TW202242136A - Dna片段接合檢測方法及套組 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及分子診斷學及基因體學的方法及套組的領域。更具體而言，本發明係關於一種檢測DNA片段接合事件或識別選擇性剪接事件的方法及套組。本發明亦涉及一種透過測定患有一特定癌症類型或基因型的風險的步驟，施予一個體適當治療的方法。

Description

DNA片段接合檢測方法及套組
本申請案主張2021年2月17日提出的美國臨時申請案第63/150,095號的優先權，其全部內容透過引用併入本文。
本發明涉及分子診斷學及基因體學的方法及套組的領域。更具體而言，本發明係關於一種檢測去氧核醣核酸(DNA)片段接合事件或識別選擇性剪接(alternative splicing)事件的方法及套組。本發明亦涉及一種透過測定患有一特定癌症類型或基因型的風險的步驟，施予一個體適當治療的方法。
在遺傳學中，出現在DNA片段接合(DNA fragment joining)中的DNA重排(rearrangement)、易位(translocation)、縱排重複(tandem repeat)、倒置(inversion)、插入(insertion)、缺失(deletion)或其他嵌合變異，通常是疾病的同義詞。在我們的器官細胞中，這些類型的DNA損傷已被證實是遺傳疾病或癌症的起點；因此，檢測DNA片段接合可用於篩檢潛在的健康異常或疾病。然而，這對於精准醫療來說仍遠不足夠。
組成性剪接(constitutive splicing)係在核醣核酸(RNA)的剪接過程中將內含子(intron)去除及將外顯子(exon)連接起來。選擇性剪接(alternative splicing)則包含了偏離正常的剪接，其中外顯子被跳過(skipped)、內含子被保留(retained)、外顯子相互排斥(exclusive)、或者在成熟的訊息核醣核酸(mRNA)中保留了選擇性5'端剪接位點(alternative 5′ splice sites)或選擇性3'端剪接位點(alternative 5′ splice sites)。近來，選擇性剪接因其在基因表現中的作用及其與疾病的關聯而受到關注。例如，在原發癌細胞的細胞質中可以檢測到許多內含子保留，並且可以關聯至癌細胞轉錄組(transcriptomes)的多樣性。
DNA片段接合及選擇性剪接事件會影響生成的蛋白質，而且可能顯著影響疾病風險、疾病進展、以及藥物反應。對DNA片段接合進行檢測或對選擇性剪接之基因變異予以識別可作為診斷標記，且其對後續涉及基因相關疾病的標靶治療可能很重要，畢竟選擇性基因剪接與癌症耐藥性之間的相關性已經被證實，如以下文獻所述：Wang, Bi-Dar and Norman H. Lee. “Aberrant RNA splicing in cancer and drug resistance.” Cancers10.11 (2018): 458，其內容透過引用併入本文。
透過生物資訊分析可以識別DNA片段接合事件或特定的選擇性剪接事件，該分析包括次世代定序(next-generation sequencing，NGS)、免疫組織化學染色法(immunohistochemistry，IHC)、螢光原位雜交(fluorescent in situ hybridization， FISH)，以及即時定量聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)、微陣列(microarrays)或RNAseq資料分析。儘管次世代定序提供了包含細節的全面資訊，但它不僅費用高、耗時長，而且需要較多的樣本，因此限制了其臨床應用。免疫組織化學染色法可以檢測到蛋白質的生成，但要分辨基因型突變和表型變異之間的關聯是有困難的。螢光原位雜交可以檢測基因融合，但需要單獨的反應來檢測每一種融合類型，還需要訓練有素的專家來分析結果。因此，新穎、更為準確且全面的檢測DNA片段接合類型及預測基因型的方法實有其需要，特別是檢測已被發現與疾病特徵相關的mRNA剪接缺陷。
本發明提供一種檢測DNA片段接合事件的方法。該方法包含以下步驟： (a) 自一樣本中獲取一DNA或由提取的RNA獲得一DNA； (b) 使用一寡核苷酸(oligonucleotides)組擴增該DNA，以獲得一目標核酸； (c) 使用一分體探針(split probe)探測該目標核酸，包含： (i) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段(partner DNA fragment)的3'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的5'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；或 (ii) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的5'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的3'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；以及 (d) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號。
依據上述，該寡核苷酸組係為一基因特異性引子(gene-specific primer)或一基因特異性探針(gene-specific probe)。
依據上述，在步驟(b)中使用至少二對的一基因特異性引子進行多重PCR (multiplex PCR)以擴增該DNA。
依據上述，該方法進一步包含一測定步驟，係測定 (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段是否與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號及該目標核酸的一獨立PCR的結果。
依據上述，至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段(upstream DNA fragment)的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段(downstream DNA fragment)的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
依據上述，該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
依據上述，該第一分體探針或該第二分體探針係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-40 bp的一距離範圍。
依據上述，該第一分體探針係選自由SEQ ID NO：32、35及其任一互補序列所組成的群組。
依據上述，該第二分體探針係選自由SEQ ID NO：33、36及其任一互補序列所組成的群組。
依據上述，該第三分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。
依據上述，該分體探針的長度為10-60 bp。
依據上述，在該方法的步驟(c)中使用一分體探針及靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針去探測該目標核酸。
依據上述，該夥伴DNA片段包含一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
依據上述，該目標DNA片段包含一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組。
依據上述，該夥伴DNA片段及該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR (例如ARV7)、BCL2L1、類BCL2 11 (BCL2-Like 11，亦稱BIM 或BCL2L11)、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2 (CASP-2)、CD19、CD44、CXCR3、周期蛋白D1 (Cyclin D1，亦稱CCND1)、DMP1、CDH1、EGFR (例如EGFRvIII)、ER (例如ESR1或ESR2)、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS (H-RAS)、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
依據上述，該DNA片段接合事件係選自由ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、 FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、及 ZNF710-NTRK3突變所組成的群組。
依據上述，該第三DNA片段包含一夥伴基因或一目標基因的一序列。
依據上述，在該方法的步驟(b)中，首先使用該基因特異性引子以及隨後使用一通用引子(universal primer)擴增該DNA，以獲得該目標核酸。
依據上述，該訊號係選自由染劑(dyes)、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記(spin labels)、酶、半抗原(haptens)、量子點(quantum dots)、珠子、胺基己基化合物(aminohexyls)、及芘類化合物(pyrenes)所組成的群組。
另一方面，本發明提供一種識別選擇性剪接事件的方法。該方法包含以下步驟： (a)  使用一分體探針探測一目標核酸，包含： (b) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號； (c)  測定 (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段是否與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號；以及 (d) 比較該目標核酸的長度是否與組成性剪切的一參考序列的長度相同。
依據上述，該目標核酸係使用一寡核苷酸組予以擴增。
依據上述，該目標核酸係使用至少二對的一基因特異性引子進行多重PCR而擴增。
依據上述，該方法進一步包含透過一獨立的PCR再次確認之步驟(e)。
依據上述，至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，至少一該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
依據上述，該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
依據上述，多重PCR的產物隨後係使用一通用引子予以擴增以獲得該目標核酸。
依據上述，該第一分體探針的靶點及該第二分體探針的靶點與該DNA片段接合邊界之間的一距離係在0-40 bp以內。
依據上述，該分體探針的長度為10-60 bp。
依據上述，在該方法的步驟(a)中使用一分體探針及靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針探測該目標核酸。
依據上述，該夥伴DNA片段及該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
依據上述，該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
依據上述，該第三DNA片段包含一夥伴基因或一目標基因的一序列。
依據上述，該訊號係選自由染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物所組成的群組。
另一方面，本發明亦提供一種治療一個體的方法。該方法包含以下步驟： (a) 測定一個體是否患有癌症或一基因型的風險，包含對來自該個體的一樣本依前述段落所述方法檢測一DNA片段接合事件及/或依前述段落所述方法識別一選擇性剪接事件；以及 (b) 施予 (i) 針對該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件的治療有效量的一siRNA； (ii) 針對由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一抑制劑； (iii) 抑制由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一藥劑； (iv) 治療有效量的一抗癌劑，該抗癌劑係選自由細胞激素(cytokines)、細胞凋亡誘導劑(apoptosis-inducing agents)、抗血管生成劑(anti-angiogenic agents)、化學治療劑(chemotherapeutic agents)、放射治療劑(radio-therapeutic agents)、及抗癌免疫毒素(anticancer immunotoxins)所組成的群組；或 (v) 對該個體的細胞提供一靶向性基因體編輯程序。
依據上述，該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件呈現一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
依據上述，該DNA片段接合事件呈現一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2所組成的群組。
依據上述，該選擇性剪接事件呈現一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
依據上述，該DNA片段接合事件或該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
依據上述，該選擇性剪接事件係選自由組成性剪接、外顯子跳躍(exon skipping)、內含子保留(intron retention)、外顯子互斥(mutually exclusive exons)、及選擇性5'端或3'端剪接位點(alternative 5' or 3' splice sites)所組成的群組。
依據上述，該癌症係選自由上皮癌(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphoma)、白血病(leukemia)、及骨髓瘤(myeloma)所組成的群組。
依據上述，該癌症係選自由腦癌(brain cancer)、乳癌(breast cancer)、結腸癌(colon cancer)、內分泌腺體癌(endocrine gland cancer)、食道癌(esophageal cancer)、女性生殖器官癌(female reproductive organ cancer)、頭頸癌(head and neck cancer)、肝膽系統癌(hepatobiliary system cancer)、腎癌(kidney cancer)、肺癌(lung cancer)、間質細胞瘤(mesenchymal cell neoplasm)、前列腺癌(prostate cancer)、皮膚癌(skin cancer)、胃癌(stomach cancer)、外分泌胰腺腫瘤(tumor of the exocrine pancreas)、及泌尿系統癌(urinary system cancer)所組成的群組。
另一方面，本發明亦提供一種用於檢測一樣本的DNA片段接合事件及/或選擇性剪接事件的套組。該套組包含： (a) 一寡核苷酸組； (b) 一分體探針，包含： (i) 與一夥伴DNA片段的3'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的5'端互補的一第二分體探針，及/或與一第三DNA片段互補的一第三分體探針，其中一目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；或 (ii) 與一夥伴DNA片段的5'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的3'端互補的一第二分體探針，及/或與一第三DNA片段互補的一第三分體探針，其中一目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；以及 (c) 用於檢測一分體探針雜交訊號的一探針雜交試劑組，其包含染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物。
依據上述，該寡核苷酸組係為一基因特異性引子或一基因特異性探針。
依據上述，該套組包含至少二對的一基因特異性引子。
依據上述，該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
依據上述，該套組進一步包含一通用引子。
依據上述，至少一該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
依據上述，該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
依據上述，該第一分體探針或該第二分體探針係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-40 bp的一距離範圍。
依據上述，該第一分體探針係選自由SEQ ID NO：32、35及其任一互補序列所組成的群組。
依據上述，該第二分體探針係選自由SEQ ID NO：33、36及其任一互補序列所組成的群組。
依據上述，該第三分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。
