JP7245872B2 - 腫瘍試料の多重遺伝子分析 - Google Patents

腫瘍試料の多重遺伝子分析 Download PDF

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Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１４年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／０８８，４５７号の優
先権を主張するものであり、前記出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込
まれる。
配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子出願された配列リストを含有し、その全体が参照により
本明細書に組み込まれる。２０１５年１２月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、
Ｆ２０３６－７０５６ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは１，１７２バイトであ
る。
本発明は、腫瘍試料からの核酸を分析するための最適化された方法、例えば、最適化さ
れた核酸選択、リードアライメントおよび突然変異呼び出しを統合した方法に関する。
癌細胞のゲノム試験は、癌のより良好な理解の発展と、より効果的な処置アプローチの
管理に対する著しい有望性を示す。ゲノム試験は、患者の癌細胞のゲノムの配列決定、お
よびそれらの細胞における何らかのゲノム変化の同定を含む。ゲノム変化には、とりわけ
、例えば、突然変異、塩基置換、再編成、欠失、挿入が含まれ得る。特定の患者の癌に見
られる場合、これらのゲノム変化を理解することは、より良好な処置を開発することにも
役立ち、ゲノム変化情報を用いて特定の癌変異体を処置するための最良のアプローチを特
定することに役立ち得る。
本明細書中に記載の方法は、関心領域を評価するための、例えば試料中の関心領域のク
ローンプロファイルを評価するための、ベイトセットへの試料核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの使用を提供する。例えば、本明細書中に記載の方法によって、体細胞変化、例えば
、再編成または体細胞高頻度変異にさらされている遺伝子座の存在量または構造の分析が
可能になる。本明細書中に記載の方法によって、選択配列、例えばＶセグメント、または
他の配列、例えば免疫グロブリン配列、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）配列、またはＴ細胞受容
体（ＴＣＲ）配列の再編成および発現の評価が可能になる。本明細書中に記載の方法は、
例えば選択されたシグネチャーまたはそれらを含有する細胞の相対的存在量を提供する、
クローン分析を可能にする。典型的な非限定的な用途は、体細胞再編成抗体およびＢ細胞
受容体またはＴ細胞受容体遺伝子におけるＶ、ＤまたＪセグメントの使用を評価すること
である。本方法は、ゲノムレベル（例えば染色体ＤＮＡの分析）または転写レベル（例え
ばｍＲＮＡの分析）またはその両方で行い得る。一実施形態において、本方法は、第１の
対象区間のクローンプロファイルおよび第２の予め選択された対象区間の配列、例えばＶ
セグメントのクローンプロファイル、および別の遺伝子、例えば癌遺伝子における突然変
異の出現または不在を提供する。一実施形態において、第１の細胞タイプにおける第１の
対象区間のクローンプロファイルが提供される。別の実施形態において、第２の細胞タイ
プにおける第２の対象区間の配列が提供される。例えば、第１の細胞タイプは非悪性細胞
、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得、第２の細胞タイプは悪性細胞であり得る
。第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプは、患者からの同じ試料、例えば腫瘍試料か
ら得ることができる。したがって、本方法は、クローンプロファイルおよび体細胞突然変
異、例えば、疾患、例えば癌に関連する体細胞突然変異の統合分析を提供する。
したがって、一態様において、本発明は、対象における、対象区間、例えばサブゲノム
区間または発現サブゲノム区間（またはそれを含有する細胞）のクローンプロファイルを
評価または提供する方法であって、
（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液
悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを
得て；
（ｂ）それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部（本明細書ではラ
イブラリキャッチと呼ばれることがある。）を提供するために、ライブラリをベイトセッ
トと接触させ；
（ｃ）例えば、対象区間の増幅配列を提供するために、複数の選択メンバーの各メンバ
ーを増幅してもよく；
（ｄ）対象区間の１回以上の出現の配列を得て、それによって対象区間のクローンプロ
ファイルを提供または評価する
ことを含む方法を特徴とする。一実施形態において、段階（ａ）は、対象からの核酸を断
片化する、例えばせん断することを含む。
一実施形態において、段階（ｂ）は、溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラ
リをベイトセットと接触させることを含む。
一実施形態において、段階（ｂ）は、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下で
ライブラリをベイトセットと接触させることを含む。
一実施形態において、段階（ｂ）は、表面上のベイトセット、例えば複数のベイトを含
む基材上に配置されたベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、段階（ｃ）は、メンバー中の標的／対象核酸との配列特異的相互
作用に依存するかまたはそれを含む方法によって、例えば、メンバー中の標的／対象核酸
に結合するプライマーを用いて、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによっ
て、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む。
一実施形態において、段階（ｃ）は、プライマー対を用いて複数の選択メンバーの各メ
ンバーを増幅することを含み、そのメンバーの標的／対象核酸にプライマー対の少なくと
も一方のメンバーが結合しない。
一実施形態において、段階（ｃ）は、メンバー中の標的／対象核酸との配列特異的相互
作用に依存しないか、またはそれを含まない方法によって複数の選択メンバーの各メンバ
ーを増幅すること含む。
一実施形態において、段階（ｃ）は、メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライ
マー対を用いて複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メ
ンバーの各メンバーを増幅することを含む。
一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。
一実施形態において、対象区間は発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間のクローン
プロファイルを評価することを含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間での第１の対立遺伝子またはシグネチャー（
例えば第１のＶセグメント）の配列を、比較値、例えば予め選択された値、例えば第２の
対立遺伝子またはシグネチャー（例えば第２のＶセグメント）の配列の関数である値と比
較することを含む。
一実施形態において、本方法は、
（ｅ）（ｉ）対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現（サブゲ
ノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル）、存在量または同一性、例えば配列
、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または対象区間での複数の配列、シ
グネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値；または
（ｉｉ）可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部での
インデルの形成による、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結、またはＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ３
から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であっ
て、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の対象区間について存在する異な
る変異体の数の関数である値
を得ることをさらに含む。
一実施形態において、（ｉ）は、対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチ
ャーの存在量に対する、対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対
的存在量についての値を得ることを含む。一実施形態において、（ｉ）は、第２の対象区
間での第２の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、対象区間での第１
の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む。
一実施形態において、（ｉ）は、対象区間での複数の配列、対立遺伝子またはシグネチ
ャーの存在量に対する、対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対
的存在量についての値を得ることを含む。
一実施形態において、（ｉ）は、発現サブゲノム区間で、配列、対立遺伝子またはシグ
ネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることを含む
。
一実施形態において、本方法は、対応するサブゲノム区間での、配列、対立遺伝子また
はシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ること
をさらに含む。
一実施形態において、（ｉｉ）は、対象区間で生じる、異なる配列、対立遺伝子または
シグネチャーの数についての値を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｅ）（ｉ）を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、シグネチャーに対して（ｅ）（ｉ）を得ることを含む
。
一実施形態において、本方法は、対立遺伝子に対して（ｅ）（ｉ）を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｅ）（ｉｉ）を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、第１の対象区間での、配列、対立遺伝子またはシグネ
チャー、例えばＶセグメント、またはＶＤＪもしくはＶＪ再編成のクローンプロファイル
；および
ｉ）対象の表現型、例えば疾患状態；または
ｉｉ）第２の対象区間での遺伝子型、例えば表１～９から選択される遺伝子またはＭＨ
Ｃ遺伝子、例えばＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の遺伝子型、
を提供することを含む。
一実施形態において、表現型は、
感染因子、例えば、細菌、ウイルス、原生動物または真菌による感染；
疾患のステージ；
障害、例えば癌の遺伝子型の変化；
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における
変化、例えば癌の場合、転移の発現；
処置発現（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｓ）への反応性；
疾患または障害の進行、再燃、再発または持続；
疾患に関連する薬剤への事前の曝露；
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応；
対象からのプロテオミクスデータ；
年齢；
性別；
体重；
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置；または
環境的もしくは職業的要因
を含む。
一実施形態において、第２の対象区間での遺伝子型は、例えば表１～９からの遺伝子に
おける、体細胞突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む。
一実施形態において、段階（ｄ）は：
（ｉ）対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Ｖセグメントを含む対
象区間の第１の出現およびＶセグメントを含む区間の第２の出現の配列を得ることを含み
、この第１および第２の出現は、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部での多様性によって異なる
か；または
（ｉｉ）第１の対象区間および第２の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば
第１の対象区間は第１の遺伝子からの配列を含み、第２の対象区間は第２の遺伝子からの
配列を含む。
一実施形態において、段階（ｄ）は、対象区間の複数の出現、例えば、ＶＤＪ配列を含
む対象区間の複数の出現、例えば、特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特定
のＪセグメントを含むＶＤＪ配列を含む対象区間の複数の出現、のそれぞれの配列を得る
ことを含む。
一実施形態において、対象区間の複数の出現の第１の出現は、サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、対象区間の複数の出現の第２の出現は、サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、対象区間の複数の出現の第１の出現は、発現サブゲノム区間を含
む。
一実施形態において、対象区間の複数の出現の第２の出現は、発現サブゲノム区間を含
む。
一実施形態において、対象区間の複数の出現の第１の出現は、サブゲノム区間、例えば
再編成、例えば転座を含み；対象区間の複数の出現の第２の出現は、発現サブゲノム区間
、例えばサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これは例えば、ゲノムの
、例えば体細胞ゲノムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその
発現の相対的存在量の評価を可能にする。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現
またはレベルを評価することを含む。
一実施形態において、段階（ｄ）は、第１の対象区間および第２の異なる対象区間の配
列を得ることを含み、例えば、第１および第２の区間は、対象区間からの異なるゲノム配
列、例えば第１の遺伝子からの配列および第２の遺伝子からの配列に対応する。
一実施形態において、第１の対象区間はＶＤＪセグメントの第１の組み合わせを含み、
第２の対象区間はＶＤＪセグメントの第２の組み合わせを含み、例えば第１の対象区間は
第１のＶセグメントを含み、第２の対象区間は第２のＶセグメントを含む。
一実施形態において、第１の対象区間は第１のサブゲノム区間を含み、第２の対象区間
は第２のサブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第１の対象区間は第１の発現サブゲノム区間を含み、第２の対象
区間は第２の発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第１の対象区間はサブゲノム区間を含み、第２の対象区間は発現
サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、評価することは、癌の第１のクローンに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、癌の第２のクローンに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、例えば参照物に対する、例えば、癌の第２のク
ローンの存在量に対する、癌の第１クローンの存在量についての値を提供することを含む
。
一実施形態において、本方法は、遺伝子型を含む癌の第１のクローンおよび第２の遺伝
子型を含む第２のクローンの相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、第１の突然変異、例えば再編成を含む癌の第１のクロ
ーンおよび突然変異を含まない第２のクローンの相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、第１の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む癌
の第１のクローンおよび第２の突然変異、例えば再編成、例えば転位を含む第２のものを
含まない第２のクローンの相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＶセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第２のＶセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＶセグメントおよび第２のＶセグメント
の相対的存在量についての値を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＤセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第２のＤセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＤセグメントおよび第２のＤセグメント
の相対的存在量についての値を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＪセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第２のＪセグメントに対するクローンプロファ
イルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＪセグメントおよび第２のＪセグメント
の相対的存在量についての値を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対する
クローンプロファイルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第２のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対する
クローンプロファイルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、第１のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせおよび第
２のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせの相対的存在量についての値を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、抗体軽鎖に対するクローンプロファイルを提供
することを含む。
一実施形態において、評価することは、抗体重鎖に対するクローンプロファイルを提供
することを含む。
一実施形態において、評価することは、抗体軽鎖および抗体重鎖の相対的存在量の値を
提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、サブゲノム区間における配列、対立遺伝子また
はシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子また
はシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシ
グネチャーに対する、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャ
ーについての相対的存在量についての値を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、対象区間中の遺伝子座、例えばＶ、Ｄ、または
Ｊセグメントにおける高頻度変異に対する可変性を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、例えば対象区間において連結部でインデルを形
成することによって、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部から生じる可変性を提供することを含
む。
一実施形態において、評価することは、対象区間においてＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ３
における可変性を提供することを含む。
一実施形態において、評価することは、表１０からの配列（またはその配列を含む細胞
）に対するクローンプロファイルを提供することを含む。
Figure 0007245872000001
一実施形態において、本方法は、（ｅ）（ｉ）についての値を得ることを含む。
一実施形態において、（ｅ）（ｉ）の値は、比較値、例えば予め選択された値、例えば
第２の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子（例えば第２のＶセグメント）の存在量の関
数である値に対する、対象区間における配列、シグネチャーまたは対立遺伝子（例えば第
１のＶセグメント）の存在量についての値を含む。
一実施形態において、（ｅ）（ｉ）の値は、比較値、例えば予め選択された値、例えば
事象を欠く配列、例えば対象区間中の非突然変異または非再編成配列の存在量の関数であ
る値に対する、対象区間における事象、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例
えば突然変異または再編成の存在量についての値を含む。
一実施形態において、（ｅ）（ｉ）の値は、対象区間でＸ個の固有の（すなわち互いに
異なる）配列、シグネチャーまたは対立遺伝子のそれぞれについての相対的存在量の値を
含む。
一実施形態において、Ｘは、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、
５０、１００または２００以上である。
一実施形態において、Ｘは、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００
，０００、１０，０００，０００または５０，０００，０００以上である。
一実施形態において、本方法は、例えば、存在量の関数、例えば相対的存在量として、
例えばヒストグラムとして、（ｅ）（ｉ）の値を表示することをさらに含む。
一実施形態において、対象区間は、Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えばＴ細胞受容
体またはＢ細胞受容体からの配列を含む。
一実施形態において、対象区間は、Ｖセグメント、ＤセグメントまたはＪセグメントか
らの配列を含む。
一実施形態において、対象区間は、表１０からの配列を含む。
一実施形態において、本方法は、Ｖセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子に
ついての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、複数の、Ｖセグメント配列、シグネチャーまたは対立
遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｊセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子に
ついての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、複数の、Ｊセグメント配列、シグネチャーまたは対立
遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｄセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子に
ついての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、複数の、Ｄセグメント配列、シグネチャーまたは対立
遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺
伝子についての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、複数の、クラススイッチ領域配列、シグネチャーまた
は対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｅ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）を得ることを含む
。
一実施形態において、本方法は、（ｅ）（ｉｉ）についての値を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、体細胞高頻度変異からの可変性についての値を得るこ
とを含む。
一実施形態において、本方法は、例えば、連結部でのインデルの形成によってＶＤ、Ｄ
ＪまたはＶＪ連結部から生じる可変性についての値を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、ＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ３可変性から生じる可変性
についての値を得ることを含む。
一実施形態において、対象区間は、表１０からの配列を含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の固有のコピー、例えば、対象区間で
の複数の固有のシグネチャー、の配列を得ることを含む。
一実施形態において、（ｅ）（ｉｉ）における値は、対象区間に対する複数の、例えば
Ｘ個のシグネチャーにおける配列多様性についての値を含む。
一実施形態において、値は、対象区間での固有のシグネチャーの数を含む。
一実施形態において、値は、対象区間での固有のシグネチャーの表示、記録または一覧
を含む。
