CN117222750A - Dna片段接合检测方法及套组 - Google Patents

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CN117222750A CN202280015354.6A CN202280015354A CN117222750A CN 117222750 A CN117222750 A CN 117222750A CN 202280015354 A CN202280015354 A CN 202280015354A CN 117222750 A CN117222750 A CN 117222750A
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林佩颐
杨芝宜
魏大程
陈华键
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Abstract

本发明涉及分子诊断学及基因体学的方法及套组的领域。更具体而言，本发明是关于一种检测DNA片段接合事件或识别选择性剪接事件的方法及套组。本发明亦涉及一种透过测定患有一特定癌症类型或基因型的风险的步骤，施予一个体适当治疗的方法。

Description

DNA片段接合检测方法及套组
技术领域
本申请案主张2021年2月17日提出的美国临时申请案第63/150,095号的优先权，其全部内容透过引用并入本文。
本发明涉及分子诊断学及基因体学的方法及套组的领域。更具体而言，本发明是关于一种检测脱氧核糖核酸(DNA)片段接合事件或识别选择性剪接(alternativesplicing)事件的方法及套组。本发明亦涉及一种透过测定患有一特定癌症类型或基因型的风险的步骤，施予一个体适当治疗的方法。
背景技术
在遗传学中，出现在DNA片段接合(DNA fragment joining)中的DNA重排(rearrangement)、易位(translocation)、纵排重复(tandemrepeat)、倒置(inversion)、插入(insertion)、缺失(deletion)或其他嵌合变异，通常是疾病的同义词。在我们的器官细胞中，这些类型的DNA损伤已被证实是遗传疾病或癌症的起点；因此，检测DNA片段接合可用于筛检潜在的健康异常或疾病。然而，这对于精准医疗来说仍远不足够。
组成性剪接(constitutive splicing)在核糖核酸(RNA)的剪接过程中将内含子(intron)去除及将外显子(exon)连接起来。选择性剪接(alternative splicing)则包含了偏离正常的剪接，其中外显子被跳过(skipped)、内含子被保留(retained)、外显子相互排斥(exclusive)、或者在成熟的讯息核糖核酸(mRNA)中保留了选择性5'端剪接位点(alternative 5′splice sites)或选择性3'端剪接位点(alternative 5′splice sites)。近来，选择性剪接因其在基因表现中的作用及其与疾病的关联而受到关注。例如，在原发癌细胞的细胞质中可以检测到许多内含子保留，并且可以关联至癌细胞转录组(transcriptomes)的多样性。
DNA片段接合及选择性剪接事件会影响生成的蛋白质，而且可能显著影响疾病风险、疾病进展、以及药物反应。对DNA片段接合进行检测或对选择性剪接的基因变异予以识别可作为诊断标记，且其对后续涉及基因相关疾病的标靶治疗可能很重要，毕竟选择性基因剪接与癌症耐药性之间的相关性已经被证实，如以下文献所述：Wang,Bi-Dar andNorman H.Lee.“Aberrant RNA splicing in cancer and drug resistance.”Cancers10.11(2018):458，其内容透过引用并入本文。
透过生物信息分析可以识别DNA片段接合事件或特定的选择性剪接事件，该分析包括次世代定序(next-generation sequencing，NGS)、免疫组织化学染色法(immunohistochemistry，IHC)、荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)，以及实时定量聚合酶连锁反应(qRT-PCR)、微阵列(microarrays)或RNAseq资料分析。尽管次世代定序提供了包含细节的全面信息，但它不仅费用高、耗时长，而且需要较多的样本，因此限制了其临床应用。免疫组织化学染色法可以检测到蛋白质的生成，但要分辨基因型突变和表型变异之间的关联是有困难的。荧光原位杂交可以检测基因融合，但需要单独的反应来检测每一种融合类型，还需要训练有素的专家来分析结果。因此，新颖、更为准确且全面的检测DNA片段接合类型及预测基因型的方法实有其需要，特别是检测已被发现与疾病特征相关的mRNA剪接缺陷。
发明内容
本发明提供一种检测DNA片段接合事件的方法。该方法包含以下步骤：
(a)自一样本中获取一DNA或由提取的RNA获得一DNA；
(b)使用一寡核苷酸(oligonucleotides)组扩增该DNA，以获得一目标核酸；
(c)使用一分体探针(splitprobe)探测该目标核酸，包含：
(i)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段(partnerDNAfragment)的3'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的5'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中该目标核酸上该第一分体探针的靶点与该第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；或
(ii)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的5'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的3'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中该目标核酸上该第一分体探针的靶点
与该第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；以及
(d)侦测反映该分体探针结合至该目标核酸的一讯号。
依据上述，该寡核苷酸组为一基因特异性引物(gene-specific primer)或一基因特异性探针(gene-specific probe)。
依据上述，在步骤(b)中使用至少两对的一基因特异性引物进行多重PCR(multiplex PCR)以扩增该DNA。
依据上述，该方法进一步包含一测定步骤，测定
(i)该伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或该目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的5'端的讯号；
(ii)该伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或该目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的3'端的讯号；或
(iii)该第三DNA片段是否与该伙伴DNA片段及该目标DNA片段接合，其透过确认该第三分体探针结合至该第三DNA片段的讯号及该目标核酸的一独立PCR的结果。
依据上述，至少两对的该基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段(upstreamDNA fragment)的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，至少两对的该基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段(downstreamDNAfragment)的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，该基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
依据上述，该基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
依据上述，该第一分体探针或该第二分体探针靶向与一DNA片段接合边界相距0-40bp的一距离范围。
依据上述，该第一分体探针选自由SEQ ID NO：32、35及其任一互补序列所组成的群组。
依据上述，该第二分体探针选自由SEQ ID NO：33、36及其任一互补序列所组成的群组。
依据上述，该第三分体探针选自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。
依据上述，该分体探针的长度为10-60bp。
依据上述，在该方法的步骤(c)中使用一分体探针及靶向一DNA片段接合边界的一单一探针去探测该目标核酸。
依据上述，该伙伴DNA片段包含一伙伴基因的一序列，该伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
依据上述，该目标DNA片段包含一目标基因的一序列，该目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组。
依据上述，该伙伴DNA片段及该目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，该同一基因选自由AR(例如ARV7)、BCL2L1、类BCL211(BCL2-Like 11，亦称BIM或BCL2L11)、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2(CASP-2)、CD19、CD44、CXCR3、周期蛋白D1(CyclinD1，亦称CCND1)、DMP1、CDH1、EGFR(例如EGFRvIII)、ER(例如ESR1或ESR2)、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS(H-RAS)、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
依据上述，该DNA片段接合事件选自由ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、及ZNF710-NTRK3突变所组成的群组。
依据上述，该第三DNA片段包含一伙伴基因或一目标基因的一序列。
依据上述，在该方法的步骤(b)中，首先使用该基因特异性引物以及随后使用一通用引物(universal primer)扩增该DNA，以获得该目标核酸。
依据上述，该讯号选自由染剂(dyes)、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记(spinlabels)、酶、半抗原(haptens)、量子点(quantumdots)、珠子、胺基己基化合物(aminohexyls)、及芘类化合物(pyrenes)所组成的群组。
另一方面，本发明提供一种识别选择性剪接事件的方法。该方法包含以下步骤：
(a)使用一分体探针探测一目标核酸，包含：
(b)侦测反映该分体探针结合至该目标核酸的一讯号；
(c)测定；
(i)该伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或该目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的5'
端的讯号；
(ii)该伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或该目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的3'
端的讯号；或
(iii)该第三DNA片段是否与该伙伴DNA片段及该目标DNA片段接合，其透过确认该第三分体探针结合至该第三DNA片段的讯号；以及
(d)比较该目标核酸的长度是否与组成性剪切的一参考序列的长度相同。
依据上述，该目标核酸使用一寡核苷酸组予以扩增。
依据上述，该目标核酸使用至少两对的一基因特异性引物进行多重PCR而扩增。
依据上述，该方法进一步包含透过一独立的PCR再次确认的步骤(e)。
依据上述，至少两对的该基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，至少两对的该基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，至少一该基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
依据上述，该基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
依据上述，多重PCR的产物随后使用一通用引物予以扩增以获得该目标核酸。
依据上述，该第一分体探针的靶点及该第二分体探针的靶点与该DNA片段接合边界之间的一距离在0-40bp以内。
依据上述，该分体探针的长度为10-60bp。
依据上述，在该方法的步骤(a)中使用一分体探针及靶向一DNA片段接合边界的一单一探针探测该目标核酸。
依据上述，该伙伴DNA片段及该目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，该同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
依据上述，该选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
依据上述，该第三DNA片段包含一伙伴基因或一目标基因的一序列。