另一方面，本發明提供的套組包含長度為10-60 bp的分體探針。
依據上述，該套組進一步包含靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針。
依據上述，該第一分體探針係與一夥伴基因的一序列互補，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
依據上述，該第二分體探針係與一目標基因的一序列互補，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組。
依據上述，與該第一分體探針互補的該夥伴DNA片段及與該第二分體探針互補的該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
依據上述，該DNA片段接合事件或該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
依據上述，與該第三分體探針互補的該第三DNA片段具有一夥伴基因或一目標基因的一序列。
除非另有定義，本文中使用的所有技術及科學術語的含義與本揭露所屬技術領域中熟習技藝者通常理解的含義相同。
定義
除非上下文另有指示，本文中所使用的單數形式「一」、「一種」及「該」包含複數指稱。
術語「DNA片段接合(DNA fragment joining)」係指透過DNA片段的斷裂和重新連接而發生的DNA的重排(rearrangement)、易位(translocation)、縱排重複(tandem repeat)、倒置(inversion)、插入(insertion)、缺失(deletion)或其他嵌合變異。DNA片段接合發生時，一雜合DNA (hybrid DNA)片段會由二個或更多個在正常情況下分離的DNA片段產生。術語「DNA片段接合」亦指從依循選擇性剪接途徑的mRNA合成cDNA產物之時。
術語「選擇性剪接(alternative splicing)」係指一初級轉錄本(primary transcript)可以剪接成一種以上的mRNA異構體的事件。現今已公開的選擇性剪接有不同類別，包含組成性剪接、外顯子跳躍、內含子保留、外顯子互斥、及選擇性5'端或3'端剪接位點。
術語「目標DNA片段」係指任何核酸分子、多核苷酸序列、或包含基因體DNA中特定基因或基因座(genetic locus)的一部分的任何片段。術語「夥伴DNA片段」係指其3'端或5'端序列與「目標DNA片段」的5'端或3'端序列連接的一片段。目標DNA片段或夥伴DNA片段包括一完整的基因、一外顯子或內含子、一個調節序列或基因之間的任何區域。位於雜合DNA片段的5'端的DNA片段被稱為「上游DNA片段」，而位於雜合DNA片段的3'端的DNA片段被稱為「下游DNA片段」。
雜合DNA片段具有「DNA片段接合邊界」，其係一個DNA片段與另一個DNA片段連接的區域。例如，夥伴DNA片段與目標DNA片段連接的區域、或夥伴DNA片段與另一DNA片段連接的區域、或融合接點(fusion junction)。二個或更多個特定DNA片段之間的連接進一步使DNA片段接合邊界更多樣化。
目標DNA片段和由特定基因序列組成的夥伴DNA片段有時候以異常的組合方式連接，導致基因融合(gene fusion)。術語「基因融合」係指一染色體上的一第一基因與相同或不同染色體上的一第二基因融合，從而形成一雜合基因或一融合基因的現象。這種現象通常也被稱為「基因易位」或「基因重排」。例如，當一NTRK基因是多個被融合的基因之一時，此種基因融合被稱為「NTRK基因融合」或「NTRK融合」。
位於融合基因的5'端的基因被稱為「5'端基因」，而位於融合基因的3'端的基因被稱為「3'端基因」。融合基因具有一 「融合接點」，其係基因融合的部位。融合接點位於由一融合序列(亦稱為一融合接點序列)所定義的一融合區內，該序列包含來自5'基因的序列和來自3'基因的序列。融合基因的不同組合會造成不同的「融合類型」。二個特定基因之間的融合因融合接點而更為分歧，因為融合接點可能發生在融合基因的任何地方。例如，一第一基因的第一外顯子與一第二基因的第二外顯子之間的融合是一種融合類型，而該第一基因的第三外顯子與該第二基因的第一外顯子之間的融合是另一種融合類型。
基因融合可以透過識別一DNA或該DNA的一RNA轉錄本(RNA transcript)中的一融合接點來檢測。本文中所用的「融合類型」係指存在於RNA轉錄本中的獨特融合。換言之，當二個特定基因之間的融合發生在同一內含子區域的不同位點時，其被認為是同一種融合類型。例如，基因A的外顯子3和基因B的外顯子5之間的融合所具有的一DNA融合區可能包含基因A的外顯子3和4之間的內含子的一小部分和基因B的外顯子4和5之間的內含子的一大部分。或者，此融合所具有的一DNA融合區可能包含基因A的外顯子3和4之間的內含子的一大部分以及基因B的外顯子4和5之間的內含子的一小部分。前述二種融合雖然有不同的DNA融合接點，但被認為是同一 種「融合類型」，因為該二種融合產生的RNA轉錄本是相同的。
術語「一寡核苷酸組」係指一組合成的單股寡核苷酸，其可用於擴增欲定序的目標基因區。本文中所用術語「基因特異性引子(對)」、「MET突變特異性引子(對)」、「NTRK融合特異性引子(對)」或「EGFRvIII突變特異性引子(對)」係指一DNA引子(對)，其被設計用於擴增包含DNA片段接合邊界或融合接點的一目標DNA。本文中所用術語「基因特異性探針」係指與目標基因序列互補的一合成的寡核苷酸探針(作為餌)。
本文中所用術語「通用引子」係指一種DNA引子，其被設計用於擴增包含通用引子的核苷酸序列的任何DNA。通用引子為成對使用，包含一通用正向引子及一通用反向引子。
除非另有定義，術語「分體探針」係指二個或更多個合成的單股DNA寡核苷酸，其可以與源自夥伴DNA片段與目標DNA片段及/或另一DNA片段的DNA片段接合區雜交。
本文中所述的基因各自對應至NCBI基因資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中所列的「基因名稱(或標記)」。因此，利用NCBI基因資料庫來識別一基因的序列或基因名稱的同義詞。
本揭露提供一種檢測DNA片段接合事件的方法。該方法包含以下步驟： (a)  自一樣本中獲取一DNA或由提取的RNA獲得一DNA； (b) 使用一寡核苷酸組擴增該DNA，以獲得一擴增的目標核酸； (c)  使用一分體探針探測該擴增的目標核酸，包含： (i) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的3'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的5'端互補，及/或一第三分體探針係與另一DNA片段互補，其中該擴增的目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內；或 (ii) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的5'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的3'端互補，及/或一第三分體探針係與另一DNA片段互補，其中該目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內；以及 (d) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號。
在一些實施例中，RNA係從一生物樣本製備而得。該生物樣本可以是從動物及人類個體獲得的任何樣本。生物樣本的例子包括福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)組織切片、外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)、血液、血漿、或其他細胞或體液。在一些實施例中，該生物樣本係來自於一癌症患者。在一些實施例中，該生物樣本係來自於上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、或骨髓瘤。在一些實施例中，該生物樣本係來源於患有腦癌、乳癌、結腸癌、內分泌腺體癌、食道癌、女性生殖器官癌、頭頸癌、肝膽系統癌、腎癌、肺癌、間質細胞瘤、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、外分泌胰腺腫瘤、或泌尿系統癌的患者。
從生物樣本製備總RNA (total RNA)係可透過本技術領域中已知的各種方法進行。一種典型的流程是使用有機溶劑(例如苯酚/氯仿)提取RNA並且透過離心將其沉澱。市面上亦可取得用於分離或純化RNA的套組。獲得RNA後，使用反轉錄酶(reverse transcriptase)與四種去氧核糖核苷三磷酸酯(deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)，包括dATP，dCTP，dTTP及dGTP)從模板RNA生成cDNA，此一過程稱為反轉錄。反轉錄之進行可以使用SuperScript cDNA合成套組(SuperScript cDNA synthesis kit；貨號：11754050，Invitrogen)。
在一些實施例中，本文揭露的方法進一步包含一測定步驟，係測定： (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段是否與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號及該目標核酸的一獨立PCR的結果。
本揭露提供一種檢測DNA片段接合事件的方法。該方法包含以下步驟： (a) 使用一分體探針探測一擴增的目標核酸，包含： (i) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的3'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的5'端互補，及/或一第三分體探針係與另一DNA片段互補，其中該目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內；或 (ii) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的5'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的3'端互補，及/或一第三分體探針係與另一DNA片段互補，其中該目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內； (b) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號； (c) 測定 (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號；以及 (d) 比較該目標核酸的長度是否與組成性剪切的一參考序列的長度相同。
在一些實施例中，該寡核苷酸組係為一基因特異性引子或一基因特異性探針。
在一些實施例中，該擴增的目標核酸係使用至少二對的該基因特異性引子進行多重PCR進行擴增。
在一些實施例中，前述段落所述的方法進一步包含透過一獨立的PCR (例如Sanger PCR或qPCR)再次確認的步驟。
在一些實施例中，使用DNA聚合酶及至少二對的一基因特異性引子擴增該DNA以獲得供探針檢測的一擴增的目標核酸。在一些實施例中，該基因特異性引子是一NTRK融合特異性引子、一MET突變特異性引子、或一EGFRvIII突變特異性引子。可使用含DNA聚合酶(DNA polymerase)的多重PCR套組(貨號：206143, Qiagen)進行擴增。該基因特異性引子在使用前可作為一試劑而提供。在一些實施例中，一NTRK融合特異性引子被用於擴增目標核酸。在一些實施例中，將二對或多對NTRK融合特異性引子彙集在一起以擴增各目標核酸。
在一些實施例中，將由NTRK融合特異性引子、MET突變特異性引子、及EGFRvIII突變特異性引子組成的二對或多對基因特異性引子彙集在一起以擴增各目標核酸。
在其他實施例中，該基因特異性引子被部分匯集以形成複數個匯集試劑，其中每一匯集試劑包含至少一對的該基因特異性引子。因此，匯集試劑的數量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多。在一些較佳實施例中，由四個匯集試劑提供超過一百對的NTRK融合特異性引子，以便用於四個多重擴增反應。以此種方式進行的DNA擴增相比將所有基因特異性引子用於進行單一個多重擴增反應，已被證實表現出明顯更高的效能，這可能是由於引子的複雜性減低。
在一些較佳實施例中，首先使用至少二對的NTRK融合特異性引子及隨後使用一通用引子擴增DNA，以獲得擴增的目標核酸。當本文所揭露方法利用了通用引子時，各基因特異性引子對中的基因特異性正向引子進一步包含該通用引子對中的通用正向引子的核苷酸序列，並且各基因特異性引子對中的基因特異性反向引子進一步包含該通用引子對中的通用反向引子的核苷酸序列。使用通用引子可以提高任何可能的擴增產物的最終產量，無論欲檢測的DNA片段為何或在第一輪擴增中使用了何種基因特異性引子。使用通用引子的另一項優點是，欲將引子修飾成為可偵測的引子時，只需要對二個甚至一個通用引子進行修飾，例如在一個通用引子和一個連結子(如生物素)之間形成連接，從而使一可偵測分子可以與通用引子相連。否則，所有基因特異性引子都需要經過修飾，這將使得引子修飾過程更為複雜且昂貴。
在一些較佳實施例中，將該擴增的目標核酸與該分體探針混合，以便透過核酸雜交生成一探針結合產物，其可反映該分體探針與該擴增的目標核酸之間的結合。
在一些實施例中，由於該分體探針是依據夥伴DNA片段、目標DNA片段、或第三DNA片段的特定序列方向而特別設計，藉由偵測來自一特定探針結合產物的第一分體探針、第二分體探針或第三分體探針的訊號，可以確定確切的DNA片段接合事件。
在一些實施例中，各該分體探針的長度為10-60 bp。在一些實施例中，該目標核酸的長度不超過200 bp。
在一些較佳實施例中，DNA之擴增係使用被設計從作為上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲得該目標核酸的至少二對的該基因特異性引子。
在一些較佳實施例中，DNA之擴增係使用被設計從作為下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲得該目標核酸的至少二對的該基因特異性引子。
在一些實施例中，可檢測的DNA片段接合包括但不限於樣本的重排、易位、縱排重複、倒置、插入、缺失或其他嵌合變異。
在一些實施例中，可檢測的基因突變包括但不限於一目標基因與一夥伴基因之間的融合，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
在一些實施例中，該夥伴DNA片段包含一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
在一些實施例中，該目標DNA片段包含一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組。
在一些實施例中，該第三DNA片段包含該夥伴基因或該目標基因的一序列。
在一些實施例中，可檢測的基因突變類型包括但不限於ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、 FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、或 ZNF710-NTRK3。
在一較佳實施例中，可檢測的NTRK基因融合類型包括TFG-NTRK1、ETV6-NTRK3、QKI-NTRK2、TPM3-NTRK1、ETV6-NTRK2、TFG-NTRK3、及NACC2-NTRK2。在另一較佳實施例中，可檢測的NTRK基因融合類型包括PDE4DIP-NTRK1、TRIM63-NTRK1、GON4L-NTRK1、及CTRC-NTRK1。
在一較佳實施例中，可檢測的DNA片段接合事件包括包含NTRK基因的該目標DNA片段為下游DNA片段，以及包含前述段落所述之夥伴基因的該夥伴DNA片段為上游DNA片段。
在一較佳實施例中，可檢測的DNA片段接合事件包括包含EGFR基因的該目標DNA片段為上游DNA片段，以及包含前述段落所述之夥伴基因的該夥伴DNA片段為下游DNA片段。
在一些實施例中，可檢測的選擇性剪接事件的基因突變包括但不限於AR (例如ARV7)、BCL2L1、類BCL2 11 (BCL2-Like 11，亦稱BIM 或BCL2L11)、BCOR、BCR-ABL、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2 (CASP-2)、CD19、CD44、CXCR3、周期蛋白D1 (Cyclin D1，亦稱CCND1)、DMP1、CDH1 (E-鈣黏蛋白(E-cadherin))、EGFR (例如EGFRvIII)、ER (例如ESR1或ESR2)、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS (H-RAS)、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB (例如RPS6KB1或RPS6KB2)、STAT3、TP53、TSC2、或VEGF。
在一些實施例中，該第一分體探針係互補於該夥伴DNA片段，且該夥伴DNA片段具有前述段落中描述之夥伴基因的一序列及其任何互補序列。在其他實施例中，該第二分體探針係互補於該目標DNA片段，且該目標DNA片段具有前述段落中描述之目標基因的一序列及其任何互補序列。在其他實施例中，該第三分體探針係互補於該第三DNA片段，且該第三DNA片段具有前述段落中描述之夥伴基因或目標基因的一序列及其任何互補序列。
表1列出了特別設計用於檢測特定DNA片段接合的分體探針。該些探針之任一者皆被設計為對DNA片段的標靶區域(例如目標基因或夥伴基因)具有特異性且能普遍用於不同的DNA片段類型，其使得探針的修飾過程更為容易，並且能準確地測定DNA片段接合事件。