一実施形態において、値は、例えば、対象区間の総コピーの関数としての固有のコピー
の数の尺度を含む。
一実施形態において、Ｘは、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、
５０、１００、２００、３００、４００または５００以上である。
一実施形態において、Ｘは、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００
，０００、１０，０００，０００または５０，０００，０００以上である。
一実施形態において、複数のシグネチャーは全て、単一のＶＤＪまたはＶＪの組み合わ
せに対するものであり、例えば、選択されたＶＤＪまたはＶＪの組み合わせにおける配列
多様性についての値を提供する。
一実施形態において、可変性は、セグメント連結、例えば、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結
部での多様性、例えば連結部での挿入または欠失からの可変性を含む。
一実施形態において、可変性は、体細胞高頻度変異からの可変性を含む。
一実施形態において、複数のシグネチャーのそれぞれは、異なるＶＤＪまたはＶＪの組
み合わせに対するものである。
一実施形態において、可変性は、セグメント連結部、例えば、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連
結部での多様性、例えば連結部での挿入または欠失からの可変性を含む。
一実施形態において、ライブラリは、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む対象、例えばマン
トル細胞癌を含む対象からのＢ細胞から作製される。
一実施形態において、対象区間は、Ｂ細胞受容体からの、Ｖ、ＤもしくはＪセグメント
またはＶＤもしくはＤＪ連結部をコードする配列を含む。
一実施形態において、本方法は、可変性、例えば体細胞高頻度変異、の量を比較値と比
較することをさらに含み、比較値との予め選択された関係、例えば比較値より大きいこと
は、疾患の、転帰、予後またはステージを示す。
一実施形態において、本方法は、ライブラリを単一のベイトセットと接触させることを
含む。
一実施形態において、本方法は、ライブラリを複数のベイトセットと接触させることを
含む。
一実施形態において、本方法は、
対象区間での配列；
対象区間でのシグネチャー；または
対象区間での対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適
化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させ
ることを含む。
一実施形態において、本方法は、
対象区間での第２の配列；
対象区間での第２のシグネチャー；または
対象区間での第２の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化
されている、またはそれとハイブリッド形成する第２のベイトセットとライブラリを接触
させることを含む。
一実施形態において、本方法は、複数の、例えば少なくともＸ個の固有のベイトセット
と接触させることを含み、複数のベイトセットのそれぞれは、
対象区間からの異なる配列；
対象区間での異なるシグネチャー；または
対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化
されている、またはこれとハイブリッド形成し、
Ｘは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００または２００と同等であ
る。
一実施形態において、本方法は、
対象区間での第１の配列および第２の配列；
対象区間での第１のシグネチャーおよび第２のシグネチャー；または
対象区間での第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化
されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、
対象区間からの少なくともＸ個の配列；
対象区間での少なくともＸ個のシグネチャー；または
対象区間での少なくともＸ個の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化
されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、
Ｘは、独立に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００または２００と
同等である。
一実施形態において、本方法は、対象もしくは試料における対象区間で存在しない、第
１の配列、対立遺伝子もしくはシグネチャーを捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択さ
れた効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成
するベイトセットと接触させることを含む。
一実施形態において、対象区間は、表１０からの配列を含む。
一実施形態において、本方法は、第１のＶ、ＤもしくはＪセグメントからの配列および
第２のＶ、ＤもしくはＪセグメントからの配列を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選
択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド
形成するベイトセットと接触させることを含む。
一実施形態において、対象区間は、Ｖ、ＤまたはＪセグメントの配列を含む。
一実施形態において、本方法は、Ｖセグメント（ＤまたはＪセグメントではない。）を
捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとラ
イブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｄセグメント（ＶまたはＪセグメントではない。）を
捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとラ
イブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｊセグメント（ＶまたはＤセグメントではない。）を
捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットとラ
イブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｖセグメントを捕捉するように最適化されているかま
たはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｄセグメントを捕捉するように最適化されているかま
たはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、Ｊセグメントを捕捉するように最適化されているかま
たはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部にまたがる（１つまたは
複数の）ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、再編成されたＶＤＪまたはＶＪ配列にまたがる（１つ
または複数の）ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、核酸類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）または二環式核酸（ＢＮＡ）を含む（１つまたは複数の）ベイトを含む
ベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
一実施形態において、本方法は、機能的であるために十分に長いが、親和性最適化に十
分短い（１つまたは複数の）ベイトを含むベイトセットとライブラリを接触させることを
含む。
一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。
一実施形態において、対象区間は発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間の配列を得ることおよび発現サブゲノ
ム区間の配列を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価するこ
とを含む。
一実施形態において、本方法は、発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価す
ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価するこ
とおよび発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現
またはレベルを評価することを含み、例えば、シグネチャー、例えば再編成、例えば転座
が対応するサブゲノム区間に存在する。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現
またはレベルを評価することを含み、例えば、シグネチャー、例えば再編成、例えば転座
は、対応するサブゲノム区間における存在量の関数である。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチ
ャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーに
ついての相対的存在量についての値を提供することを含む評価することを含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを
含み；
段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの１つが、対象区間の第１の出現および対象区
間の第２の出現に対して個別に行われ、例えば段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち１
つが、第１の出現に対して第１の反応混合物中で、および第２の出現に対して第２の反応
混合物中で行われる。
一実施形態において、（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）およ
び（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または（ａ）、（ｂ）および（ｃ
）は個別に行われる。
一実施形態において、対象区間の複数の固有のコピーの第１のコピーは、サブゲノム区
間を含む。
一実施形態において、対象区間の複数の固有のコピーの第２のコピーは、サブゲノム区
間、例えばサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、複数のうち第１の出現はサブゲノム区間を含み、例えばこのサブ
ゲノム区間は、ＶＤＪ配列、例えば、特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特
定のＪセグメントを含むＶＤＪ配列を含み；
複数のうち第２の出現は発現サブゲノム区間を含み、例えばこの発現サブゲノム区間は
、ＶＤＪ配列、例えば特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特定のＪセグメン
トを含むＶＤＪ配列を含む。
一実施形態において、対象区間の第１の出現は、発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、対象区間の第２の出現は、発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを
含み；
段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１つが、対象区間の第１の出現に
対しておよび対象区間の第２の出現に対して同じ反応混合物中で行われる。
一実施形態において、（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）およ
び（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）の全てが同じ反応混合物中で行われる。
一実施形態において、
段階（ｂ）において、対象区間の複数の出現の第１のコピーを第１のベイトセットと接
触させ、
段階（ｂ）において、対象区間の第２の出現を第２のベイトセット、例えば、第１のベ
イトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第２のベイトセットと接
触させる。
一実施形態において、段階（ｂ）において、対象区間の複数の固有のコピーの第１のコ
ピーをベイトセットと接触させ；段階（ｂ）において、対象区間の複数の固有のコピーの
第２のコピーを同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ（１つま
たは複数の）ベイトを含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間および第２の異なる対象区間（異なるとは、
異なる染色体位置から、を意味する。）の配列を得ることを含み、段階（ａ）、（ｂ）お
よび（ｃ）のうち１つは、第１の対象区間のために第１の反応混合物において、および第
２の対象区間のために第２の反応混合物中で行われる。
一実施形態において、（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）およ
び（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）の全てが個別に行われる。
一実施形態において、対象区間はサブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第２の異なる対象区間はサブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第１の対象区間は発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第２の異なる対象区間は発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、第１の対象区間はサブゲノム区間を含み、第２の異なる対象区間
は発現サブゲノム区間を含む。
一実施形態において、本方法は、対象区間および第２の異なる対象区間（異なるとは、
異なる染色体位置から、を意味する。）の配列を得ることを含み、段階（ａ）、（ｂ）お
よび（ｃ）のうち少なくとも１つは、第１の対象区間のためにおよび第２の対象区間のた
めに同じ反応混合物中で行われる。
一実施形態において、（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）およ
び（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）の全てが同じ反応混合物中で行われる。
一実施形態において、段階（ｂ）において、第１の対象区間を第１のベイトセットと接
触させ；段階（ｂ）において、第２の対象区間を第２のベイトセット、例えば、第１のベ
イトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第２のベイトセットと接
触させる。
一実施形態において、段階（ｂ）において、第１の対象区間をベイトセットと接触させ
；段階（ｂ）において、第２の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベ
イトセットが同じ（１つまたは複数の）ベイトを含む。
一実施形態において、本方法は、段階（ａ）～（ｄ）を反復すること段階を含む。
一実施形態において、本方法は、次の１つ以上の後に、段階（ａ）～（ｄ）を反復する
ことを含む：
予め選択された期間の経過；
障害、例えば癌の遺伝子型変化；
障害の発現における変化、例えば癌の場合は、処置に対する攻撃性または耐性における
変化、例えば癌の場合は、転移の発現；
処置発現（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｓ）への反応性欠如；または
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性。
一実施形態において、ライブラリは染色体ＤＮＡから作製される。
一実施形態において、ライブラリは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製される。
一実施形態において、本方法は：
（ａ）染色体ＤＮＡから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクローンプロフ
ァイルを評価すること；
（ｂ）ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間の
クローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の選択配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定
するために、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
一実施形態において、段階（ａ）およびまたは（ｂ）は、
（ｉ）対象区間での対立遺伝子の分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写コピーの
出現またはレベル）存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、対立遺
伝子または複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値；または
（ｉｉ）対象区間でのシグネチャーの分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写コピ
ーの出現またはレベル）存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、シ
グネチャー、または複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値；または
（ｉｉｉ）シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異について
の値
を得ることを含む。
一実施形態において、
段階（ａ）は（ｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉ）を含むか；
段階（ａ）は（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉ）を含むか；または
段階（ａ）は（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）は（ｉｉｉ）を含む。
一実施形態において、ライブラリは、疾患状態組織から、例えば癌細胞から作製される
。
一実施形態において、ライブラリは、固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫瘍か
らの細胞から作製される。
一実施形態において、ライブラリは、浸潤固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫
瘍を有する細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞から作製される。
一実施形態において、ライブラリは、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）、例えば、本
明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの細胞から作製される。
一実施形態において、ライブラリは無細胞ＤＮＡから作製される。
一実施形態において、ライブラリは、非疾患状態の組織から作製される。
一実施形態において、ライブラリは、末梢血、骨髄、腫瘍組織、腫瘍浸潤細胞、リンパ
球、Ｂ細胞、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞または無細胞ＤＮＡから作製される。
一実施形態において、ライブラリは、腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤Ｂ細胞、プレＢ細
胞、成熟Ｂ細胞またはＴ細胞から作製される。
一実施形態において、ライブラリは、末梢Ｂ細胞、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞またはＴ細
胞、例えばＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋、Ｔ細胞から作製される。
一実施形態において、本方法は、非疾患状態組織、例えば腫瘍を付随しない細胞、例え
ば非腫瘍細胞、または末梢血リンパ球に対するクローンプロファイルを評価することを含
む。
一実施形態において、本方法は、疾患状態組織、例えば腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞に
対する、または非癌性障害に対するクローンプロファイルを評価することを含む。
一実施形態において、ライブラリはＴ細胞から作製され、サブゲノム区間はＴ細胞受容
体、例えばアルファ／ベータまたはデルタ／ガンマ、ＴＣＲ鎖をコードする配列を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば、第１の細胞タイプから作製された、例えば、
第１の細胞タイプからの染色体ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製されたライ
ブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば、第２の細胞タイプから作製された、例えば、
第２の細胞タイプからの染色体ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製されたライ
ブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
（ｂ）第２の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること；およ
び
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
一実施形態において、本方法は：
（ａ）染色体ＤＮＡから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイル
を評価すること；
（ｂ）ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばｃＤＮＡから作製されたライブラリからの対象
区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
（ｂ）第２の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
一実施形態において、この第１の期間は予め選択された事象の前であり、第２の期間は
予め選択された事象の後であり、この予め選択された事象は、感染、医学的または外科的
手順、例えば移植、診断、処置、例えば第１選択の処置もしくは第２選択の処置を受ける
こと、再発または再燃または疾患を含み得る。
一実施形態において、本方法は、
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローン
プロファイルを評価すること；および
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローン
プロファイルを評価すること
を含む。
一実施形態において、本方法は、
疾患状態細胞からの第１の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのク
ローンプロファイルを評価すること；および
疾患状態細胞からの第２の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャ
ーのクローンプロファイルを評価すること
を含む。
一実施形態において、対象は癌を有する。別の実施形態において、対象は、血液悪性腫
瘍（または前悪性腫瘍）を有する。さらに別の実施形態において、対象は固形腫瘍を有す
る。
一実施形態において、ライブラリはＢ細胞から作製され、対象はＢ細胞悪性腫瘍、例え
ばマントル細胞癌を有する。
一実施形態において、対象は癌以外の障害を有する。
一実施形態において、対象は、免疫障害、例えば自己免疫障害、免疫不全、例えば遺伝
性もしくは後天性免疫不全、例えばＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染を有する。
一実施形態において、対象は、移植片レシピエント、例えば、骨髄レシピエント、実質
臓器レシピエントまたは皮膚移植片レシピエントである。
一実施形態において、対象は、感染または感染性疾患、例えば、ウイルス性、細菌性、
原生動物性または真菌性の感染もしくは疾患を有する。
一実施形態において、対象区間は、クローン事象を代表する、ヌクレオチド位置または
連結部または配列を含む。
一実施形態において、対象区間は、Ｔ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを代表する、
ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む。
一実施形態において、段階（ｃ）または本方法は、メンバー中の標的／対象核酸との配
列特異的相互作用に依存する方法によって、例えば、メンバー中の標的／対象核酸に結合
するプライマーを用いて、複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のもの
の各メンバーまたは何れかのメンバーを増幅することを含まない。
一実施形態において、段階（ｄ）は、
前記ライブラリからのメンバー（またはライブラリキャッチ）からの対象区間に対する
リードを得て；
複数のメンバーのそれぞれについて、対象区間内のヌクレオチド位置に対するリードか
らヌクレオチド値を割り当てること
を含む。
一実施形態において、本方法は、複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の５
’または３’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む。
一実施形態において、本方法は、複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の５
’および３’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む。
一実施形態において、前記の複数のメンバーの各メンバーは、５’から３’方向に、５
’アダプター配列、対象配列（例えばゲノム配列または転写配列）および３’アダプター
を含む。