依据上述，该讯号选自由染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物所组成的群组。
另一方面，本发明亦提供一种治疗一个体的方法。该方法包含以下步骤：
(a)测定一个体是否患有癌症或一基因型的风险，包含对来自该个体的一样本依前述段落所述方法检测一DNA片段接合事件及/或依前述段落所述方法识别一选择性剪接事件；以及
(b)施予
(i)针对该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件的治疗有效量的一siRNA；
(ii)针对由该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一抑制剂；
(iii)抑制由该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一药剂；
(iv)治疗有效量的一抗癌剂，该抗癌剂选自由细胞激素(cytokines)、细胞凋亡诱导剂(apoptosis-inducing agents)、抗血管生成剂(anti-angiogenic agents)、化学治疗剂(chemotherapeutic agents)、放射治疗剂(radio-therapeutic agents)、及抗癌免疫毒素(anticancer immunotoxins)所组成的群组；或
(v)对该个体的细胞提供一靶向性基因体编辑程序。
依据上述，该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件呈现一伙伴基因的一序列，该伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
依据上述，该DNA片段接合事件呈现一目标基因的一序列，该目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2所组成的群组。
依据上述，该选择性剪接事件呈现一同一基因的一不同序列，该同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
依据上述，该DNA片段接合事件或该选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
依据上述，该选择性剪接事件选自由组成性剪接、外显子跳跃(exon skipping)、内含子保留(intron retention)、外显子互斥(mutuallyexclusiveexons)、及选择性5'端或3'端剪接位点(alternative 5'or3'splice sites)所组成的群组。
依据上述，该癌症选自由上皮癌(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphoma)、白血病(leukemia)、及骨髓瘤(myeloma)所组成的群组。
依据上述，该癌症选自由脑癌(braincancer)、乳癌(breastcancer)、结肠癌(coloncancer)、内分泌腺体癌(endocrine gland cancer)、食道癌(esophageal cancer)、女性生殖器官癌(female reproductive organ cancer)、头颈癌(headandneckcancer)、肝胆系统癌(hepatobiliary systemcancer)、肾癌(kidneycancer)、肺癌(lungcancer)、间质细胞瘤(mesenchymal cell neoplasm)、前列腺癌(prostate cancer)、皮肤癌(skincancer)、胃癌(stomach cancer)、外分泌胰腺肿瘤(tumor ofthe exocrine pancreas)、及泌尿系统癌(urinary system cancer)所组成的群组。
另一方面，本发明亦提供一种用于检测一样本的DNA片段接合事件及/或选择性剪接事件的套组。该套组包含：
(a)一寡核苷酸组；
(b)一分体探针，包含：
(i)与一伙伴DNA片段的3'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的5'端互补的一第二分体探针，及/或与一第三DNA片段互补的一第三分体探针，其中一目标核酸上该第一分体探针的靶点与该第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；或
(ii)与一伙伴DNA片段的5'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的3'端互补的一第二分体探针，及/或与一第三DNA片段互补的一第三分体探针，其中一目标核酸上该第一分体探针的靶点与该第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；以及
(c)用于检测一分体探针杂交讯号的一探针杂交试剂组，其包含染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物。
依据上述，该寡核苷酸组为一基因特异性引物或一基因特异性探针。
依据上述，该套组包含至少两对的一基因特异性引物。
依据上述，该基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，该基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段的该伙伴DNA片段中获取该目标核酸。
依据上述，该套组进一步包含一通用引物。
依据上述，至少一该基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
依据上述，该基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
依据上述，该第一分体探针或该第二分体探针靶向与一DNA片段接合边界相距0-40bp的一距离范围。
依据上述，该第一分体探针选自由SEQ ID NO：32、35及其任一互补序列所组成的群组。
依据上述，该第二分体探针选自由SEQ ID NO：33、36及其任一互补序列所组成的群组。
依据上述，该第三分体探针选自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。
另一方面，本发明提供的套组包含长度为10-60bp的分体探针。
依据上述，该套组进一步包含靶向一DNA片段接合边界的一单一探针。
依据上述，该第一分体探针与一伙伴基因的一序列互补，该伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
依据上述，该第二分体探针与一目标基因的一序列互补，该目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组。
依据上述，与该第一分体探针互补的该伙伴DNA片段及与该第二分体探针互补的该目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，该同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
依据上述，该DNA片段接合事件或该选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
依据上述，与该第三分体探针互补的该第三DNA片段具有一伙伴基因或一目标基因的一序列。
附图说明
本领域中的技术人员依据以下对较佳实施例的详细说明及参考所附图式应可理解本发明，在该图式中：
图1是依据本发明的一实施例的检测MET基因突变的方法的示意图；该检测基于一步式PCR目标-探针杂交试验。
图2是依据本发明的一实施例的检测NTRK基因突变的方法的示意图；该检测基于二步式PCR目标-探针杂交试验。
图3是依据本发明的一实施例的检测EGFR基因突变的方法的示意图；该检测基于二步式PCR目标-探针杂交试验。
图4显示一孔盘的一孔洞中点制的探针点阵列；由上方起算第一行和从左侧起算第一列中的数字是作为参考坐标呈现；标有1-117的方块代表分体探针点，标有IC001-IC009的方块代表对照探针点，而标有R144的方块代表锚定探针点。
图5显示依据本发明的一实施例的ETV6-NTRK3(外显子5及外显子14)基因融合阳性的探针点阵列，其位于一孔盘之一孔洞中。
图6显示依据本发明的一实施例的QKI-NTRK2(外显子6及外显子16)基因融合阳性的探针点阵列，其位于一孔盘的一孔洞中。
图7显示依据本发明的一实施例的AFAP1-NTRK1(外显子4及外显子10)基因融合阳性的探针点阵列，其位于一孔盘之一孔洞中。
图8显示依据本发明的一实施例的新颖的人为PPL-NTRK3(外显子22及外显子14)基因融合阳性的探针点阵列，其位于一孔盘的一孔洞中。
图9显示一对照组(水、融合阴性样本)孔洞及一融合组(PPL-NTRK3)孔洞中的融合阴性及融合阳性的探针点阵列。
具体实施方式
除非另有定义，本文中使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属技术领域中熟习技艺者通常理解的含义相同。
定义
除非上下文另有指示，本文中所使用的单数形式「一」、「一种」及「该」包含复数指称。
术语「DNA片段接合(DNAfragmentjoining)」是指透过DNA片段的断裂和重新连接而发生的DNA的重排(rearrangement)、易位(translocation)、纵排重复(tandem repeat)、倒置(inversion)、插入(insertion)、缺失(deletion)或其他嵌合变异。DNA片段接合发生时，一杂合DNA(hybridDNA)片段会由两个或更多个在正常情况下分离的DNA片段产生。术语「DNA片段接合」亦指从依循选择性剪接途径的mRNA合成cDNA产物之时。
术语「选择性剪接(alternative splicing)」是指一初级转录本(primarytranscript)可以剪接成一种以上的mRNA异构体的事件。现今已公开的选择性剪接有不同类别，包含组成性剪接、外显子跳跃、内含子保留、外显子互斥、及选择性5'端或3'端剪接位点。
术语「目标DNA片段」是指任何核酸分子、多核苷酸序列、或包含基因体DNA中特定基因或基因座(genetic locus)的一部分的任何片段。术语「伙伴DNA片段」是指其3'端或5'端序列与「目标DNA片段」的5'端或3'端序列连接的一片段。目标DNA片段或伙伴DNA片段包括一完整的基因、一外显子或内含子、一个调节序列或基因之间的任何区域。位于杂合DNA片段的5'端的DNA片段被称为「上游DNA片段」，而位于杂合DNA片段的3'端的DNA片段被称为「下游DNA片段」。
杂合DNA片段具有「DNA片段接合边界」，其是一个DNA片段与另一个DNA片段连接的区域。例如，伙伴DNA片段与目标DNA片段连接的区域、或伙伴DNA片段与另一DNA片段连接的区域、或融合接点(fusionjunction)。两个或更多个特定DNA片段之间的连接进一步使DNA片段接合边界更多样化。
目标DNA片段和由特定基因序列组成的伙伴DNA片段有时候以异常的组合方式连接，导致基因融合(gene fusion)。术语「基因融合」是指一染色体上的一第一基因与相同或不同染色体上的一第二基因融合，从而形成一杂合基因或一融合基因的现象。这种现象通常也被称为「基因易位」或「基因重排」。例如，当一NTRK基因是多个被融合的基因之一时，此种基因融合被称为「NTRK基因融合」或「NTRK融合」。
位于融合基因的5'端的基因被称为「5'端基因」，而位于融合基因的3'端的基因被称为「3'端基因」。融合基因具有一「融合接点」，其是基因融合的部位。融合接点位于由一融合序列(亦称为一融合接点序列)所定义的一融合区内，该序列包含来自5'基因的序列和来自3'基因的序列。融合基因的不同组合会造成不同的「融合类型」。两个特定基因之间的融合因融合接点而更为分歧，因为融合接点可能发生在融合基因的任何地方。例如，一第一基因的第一外显子与一第二基因的第二外显子之间的融合是一种融合类型，而该第一基因的第三外显子与该第二基因的第一外显子之间的融合是另一种融合类型。
基因融合可以透过识别一DNA或该DNA的一RNA转录本(RNAtranscript)中的一融合接点来检测。本文中所用的「融合类型」是指存在于RNA转录本中的独特融合。换言之，当两个特定基因之间的融合发生在同一内含子区域的不同位点时，其被认为是同一种融合类型。例如，基因A的外显子3和基因B的外显子5之间的融合所具有的一DNA融合区可能包含基因A的外显子3和4之间的内含子的一小部分和基因B的外显子4和5之间的内含子的一大部分。或者，此融合所具有的一DNA融合区可能包含基因A的外显子3和4之间的内含子的一大部分以及基因B的外显子4和5之间的内含子的一小部分。前述两种融合虽然有不同的DNA融合接点，但被认为是同一种「融合类型」，因为该两种融合产生的RNA转录本是相同的。
术语「一寡核苷酸组」是指一组合成的单股寡核苷酸，其可用于扩增欲定序的目标基因区。本文中所用术语「基因特异性引物(对)」、「MET突变特异性引物(对)」、「NTRK融合特异性引物(对)」或「EGFRvIII突变特异性引物(对)」是指一DNA引物(对)，其被设计用于扩增包含DNA片段接合边界或融合接点的一目标DNA。本文中所用术语「基因特异性探针」是指与目标基因序列互补的一合成的寡核苷酸探针(作为饵)。
本文中所用术语「通用引物」是指一种DNA引物，其被设计用于扩增包含通用引物的核苷酸序列的任何DNA。通用引物为成对使用，包含一通用正向引物及一通用反向引物。
除非另有定义，术语「分体探针」是指两个或更多个合成的单股DNA寡核苷酸，其可以与源自伙伴DNA片段与目标DNA片段及/或另一DNA片段的DNA片段接合区杂交。
本文中所述的基因各自对应至NCBI基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中所列的「基因名称(或标记)」。因此，利用NCBI基因数据库来识别一基因的序列或基因名称的同义词。