表1
探針的標靶區域 探針序列 ( 由 5 ' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
ABL (外顯子2) GCGGCCAGTAGCATCTGACT 1
ABL (內含子8) TGATAACCGTGAAGAAAGAA 2
AFAP1 (外顯子4) CTCCGGAATACATCACATCA 3
ALK (外顯子20) TGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGC 4
AR (外顯子3) GCAATTGCAAGCATCTCA 5
AR (外顯子4) AGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAA 6
AXL (外顯子20) TACAGAGTGTGGACTCTGGTGCCTCCAGA 7
BAG4 (外顯子2) CATATCCTGTAAGACCAGAA 8
BCR (外顯子14) GCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAA 9
BICC1 (外顯子2) TGCTGCTGAAGGGAAAGGCAGAAGT 10
CCDC6 (外顯子1) GAACCGCGACCTGCGCAAAGCCAGCGTGA 11
EGFR (外顯子1) GTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAG 12
EGFR (外顯子8) GTAATTATGTGGTGACAGAT 13
EML4 (外顯子13) CACCTGGGAAAGGACCTAA 14
FGFR1 (外顯子6) ACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAAC 15
FGFR2 (外顯子10) TTACAGCTTCCCCAGACTACCTGG 16
FGFR2 (外顯子17) ATTCTCACTCTCACAACC 17
FGFR2 (外顯子8) ACCAGTCTGCCTGGCTCA 18
FGFR3 (外顯子17) TGTCCTTACCGTGACGTCCACCGA 19
MBIP (外顯子4) AAGCTGAAATCAATGAAAACAACGTCAGGGA 20
MET (外顯子13) TGTGGCTGAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAG 21
MET (外顯子15) ATCAGTTTCCTAATTCATCT 22
NTRK1 (外顯子10) ACAGCACATCTGGAGACCCG 23
PDGFRA (外顯子2) TTTCCCAGAGCTATGGGGACTT 24
PPL (外顯子22) AATAAACCTGGTGGCTGGAG 25
RET (外顯子12) AAGTGGGAATTCCCTCGGAAGA 26
ROS1 (外顯子32) TCCCAAATTACTAGAAGGGA 27
SCAF11 (外顯子1) CCTCGACCTCGGTCTGA 28
SLC34A2 (外顯子4) TCGTGTGCTCCCTGGATATTCTTA 29
TACC3 (外顯子8) AGTCGGCCTTGAGGAAGCA 30
在一些實施例中，進行NTRK基因融合之檢測時，係使用具有5'-GGGAGAATAGCAGGTCCCGT-3' (SEQ ID NO：31)或5'-TGGTGTATTAGG CCCAGCCT-3' (SEQ ID NO：34)任一序列的單一探針以及具有SEQ ID NO：32、33、35、36中任何一序列的分體探針，以便比較檢測靈敏度和特異性(參考表2、圖5及圖6)。
表2
探針的標靶區域 探針序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
ETV6 (外顯子5) CGCCATGCCCATTGGGAGAA 32
NTRK3 (外顯子14) GTCCCGTGGCTGTCATCAGT 33
QKI (外顯子6) TATCCTATTGAACCTAGTGG 35
NTRK2 (外顯子16) GCCCAGCCTCCGTTATCAGC 36
在一些實施例中，對一個目標核酸進行擴增及探測後，可檢測到一個DNA片段接合事件。在其他實施例中，具有不同序列的二個或更多個目標核酸在一次反應中被擴增(稱為多重擴增反應)及/或在一次反應中被探測(稱為多重雜交反應)後，多種NTRK融合類型可同時被檢測到。在一些實施例中，至少二組的該分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。該些探針可作為一個單一的匯集試劑提供，或作為複數個分開的試劑提供。
通常，探針及擴增產物係在一特定溫度下混合以促使探針雜交。探針雜交的最佳熱混合條件會隨探針序列而改變。因此，對於使用至少二種探針的多重反應，為所有探針選擇出一個合適的雜交條件非常困難。然而，透過使用表2所列的探針，多重反應可以在一固定溫度下配合固定搖動速度進行，因為該些探針被設計為能夠在相近的雜交條件下與各自的標靶雜交。在一些實施例中，雜交的溫度係介於35-50℃、40-50℃、40-45℃、或45-50℃之間。在一些實施例中，雜交係透過使用一熱混合器在介於700-1000 rpm、750-1000 rpm、800-1000 rpm、900-1000 rpm、700-750 rpm，700-800 rpm、750-800 rpm、或800-900 rpm之間的轉速下進行。
對前述探針結合產物之偵測可以透過檢測該產物中的基因特異性引子、通用引子或分體探針來達成。因此，該些引子或探針通常被修飾為可被偵測。透過將該些引子或探針直接或間接地與一可偵測分子相連，其可以被修飾為具有螢光或化學發光活性，或者成為可呈色或可比色。在一些實施例中，該引子對中的一個或二個引子係連接至生物素(biotin)或者其他化合物，其能夠與綴合至鏈親和素(streptavidin)且帶有訊號的一可偵測分子相結合。該可偵測訊號可以是染劑、化學發光染劑、螢光分子如藻紅蛋白(phycoerythrin ，PE)或花青類染劑(cyanines)、放射性同位素、自旋標記、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、芘類化合物、或用於呈色反應的酶，例如鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)或山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)。呈色反應中使用的酶在一呈色受質存在的情況下會催化有色化合物的生成。在一些實施例中，用於檢測特定NTRK融合類型的分體探針分別與各自的獨有識別元件相連，使得多種NTRK融合類型能被同時檢測，並且可將它們彼此區分。該獨有識別元件可以是具有一獨特序列的寡核苷酸，或者包含一獨特條碼(barcode)於其表面的微珠或奈米粒子。該條碼可以是一種幾何圖案，其可由配備一明視野成像系統的一光學掃描儀讀取。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子是一種磁性粒子。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子係由合成聚合物所製成。
該獨有識別元件可以直接或透過一連接子(linker)與探針相連。在一些實施例中，該獨有識別元件係透過直接的化學偶聯與探針相連，故在獨有識別元件與探針間形成一共價鍵。在一些實施例中，該獨有識別元件係透過一聚合物連接子與探針相連。在一些實施例中，該獨有識別元件係透過互補核苷酸序列之間的雜交連接至探針。
本文揭露的方法可以在能夠進行多重反應的數種技術平臺上執行，例如一微陣列板(microarray plate)、一基因晶片(gene chip)、微珠(microbeads)、奈米粒子(nanoparticles)、一膜片(membrane) 、或一微流體裝置(microfluidic device)。在一些實施例中，前述探針係固著於一微陣列板、一基因晶片或一膜片的不同位置上，例如呈一點陣列的形式，每一點包含複數個的一種探針。在其他實施例中，該探針係與微珠(如磁性微珠)相連接。在另一些實施例中，該探針係塗覆於一微流體裝置的一基板上，其中不同探針係位於該基板的不同區域內。
當探針係固著於一DNA微陣列板上時，該微陣列板可進一步包含一組對照點，每一對照點包含複數個的一種對照探針(control probe)。該對照探針會與持家基因(housekeeping gene)如β-肌動蛋白(beta-actin)、3-磷酸甘油酯脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、及β2-微球蛋白(beta 2-microglobulin)的DNA結合。因此，該對照點可以作為內部對照組來檢驗試驗的效能。此外，該微陣列板可以進一步包含一組錨定點，每一錨定點都包含複數個的一種錨點探針(anchor probe)。該錨定探針被設計為無關於擴增產物而可被檢測到。因此，該錨定點可以用作該微陣列板上錨定點鄰近之點的位置指標。
本文亦提供一種於治療一個體的方法。該方法包含以下步驟： (a) 測定一個體是否患有癌症或一基因型的風險，包含對來自該個體的一樣本依前述段落所述方法檢測一DNA片段接合事件及/或依前述段落所述方法識別一選擇性剪接事件；以及 (b) 施予 (i) 針對該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件的治療有效量的一siRNA； (ii) 針對由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一抑制劑； (iii) 抑制由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一藥劑； (iv) 治療有效量的一抗癌劑，該抗癌劑係選自由細胞激素、細胞凋亡誘導劑、抗血管生成劑、化學治療劑、放射治療劑、及抗癌免疫毒素所組成的群組；或 (v) 對該個體的細胞提供一靶向性基因體編輯程序。
在一些實施例中，該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件呈現出如前述段落所述之夥伴基因的一序列。在一些實施例中，該DNA片段連接事件及/或該選擇性剪接事件呈現出如前述段落所述之目標基因的一序列。
在一些實施例中，該選擇性剪接事件係選自由組成性剪接、外顯子跳躍、內含子保留、外顯子互斥、及選擇性5'端或3'端剪接位點所組成的群組。
在一些實施例中，所述癌症係選自由上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、及骨髓瘤所組成的群組。
在一些實施例中，該癌症係選自由腦癌、乳癌、結腸癌、內分泌腺體癌、食道癌、女性生殖器官癌、頭頸癌、肝膽系統癌、腎癌、肺癌、間質細胞瘤、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、外分泌胰腺腫瘤、及泌尿系統癌所組成的群組。
在一些實施例中，當在來自一癌症患者(個體)的一樣本中檢測到NTRK基因融合(DNA 片段接合)時，可以預期該患者對一TRK抑制劑有反應，特別是對一NTRK抑制劑，例如拉羅特雷替尼(larotrectinib)、恩曲替尼(entrectinib)、 LOXO-195或TPX-0005。
在一些實施例中，前述段落中揭露的方法可用於對RNA剪接相關疾病或癌症疾病的過程或治療的前瞻性分析(參見例如，Scotti, M., Swanson, M. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet17, 19-32 (2016)；Kim, H.K., Pham, M.H.C., Ko, K.S. et al. Alternative splicing isoforms in health and disease. Pflugers Arch - Eur J Physiol470, 995-1016 (2018)；Wang, E., & Aifantis, I. RNA Splicing and Cancer. Trends in Cancer6, 631-644 (2020)，前述文獻內容透過引用併入本文)。
本文亦提供一種用於檢測一樣本的DNA片段接合事件及/或選擇性剪接事件的套組。該套組包含： (a) 一寡核苷酸組； (b) 一分體探針，包含： (i) 與一夥伴DNA片段的3'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的5'端互補的一第二分體探針，及/或與另一DNA片段互補的一第三分體探針，其中一擴增的目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內；或 (ii) 與一夥伴DNA片段的5'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的3'端互補的一第二分體探針，及/或與一第三DNA片段互補的一第三分體探針，其中一目標核酸上該些分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的一距離範圍內；以及 (c) 用於檢測一分體探針雜交訊號的一探針雜交試劑組，其包含染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物。
在一些實施例中，該套組包含的該寡核苷酸組係為一基因特異性引子或一基因特異性探針。在一些實施例中，該套組包含至少二對的如前述段落所述的基因特異性引子。在一些實施例中，該基因特異性引子被設計從作為上游DNA片段的夥伴DNA片段中獲得目標核酸。在一些實施例中，該基因特異性引子被設計從作為下游DNA片段的夥伴DNA片段中獲得目標核酸。
在一些實施例中，該套組進一步包含如前述段落所述的一通用引子。
在一些實施例中，至少一該基因特異性引子係靶向 一DNA片段接合邊界。
在一些實施例中，該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
在一些實施例中，該第一分體探針及該第二分體探針係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-40 bp的一距離範圍。
在一些實施例中，該第一分體探針係互補於該夥伴DNA片段，且該夥伴DNA片段具有前述段落中描述之夥伴基因的一序列及其任何互補序列。在其他實施例中，該第二分體探針係互補於該目標DNA片段，該目標DNA片段具有前述段落中描述之目標基因的一序列及其任何互補序列。在其他實施例中，該第三分體探針係互補於該第三DNA片段，該第三DNA片段具有前述段落中描述之夥伴基因或目標基因的一序列及其任何互補序列。
在一些實施例中，該第一分體探針係互補於該夥伴DNA片段及其任何互補序列，該夥伴DNA片段包含前述段落中所述之夥伴基因的一序列。在一些實施例中，第二分體探針係互補於該目標DNA片段，且該目標DNA片段包含前述段落中所述之該目標基因的一序列及其任何互補序列。在一些實施例中，該第三分體探針係互補於該第三DNA片段，且該第三DNA片段包含前述段落中所述之夥伴基因或目標基因的一序列及其任何互補序列。
在一些實施例中，該分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。
在一些實施例中，該引子對中的一個或二個引子係連接至生物素或者其他化合物，其能夠與綴合至鏈親和素且帶有訊號的一可偵測分子相結合。
在一些實施例中，該分體探針的長度為10-60 bp。
在一些實施例中，該擴增的目標核酸的長度不超過200 bp。
在一些實施例中，一探針雜交試劑組被設計用於檢測各種可偵測的訊號，例如染劑、化學發光染劑、螢光分子如藻紅蛋白(PE)或花青類染劑、放射性同位素、自旋標記、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、芘類化合物、或用於呈色反應的酶，例如鹼性磷酸酶(AP)或山葵過氧化酶(HRP)。
在一些實施例中，用於檢測特定NTRK融合類型的分體探針被設計成與各自的獨有識別元件相連。該獨有識別元件可以是具有一獨特序列的寡核苷酸，或者包含一獨特條碼於其表面的微珠或奈米粒子。該條碼可以是一種幾何圖案，其可由配備一明視野成像系統的一光學掃描儀讀取。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子是一種磁性粒子。在一些實施例中，該微珠或該奈米粒子係由合成聚合物所製成。
在一些較佳實施例中，該套組包含一通用引子。當複數個NTRK融合特異性引子對與該通用引子一起使用時，各該NTRK融合特異性引子對中的NTRK融合特異性正向引子進一步包含該通用引子對中的通用正向引子的核苷酸序列，並且各該NTRK融合特異性引子對中的NTRK融合特異性反向引子進一步包含該通用引子對中的通用反向引子的核苷酸序列。
在一些實施例中，該套組進一步包含一反轉錄酶，係用於對分離自樣本的RNA進行反轉錄，並且該套組還包含一DNA聚合酶，係用於擴增由該反轉錄產生的cDNA。
在一些實施例中，該套組進一步包含一內部對照組。該內部對照組可以是存在NTRK基因融合的一陽性對照樣品，或者可以是不具有NTRK基因融合的一陰性對照樣品。在一些實施例中，該內部對照組係為一FFPE組織切片、外周血單核細胞(PBMCs)、血液、血漿、其他細胞或體液、核酸、或寡核苷酸。
前述段落所中描述的套組的優點在於，在尋找DNA片段接合以及選擇性剪接事件方面具備檢測準確性，因此得以實現對臨床基因型的可靠分析。
本揭露由以下實施例進一步說明，該些實施例係用於示範而非用於限制本發明。 實施例
實施例 1
以一步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗檢測 MET 基因突變