一実施形態において、前記の複数のメンバーの各メンバーは、５’から３’方向に、５
’アダプター配列、対象配列（例えばゲノム配列または転写配列）および３’アダプター
を含み、このアダプターのうち１つは、識別子、例えばバーコードとして機能し得る配列
を含む。
一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、アダプター配列に特異的なプ
ライマーを用いて増幅される。
一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、５’アダプターに結合するプ
ライマーまたは３’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増
幅される。
一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、５’アダプターに結合するプ
ライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される。
一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、３’アダプターに結合するプ
ライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される。
一実施形態において、この複数メンバーの各メンバーは、アダプター配列に特異的なプ
ライマーおよびメンバーにおける標的／対象核酸に特異的なプライマーを用いて増幅され
る。
一実施形態において、段階（ｄ）は、
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば
前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対
するリードを得て；
アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリード
をアライメントし；
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオチド値を割り当て
る（例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然変異を呼び出す）
ことを含む。
対象区間に対するクローンプロファイルを提供するための本明細書中に記載の方法は、
他の情報を提供する方法で増強され得る。一実施形態において、本方法は、例えば、体細
胞再編成または体細胞高頻度変異を受けない遺伝子、例えば、免疫グロブリン遺伝子以外
およびＴ細胞受容体遺伝子以外の遺伝子に対してクローンプロファイルが提供されるもの
以外の遺伝子に対する対象区間の配列を提供し得る。これらの配列は、関心のある核酸を
回収するための溶液ハイブリダイゼーションおよびベイトの使用によって提供され得る。
一実施形態において、本方法は、第２の、例えば第２の対象区間、例えば表１～９から
選択される本明細書中に記載の遺伝子からの配列を含む対象区間の配列を提供することを
さらに含む。
一実施形態において、本方法は、第２の、例えば第２の対象区間、例えばｍｉＲＮＡ、
プロモーターまたは他の要素をコードする配列を含む対象区間の配列を提供することをさ
らに含む。
一実施形態において、本方法は、免疫グロブリンまたはＴ細胞またはＢ細胞受容体遺伝
子以外の遺伝子からのものである第２の対象区間の配列を提供することをさらに含む。一
実施形態において、本方法は、例えば表１～９から選択される、第３の、または少なくと
もＸ個のさらなる対象区間の配列を提供すること（Ｘは４、５、６、７、８、９、１０、
５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００
と等しい。）を含む。
一実施形態において、第３の、またはＸ個のさらなる対象区間は、免疫グロブリン、Ｂ
細胞受容体またはＴ細胞受容体遺伝子以外の遺伝子由来である。
一実施形態において、Ｘは、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２
００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００以上である。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪
性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例えば表１０から
選択される第１の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細
胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される第２の対象区間の配
列を提供すること
を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪
性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例えば表１０から
選択される第１の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細
胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される、第２、第３または
少なくともＸ個のさらなる対象区間の配列を提供すること（Ｘは、４、５、６、７、８、
９、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０ま
たは５００に等しい。）
を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪
性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例えば表１０から
選択される、第１の、第２の、または少なくともＸ個のさらなる対象区間のクローンプロ
ファイルを評価すること（Ｘは、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１
５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００に等しい。）；お
よび
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細
胞から作製されたライブラリからの、例えば、表１～９から選択される、（Ｘ＋１）番目
の対象区間の配列を提供すること
を含む。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪
性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例えば表１０から
選択される１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、
１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上）
の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細
胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される１つ以上（例えば、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３０
０、３５０、４００、４５０、５００以上）の対象区間の配列を提供すること
を含む。
一実施形態において、第１の細胞タイプまたは第１の細胞タイプから作製されたライブ
ラリは、第２の細胞タイプまたは第２の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる
試料と同じ試料から得られる。例えば、試料は、非癌細胞（または非悪性細胞、例えば腫
瘍浸潤リンパ球）および癌細胞（または悪性細胞）の両方を含有し得る。
一実施形態において、第１の細胞タイプまたは第１の細胞タイプから作製されたライブ
ラリは、第２の細胞タイプまたは第２の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる
試料とは異なる試料から得られる。例えば、第１の細胞タイプ、または第１の細胞タイプ
から作製されたライブラリが得られる試料は、非癌細胞（または非悪性細胞、例えば腫瘍
浸潤リンパ球）を含有し得、本質的に癌細胞（または悪性細胞）不含であり；第２の細胞
タイプまたは第２の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料は、癌細胞（ま
たは悪性細胞）を含有し得、本質的に非癌細胞（または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リ
ンパ球）不含である。
一実施形態において、第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプは、同時に得られる。
別の実施形態において、第１の細胞タイプは、例えば、第２の細胞タイプが得られる前、
少なくとも１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ
月、５カ月または６カ月前に得られる。また別の実施形態において、第１の細胞タイプは
、例えば、第２の細胞タイプが得られた後、少なくとも１日、２日、３日、１週間、２週
間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月後に得られる。
一実施形態において、本方法は、第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞
（例えば腫瘍浸潤リンパ球）を試料、例えば腫瘍試料から単離することをさらに含む。別
の実施形態において、本方法は、第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞を試料
、例えば腫瘍試料から単離することをさらに含む。また別の実施形態において、本方法は
、第１の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）を単
離し；第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞を、試料、例えば腫瘍試料から単
離することをさらに含む。
一実施形態において、本方法は、第１の細胞タイプ（例えば非癌細胞または非悪性細胞
、例えば腫瘍浸潤リンパ球）、第２の細胞タイプ（例えば癌細胞または悪性細胞）または
両方を試料、例えば腫瘍試料から単離することなく行われ、例えばライブラリが作製され
る。
一実施形態において、本方法は、
（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリ、例え
ば本明細書中に記載のライブラリを得て；
（ｂ）それぞれが第２の（または続く）対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその
一部（本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例えば
溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、このライブラリをベイトセットと接
触させ；
（ｃ）例えばメンバー中での標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法
によって、例えば、メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数の
ものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し；
（ｄ）対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、第２の（または続く）対象区間の配列を提供することを含む。
一実施形態において、段階（ｄ）は、
（ｄ）（ｉ）例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバ
ー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノ
ム区間に対するリードを得て；
（ｄ）（ｉｉ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によっ
て前記リードをアライメントし；
（ｄ）（ｉｉｉ）予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオ
チド値を割り当てる（例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然
変異を呼び出す）
ことを含む。
別の態様において、本発明は、例えば、染色体腕の少なくとも５％、１０％、２０％、
３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％または全てを含む、全
腕または大きな再編成、例えば再編成、例えば転座、複製、挿入または欠失の発生につい
て対象を評価する方法であって；
（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て
；
（ｂ）それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部（本明細書中でラ
イブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼー
ションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ；
（ｃ）例えばメンバー中での標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法
によって、例えば、メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数の
ものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し；
（ｄ）全腕または大きな再編成の判定を可能にすることなどのために染色体上に配置さ
れる複数の対象区間の配列を得る
ことを含む方法を特色とする。
本明細書中で使用される場合、「大きな再編成」とは、例えば染色体の少なくとも約１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％もしくは７０％または染色体の腕（例え
ば長腕または短腕）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７
０％、８０％、９０％もしくは１００％に影響を及ぼす再編成を指す。
また別の態様において、本発明は対象を評価する方法であって、
（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複
数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て；
（ｂ）それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部（本明細書中でラ
イブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼー
ションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ；
（ｃ）例えばメンバー中での標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法
によって、例えば、メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数の
選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メンバーの各メンバーを
増幅し；
（ｄ）サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て
それによって対象を評価すること
を含む方法を特徴とし；
（ｉ）本方法は、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセ
ットとライブラリを接触させることを含み；
（ｉｉ）本方法は、サブゲノム区間を提供する第１のベイトセットおよび発現サブゲノ
ム区間を提供する第２のベイトセットとライブラリを接触させることを含み；
（ｉｉｉ）ライブラリはゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセット
と接触させられ、本方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触さ
せられるｃＤＮＡを含む第２のライブラリをさらに含み；
（ｉｖ）ライブラリはゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと
接触させられ、本方法は、発現サブゲノム区間を提供するために第２のベイトセットと接
触させられるｃＤＮＡを含む第２のライブラリをさらに含み；または
（ｖ）本方法は、第１の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために第１の反応
混合物において、および例えばサブゲノム区間に対応する、第２の対象区間、例えば発現
サブゲノム区間を提供するために第２の反応混合物において、段階（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）のうち１つを実施することを含む。
一実施形態において、（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）およ
び（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）の全てが個別に行われる。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は、独立して、表１～
４から選択される。
一実施形態において、本方法は、Ｘが、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５
０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００と等し
いかまたはこれを超える、少なくともＸ個の対象区間の配列を提供することを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は、同じ対象区間に対
応し、例えば、同じ遺伝子からの（１つまたは複数の）配列を含む。
一態様において、本発明は、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）、例えば本明細書中に
記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料を分析する方法を特徴とする。
本方法は、
（ａ）複数の標的メンバー、例えば腫瘍メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを
試料、例えば腫瘍試料から得て；
（ｂ）選択メンバー（本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることがある。
）を提供するために、１つまたは複数のライブラリをベイトセット（または複数のベイト
セット）と接触させてもよく；
（ｃ）例えば配列決定法によって、例えば次世代配列決定法で、ライブラリまたはライ
ブラリキャッチからの腫瘍メンバーからの対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現
サブゲノム区間）に対するリードを得て；
（ｄ）前記のリードをアライメントし；
（ｅ）予め選択されたヌクレオチド位置についての、例えば複数の対象区間（例えばサ
ブゲノム区間、発現サブゲノム区間または両方）のそれぞれ、例えば複数の遺伝子のそれ
ぞれ、における予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチ
ド値を割り当て（例えば、突然変異呼び出し、例えばＢａｙｅｉｓａｎ法によるもの）、
それによって前記の試料を分析することを含み：ここで、
（ｉ）Ｘ個のヌクレオチド位置のそれぞれを、段階（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ
）のうち１つまたは組み合わせについて固有の条件のセット下で分析してもよい（ここで
、固有とは、他のＸ－１個の条件のセットとは異なることを意味し、Ｘは少なくとも２、
５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００
、７００、８００、９００または１０００である。）。例えば、第１の条件のセット、例
えば本明細書中に記載の条件のセットは、例えば第１のサブゲノム区間または遺伝子にお
ける第１のヌクレオチド位置に対して使用され、第２の条件のセット、例えば本明細書中
に記載の第２の条件のセットは、第２のヌクレオチド位置に対して、例えば第２のサブゲ
ノム区間または遺伝子において使用され；
（ｉｉ）そのヌクレオチド位置で起こり得る予め選択された改変、例えば突然変異の特
徴、例えば本明細書中に記載の特徴に反応するＸ個のヌクレオチド位置のそれぞれについ
て、ヌクレオチド位置を固有の条件セット下で分析する（ここで、固有とは、他のＸ－１
個の条件のセットとは異なることを意味し、Ｘは少なくとも（ａｔ ｌｅｓｔ）２、５、
１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７
００、８００、９００または１０００である。）。例えば、第１の対象区間（サブゲノム
区間または発現サブゲノム区間）におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変
化、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位
置を第１の条件のセット下で分析し、第２の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発
現サブゲノム区間）におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変化、例えば突
然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位置を第２の条
件のセット下で分析する；
（ｉｉｉ）前記の方法が、少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３
００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の対象区間（
例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）、例えば遺伝子における
ヌクレオチド位置に対する９５、９８または９９％感度または特異性を可能にする条件下
で、試料、例えば保存腫瘍試料において行われる；または
（ｉｖ）本方法は、
ａ）約５００Ｘ以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち
５％を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、第１の対象区間（例えば
サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を配列決定すること；
ｂ）約２００Ｘ以上、例えば、約２００Ｘ～約５００Ｘの配列決定デプスを提供するた
めに、例えば試料からの細胞のうち１０％を超えないもので存在する突然変異を配列決定
するために、第２の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を配列
決定すること；
ｃ）約１０～１００Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えば、ａ）異なる薬物を患
者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム（ＰＧｘ）一塩基多型（ＳＮＰ）またはｂ）患
者を固有に同定するために使用され得るゲノムＳＮＰ（例えばフィンガープリント）から
選択される１つ以上の対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその
両方、例えばエクソン）を配列決定するために、第３の対象区間（例えばサブゲノム区間
または発現サブゲノム区間）を配列決定すること；
ｄ）約５～５０Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えば構造的限界点、例えばゲノ
ム転座またはインデルを検出するために、第４の対象区間（例えばサブゲノム区間または
発現サブゲノム区間）を配列決定すること
例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために５～５０Ｘの配
列対スパニングデプスを必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座／インデ
ルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用し得る；または
ｅ）約０．１～３００Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検
出するために、第５の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を
配列決定すること
のうち１つ以上または全てを含む。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の
変化を検出するために約０．１～１０Ｘの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態に
おいて、配列決定デプスは、ゲノムＤＮＡのコピー数の増加／減少またはヘテロ接合性喪
失（ＬＯＨ）を評価するために使用されるゲノムＳＮＰ／遺伝子座を検出するために、約
１００～３００Ｘの範囲である。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲ
ノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第１の
ライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第２の
ライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライ
ブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。
一実施形態において、第１のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはラ
イブラリキャッチを提供するために使用され、第２のベイトセットは、発現サブゲノム区