本发明提供一种检测DNA片段接合事件的方法。该方法包含以下步骤：
(a)自一样本中获取一DNA或由提取的RNA获得一DNA；
(b)使用一寡核苷酸组扩增该DNA，以获得一扩增的目标核酸；
(c)使用一分体探针探测该扩增的目标核酸，包含：
(i)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的3'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的5'端互补，及/或一第三分体探针是与另一DNA片段互补，其中该扩增的目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；或
(ii)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的5'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的3'端互补，及/或一第三分体探针是与另一DNA片段互补，其中该目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；以及
(d)侦测反映该分体探针结合至该目标核酸的一讯号。
在一些实施例中，RNA是从一生物样本制备而得。该生物样本可以是从动物及人类个体获得的任何样本。生物样本的例子包括福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE)组织切片、外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)、血液、血浆、或其他细胞或体液。在一些实施例中，该生物样本来自于一癌症患者。在一些实施例中，该生物样本来自于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。在一些实施例中，该生物样本来源于患有脑癌、乳癌、结肠癌、内分泌腺体癌、食道癌、女性生殖器官癌、头颈癌、肝胆系统癌、肾癌、肺癌、间质细胞瘤、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、外分泌胰腺肿瘤、或泌尿系统癌的患者。
从生物样本制备总RNA(totalRNA)可透过本技术领域中已知的各种方法进行。一种典型的流程是使用有机溶剂(例如苯酚/氯仿)提取RNA并且透过离心将其沉淀。市面上亦可取得用于分离或纯化RNA的套组。获得RNA后，使用反转录酶(reverse transcriptase)与四种脱氧核糖核苷三磷酸酯(deoxyribonucleoside triphosphates(dNTP)，包括dATP，dCTP，dTTP及dGTP)从模板RNA生成cDNA，此一过程称为反转录。反转录的进行可以使用SuperScript cDNA合成套组(SuperScript cDNA synthesis kit；货号：11754050，Invitrogen)。
在一些实施例中，本发明的方法进一步包含一测定步骤，测定：
(i)该伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或该目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的5'端的讯号；
(ii)该伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或该目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的3'端的讯号；或
(iii)该第三DNA片段是否与该伙伴DNA片段及该目标DNA片段接合，其透过确认该第三分体探针结合至该第三DNA片段的讯号及该目标核酸的一独立PCR的结果。
本发明提供一种检测DNA片段接合事件的方法。该方法包含以下步骤：
(a)使用一分体探针探测一扩增的目标核酸，包含：
(i)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的3'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的5'端互补，及/或一第三分体探针是与另一DNA片段互补，其中该目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；或
(ii)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的5'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的3'端互补，及/或一第三分体探针是与另一DNA片段互补，其中该目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；
(b)侦测反映该分体探针结合至该目标核酸的一讯号；
(c)测定
(i)该伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或该目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的5'端的讯号；
(ii)该伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或该目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认该第一分体探针结合至该伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或该第二分体探针结合至该目标DNA片段的3'端的讯号；或
(iii)该第三DNA片段与该伙伴DNA片段及该目标DNA片段接合，其透过确认该第三分体探针结合至该第三DNA片段的讯号；以及
(d)比较该目标核酸的长度是否与组成性剪切的一参考序列的长度相同。
在一些实施例中，该寡核苷酸组为一基因特异性引物或一基因特异性探针。
在一些实施例中，该扩增的目标核酸使用至少两对的该基因特异性引物进行多重PCR进行扩增。
在一些实施例中，前述段落所述的方法进一步包含透过一独立的PCR(例如SangerPCR或qPCR)再次确认的步骤。
在一些实施例中，使用DNA聚合酶及至少两对的一基因特异性引物扩增该DNA以获得供探针检测的一扩增的目标核酸。在一些实施例中，该基因特异性引物是一NTRK融合特异性引物、一MET突变特异性引物、或一EGFRvIII突变特异性引物。可使用含DNA聚合酶(DNApolymerase)的多重PCR套组(货号：206143,Qiagen)进行扩增。该基因特异性引物在使用前可作为一试剂而提供。在一些实施例中，一NTRK融合特异性引物被用于扩增目标核酸。在一些实施例中，将两对或多对NTRK融合特异性引物汇集在一起以扩增各目标核酸。
在一些实施例中，将由NTRK融合特异性引物、MET突变特异性引物、及EGFRvIII突变特异性引物组成的两对或多对基因特异性引物汇集在一起以扩增各目标核酸。
在其他实施例中，该基因特异性引物被部分汇集以形成复数个汇集试剂，其中每一汇集试剂包含至少一对的该基因特异性引物。因此，汇集试剂的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多。在一些较佳实施例中，由四个汇集试剂提供超过一百对的NTRK融合特异性引物，以便用于四个多重扩增反应。以此种方式进行的DNA扩增相比将所有基因特异性引物用于进行单一个多重扩增反应，已被证实表现出明显更高的效能，这可能是由于引物的复杂性减低。
在一些较佳实施例中，首先使用至少两对的NTRK融合特异性引物及随后使用一通用引物扩增DNA，以获得扩增的目标核酸。当本文所揭露方法利用了通用引物时，各基因特异性引物对中的基因特异性正向引物进一步包含该通用引物对中的通用正向引物的核苷酸序列，并且各基因特异性引物对中的基因特异性反向引物进一步包含该通用引物对中的通用反向引物的核苷酸序列。使用通用引物可以提高任何可能的扩增产物的最终产量，无论欲检测的DNA片段为何或在第一轮扩增中使用了何种基因特异性引物。使用通用引物的另一项优点是，欲将引物修饰成为可侦测的引物时，只需要对两个甚至一个通用引物进行修饰，例如在一个通用引物和一个连结子(如生物素)之间形成连接，从而使一可侦测分子可以与通用引物相连。否则，所有基因特异性引物都需要经过修饰，这将使得引物修饰过程更为复杂且昂贵。
在一些较佳实施例中，将该扩增的目标核酸与该分体探针混合，以便透过核酸杂交生成一探针结合产物，其可反映该分体探针与该扩增的目标核酸之间的结合。
在一些实施例中，由于该分体探针是依据伙伴DNA片段、目标DNA片段、或第三DNA片段的特定序列方向而特别设计，藉由侦测来自一特定探针结合产物的第一分体探针、第二分体探针或第三分体探针的讯号，可以确定确切的DNA片段接合事件。
在一些实施例中，各该分体探针的长度为10-60bp。在一些实施例中，该目标核酸的长度不超过200bp。
在一些较佳实施例中，DNA的扩增使用被设计从作为上游DNA片段的该伙伴DNA片段中获得该目标核酸的至少两对的该基因特异性引物。
在一些较佳实施例中，DNA的扩增使用被设计从作为下游DNA片段的该伙伴DNA片段中获得该目标核酸的至少两对的该基因特异性引物。
在一些实施例中，可检测的DNA片段接合包括但不限于样本的重排、易位、纵排重复、倒置、插入、缺失或其他嵌合变异。
在一些实施例中，可检测的基因突变包括但不限于一目标基因与一伙伴基因之间的融合，该目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组，该伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
在一些实施例中，该伙伴DNA片段包含一伙伴基因的一序列，该伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
在一些实施例中，该目标DNA片段包含一目标基因的一序列，该目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组。
在一些实施例中，该第三DNA片段包含该伙伴基因或该目标基因的一序列。
在一些实施例中，可检测的基因突变类型包括但不限于ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、或ZNF710-NTRK3。
在一较佳实施例中，可检测的NTRK基因融合类型包括TFG-NTRK1、ETV6-NTRK3、QKI-NTRK2、TPM3-NTRK1、ETV6-NTRK2、TFG-NTRK3、及NACC2-NTRK2。在另一较佳实施例中，可检测的NTRK基因融合类型包括PDE4DIP-NTRK1、TRIM63-NTRK1、GON4L-NTRK1、及CTRC-NTRK1。
在一较佳实施例中，可检测的DNA片段接合事件包括包含NTRK基因的该目标DNA片段为下游DNA片段，以及包含前述段落所述的伙伴基因的该伙伴DNA片段为上游DNA片段。
在一较佳实施例中，可检测的DNA片段接合事件包括包含EGFR基因的该目标DNA片段为上游DNA片段，以及包含前述段落所述的伙伴基因的该伙伴DNA片段为下游DNA片段。
在一些实施例中，可检测的选择性剪接事件的基因突变包括但不限于AR(例如ARV7)、BCL2L1、类BCL211(BCL2-Like 11，亦称BIM或BCL2L11)、BCOR、BCR-ABL、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2(CASP-2)、CD19、CD44、CXCR3、周期蛋白D1(Cyclin D1，亦称CCND1)、DMP1、CDH1(E-钙黏蛋白(E-cadherin))、EGFR(例如EGFRvIII)、ER(例如ESR1或ESR2)、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS(H-RAS)、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB(例如RPS6KB1或RPS6KB2)、STAT3、TP53、TSC2、或VEGF。
在一些实施例中，该第一分体探针互补于该伙伴DNA片段，且该伙伴DNA片段具有前述段落中描述的伙伴基因的一序列及其任何互补序列。在其他实施例中，该第二分体探针互补于该目标DNA片段，且该目标DNA片段具有前述段落中描述的目标基因的一序列及其任何互补序列。在其他实施例中，该第三分体探针互补于该第三DNA片段，且该第三DNA片段具有前述段落中描述的伙伴基因或目标基因的一序列及其任何互补序列。
表1列出了特别设计用于检测特定DNA片段接合的分体探针。该些探针的任一者皆被设计为对DNA片段的标靶区域(例如目标基因或伙伴基因)具有特异性且能普遍用于不同的DNA片段类型，其使得探针的修饰过程更为容易，并且能准确地测定DNA片段接合事件。
表1
在一些实施例中，进行NTRK基因融合的检测时，使用具有5'-GGGAGAATAGCAGGTCCCGT-3'(SEQ ID NO：31)或5'-TGGTGTATTAGG CCCAGCCT-3'(SEQ ID NO：34)任一序列的单一探针以及具有SEQ ID NO：32、33、35、36中任何一序列的分体探针，以便比较检测灵敏度和特异性(参考表2、图5及图6)。
表2
在一些实施例中，对一个目标核酸进行扩增及探测后，可检测到一个DNA片段接合事件。在其他实施例中，具有不同序列的两个或更多个目标核酸在一次反应中被扩增(称为多重扩增反应)及/或在一次反应中被探测(称为多重杂交反应)后，多种NTRK融合类型可同时被检测到。在一些实施例中，至少两组的该分体探针选自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。该些探针可作为一个单一的汇集试剂提供，或作为复数个分开的试剂提供。