一步式PCR目標-探針雜交試驗可以在單一反應中同時檢測複數種可能的MET選擇性剪接類型。圖1顯示該試驗的整體流程，其包括以下步驟：從一樣本中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用多個MET突變特異性引子對透過PCR擴增該cDNA的MET選擇性剪接區(即目標cDNA)以獲得該目標cDNA的一擴增產物，使用分體探針與該擴增的目標cDNA進行探針雜交，以及偵測探針結合產物。下面是該試驗的一個例子。
分體探針的製備
進行試驗前，基於MET基因的RNA轉錄本中的融合區的核苷酸序列(表3)設計了一種靶向MET基因的外顯子14跳躍突變的探針。表3中的序列分別來自5'夥伴(MET基因的外顯子13)和3'目標(MET基因的外顯子15)。分體探針(如表1所示)被設計為可結合至表3中所列的序列。該分體探針係固著於一微陣列板上，呈一點陣列的形式，每一點包含複數個的一種探針。
表3
突變類型 夥伴及目標 片段接合區的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
MET-MET 選擇性剪接 MET 外顯子13 MET 外顯子15 TGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTAATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACAGGATTGATTGCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTGTTATTACTACTTGGGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAGATCAGTTTCCTAATTCATCTCAGAACGGTTCATGCCGACAAGTGCAGTATCCTCTGACAGACATGTCCCCCATCCTAACTAGTGGGGACTCTGATATATCCAGTCCATTACTGCAAAATACTGTCCACATTGACCTCAGTGCTCTAAATCCAGAGCTGGTCCAGGC 37
使用 MET 突變特異性引子對進行 PCR 擴增
為了替代帶有MET選擇性剪接的臨床樣本，由IDT公司合成的寡核苷酸被用作陽性對照組模板。該MET選擇性剪接寡聚物係以表4所示的MET突變特異性引子對進行PCR擴增。該引子對係由IDT合成，其能結合至該MET選擇性剪接寡聚物之5'端和3'端。該引子對中的反向引子的5'端被生物素修飾，以便後續與鏈親和素-藻紅素(streptavidin-phycoerythrin，SA-PE)綴合物(Thermo Fisher Scientific)產生交互作用。依據製造商說明書使用高保真度Platinum Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)在Veriti™ 96孔熱循環儀(Thermo Fisher Scientific)上進行30個熱循環的PCR。
表4
突變類型 MET 突變特異性引子對的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
MET-MET 選擇性剪接 正向 AAGAGAAAGCAAATTAAAGATCAGTT 38
反向 CTGTCAGAGGATACTGCAC 39
探針雜交及訊號偵測
將MET選擇性剪接寡聚物的擴增產物轉移到預先阻斷的孔洞中進行雜交，每一孔洞都點製有分體探針的點陣列，包括MET選擇性剪接特異性探針的點(例如表1所示)、對照探針(control probes)的點、及錨定探針的點。雜交後，將可發螢光的SA-PE綴合物加入該孔洞中以便其與擴增產物的生物素相結合，使得有色產物在探針-目標雜合體所在的位置生成。透過使用一特定相機對該孔洞拍照以及辨認有色斑點在該孔洞中的位置，便可確定一種特定雜交，其指示存在一種特定的MET選擇性剪接。有色斑點的位置可以由電腦進行分析。
實施例 2
以二步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗檢測 NTRK 基因突變
為了在單一反應中同時檢測多種可能的NTRK融合而設計的另一種方法是二步式PCR目標-探針雜交試驗。圖2顯示該試驗的整體流程，其包括以下步驟：從一樣本中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用多個NTRK融合特異性引子對透過PCR擴增該cDNA的NTRK融合區(即目標cDNA)以獲得該目標cDNA的第一擴增產物，使用一通用引子對透過PCR擴增該第一擴增產物以獲得該目標cDNA的第二擴增產物，對該擴增的目標cDNA進行探針雜交，以及偵測探針結合產物。下面是該試驗的一個例子。
RNA 提取及反轉錄
依據製造商說明書利用RecoverAll總核酸分離套組(貨號：AM1975，Ambient Technologies)從一癌症患者的FFPE組織樣本中提取DNA和RNA。使用SuperScript cDNA合成套組(貨號：11754050，Invitrogen)及隨機六核苷酸引子(random hexanucleotide primers)在42°C對100 ng的總RNA進行反轉錄30至60分鐘。此步驟生成10 μL的cDNA產物。
使用 NTRK 融合特異性引子對進行 PCR 擴增
本試驗中使用的NTRK融合特異性引子對中的每個引子被設計成具有二個片段。一個片段被稱為融合特異性片段，係用於結合一種特定NTRK融合之融合序列的5'端或3'端。另一個片段被稱為通用片段，其具有將在第二輪PCR中使用的通用引子的核苷酸序列。該通用片段相對於該融合特異性片段總是位在上游或5'的位置(圖2)。該通用引子可以是表5中所列的任一引子，表5中的每個通用引子都可以用作通用正向引子或通用反向引子。表6顯示了本試驗中使用的一些融合特異性引子對的融合特異性片段。
表5
通用引子編號 引子序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
U01 GTTTTCCCAGTCACGACGT 40
U02 GCAAATGGCATTCTGACATCC 41
U03 GCGGATAACAATTTCACACAGG 42
U04 CGTCCATGCCGAGAGTG 43
U05 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 44
U06 GACTGGTTCCAATTGACAAGC 45
U07 GCGTGAATGTAAGCGTGAC 46
U08 TGTAAAACGACGGCCAGT 47
U09 AAGGGTCTTGCGAAGGATAG 48
U10 GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG 49
表6
突變類型 NTRK 融合特異性引子對的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
ETV6-NTRK3 融合 正向 CCACATCATGGTCTCTGTCT 50
反向 TGGTTGATGTGGTGCAG 51
TFG-NTRK1 融合 正向 ACAGCAGCCACCATATACA 52
反向 AGACCCCAAAAGGTGTT 53
TFG-NTRK1 融合 正向 ATCCTTTAAAAAACCAAGATGAAATCAATA 54
反向 GAGAAGGGGATGCACCA 55
TPM3-NTRK1 融合 正向 GACCCGTGCTGAGTTTG 56
反向 AAATGCAGGGACATGGC 57
ETV6-NTRK2 融合 正向 TTCCACCCTGGAAACTCTATAC 58
反向 CATTGGAGATGTGATGGAGTG 59
TFG-NTRK3 融合 正向 ACAGCAGCCACCATATACA 60
反向 CTCGATGCAGTGCTCCA 61
進行融合特異性PCR時，在10 μL的cDNA產物中加入7 μL的水，其後將得到的混合物(17 μL)等分為四組，每組有4 μL的混合物，並餘下1 μL的死容積(dead volume)。分組的數目係取決於引子效能。更具體而言，首先測定每種融合特異性引子對的引子效率，然後將效率相近的融合特異性子對混合以形成單一引子匯集物，最終形成共四個引子匯集物(表示為P1、P2、P3、P4)。將包含23至48個融合特異性引子的每個引子匯集物(表7) 一組cDNA (4 μL)。其後，依據製造商說明書使用多重PCR套組(貨號：206143，Qiagen)，在Veriti™ 96孔熱循環儀(Thermo Fisher Scientific)上對各組cDNA進行25個熱循環的擴增，由此生成10 μL的第一擴增產物。換言之，進行四個多重PCR反應以產生四組第一擴增產物。
表7
匯集物 編號 引子數目 NTRK 融合基因 數目 持家基因 數目
P1 48 39 1
P2 35 25 1
P3 43 28 1
P4 23 16 0
使用通用引子對進行 PCR 擴增
由於每個融合特異性引子在5'端包含一通用引子的核苷酸序列，可以使用一通用引子對透過PCR進一步擴增該第一擴增產物。該通用引子對包含具有選自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用正向引子，以及具有選自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用反向引子。該通用反向引子經過生物素修飾。進行第二輪PCR時，將前述四組第一擴增產物分別稀釋100倍於最終反應混合物中，並且依據製造商說明書使用Platinum SuperFi II PCR預混液(Platinum SuperFi II PCR Master Mix；Cat No：12368010，Invitrogen)在Veriti™ 96孔熱循環儀(Thermo Fisher Scientific)上對各組第一擴增產物進行擴增25個熱循環，由此得到10 μL的第二擴增產物。換言之，進行四個PCR反應以產生四組第二擴增產物。
探針雜交及訊號偵測
將前述四組第二擴增產物合併(總計40 μL)，所得匯集物取18 μL與3 μL水混合以產生一混合物。將該混合物置於一96孔PCR盤(貨號：P46-4TI-1000 /C，4titude)。該第二擴增產物在96°C變性5分鐘，再移入經預阻斷處理(pre-blocked)的孔洞，各孔洞中預先點製一探針點陣列，包括分體探針的多個點、對照探針的9個點、及一錨定探針的10個點。該分體探針係選自SEQ ID NO：32、33、35、36的序列(表2)。圖5及圖6顯示不同探針在一個孔洞中的分布。目標-探針雜交係在50℃下伴隨振盪進行15分鐘。雜交後，將孔洞冷卻並清洗二次。隨後，將含有一鏈親和素-鹼性磷酸酶綴合物的一緩衝液添加到該孔洞中，使生物素-鏈親和素得以交互作用，然後加入該鹼性磷酸酶的一受質，以便有色產物在探針-目標雜合體所在的位置生成。透過使用相機對孔洞拍照以及辨認有色斑點在該孔洞中的位置，便可確定一種特定雜交，其指示存在一種特定的NTRK融合。有色斑點的位置可以由一電腦進行分析。
實施例 3
透過二步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗檢測 EGFRvIII 突變
使用二步式PCR目標-探針雜交試驗檢測EGFRvIII突變。圖3顯示該試驗的整體流程，其包括以下步驟：從一樣本中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用一EGFRvIII突變特異性引子對透過PCR擴增該cDNA的EGFRvIII突變區(即目標cDNA)以獲得該目標cDNA的第一擴增產物，使用一通用引子對透過PCR擴增該第一擴增產物以獲得該目標cDNA的第二擴增產物，對該擴增的目標cDNA進行探針雜交，以及偵測探針結合產物。下面是該試驗的一個例子。
RNA 提取及反轉錄
依據製造商說明書利用RecoverAll總核酸分離套組(貨號：AM1975，Ambient Technologies)從一癌症患者的FFPE組織樣本中提取DNA和RNA。使用SuperScript cDNA合成套組(貨號：11754050，Invitrogen)及隨機六核苷酸引子(random hexanucleotide primers)在42°C對100 ng的總RNA進行反轉錄30至60分鐘，由此獲得10 μL的cDNA產物。
使用 EGFRvIII 突變特異性引子對進行 PCR 擴增
本試驗中使用的EGFRvIII突變特異性引子對中的每個引子被設計成具有二個片段。一個片段被稱為選擇性剪接特異性片段，係用於結合EGFRvIII突變序列的5'端或3'端。該選擇性剪接特異性片段可以具有SEQ ID NO：62或63的序列(表8)。另一個片段被稱為通用片段，其具有將在第二輪PCR中使用的通用引子的核苷酸序列。該通用片段相對於該選擇性剪接特異性段總是位在上游或在5'的位置。該通用引子可以是表5中所列的任一引子，表5中的每個通用引子都可以用作通用正向引子或通用反向引子。
表8
突變類型 EGFRvIII 突變 特異性引子對的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
EGFR-EGFR 選擇性剪切 正向 GGGCTCTGGAGGAAAAGAA 62
反向 TCCATCTCATAGCTGTCGG 63
進行選擇性剪切特異性PCR時，依據製造商說明書使用多重PCR套組(貨號：206143，Qiagen)，在Veriti™ 96孔熱循環儀(Thermo Fisher Scientific)上對cDNA產物進行15-30個熱循環的擴增，產出10 μL的第一擴增產物。
使用通用引子對進行 PCR 擴增
由於每個突變特異性引子在5'端包含一通用引子的核苷酸序列，可以使用一通用引子對透過PCR進一步擴增該第一擴增產物。該通用引子對包含具有選自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用正向引子，以及具有選自SEQ ID NO：40-49的序列的一通用反向引子。該通用反向引子經過生物素修飾。進行第二輪PCR時，將該第一擴增產物稀釋100倍於最終反應混合物中，並且依據製造商說明書使用Platinum SuperFi II PCR預混液(Platinum SuperFi II PCR Master Mix；Cat No：12368010，Invitrogen)在Veriti™ 96孔熱循環儀(Thermo Fisher Scientific)上對該第一擴增產物進行擴增15-30個熱循環，由此得到10 μL的第二擴增產物。
探針雜交及訊號偵測
將該第二擴增產物置於一96孔PCR盤(貨號：P46-4TI-1000/C，4titude)。該第二擴增產物在96°C變性5分鐘，再移入經預阻斷處理的孔洞，各孔洞中預先點製一探針點陣列，包括分體探針的117個點、對照探針的9個點、及一錨定探針的10個點(圖4)。該分體探針(如表1所示)被設計為與表9所列的序列結合。目標-探針雜交係在50℃下伴隨振盪進行15分鐘。雜交後，將孔洞冷卻並清洗二次。隨後，將含有一鏈親和素-鹼性磷酸酶綴合物的一緩衝液添加到該孔洞中，使生物素-鏈親和素得以交互作用，然後加入該鹼性磷酸酶的一受質，以便有色產物在探針-目標雜合體所在的位置生成。透過使用相機對孔洞拍照以及辨認有色斑點在該孔洞中的位置，便可確定一種特定雜交，其指示存在EGFRvIII突變。有色斑點的位置可以由一電腦進行分析。
表9
突變類型 夥伴及目標 片段接合區的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
EGFR-EGFR 選擇性剪切 EGFR 外顯子1 EGFR 外顯子8 CCACCTCGTCGGCGTCCGCCCGAGTCCCCGCCTCGCCGCCAACGCCACAACCACCGCGCACGGCCCCCTGACTCCGTCCAGTATTGATCGGGAGAGCCGGAGCGAGCTCTTCGGGGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAG 64
實施例 4
以二步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗 檢驗基因融合檢測的分析靈敏度
進行分析前，基於NTRK基因的RNA轉錄本中的融合區的核苷酸序列設計了靶向NTRK融合的分裂探針。為了檢驗基因融合檢測的分析靈敏度，合成了多個DNA模板，其包含已知的NTRK融合類型或先前未被報導的NTRK融合類型(例如表1、表2、表10所示的融合類型)。涉及已知NTRK融合類型的合成DNA模板共有165個，涉及新的NTRK融合類型的合成DNA模板有50個。每個模板都被稀釋成1000份，以檢查各探針的靈敏度。依據各探針的檢測範圍，探針訊號必須高於其本身訊號閾值才能達到一定的分析靈敏度。對於已知的NTRK融合類型(如圖7所示)(共165個)，資料顯示85%的NTRK融合轉錄本(141個)在1000份時具有靈敏度。對於新穎的NTRK融合類型(如圖8所示)，資料顯示98%的NTRK融合轉錄本(49個)在1000份時具有靈敏度。
表10
探針的標靶區域 探針序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
PPL (外顯子22) AATAAACCTGGTGGCTGGAG 65
NTRK3 (外顯子14) GTCATCAGTGGTGAGGAGGA 66
實施例 5
以二步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗 進行基因融合檢測的臨床樣本驗證