間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。
代表的な第１および第２の条件セットは、
第１のベイトセットが第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現区間）に対し
て使用され、第２のベイトセットが第２の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サ
ブゲノム区間）に対して使用され；
第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するリードに
第１のアライメント方法が適用され、第２の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現
サブゲノム区間）に対するリードに第２のアライメント方法が適用され；
第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）のヌクレオチド位
置に第１の突然変異呼び出し法が適用され、第２の対象区間（例えば、サブゲノム区間ま
たは発現サブゲノム区間）のヌクレオチド位置に第２の突然変異呼び出し方法が適用され
ること
を含む。
一実施形態において、
第１のベイト条件のセット、第１のアライメント方法および第１の突然変異呼び出し方
法で第１のヌクレオチド位置を分析し；
前記の第１のベイト条件のセット、第２のアライメント方法および前記の第１の突然変
異呼び出し方法で第２のヌクレオチド位置を分析し；
前記の第１のベイト条件のセット、前記の第１のアライメント方法および第２の突然変
異呼び出し方法で第３のヌクレオチド位置を分析し、
他の２つの条件と比較したとき、それぞれが固有の条件下で分析された３個のヌクレオ
チド位置を提供する。
一実施形態において、本条件は
第１のベイトセットが第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区
間）に対して使用され、第２のベイトセットが第２の対象区間（例えばサブゲノム区間ま
たは発現サブゲノム区間）に対して使用される；
第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するリードに
第１のアライメント方法が適用され、第２の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現
サブゲノム区間）に対するリードに第２のアライメント方法が適用される；または
第１の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）のヌクレオチド位
置に第１の突然変異呼び出し方法が適用され、第２の対象区間（例えばサブゲノム区間ま
たは発現サブゲノム区間）のヌクレオチド位置に第２の突然変異呼び出し方法が適用され
ること
を含む。
代表的な特徴としては、
（ｉ）変化が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制
因子、予め選択されたまたは変異体または変異体のタイプ、例えば突然変異を特徴とする
、または予め選択された頻度の突然変異を特徴とする遺伝子または遺伝子のタイプ、また
は本明細書中に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子のタイプ；
（ｉｉ）変化のタイプ、例えば、置換、挿入、欠失または転座；
（ｉｉｉ）変化について分析している試料のタイプ、例えば、ＦＦＰＥ試料、血液試料
または骨髄穿刺試料；
（ｉｖ）評価している変化のヌクレオチドの位置にあるかまたはその付近にある配列、
例えば、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するミスアラ
イメントについての予想される傾向に影響を与え得る配列、例えばヌクレオジテッド（ｎ
ｕｃｌｅｏｄｉｔｅｄ）位置にあるかまたはその付近にある反復配列の存在；
（ｖ）例えば予め選択されたタイプの腫瘍における、変化、例えば突然変異を示す選択
された型の腫瘍における突然変異を示すリードを観察する事前（例えば文献）期待値；
（ｖｉ）塩基呼び出しエラーのみによる変化を示すリードを観察する確率；または
（ｖｉｉ）変化を検出するために所望される予め選択された配列決定のデプス
が挙げられる。
一実施形態において、特徴は、配列決定されているヌクレオチドの同一性以外のもので
あり、例えば、この特徴は、配列がＡまたはＴであるか否かではない。
一実施形態において、段階（ｂ）が存在する。一実施形態において、段階（ｂ）は存在
しない。
一実施形態において、少なくともＸ個の遺伝子からのサブゲノム区間、例えば、表１～
４からの少なくともＸ個の遺伝子を異なる条件下で分析し、Ｘは、２、３、４、５、１０
、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、
４００、５００に等しいかまたはこれを超える。
一実施形態において、本方法は、次のうち１つ以上を含む：
（ｉ）本方法、例えば上記方法の段階（ｂ）は、本明細書中に記載のベイトセット、例
えば、「ベイト」という見出しの下で記載されるようなベイトセットの使用を含むか；
（ｉｉ）本方法、例えば上記方法の段階（ｃ）は、対象区間のセットまたは群（例えば
、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対して、または本明細書中に
記載の遺伝子のセットもしくは群からリードを得ることを含むか；
（ｉｉｉ）本方法、例えば上記方法の段階（ｄ）は、本明細書中に記載の複数のアライ
メント方法、例えば「アライメント」という見出しの下で記載される方法の使用を含むか
；
（ｉｖ）本方法、例えば上記方法の段階（ｅ）は、本明細書中に記載の、ヌクレオチド
値を予め選択されたヌクレオチド位置に割り当てるための複数の方法、例えば「突然変異
呼び出し」の見出しの下で、または「臨床癌検体の次世代配列決定からの、体細胞ゲノム
変化の高感度検出のためのベイジアン法」の題名のセクションに記載の方法の使用を含む
か；または
（ｖ）本方法は、本明細書中に記載の対象区間、例えば「遺伝子選択」という題名のセ
クションで本明細書中に記載のような、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその
両方のセットにヌクレオチド値を割り当てること
を含む。
一実施形態において、本方法は、（ｉ）および（ｉｉ）～（ｖ）のうち１、２、３個ま
たは全てを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｉｉ）および、（ｉ）および（ｉｉｉ）～（ｖ）の
うち１、２、３個または全てを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｉｉｉ）および、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）およ
び（ｖ）のうち１、２、３個または全てを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｉｖ）および、（ｉ）～（ｉｉｉ）および（ｖ）の
うち１、２、３個または全てを含む。
一実施形態において、本方法は、（ｖ）および、（ｉ）～（ｉｖ）のうち１、２、３個
または全てを含む。
アライメント
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に多数の多様な遺伝子における多数
の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法、例えば本明細書中に記載の癌
からの腫瘍試料を分析する方法において、性能を最適化するための複数の個別に調整され
たアライメント方法またはアルゴリズムの使用を統合し得る。実施形態において、リード
を分析するために、異なる遺伝子における多数の変異体のそれぞれに対して個別にカスタ
マイズまたは調整される複数のアライメント方法を使用する。実施形態において、調整は
、配列決定されている遺伝子（または他のサブゲノムイナーバル（ｉｎｅｒｖａｌ））（
のうち１つ以上）の機能、試料中の腫瘍タイプ、配列決定されている変異体または試料も
しくは対象の特徴であり得る。配列決定しようとする多数の対象区間（例えば、サブゲノ
ム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対して個々に調整されるアライメント条
件の選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較
的多数の多様な対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方
）に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。
したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性
腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、
を分析する方法を特徴とする。本方法は、
（ａ）試料からの複数メンバー、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む１つ
または複数のライブラリを得て；
（ｂ）例えば選択メンバー（本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることが
ある。）を提供するために、１つまたは複数のライブラリをベイトセット（または複数の
ベイトセット）と接触させることによって、予め選択された配列に対して１つまたは複数
のライブラリを濃縮してもよく；
（ｃ）例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバ
ー、例えばライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間、例
えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間に対するリードを得て；
（ｄ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記の
リードをアライメントし；
（ｅ）予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を
割り当て（例えばベイジアン法により、例えば突然変異を呼び出すこと）、
それによって前記の腫瘍試料を分析することを含み、
Ｘ個の固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方
）のそれぞれからのリードを、固有のアライメント方法でアライメントしてもよく、ここ
で、固有の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）は、他のＸ－１
個の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方）とは
異なることを意味し、固有のアライメント方法は、他のＸ－１個のアライメント方法とは
異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲ
ノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第１の
ライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第２の
ライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライ
ブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。
一実施形態において、第１のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはラ
イブラリキャッチを提供するために使用され、第２のベイトセットは、発現サブゲノム区
間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。
一実施形態において、段階（ｂ）が存在する。一実施形態において、段階（ｂ）は存在
しない。
一実施形態において、Ｘは少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０、１
００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０
００である。
一実施形態において、少なくともＸ個の遺伝子、例えば表１～４からの少なくともＸ個
の遺伝子からの対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方
）が、固有のアライメント方法でアライメントされ、Ｘは、２、３、４、５、１０、１５
、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００
、５００と等しいかまたはそれを超える。
一実施形態において、方法（例えば、上に列挙した方法の要素（ｄ））は、リードを分
析、例えばアライメントするためのアライメント方法を選択または使用することを含み、
前記のアライメント方法は、
（ｉ）腫瘍タイプ、例えば前記の試料中の腫瘍タイプ；
（ｉｉ）配列決定されている前記の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲ
ノム区間）が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、予め選択されたまたは変異
体もしくは変異体のタイプ、例えば突然変異、または予め選択された頻度の突然変異を特
徴とする、遺伝子または遺伝子のタイプ；
（ｉｉｉ）分析されている部位（例えばヌクレオチド位置）；
（ｉｖ）評価されている対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）
内の変異体のタイプ、例えば置換；
（ｖ）試料のタイプ、例えば、ＦＦＰＥ試料、血液試料または骨髄穿刺試料；および
（ｖｉ）評価されている前記のサブゲノム区間にあるかまたはその付近にある配列、例
えば前記の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するミスア
ライメントについての予想される傾向、例えば、前記の対象区間（例えばサブゲノム区間
または発現サブゲノム区間）にあるかまたはその付近にある反復配列の存在
のうち１つ以上または全ての関数であるか、それに対応して選択されるかまたはそれに対
して最適化される。
本明細書中の他の箇所で述べるように、方法は、比較的多数の対象区間（例えば、サブ
ゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対するリードのアライメントが最適
化される場合に特に有効である。したがって、一実施形態において、少なくともＸ個の固
有のアライメント方法が、少なくともＸ個の固有のサブゲノム区間に対するリードを分析
するために使用され、ここで固有とは他のＸ－１個とは異なることを意味し、Ｘは、２、
３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００
、６００、７００、８００、９００、１，０００と等しいかまたはそれを超える。
一実施形態において、表１～４からの少なくともＸ個の遺伝子からの対象区間（例えば
、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）を分析し、Ｘは、２、３、４、
５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、
３００、４００、５００と等しいかまたはそれを超える。
一実施形態において、少なくとも３、５、１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０
、９０、１００、２００、３００、４００または５００個の異なる遺伝子のそれぞれにお
いて対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に固有の
アライメント方法が適用される。
一実施形態において、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、
１６０または１８０、２００、３００、４００または５００個の遺伝子、例えば表１～４
からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態にお
いて、分析した前記の遺伝子の、少なくとも１０、２０、３０、４０または５０％のそれ
ぞれにおいて、対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に固有の
アライメント方法が適用される。
本明細書で開示される方法は、煩雑なリード、例えば、再配列を有するリードの迅速か
つ効率的なアライメントを可能にする。したがって、対象区間（例えばサブゲノム区間ま
たは発現サブゲノム区間）に対するリードが、再編成、例えばインデルを伴うヌクレオチ
ド位置を含む実施形態において、本方法は、適切に調整され、
予め選択される再編成とアライメントするために予め選択される再編成参照配列を、リ
ードとのアライメントのために選択すること（この実施形態において、参照配列はゲノム
再編成と同一ではない。）；
前記の予め選択された再編成参照配列とリードを比較する、例えばアライメントするこ
と；
を含むアライメント方法を使用することを含み得る。
実施形態において、煩雑なリードをアライメントするために他の方法が使用される。こ
れらの方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間に対するリードのアライメントが最適
化される場合に特に有効である。一例として、腫瘍試料を分析する方法は、
第１のパラメータのセット（例えば、第１のマッピングアルゴリズム、または第１の参
照配列を用いて）の下でリードの比較、例えばアライメント比較を行い、前記のリードが
第１の所定のアライメント基準を満たすか（例えば、このリードを前記の第１の参照配列
と、例えば予め選択されたミスマッチ数未満で、アライメントし得るか）否かを判定し；
前記のリードが第１の所定のアライメント基準に合致しない場合、第２のパラメータの
セット（例えば、第２のマッピングアルゴリズム、または第２の参照配列を用いて）の下
で第２のアライメント比較を行い；
前記のリードが前記の第２の所定の基準と合致するか（例えば、予め選択されたミスマ
ッチ数未満で前記の第２の参照配列とリードをアライメントし得るか）否かを判定しても
よい
ことを含み得、
ここで前記の第２のパラメータのセットは、パラメータのセット、例えば前記の第２の
参照配列の使用を含み、これは、前記の第１のパラメータのセットと比較して、予め選択
された変異体、例えば再編成、例えば挿入、欠失または転座に対するリードとのアライメ
ントの可能性が高くなる。
これらおよび他のアライメント方法は、本明細書中の他の箇所、例えば、「アライメン
ト」というセクションでより詳細に論じる。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析する方
法に含められ得る。実施形態において、「アライメント」という題名のセクションからの
アライメント方法は、「突然変異呼び出し」という題名のセクションからの突然変異呼び
出し方法および／または「ベイト」という題名のセクションからのベイトセットと組み合
わせられる。この方法は、「遺伝子選択」という題名のセクションからの対象区間（例え
ば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットに適用し得る。
突然変異呼び出し
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に、例えば腫瘍試料からの、例えば
本明細書中に記載の癌からの、多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大
規模並行配列決定に依存する方法において性能を最適化するために、カスタマイズされて
いるかまたは調整されている突然変異呼び出しパラメータの使用を統合し得る。この方法
の実施形態において、多数の予め選択された対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サ
ブゲノム区間またはその両方）のそれぞれに対する突然変異呼び出しは、個別にカスタマ
イズされるか、または微調整される。カスタマイズ化または調整は、本明細書中に記載の
因子の１つ以上、例えば、試料中の癌のタイプ、配列決定しようとする対象区間（例えば
サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）が位置する遺伝子、または配列決定しようと
する変異体に基づき得る。配列決定しようとする多数の対象区間（例えば、サブゲノム区
間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対して微調整されるアライメント条件のこの
選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多
数の多様な対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に
対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。
したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性
腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、
を分析する方法を特徴とする。本方法は、
（ａ）試料からの複数メンバー、例えば試料、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバ
ーを含む１つまたは複数のライブラリを得て；
（ｂ）選択されたメンバー、例えばライブラリキャッチを提供するために、例えばライ
ブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）と接触させることによって、予め選
択された配列に対して１つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく；
（ｃ）例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバ
ー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区
間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するリードを得て；
（ｄ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記の
リードをアライメントし；
（ｅ）予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を
割り当て（例えばベイジアン法または本明細書中に記載の呼び出し方法によって、例えば
突然変異を呼び出し）、それにより前記の腫瘍試料を分析すること
を含む。
ここで
固有の呼び出し方法によって、Ｘ個の固有の対象区間（サブゲノム区間、発現サブゲノ
ム区間またはその両方）のそれぞれにおいヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て
てもよく、ここで固有の対象区間（例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）
は、他のＸ－１個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその
両方）とは異なることを意味し、固有の呼び出し方法は、他のＸ－１個の呼び出し方法と
は異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。呼び出し方法は異なり得、それによっ
て、例えば異なるベイジアン事前値（ｐｒｉｏｒ ｖａｌｕｅ）に依存することにより、
固有であり得る。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現サブゲ
ノム区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第１の
ライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第２の
ライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライ
ブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。
一実施形態において、第１のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはラ
イブラリキャッチを提供するために使用され、第２のベイトセットは、発現サブゲノム区
間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。
一実施形態において、段階（ｂ）が存在する。一実施形態において、段階（ｂ）は存在
しない。
一実施形態において、前記のヌクレオチド値を割り当てることは、タイプの腫瘍におけ
る前記の予め選択されたヌクレオチド位置で、予め選択された変異体、例えば突然変異を
示すリードを観察する先行（例えば文献）期待値であるかまたはそれに相当する値の関数
である。
一実施形態において、本方法は、少なくとも１０、２０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００
または１０００個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当て
ること（例えば突然変異を呼び出すこと）を含み、ここで各割り当ては、タイプの腫瘍に
おける前記の予め選択されたヌクレオチド位置で、予め選択された変異体、例えば突然変
異を示すリードを観察する先行（例えば文献）期待値であるかまたはそれに相当する固有
の（他の割り当てについての値とは対照的）値の関数である。
一実施形態において、前記のヌクレオチド値を割り当てることは、変異体がある頻度（
例えば、１％、５％または１０％など）で試料中に存在する場合、および／または変異体
が存在しない（例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリードで観察される）場合、
前記の予め選択されたヌクレオチド位置で前記の予め選択された変異体を示すリードを観
察する確率を表す一連の値の関数である。
一実施形態において、方法（例えば、上記で列挙される方法の段階（ｅ））は、突然変
異呼び出し方法を含む。本明細書中に記載の突然変異呼び出し方法は、次のことを含み得
る：
前記Ｘ個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）
のそれぞれにおける予め選択されたヌクレオチド位置に対して、
（ｉ）タイプＸの腫瘍中の前記の予め選択されたヌクレオチド位置に、予め選択された
