CO2的湿润气氛中。一旦细胞达到80-90％汇合，就将它们在磷酸盐缓冲盐水中洗涤(x 3)并且通过离心(500xg)收集。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)分离DNA。用Quant-iT Picogreen测定(LifeTechnologies/ThermoFisher；Waltham，Ma)确定DNA浓度。
从Roche(Indianapolis，IN)购买含有分离自人血(血沉棕黄层)的高分子量(＞50kb)基因组DNA(Roche人基因组DNA)的人基因组DNA(0.2mg/ml)。它的浓度通过Quant-iTPicoGreen dsDNA测定试剂盒确定为39ng/μl。
用酶Bsh1236I对基因组DNA的限制酶切消化。用在20μl反应混合物中的10单位限制性酶Bsh1236I消化来自以上列出的细胞系的基因组DNA(500ng)，所述反应混合物含有1xCutSmart缓冲液(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸、10mM醋酸镁、100μg/ml BSA、pH7.9、在25℃下)。在37℃下将消化反应进行1小时，并且随后通过加热至80℃，持续20min进行酶失活。
亚硫酸氢盐转化消化的基因组DNA。使用来自Zymo Research Corporation(Irvine，CA)的EZ DNA甲基化-Lightning试剂盒进行亚硫酸氢盐转化。将130μl Lightning转化试剂添加至20μl Bsh1236I消化的基因组DNA。将转化反应在98℃下孵育8分钟，接着在54℃下孵育1小时，然后冷却至4℃。将600μl M-结合缓冲液添加至Zymo-SpinTM柱，接着将柱放置到收集管中。将含有消化的DNA和lightning转化试剂的150μl反应混合物加载到含有600μl M-结合缓冲液的Zymo-Spin IC柱中。将柱的盖密封并且通过将柱倒置数次来混合溶液。将柱全速(≥10,000xg)离心30秒，弃掉流出液。将100μl M-洗涤缓冲液添加至柱，并且将柱全速离心30秒，并且弃掉流出液。将200μl L-脱磺化缓冲液添加到柱中，并且使柱在室温下静置15-20分钟。孵育之后，将柱全速离心30秒。将200μl M-洗涤缓冲液添加至柱，并且将柱全速离心30秒，弃掉流出液。将这个洗涤步骤重复一次以上。最终，将柱放置到1.5ml微离心管中，并且将10μl M-洗脱缓冲液添加至柱基质，并全速离心30秒以洗脱亚硫酸氢盐转化的DNA。
PCR和LDR引物。使用的所有引物在表19中列出。所有引物购自Integrated DNATechnologies Inc.(IDT，Coralville，IA)，除了LNA1和LNA2购自Exiqon Inc.(Woburn，MA)，以及PNA购自PNA Bio(Thousand Oaks，CA)。
表19.用于PCR-LDR-qPCR甲基化的引物。
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
PCR-LDR-qPCR实验。在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行PCR步骤：2μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、0.8μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、0.2μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、0.25μl 2μM的iCDx-2031-Vim-S3-FP正向引物、0.25μl 2μM的iCDx-2032A-Vim-S3-RP反向引物、1.25μl 2μM的VIM-S3-LNA或VIM-S3-PNA2阻断引物、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen/ThermoFisher，Waltham，Ma)混合的0.22μl Klentaq1聚合酶(DNA Polymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.02μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至0.2μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及4.78μl对应的含有35ng基因组DNA的模板。模板为：LS-174T、HCT-15、HT-29、WiDr、SW1116细胞系基因组DNA和Roche人基因组DNA。PCR反应在ProFlexPCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher，Waltham，Ma)中运行并且以下述程序进行运行：在95℃下2min，40个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应物中进行LDR步骤：5.82μl无核酸酶水(IDT)、1μl 10X AK16D连接反应缓冲液[1X缓冲液含有20mM Tris-HCl pH 8.5(Bio-Rad，Hercules，CA)、5mM MgCl2(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、50mM KCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、10mM DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)和20ug/ml BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)]、0.25μl 40mM的DTT(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 40mM的NAD+(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo)、0.25μl 20mU/μl的RNA酶H2(IDT)、0.2μl 500nM的iCDx-2033A-Vim-S3-Up引物、0.2μl 500nM的iCDx-2034A-Vim-S3-Dn引物、0.028μl 8.8μM的纯化的AK16D连接酶以及2μl PCR反应物。LDR反应在ProFlex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher，Waltham，Ma)中运行并且以下述程序进行运行：20个循环(在94℃下10s及在60℃下4min)，然后最终保持在4℃下。
在通过添加以下项制备的10μl反应混合物中进行qPCR步骤：1.5μl无核酸酶水(IDT)、来自Applied Biosystems(Applied Biosyste ms/ThermoFisher；Waltham，Ma)的5μl 2X快速通用PCR预混合物(快速amplitaq、UDG和dUTP)、1μl 2.5μM的iCDx-2036-Vim-S3-RT-FP正向引物、1μl 2.5μM的iCDx-2037-Vim-S3-RT-RP反向引物、0.5μl 5μM的iCDx-2035A-Vim-S3-RT-Pb Taqman探针以及1μl LDR反应产物。qPCR反应在来自AppliedBiosystems(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)的ViiA7实时热循环仪中进行，使用了用Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma的MicroAmpTM光学粘合剂膜密封的快速-96-孔反应0.1ml板和以下设定：快速阻断，标准曲线作为实验类型，ROX作为被动参考，Ct作为定量方法(自动阈值，但需要时调整至0.05)，TAMRA作为报告蛋白并且NFQ-MGB作为淬灭剂；以及使用以下程序：在50℃下2min，以及40个循环(在95℃下1s及在60℃下20s)。结果在图173和表20中示出。
表20.检测细胞系基因组DNA中的甲基化的实验结果。
像素实验。在通过添加以下项制备的130μl混合物中设置PCR步骤：59.14μl无核酸酶水(IDT)、26μl不含镁的Gotaq Flexi缓冲液5X(Promega，Madison，WI)、10.4μl 25mM的MgCl2(Promega，Madison，WI)、2.6μl dNTP(具有dATP、dCTP、dGTP和dUTP，各10mM)(Promega，Madison，WI)、3.25μl 2μM的iCDx-2031-VIM-S3-FP正向引物、3.25μl 2μM的iCDx-2032-VIM-S3-PR反向引物、16.25μl 2μM的iCDx-VIM-S3-LNA2阻断引物、3.25μl20mU/μl的RNA酶H2(IDT)(在来自IDT的RNA酶H2稀释缓冲液中稀释)、2.6μl 1U/μl的南极热敏UDG(New England Biolabs(NEB)，Ipswich，MA)和与Platinum Taq抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合的2.86μl Klentaq1聚合酶(DNA Polymerase Technology，St.Louis，MO)(混合物通过将0.3μl 50U/μl的Klentaq1聚合酶添加至3μl 5U/μl的Platinum Taq抗体制备)，以及3μl对应的模板。3μl的模板含有：(1)与9ng(2500GE)Roche hgDNA混合的0.070ng(20GE)HT-29DNA。(2)与9ng(2500GE)Roche hgDNA混合的0.035ng(10GE)HT-29细胞系DNA。(3)9ng(2500GE)Roche DNA，(4)用于无模板对照(NTC)的无核酸酶水。
将每种130μl PCR混合物分到12个管中，各10μl然后在Proflex PCR系统热循环仪(Applied Biosystems/ThermoFisher；Waltham，Ma)中并且以下述程序进行运行PCR反应：在95℃下2min，40个循环(在94℃下10s，在60℃下30s及在72℃下30s)，在99.5℃下10min，并且最终保持在4℃下。如以上所述的那样进行后续LDR和qPCR步骤。结果在图174和表25中示出。