為了驗證資料分析演算法，利用ACT融合套組(ACTFusion panel；ACT Genomics Co., LTD)在次世代定序(NGS)平臺上分析38個源自臨床FFPE樣本的RNA樣本。經過資料分析，在共計38個甲狀腺癌FFPE樣本中只有一個樣本是NTRK融合陽性，其含有 ETV6- NTRK3融合。NTRK融合分體探針檢測的結果如表11所示。此結果與使用ACT融合套組的次世代定序結果一致。ACT融合套組說明書中的NGS檢測結果如表12所示。其餘37個甲狀腺癌FFPE樣本為NTRK融合陰性，該些樣本在NGS檢測中也呈陰性。此結果說明就該38個臨床FFPE樣本而言，ACT融合套組與分體探針檢測的一致性為100%。表13顯示分體探針晶片檢測的效能資料，其係計算自樣品為NTRK融合陽性或陰性的結果。
表11
探針的標靶區域 訊號 背景值 Z 值 (Z-score)
ETV6 (外顯子4) 103.7 38.2 1279.2
NTRK3 (外顯子14) 102.2 35.9 1260.7
NTRK3 (外顯子14) 89.3 40.4 1101.5
ETV6 (外顯子4) 84.2 29.3 1038.5
NTRK3 (外顯子14) 71.2 28.2 878.0
表12
樣本編號 融合轉錄本 比對至目標的序列讀數 比對至目標的保守序列讀數
1 ETV6‐NTRK3.E4N14 22042 1785
表13
效能 參照標準 (NGS 檢測 )
陽性 陰性 總計
檢測結果 陽性 1 0 1
陰性 0 37 37
總計 1 37 38
特異度 = 100.00% (95%信賴區間：90.51% - 100.00%) 準確度 = 100.00% (95%信賴區間：90.75% - 100.00%) 陽性一致率(PPA) = 100% (95%信賴區間：2.5% - 100.00%) 陽性預測值(PPV) = 100.00% (95%信賴區間：2.5% - 100.00%)
實施例 6
以二步式 PCR 目標 - 探針雜交試驗檢測 BCR-ABL 35INS 突變
使用二步式PCR目標-探針雜交試驗來檢測BCR-ABL 35INS突變。該試驗包括與前述實施例相同的步驟，即從一樣本中獲得RNA，對該RNA進行反轉錄以獲得cDNA，使用BCR-ABL 35INS突變特異性引子對透過PCR擴增該cDNA的BCR-ABL 35INS突變區(即目標cDNA)以獲得該目標cDNA的第一擴增產物，使用一通用引子對透過PCR擴增該第一個擴增產物以獲得該目標cDNA的第二擴增產物，對該擴增的目標cDNA進行探針雜交，以及偵測探針結合產物。
使用 BCR-ABL 35INS 突變特異性引子對和通用引子對進行 PCR 擴增
本試驗中使用的BCR-ABL 35INS突變特異性引子對中的每個引子被設計成具有二個片段。一個片段被稱為選擇性剪接特異性片段，係用於結合BCR-ABL 35INS突變序列的5'端或3'端。該選擇性剪接特異性片段可以具有SEQ ID NO：67或68的序列(表14)。另一個片段被稱為通用片段，其具有將在第二輪PCR中使用的通用引子的核苷酸序列。進行選擇性剪切特異性PCR時，依據製造商說明書擴增cDNA產物，產出第一擴增產物及第二擴增產物。
表14
突變類型 BCR-ABL 35INS 突變特異性引子對的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
BCR-ABL 35INS選擇性剪切 正向 AGATGCTGACCAACTCG 67
反向 ACAATGTTCCAGGAATCCAG 68
探針雜交及訊號偵測
將該第二擴增產物在96°C變性5分鐘，再移入經預阻斷處理的孔洞，各孔洞中印有一探針點陣列，包括分體探針的點(如表1所示)、對照探針的點、以及錨定探針的點。該分體探針被設計成與表15所列的序列結合。目標-探針雜交及訊號偵測皆依據先前的說明進行。
BCR-ABL 35INS突變及擴增方法先前已有報導(Yuda, Junichiro, et al. "Persistent detection of alternatively spliced BCR‐ABL variant results in a failure to achieve deep molecular response." Cancer science 108.11 (2017): 2204-2212.)，其內容透過引用併入本文。
由於BCR-ABL選擇性剪接事件在mRNA層次會造成多種剪接形式的混合，目前已知檢測方法的運作可靠性往往受限於某一設計點。該些方法的共通點是它們被設計成一次探測一種剪接異構體，但分體探針檢測法卻可用於一次探測數種剪接異構體(如BCR-ABL或BCR-ABL 35INS)，並且透過訊號分析還能一次識別多種剪接形式。分體探針檢測法的效率會提高是因為同一探針可以使用於多種剪接類型。
分體探針檢測法作為一種探測系統具備多種優勢，包括高精確度和準確度、可報告廣泛範圍的新突變組合、成本低、及基因操作容易進行。
表15
突變類型 夥伴 目標 另一 片段 片段接合區的序列 ( 由 5' 端至 3' 端 ) SEQ ID NO
BCR-ABL 選擇性 剪切 (BCR-ABL 35INS) BCR 外顯子14 ABL 外顯子2-8 ABL 內含子 8 (35INS) ATGATGAGTCTCCGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAG ．．．．CATTTGGAGTATTGCTTTGGGAAATTGCTACCTATGGCATGTCCCCTTACCCGGGAATTGACCTGTCCCAGGTGTATGAGCTGCTAGAGAAGGACTACCGCATGGAGCGCCCAGAAGGCTGCCCAGAGAAGGTCTATGAACTCATGCGAGCATACTTTGATAACCGTGAAGAAAGAACAAGATAGAAG   (此處表示部分DNA序列) 69
無
本領域中的技術人員依據以下對較佳實施例的詳細說明及參考所附圖式應可理解本發明，在該圖式中：
圖1是依據本發明之一實施例的檢測MET基因突變的方法的示意圖；該檢測係基於一步式PCR目標-探針雜交試驗。
圖2是依據本發明之一實施例的檢測NTRK基因突變的方法的示意圖；該檢測係基於二步式PCR目標-探針雜交試驗。
圖3是依據本發明之一實施例的檢測EGFR基因突變的方法的示意圖；該檢測係基於二步式PCR目標-探針雜交試驗。
圖4顯示一孔盤之一孔洞中點製的探針點陣列；由上方起算第一行和從左側起算第一列中的數字是作為參考座標呈現；標有1-117的方塊代表分體探針點，標有IC001-IC009的方塊代表對照探針點，而標有R144的方塊代表錨定探針點。
圖5顯示依據本發明之一實施例的ETV6-NTRK3 (外顯子5及外顯子14)基因融合陽性的探針點陣列，其係位於一孔盤之一孔洞中。
圖6顯示依據本發明之一實施例的QKI-NTRK2 (外顯子6及外顯子16)基因融合陽性的探針點陣列，其係位於一孔盤之一孔洞中。
圖7顯示依據本發明之一實施例的AFAP1-NTRK1 (外顯子4及外顯子10)基因融合陽性的探針點陣列，其係位於一孔盤之一孔洞中。
圖8顯示依據本發明之一實施例的新穎的人為PPL-NTRK3 (外顯子22及外顯子14)基因融合陽性的探針點陣列，其係位於一孔盤之一孔洞中。
圖9顯示一對照組(水、融合陰性樣本)孔洞及一融合組(PPL-NTRK3)孔洞中的融合陰性及融合陽性的探針點陣列。
無。
 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  行動基因(智財)有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  DNA片段接合檢測方法及套組]]>
          <![CDATA[<130>  PCT?US2022/016877]]>
          <![CDATA[<150>  63/150,095]]>
          <![CDATA[<151>  2021-02-17]]>
          <![CDATA[<160>  69    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          gcggccagta gcatctgact                                                   20
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          tgataaccgt gaagaaagaa                                                   20
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  3]]>
          ctccggaata catcacatca                                                   20
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tgtaccgccg gaagcaccag gagc                                              24
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          gcaattgcaa gcatctca                                                     18
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          aggaaaaatt gtccatcttg tcgtcttcgg aaa                                    33
          <![CDATA[<210>  7]]>
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          tacagagtgt ggactctggt gcctccaga                                         29
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  8]]>
          catatcctgt aagaccagaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  9]]>
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          gccactggat ttaagcagag ttcaa                                             25
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          tgctgctgaa gggaaaggca gaagt                                             25
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          <![CDATA[<400>  11]]>
          gaaccgcgac ctgcgcaaag ccagcgtga                                         29
          <![CDATA[<210>  12]]>
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          gtcgggctct ggaggaaaag aaag                                              24
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  13]]>
          gtaattatgt ggtgacagat                                                   20
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          attctcactc tcacaacc                                                     18
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
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          <![CDATA[<400>  18]]>
          accagtctgc ctggctca                                                     18
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FGFR3(外顯子17)]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          tgtccttacc gtgacgtcca ccga                                              24
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MBIP(外顯子4)]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          aagctgaaat caatgaaaac aacgtcaggg a                                      31
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MET(外顯子13)]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          tgtggctgaa aaagagaaag caaattaaag                                        30
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MET(外顯子15)]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          atcagtttcc taattcatct                                                   20
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK1(外顯子10)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          acagcacatc tggagacccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PDGFRA(外顯子2)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          tttcccagag ctatggggac tt                                                22
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PPL(外顯子22)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          aataaacctg gtggctggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  RET(外顯子12)]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          aagtgggaat tccctcggaa ga                                                22
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ROS1(外顯子32)]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          tcccaaatta ctagaaggga                                                   20
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SCAF11(外顯子1)]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          cctcgacctc ggtctga                                                      17
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SLC34A2(外顯子4)]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          tcgtgtgctc cctggatatt ctta                                              24