変異体、例えば突然変異を示すリードを観察する先行（例えば文献）期待値であるかまた
はそれを表す第１の値；および
（ｉｉ）変異体がある頻度（例えば、１％、５％、１０％など）で試料中に存在する場
合、および／または変異体が存在しない（例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリ
ードで観察される）場合、前記の予め選択されたヌクレオチド位置で前記の予め選択され
た変異体を示すリードを観察する確率を表す第２の値のセット
を得ること、
前記の値に応答して、第１の値を使用して第２のセット中の値の間で比較を、例えば本
明細書中に記載のベイジアン法によって、推測する（例えば、突然変異の存在の事後確率
を計算する）ことにより、前記の予め選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する前
記のリードからのヌクレオチド値を割り当て（例えば突然変異を呼び出し）、それによっ
て前記の試料を分析すること。
一実施形態において、本方法は、次のうち１つ以上または全てを含む：
（ｉ）少なくとも１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００
、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個の予め選
択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること（例えば突然変異を
呼び出すこと）であって、各割り当てが、（他の割り当てとは対照的に）固有の第１およ
び／または第２の値に基づくもの；
（ｉｉ）割り当ての少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０、１００、２００、３００、４００または５００が、例えば予め選択された腫瘍タイプ
における細胞の、５、１０または２０％未満で予め選択された変異体が存在する確率の関
数である第１の値を用いて行われる、（ｉ）の方法の割り当て；
（ｉｉｉ）少なくともＸ個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値
を割り当てること（例えば突然変異を呼び出すこと）であって、このそれぞれが、予め選
択されたタイプの腫瘍、例えば前記の試料の腫瘍タイプ中に存在する（他のＸ－１個の割
り当てとは対照的に）固有の確率を有する予め選択された変異体と関連し、Ｘ個の割り当
てのそれぞれが、（他のＸ－１個の割り当てとは対照的に）固有の第１および／または第
２の値に基づくものであってもよい（Ｘ＝２、３、５、１０、２０、４０、５０、６０、
７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００）；
（ｉｖ）第１および第２のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること（例え
ば突然変異を呼び出すこと）であって、前記の第１のヌクレオチド位置で第１の予め選択
された変異体が予め選択されたタイプの腫瘍（例えば前記の試料の腫瘍タイプ）中に存在
する可能性が、前記の第２のヌクレオチド位置に第２の予め選択された変異体が存在する
可能性よりも少なくとも２、５、１０、２０、３０または４０倍大きく、各割り当てが、
（他の割り当てとは対照的に）固有の第１の値および／または第２の値に基づいていても
よいもの；
（ｖ）複数の予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること（例
えば突然変異を呼び出すこと）であって、前記の複数のものが、次の確率範囲のうち１つ
以上、例えば少なくとも３、４、５、６、７または全てに入る変異体に対する割り当てを
含むこと：
０．０１以下；
０．０１より大きく０．０２以下；
０．０２より大きく０．０３以下；
０．０３より大きく０．０４以下；
０．０４より大きく０．０５以下；
０．０５より大きく０．１以下；
０．１より大きく０．２以下；
０．２より大きく０．５以下；
０．５より大きく１．０以下；
１．０より大きく２．０以下；
２．０より大きく５．０以下；
５．０より大きく１０．０以下；
１０．０より大きく２０．０以下；
２０．０より大きく５０．０以下；および
５０より大きく１００．０％以下；
ここで確率範囲は、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が予め
選択されたタイプの腫瘍（例えば前記の試料の腫瘍タイプ）において存在する確率または
、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が腫瘍試料中の細胞、腫瘍
試料からのライブラリまたは予め選択されたタイプ（例えば前記の試料の腫瘍タイプ）に
対するそのライブラリからのライブラリキャッチの列挙される％で腫瘍中に存在する確率
の範囲であり；
ここで、各割り当ては、固有の第１および／または第２の値に基づいてもよい（例えば
、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるかまたは、他の挙げられる
確率範囲の１つ以上または全てに対する第１のおよび／または第２の値とは対照的に固有
である。）。
（ｖｉ）前記の試料中のＤＮＡの５０、４０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、
２、１、０．５、０．４、０．３、０．２または０．１％未満で存在する予め選択された
変異体をそれぞれが独立に有する、少なくとも１、２、３、５、１０、２０、４０、５０
、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００
、８００、９００または１０００個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオ
チド値を割り当てること（例えば突然変異を呼び出すこと）であって；各割り当てが、（
他の割り当てとは対照的に）固有の第１および／または第２の値に基づいてもよいこと；
（ｖｉｉ）第１および第２のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること（例
えば突然変異を呼び出すこと）であって、前記の試料のＤＮＡ中の第１の位置での予め選
択された変異体の可能性が、前記の試料のＤＮＡ中の前記の第２のヌクレオチド位置での
予め選択された変異体の可能性よりも少なくとも２、５、１０、２０、３０または４０倍
大きく、各割り当てが、（他の割り当てとは対照的に）固有の第１の値および／または第
２の値に基づいてもよいこと；
（ｖｉｉｉ）次のもののうち１つ以上または全てにおいてヌクレオチド値を割り当てる
こと（例えば突然変異を呼び出すこと）：
（１）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の１％未満で予め選択された変異体が存在する、少
なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（２）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の１～２％で予め選択された変異体が存在する、少
なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（３）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の２％超から３％以下で予め選択された変異体が存
在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（４）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の３％超から４％以下で予め選択された変異体が存
在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（５）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の４％超から５％以下で予め選択された変異体が存
在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（６）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の５％超から１０％以下で予め選択された変異体が
存在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（７）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の１０％超から２０％以下で予め選択された変異体
が存在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（８）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の２０％超から４０％以下で予め選択された変異体
が存在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
（９）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラ
リからのライブラリキャッチ中の核酸の４０％超から５０％以下で予め選択された変異体
が存在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位置；
または
（１０）前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブ
ラリからのライブラリキャッチ中の核酸の５０％超から１００％以下で予め選択された変
異体が存在する、少なくとも１、２、３、４または５個の予め選択されたヌクレオチド位
置；ここで、各割り当てが、固有の第１および／または第２の値に基づくものであっても
よい（例えば、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるか（例えば１
％未満の（ｉ）における範囲）または、他の挙げられている範囲の１つ以上または全てに
おける判定に対する第１および／または第２の値とは対照的に固有である。）；または
（ｉｘ）他のＸ－１個のヌクレオチド位置での予め選択された変異体に対する可能性と
比較した場合に固有である（前記の試料のＤＮＡ中に予め選択された変異体が存在する）
可能性をそれぞれが独立に有するＸ個のヌクレオチド位置のそれぞれでヌクレオチド値を
割り当てること（例えば突然変異を呼び出すこと）であって、ここでＸが、１、２、３、
５、１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４０
０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上であり、各割り当てが
、（他の割り当てと対照的に）固有の第１および／または第２の値に基づくもの。
この方法の実施形態において、リードを評価し、リードからヌクレオチド位置について
の値、例えばある遺伝子中の特定の位置での突然変異の呼び出し、を選択するために、「
閾値」を使用する。この方法の実施形態において、多数の予め選択された対象区間（例え
ば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のそれぞれに対する閾値は、
カスタマイズされるか、または微調整される。カスタマイズまたは調整は、本明細書中に
記載の因子の１つ以上、例えば、試料中の癌のタイプ、配列決定しようとする対象区間（
サブゲノム区間または発現サブゲノム区間）が位置する遺伝子または配列決定しようとす
る変異体に基づき得る。これは、配列決定しようとする多数の対象区間（例えば、サブゲ
ノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のそれぞれに対して微調整される呼び出
しを提供する。本方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間を分析する場合に特に有効
である。
したがって、別の実施形態において、腫瘍を分析する方法は、次の突然変異呼び出し方
法：
前記のＸ個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方
）のそれぞれについて閾値を得ることであって、前記の得られたＸ個の閾値のそれぞれが
、他のＸ－１個の閾値と比較して固有であり、それによりＸ個の固有の閾値を提供するこ
と；
前記のＸ個の対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）
のそれぞれに対して、予め選択されたヌクレオチド位置における予め選択されたヌクレオ
チド値を有するリードの数の関数である実測値をその固有の閾値と比較し、それによって
前記のＸ個の対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）
のそれぞれにその固有の閾値を適用すること；および
前記の比較の結果に応じて、予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り
当ててもよいことを含み、
ここでＸは２以上である。
一実施形態において、本方法は、それぞれが独立に、０．５、０．４、０．２５、０．
１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１未満である確
率の関数である第１の値を有する少なくとも２、３、５、１０、２０、４０、５０、６０
、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８０
０、９００または１０００個の予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り
当てることを含む。
一実施形態において、本方法は、他のＸ－１個の第１の値と比較して固有である第１の
値をそれぞれが独立に有する少なくともＸ個のヌクレオチド位置のそれぞれにヌクレオチ
ド値を割り当てることを含み、前記のＸ個の第１の値のそれぞれは、０．５、０．４、０
．２５、０．１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１
未満である確率の関数であり、
Ｘは、１、２、３、５、１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、
２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上
である。
一実施形態において、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、
１６０または１８０、２００、３００、４００または５００個の遺伝子、例えば表１～４
からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態にお
いて、固有の第１および／または第２の値は、分析した前記の遺伝子の、少なくとも１０
、２０、３０、４０または５０％それぞれにおいて、対象区間（例えば、サブゲノム区間
、発現サブゲノム区間またはその両方）に適用される。
本方法の実施形態は、例えば次の実施形態から分かるように、比較的多数の対象区間（
例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対する閾値が最適化さ
れる場合に適用され得る。
一実施形態において、固有の閾値は、少なくとも３、５、１０、２０、４０、５０、６
０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８
００、９００または１０００個の異なる遺伝子のそれぞれにおいて対象区間、例えば、サ
ブゲノム区間または発現サブゲノム区間、に適用される。
一実施形態において、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、
１６０または１８０、２００、３００、４００または５００個の遺伝子、例えば表１～４
からの遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態にお
いて、分析された前記の遺伝子の少なくとも１０、２０、３０、４０または５０％のそれ
ぞれにおいて、サブゲノム区間に対して固有の閾値が適用される。
一実施形態において、表１～４からの少なくとも５、１０、２０、３０または４０個の
遺伝子におけるヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる。一実施形態において、
分析された少なくとも１０、２０、３０、４０または５０％の前記の遺伝子のそれぞれに
おいて、対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間）に固有の閾値が適用
される。
これらおよび他の突然変異呼び出し方法は、本明細書中の他の箇所、例えば、「突然変
異」という題名のセクションでより詳細に論じる。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析
する方法に含められ得る。実施形態において、「突然変異呼び出し」という題名のセクシ
ョンからのアライメント方法は、「アライメント」という題名のセクションからのアライ
メント方法および／または「ベイト」という題名のセクションからのベイトセットと組み
合わせられる。本方法は、「遺伝子選択」という題名のセクションからの対象区間（例え
ば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットに適用され得る。
ベイト
本明細書中に記載の方法は、配列決定しようとする標的核酸の選択のためのベイト、例
えば溶液ハイブリダイゼーションでの使用のためのベイトの適切な選択による、１名以上
の対象からの、試料、例えば腫瘍試料、例えば本明細書中に記載の癌からの多数の遺伝子
および遺伝子産物の最適化配列決定を提供する。予め選択された選択効率を有するベイト
セットに従って、様々な対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間または
その両方）またはそのクラスに対する選択効率を適合させる。このセクションで使用され
る場合、「選択効率」とは、（１つまたは複数の）標的対象区間（例えば、（１つまたは
複数の）サブゲノム区間、（１つまたは複数の）発現サブゲノム区間またはその両方）に
従って調節されるような配列カバレッジのレベルまたはデプスを指す。
したがって、方法（例えば、上記で列挙される方法の段階（ｂ））は、選択されたメン
バー（例えばライブラリキャッチ）を提供するためにライブラリを複数のベイトと接触さ
せることを含む。
したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性
腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、
を分析する方法を特徴とする。本方法は、
（ａ）試料からの複数のメンバー（例えば標的メンバー）、例えば腫瘍試料からの複数
の腫瘍メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを得て；
（ｂ）選択メンバー（例えばライブラリキャッチ）を提供するために、１つまたは複数
のライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）と接触させ；
（ｃ）例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバ
ー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区
間、例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方に対するリードを得て；
（ｄ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記の
リードをアライメントし；
（ｅ）予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を
割り当て（例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、例えば突然変異を
呼び出し）、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、 本方法は、複数の、例
えば少なくとも２、３、４または５個のベイトまたはベイトセットとライブラリを接触さ
せることを含んでいてもよく、前記の複数の各ベイトまたはベイトセットは、（複数にお
ける他のベイトと対照的に）固有の、予め選択された選択に対する効率を有する。例えば
、各固有のベイトまたはベイトセットは、配列決定の固有のデプスを提供する。本明細書
で使用される場合、「ベイトセット」という用語は、１つのベイトまたは複数のベイト分
子をまとめて指す。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーおよび発現ゲノム
区間に対応するメンバーが得られるライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第１の
ライブラリを得ることおよび、発現サブゲノム区間に対応するメンバーが得られる第２の
ライブラリを得ることを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間および発現区間の両方を含むメンバーまたはライ
ブラリキャッチを提供するために、ベイトセットが使用される。
一実施形態において、第１のベイトセットは、サブゲノム区間を含むメンバーまたはラ
イブラリキャッチを提供するために使用され、第２のベイトセットは、発現サブゲノム区
間を含むメンバーまたはライブラリキャッチを提供するために使用される。
一実施形態において、複数のものにおける第１のベイトセットの選択効率は、複数のも
のにおける第２のベイトセットの効率と少なくとも２倍異なる。一実施形態において、第
１および第２のベイトセットは、少なくとも２倍異なる配列決定のデプスを提供する。
一実施形態において、本方法は、次のベイトセットのうち１つまたは複数をライブラリ
と接触させることを含む：
ａ）約５００Ｘ以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち
５％を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、サブゲノム区間を含む十
分なメンバーを選択するベイトセット；
ｂ）約２００Ｘ以上、例えば、約２００Ｘ～約５００Ｘの配列決定デプスを提供するた
めに、例えば試料からの細胞のうち１０％を超えないもので存在する突然変異を配列決定
するために、サブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット；
ｃ）約１０～１００Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えば、ａ）異なる薬物を患
者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム（ＰＧｘ）一塩基多型（ＳＮＰ）またはｂ）患
者を固有に同定するために使用され得るゲノムＳＮＰ（例えばフィンガープリント）から
選択される１つ以上のサブゲノム区間（例えばエクソン）を配列決定するためにサブゲノ
ム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット；
ｄ）約５～５０Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えば構造限界点、例えばゲノム
転座またはインデルなどを検出するために、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現
サブゲノム区間）を含む十分なメンバーを選択するベイトセット。例えば、イントロン限
界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために５～５０Ｘの配列対スパニングデプスを
必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座／インデルが起こり易い癌遺伝子
を検出するために使用し得るか；または
ｅ）約０．１～３００Ｘ配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検
出するために、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含む十分
なメンバー選択するベイトセット。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の
変化を検出するために約０．１～１０Ｘの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態に
おいて、配列決定デプスは、ゲノムＤＮＡのコピー数の増加／減少またはヘテロ接合性喪
失（ＬＯＨ）を評価するために使用されるゲノムＳＮＰ／遺伝子座を検出するために、約
１００～３００Ｘの範囲である。このようなベイトセットは、例えば、増幅／欠失が起こ
り易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
本明細書で使用される場合の配列決定デプスのレベル（例えば、配列決定デプスのＸ倍
レベル）は、重複リード、例えばＰＣＲ重複リードの検出および除去後のリード（例えば
固有のリード）のカバレッジのレベルを指す。
一実施形態において、ベイトセットは、１つ以上の再編成、例えば、ゲノム再編成を含
有するイントロンを含有する対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間
）を選択する。このような実施形態において、ベイトセットは、選択効率を高めるために
反復配列が遮蔽されるように設計される。再編成が既知の連結配列を有する実施形態にお
いて、選択効率を高めるために、連結配列に対して相補的なベイトセットを設計し得る。
実施形態において、本方法は、それぞれが異なるベイト設計ストラテジーを有する２つ
以上の異なる標的カテゴリを捕捉するように設計されたベイトの使用を含む。実施形態に
おいて、本明細書中で開示されるハイブリッド捕捉方法および組成物は、標的配列の定め
られたサブセット（例えば、標的メンバー）を捕捉し、そのサブセットの外側のカバレッ
ジを最小限にしながら、標的配列の均質なカバレッジを提供する。一実施形態において、
標的配列は、ゲノムＤＮＡからのエクソン全体またはその選択されたサブセットを含む。
別の実施形態において、標的配列は、大きな染色体領域、例えば染色体アーム全体を含む
。本明細書に開示される方法および組成物は、複雑な標的核酸配列（例えば核酸ライブラ
リ）に対する異なるデプスおよびカバレッジのパターンを達成するための異なるベイトセ
ットを提供する。
一実施形態において、本方法は、１つまたは複数の核酸ライブラリの選択されたメンバ
ー（例えばライブラリキャッチ）を提供することを含む。本方法は、