通常，探针及扩增产物在一特定温度下混合以促使探针杂交。探针杂交的最佳热混合条件会随探针序列而改变。因此，对于使用至少两种探针的多重反应，为所有探针选择出一个合适的杂交条件非常困难。然而，透过使用表2所列的探针，多重反应可以在一固定温度下配合固定摇动速度进行，因为该些探针被设计为能够在相近的杂交条件下与各自的标靶杂交。在一些实施例中，杂交的温度介于35-50℃、40-50℃、40-45℃、或45-50℃之间。在一些实施例中，杂交透过使用一热混合器在介于700-1000rpm、750-1000rpm、800-1000rpm、900-1000rpm、700-750rpm，700-800rpm、750-800rpm、或800-900rpm之间的转速下进行。
对前述探针结合产物之侦测可以透过检测该产物中的基因特异性引物、通用引物或分体探针来达成。因此，该些引物或探针通常被修饰为可被侦测。透过将该些引物或探针直接或间接地与一可侦测分子相连，其可以被修饰为具有荧光或化学发光活性，或者成为可呈色或可比色。在一些实施例中，该引物对中的一个或两个引物连接至生物素(biotin)或者其他化合物，其能够与缀合至链亲和素(streptavidin)且带有讯号的一可侦测分子相结合。该可侦测讯号可以是染剂、化学发光染剂、荧光分子如藻红蛋白(phycoerythrin，PE)或花青类染剂(cyanines)、放射性同位素、自旋标记、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、芘类化合物、或用于呈色反应的酶，例如碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)或山葵过氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)。呈色反应中使用的酶在一呈色受质存在的情况下会催化有色化合物的生成。在一些实施例中，用于检测特定NTRK融合类型的分体探针分别与各自的独有识别元件相连，使得多种NTRK融合类型能被同时检测，并且可将它们彼此区分。该独有识别元件可以是具有一独特序列的寡核苷酸，或者包含一独特条形码(barcode)于其表面的微珠或奈米粒子。该条形码可以是一种几何图案，其可由配备一明视野成像统的一光学扫描仪读取。在一些实施例中，该微珠或该奈米粒子是一种磁性粒子。在一些实施例中，该微珠或该奈米粒子由合成聚合物所制成。
该独有识别元件可以直接或透过一连接子(linker)与探针相连。在一些实施例中，该独有识别元件透过直接的化学偶联与探针相连，故在独有识别元件与探针间形成一共价键。在一些实施例中，该独有识别元件透过一聚合物连接子与探针相连。在一些实施例中，该独有识别元件透过互补核苷酸序列之间的杂交连接至探针。
本文揭露的方法可以在能够进行多重反应的数种技术平台上执行，例如一微阵列板(microarrayplate)、一基因芯片(gene chip)、微珠(microbeads)、奈米粒子(nanoparticles)、一膜片(membrane)、或一微流体装置(microfluidic device)。在一些实施例中，前述探针固着于一微阵列板、一基因芯片或一膜片的不同位置上，例如呈一点阵列的形式，每一点包含复数个的一种探针。在其他实施例中，该探针与微珠(如磁性微珠)相连接。在另一些实施例中，该探针涂覆于一微流体装置的一基板上，其中不同探针位于该基板的不同区域内。
当探针固着于一DNA微阵列板上时，该微阵列板可进一步包含一组对照点，每一对照点包含复数个的一种对照探针(control probe)。该对照探针会与持家基因(housekeeping gene)如β-肌动蛋白(beta-actin)、3-磷酸甘油酯脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、及β2-微球蛋白(beta2-microglobulin)的DNA结合。因此，该对照点可以作为内部对照组来检验试验的效能。此外，该微阵列板可以进一步包含一组锚定点，每一锚定点都包含复数个的一种锚点探针(anchorprobe)。该锚定探针被设计为无关于扩增产物而可被检测到。因此，该锚定点可以用作该微阵列板上锚定点邻近的点的位置指标。
本文亦提供一种于治疗一个体的方法。该方法包含以下步骤：
(a)测定一个体是否患有癌症或一基因型的风险，包含对来自该个体的一样本依前述段落所述方法检测一DNA片段接合事件及/或依前述段落所述方法识别一选择性剪接事件；以及
(b)施予
(i)针对该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件的治疗有效量的一siRNA；
(ii)针对由该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一抑
制剂；
(iii)抑制由该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一药剂；
(iv)治疗有效量的一抗癌剂，该抗癌剂选自由细胞激素、细胞凋亡诱导剂、抗血管生成剂、化学治疗剂、放射治疗剂、及抗癌免疫毒素所组成的群组；或
(v)对该个体的细胞提供一靶向性基因体编辑程序。
在一些实施例中，该DNA片段接合事件及/或该选择性剪接事件呈现出如前述段落所述的伙伴基因的一序列。在一些实施例中，该DNA片段连接事件及/或该选择性剪接事件呈现出如前述段落所述的目标基因的一序列。
在一些实施例中，该选择性剪接事件选自由组成性剪接、外显子跳跃、内含子保留、外显子互斥、及选择性5'端或3'端剪接位点所组成的群组。
在一些实施例中，所述癌症选自由上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、及骨髓瘤所组成的群组。
在一些实施例中，该癌症选自由脑癌、乳癌、结肠癌、内分泌腺体癌、食道癌、女性生殖器官癌、头颈癌、肝胆系统癌、肾癌、肺癌、间质细胞瘤、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、外分泌胰腺肿瘤、及泌尿系统癌所组成的群组。
在一些实施例中，当在来自一癌症患者(个体)的一样本中检测到NTRK基因融合(DNA片段接合)时，可以预期该患者对一TRK抑制剂有反应，特别是对一NTRK抑制剂，例如拉罗特雷替尼(larotrectinib)、恩曲替尼(entrectinib)、LOXO-195或TPX-0005。
在一些实施例中，前述段落中揭露的方法可用于对RNA剪接相关疾病或癌症疾病的过程或治疗的前瞻性分析(参见例如，Scotti,M.,Swanson,M.RNA mis-splicing indisease.NatRev Genet 17,19-32(2016)；Kim,H.K.,Pham,M.H.C.,Ko,K.S.etal.Alternative splicing isoforms in health and disease.Pflugers Arch-Eur JPhysiol 470,995-1016(2018)；Wang,E.,&Aifantis,I.RNA Splicing and Cancer.Trendsin Cancer 6,631-644(2020)，前述文献内容透过引用并入本文)。
本文亦提供一种用于检测一样本的DNA片段接合事件及/或选择性剪接事件的套组。该套组包含：
(a)一寡核苷酸组；
(b)一分体探针，包含：
(i)与一伙伴DNA片段的3'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的5'端互补的一第二分体探针，及/或与另一DNA片段互补的一第三分体探针，其中一扩增的目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；或
(ii)与一伙伴DNA片段的5'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的3'端互补的一第二分体探针，及/或与一第三DNA片段互补的一第三分体探针，其中一目标核酸上该些分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的一距离范围内；以及
(c)用于检测一分体探针杂交讯号的一探针杂交试剂组，其包含染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物。
在一些实施例中，该套组包含的该寡核苷酸组为一基因特异性引物或一基因特异性探针。在一些实施例中，该套组包含至少两对的如前述段落所述的基因特异性引物。在一些实施例中，该基因特异性引物被设计从作为上游DNA片段的伙伴DNA片段中获得目标核酸。在一些实施例中，该基因特异性引物被设计从作为下游DNA片段的伙伴DNA片段中获得目标核酸。
在一些实施例中，该套组进一步包含如前述段落所述的一通用引物。
在一些实施例中，至少一该基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
在一些实施例中，该基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
在一些实施例中，该第一分体探针及该第二分体探针靶向与一DNA片段接合边界相距0-40bp的一距离范围。
在一些实施例中，该第一分体探针互补于该伙伴DNA片段，且该伙伴DNA片段具有前述段落中描述的伙伴基因的一序列及其任何互补序列。在其他实施例中，该第二分体探针互补于该目标DNA片段，该目标DNA片段具有前述段落中描述的目标基因的一序列及其任何互补序列。在其他实施例中，该第三分体探针互补于该第三DNA片段，该第三DNA片段具有前述段落中描述的伙伴基因或目标基因的一序列及其任何互补序列。
在一些实施例中，该第一分体探针互补于该伙伴DNA片段及其任何互补序列，该伙伴DNA片段包含前述段落中所述的伙伴基因的一序列。在一些实施例中，第二分体探针互补于该目标DNA片段，且该目标DNA片段包含前述段落中所述的该目标基因的一序列及其任何互补序列。在一些实施例中，该第三分体探针互补于该第三DNA片段，且该第三DNA片段包含前述段落中所述的伙伴基因或目标基因的一序列及其任何互补序列。
在一些实施例中，该分体探针选自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。
在一些实施例中，该引物对中的一个或两个引物连接至生物素或者其他化合物，其能够与缀合至链亲和素且带有讯号的一可侦测分子相结合。
在一些实施例中，该分体探针的长度为10-60bp。
在一些实施例中，该扩增的目标核酸的长度不超过200bp。
在一些实施例中，一探针杂交试剂组被设计用于检测各种可侦测的讯号，例如染剂、化学发光染剂、荧光分子如藻红蛋白(PE)或花青类染剂、放射性同位素、自旋标记、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、芘类化合物、或用于呈色反应的酶，例如碱性磷酸酶(AP)或山葵过氧化酶(HRP)。
在一些实施例中，用于检测特定NTRK融合类型的分体探针被设计成与各自的独有识别元件相连。该独有识别元件可以是具有一独特序列的寡核苷酸，或者包含一独特条形码于其表面的微珠或奈米粒子。该条形码可以是一种几何图案，其可由配备一明视野成像统的一光学扫描仪读取。在一些实施例中，该微珠或该奈米粒子是一种磁性粒子。在一些实施例中，该微珠或该奈米粒子由合成聚合物所制成。
在一些较佳实施例中，该套组包含一通用引物。当复数个NTRK融合特异性引物对与该通用引物一起使用时，各该NTRK融合特异性引物对中的NTRK融合特异性正向引物进一步包含该通用引物对中的通用正向引物的核苷酸序列，并且各该NTRK融合特异性引物对中的NTRK融合特异性反向引物进一步包含该通用引物对中的通用反向引物的核苷酸序列。
在一些实施例中，该套组进一步包含一反转录酶，用于对分离自样本的RNA进行反转录，并且该套组还包含一DNA聚合酶，用于扩增由该反转录产生的cDNA。
在一些实施例中，该套组进一步包含一内部对照组。该内部对照组可以是存在NTRK基因融合的一阳性对照样品，或者可以是不具有NTRK基因融合的一阴性对照样品。在一些实施例中，该内部对照组为一FFPE组织切片、外周血单核细胞(PBMCs)、血液、血浆、其他细胞或体液、核酸、或寡核苷酸。
前述段落所中描述的套组的优点在于，在寻找DNA片段接合以及选择性剪接事件方面具备检测准确性，因此得以实现对临床基因型的可靠分析。
本发明由以下实施例进一步说明，该些实施例用于示范而非用于限制本发明。
实施例
实施例1
以一步式PCR目标-探针杂交试验检测MET基因突变
一步式PCR目标-探针杂交试验可以在单一反应中同时检测复数种可能的MET选择性剪接类型。图1显示该试验的整体流程，其包括以下步骤：从一样本中获得RNA，对该RNA进行反转录以获得cDNA，使用多个MET突变特异性引物对透过PCR扩增该cDNA的MET选择性剪接区(即目标cDNA)以获得该目标cDNA的一扩增产物，使用分体探针与该扩增的目标cDNA进行探针杂交，以及侦测探针结合产物。下面是该试验的一个例子。
分体探针的制备
进行试验前，基于MET基因的RNA转录本中的融合区的核苷酸序列(表3)设计了一种靶向MET基因的外显子14跳跃突变的探针。表3中的序列分别来自5'伙伴(MET基因的外显子13)和3'目标(MET基因的外显子15)。分体探针(如表1所示)被设计为可结合至表3中所列的序列。该分体探针固着于一微阵列板上，呈一点阵列的形式，每一点包含复数个的一种探针。
表3
使用MET突变特异性引物对进行PCR扩增
为了替代带有MET选择性剪接的临床样本，由IDT公司合成的寡核苷酸被用作阳性对照组模板。该MET选择性剪接寡聚物以表4所示的MET突变特异性引物对进行PCR扩增。该引物对由IDT合成，其能结合至该MET选择性剪接寡聚物之5'端和3'端。该引物对中的反向引物的5'端被生物素修饰，以便后续与链亲和素-藻红素(streptavidin-phycoerythrin，SA-PE)缀合物(Thermo Fisher Scientific)产生交互作用。依据制造商说明书使用高保真度Platinum Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)在VeritiTM 96孔热循环仪(Thermo Fisher Scientific)上进行30个热循环的PCR。