使用修改型式的LDR和Taqman探针(即B型)探针如上所述那样重复用于VIM-S3顶链和底链的甲基化检测的PCR-LDR-qPCR程序。甲基化检测结果的比较在图175-178的扩增曲线中示出。图175提供细胞系且野生型(Roche)DNA的实时PCR曲线，使用了VIM-S3顶链引物设计和“A”型Taqman探针(表21)。结果示出WiDr和HT-29细胞系DNA的Ct值分别为约10和11.5，指示了VIM启动子区中S3位点处的甲基化。细胞系SW1116、Roche DNA、用于初始PCR步骤、随后的LDR步骤和最终Taqman步骤的无模板对照(NTC)全部是基线(即平直的)。使用设计用于底链的“A”型探针重复相同实验(图176和表22)。如所预知的，结果示出WiDr和HT-29细胞系DNA的Ct值分别为约11和9，指示了VIM启动子区中S3位点处的甲基化。然而，SW1116、Roche DNA、用于初始PCR步骤的无模板对照(NTC)和用于随后的LDR步骤的NTC的结果全部给出约28.5至31的Ct值，虽然我们从以前实验中知道在VIM启动子区中的S3位点处没有甲基化。这种矛盾性通过将Taqman探针设计为与LCR产物的上游LDR探针部分重叠约9个碱基并且与LDR产物的下游LDR探针部分重叠探针中的剩余碱基来解决。此外，将5’侧上的两个非互补性碱基添加至Taqman探针，以确保任何意外的交叉聚合酶延伸将不能在后续轮中在对上游LDR探针延伸。图177提供细胞系且野生型(Roche)DNA的实时PCR曲线，使用了WIM-S3顶链引物设计和“B”型Taqman探针(表23)。结果示出WiDr和HT-29细胞系DNA的Ct值分别为约12和13.5，指示了VIM启动子区中S3位点处的甲基化。细胞系SW1116、Roche DNA、用于初始PCR步骤、随后的LDR步骤和最终Taqman步骤的无模板对照(NTC)全部是基线(即平直的)。使用设计用于底链的“B”型探针重复相同实验(图178和表24)。如所预知的，结果示出WiDr和HT-29细胞系DNA的Ct值分别为约11.5和9.5，指示了VIM启动子区中S3位点处的甲基化。现在，细胞系SW1116、Roche DNA、用于初始PCR步骤、后面的LDR步骤和最终Taqman步骤的非模板对照(NTC)的结果全部是基线的(即平直的)，这表明新的“B”型探针设计解决了来自NTC或在VIM位点3区中没有甲基化的样品的假信号的问题。
表21 使用“A”型Taqman探针的用于VIM_S3_顶链的甲基化引物
/5SPC3/-5′C3间隔子；/3SPC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
表22 使用“A”型Taqman探针的用于VIM_S3_底链的甲基化引物
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SPC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
表23 使用“B”型Taqman探针的用于VIM_S3_顶链的甲基化引物
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
表24 使用“B”型Taqman探针的用于VIM_S3_底链的甲基化引物
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
经验实施例6-甲基化和突变检测引物设计
甲基化测定设计通过首先进行波形蛋白(VIM)和TMEM90B基因的基因组DNA序列的计算机化分析以鉴定预期的高度甲基化CG位点来完成。在计算机分析并鉴定多个甲基化位点之后，选择每个基因内的三至四个位点用于测定开展。为了有助于测定开展，对相应基因的亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行计算机亚硫酸氢盐转化。对顶链和底链均完成此举以设计从预期的亚硫酸氢盐转化的序列离开的寡核苷酸。计算机转化通过以下方式进行：在顶链上，将未跟随紧邻的5’C碱基的G碱基转化为A碱基(对于非CG的所有G进行G-A转化)并且对于底链，将靠近紧邻的3’G碱基的C碱基转化为T碱基(对于非CG的所有C碱基进行C-T转化)。对于连接测定的设计标准起始于鉴定为甲基化C或相邻G(其中互补链的C是甲基化的)的区分碱基，因为鉴定序列中的一些附加特征将有助于我们的设计标准，包括避开在亚硫酸氢盐转化之后具有非常高的GC含量的序列。一旦选择了用于测定开展的甲基化位点，就测定顶链和底链中的相同位点。利用四步法来设计用于这个测定的寡核苷酸。第一步是设计上游和下游连接酶检测反应(LDR)寡核苷酸。第二，设计覆盖LDR位点的基因特异性正向寡核苷酸和反向寡核苷酸和在总长为100至140个碱基之间的基因特异性扩增子内的LDR寡核苷酸。第三，设计覆盖连接位点并且与连接的LDR产物特异性结合的荧光染料标记的探针(FAM和HEXTM)。并且最后的步骤是设计阻断亚硫酸氢盐转化的未甲基化启动子区的扩增的对应WT锁核酸(LNATM)探针。
亚硫酸氢盐转化之前和亚硫酸氢盐转化之后的顶VIM位点3(S3)基因组序列。(红色粗体核苷酸表示甲基化的S3位点)
LDR上游(Up)寡核苷酸探针设计为具有64-66℃的Tm，其中目标区分碱基C或G处的3’端在甲基化CG中。一旦选择了引物序列并且所述引物序列在所需的Tm范围内，就利用基于IDT(Coralville，Ia)RNaseH2TM裂解方法的阻断非特异性延伸的技术来将互补RNA碱基添加成紧邻区分碱基的3’侧，接着将两个匹配的DNA碱基添加在第二位置和第三位置处并且将两个错配的DNA碱基(优选G-T或A-C错配)添加在第四位置和第五位置(或第三位置和第五位置)处，接着添加3’C3间隔子。使用总共五个碱基的尾和间隔子来阻断脱离上游LDR探针的非特异性延伸。对于上游LDR寡核苷酸探针，还在区分碱基的5’侧的相邻处、第二或第三位置处利用另外的错配(优选G-T或A-C错配)。另外的修饰包括任选的5’C3间隔子以阻断连接产物的λ核酸外切酶消化。在选择和修饰上游寡核苷酸之后，将对应于用于后续实时PCR实验的正向寡核苷酸的标签序列添加至序列的5’侧。标签序列选自先前设计的qPCR寡核苷酸正向引物和反向引物对的列表。
上游LDR探针序列：
5’标签序列+上游LDR探针序列：
具有5’间隔子和第四和第五裂解位置错配的5’标签序列+上游LDR探针序列：
具有5’间隔子和第三和第五裂解位置错配的5’标签序列+上游LDR探针序列：
qPCR正向引物：5’-TAGACACGAGCGAGGTCAC 3’(SEQ ID NO：39)
粗体为VIM S3亚硫酸氢盐转化的基因组DNA上游LDR位置，小写字母“a”为第三位置错配的位点，并且加下划线的为RNA裂解位点。
下游(Dn)LDR寡核苷酸探针被设计成在紧邻区分碱基的3’侧的碱基处。寡核苷酸探针被设计成具有70-72℃的Tm。与上游探针类似，将选择的标签序列添加至序列的3’端。对设计进行的另外修饰包括将错配添加在最靠近5’侧的第四位置处并且使另外错配碱基包含至就在实时标签序列前的寡核苷酸的3’端。
下游LDR探针序列：/5Phos/TCCACCCGCACCTACAACCTAAACAACGC(SEQ ID NO：134)
下游LDR探针+3’互补标签引物序列：
下游寡核苷酸具有第四位置错配和将亚硫酸氢盐转化的基因组序列与qPCR序列隔开的另外碱基：
qPCR反向引物：5’-TGCACAGCCTGAATTTTGCAC-3’(SEQ ID NO：40)
粗体为VIM S3亚硫酸氢盐转化的基因组DNA下游(Dn)LDR位置，加下划线的为甲基化的CG位点
基因特异性正向(FP)和反向(RP)寡核苷酸引物被设计成紧邻LDR寡核苷酸探针的上游、与上游LDR寡核苷酸探针具有显著重叠，总扩增子长度在约100-140个碱基之间。正向和反向基因特异性寡核苷酸引物被设计成具有62-64℃的Tm。还将反向引物设计在下游并且与Dn LDR寡核苷酸探针没有重叠以掺入存在时用于进一步区分甲基化位点的另外CGCG限制性位点。优选地，在靶DNA中存在一个或多个Bsh1236I(CGCG)限制性位点，以允许在亚硫酸氢盐转化之前任选地裂解未甲基化DNA。任选地，反向引物具有添加至5’端的非特异性的10个碱基的尾以防止与其他反向引物形成引物二聚体。正向引物和反向引物还在引物的3’端利用了RNA裂解手段，但是与LDR寡核苷酸探针不同，引物仅在邻近阻断基团的3’端处具有一个错配。
正向引物：
反向引物：
反向引物+10个碱基的尾
在引物的RNA裂解部分中含有一个碱基错配(小写字母和粗体)的正向引物和反向引物
粗体为VIM S3亚硫酸氢盐转化的基因组DNA基因特异性正向(FP)和反向(RP)引物，放大的是甲基化的CG位点加下划线的是RNA裂解位点区
在由以上分析所鉴定的三至四个位点中，选择两个位点用于对顶链和底链的测定开展。为了区分两个位点，将链特异性实时探针设计成覆盖具有位点特异性5’FAM或5’HEXTM标记探针的连接产物。将实时探针设计成掺入有掺入到在上游LDR探针中的区分碱基的5’侧的第三位错配，并且另外探针被设计成覆盖5’错配和下游探针中在区分碱基的3’侧的任选第四位错配。探针的Tm被设计为68-70℃。起初，探针被设计成具有在连接位点的5’和3’侧的相等覆盖度，但是另外探针被设计成在连接位点的(5’)侧具有1/3的覆盖度偏差，接着在下游侧(3’)具有2/3覆盖度偏差，对于大多数探针最常见的情况是在连接位点的上游覆盖度偏差为7个碱基并且在连接位点的下游覆盖度偏差为15个碱基。为了避免在与G碱基偶联时的低FAM染料荧光的问题，所有探针被设计成在其首个5’碱基处避免G碱基，那么染料可根据需要互换而无需序列修饰。另外修饰包括紧邻荧光染料添加错配。探针由IDT合成并且利用自5’侧九个碱基的ZENTM(IDT)淬灭剂和在3’端处的IowaFQ(IDT)荧光淬灭剂。
具有匹配的第三位错配(粗体)的实时探针：
具有匹配的第三位错配(粗体)和两个另外碱基的实时探针：
实时探针的VIM S3亚硫酸氢盐转化的基因组DNA位点，第三位错配上游的小写字母“a”位点和第四位错配下游的加下划线的A位点
锁核酸(LNATM)阻断引物被设计用于减少亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶标的扩增，方式是与亚硫酸氢盐转化的未甲基化靶标具有完全匹配的LNA探针结合并且利用在5-10之间的锁(LNA)碱基以防止扩增。LNA阻断探针由Exiqon(Woburn，Ma)合成，具有72-75℃的Tm。
表26.甲基化检测寡核苷酸列表
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SPC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
对具有已知热点突变的多种不同的癌症癌基因和肿瘤抑制基因进行突变检测，所述已知热点突变包括KRAS(G12A、G12D、G12S、G12C和G12V)、BRAF(V600E，1799T＞A)和Tp53(R248Q，743G＞A)。与使用定量连接酶检测反应(LDR)的甲基化测定类似地进行测定，不同的是区分碱基位于目标突变处。