複数のメンバー、例えば、標的核酸メンバー（例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メン
バーおよび／またはＰＧｘメンバーを含む。）を含む１つまたは複数のライブラリ（例え
ば１つまたは複数の核酸ライブラリ）を提供し；
複数のベイト／メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成する
ために、複数のベイト（例えばオリゴヌクレオチドベイト）と１つまたは複数のライブラ
リを、例えば溶液ベースの反応において接触させ；
例えば前記のハイブリダイゼーション混合物を、前記の複数のベイト／メンバーハイブ
リッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって前記のハイブリダイゼーシ
ョン混合物から複数のベイト／メンバーハイブリッドを分離し、
それによってライブラリキャッチ（例えば、１つまたは複数のライブラリからの核酸分
子の、選択されたまたは濃縮されたサブグループ）を提供すること
を含み、
この複数のベイトは、次のうち２つ以上を含んでいてもよい：
ａ）低頻度、例えば約５％以下で出現する（すなわち、試料からの細胞のうち５％がそ
れらのゲノムにおいて変化を保有する。）変化（例えば１つ以上の突然変異）に対する高
レベルの感度を可能にするために最大デプスのカバレッジが必要とされる、高レベルの標
的（例えば、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含む１つ以
上の腫瘍メンバー、このような遺伝子、エクソンまたは塩基）を選択する第１のベイトセ
ット。一実施形態において、第１のベイトセットは、約５００Ｘ以上の配列決定デプスを
必要とする変化（例えば点突然変異）を含む腫瘍メンバーを選択する（例えば、それに相
補的である。）。
ｂ）ａ）における高レベルの標的よりも高い頻度、例えば約１０％の頻度で（すなわち
、試料からの細胞のうち１０％がそれらのゲノムにおいて変化を保有する。）出現する変
化（例えば１つ以上の突然変異）に対する高レベルの感度を可能にするために高いカバレ
ッジが必要とされる、中程度のレベルの標的（例えば、遺伝子、エクソンまたは塩基など
、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含む１つ以上の腫瘍メ
ンバー）を選択する第２のベイトセット。一実施形態において、第２のベイトセットは、
約２００Ｘ以上の配列決定デプスを必要とする変化（例えば点突然変異）を含む腫瘍メン
バーを選択する（例えばそれと相補的である。）。
ｃ）高レベルの感度を可能にするために、例えばヘテロ接合性の対立遺伝子を検出する
ために、低－中程度のカバレッジが必要とされる、低レベルの標的（例えば、対象区間（
例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含む１つ以上のＰＧｘメンバー、例
えば遺伝子、エクソンまたは塩基など）を選択する第３のベイトセット。例えば、ヘテロ
接合性の対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために１０～１００Ｘの配列決
定デプスを必要とする。一実施形態において、第３のベイトセットは、ａ）患者が様々な
薬物を代謝する能力を説明し得る薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）一塩基多型（ＳＮＰ）または
ｂ）患者を固有に同定するために使用され得るゲノムＳＮＰ（例えばフィンガープリント
）から選択される１つ以上の対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間また
はその両方、例えばエクソン）を選択し；
ｄ）例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造的限界点を検出するために、低中程
度のカバレッジが必要とされる第１のイントロン標的（例えば、イントロン配列を含むメ
ンバー）を選択する第４のベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出
信頼性を確保するために５～５０Ｘの配列対スパニングデプスを必要とする。前記の第４
のベイトセットは、例えば、転座／インデル傾向のある癌遺伝子を検出するために使用し
得；または
ｅ）コピー数の変化を検出する能力を向上させるために低密度のカバレッジが必要とさ
れる第２のイントロン標的（例えばイントロンメンバー）を選択する第５のベイトセット
。例えば、いくつかの末端エクソンの１コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保する
ために０．１～３００Ｘのカバレッジを必要とする。一実施形態において、カバレッジの
デプスは、コピー数の変化を検出するために約０．１～１０Ｘの範囲である。他の実施形
態において、カバレッジのデプスは、ゲノムＤＮＡのコピー数の増加／減少またはヘテロ
接合性喪失（ＬＯＨ）を評価するために使用されるゲノムＳＮＰ／遺伝子座を検出するた
めに、約１００～３００Ｘの範囲である。前記の第５のベイトセットは、例えば、増幅／
欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
前述のベイトセットのうち２、３、４またはそれを超えるものの何らかの組み合わせを
使用し得、例えば、第１および第２のベイトセット；第１および第３のベイトセット；第
１および第４のベイトセット；第１および第５のベイトセット；第２および第３のベイト
セット；第２および第４のベイトセット；第２および第５のベイトセット；第３および第
４のベイトセット；第３および第５のベイトセット；第４および第５のベイトセット；第
１、第２および第３のベイトセット；第１、第２および第４のベイトセット；第１、第２
および第５のベイトセット；第１、第２、第３、第４のベイトセット；第１、第２、第３
、第４および第５のベイトセットの組み合わせなどである。
一実施形態において、第１、第２、第３、第４または第５のベイトセットのそれぞれは
、選択（例えば捕捉）のための予め選択された効率を有する。一実施形態において、選択
効率についての値は、ａ）～ｅ）による全５個のベイトのうち少なくとも２、３、４個に
ついて同じである。他の実施形態において、選択効率についての値は、ａ）～ｅ）による
全５個のベイトのうち少なくとも２、３、４個について異なる。
いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４または５個全てのベイトセットが
、異なる予め選択された効率値を有する。例えば、選択効率についての値は、次のうち１
つ以上（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）から選択される：
（ｉ）第１の予め選択された効率は、少なくとも約５００Ｘ以上の配列決定デプスであ
る第１の選択効率についての値を有する（例えば、第２、第３、第４または第５の予め選
択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。（例えば、第２の選択効
率についての値よりも約２～３倍大きく；第３の選択効率についての値よりも約５～６倍
大きく；第４の選択効率についての値よりも約１０倍大きく；第５の選択効率についての
値よりも約５０～５０００倍大きい。）；
（ｉｉ）第２の予め選択された効率は、少なくとも約２００Ｘ以上の配列決定デプスで
ある第２の選択効率についての値を有し、例えば、第３、第４または第５の予め選択され
た選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。（例えば、第３の選択効率につ
いての値よりも約２倍大きく；第４の選択効率についての値よりも約４倍大きく；第５の
選択効率についての値よりも約２０～２０００倍大きい。）；
（ｉｉｉ）第３の予め選択された効率は、少なくとも約１００Ｘ以上の配列決定デプス
である第３の選択効率についての値を有し、例えば、第４または第５の予め選択された選
択効率よりも大きい選択効率についての値を有する（例えば、第４の選択効率についての
値よりも約２倍大きく；第５の選択効率についての値よりも約１０～１０００倍大きい。
）；
（ｉｖ）第４の予め選択された効率は、少なくとも約５０Ｘ以上の配列決定デプスであ
る第４の選択効率についての値を有し、例えば、第５の予め選択された選択効率よりも大
きい選択効率についての値を有する（例えば、第５の選択効率についての値よりも約５０
～５００倍大きい。）；または
（ｖ）第５の予め選択された効率は、少なくとも約１０Ｘ～０．１Ｘ配列決定デプスで
ある第５の選択効率についての値を有する。
ある一定の実施形態において、選択効率についての値は、異なるベイトセットの差次的
な表示、ベイトサブセットの差次的な重複（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｖｅｒｌａｐ
）、異なるベイトパラメータ、異なるベイトセットの混合および／または異なるタイプの
ベイトセットの使用のうち１つ以上により改変される。例えば、選択効率の変動（例えば
、各ベイトセット／標的カテゴリの相対的配列カバレッジ）は、次のうち１つ以上を変更
することによって調整し得る：
（ｉ）異なるベイトセットの差次的な表示－相対的な標的カバレッジのデプスを増強／
低下させるために、所与の標的（例えば標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設
計は、より多くの／より少ないコピー数に含まれ得る；
（ｉｉ）ベイトセットの差次的な重複（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｖｅｒｌａｐ）
－相対的な標的カバレッジのデプスを増強／低下させるために、所与の標的（例えば標的
メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、近隣ベイト間のより長いかまたはより
短い重複を含み得る；
（ｉｉｉ）差次的ベイトパラメータ－捕捉効率を低下させ、相対的な標的カバレッジの
デプスを低下させるために、所与の標的（例えば標的メンバー）を捕捉するためのベイト
セット設計は、配列修飾／長さがより短いことを含み得る；
（ｉｖ）異なるベイトセットの混合－相対標的カバレッジのデプスを増強／低下させる
ために、異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比率で
混合し得る；
（ｖ）異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットの使用－ある一定の実施形態に
おいて、ベイトセットは次のものを含み得る：
（ａ）１つ以上の化学的に（例えば非酵素的に）合成された（例えば個別に合成された
）ベイト、
（ｂ）アレイにおいて合成された１つ以上のベイト、
（ｃ）１つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の何らかの組み合わせ、
（ｅ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば天然または非天然のＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド）、
（ｆ）１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば天然または非天然のＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド）、
（ｇ）（ｅ）および（ｆ）の組み合わせ、または
（ｈ）上記の何れかの組み合わせ。
異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせは、様々な比、例えば、１：１、１：２、１：
３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０；１：１００、１：１０００などか
ら選択される比率で混合され得る。一実施形態において、化学合成されたベイトとアレイ
生成ベイトとの比率は、１：５、１：１０または１：２０から選択される。ＤＮＡまたは
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。ある一定の実施形態におい
て、ベイトは、例えば融解温度を上昇させるために１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む
。代表的な非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが
挙げられる。代表的な修飾ヌクレオチド（例えば修飾ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド）
としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）（ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素およ
び４’炭素を連結する余分な架橋で修飾される。）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、
ペプチド結合によって連結された繰り返しＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から
構成されるＰＮＡ；低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌ
クレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシ
シチジン；および２，６－ジアミノプリンが挙げられるが限定されない。他の修飾ＤＮＡ
およびＲＮＡヌクレオチドは当技術分野で公知である。
ある一定の実施形態において、標的配列（例えば標的メンバー）の実質的に均一または
均質なカバレッジが得られる。例えば、各ベイトセット／標的カテゴリ内で、ベイトパラ
メータを修飾することによって、例えば次のうち１つ以上によって、カバレッジの均一性
を最適化し得る：
（ｉ）同じカテゴリ中の他の標的に対して過小／過剰にカバーされる標的（例えば標的
メンバー）のカバレッジを拡大／縮小させるために、ベイト表示または重複を増加／減少
させることを使用し得る；
（ｉｉ）低カバレッジのために、標的配列（例えば高ＧＣ含量配列）を捕捉することが
困難である場合、例えば隣接配列（例えばＧＣリッチ度がより低い隣接配列）をカバーす
るようにベイトセットで標的化される領域を拡大する；
（ｉｉｉ）ベイトの二次構造を減少させ、その選択効率を高めるために、ベイト配列の
修飾をなし得る；
（ｉｖ）同じカテゴリ内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション速度を等しくす
るために、ベイトの長さの変更を使用し得る。（長さが様々なベイトを作製することによ
って）直接、または（一貫した長さのベイトを作製し、ベイト末端を任意の配列で置き換
えることによって）間接的にベイト長を変更し得る；
（ｖ）同じ標的領域（すなわちフォワードおよびリバース鎖）に対して異なる向きのベ
イトを修飾することで、結合効率が異なり得る。各標的に対して最適のカバレッジを提供
する何れかの方向性を有するベイトセットを選択し得る；
（ｖｉ）各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ（例えばビオチン）の量を変
更することは、その結合効率に影響を及ぼし得る。相対標的カバレッジを拡大／縮小させ
るために、特定の標的を標的とするベイトのタグレベルを増加／減少させることを使用し
得る；
（ｖｉｉ）標的への結合親和性に影響を及ぼし、相対標的カバレッジを拡大／縮小させ
るために、異なるベイトに対して使用されるヌクレオチドのタイプを変更し得る；または
（ｖｉｉｉ）高ＧＣ含量に対して低いまたは通常のＧＣ含量の領域間での融解ハイブリ
ダイゼーション速度を等しくするために、修飾オリゴヌクレオチドベイトを用いること、
例えばより安定な塩基対形成を有することを使用し得る。
例えば、異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットを使用し得る。
一実施形態において、選択効率についての値は、予め選択された標的領域を包含するた
めに異なるタイプのベイトオリゴヌクレオチドを使用することによって修正される。例え
ば、大きな標的領域（例えば１～２ＭＢの全標的領域）をカバーするために、第１のベイ
トセット（例えば１０，０００～５０，０００のＲＮＡまたはＤＮＡベイトを含むアレイ
に基づくベイトセット）を使用し得る。予め選択された標的領域（例えば、標的領域の関
心のある全域、例えば２５０ｋｂ以下の選択されたサブゲノム区間）をカバーするために
、第２のベイトセット（例えば５，０００個未満のベイトを含む個別に合成されたＲＮＡ
またはＤＮＡベイトセット）および／またはより高い二次構造、例えばより高いＧＣ含量
の領域を第１のベイトセットに添加し得る。関心のある選択対象区間（例えば、サブゲノ
ム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、本明細書中に記載の遺伝子もしくは遺
伝子産物のうち１つ以上またはその断片に対応し得る。第２のベイトセットは、所望のベ
イト重複に応じて、約１～５，０００、２～５，０００、３～５，０００、１０～５，０
００、１００～５，０００、５００～５，０００、１００～５，０００、１，０００～５
，０００、２，０００～５，０００個のベイトを含み得る。他の実施形態において、第２
のベイトセットは、第１のベイトセットに添加される選択オリゴベイト（例えば、４００
、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１個未満のベ
イト）を含み得る。第２のベイトセットは、個々のオリゴベイトのあらゆる比率で混合さ
れ得る。例えば、第２のベイトセットは、１：１の等モル比として存在する個々のベイト
を含み得る。あるいは、第２のベイトセットは、例えば、ある一定の標的（例えば、ある
一定の標的は、他の標的と比較して５～１０Ｘの第２のベイトを有し得る。）の捕捉を最
適化するために、異なる比率（例えば、１：５、１：１０、１：２０）で存在する個々の
ベイトを含み得る。
他の実施形態において、ベイトの当モル混合を使用した場合に観察される異なる配列捕
捉効率に関連してベイトの相対的存在量または結合実体の密度（例えばハプテンまたは親
和性タグ密度）を調整し、次いで内部水平化した群２に対して、全体的なベイト混合物に
差次的過剰量の内部水平化した群１を導入することにより、群内（例えば、第１、第２ま
たは第３の複数のベイト）で個々のベイトの効率を等しくすることによって、選択効率が
調整される。
一実施形態において、本方法は、腫瘍メンバー、例えば、腫瘍細胞からの対象区間（例
えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含む核酸分子を選択するベイトセット
（本明細書で「腫瘍ベイトセット」とも呼ばれる。）を含む複数のベイトセットの使用を
含む。腫瘍メンバーは、腫瘍細胞中に存在する何らかのヌクレオチド配列、例えば腫瘍ま
たは癌細胞中に存在する本明細書中に記載のような突然変異型、野生型、ＰＧｘ、参照ま
たはイントロンヌクレオチド配列であり得る。一実施形態において、腫瘍メンバーは、低
頻度で出現する変化（例えば１つ以上の突然変異）を含み、例えば、腫瘍試料からの細胞
の約５％以下がそれらのゲノムにおいて変化を有する。他の実施形態において、腫瘍メン
バーは、腫瘍試料からの細胞の約１０％の頻度で出現する変化（例えば１つ以上の突然変
異）を含む。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、ＰＧｘ遺伝子または遺伝子産物か
らのサブゲノム区間、イントロン配列、例えば、本明細書中に記載のようなイントロン配
列、腫瘍細胞中に存在する参照配列を含む。
別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のベイトセット、本明細書中に記載の
個々のベイトセットの組み合わせ、例えば本明細書中に記載の組み合わせを特徴とする。
（１つまたは複数の）ベイトセットは、説明書、標準物質、緩衝液または酵素または他の
試薬を含んでいてもよいキットの一部であり得る。
遺伝子選択
分析のための予め選択された対象区間、例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間
またはその両方、例えば遺伝子および他の領域のセットまたは群に対するサブゲノム区間
の群またはセットが本明細書中で記載される。
したがって、一実施形態において、方法は、得られた核酸試料からの少なくとも５、６
、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の、表１～４から選択され
る、遺伝子または遺伝子産物からの対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノ
ム区間）を例えば次世代配列決定法によって配列決定し、それにより、例えば本明細書中
に記載の癌からの腫瘍試料を分析することを含む。
したがって、一態様において、本発明は、試料、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性
腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料、
を分析する方法を特徴とする。本方法は、
（ａ）試料からの複数メンバー、例えば、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）、例えば
本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）からの腫瘍試料からの複数の腫瘍
メンバーを含む１つまたは複数のライブラリを得て；
（ｂ）選択メンバー（例えばライブラリキャッチ）を提供するために、例えば１つまた
は複数のライブラリをベイトセット（または複数のベイトセット）と接触させることによ
って、予め選択した配列に対して１つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく；
（ｃ）例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例
えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間（例
えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に対するリードを得て；
（ｄ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記の
リードをアライメントし；
（ｅ）予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を
割り当て（例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、突然変異を呼び出
し）、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、
本方法は、試料からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、
またはそれ以上の、表１～４から選択される、遺伝子または遺伝子産物からの対象区間（
例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を例えば次世代配列決定法によって配
列決定することを含んでいてもよい。
一実施形態において、段階（ｂ）が存在する。一実施形態において、段階（ｂ）は存在
しない。
別の実施形態において、次のセットまたは群の１つの対象区間（例えば、サブゲノム区
間、発現サブゲノム区間またはその両方）を分析する。例えば、腫瘍または癌遺伝子また
は遺伝子産物、参照（例えば野生型）遺伝子または遺伝子産物およびＰＧｘ遺伝子または
遺伝子産物に関連する対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはそ
の両方）は、腫瘍試料からサブゲノム区間の群またはセットを提供し得る。
一実施形態において、本方法は、リード、例えば配列、腫瘍試料からの対象区間（例え
ば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットを得るが、ここで、
この対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、次の
もののうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７または全てから選択される：
Ａ）表１～４による突然変異型または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物からの、少なく
とも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の対象区間、例
えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方；
Ｂ）腫瘍または癌に関連する遺伝子または遺伝子産物（例えば陽性または陰性処置反応
予測因子であるか、陽性または陰性予後因子であるかまたは腫瘍もしくは癌の鑑別診断を
可能とするもの、例えば表１～４による遺伝子または遺伝子産物）からの少なくとも５、
６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０
、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の対象区間（例えばサブ
ゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方）；
Ｃ）表１～４から選択される、薬物代謝、薬物反応性または毒性の１つ以上に関連する
遺伝子または遺伝子産物（そこでＰＧｘ遺伝子とも呼ばれる。）に存在するサブゲノム区
間の突然変異型または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物（例えば一塩基多型（ＳＮＰ））
からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６
０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の
対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方）；
Ｄ）表１～４から選択される、（ｉ）薬物で処置された癌患者のより良好な生存率（例
えばパクリタキセルで処置された乳癌患者のより良好な生存率）；（ｉｉ）パクリタキセ
ル代謝；（ｉｉｉ）薬物に対する毒性；または（ｉｖ）薬物に対する副作用のうち１つ以
上に関連する遺伝子または遺伝子産物中に存在する対象区間（例えばサブゲノム区間また
は発現サブゲノム区間）の突然変異型もしくは野生型ＰＧｘ遺伝子または遺伝子産物（例
えば一塩基多型（ＳＮＰ））からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、