表4
探针杂交及讯号侦测
将MET选择性剪接寡聚物的扩增产物转移到预先阻断的孔洞中进行杂交，每一孔洞都点制有分体探针的点阵列，包括MET选择性剪接特异性探针的点(例如表1所示)、对照探针(controlprobes)的点、及锚定探针的点。杂交后，将可发荧光的SA-PE缀合物加入该孔洞中以便其与扩增产物的生物素相结合，使得有色产物在探针-目标杂合体所在的位置生成。透过使用一特定相机对该孔洞拍照以及辨认有色斑点在该孔洞中的位置，便可确定一种特定杂交，其指示存在一种特定的MET选择性剪接。有色斑点的位置可以由计算机进行分析。
实施例2
以二步式PCR目标-探针杂交试验检测NTRK基因突变
为了在单一反应中同时检测多种可能的NTRK融合而设计的另一种方法是二步式PCR目标-探针杂交试验。图2显示该试验的整体流程，其包括以下步骤：从一样本中获得RNA，对该RNA进行反转录以获得cDNA，使用多个NTRK融合特异性引物对透过PCR扩增该cDNA的NTRK融合区(即目标cDNA)以获得该目标cDNA的第一扩增产物，使用一通用引物对透过PCR扩增该第一扩增产物以获得该目标cDNA的第二扩增产物，对该扩增的目标cDNA进行探针杂交，以及侦测探针结合产物。下面是该试验的一个例子。
RNA提取及反转录
依据制造商说明书利用RecoverAll总核酸分离套组(货号：AM1975，AmbientTechnologies)从一癌症患者的FFPE组织样本中提取DNA和RNA。使用SuperScript cDNA合成套组(货号：11754050，Invitrogen)及随机六核苷酸引物(random hexanucleotideprimers)在42℃对100ng的总RNA进行反转录30至60分钟。此步骤生成10μL的cDNA产物。
使用NTRK融合特异性引物对进行PCR扩增
本试验中使用的NTRK融合特异性引物对中的每个引物被设计成具有两个片段。一个片段被称为融合特异性片段，用于结合一种特定NTRK融合之融合序列的5'端或3'端。另一个片段被称为通用片段，其具有将在第二轮PCR中使用的通用引物的核苷酸序列。该通用片段相对于该融合特异性片段总是位在上游或5'的位置(图2)。该通用引物可以是表5中所列的任一引物，表5中的每个通用引物都可以用作通用正向引物或通用反向引物。表6显示了本试验中使用的一些融合特异性引物对的融合特异性片段。
表5
表6
进行融合特异性PCR时，在10μL的cDNA产物中加入7μL的水，其后将得到的混合物(17μL)等分为四组，每组有4μL的混合物，并余下1μL的死容积(dead volume)。分组的数目取决于引物效能。更具体而言，首先测定每种融合特异性引物对的引物效率，然后将效率相近的融合特异性子对混合以形成单一引物汇集物，最终形成共四个引物汇集物(表示为P1、P2、P3、P4)。将包含23至48个融合特异性引物的每个引物汇集物(表7)一组cDNA(4μL)。其后，依据制造商说明书使用多重PCR套组(货号：206143，Qiagen)，在VeritiTM 96孔热循环仪(Thermo Fisher Scientific)上对各组cDNA进行25个热循环的扩增，由此生成10μL的第一扩增产物。换言之，进行四个多重PCR反应以产生四组第一扩增产物。
表7
使用通用引物对进行PCR扩增
由于每个融合特异性引物在5'端包含一通用引物的核苷酸序列，可以使用一通用引物对透过PCR进一步扩增该第一扩增产物。该通用引物对包含具有选自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用正向引物，以及具有选自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用反向引物。该通用反向引物经过生物素修饰。进行第二轮PCR时，将前述四组第一扩增产物分别稀释100倍于最终反应混合物中，并且依据制造商说明书使用Platinum SuperFi IIPCR预混液(Platinum SuperFi IIPCR Master Mix；CatNo：12368010，Invitrogen)在VeritiTM 96孔热循环仪(Thermo Fisher Scientific)上对各组第一扩增产物进行扩增25个热循环，由此得到10μL的第二扩增产物。换言之，进行四个PCR反应以产生四组第二扩增产物。
探针杂交及讯号侦测
将前述四组第二扩增产物合并(总计40μL)，所得汇集物取18μL与3μL水混合以产生一混合物。将该混合物置于一96孔PCR盘(货号：P46-4TI-1000/C，4titude)。该第二扩增产物在96℃变性5分钟，再移入经预阻断处理(pre-blocked)的孔洞，各孔洞中预先点制一探针点阵列，包括分体探针的多个点、对照探针的9个点、及一锚定探针的10个点。该分体探针选自SEQ ID NO：32、33、35、36的序列(表2)。图5及图6显示不同探针在一个孔洞中的分布。目标-探针杂交是在50℃下伴随振荡进行15分钟。杂交后，将孔洞冷却并清洗两次。随后，将含有一链亲和素-碱性磷酸酶缀合物的一缓冲液添加到该孔洞中，使生物素-链亲和素得以交互作用，然后加入该碱性磷酸酶的一受质，以便有色产物在探针-目标杂合体所在的位置生成。透过使用相机对孔洞拍照以及辨认有色斑点在该孔洞中的位置，便可确定一种特定杂交，其指示存在一种特定的NTRK融合。有色斑点的位置可以由一计算机进行分析。
实施例3
透过二步式PCR目标-探针杂交试验检测EGFRvIII突变
使用二步式PCR目标-探针杂交试验检测EGFRvIII突变。图3显示该试验的整体流程，其包括以下步骤：从一样本中获得RNA，对该RNA进行反转录以获得cDNA，使用一EGFRvIII突变特异性引物对透过PCR扩增该cDNA的EGFRvIII突变区(即目标cDNA)以获得该目标cDNA的第一扩增产物，使用一通用引物对透过PCR扩增该第一扩增产物以获得该目标cDNA的第二扩增产物，对该扩增的目标cDNA进行探针杂交，以及侦测探针结合产物。下面是该试验的一个例子。
RNA提取及反转录
依据制造商说明书利用RecoverAll总核酸分离套组(货号：AM1975，AmbientTechnologies)从一癌症患者的FFPE组织样本中提取DNA和RNA。使用SuperScriptcDNA合成套组(货号：11754050，Invitrogen)及随机六核苷酸引物(random hexanucleotideprimers)在42℃对100ng的总RNA进行反转录30至60分钟，由此获得10μL的cDNA产物。
使用EGFRvIII突变特异性引物对进行PCR扩增
本试验中使用的EGFRvIII突变特异性引物对中的每个引物被设计成具有两个片段。一个片段被称为选择性剪接特异性片段，用于结合EGFRvIII突变序列的5'端或3'端。该选择性剪接特异性片段可以具有SEQ ID NO：62或63的序列(表8)。另一个片段被称为通用片段，其具有将在第二轮PCR中使用的通用引物的核苷酸序列。该通用片段相对于该选择性剪接特异性段总是位在上游或在5'的位置。该通用引物可以是表5中所列的任一引物，表5中的每个通用引物都可以用作通用正向引物或通用反向引物。
表8
进行选择性剪切特异性PCR时，依据制造商说明书使用多重PCR套组(货号：206143，Qiagen)，在VeritiTM 96孔热循环仪(Thermo Fisher Scientific)上对cDNA产物进行15-30个热循环的扩增，产出10μL的第一扩增产物。
使用通用引物对进行PCR扩增
由于每个突变特异性引物在5'端包含一通用引物的核苷酸序列，可以使用一通用引物对透过PCR进一步扩增该第一扩增产物。该通用引物对包含具有选自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用正向引物，以及具有选自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用反向引物。该通用反向引物经过生物素修饰。进行第二轮PCR时，将该第一扩增产物稀释100倍于最终反应混合物中，并且依据制造商说明书使用Platinum SuperFi IIPCR预混液(PlatinumSuperFi IIPCR Master Mix；CatNo：12368010，Invitrogen)在VeritiTM 96孔热循环仪(Thermo Fisher Scientific)上对该第一扩增产物进行扩增15-30个热循环，由此得到10μL的第二扩增产物。
探针杂交及讯号侦测
将该第二扩增产物置于一96孔PCR盘(货号：P46-4TI-1000/C，4titude)。该第二扩增产物在96℃变性5分钟，再移入经预阻断处理的孔洞，各孔洞中预先点制一探针点阵列，包括分体探针的117个点、对照探针的9个点、及一锚定探针的10个点(图4)。该分体探针(如表1所示)被设计为与表9所列的序列结合。目标-探针杂交在50℃下伴随振荡进行15分钟。杂交后，将孔洞冷却并清洗两次。随后，将含有一链亲和素-碱性磷酸酶缀合物的一缓冲液添加到该孔洞中，使生物素-链亲和素得以交互作用，然后加入该碱性磷酸酶的一受质，以便有色产物在探针-目标杂合体所在的位置生成。透过使用相机对孔洞拍照以及辨认有色斑点在该孔洞中的位置，便可确定一种特定杂交，其指示存在EGFRvIII突变。有色斑点的位置可以由一计算机进行分析。
表9
实施例4
以二步式PCR目标-探针杂交试验检验基因融合检测的分析灵敏度
进行分析前，基于NTRK基因的RNA转录本中的融合区的核苷酸序列设计了靶向NTRK融合的分裂探针。为了检验基因融合检测的分析灵敏度，合成了多个DNA模板，其包含已知的NTRK融合类型或先前未被报导的NTRK融合类型(例如表1、表2、表10所示的融合类型)。涉及已知NTRK融合类型的合成DNA模板共有165个，涉及新的NTRK融合类型的合成DNA模板有50个。每个模板都被稀释成1000份，以检查各探针的灵敏度。依据各探针的检测范围，探针讯号必须高于其本身讯号阈值才能达到一定的分析灵敏度。对于已知的NTRK融合类型(如图7所示)(共165个)，资料显示85％的NTRK融合转录本(141个)在1000份时具有灵敏度。对于新颖的NTRK融合类型(如图8所示)，资料显示98％的NTRK融合转录本(49个)在1000份时具有灵敏度。
表10
实施例5
以二步式PCR目标-探针杂交试验进行基因融合检测的临床样本验证
为了验证资料分析算法，利用ACT融合套组(ACTFusionpanel；ACT Genomics Co.,LTD)在次世代定序(NGS)平台上分析38个源自临床FFPE样本的RNA样本。经过资料分析，在共计38个甲状腺癌FFPE样本中只有一个样本是NTRK融合阳性，其含有ETV6-NTRK3融合。NTRK融合分体探针检测的结果如表11所示。此结果与使用ACT融合套组的次世代定序结果一致。ACT融合套组说明书中的NGS检测结果如表12所示。其余37个甲状腺癌FFPE样本为NTRK融合阴性，该些样本在NGS检测中也呈阴性。此结果说明就该38个临床FFPE样本而言，ACT融合套组与分体探针检测的一致性为100％。表13显示分体探针芯片检测的效能资料，其计算自样品为NTRK融合阳性或阴性的结果。
表11
表12
样本编号 融合转录本 比对至目标的序列读数 比对至目标的保守序列读数
1 ETV6-NTRK3.E4N14 22042 1785
表13
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特异度＝100.00％(95％信赖区间：90.51％-100.00％)
准确度＝100.00％(95％信赖区间：90.75％-100.00％)
阳性一致率(PPA)＝100％(95％信赖区间：2.5％-100.00％)
阳性预测值(PPV)＝100.00％(95％信赖区间：2.5％-100.00％)
实施例6
以二步式PCR目标-探针杂交试验检测BCR-ABL35INS突变
使用二步式PCR目标-探针杂交试验来检测BCR-ABL35INS突变。该试验包括与前述实施例相同的步骤，即从一样本中获得RNA，对该RNA进行反转录以获得cDNA，使用BCR-ABL35INS突变特异性引物对透过PCR扩增该cDNA的BCR-ABL35INS突变区(即目标cDNA)以获得该目标cDNA的第一扩增产物，使用一通用引物对透过PCR扩增该第一个扩增产物以获得该目标cDNA的第二扩增产物，对该扩增的目标cDNA进行探针杂交， 以及侦测探针结合产物。
使用BCR-ABL35INS突变特异性引物对和通用引物对进行PCR扩增
本试验中使用的BCR-ABL35INS突变特异性引物对中的每个引物被设计成具有两个片段。一个片段被称为选择性剪接特异性片段，用于结合BCR-ABL35INS突变序列的5'端或3'端。该选择性剪接特异性片段可以具有SEQ ID NO：67或68的序列(表14)。另一个片段被称为通用片段，其具有将在第二轮PCR中使用的通用引物的核苷酸序列。进行选择性剪切特异性PCR时，依据制造商说明书扩增cDNA产物，产出第一扩增产物及第二扩增产物。
表14
探针杂交及讯号侦测
将该第二扩增产物在96℃变性5分钟，再移入经预阻断处理的孔洞，各孔洞中印有一探针点阵列，包括分体探针的点(如表1所示)、对照探针的点、以及锚定探针的点。该分体探针被设计成与表15所列的序列结合。目标-探针杂交及讯号侦测皆依据先前的说明进行。
BCR-ABL35INS突变及扩增方法先前已有报导(Yuda,Junichiro,et al."Persistentdetection ofalternatively spliced BCR-ABL variant results in a failure toachieve deep molecular response."Cancer science 108.11(2017):2204-2212.)，其内容透过引用并入本文。