LDR上游(Up)寡核苷酸探针被设计成具有64-66℃的Tm，在突变(目标区分碱基)的5’上游并且终止在突变处。一旦选择了脱离这个碱基的引物并且所述引物在所需的Tm范围内，就利用基于IDT(Coralville，Ia)RNaseH2TM裂解方法的阻断非特异性延伸的技术来将互补RNA碱基添加成紧邻区分碱基的3’侧，接着将两个匹配的DNA碱基添加在第二位置和第三位置处并且将两个错配的DNA碱基(G-A、C-T)添加在第四位置和第五位置处，接着添加3’C3间隔子。使用总共五个碱基的尾和间隔子来阻断脱离上游LDR探针的非特异性延伸。对于上游LDR寡核苷酸探针，还在区分甲基的5’侧的相邻处、第二或优选地第三位置处利用另外的错配(优选G-T或A-C错配)。在选择和修饰上游寡核苷酸之后，将对应于用于后续实时PCR实验的正向引物的标签序列添加至上游LDR探针序列的5’侧。标签序列选自先前设计的qPCR寡核苷酸正向引物和反向引物对的列表。
iCDx-308-Br600_(3)-L_Up_Rm：
上游LDR寡核苷酸的实例(从5’开始：呈大写字母且粗体的标签，呈小写字母斜体的短接头序列，呈大写字母的上游LDR探针序列，其具有在突变之前的第3位置处的错配(粗体)和五个碱基的尾的最后位置处的错配(呈粗体和小写字母))
如上所述那样设计另外上游LDR探针，具有下述修饰：对于“A”型LDR探针，RNA碱基紧挨区分碱基的3’侧，接着是在第二、第三和第四位处的三个匹配DNA碱基和在第五位处的一个错配DNA碱基(G-A、C-T)，接着添加3’C3间隔子；对于“B”型LDR探针，RNA碱基紧挨区分碱基的3’侧，接着是在第二和第三位处的两个匹配DNA碱基和在第四位和第五位处的两个错配DNA碱基(G-A、C-T)，接着添加3’C3间隔子；对于“D”型LDR探针，RNA碱基紧挨区分碱基的3’侧，接着是在第二和第四位处的两个匹配DNA碱基和在第三位和第五位处的两个错配DNA碱基(G-A、C-T)，接着添加3’C3间隔子。此外，“A”、“B”和“D”型的上游LDR探针在自连接接点(即，用RNA酶H裂解后的3’端)的第三位置处具有错配的DNA碱基(G-A，C-T)，并且“D”型下游LDR探针在自连接接点(即，5’端)的第四位置处具有错配的DNA碱基(G-A、C-T)。
下游(Dn)LDR寡核苷酸探针被设计成在紧邻区分碱基的3’侧的碱基处。寡核苷酸被设计成具有68℃的Tm。将对应于用于后续实时PCR实验的反向引物的反向互补序列的标签序列添加至LDR特异性序列的3’侧。与上游LDR寡核苷酸探针类似，这些序列也选自最佳qPCR引物对的预定列表。
iCDx-276-Br600-L_Dn_P：
下游LDR寡核苷酸的实例(从5’开始：呈大写字母的上游LDR探针序列，呈小写字母斜体的短接头序列，并且接着是呈大写字母且粗体的用于实时PCR的标签)
用于PCR步骤的基因特异性正向(FP)和反向(RP)引物被分别设计成紧挨LDR寡核苷酸探针的上游或下游。在FP与上游LDR寡核苷酸探针之间存在显著重叠，并且在RP与下游LDR探针之间不存在重叠。正向和反向基因特异性寡核苷酸引物被设计成具有64-66℃的Tm，并且具有74-94个碱基的总扩增子长度。另外，反向引物具有添加至5’端的非特异性的10个碱基的尾以防止下游引物的引物二聚体形成。任选地，正向引物和反向引物还在引物的3’端利用了5个碱基的RNaseH2TM裂解方法，但是与LDR寡核苷酸探针不同，它们在3’端处具有零个或一个错配(当所述3’端是待区分的突变碱基时，所述引物与野生型序列匹配并且与突变型序列错配)。
iCDx-328-Braf_PF_WT_blk2(基因特异性FP，其利用5个碱基的RNaseH2TM裂解方法并且在3’端处具有错配)：CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTArGCTAt/3SpC3/(SEQ ID NO：1)
iCDx-284-Br600-PR(基因特异性RP，其具有呈粗体的10个碱基的尾、呈斜体的一个额外接头碱基和呈大写字母的基因特异性序列)：
基因特异性正向和反向PCR引物的实例
对于实时PCR步骤，在5’端处用FAM、HEXTM或TAMRA标记的链特异性实时探针被设计成横跨上游LDR引物与下游LDR引物之间的接点覆盖连接产物。不同的探针被设计成掺入有定位在被掺入到对应上游寡核苷酸中的区分碱基的5’侧的相邻位、第二位或第三位错配。探针被设计成具有68℃的Tm。为了避免在与G碱基偶联时的低FAM染料荧光的问题，所有探针被设计成不在其首个5’起始碱基处使用G碱基，那么染料可根据需要互换而无需序列修饰。另外修饰包括紧邻荧光探针添加错配。探针由IDT合成并且大多数利用自5’侧九个碱基的ZENTM淬灭剂和在3’端处的IowaFQ或IowaRQ(IDT)荧光淬灭剂。iCDx-277_A4：TAGCGATAGTACCGACAGTCAC(SEQ ID NO：6)
iCDx-279_C4：TCGACGATAGGTTTCCGCAC(SEQ ID NO：7)
iCDx-281-Br600_(3)_probe：5′-/56-TAMN/TA CGG AGA AAT CTC GAT GGA GTGGGT/3IAbRQSp/-3′(SEQ ID NO：8)
实时PCR实验中使用的寡核苷酸的实例
锁核酸(LNATM)阻断引物被设计用于减少野生型靶标的扩增以及上游和下游LDR探针在扩增的野生型靶标上的连接。为了达成这个目标，由Exiqon(Woburn，Ma)合成利用3-6个之间的锁碱基与野生型完全匹配的LNA探针，所述LNA探针具有为71-76℃的Tm。LNA还含有5’磷酸基因和三个引发(prime)C3间隔子以防止产生自探针在野生型DNA上的延伸的假阳性结果。
iCDx-315-BRAF_FLW：/5Phos/GCTA+C+AG+T+G+AAAT+CTCG/3SpC3/(SEQ ID NO：3)
用于阻断野生型信号的LNA寡核苷酸的实例(LNA碱基是前面有+符号的那些)
另选地，肽核酸(PNATM)阻断引物被设计用于减少野生型靶标的扩增以及上游和下游LDR探针在扩增的野生型靶标上的连接。为了做到这一点，与野生型完全匹配的PNA寡核苷酸被设计成在区分碱基的每侧包含4-8个碱基，并且具有70-76℃的Tm。PNA寡核苷酸由PNA Bio(Thousand Oaks，CA)合成。
PNA-p53-248-11L：
用于阻断野生型信号的PNA寡核苷酸的实例(区分碱基呈粗体并且所述PNA寡核苷酸与野生型靶标匹配)
表27.突变检测引物列表
/5SPC3/-5′C3间隔子；/3SpC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷
/5SpC3/-5′C3间隔子；/3SPC3/-3′C3间隔子；/5Phos/-5′磷酸；/56-FAM/-5′Fam荧光染料；/5HEX/-HEXTM荧光染料；/ZEN/-ZENTM荧光淬灭剂TM；/3IABkFQ/-3′Iowa荧光淬灭剂，绿色至粉红色的光谱范围；“+”-锁核酸碱基；“rA”-核糖核苷酸碱基腺嘌呤核糖核苷；“rT”-核糖核苷酸碱基胸腺嘧啶核糖核苷；“rG”-核糖核苷酸碱基鸟嘌呤核糖核苷；“rC”-核糖核苷酸碱基胞嘧啶核糖核苷。

Claims (68)

1.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有的一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
提供能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近所述靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由所述第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将所述样品、所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化所述样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’引物特异性部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组、能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
2.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
提供能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近所述靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由所述第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将所述样品、所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化所述样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括：
在所述共混形成聚合酶链式反应混合物之前或同时，使所述样品与至少第一甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中所述第一甲基化敏感性酶裂解所述样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子，并且由此所述检测包括检测含有所述靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子，其中所述核酸分子初始含有一个或多个甲基化残基。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一一级寡核苷酸引物包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列，并且所述第二一级寡核苷酸引物包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其还包括：
在所述共混形成聚合酶链式反应混合物之前使所述限制性酶反应混合物在适于将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基的条件下经历亚硫酸氢盐处理，其中所述提供的一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含与含有一个或多个甲基化未裂解限制性位点的所述亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述提供的一级寡核苷酸引物组的所述第二一级寡核苷酸引物包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的所述延伸产物的一部分互补的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括：
提供裂解在甲基化敏感性酶识别序列内含有未甲基化残基的核酸分子的一种或多种第二甲基化敏感性酶；以及