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TACC3(外顯子8)]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          agtcggcctt gaggaagca                                                    19
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          gggagaatag caggtcccgt                                                   20
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETV6(外顯子5)]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          cgccatgccc attgggagaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK3(外顯子14)]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          gtcccgtggc tgtcatcagt                                                   20
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          tggtgtatta ggcccagcct                                                   20
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  QKI(外顯子6)]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          tatcctattg aacctagtgg                                                   20
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK2(外顯子16)]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          gcccagcctc cgttatcagc                                                   20
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  323]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MET-MET選擇性剪切]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat       60
          ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca atatcaacag cactgttatt actacttggg      120
          tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa attaaagatc agtttcctaa ttcatctcag      180
          aacggttcat gccgacaagt gcagtatcct ctgacagaca tgtcccccat cctaactagt      240
          ggggactctg atatatccag tccattactg caaaatactg tccacattga cctcagtgct      300
          ctaaatccag agctggtcca ggc                                              323
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MET-MET選擇性剪切正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          aagagaaagc aaattaaaga tcagtt                                            26
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MET-MET選擇性剪切反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          ctgtcagagg atactgcac                                                    19
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U01]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gttttcccag tcacgacgt                                                    19
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U02]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gcaaatggca ttctgacatc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U03]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          gcggataaca atttcacaca gg                                                22
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U04]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          cgtccatgcc gagagtg                                                      17
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U05]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          ctttatgttt ttggcgtctt cca                                               23
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U06]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          gactggttcc aattgacaag c                                                 21
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U07]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          gcgtgaatgt aagcgtgac                                                    19
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U08]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          tgtaaaacga cggccagt                                                     18
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U09]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          aagggtcttg cgaaggatag                                                   20
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  通用引子No. U10]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          gggttatgct agttattgct cag                                               23
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETV6-NTRK3融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          ccacatcatg gtctctgtct                                                   20
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETV6-NTRK3融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          tggttgatgt ggtgcag                                                      17
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK1融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          acagcagcca ccatataca                                                    19
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK1融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          agaccccaaa aggtgtt                                                      17
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK1融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          atcctttaaa aaaccaagat gaaatcaata                                        30
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK1融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          gagaagggga tgcacca                                                      17
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TPM3-NTRK1融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          gacccgtgct gagtttg                                                      17
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TPM3-NTRK1融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          aaatgcaggg acatggc                                                      17
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETV6-NTRK2融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          ttccaccctg gaaactctat ac                                                22
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ETV6-NTRK2融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          cattggagat gtgatggagt g                                                 21
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK3融合正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          acagcagcca ccatataca                                                    19
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TFG-NTRK3融合反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          ctcgatgcag tgctcca                                                      17
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EGFRvIII突變特異性正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          gggctctgga ggaaaagaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EGFRvIII突變特異性反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          tccatctcat agctgtcgg                                                    19
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  328]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  EGFR-EGFR選擇性剪切]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          ccacctcgtc ggcgtccgcc cgagtccccg cctcgccgcc aacgccacaa ccaccgcgca       60
          cggccccctg actccgtcca gtattgatcg ggagagccgg agcgagctct tcggggagca      120
          gcgatgcgac cctccgggac ggccggggca gcgctcctgg cgctgctggc tgcgctctgc      180
          ccggcgagtc gggctctgga ggaaaagaaa ggtaattatg tggtgacaga tcacggctcg      240
          tgcgtccgag cctgtggggc cgacagctat gagatggagg aagacggcgt ccgcaagtgt      300
          aagaagtgcg aagggccttg ccgcaaag                                         328
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PPL(外顯子22)探針序列]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          aataaacctg gtggctggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NTRK3(外顯子14)探針序列]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          gtcatcagtg gtgaggagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  BCR-ABL35INS突變特異性正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          agatgctgac caactcg                                                      17