由于BCR-ABL选择性剪接事件在mRNA层次会造成多种剪接形式的混合，目前已知检测方法的运作可靠性往往受限于某一设计点。该些方法的共通点是它们被设计成一次探测一种剪接异构体，但分体探针检测法却可用于一次探测数种剪接异构体(如BCR-ABL或BCR-ABL35INS)，并且透过讯号分析还能一次识别多种剪接形式。分体探针检测法的效率会提高是因为同一探针可以使用于多种剪接类型。
分体探针检测法作为一种探测系统具备多种优势，包括高精确度和准确度、可报告广泛范围的新突变组合、成本低、及基因操作容易进行。
表15
/>
序列表
<110> 行动基因(智财)有限公司
<120> DNA片段接合检测方法及套组
<130> PCT/US2022/016877
<150> 63/150,095
<151> 2021-02-17
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABL(外显子2)
<400> 1
gcggccagta gcatctgact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ABL(內含子8)
<400> 2
tgataaccgt gaagaaagaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AFAP1(外显子4)
<400> 3
ctccggaata catcacatca 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALK(外显子20)
<400> 4
tgtaccgccg gaagcaccag gagc 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AR(外显子3)
<400> 5
gcaattgcaa gcatctca 18
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AR(外显子4)
<400> 6
aggaaaaatt gtccatcttg tcgtcttcgg aaa 33
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AXL(外显子20)
<400> 7
tacagagtgt ggactctggt gcctccaga 29
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BAG4(外显子2)
<400> 8
catatcctgt aagaccagaa 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR(外显子14)
<400> 9
gccactggat ttaagcagag ttcaa 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BICC1(外显子2)
<400> 10
tgctgctgaa gggaaaggca gaagt 25
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCDC6(外显子1)
<400> 11
gaaccgcgac ctgcgcaaag ccagcgtga 29
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR(外显子1)
<400> 12
gtcgggctct ggaggaaaag aaag 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR(外显子8)
<400> 13
gtaattatgt ggtgacagat 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EML4(外显子13)
<400> 14
cacctgggaa aggacctaa 19
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGFR1(外显子6)
<400> 15
actctgtggt gccctctgac aagggcaac 29
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGFR2(外显子10)
<400> 16
ttacagcttc cccagactac ctgg 24
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGFR2(外显子17)
<400> 17
attctcactc tcacaacc 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGFR2(外显子8)
<400> 18
accagtctgc ctggctca 18
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGFR3(外显子17)
<400> 19
tgtccttacc gtgacgtcca ccga 24
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MBIP(外显子4)
<400> 20
aagctgaaat caatgaaaac aacgtcaggg a 31
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET(外显子13)
<400> 21
tgtggctgaa aaagagaaag caaattaaag 30
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET(外显子15)
<400> 22
atcagtttcc taattcatct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK1(外显子10)
<400> 23
acagcacatc tggagacccg 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDGFRA(外显子2)
<400> 24
tttcccagag ctatggggac tt 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPL(外显子22)
<400> 25
aataaacctg gtggctggag 20
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RET(外显子12)
<400> 26
aagtgggaat tccctcggaa ga 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1(外显子32)
<400> 27
tcccaaatta ctagaaggga 20
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCAF11(外显子1)
<400> 28
cctcgacctc ggtctga 17
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC34A2(外显子4)
<400> 29
tcgtgtgctc cctggatatt ctta 24
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TACC3(外显子8)
<400> 30
agtcggcctt gaggaagca 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK
<400> 31
gggagaatag caggtcccgt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ETV6(外显子5)
<400> 32
cgccatgccc attgggagaa 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK3(外显子14)
<400> 33
gtcccgtggc tgtcatcagt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK
<400> 34
tggtgtatta ggcccagcct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QKI(外显子6)
<400> 35
tatcctattg aacctagtgg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK2(外显子16)
<400> 36
gcccagcctc cgttatcagc 20
<210> 37
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET-MET选择性剪切
<400> 37
tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat 60
ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca atatcaacag cactgttatt actacttggg 120
tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa attaaagatc agtttcctaa ttcatctcag 180
aacggttcat gccgacaagt gcagtatcct ctgacagaca tgtcccccat cctaactagt 240
ggggactctg atatatccag tccattactg caaaatactg tccacattga cctcagtgct 300
ctaaatccag agctggtcca ggc 323
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET-MET选择性剪切正向引物
<400> 38
aagagaaagc aaattaaaga tcagtt 26
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MET-MET选择性剪切反向引物
<400> 39
ctgtcagagg atactgcac 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U01
<400> 40
gttttcccag tcacgacgt 19
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U02
<400> 41
gcaaatggca ttctgacatc c 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U03
<400> 42
gcggataaca atttcacaca gg 22
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U04
<400> 43
cgtccatgcc gagagtg 17
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U05
<400> 44
ctttatgttt ttggcgtctt cca 23
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U06
<400> 45
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U07
<400> 46
gcgtgaatgt aagcgtgac 19
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U08
<400> 47
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U09
<400> 48
aagggtcttg cgaaggatag 20
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 通用引物No. U10
<400> 49
gggttatgct agttattgct cag 23
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ETV6-NTRK3融合正向引物
<400> 50
ccacatcatg gtctctgtct 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ETV6-NTRK3融合反向引物
<400> 51
tggttgatgt ggtgcag 17
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK1融合正向引物
<400> 52
acagcagcca ccatataca 19
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK1融合反向引物
<400> 53
agaccccaaa aggtgtt 17
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK1融合正向引物
<400> 54
atcctttaaa aaaccaagat gaaatcaata 30
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK1融合反向引物
<400> 55
gagaagggga tgcacca 17