将所述至少一种第二甲基化敏感性酶与包含所述亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的所述聚合酶链式反应混合物共混，以形成第二限制性酶反应混合物，其中在所述杂交处理过程中，所述第二甲基化敏感性酶裂解所述样品中潜在存在的在至少一个甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述杂交处理过程中裂解一种或两种寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与亚硫酸氢盐处理的未甲基化靶序列中的与所述一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与亚硫酸氢盐处理的甲基化靶序列中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述DNA聚合酶缺乏5’核酸酶活性、3’核酸酶活性和链置换活性。
10.如权利要求4所述的方法，其还包括；
提供能够与所述亚硫酸氢盐处理的靶核苷酸序列的含有未甲基化残基的区杂交的一种或多种阻断寡核苷酸；以及
在所述经历之前，使包含所述亚硫酸氢盐处理的限制性酶反应混合物的所述聚合酶链式反应混合物与所述一种或多种阻断寡核苷酸接触，其中所述一种或多种阻断寡核苷酸在所述杂交处理过程中与互补亚硫酸氢盐处理的靶核酸序列杂交并且在所述延伸处理过程中阻止一级寡核苷酸引物延伸。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述杂交处理过程中裂解一种或两种寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述可裂解核苷酸包含一个或多个RNA碱基。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述第一一级寡核苷酸引物包含5’部分，所述5’部分具有与野生型核酸分子中的与所述一级寡核苷酸引物杂交的核苷酸序列部分相同，但是与所述靶核酸分子中的对应核苷酸序列部分具有一个或多个核苷酸序列错配的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个序列错配位于离所述第一一级寡核苷酸引物的5’端两个核苷酸碱基处，和/或离所述第一一级寡核苷酸引物的5’端三个核苷酸碱基处。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述DNA聚合酶缺乏5’核酸酶活性、3’核酸酶活性和链置换活性。
16.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子；所述方法包括：
提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与所述一个或多个靶核糖核酸分子互补；
将所述所接触的样品、所述一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物；
在所述反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与所述靶核糖核酸分子序列互补并且含有dU的核苷酸序列；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近所述cDNA的所述靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列，和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将含有所述cDNA分子的所述反转录混合物、所述一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物；
提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶核糖核酸分子序列的互补部分上；
使所述一级延伸产物与连接酶和所述一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一探针和所述第二探针连接在一起以在所述连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
17.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶核糖核酸分子的方法，所述一个或多个靶核糖核酸分子由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子；所述方法包括：
提供含有一个或多个靶核糖核酸分子的样品，所述一个或多个靶核糖核酸分子在序列上潜在不同于其他核糖核酸分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一种或多种寡核苷酸引物，每种引物与所述一个或多个靶核糖核酸分子互补；
将所述所接触的样品、所述一种或多种寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及反转录酶共混以形成反转录混合物；
在所述反转录混合物中产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子，每个cDNA分子包含与所述靶核糖核酸分子序列互补并且含有dU的核苷酸序列；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与cDNA核苷酸序列中邻近所述cDNA的所述靶核糖核酸分子序列互补序列的部分互补的核苷酸序列和(b)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；
将含有所述cDNA分子的所述反转录混合物、所述一个或多个寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和聚合酶共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成一种或多种不同的一级延伸产物；
提供一个或多个寡核苷酸探针组，每个探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶核糖核酸分子序列的互补部分上；
使所述一级延伸产物与连接酶和所述一个或多个寡核苷酸探针组接触以形成连接反应混合物；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一探针和所述第二探针连接在一起以在所述连接酶反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测对所述样品中的所述连接产物序列进行区分，以鉴定由于可变剪接、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、易位、突变或基因组水平上的其他重排而在序列上不同于所述样品中的其他核糖核酸分子的一个或多个核糖核酸分子的存在。
18.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与所述第二寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述所接触的样品、引物组的所述一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中所述第一寡核苷酸引物与所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且所述反转录酶使所述杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物；
将所述反转录反应混合物与所述引物组的所述第二寡核苷酸引物、所述第三寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述延伸的第一寡核苷酸引物的包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物；
将所述多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
19.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个靶miRNA分子的样品，所述一个或多个靶miRNA分子因一个或多个碱基而在序列上潜在不同于所述样品中的其他miRNA分子
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其具有5’茎-环部分、阻断基团、环区内的内引物特异性部分和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列部分，(b)第二寡核苷酸引物，其具有与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列部分，和5’引物特异性部分，(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述内引物特异性部分相同的核苷酸序列，以及(d)第四寡核苷酸引物，其包含与所述第二寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述所接触的样品、引物组的所述一个或多个第一寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中所述第一寡核苷酸引物与所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)杂交，并且所述反转录酶使所述杂交的第一寡核苷酸引物的3’端延伸以产生包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的延伸的第一寡核苷酸引物；
将所述反转录反应混合物与所述引物组的所述第二寡核苷酸引物、所述第三寡核苷酸引物和所述第四寡核苷酸引物在下述条件下共混以形成聚合酶反应混合物，所述条件有效地使引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述延伸的第一寡核苷酸引物的包含所述靶miRNA分子序列的所述互补序列的区杂交并且进行延伸以产生包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成多种一级延伸产物；
将所述多种一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
20.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触
将所述所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应；