５００個、またはそれ以上の対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間
またはその両方）；
Ｅ）表１～４による少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、ま
たはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化；
Ｆ）表１～４から選択される少なくとも５個の遺伝子または遺伝子産物であって、例え
ば予め選択された位置での対立遺伝子の多様性が予め選択されたタイプの腫瘍と関連し、
前記の対立遺伝子の多様性が、前記の腫瘍タイプにおける細胞の５％未満で存在するもの
；
Ｇ）ＧＣリッチ領域に埋め込まれている表１～４から選択される少なくとも５個の遺伝
子または遺伝子産物；または
Ｈ）癌発症のための遺伝（例えば、生殖系列リスク）要因（例えば、遺伝子または遺伝
子産物は表１～４から選択される。）を示す少なくとも５個の遺伝子または遺伝子産物。
また別の実施形態において、本方法は、リード、例えば配列、腫瘍試料からの対象区間
（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットを得るが、こ
こでこの対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、
表１に記載の遺伝子または遺伝子産物のうち、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ま
たは全てから選択される。
また別の実施形態において、本方法は、リード、例えば配列、腫瘍試料からの対象区間
（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットを得るが、こ
こでこの対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、
表２に記載の遺伝子または遺伝子産物のうち、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０または全てから選択される。
また別の実施形態において、本方法は、リード、例えば配列、腫瘍試料からの対象区間
（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットを得るが、こ
こでこの対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、
表３に記載の遺伝子または遺伝子産物のうち、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００または全て
から選択される。
また別の実施形態において、本方法は、リード、例えば配列、腫瘍試料からの対象区間
（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）のセットを得るが、こ
こでこの対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、
表４に記載の遺伝子または遺伝子産物のうち、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または全てから選択される。
これらおよび他のサブゲノム区間のセットおよび群は、本明細書の他の箇所、例えば、
「遺伝子選択」という題名のセクションでより詳細に論じる。
本明細書中に記載の方法の何れも、以下の実施形態の１つ以上と組み合わせ得る。
他の実施形態において、試料は腫瘍試料であり、例えば、１つ以上の前悪性または悪性
細胞を含む。ある一定の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、血液悪性腫瘍（ま
たは前悪性腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）から得
られる。ある一定の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、固形腫瘍、軟部組織腫
瘍または転移性病変から得られる。他の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、切
除縁からの組織または細胞を含む。ある一定の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料
は、腫瘍浸潤リンパ球を含む。試料は、組織学的に正常な組織であり得る。別の実施形態
において、試料、例えば腫瘍試料は、１つ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）（例えば血液試
料から得られるＣＴＣ）を含む。一実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、１つ以
上の非悪性細胞を含む。一実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、１つ以上の腫瘍
浸潤リンパ球を含む。
一実施形態において、本方法は、試料、例えば、本明細書中に記載の腫瘍試料を得るこ
とをさらに含む。試料は、直接的または間接的に得られ得る。一実施形態において、試料
は、悪性細胞および非悪性細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の両方を含有する試料から
、例えば単離または精製によって得られる。
他の実施形態において、本方法は、本明細書中に記載の方法を使用して、試料、例えば
組織学的に正常な試料、例えば切除縁からのもの、を評価することを含む。出願人は、組
織学的に正常な組織から得られた試料（例えば他の点では組織学的に正常な組織縁）が、
本明細書に記載されるような変化を依然として有し得ることを発見した。したがって、本
方法は、検出された変化の存在に基づいて組織試料を再分類することをさらに含み得る。
別の実施形態において、得られるかまたは分析されるリードの少なくとも１０、２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、本明細書中に記載の遺伝子、例え
ば表１～４からの遺伝子からの対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間ま
たはその両方）に対するものである。
一実施形態において、本方法で生成される突然変異呼び出しの少なくとも１０、２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、本明細書中に記載の遺伝子または
遺伝子産物、例えば表１～４からの遺伝子または遺伝子産物からの対象区間（例えばサブ
ゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対するものである。
一実施形態において、本方法において使用される固有の閾値の少なくとも１０、２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、本明細書中に記載の遺伝子または
遺伝子産物、例えば表１～４からの遺伝子または遺伝子産物からの対象区間（例えばサブ
ゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対するものである。
一実施形態において、第三者に対してアノテーションされるかまたは報告される突然変
異呼び出しの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％
は、本明細書中に記載の遺伝子または遺伝子産物、例えば表１～４からの遺伝子または遺
伝子産物からの対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）
に対するものである。
一実施形態において、本方法は、腫瘍および／または対照核酸試料（例えばＦＦＰＥ由
来核酸試料）から得られたヌクレオチド配列リードを得ることを含む。
一実施形態において、リードは、ＮＧＳ配列決定方法によって提供される。
一実施形態において、本方法は、核酸メンバーの１つまたは複数のライブラリを提供し
、前記の１つまたは複数のライブラリの複数のメンバーから、予め選択されたサブゲノム
区間を配列決定することを含む。実施形態において、本方法は、配列決定のための前記の
１つまたは複数のライブラリのサブセットを選択する段階、例えば溶液ベースの選択また
は固体支持体（例えばアレイ）ベースの選択を含み得る。
一実施形態において、本方法は、核酸の選択サブグループ、例えばライブラリキャッチ
を提供するために、１つまたは複数のライブラリを複数のベイトに接触させる段階を含む
。一実施形態において、接触段階は溶液ハイブリダイゼーションにおいて行われる。別の
実施形態において、接触段階は、固体支持体、例えばアレイにおいて行われる。ある一定
の実施形態において、本方法は、１回以上のさらなるハイブリダイゼーションによってハ
イブリダイゼーション段階を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法
は、同じまたは異なるベイト収集物を用いた１回以上のさらなるハイブリダイゼーション
にライブラリキャッチを供することをさらに含む。
さらに他の実施形態において、本方法は、ライブラリキャッチを分析することをさらに
含む。一実施形態において、ライブラリキャッチは、配列決定方法、例えば、本明細書中
に記載のような次世代配列決定方法によって分析される。本方法は、例えば、溶液ハイブ
リダイゼーションによってライブラリキャッチを単離し、核酸配列決定にそのライブラリ
キャッチを供することを含む。ある一定の実施形態において、ライブラリキャッチを再配
列決定し得る。次世代配列決定方法は当技術分野で公知であり、例えばＭｅｔｚｋｅｒ，
Ｍ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：
３１－４６に記載されている。
一実施形態において、ヌクレオチド位置に対する割り当て値は、説明的なアノテーショ
ン付きで第三者に伝達してもよい。
一実施形態において、ヌクレオチド位置に対する割り当て値は、第三者に伝達されない
。
一実施形態において、複数のヌクレオチド位置に対する割り当て値は、場合によっては
説明的なアノテーション付きで、第三者に伝達され、第２の複数のヌクレオチド位置に対
する割り当て値は第三者に伝達されない。
一実施形態において、少なくとも０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．１、
０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１５また
は３０メガ塩基の塩基、例えばゲノム塩基を配列決定する。
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つのＳＮＰを含む複数のリードを評価す
ることを含む。
一実施形態において、本方法は、試料および／または対照リード中のＳＮＰ対立遺伝子
比を決定することを含む。
一実施形態において、本方法は、例えばバーコード解析によって１つ以上のリードを対
象に割り当てることを含む。
一実施形態において、本方法は、例えば、バーコード解析によって、腫瘍リードまたは
対照リードとして１つ以上のリードを割り当てることを含む。
一実施形態において、本方法は、例えば、参照配列とのアライメントによって、前記の
１つ以上のリードのそれぞれをマッピングすることを含む。
一実施形態において、本方法は、呼び出された突然変異を提出（ｍｅｍｏｒｉａｌｉｚ
ｉｎｇ）することを含む。
一実施形態において、本方法は、呼び出された突然変異にアノテーションすること、例
えば突然変異構造、例えばミスセンス突然変異、または機能、例えば疾患表現型、の指標
がある呼び出された突然変異にアノテーションすることを含む。
一実施形態において、本方法は、腫瘍および対照核酸に対するヌクレオチド配列リード
を得ることを含む。
一実施形態において、本方法は、例えばベイジアン呼び出し法または非ベイジアン呼び
出し法によって、対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方
）のそれぞれに対する、ヌクレオチド値、例えば変異体、例えば突然変異を呼び出すこと
を含む。
一実施形態において、例えば異なる対象からの複数の試料が同時に処理される。
本明細書で開示される方法は、対象のゲノムまたはトランスクリプトームに存在する変
化を検出するために使用し得、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定、例えば標的化ＲＮＡおよび
／またはＤＮＡ配列決定に適用し得る。したがって、本発明において特徴となる別の態様
は、本明細書中に記載の変化を検出するための、標的化ＲＮＡ配列決定、例えば試料、例
えばＦＦＰＥ試料、血液試料または骨髄穿刺試料から得られたＲＮＡ由来のｃＤＮＡの配
列決定ための方法を含む。この変化は、再編成、例えば遺伝子融合をコードする再編成で
あり得る。他の実施形態において、本方法は、遺伝子または遺伝子産物のレベルの変化（
例えば増加または減少）、例えば、本明細書中に記載の遺伝子または遺伝子産物の発現の
変化の検出を含む。本方法は、標的ＲＮＡについて試料を濃縮する段階を含んでいてもよ
い。他の実施形態において、本方法は、ある一定の高存在量のＲＮＡ、例えばリボソーム
またはグロビンＲＮＡの試料を枯渇させる段階を含む。ＲＮＡ配列決定方法は、単独で、
または本明細書中に記載のＤＮＡ配列決定方法と組み合わせて使用し得る。一実施形態に
おいて、本方法は、ＤＮＡ配列決定段階およびＲＮＡ配列決定段階を実施することを含む
。本方法は、あらゆる順序で行い得る。例えば、本方法は、本明細書中に記載の変化の発
現をＲＮＡ配列決定することによって確認すること、例えば本発明のＤＮＡ配列決定方法
によって検出される突然変異または融合の発現を確認することを含み得る。他の実施形態
において、本方法は、ＲＮＡ配列決定段階を行い、続いてＤＮＡ配列決定段階を行うこと
を含む。
別の態様において、本発明は、標的化サブゲノム領域に対する配列決定／アライメント
アーチファクトのデータベースを構築することを含む方法を特徴とする。実施形態におい
て、偽の突然変異呼び出しを除去し、特異性を改善するために、データベースを使用し得
る。一実施形態において、データベースは、無関係の非腫瘍（例えばＦＦＰＥ、血液また
は骨髄穿刺）試料または細胞株の配列決定を行い、これらの正常試料の１つ以上において
無作為の配列決定エラーのみに起因する、予想されるものよりも頻度が高いと思われる非
参照対立遺伝子事象を記録することによって構築される。このアプローチは、生殖系列変
異をアーチファクトとして分類し得るが、それは体細胞突然変異に関する方法では許容可
能である。アーチファクトとしての生殖細胞系列変異のこの誤分類は、必要に応じて、既
知の生殖系列変異（共通変異体の除去）に対して、および１個体のみに出現するアーチフ
ァクトに対して（希少変異の除去）このデータベースをフィルタリングすることにより、
改善し得る。
本明細書中で開示される方法は、例えば、ゲノムの癌関連セグメントに適用されるよう
な、最適化されたベイトに基づく選択、最適化されたアライメントおよび最適化された突
然変異呼び出しを含む多数の最適化された要素の統合を可能にする。本明細書中に記載の
方法は、癌ごと、遺伝子ごとおよび部位ごとに最適化し得る腫瘍のＮＧＳに基づく分析を
提供する。これは、例えば、本明細書中に記載の遺伝子／部位および腫瘍タイプに適用し
得る。本方法は、所定の配列決定技術を用いて突然変異検出に対する感度および特異性の
レベルを最適化する。癌ごと、遺伝子ごと、および部位ごとの最適化は、臨床製品にとっ
て必須である非常に高いレベルの感度／特異性（例えば両方について＞９９％）を提供す
る。
本明細書に記載される方法は、最適処置および疾患管理の決断を知らせるために、日常
的な実在の試料からの、次世代配列決定技術を用いた、臨床および規制グレードの包括的
な分析および妥当に実用可能な遺伝子の包括的セット（これは一般的には５０～５００個
の遺伝子の範囲であり得る。）に対するゲノム異常の解釈を提供する。
本明細書中に記載の方法は、最適処置および疾患管理の判断を知らせるために、腫瘍試
料を送付してその腫瘍に対するゲノムおよび他の分子の変化の包括的な分析および説明を
受領する腫瘍専門医／病理学者のためのワンストップショッピングを提供する。
本明細書中に記載の方法は、標準的な入手可能な腫瘍試料を採取するロバストで現実的
な臨床癌診断ツールを提供し、１つの試験で、どの異常が腫瘍の原因になり得、腫瘍専門
医に処置判断を伝えるのに有用であり得るかの包括的な説明を腫瘍専門医に提供するため
に、包括的なゲノムおよび他の分子の異常分析を提供する。
本明細書中に記載の方法は、臨床グレードの品質の、患者の癌ゲノムの包括的分析を提
供する。方法は、最も関連性の高い遺伝子および潜在的な変化を含み、突然変異、コピー
数、再編成、例えば転座、発現およびエピジェネティックマーカーの分析のうち１つ以上
を含む。遺伝子分析の結果は、実施可能な結果の記述的報告とともに状況を説明し得る。
方法は、この使用を関連する科学的および医学的知識の最新のセットと結び付ける。
本明細書中に記載の方法は、ケアの質および効率の両方の向上をもたらす。これには、
腫瘍が、標準治療がないかまたは確立された一連の治療が患者にとって無効であるような
、稀であるかまたはあまり研究されていないタイプのものであり、さらなる治療の選択の
ための、または臨床試験参加のための合理的根拠が有用であり得る、適用を含む。例えば
、方法は、治療の何れかの時点で、腫瘍専門医が意思決定を伝えるために利用可能な完全
な「分子イメージ」および／または「分子サブ診断」を有することによって利益を得る選
択を可能にする。
本明細書中に記載の方法は、患者または別の者または実体、例えば介護者、例えば医師
、例えば腫瘍専門医、病院、クリニック、第三者の支払人、保険会社または官公庁に、例
えば電子、ウェブベースまたは紙形態で、レポートを提供することを含み得る。この報告
は、本方法からの結果、例えばヌクレオチド値の同定、試料のタイプの腫瘍と関連する、
例えば対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）に対する
、変化、突然変異もしくは野生型配列の有無の指標を含み得る。報告書はまた、配列の役
割における情報、例えば疾患における変化、突然変異または野生型配列も含み得る。この
ような情報は、予後、耐性または潜在的もしくは示唆された治療選択肢に対する情報を含
み得る。報告は、治療選択肢の起こり得る有効性、治療選択肢の許容性または、患者、例
えば試験において、および実施形態において同定される、本報告で同定される、配列、変
化または突然変異を有する患者に対する治療選択肢の適用の妥当性に対する情報を含み得
る。例えば、報告は、薬物の投与、例えば予め選択された投与量での、または予め選択さ
れた処置計画での、例えば他の薬物と組み合わせられた、患者への投与に対する、情報ま
たは推奨を含み得る。一実施形態において、本方法で同定される突然変異の全てが報告で
特定される訳ではない。例えば、報告は、例えば予め選択された治療選択肢による処置に
対する癌の発生、予後、ステージまたは易罹患性との相関の予め選択されたレベルを有す
る遺伝子における突然変異に限定され得る。本明細書において特徴となる方法は、本方法
を実施する実体による試料の受領から７日、１４日または２１日以内に、例えば本明細書
中に記載の実体に報告を送付することを可能にする。
このように、本発明において特徴とされる方法は、例えば試料の受領から７、１４また
は２１日以内という、迅速なターンアラウンド時間を可能にする。
本明細書中に記載の方法は、組織学的に正常な試料、例えば切除縁からの試料を評価す
るためにも使用し得る。本明細書中に記載のような１つ以上の変化を検出する場合、組織
は、例えば悪性または前悪性として再分類され得、および／または治療経過が変更され得
る。
ある一定の態様において、本明細書中に記載の配列決定方法は、非癌用途、例えば法医
学用途（例えば、歯科記録の使用の代替としてまたはそれに加えた同定）、父親検査およ
び、疾患の診断および予後、例えば、中でも感染性疾患、自己免疫障害、嚢胞性線維症、
ハンチントン病、アルツハイマー病に対して有用である。例えば、本明細書中に記載の方
法による遺伝子変化の同定は、特定の障害を発症することについての個体の存在またはリ
スクを示し得る。
別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野での通常の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有す
る。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施ま
たは試験において使用し得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で
言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体において参照
により組み込まれる。さらに、材料、方法および実施例は単なる例示であり、限定するこ
とを意図するものではない。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面から、および特許請求の範囲から明
らかになるであろう。
図１Ａは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図１Ｂは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図１Ｃは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図１Ｄは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図１Ｅは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図１Ｆは、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャートを示す。 図２は、突然変異検出に対する事前予測およびリードデプスの影響を示す。
遺伝子および遺伝子産物の選択された群を評価することによる、１名以上の対象からの
試料、例えば疾患状態組織または非疾患状態組織からの、多数の遺伝子および遺伝子産物
、例えば抗体または免疫グロブリンスーパーファミリー受容体（例えばＴ細胞受容体また
はＢ細胞受容体）を配列決定するための最適化された方法およびアッセイが開示される。
一実施形態において、本発明の特色とされる方法およびアッセイは、多重アッセイ形式、
例えば、多数の遺伝子における多数の多様な遺伝子事象からの複数のシグナルを組み込ん
だアッセイにおいて使用される。本明細書中に開示されるのは、癌性表現型（例えば、癌
リスク、癌進行、癌処置または処置に対する耐性のうち１つ以上）に（例えば、陽性また
は陰性に）関連する遺伝子または遺伝子産物の選択された群に少なくとも部分的に基づく
方法およびアッセイである。このような予め選択された遺伝子または遺伝子産物は、配列
決定方法、特に多数の多様な遺伝子、例えば腫瘍または対照試料の大規模並行配列決定に
依存する方法の適用を可能にする。
本明細書中で開示される方法は、例えばＤＮＡおよびＲＮＡレベルの一方または両方で
の、対象区間のクローン分析を提供する。例えば、本明細書中で開示される方法は、対象
区間での事象の相対的存在量、例えば免疫グロブリン、Ｂ細胞受容体またはＴ細胞受容体
中の、例えば特定のＶセグメントまたはＶＤ、ＶＪもしくはＤＪ連結部の相対的存在量を
提供することを可能にする。他の方法は、対象区間での、例えば体細胞高頻度変異からの
、多様性レベルの評価を可能にする。他の方法は、大きな染色体、例えば全腕再編成の分
析を可能にする。他の（Ｏｎｔｈｅｒ）の方法は、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）に
関与する対象区間の、例えばＤＮＡまたはＲＮＡレベルの一方または両方での、評価を可
能にする。
ある一定の用語を最初に定義する。本明細書全体を通じてさらなる用語を定義する。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語
の１つまたは複数（例えば少なくとも１つ）を指す。
「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量
に対する許容可能なエラーの程度を意味する。代表的なエラーの程度は、所与の値または
値の範囲の２０％以内、一般的には１０％以内、より一般的には５％以内である。
「得る」または「得ること」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、物理的実
体または値を「直接得ること」または「間接的に得ること」によって、物理的実体または
値、例えば数値の所有を得ることを指す。「直接得ること」とは、物理的実体または値を
得るために、ある工程を行うこと（例えば、合成または分析方法を行うこと）を意味する
。「間接的に得ること」とは、別の団体または供給元（例えば、物理的実体または値を直
接得る第三者の研究室）から物理的実体または値を受領することを指す。物理的実体を直
接得ることは、物理的材料、例えば出発材料における物理的変化を含む工程を行うことを
含む。代表的な変化は、２つまたは１つ（ｏｒｅ）の出発材料から物理的実体を作製し、
物質をせん断または断片化し、物質を分離または精製し、２つ以上の別個の実体を混合物
になるように組み合わせ、共有または非共有結合を破壊するかまたは形成させることを含
む化学反応を行うことを含む。値を直接得ることは、試料または別の物質における物理的
変化を含む工程を行うこと、例えば物質、例えば試料、分析物または試薬における物理的
変化を含む分析工程を行うこと（本明細書中で「物理学的分析」と呼ぶことがある。）、
分析方法、例えば次のもの：物質、例えば分析物またはその断片もしくは他の誘導体を別
の物質から分離または精製すること；分析物またはその断片もしくは他の誘導体を別の物
質、例えば緩衝液、溶媒または反応物と組み合わせること；または、分析物の第１の原子
と第２の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を切断または形成させることによって
；または試薬もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を変化させることによって、例
えば試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合もしくは非共有結合を切断または形
成させることによって、分析物またはその断片もしくは他の誘導体の構造を変化させるこ
とのうちの１つ以上を含む方法を行うことを含む。
「配列を得ること」または「リードを得ること」は、この用語が本明細書中で使用され
る場合、配列またはリードを「直接得る」または「間接的に得る」ことによってヌクレオ
チド配列またはアミノ酸配列の所有を得ることを指す。配列またはリードを「直接得るこ
と」は、配列決定方法（例えば次世代配列決定（ＮＧＳ）法）を行うなど、配列を得るた