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  BCR-ABL35INS突變特異性反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          acaatgttcc aggaatccag                                                   20
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  1454]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  BCR-ABL選擇性剪切(BCR-ABL35INS)]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          atgatgagtc tccggggctc tatgggtttc tgaatgtcat cgtccactca gccactggat       60
          ttaagcagag ttcaaaagcc cttcagcggc cagtagcatc tgactttgag cctcagggtc      120
          tgagtgaagc cgctcgttgg aactccaagg aaaaccttct cgctggaccc agtgaaaatg      180
          accccaacct tttcgttgca ctgtatgatt ttgtggccag tggagataac actctaagca      240
          taactaaagg tgaaaagctc cgggtcttag gctataatca caatggggaa tggtgtgaag      300
          cccaaaccaa aaatggccaa ggctgggtcc caagcaacta catcacgcca gtcaacagtc      360
          tggagaaaca ctcctggtac catgggcctg tgtcccgcaa tgccgctgag tatctgctga      420
          gcagcgggat caatggcagc ttcttggtgc gtgagagtga gagcagtcct ggccagaggt      480
          ccatctcgct gagatacgaa gggagggtgt accattacag gatcaacact gcttctgatg      540
          gcaagctcta cgtctcctcc gagagccgct tcaacaccct ggccgagttg gttcatcatc      600
          attcaacggt ggccgacggg ctcatcacca cgctccatta tccagcccca aagcgcaaca      660
          agcccactgt ctatggtgtg tcccccaact acgacaagtg ggagatggaa cgcacggaca      720
          tcaccatgaa gcacaagctg ggcgggggcc agtacgggga ggtgtacgag ggcgtgtgga      780
          agaaatacag cctgacggtg gccgtgaaga ccttgaagga ggacaccatg gaggtggaag      840
          agttcttgaa agaagctgca gtcatgaaag agatcaaaca ccctaacctg gtgcagctcc      900
          ttggggtctg cacccgggag cccccgttct atatcatcac tgagttcatg acctacggga      960
          acctcctgga ctacctgagg gagtgcaacc ggcaggaggt gaacgccgtg gtgctgctgt     1020
          acatggccac tcagatctcg tcagccatgg agtacctgga gaagaaaaac ttcatccaca     1080
          gagatcttgc tgcccgaaac tgcctggtag gggagaacca cttggtgaag gtagctgatt     1140
          ttggcctgag caggttgatg acaggggaca cctacacagc ccatgctgga gccaagttcc     1200
          ccatcaaatg gactgcaccc gagagcctgg cctacaacaa gttctccatc aagtccgacg     1260
          tctgggcatt tggagtattg ctttgggaaa ttgctaccta tggcatgtcc ccttacccgg     1320
          gaattgacct gtcccaggtg tatgagctgc tagagaagga ctaccgcatg gagcgcccag     1380
          aaggctgccc agagaaggtc tatgaactca tgcgagcata ctttgataac cgtgaagaaa     1440
          gaacaagata gaag                                                       1454
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019

Claims (64)

  1. 一種檢測DNA片段接合事件的方法，包含： (a) 自一樣本中獲取一DNA或由提取的RNA獲得一DNA； (b) 使用一寡核苷酸組擴增該DNA，以獲得一目標核酸； (c) 使用一分體探針探測該目標核酸，包含： (i) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的3'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的5'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；或 (ii) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的5'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的3'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；以及 (d) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號。
  2. 如請求項1所述的方法，其中該寡核苷酸組係為一基因特異性引子或一基因特異性探針。
  3. 如請求項1所述的方法，其中在步驟(b)中使用至少二對的一基因特異性引子進行多重PCR以擴增該DNA。
  4. 如請求項3所述的方法，進一步包含： (e) 測定 (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段是否與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號及該目標核酸的一獨立PCR的結果。
  5. 如請求項3所述的方法，其中至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  6. 如請求項3所述的方法，其中至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  7. 如請求項3所述的方法，其中至少一該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
  8. 如請求項3所述的方法，其中該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
  9. 如請求項1所述的方法，其中該第一分體探針或該第二分體探針係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-40 bp的一距離範圍。
  10. 如請求項1所述的方法，其中該第一分體探針係選自由SEQ ID NO：32、35及其任一互補序列所組成的群組。
  11. 如請求項1所述的方法，其中該第二分體探針係選自由SEQ ID NO：33、36及其任一互補序列所組成的群組。
  12. 如請求項1所述的方法，其中該第三分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。
  13. 如請求項1所述的方法，其中該分體探針的長度為10-60 bp。
  14. 如請求項1所述的方法，其中在步驟(c)中使用一分體探針及靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針探測該目標核酸。
  15. 如請求項1所述的方法，其中該夥伴DNA片段包含一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
  16. 如請求項1所述的方法，其中該目標DNA片段包含一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組。
  17. 如請求項1所述的方法，其中該夥伴DNA片段及該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
  18. 如請求項1所述的方法，其中該DNA片段接合事件係選自由ACVR2A-AKT3、AFAP1-NTRK1、AFAP1-NTRK2、AFAP1-RET、AGAP3-BRAF、AGBL4-NTRK2、AGGF1-RAF1、AKAP13-NTRK3、AKAP13-RET、AKAP9-BRAF、AKT3-P2RX5、AKT3-PTPRR、AMOTL2-NTRK1、APIP-FGFR2、ARGLU1-NTRK1、ARHGEF11-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、ATG7-RAF1、ATP1B-NTRK1、AXL-MBIP、BAG4-FGFR1、BAIAP2L1-BRAF、BAIAP2L1-MET、BCAN-NTRK1、BCL6-RAF1、BCR-ABL、BCR-FGFR1、BCR-JAK2、BCR-NTRK2、BCR-RET、BRD3-NUTM1、BRD4-NUTM1、BTBD1-NTRK3、CAPZA2-MET、CBR4-ERBB4、CCDC6-BRAF、CCDC6-RET、CCDC6-ROS1、CD74-NRG1、CD74-NRG2、CD74-NTRK1、CD74-ROS1、CDK12-ERBB2、CDK5RAP2-BRAF、CEL-NTRK1、CEP170-AKT3、CHTOP-NTRK1、CLCN6-RAF1、CLIP1-ALK、CLIP1-ROS1、CLIP2-BRAF、CLIP2-MET、CLTC-ALK、CLTC-ROS1、CNTRL-KIT、COL25A1-ALK、COL25A1-FGFR2、COX5A-NTRK3、CPD-ERBB2、CTRC-NTRK1、CUX1-BRAF、CUX1-FGFR1、CUX1-RET、DCTN1-ALK、DCTN1-MET、DLG1-NTRK3、DNAJC8-ERBB2、EIF3E-RSPO2、EML1-NTRK2、EML4-ALK、EML4-BRAF、EML4-NTRK3、EML4-RET、EPHB2-NTRK1、EPS15-BRAF、EPS15-MET、EPS15-NTRK1、ERBB2-CDK12、ERBB2-CFB、ERBB2-CNIH4、ERBB2-CTTN、ERBB2-DNAJC7、ERBB2-ENO1、ERBB2-FCGRT、ERBB2-FKBP10、ERBB2-GRB7、ERBB2-GSE1、ERBB2-GTF2E2/SMIM18、ERBB2-IKZF3、ERBB2-KRT20、ERBB2-KRT39、ERBB2-KRTAP1-4、ERBB2-LMNTD1、ERBB2-LTBP4、ERBB2-MAD2L2、ERBB2-MED1、ERBB2-PARN、ERBB2-PGAP3、ERBB2-POLD4、ERBB2-PPP1R1B、ERBB2-PRDX4、ERBB2-PSMB3、ERBB2-SHKBP1、ERBB2-SLC39A11、ERBB2-SPTBN2、ERBB2-SRCIN1、ERBB2-TADA2A、ERBB2-TATDN1、ERBB2-XBP1、ERBB2-ZAN、ERBB4-AKAP6、ERBB4-FUS、ERBB4-IKZF2、ERBB4-STK11IP、ERC1-BRAF、ERC1-RET、ERC1-ROS1、ESRP1-RAF1、ESR1-CCDC170、ETV6-FGFR3、ETV6-NTRK2、ETV6-NTRK3、ETV6-PDGFRB、ETV6-PRDM16、EZR-ERBB4、EZR-ROS1、FAM131B-BRAF、FAT1-NTRK3、FGFR2-BICC1、FGFR2-TACC3、FGFR3-TACC3、FIP1L1-PDGFRA、 FN1-ALK、FN1-ERBB4、FN1-FGFR1、FNDC3B-PIK3CA、FRY-NTRK3、GKAP1-NTRK2、GOLGA4-RAF1、GON4L-NTRK1、GOPC-ROS1、GRHL2-RSPO2、GRIPAP-NTRK1、GTF2IRD1-ALK、HACL1-RAF1、HIP1-ALK、HNRNPA2B1-NTRK3、IKZF2-ERBB4、IQSEC1-RAF1、IRF2BP2-NTRK1、KANK1-NTRK2、KCTD16-NTRK2、KCTD8-NTRK2、KHDRBS1-NTRK3、KIAA1549-BRAF、KIF5B-ALK、KIF5B-RET、KIF5B-ERBB4、KIT-ANKRD11、KIT-PDGFRA、KIT-SLC4A4、KMT2A-AFF1、KMT2A-CREBBP、KMT2A-DAB2IP、KMT2A-ELL、KMT2A-EPS15、KMT2A-MLLT1、KMT2A-MLLT10、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3、KMT2A-MLLT4、KMT2A-SEP6、KMT2A-SEP9、KTN1-ALK、KTN1-RET、LIPI-NTRK1、LMNA-ALK、LMNA-NTRK1、LMNA-RAF1、LRRC71-NTRK1、LRRFIP1-FGFR1、LRRFIP1-MET、LYN-NTRK3、MAGI3-AKT3、MBNL1-RAF1、MEF2D-NTRK1、MET-MET、MIR548F1-NTRK1、MKRN1-BRAF、MPRIP-ALK、MPRIP-NTRK1、MPRIP-RAF1、MPRIP-RET、MRPL24-NTRK1、MSN-ALK、MSN-ROS1、MTSS1-ERBB2、MUC2-NTRK2、MYH9-ALK、MYO5A-NTRK3、MYO5A-ROS1、NACC2-NTRK2、NAV1-NTRK2、NBPF20-NTRK2、NCOA4-RET、NFASC-NTRK1、NOS1AP-NTRK1、NOS1AP-NTRK2、NRG2-CYSTM1、NRG2-UBE2D2、NRIP1-RSPO2、P2RY8-NTRK1、PAIP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、PAPD7-RAF1、PDE4DIP-NTRK1、PEAR1-NTRK1、PHF20-NTRK1、PICALM-BRAF、PICALM-RET、PLEKHA6-NTRK1、PML-RARA、PPFIBP1-ALK、PPFIBP1-MET、PPFIBP1-ROS1、PPL-NTRK1、PRDX1-NTRK1、PRKAR1A-ALK、PRKAR1A-RET、PRKAR1B-ALK、PRKAR1B-BRAF、PRKAR2A-NTRK2、PRPSAP1-NTRK3、PTPRZ1-MET、QKI-NTRK2、QKI-RAF1、RAC1-AKT3、RAF1-ACTR2、RAF1-AGGF1、RAF1-DAZL、RAF1-ESRP1、RAF1-PHC3、RAF1-TMEM40、RAF1-TRAK1、RAF1-ZPR1、RALGPS2-NTRK3、RANBP2-ALK、RANBP2-FGFR1、RBPMS-NTRK3、RFWD2-NTRK1、RNF213-ALK、RNF213-NTRK1、RRBP1-ALK、RRBP1-RET、SATB1-ALK、SATB1-RET、SCAF11-PDGFRA、SCP2-NTRK1、SCYL3-NTRK1、SDC4-NRG1、SDC4-ROS1、SEC31A-ALK、SHC1-ERBB2、SIL1-NRG2、SLC34A2-MET、SLC34A2-ROS1、SLC45A3-BRAF、SLC45A3-ERG、SLC45A3-FGFR2、SLMAP-NTRK2、SND1-BRAF、SPECC1L-NTRK2、SPECC1L-NTRK3、SPTBN1-ALK、SQSTM1-ALK、SQSTM1-FGFR1、SQSTM1-NTRK1、SQSTM1-NTRK2、SQSTM1-NTRK3、SRGAP3-RAF1、SRGAP3-SRGAP3-RAF1、SSBP2-NTRK1、STRN-ALK、STRN-NTRK2、STRN-NTRK3、STRN3-BRAF、STRN3-NTRK1、STRN3-NTRK2、STRN3-NTRK3、TBC1D2-NTRK2、TBL1XR1-NRG1、TBL1XR1-PIK3CA、TBL1XR1-RET、TFG-ALK、TFG-MET、TFG-NTRK1、TFG-NTRK3、TFG-RET、TFG-ROS1、TIMP3-ALK、TIMP3-NTRK1、TKT-ERBB2、TLE4-NTRK2、TMEM106B-BRAF、TMEM106B-ROS1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4、TMPRSS2-ETV5、TNS3-NTRK2、TP53-NTRK1、TPM3-ALK、TPM3-NTRK1、TPM3-ROS1、TPM4-ALK、TPM4-NTRK3、TPR-ALK、TPR-BRAF、TPR-FGFR1、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRAF2-NTRK2、TRAK1-RAF1、TRIM24-BRAF、TRIM24-FGFR1、TRIM24-NTRK2、TRIM24-RET、TRIM33-RET、TRIM33-NTRK1、TRIM4-BRAF、TRIM4-MET、TRIM63-NTRK1、UBE2R2-NTRK3、UFD1-NTRK2、USP13-PIK3CA、VANGL2-NTRK1、VCAN-NTRK2、VCL-ALK、VCL-NTRK2、VIM-NTRK3、VPS18-NTRK3、WHSC1L1-FGFR1、WHSC1L1-NUTM1、WIPF2-ERBB2、WNK2-NTRK2、ZBTB7B-NTRK1、及 ZNF710-NTRK3突變所組成的群組。