将所述靶miRNA分子序列在其3’端处连接至所述第一寡核苷酸探针的所述5’磷酸，以产生包含附加至所述第一寡核苷酸探针的所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸探针的所述内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述嵌合核酸分子、所述一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述嵌合核酸分子的所述内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸，以产生所述嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列；
将所述反转录反应混合物与引物组的所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物。
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶序列特异性部分、与一级延伸产物互补的部分和3’引物特异性部分，其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；
将所述连接产物序列和所述一个或多个二级寡核苷酸引物组与能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分，从而鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子。
21.一种用于鉴定样品中的一个或多个靶微核糖核酸(miRNA)分子的方法，所述一个或多个靶微核糖核酸分子因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子，所述方法包括：
提供含有一个或多个miRNA分子的样品，所述一个或多个miRNA分子因一个或多个碱基差异而在序列上潜在不同于其他miRNA分子；
使所述样品与能够消化所述样品中潜在存在的含有dU的核酸分子的一种或多种酶接触
将所述所接触的样品与连接酶和包含5’磷酸、5’茎-环部分、环区内的内引物特异性部分、阻断基团和与所述靶miRNA分子序列的3’部分互补的3’核苷酸序列的第一寡核苷酸探针共混以形成连接反应；
将所述靶miRNA分子序列在其3’端处连接至所述第一寡核苷酸探针的所述5’磷酸，以产生包含附加至所述第一寡核苷酸探针的所述靶miRNA分子序列(如果样品中存在的话)的嵌合核酸分子；
提供一个或多个寡核苷酸引物组，每个引物组包括(a)第一寡核苷酸引物，其包含与所述靶miRNA分子序列的5’端的互补序列互补的3’核苷酸序列，和5’引物特异性部分，(b)第二寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸探针的所述内引物特异性部分互补的核苷酸序列，以及(c)第三寡核苷酸引物，其包含与所述第一寡核苷酸引物的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列；
将所述嵌合核酸分子、所述一种或多种第二寡核苷酸引物、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物和反转录酶共混以形成反转录反应混合物，其中引物组的所述一种或多种第二寡核苷酸引物与所述嵌合核酸分子的所述内引物特异性部分杂交，并且在其3’端处进行延伸，以产生所述嵌合核酸分子(如果样品中存在的话)的互补序列；
将所述反转录反应混合物与引物组的所述第一寡核苷酸引物和所述第三寡核苷酸引物共混以形成聚合酶反应混合物；
使所述聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述5’引物特异性部分、对应于所述靶miRNA分子序列的核苷酸序列和所述内引物特异性部分的所述互补序列的一级延伸产物；
将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’部分，其中所述探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述5’部分与所述第二寡核苷酸探针的所述3’部分的一部分互补，其中所述探针组中的一个探针包含产生可检测信号的部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的对应于所述靶miRNA分子序列的互补部分上；
使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’部分、所述靶特异性部分、所述3’部分和所述产生可检测信号的部分；
使所述连接产物序列的所述5’部分与其互补的3’部分杂交；
检测在所述杂交后产生的来自所述产生可检测信号的部分的信号；以及
基于所述检测区分所述样品中的连接产物序列以鉴定因一个或多个碱基而在序列上不同于所述样品中的其他miRNA分子的一个或多个靶miRNA分子的存在。
22.如权利要求1、16、18或20中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组的所述第二寡核苷酸探针还包含unitaq检测部分，从而形成包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分、所述unitaq检测部分和所述3’引物特异性部分的连接产物序列，所述方法还包括：
提供一种或多种unitaq检测探针，其中每个unitaq检测探针与互补的unitaq检测部分杂交并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种unitaq检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及
在所述使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于一个或多个聚合酶链式反应循环的条件的过程中，使所述一个或多个unitaq检测探针与所述连接产物序列或其互补序列上的互补unitaq检测部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述延伸处理的过程中从所述一种或多种unitaq检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
23.如权利要求1、16、18或20中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供一种或多种寡核苷酸检测探针，其中每个寡核苷酸检测探针与连接产物接点部分或其互补序列杂交，并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种寡核苷酸检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及
在所述使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于一个或多个聚合酶链式反应循环的条件的过程中，使所述一种或多种寡核苷酸检测探针与所述连接产物序列或其互补序列上的互补检测部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述延伸处理的过程中从所述一种或多种寡核苷酸检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
24.如权利要求2、17、19或21中任一项所述的方法，所述方法还包括：
在所述连接之前或之后将每种一级延伸产物的至少一个链固定在固体支持物上，其中所述连接产物序列与所述固定的一级延伸产物杂交；以及
在所述连接之后将未连接的寡核苷酸探针和非靶特异性连接产物从所述样品中去除；以及
在所述杂交之前，使所述连接产物序列从所述固定的一级延伸产物中变性。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针的所述3’部分包含可裂解的核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述3’端不适于聚合酶延伸或连接，所述方法还包括；
当所述探针与其所述一级延伸产物的互补靶核苷酸序列杂交时使所述第一寡核苷酸探针的所述可裂解的核苷酸或核苷酸类似物裂解，从而在所述连接之前释放所述第一寡核苷酸探针上的3’OH。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸探针在其5’端具有与所述第一寡核苷酸探针的3’端重叠的相同核苷酸，并且在探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针在相邻位置处杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上形成接点时，所述第二寡核苷酸探针的所述重叠相同核苷酸在与所述第一寡核苷酸探针的所述接点处形成侧翼，所述方法还包括：
用具有5’核酸酶活性的酶裂解所述第二寡核苷酸探针的所述重叠相同核苷酸，从而在所述连接之前释放所述第二寡核苷酸探针的5’端处的磷酸。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸探针组还包括具有靶特异性部分的第三寡核苷酸探针，其中所述探针组的所述第二寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针被构造成彼此相邻地杂交于所述靶核苷酸序列，在所述第二寡核苷酸探针与所述第三寡核苷酸探针之间具有接点，从而允许所述第二寡核苷酸探针与所述第三寡核苷酸探针之间连接形成包含探针组的所述第一寡核苷酸探针、所述第二寡核苷酸探针和所述第三寡核苷酸探针的连接产物序列。
28.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：
提供含有一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在包含因一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；
使所述样品与能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶接触；
使所述样品与一种或多种甲基化敏感性酶接触以形成限制性酶反应混合物，其中所述一种或多种所述甲基化敏感性酶裂解所述样品中的在至少一种甲基化敏感性酶识别序列内含有一个或多个未甲基化残基的核酸分子；
提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的上游的区互补的核苷酸序列和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与所述靶核苷酸序列中位于所述一个或多个甲基化残基的下游的区相同的核苷酸序列；