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPM3-NTRK1融合正向引物
<400> 56
gacccgtgct gagtttg 17
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPM3-NTRK1融合反向引物
<400> 57
aaatgcaggg acatggc 17
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ETV6-NTRK2融合正向引物
<400> 58
ttccaccctg gaaactctat ac 22
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ETV6-NTRK2融合反向引物
<400> 59
cattggagat gtgatggagt g 21
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK3融合正向引物
<400> 60
acagcagcca ccatataca 19
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFG-NTRK3融合反向引物
<400> 61
ctcgatgcag tgctcca 17
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIII突變特異性正向引物
<400> 62
gggctctgga ggaaaagaa 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRvIII突變特異性反向引物
<400> 63
tccatctcat agctgtcgg 19
<210> 64
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR-EGFR选择性剪切
<400> 64
ccacctcgtc ggcgtccgcc cgagtccccg cctcgccgcc aacgccacaa ccaccgcgca 60
cggccccctg actccgtcca gtattgatcg ggagagccgg agcgagctct tcggggagca 120
gcgatgcgac cctccgggac ggccggggca gcgctcctgg cgctgctggc tgcgctctgc 180
ccggcgagtc gggctctgga ggaaaagaaa ggtaattatg tggtgacaga tcacggctcg 240
tgcgtccgag cctgtggggc cgacagctat gagatggagg aagacggcgt ccgcaagtgt 300
aagaagtgcg aagggccttg ccgcaaag 328
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPL(外显子22)探针序列
<400> 65
aataaacctg gtggctggag 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTRK3(外显子14)探针序列
<400> 66
gtcatcagtg gtgaggagga 20
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR-ABL35INS突变特异性正向引物
<400> 67
agatgctgac caactcg 17
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR-ABL35INS突变特异性反向引物
<400> 68
acaatgttcc aggaatccag 20
<210> 69
<211> 1454
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BCR-ABL选择性剪切(BCR-ABL35INS)
<400> 69
atgatgagtc tccggggctc tatgggtttc tgaatgtcat cgtccactca gccactggat 60
ttaagcagag ttcaaaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc 120
tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct cgctggaccc agtgaaaatg 180
accccaacct tttcgttgca ctgtatgatt ttgtggccag tggagataac actctaagca 240
taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca caatggggaa tggtgtgaag 300
cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta catcacgcca gtcaacagtc 360
tggagaaaca ctcctggtac catgggcctg tgtcccgcaa tgccgctgag tatctgctga 420
gcagcgggat caatggcagc ttcttggtgc gtgagagtga gagcagtcct ggccagaggt 480
ccatctcgct gagatacgaa gggagggtgt accattacag gatcaacact gcttctgatg 540
gcaagctcta cgtctcctcc gagagccgct tcaacaccct ggccgagttg gttcatcatc 600
attcaacggt ggccgacggg ctcatcacca cgctccatta tccagcccca aagcgcaaca 660
agcccactgt ctatggtgtg tcccccaact acgacaagtg ggagatggaa cgcacggaca 720
tcaccatgaa gcacaagctg ggcgggggcc agtacgggga ggtgtacgag ggcgtgtgga 780
agaaatacag cctgacggtg gccgtgaaga ccttgaagga ggacaccatg gaggtggaag 840
agttcttgaa agaagctgca gtcatgaaag agatcaaaca ccctaacctg gtgcagctcc 900
ttggggtctg cacccgggag cccccgttct atatcatcac tgagttcatg acctacggga 960
acctcctgga ctacctgagg gagtgcaacc ggcaggaggt gaacgccgtg gtgctgctgt 1020
acatggccac tcagatctcg tcagccatgg agtacctgga gaagaaaaac ttcatccaca 1080
gagatcttgc tgcccgaaac tgcctggtag gggagaacca cttggtgaag gtagctgatt 1140
ttggcctgag caggttgatg acaggggaca cctacacagc ccatgctgga gccaagttcc 1200
ccatcaaatg gactgcaccc gagagcctgg cctacaacaa gttctccatc aagtccgacg 1260
tctgggcatt tggagtattg ctttgggaaa ttgctaccta tggcatgtcc ccttacccgg 1320
gaattgacct gtcccaggtg tatgagctgc tagagaagga ctaccgcatg gagcgcccag 1380
aaggctgccc agagaaggtc tatgaactca tgcgagcata ctttgataac cgtgaagaaa 1440
gaacaagata gaag 1454

Claims (64)

1.一种检测DNA片段接合事件的方法，其特征在于，包含：
(a)从一样本中获取一DNA或由提取的RNA获得一DNA；
(b)使用一寡核苷酸组扩增所述DNA，以获得一目标核酸；
(c)使用一分体探针探测所述目标核酸，包含：
(i)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的3'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的5'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中所述目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的间隙在0-80bp的范围内；或
(ii)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的5'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的3'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中所述目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的间隙在0-80bp的范围内；以及
(d)侦测反映所述分体探针结合至所述目标核酸的一讯号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述寡核苷酸组为一基因特异性引物或一基因特异性探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中在步骤(b)中使用至少两对的一基因特异性引物进行多重PCR以扩增所述DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包含：
(e)测定
(i)所述伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或所述目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认所述第一分体探针结合至所述伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或所述第二分体探针结合至所述目标DNA片段的5'端的讯号；
(ii)所述伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或所述目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认所述第一分体探针结合至所述伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或所述第二分体探针结合至所述目标DNA片段的3'端的讯号；或
(iii)所述第三DNA片段是否与所述伙伴DNA片段及所述目标DNA片段接合，其透过确认所述第三分体探针结合至所述第三DNA片段的讯号及所述目标核酸的一独立PCR的结果。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其中至少两对的所述基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其中至少两对的所述基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其中至少一所述基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：其中所述基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述第一分体探针或所述第二分体探针靶向与一DNA片段接合边界相距0-40bp的一距离范围。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述第一分体探针选自由SEQ IDNO：32、35及其任一互补序列所组成的群组。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述第二分体探针选自由SEQ IDNO：33、36及其任一互补序列所组成的群组。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述第三分体探针选自由SEQ IDNO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述分体探针的长度为10-60bp。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中在步骤(c)中使用一分体探针及靶向一DNA片段接合边界的一单一探针探测所述目标核酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述伙伴DNA片段包含一伙伴基因的一序列，所述伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述目标DNA片段包含一目标基因的一序列，所述目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述伙伴DNA片段及所述目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，所述同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述DNA片段接合事件选自由ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、及ZNF710-NTRK3突变所组成的群组。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述第三DNA片段包含一伙伴基因或一目标基因的一序列。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中在步骤(b)中，首先使用一基因特异性引物以及随后使用一通用引物扩增所述DNA，以获得所述目标核酸。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述讯号选自由染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物所组成的群组。