  19. 如請求項1所述的方法，其中該第三DNA片段包含一夥伴基因或一目標基因的一序列。
  20. 如請求項1所述的方法，其中在步驟(b)中，首先使用一基因特異性引子以及隨後使用一通用引子擴增該DNA，以獲得該目標核酸。
  21. 如請求項1所述的方法，其中該訊號係選自由染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物所組成的群組。
  22. 一種識別選擇性剪接事件的方法，包含： (a) 使用一分體探針探測一目標核酸，包含： (i) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的3'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的5'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；或 (ii) 一第一分體探針係與一夥伴DNA片段的5'端互補，一第二分體探針係與一目標DNA片段的3'端互補，及/或一第三分體探針係與一第三DNA片段互補，其中該目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內； (b) 偵測反映該分體探針結合至該目標核酸的一訊號； (c) 測定 (i) 該夥伴DNA片段為一上游DNA片段及/或該目標DNA片段為一下游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的3'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的5'端的訊號； (ii) 該夥伴DNA片段為一下游DNA片段及/或該目標DNA片段為一上游DNA片段，其係透過確認該第一分體探針結合至該夥伴DNA片段的5'端的訊號及/或該第二分體探針結合至該目標DNA片段的3'端的訊號；或 (iii) 該第三DNA片段是否與該夥伴DNA片段及該目標DNA片段接合，其係透過確認該第三分體探針結合至該第三DNA片段的訊號；以及 (d) 比較該目標核酸的長度是否與一參考序列的長度相同。
  23. 如請求項22所述的方法，其中該目標核酸係使用一寡核苷酸組予以擴增。
  24. 如請求項22所述的方法，其中該目標核酸係使用至少二對的一基因特異性引子進行多重PCR而擴增。
  25. 如請求項24所述的方法，進一步包含(e)透過一獨立的PCR再次確認。
  26. 如請求項24所述的方法，其中至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  27. 如請求項24所述的方法，其中至少二對的該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  28. 如請求項24所述的方法，其中至少一該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
  29. 如請求項24所述的方法，其中該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
  30. 如請求項24所述的方法，其中多重PCR的產物隨後係使用一通用引子進行擴增以獲得該目標核酸。
  31. 如請求項22所述的方法，其中該第一分體探針的靶點及該第二分體探針的靶點與該DNA片段接合邊界之間的一距離係在0-40 bp以內。
  32. 如請求項22所述的方法，其中該分體探針的長度為10-60 bp。
  33. 如請求項22所述的方法，其中在步驟(a)中使用一分體探針及靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針探測該目標核酸。
  34. 如請求項22所述的方法，其中該夥伴DNA片段及該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
  35. 如請求項22所述的方法，其中該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
  36. 如請求項22所述的方法，其中該第三DNA片段包含一夥伴基因或一目標基因的一序列。
  37. 如請求項22所述的方法，其中該訊號係選自由染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物所組成的群組。
  38. 一種治療一個體的方法，包含： (a) 測定一個體是否患有癌症或一基因型的風險，包含對來自該個體的一樣本依請求項1所述的方法檢測一DNA片段接合事件及/或依請求項22所述的方法識別一選擇性剪接事件；以及 (b) 施予 (i) 針對該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件的治療有效量的一siRNA； (ii) 針對由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一抑制劑； (iii) 抑制由該DNA片段接合事件及/或該選擇性剪接事件所編碼的一融合蛋白的治療有效量的一藥劑； (iv) 治療有效量的一抗癌劑，該抗癌劑係選自由細胞激素、細胞凋亡誘導劑、抗血管生成劑、化學治療劑、放射治療劑、及抗癌免疫毒素所組成的群組；或 (v) 對該個體的細胞提供一靶向性基因體編輯程序。
  39. 如請求項38所述的方法，其中該DNA片段接合事件呈現一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
  40. 如請求項38所述的方法，其中該DNA片段接合事件呈現一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2及TMPRSS2所組成的群組。
  41. 如請求項38所述的方法，其中該選擇性剪接事件呈現一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
  42. 如請求項38所述的方法，其中該DNA片段接合事件或該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
  43. 如請求項38所述的方法，其中該選擇性剪接事件係選自由組成性剪接(constitutive splicing)、外顯子跳躍(exon skipping)、內含子保留(intron retention)、外顯子互斥(mutually exclusive exons)、及選擇性5'端或3'端剪接位點(alternative 5' or 3' splice sites)所組成的群組。
  44. 如請求項38所述的方法，其中該癌症係選自由上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、及骨髓瘤所組成的群組。
  45. 如請求項38所述的方法，其中該癌症係選自由腦癌、乳癌、結腸癌、內分泌腺體癌、食道癌、女性生殖器官癌、頭頸癌、肝膽系統癌、腎癌、肺癌、間質細胞瘤、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、外分泌胰腺腫瘤、及泌尿系統癌所組成的群組。
  46. 一種用於檢測一樣本的DNA片段接合事件及/或選擇性剪接事件的套組，包含： (a) 一寡核苷酸組； (b) 一分體探針，包含： (i) 與一夥伴DNA片段的3'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的5'端互補的一第二分體探針，及/或與一第三DNA片段互補的一第三分體探針，其中一目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；或 (ii) 與一夥伴DNA片段的5'端互補的一第一分體探針，與一目標DNA片段的3'端互補的一第二分體探針，及/或與一第三DNA片段互補的一第三分體探針，其中一目標核酸上該第一分體探針的靶點與該第二分體探針的靶點之間的一間隙係在0-80 bp的範圍內；以及 (c) 用於檢測一分體探針雜交訊號的一探針雜交試劑組，其包含染劑、化學發光染劑、螢光分子、放射性同位素、自旋標記、酶、半抗原、量子點、珠子、胺基己基化合物、及芘類化合物。
  47. 如請求項46所述的套組，其中該寡核苷酸組係為一基因特異性引子或一基因特異性探針。
  48. 如請求項46所述的套組，其中該套組包含至少二對的一基因特異性引子。
  49. 如請求項48所述的套組，其中該基因特異性引子被設計從作為一上游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  50. 如請求項48所述的套組，其中該基因特異性引子被設計從作為一下游DNA片段的該夥伴DNA片段中獲取該目標核酸。
  51. 如請求項46所述的套組，進一步包含一通用引子。
  52. 如請求項48所述的套組，其中至少一該基因特異性引子係靶向一DNA片段接合邊界。
  53. 如請求項48所述的套組，其中該基因特異性引子係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-80 bp的一距離範圍。
  54. 如請求項46所述的套組，其中該第一分體探針或該第二分體探針係靶向與一DNA片段接合邊界相距0-40 bp的一距離範圍。
  55. 如請求項46所述的套組，其中該第一分體探針係選自由SEQ ID NO：32、35及其任一互補序列所組成的群組。
  56. 如請求項46所述的套組，其中該第二分體探針係選自由SEQ ID NO：33、36及其任一互補序列所組成的群組。
  57. 如請求項46所述的套組，其中該第三分體探針係選自由SEQ ID NO：32、33、35、36及其任一互補序列所組成的群組。
  58. 如請求項46所述的套組，其中該分體探針的長度為10-60 bp。
  59. 如請求項46所述的套組，進一步包含靶向一DNA片段接合邊界的一單一探針。
  60. 如請求項46所述的套組，其中與該第一分體探針互補的該夥伴DNA片段包含一夥伴基因的一序列，該夥伴基因係選自由ACVR2A、AFAP1、AFF1、AGAP3、AGBL4、AGGF1、AKAP13、AKAP6、AKAP9、AMOTL2、ANKRD11、APIP、ARGLU1、ARHGEF11、ARHGEF2、ATG7、ATP1B、BAG4、BAIAP2L1、BCAN、BCL6、BCR、BICC1、BRD3、BRD4、BTBD1、CAPZA2、CBR4、CCDC170、CCDC6、CD74、CDK12、CDK5RAP2、CEL、CEP170、CFB、CHTOP、CLCN6、CLIP1、CLIP2、CLTC、CNIH4、CNTRL、COL25A1、COX5A、CPD、CREBBP、CTRC、CTTN、CUX1、CYSTM1、DAB2IP、DAZL、DCTN1、DLG1、DNAJC7、DNAJC8、EIF3E、ELL、EML1、EML4、ENO1、EPHB2、EPS15、ERC1、ESRP1、ETV6、EZR、FAM131B、FAT1、FCGRT、FGFR1、FGFR3、FIP1L1、FKBP10、FN1、FNDC3B、FRY、FUS、GKAP1、GOLGA4、GON4L、GOPC、GRB7、GRHL2、GRIPAP、GSE1、GTF2E2、GTF2IRD1、HACL1、HIP1、HNRNPA2B1、IKZF2、IKZF3、IQSEC1、IRF2BP2、JAK2、KANK1、KCTD16、KCTD8、KHDRBS1、KIAA1549、KIF5B、KRT20、KRT39、KRTAP1-4、KTN1、LIPI、LMNA、LMNTD1、LRRC71、LRRFIP1、LTBP4、LYN、MAD2L2、MAGI3、MBIP、MBNL1、MED1、MEF2D、MET、MIR548F1、MKRN1、MLLT1、MLLT10、MLLT11、MLLT3、MLLT4、MPRIP、MRPL24、MSN、MTSS1、MUC2、MYH9、MYO5A、NACC2、NAV1、NBPF20、NCOA4、NFASC、NOS1AP、NRG1、NRIP1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、P2RX5、P2RY8、PAIP1、PAN3、PAPD7、PARN、PDE4DIP、PDGFRA、PDGFRB、PEAR1、PGAP3、PHC3、PHF20、PICALM、PLEKHA6、PML、POLD4、PPFIBP1、PPL、PPP1R1B、PRDM16、PRDX1、PRDX4、PRKAR1A、PRKAR1B、PRKAR2A、PRPSAP1、PSMB3、PTPRR、PTPRZ1、QKI、RAC1、RALGPS2、RANBP2、RBPMS、RET、RFWD2、RNF213、ROS1、RRBP1、SATB1、SCAF11、SCP2、SCYL3、SDC4、SEC31A、SEP6、SEP9、SHC1、SHKBP1、SIL1、SLC34A2、SLC39A11、SLC45A3、SLC4A4、SLMAP、SMIM18、SND1、SPECC1L、SPTBN1、SPTBN2、SQSTM1、SRCIN1、SRGAP3、SSBP2、STK11IP、STRN、STRN3、TACC3、TADA2A、TATDN1、TBC1D2、TBL1XR1、TFG、TIMP3、TKT、TLE4、TMEM106B、TMEM40、TMPRSS2、TNS3、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRAK1、TRIM24、TRIM33、TRIM4、TRIM63、UBE2D2、UBE2R2、UFD1、USP13、VANGL2、VCAN、VCL、VIM、VPS18、WHSC1L1、WIPF2、WNK2、XBP1、ZAN、ZBTB7B、ZNF710、及ZPR1所組成的群組。
  61. 如請求項46所述的套組，其中與該第二分體探針互補的該目標DNA片段包含一目標基因的一序列，該目標基因係選自由ABL、AKT3、ALK、AXL、BCR、BRAF、CD74、ERBB2、ERBB4、ERG、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EZR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KIT、KMT2A、MET、NRG1、NRG2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUTM1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、RAF1、RARA、RET、ROS1、RSPO2、SDC4、SLC34A2、及TMPRSS2所組成的群組。
  62. 如請求項46所述的套組，其中與該第一分體探針互補的該夥伴DNA片段及與該第二分體探針互補的該目標DNA片段各自包含一同一基因的一不同序列，該同一基因係選自由AR、BCL2L1、BCL2L11、BCOR、BIN1、BRAF、BRCA1、BRCA2、CASP2、CD19、CD44、CXCR3、CCND1、DMP1、CDH1、EGFR、ER、EZH2、FAS、FGFR2、HRAS、IKZF1、KLF6、KRAS、MAP3K7、MCL1、MDM4、MET、MNK2、PIK3CD、PKM、RASGRP2、RON、RPS6KB、STAT3、TP53、TSC2及VEGF所組成的群組。
  63. 如請求項46所述的套組，其中該DNA片段接合事件或該選擇性剪接事件係為BCR-ABL突變。
  64. 如請求項46所述的套組，其中與該第三分體探針互補的該第三DNA片段包含一夥伴基因或一目標基因的一序列。
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