将所述限制性酶反应混合物与所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成一级聚合酶链式反应混合物；
使所述一级聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；
提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括能够与所述一级延伸产物杂交的第一嵌套式寡核苷酸引物和第二嵌套式寡核苷酸引物；
将所述一级延伸产物、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成二级聚合酶链式反应混合物；
使所述第二聚合酶链式反应混合物经历包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及
对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有因一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列的靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括：
提供一种或多种寡核苷酸检测探针，其中每个寡核苷酸检测探针与所述一级延伸产物中的靶核苷酸序列或其互补序列杂交，并且所述检测探针包含彼此分开的淬灭剂分子和可检测标记；
将所述一种或多种寡核苷酸检测探针添加至所述第二聚合酶链式反应混合物；以及
在所述经历中，使所述一种或多种寡核苷酸检测探针与所述一级延伸产物的互补部分杂交，由此所述淬灭剂分子和所述可检测标记在所述二级聚合酶链式反应混合物的所述一个或多个聚合酶链式反应循环的所述延伸处理过程中从所述一种或多种寡核苷酸检测探针裂解，由此所述检测包括对所述裂解的可检测标记的检测。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的一种或两种一级寡核苷酸引物具有3’部分，所述3’部分包含可裂解核苷酸或核苷酸类似物和阻断基团，使得所述一种或多种引物的3’端不适于聚合酶延伸，所述方法还包括：
在所述一级聚合酶链式反应混合物的所述一个或多个聚合酶链式反应循环的所述杂交处理过程中裂解一种或两种一级寡核苷酸引物的所述可裂解核苷酸或核苷酸类似物，从而在所述延伸处理之前释放一种或两种一级寡核苷酸引物上的游离3’OH端。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述一级寡核苷酸引物组的所述一级寡核苷酸引物包含相同的或基本相同的5’核苷酸序列部分，所述5’核苷酸序列部分的长度介于约6至20个碱基之间。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下项组成的组：组织、细胞、血清、血液、血浆、羊水、痰、尿液、体液、身体分泌物、身体排泄物、无细胞循环核酸、无细胞循环肿瘤核酸、妊娠女性的无细胞循环胎儿核酸、循环肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤活检和外来体。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶核苷酸序列是包含以下项的低丰度核酸分子：一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基。
34.如权利要求33所述的方法，其中具有一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的所述低丰度核酸分子被鉴定并与所述样品中的具有与所述低丰度核酸分子类似的核苷酸序列，但没有所述一个或多个核苷酸碱基突变、插入、缺失、易位、剪接变体、miRNA变体、可变转录物、可变起始位点、可变编码序列、可变非编码序列、可变剪接、外显子插入、外显子缺失、内含子插入、或基因组水平上的其他重排和/或甲基化核苷酸碱基的高丰度核酸分子区分开。
35.如权利要求34所述的方法，其中相对于所述样品中的所述高丰度核酸分子的拷贝数来定量一种或多种低丰度靶核苷酸序列的拷贝数。
36.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种靶核苷酸序列进行定量或计数。
37.如权利要求36所述的方法，其中相对于所述样品或经历相同后续步骤的其他样品中的其他核苷酸序列来定量或计数所述一种或多种靶核苷酸序列。
38.如权利要求37所述的方法，其中对一种或多种靶核苷酸序列的所述相对拷贝数进行定量或计数。
39.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其还包括：
基于所述鉴定诊断或预后疾病状态。
40.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其还包括：
基于所述鉴定区分基因型或疾病易感性。
41.一种与微量滴定板组合使用以向所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔同时添加液体的装置，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中所述顶部表面具有通向所述孔的开口并且所述底部表面限定了所述孔的闭合端，所述装置包括：
第一层，所述第一层由第一边界和第二边界限定，其中计量室在所述第一层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸并且彼此流体连通，所述第一层被构造成在操作位置中装配成接近所述微量滴定板，其中所述第一层的所述第一边界最靠近所述微量滴定板的所述顶部表面并且每个所述计量室与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通，所述第一层还包括与一个或多个所述计量室流体连通的填充室，以及
第二层，所述第二层由第一边界和第二边界限定，其中填充口在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第二层被构造成在操作位置中装配成接近所述第一层，其中所述第二层的所述第一边界最靠近所述第一层的所述第二边界并且所述填充口与所述填充室对准，其中，当所述第一层、所述第二层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室并且进入所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
42.如权利要求41所述的装置，其中所述第二层包括在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸的空气通路，其中所述空气通路与所述计量室对准。
43.如权利要求41所述的装置，其还包括：
中间层，所述中间层由第一边界和第二边界限定，其中中间层通路在所述中间层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述中间层被构造成在操作位置中装配在所述微量滴定板与所述第一层之间，其中所述中间层的所述第一边界与所述微量滴定板的所述顶部表面相邻并且所述中间层的所述第二边界与所述第一层的所述第一边界相邻，并且一个所述中间层通路与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
44.如权利要求43所述的装置，其中所述中间层通路包括疏水性壁。
45.如权利要求43所述的装置，其中所述中间层通路是爆破阀。
46.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层还包括与所述填充室流体连通的溢流室。
47.如权利要求46所述的装置，其中所述中间层还包括使所述溢流室与所述填充室连接的溢流通路。
48.如权利要求46所述的装置，其中所述第二层具有在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸的溢流空气通路，其中所述溢流空气通路与所述溢流室对准。
49.如权利要求43所述的装置，其还包括：
第三层，所述第三层具有第一边界和第二边界，其中填充口连接器在所述第三层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第三层被构造成在操作位置中装配在所述第一层与所述第二层之间，其中所述第三层的所述第一边界与所述第一层的所述第二边界相邻并且所述填充口连接器与所述填充口对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述第三层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充口连接器、所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
50.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成允许通过毛细管作用填充所述计量室。
51.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成允许通过机械力填充所述计量室。
52.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层在所述计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和半个所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对填充室中的另一个所述填充室和另一半所述计量室提供液体。
53.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层在所述计量室的相对末端上设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对填充室中的一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对填充室中的另一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体。
54.如权利要求41所述的装置，其中所述装置被构造成用液体填充所述微量滴定板的两个或更多个行和列。
55.如权利要求41所述的装置，其中所述第一层具有第一区域和第二区域，所述第一区域具有在两个或更多个行中的所述计量室，所述第二区域具有在两个或更多个列中的所述计量室，其中所述第一区域和所述第二区域彼此移位。
56.如权利要求41-55中任一项所述的装置，其中所述层是集成的，从而赋予所述装置单片结构。
57.一种向微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔添加液体的方法，所述微量滴定板具有相对的顶部表面和底部表面，其中所述顶部表面具有通向所述孔的开口并且所述底部表面限定了所述孔的闭合端，所述方法包括：