22.一种识别选择性剪接事件的方法，其特征在于，包含：
(a)使用一分体探针探测一目标核酸，包含：
(i)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的3'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的5'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中所述目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；或
(ii)一第一分体探针是与一伙伴DNA片段的5'端互补，一第二分体探针是与一目标DNA片段的3'端互补，及/或一第三分体探针是与一第三DNA片段互补，其中所述目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；
(b)侦测反映所述分体探针结合至所述目标核酸的一讯号；
(c)测定
(i)所述伙伴DNA片段为一上游DNA片段及/或所述目标DNA片段为一下游DNA片段，其透过确认所述第一分体探针结合至所述伙伴DNA片段的3'端的讯号及/或所述第二分体探针结合至所述目标DNA片段的5'端的讯号；
(ii)所述伙伴DNA片段为一下游DNA片段及/或所述目标DNA片段为一上游DNA片段，其透过确认所述第一分体探针结合至所述伙伴DNA片段的5'端的讯号及/或所述第二分体探针结合至所述目标DNA片段的3'端的讯号；或
(iii)所述第三DNA片段是否与所述伙伴DNA片段及所述目标DNA片段接合，其透过确认所述第三分体探针结合至所述第三DNA片段的讯号；以及
(d)比较所述目标核酸的长度是否与一参考序列的长度相同。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述目标核酸使用一寡核苷酸组予以扩增。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述目标核酸使用至少两对的一基因特异性引物进行多重PCR而扩增。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：进一步包含(e)透过一独立的PCR再次确认。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：其中至少两对的所述基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：其中至少两对的所述基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
28.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：其中至少一所述基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
29.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：其中所述基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
30.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：其中多重PCR的产物随后使用一通用引物进行扩增以获得所述目标核酸。
31.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述第一分体探针的靶点及所述第二分体探针的靶点与所述DNA片段接合边界之间的一距离在0-40bp以内。
32.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述分体探针的长度为10-60bp。
33.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中在步骤(a)中使用一分体探针及靶向一DNA片段接合边界的一单一探针探测所述目标核酸。
34.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述伙伴DNA片段及所述目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，所述同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
35.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
36.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述第三DNA片段包含一伙伴基因或一目标基因的一序列。
37.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：其中所述讯号选自由染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物所组成的群组。
38.一种治疗一个体的方法，其特征在于，包含：
(a)测定一个体是否患有癌症或一基因型的风险，包含对来自所述个体的一样本依权利要求1所述的方法检测一DNA片段接合事件及/或依权利要求22所述的方法识别一选择性剪接事件；以及
(b)施予
(i)针对所述DNA片段接合事件及/或所述选择性剪接事件的治疗有效量的一siRNA；
(ii)针对由所述DNA片段接合事件及/或所述选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一抑制剂；
(iii)抑制由所述DNA片段接合事件及/或所述选择性剪接事件所编码的一融合蛋白的治疗有效量的一药剂；
(iv)治疗有效量的一抗癌剂，所述抗癌剂选自由细胞激素、细胞凋亡诱导剂、抗血管生成剂、化学治疗剂、放射治疗剂、及抗癌免疫毒素所组成的群组；或
(v)对所述个体的细胞提供一靶向性基因体编辑程序。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述DNA片段接合事件呈现一伙伴基因的一序列，所述伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
40.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述DNA片段接合事件呈现一目标基因的一序列，所述目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2所组成的群组。
41.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述选择性剪接事件呈现一同一基因的一不同序列，所述同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
42.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述DNA片段接合事件或所述选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
43.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述选择性剪接事件选自由组成性剪接、外显子跳跃、内含子保留、外显子互斥、及选择性5'端或3'端剪接位点所组成的群组。
44.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述癌症选自由上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、及骨髓瘤所组成的群组。
45.根据权利要求38所述的方法，其特征在于：其中所述癌症选自由脑癌、乳癌、结肠癌、内分泌腺体癌、食道癌、女性生殖器官癌、头颈癌、肝胆系统癌、肾癌、肺癌、间质细胞瘤、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、外分泌胰腺肿瘤、及泌尿系统癌所组成的群组。
46.一种用于检测一样本的DNA片段接合事件及/或选择性剪接事件的套组，其特征在于，包含：
(a)一寡核苷酸组；
(b)一分体探针，包含：
(i)与一伙伴DNA片段的3'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的5'端互补的一第二分体探针，及/或与一第三DNA片段互补的一第三分体探针，其中一目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；或
(ii)与一伙伴DNA片段的5'端互补的一第一分体探针，与一目标DNA片段的3'端互补的一第二分体探针，及/或与一第三DNA片段互补的一第三分体探针，其中一目标核酸上所述第一分体探针的靶点与所述第二分体探针的靶点之间的一间隙在0-80bp的范围内；以及
(c)用于检测一分体探针杂交讯号的一探针杂交试剂组，其包含染剂、化学发光染剂、荧光分子、放射性同位素、自旋标记、酶、半抗原、量子点、珠子、胺基己基化合物、及芘类化合物。
47.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述寡核苷酸组为一基因特异性引物或一基因特异性探针。
48.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述套组包含至少两对的一基因特异性引物。
49.根据权利要求48所述的套组，其特征在于：其中所述基因特异性引物被设计从作为一上游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
50.根据权利要求48所述的套组，其特征在于：其中所述基因特异性引物被设计从作为一下游DNA片段的所述伙伴DNA片段中获取所述目标核酸。
51.根据权利要求46所述的套组，其特征在于，进一步包含：一通用引物。
52.根据权利要求48所述的套组，其特征在于：其中至少一所述基因特异性引物靶向一DNA片段接合边界。
53.根据权利要求48所述的套组，其特征在于：其中所述基因特异性引物靶向与一DNA片段接合边界相距0-80bp的一距离范围。
54.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述第一分体探针或所述第二分体探针靶向与一DNA片段接合边界相距0-40bp的一距离范围。
55.根据权利要求46所述的套组，其中所述第一分体探针选自由SEQ ID NO：32、35及其任一互补序列所组成的群组。
56.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述第二分体探针选自由SEQ IDNO：33、36及其任一互补序列所组成的群组。
57.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述第三分体探针选自由SEQ IDNO：32、33、35、36及其任一互补序列所组成的群组。
58.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述分体探针的长度为10-60bp。
59.根据权利要求46所述的套组，其特征在于，进一步包含：靶向一DNA片段接合边界的一单一探针。
60.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中与所述第一分体探针互补的所述伙伴DNA片段包含一伙伴基因的一序列，所述伙伴基因选自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所组成的群组。
61.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中与所述第二分体探针互补的所述目标DNA片段包含一目标基因的一序列，所述目标基因选自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所组成的群组。
62.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中与所述第一分体探针互补的所述伙伴DNA片段及与所述第二分体探针互补的所述目标DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，所述同一基因选自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所组成的群组。
63.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中所述DNA片段接合事件或所述选择性剪接事件为BCR-ABL突变。
64.根据权利要求46所述的套组，其特征在于：其中与所述第三分体探针互补的所述第三DNA片段包含一伙伴基因或一目标基因的一序列。
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