提供装置，其包括：
第一层，所述第一层具有第一边界和第二边界，其中计量室在所述第一层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸并且彼此流体连通，所述第一层被构造成在操作位置中装配成接近所述微量滴定板，其中所述第一层的所述第一边界最靠近所述微量滴定板的所述顶部表面并且一个所述计量室与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔流体连通，所述第一层还包括与一个或多个所述计量室流体连通的填充室，以及
第二层，所述第二层具有第一边界和第二边界，其中填充口在所述第二层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第二层被构造成在操作位置中装配成接近所述第一层，其中所述第二层的所述第一边界最靠近所述第一层的所述第二边界并且所述填充口与所述填充室对准，其中，当所述第一层、所述第二层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室并且进入所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中；
用液体填充所述装置；以及
将所述装置中的液体排放到所述微量滴定板的行和/或列中的两个或更多个孔中。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述装置还包括：
中间层，所述中间层具有第一边界和第二边界，其中中间层通路在所述中间层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述中间层被构造成在操作位置中装配在所述微量滴定板与所述第一层之间，其中所述中间层的所述第一边界与所述微量滴定板的所述顶部表面相邻并且所述中间层的所述第二边界与所述第一层的所述第一边界相邻，并且一个所述中间层通路与所述微量滴定板的行和/或列中的单个孔对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述中间层通路包括疏水性壁。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述中间层通路是爆破阀。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述装置还包括：
第三层，所述第三层具有第一边界和第二边界，其中填充口连接器在所述第三层的所述第一边界与所述第二边界之间延伸，所述第三层被构造成在操作位置中装配在所述第一层与所述第二层之间，其中所述第三层的所述第一边界与所述第二层的所述第二边界相邻并且所述填充口连接器与所述填充口对准，其中，当所述第一层、所述第二层、所述第三层、所述中间层和所述微量滴定板相对于彼此被定位在其操作位置时，通过所述填充口进入所述装置的液体将穿过所述填充口连接器、所述填充室、所述计量室、所述中间层通路，并且进入所述微量滴定板的所述孔中。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述填充通过毛细管作用进行。
63.如权利要求57所述的方法，其中所述排放通过机械力进行。
64.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层在所述计量室的相对侧设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此，在所述填充过程中，所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和半个所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的另一个所述填充室和另一半所述计量室提供液体。
65.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层在所述计量室的相对侧设置有一对间隔开的填充室并且所述第二层设置有一对间隔开的填充口，每个所述填充口与所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室流体连通，由此，在所述填充过程中，所述一对间隔开的填充口中的一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体，而所述一对间隔开的填充口中的另一个所述填充口向所述一对间隔开的填充室中的另一个所述填充室和全部的所述计量室提供液体。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述装置被构造成在所述填充过程中用液体填充所述微量滴定板的两个或更多个行和列。
67.如权利要求57所述的方法，其中所述第一层具有第一区域和第二区域，所述第一区域具有在两个或更多个行中的所述计量室，所述第二区域具有在两个或更多个列中的所述计量室，其中所述第一区域和所述第二区域彼此移位。
68.如权利要求57-67中任一项所述的方法，其中所述层是集成的，从而赋予所述装置单片结构。
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AU (2) AU2015330844B2 (zh)
BR (1) BR112017007033B1 (zh)
CA (2) CA2963687C (zh)
DK (2) DK3690060T3 (zh)
ES (2) ES2784342T3 (zh)
IL (3) IL296204B1 (zh)
PT (2) PT3690060T (zh)
SG (2) SG11201702831XA (zh)
WO (1) WO2016057832A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108179176A (zh) * 2018-02-08 2018-06-19 斯格特生物 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法
CN108998535A (zh) * 2018-09-11 2018-12-14 广州市宝创生物技术有限公司 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒
CN112513265A (zh) * 2018-05-22 2021-03-16 博诚研究中心 用于人类癌症检测的修饰核酸的靶向富集和测序
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US8825412B2 (en) 2010-05-18 2014-09-02 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
RU2717641C2 (ru) 2014-04-21 2020-03-24 Натера, Инк. Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
DK3607086T3 (da) * 2017-04-03 2021-10-04 Qiagen Gmbh Fremgangsmåde til analyse af ekspressionen af et eller flere rna-biomarkørmolekyler
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
CN109385464A (zh) * 2018-07-27 2019-02-26 中山大学附属第六医院 一种dna甲基化检测试剂盒及方法
US20220205050A1 (en) * 2019-05-03 2022-06-30 Cornell University Method and markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence, mutation, copy number, or methylation changes
SG11202112246UA (en) * 2019-05-03 2021-12-30 Univ Cornell Markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence mutation, expression, splice variant, translocation, copy number, or methylation changes
CA3176759A1 (en) * 2020-05-01 2021-11-04 Francis Barany Method and markers for identifying and relative quantifying of nucleic acid sequence, mutation, copy number, or methylation changes using combinations of nuclease, ligation, deamination, dna repair, and polymerase reactions with carryover preventio
WO2022149575A1 (ja) * 2021-01-06 2022-07-14 東洋鋼鈑株式会社 Ｍｌｈ１メチル化修飾及びｂｒａｆ変異を検出するためのキット
CN117222750A (zh) * 2021-02-17 2023-12-12 行动基因(智财)有限公司 Dna片段接合检测方法及套组
WO2022182682A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2023183812A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Billion Toone, Inc. Molecule counting of methylated cell-free dna for treatment monitoring

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045559A1 (en) * 1996-05-29 1997-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
WO2004027082A2 (en) * 2002-09-19 2004-04-01 Applera Corporation Methods and compositions for detecting targets
CN1632132A (zh) * 2003-12-22 2005-06-29 华东理工大学 一种探针及其在关联检测基因多态性位点中的应用
WO2005092038A2 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 The Johns Hopkins University Methods for the detection of nucleic acid differences
WO2008135512A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Jerzy Paszkowski Dna amplification method
US20080299609A1 (en) * 2007-03-12 2008-12-04 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Uracil-DNA glycosylase of psychrobacter sp. HJ147 and use thereof
CN101329250A (zh) * 2007-06-20 2008-12-24 上海翼和应用生物技术有限公司 一种荧光标记探针的pcr-ldr基因多态性检测测序方法
CN101613730A (zh) * 2008-06-26 2009-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于预防核酸扩增技术中遗留污染的改良方法
US20110287436A1 (en) * 2006-08-01 2011-11-24 Applied Biosystems, Llc Detection Of Analytes And Nucleic Acids

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5035996A (en) 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
EP1507000B1 (en) 1990-05-03 2010-03-03 Cornell Research Foundation, Inc. A thermostable ligase mediated DNA amplification system for the detection of genetic diseases
CA2073298C (en) 1991-07-12 2007-04-17 James L. Hartley Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
GB9609441D0 (en) 1996-05-04 1996-07-10 Zeneca Ltd Process
US6312892B1 (en) 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
US20030119004A1 (en) * 2001-12-05 2003-06-26 Wenz H. Michael Methods for quantitating nucleic acids using coupled ligation and amplification
US20040219565A1 (en) * 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
EP1730312B1 (en) 2004-03-24 2008-07-02 Applera Corporation Encoding and decoding reactions for determining target polynucleotides
US20100248228A1 (en) * 2008-03-27 2010-09-30 The Curators Of The University Of Missouri Method for detecting DNA methylation in cancer cells
EP2534263B1 (en) 2010-02-09 2020-08-05 Unitaq Bio Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
CA2863257C (en) 2012-02-14 2021-12-14 Cornell University Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
US10011862B2 (en) * 2013-03-14 2018-07-03 Cornell University Method for relative quantification of changes in DNA methylation, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997045559A1 (en) * 1996-05-29 1997-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US20100006437A1 (en) * 1996-05-29 2010-01-14 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
WO2004027082A2 (en) * 2002-09-19 2004-04-01 Applera Corporation Methods and compositions for detecting targets
CN1632132A (zh) * 2003-12-22 2005-06-29 华东理工大学 一种探针及其在关联检测基因多态性位点中的应用
WO2005092038A2 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 The Johns Hopkins University Methods for the detection of nucleic acid differences
US20110287436A1 (en) * 2006-08-01 2011-11-24 Applied Biosystems, Llc Detection Of Analytes And Nucleic Acids
US20080299609A1 (en) * 2007-03-12 2008-12-04 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Uracil-DNA glycosylase of psychrobacter sp. HJ147 and use thereof
WO2008135512A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Jerzy Paszkowski Dna amplification method
CN101329250A (zh) * 2007-06-20 2008-12-24 上海翼和应用生物技术有限公司 一种荧光标记探针的pcr-ldr基因多态性检测测序方法
CN101613730A (zh) * 2008-06-26 2009-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于预防核酸扩增技术中遗留污染的改良方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. XIAO ET AL.: "Molecular diagnosis of HIV and relevant novel technologies in mutation analysis", 《BIOTECHNOLOGY ADVANCES》 *
顾鸣敏等: "《医学遗传学》", 31 August 2013, 上海科学技术文献出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108179176A (zh) * 2018-02-08 2018-06-19 斯格特生物 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法
CN108179176B (zh) * 2018-02-08 2021-08-03 斯格特生物 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法
CN112513265A (zh) * 2018-05-22 2021-03-16 博诚研究中心 用于人类癌症检测的修饰核酸的靶向富集和测序
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒
CN108998535A (zh) * 2018-09-11 2018-12-14 广州市宝创生物技术有限公司 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒
CN108998535B (zh) * 2018-09-11 2021-09-10 广州市宝创生物技术有限公司 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒
CN113166797A (zh) * 2018-12-21 2021-07-23 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽
CN113166797B (zh) * 2018-12-21 2024-04-12 Illumina公司 基于核酸酶的rna耗尽

Also Published As

Publication number Publication date
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SG10202008961UA (en) 2020-10-29
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DK3690060T3 (da) 2022-01-17
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SG11201702831XA (en) 2017-05-30
IL296204B1 (en) 2024-04-01
CA3187713A1 (en) 2016-04-14
JP6871160B2 (ja) 2021-05-12
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AU2015330844A1 (en) 2017-04-27
US10344321B2 (en) 2019-07-09

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