めの工程を行うこと（例えば、合成法または分析法を行うこと）を意味する。配列または
リードを「間接的に得る」とは、別の集団または供給源（例えば、配列を直接得た第三者
研究室）から配列の情報または知識を受領するかまたは配列を受領することを指す。得ら
れた配列またはリードは、全配列である必要はなく、例えば、配列を得る対象構成に存在
するように本明細書中で開示される変化のうち１つ以上を識別する少なくとも１個のヌク
レオチドの配列決定、または情報もしくは知識を得ることである。
配列またはリードを直接得ることは、物理的物質、例えば出発材料、例えば組織または
細胞試料など、例えば生検または単離核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）試料における物
理的変化を含む工程を行うことを含む。代表的な変化は、２つ以上の出発材料から物理的
実体を作製し、物質、例えばゲノムＤＮＡ断片など、をせん断または断片化し；物質を分
離または精製し（例えば組織から核酸試料を単離し）；２つ以上の別個の実体を混合物に
なるように組み合わせ、共有または非共有結合を破壊するかまたは形成させることを含む
化学反応を行うことを含む。値を直接得ることは、上記のような試料または別の物質にお
ける物理的変化を含む工程を行うことを含む。
「試料を得ること」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、試料を「直接得る
」かまたは「間接的に得る」ことによって、試料、例えば組織試料または核酸試料の所有
を得ることを指す。「試料を直接得る」とは、試料を得るための工程を行うこと（例えば
、外科的手術または抽出などの物理的方法を行うこと）を意味する。「試料を間接的に得
る」とは、別の団体または供給元（例えば、試料を直接得る第三者の研究室）から試料を
受領することを指す。試料を直接得ることは、物理的物質、例えば出発材料、例えば組織
、例えばヒト患者における組織または患者から以前に単離された組織における物理的変化
を含む工程を行うことを含む。代表的な変化は、出発材料から物理的実体を作製し、組織
を解体または擦り取り；物質（例えば試料組織または核酸試料）を分離または精製し；２
つ以上の別個の実体を混合物になるように組み合わせ；共有または非共有結合を破壊する
かまたは形成させることを含む化学反応を行うことを含む。試料を直接得ることは、例え
ば上記のような試料または別の物質における物理的変化を含む工程を行うことを含む。
「アライメントセレクタ」は、本明細書中で使用される場合、予め選択されたサブゲノ
ム区間の配列決定を最適化し得るアライメント方法、例えばアライメントアルゴリズムま
たはパラメータの選択を可能にするかまたは指示するパラメータを指す。アライメントセ
レクタは、例えば、次のもののうち１つ以上の関数に特異的であり得るか、または関数と
して選択され得る。
１．配列状況、例えば、サブゲノム区間に対するリードのミスアライメントに対する傾
向を付随するサブゲノム区間（例えば、評価しようとする予め選択されたヌクレオチド位
置）の配列状況。例えば、ゲノムの他の場所で反復される評価しようとするサブゲノム区
間中またはその付近の配列要素の存在は、ミスアライメントを引き起こし得、それによっ
て性能が低下し得る。ミスアライメントを最小限に抑えるアルゴリズムまたはアルゴリズ
ムパラメータを選択することによって、性能を向上させ得る。この場合、アライメントセ
レクタについての値は、配列状況の関数、例えば、ゲノム（または分析されているゲノム
の一部分）中の少なくとも予め選択された回数反復される予め選択された長さの配列の有
無であり得る。
２．分析されている腫瘍タイプ。例えば、特定の腫瘍型は、欠失率の増加を特徴とし得
る。したがって、インデルに対してより感度が高いアルゴリズムまたはアルゴリズムパラ
メータを選択することによって、性能を向上させ得る。この場合、アライメントセレクタ
についての値は、腫瘍タイプの関数、例えば腫瘍タイプに対する識別子であり得る。一実
施形態において、この値は、腫瘍タイプ、例えば血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）の同
一性である。
３．分析されている遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば遺伝子または遺伝子のタイプ
を分析し得る。例として、癌遺伝子は、置換またはインフレームインデルを特徴とするこ
とが多い。したがって、これらの変異体に対して特に感度が高く、他のものに対して特異
的であるアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を向
上させ得る。腫瘍抑制因子はフレームシフトインデルを特徴とすることが多い。したがっ
て、これらの変異体に対して特に感度が高いアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータ
を選択することによって、性能を向上させ得る。したがって、サブゲノム区間と調和する
アルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を向上させ得
る。この場合、アライメントセレクタについての値は、遺伝子または遺伝子のタイプ、例
えば遺伝子または遺伝子のタイプに対する識別子の関数であり得る。一実施形態において
、値は遺伝子の同一性である。
４．分析されている部位（例えばヌクレオチド位置）。この場合、アライメントセレク
タについての値は、部位または部位のタイプ、例えば部位または部位のタイプに対する識
別子の関数であり得る。一実施形態において、値は部位の同一性である。（例えば、その
部位を含有する遺伝子が別の遺伝子と相同性が高い場合、通常型／高速の短いリードアラ
イメントアルゴリズム（例えばＢＷＡ）は２つの遺伝子間を区別することが困難であり得
、より強力なアライメント方法（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）または均等アセンブリ
（ｅｖｅｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ＡＲＡＣＨＮＥ）を必要とする可能性がある。同様に
、遺伝子配列が複雑性の低い領域（例えばＡＡＡＡＡＡ）を含有する場合、より強力なア
ライメント方法が必要であり得る。
５．評価されているサブゲノム区間に関連する、変異体または変異体のタイプ。例えば
、置換、挿入、欠失、転座または他の再編成。したがって、特異的な変異体のタイプに対
してより感度が高いアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって
、性能を向上させ得る。この場合、アライメントセレクタについての値は、変異体のタイ
プの関数、例えば変異体のタイプに対する識別子であり得る。一実施形態において、値は
、変異体のタイプ、例えば置換、の同一性である。
６．試料のタイプ、ＦＦＰＥまたは他の固定試料。試料のタイプ／品質は、エラー（非
参照配列の偽の観察）率に影響を与え得る。したがって、試料における真偽率を的確に具
現化するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を向
上させ得る。この場合、アライメントセレクタについての値は、試料のタイプの関数、例
えば試料タイプに対する識別子であり得る。一実施形態において、値は、試料タイプ、例
えば固定試料、の同一性である。
遺伝子または遺伝子産物（例えば、マーカー遺伝子または遺伝子産物）の本明細書で使
用される場合の「変化」または「変化した構造」は、遺伝子または遺伝子産物内の１つま
たは複数の突然変異、例えば、正常または野生型遺伝子と比較した場合、遺伝子または遺
伝子産物の量または活性に影響を及ぼす突然変異の存在を指す。この変化は、正常または
健康な組織または細胞（例えば対照）におけるその量、構造および／または活性と比較し
た場合の、癌組織または癌細胞における量、構造および／または活性におけるものであり
得、癌などの疾患状態と関連する。例えば、癌に関連するか、または抗癌治療に対する反
応性を予測する変化は、正常で健康な組織または細胞と比較した場合の、癌組織または癌
細胞における、ヌクレオチド配列（例えば突然変異）、アミノ酸配列、染色体転座、染色
体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性またはメチル化状
態の変化であり得る。代表的な突然変異としては、点突然変異（例えば、サイレント、ミ
スセンスまたはナンセンス）、欠失、挿入、逆位、連結突然変異、重複、転座、染色体間
および染色体内再編成が挙げられるが限定されない。突然変異は、遺伝子のコードまたは
非コード領域に存在し得る。ある一定の実施形態において、（１つまたは複数の）変化は
、再編成、例えば１つ以上のイントロンまたはその断片（例えば、５’－および／または
３’－ＵＴＲにおける１つ以上の再編成）を含むゲノム再編成として検出される。ある一
定の実施形態において、変化は、表現型、例えば癌性表現型（例えば、癌リスク、癌進行
、癌処置または癌処置に対する耐性のうち１つ以上）に関連する（または関連しない）。
一実施形態において、変化は、癌に対する遺伝的リスク因子、陽性処置反応予測因子、陰
性処置反応予測因子、陽性予後因子、陰性予後因子または診断因子のうち１つ以上に関連
する。
「クローンプロファイル」は、この用語が本明細書中で使用される場合、出現、同一性
、可変性、分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル）、ま
たは１つ以上の配列、例えば対象区間の（またはそれを含む細胞の）、対立遺伝子または
シグネチャーの存在量、例えば相対的存在量を指す。一実施形態において、クローンプロ
ファイルは、対象区間に対する複数の配列、対立遺伝子またはシグネチャーが試料中に存
在する場合、対象区間（またはそれを含む細胞）に対する１つの配列、対立遺伝子または
シグネチャーについての相対的存在量についての値である。例えば、一実施形態において
、クローンプロファイルは、対象区間に対する複数のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせのう
ち１つ以上の相対的存在量についての値を含む。一実施形態において、クローンプロファ
イルは、対象区間に対する選択されたＶセグメントの、相対的存在量についての値を含む
。一実施形態において、クローンプロファイルは、対象区間の配列内での、例えば体細胞
高頻度変異から生じるような多様性についての値を含む。一実施形態において、クローン
プロファイルは、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャーを含む発現サブゲノム区間
の出現またはレベルによって証明されるような、配列、対立遺伝子またはシグネチャーの
発現の出現またはレベルについての値を含む。
「発現サブゲノム区間」は、この用語が本明細書で使用される場合、サブゲノム区間の
転写された配列を指す。一実施形態において、発現サブゲノム区間の配列は、それが転写
される元のサブゲノム区間とは異なり、例えば、一部の配列が転写されないことがあり得
る。
「シグネチャー」は、この用語が本明細書中で使用される場合、対象区間の配列を指す
。シグネチャーは、対象区間で複数の可能性のうちの１つの出現の特徴であり得、例えば
、シグネチャーは、再編成された重鎖または軽鎖可変領域遺伝子における選択されたＶセ
グメントの出現；選択されたＶＪ連結部の出現、例えば、再編成された重鎖可変領域遺伝
子における選択されたＶおよび選択されたＪセグメントの出現の特徴であり得る。一実施
形態において、シグネチャーは、複数の特異的な核酸配列を含む。したがって、シグネチ
ャーは、特異的な核酸配列に限定されず、むしろ、対象区間での配列または可能性の第１
のグループと、対象区間での可能性の第２のグループとを区別し得る、例えば第１のＶセ
グメントと第２のＶセグメントとを区別し得るのに十分固有であり、これによって、例え
ば様々なＶセグメントの使用の評価が可能となる。シグネチャーという用語は、特異的な
核酸配列である、特異的シグネチャーという用語を含む。一実施形態において、シグネチ
ャーは、特異的な事象、例えば、再編成事象を示すものであるか、またはその帰結である
。
「サブゲノム区間」は、この用語が本明細書中で使用される場合、ゲノム配列の一部分
を指す。一実施形態において、サブゲノム区間は、単一のヌクレオチド位置、例えば腫瘍
表現型と（陽性または陰性に）関連するヌクレオチド位置変異体であり得る。一実施形態
において、サブゲノム区間は、複数のヌクレオチド位置を含む。このような実施形態は、
少なくとも２、５、１０、５０、１００、１５０または２５０個のヌクレオチド位置の長
さの配列を含む。サブゲノム区間は、遺伝子全体またはその予め選択された部分、例えば
コード領域（またはその一部）、予め選択されたイントロン（またはその一部）またはエ
クソン（またはその一部）を含み得る。サブゲノム区間は、天然の、例えばゲノムの核酸
の断片の全てまたは一部を含み得る。例えば、サブゲノム区間は、配列決定反応に供され
るゲノムＤＮＡの断片に対応し得る。実施形態において、サブゲノム区間は、ゲノム供給
源からの連続的な配列である。実施形態において、サブゲノム区間は、ゲノム中で連続し
ていない配列を含み、例えば、ｃＤＮＡ中のエクソン－エクソン連結部で形成され、見出
される連結部を含み得る。
一実施形態において、サブゲノム区間は、再編成された配列、例えば、Ｖセグメントと
Ｄセグメント、ＤセグメントとＪセグメント、ＶセグメントとＪセグメントまたはＪセグ
メントとクラスセグメントの連結の結果として生じるＢまたはＴ細胞における配列に対応
する。
一実施形態において、サブゲノム区間において多様性はない。
一実施形態において、サブゲノム区間において多様性があり、例えば、サブゲノム区間
が複数の配列によって表され、例えばＶＤ配列をカバーするサブゲノム区間は、複数のシ
グネチャーによって表され得る。
一実施形態において、サブゲノム区間は：単一ヌクレオチド位置；遺伝子内領域または
遺伝子間領域；エクソンもしくイントロン、またはその断片、典型的にはエクソン配列ま
たはその断片；コード領域または非コード領域、例えばプロモーター、エンハンサー、５
’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）またはその断片；ｃＤ
ＮＡまたはその断片；ＳＮＰ；体細胞突然変異、生殖系列突然変異またはその両方；変化
、例えば点または単一突然変異；欠失突然変異（例えば、インフレーム欠失、遺伝子内欠
失、完全遺伝子欠失）；挿入突然変異（例えば遺伝子内挿入）；逆位突然変異（例えば染
色体内逆位）；連結突然変異；連結される挿入突然変異；逆位複製突然変異；タンデム複
製（例えば染色体内タンデム複製）；転座（例えば、染色体転座、非相反転座）；再編成
（例えば、ゲノム再編成（例えば１つ以上のイントロンまたはその断片の再編成；再編成
されたイントロンは、５’－および／または３’ＵＴＲを含み得る。）；遺伝子コピー数
の変化；遺伝子発現の変化；ＲＮＡレベルの変化、またはそれらの組み合わせを含むかま
たはそれらからなる。「遺伝子のコピー数」は、特定の遺伝子産物をコードする細胞中の
ＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所与の遺伝子について、哺乳動物は各遺伝子の２つのコ
ピーを有する。コピー数は、例えば、遺伝子増幅または複製によって増加させ得るか、ま
たは欠失によって減少させ得る。
「対象区間」は、この用語が本明細書で使用される場合、サブゲノム区間または発現サ
ブゲノム区間を指す。一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は
対応し、つまり、発現サブゲノム区間は、対応するサブゲノム区間から発現される配列を
含む。一実施形態において、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間は対応せず、つま
り、発現サブゲノム区間は、対応しないサブゲノム区間から発現される配列を含まないが
、むしろ異なるサブゲノム区間に対応する。一実施形態において、サブゲノム区間および
発現サブゲノム区間は部分的に対応し、つまり、発現サブゲノム区間は、対応するサブゲ
ノム区間から発現される配列および異なる対応するサブゲノム区間から発現される配列を
含む。
本明細書で使用される場合、「ライブラリ」という用語は、メンバーの集合体を指す。
一実施形態において、ライブラリは、核酸メンバーの集合体、例えば全ゲノム、サブゲノ
ム断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ＲＮＡ断片またはこれらの
組み合わせの集合体を含む。一実施形態において、ライブラリメンバーの一部または全て
がアダプター配列を含む。アダプター配列は、一方または両方の末端に位置し得る。アダ
プター配列は、例えば、配列決定法（例えばＮＧＳ法）に対して、増幅に対して、逆転写
に対して、またはベクターへのクローニングに対して有用であり得る。
ライブラリは、メンバー、例えば標的メンバー（例えば、腫瘍メンバー、参照メンバー
、ＰＧｘメンバーまたはこれらの組み合わせ）の集合体を含み得る。ライブラリのメンバ
ーは、単一個体由来であり得る。実施形態において、ライブラリは、複数の対象（例えば
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、またはそれ以上の対象）からの
メンバーを含み得、例えば、複数の対象からのメンバーを含むライブラリを形成させるた
めに、異なる対象からの２つ以上のライブラリを組み合わせ得る。一実施形態において、
対象は、癌または腫瘍を有するか、または有するリスクがあるヒトである。
「ライブラリキャッチ」は、ライブラリのサブセット、例えば予め選択されたサブゲノ
ム区間、例えば予め選択されたベイトとのハイブリダイゼーションによって捕捉された産
物について濃縮されたサブセットを指す。
本明細書で用いられる場合、「メンバー」または「ライブラリメンバー」または他の同
様の用語は、ライブラリのメンバーである核酸分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれら
の組み合わせを指す。典型的には、メンバーはＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡである。メンバーは、断片化された、例えばせん断または酵素的に調製されたゲノ
ムＤＮＡであり得る。メンバーは、対象からの配列を含み、対象に由来しない配列、例え
ば、アダプター配列、プライマー配列または同定を可能にする他の配列、例えば「バーコ
ード」配列も含み得る。
本明細書中で使用される「ベイト」は、ハイブリッド捕捉試薬のタイプである。ベイト
は、ハイブリッド形成し得（例えば相補的であり得る）、それにより標的核酸の捕捉を可
能とする核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。一実施形態において、ベ
イトはＲＮＡ分子（例えば天然または修飾ＲＮＡ分子）；ＤＮＡ分子（例えば天然または
修飾ＤＮＡ分子）またはそれらの組み合わせである。他の実施形態において、ベイトは、
例えば、結合実体への結合による、ベイトおよびベイトに対してハイブリッド形成する核
酸によって形成されるハイブリッドの捕捉および分離を可能にする、結合実体、例えば親
和性タグを含む。一実施形態において、ベイトは溶液相ハイブリダイゼーションに適して
いる。一実施形態において、ベイトは二環式核酸（ＢＮＡ）分子である。
「ベイトセット」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のベイト分子を指す
。
「結合実体」は、分析物に特異的に結合することができる分子タグが、直接または間接
的に連結され得る何らかの分子を意味する。結合実体は、各ベイト配列上の親和性タグで
あり得る。ある一定の実施形態において、結合実体は、アビジン分子などのパートナー、
またはハプテンもしくはその抗原結合断片に結合する抗体に結合することによって、ハイ
ブリダイゼーション混合物からベイト／メンバーハイブリッドを分離することを可能にす
る。代表的な結合実体としては、ビオチン分子、ハプテン、抗体、抗体結合断片、ペプチ
ドおよびタンパク質が挙げられるが限定されない。
「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補
性を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、
第１の領域に対して逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合を形成（「塩
基対形成」）することが可能であることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシ
ン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖とは逆平行である第２の核酸鎖の残基と
塩基対形成可能であることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行に
配置されるときに第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基
と塩基対形成可能である場合、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。ある
一定の実施形態において、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含
み、それによって第１および第２の部分が逆平行に配置される場合、第１の部分のヌクレ
オチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少な
くとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成可能である。他の実施形
態において、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と
塩基対形成可能である。
「癌」または「腫瘍」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用
語は、制御されない増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖速度およびある一定の
特徴的な形態学的特徴など、癌を引き起こす細胞の典型的な特徴を保有する細胞の存在を
指す。癌細胞は、腫瘍の形態であることが多いが、このような細胞は動物内で単独で存在
し得るか、または非腫瘍形成癌細胞、例えば白血病細胞などであり得る。これらの用語に
は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍または転移病変が含まれる。本明細書中で使用される場合、
「癌」という用語は、前悪性ならびに悪性の癌を含む。
本明細書中で使用される場合、「可能性が高い」または「可能性向上」とは、項目、物
体、物または人間が出現する確率が高いことを指す。したがって、一例では、処置に反応
する可能性が高いと思われる対象は、参照対象または対象の群と比較して、処置に反応す
る確率が高くなる。
「可能性が低い」とは、参照に対して、事象、項目、物体、物または人間が出現する確
率が低いことを指す。したがって、処置に反応する可能性が低い対象は、参照対象または
対象の群と比較して、処置に反応する確率が低くなる。
「対照メンバー」は、非腫瘍細胞からの配列を有するメンバーを指す。
本明細書中で使用される場合、「インデルアライメント配列セレクタ」は、予め選択さ
れたインデルの場合、リードを一緒にアライメントしようとする配列の選択を可能にする
か、またはそれを方向付けるパラメータを指す。このような配列の使用は、インデルを含
む予め選択されたサブゲノム区間の配列決定を最適化し得る。インデルアライメント配列
セレクタの値は、予め選択されたインデルの関数、例えばインデルに対する識別子である
。一実施形態において、値はインデルの同一性である。
本明細書中で使用される場合、「次世代配列決定またはＮＧＳまたはＮＧ配列決定」は
、ハイスループット方式で、（例えば、１回の分子配列決定において）個々の核酸分子ま
たは個々の核酸分子に対するクローン性に増大させた代理物のヌクレオチド配列の何れか
を決定する何らかの配列決定法を指す（例えば、１０３、１０４、１０５、またはそれ以
上を超える分子を同時に配列決定する。）。一実施形態において、ライブラリ中の核酸種
の相対的存在量は、配列決定実験により生成されたデータ中のそれらの同族配列の出現の
相対数を数えることによって推定し得る。次世代配列決定方法は当技術分野で公知であり
、例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２０１０）Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：３１－４６に記載さ
れている。次世代配列決定は、試料中の核酸の５％未満に存在する変異を検出し得る。
本明細書中で言及される場合、「ヌクレオチド値」は、予め選択されたヌクレオチド位
置を占有するかまたはこれに割り当てられる（１つまたは複数の）ヌクレオチドの同一性
に相当する。典型的なヌクレオチド値としては、欠損（例えば欠失）；付加（例えば１つ
以上のヌクレオチドの挿入、その識別は含まれてもよいしまたは含まれなくてもよい。）
；または存在（占有）；Ａ；Ｔ；Ｃ；またはＧが挙げられる。他の値は、例えばＹでなく
てもよく（Ｙは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである。）；ＡまたはＸ（Ｘは、Ｔ、ＧまたはＣの
うち１つまたは２つである。）；ＴまたはＸ（Ｘは、Ａ、ＧまたはＣのうち１つまたは２
つである。）；ＧまたはＸ（Ｘは、Ｔ、ＡまたはＣのうち１つまたは２つである。）；Ｃ
またはＸ（Ｘは、Ｔ、ＧまたはＡのうち１つまたは２つである。）；ピリミジンヌクレオ
チド；またはプリンヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド値は、ヌクレオチド位置にお
いて１個以上、例えば２、３または４個の塩基（または本明細書に記載される他の値、例
えば欠損または付加）に対する頻度であり得る。例えば、ヌクレオチド値は、ヌクレオチ
ド位置における、Ａに対する頻度およびＧに対する頻度を含み得る。
「または」は、文脈上別段の明示がない限り、「および／または」という用語を意味す
るために本明細書中で使用され、これと交換可能に使用される。本明細書中の一部の句に
おける「および／または」という用語の使用は、文脈上別段の明示がない限り、「または
」という用語の使用が「および／または」という用語と交換可能ではないことを意味しな
い。
「一次対照」とは、腫瘍試料中のＮＡＴ組織以外の非腫瘍組織を指す。血液は代表的な
一次対照である。
本明細書中で使用される場合、「再編成アライメント配列セレクタ」は、予め選択され
た再編成の場合、リードを一緒にアライメントしようとする配列の選択を可能にするか、
またはそれを方向付けるパラメータを指す。このような配列の使用によって、再編成を含
む予め選択されたサブゲノム区間の配列決定が最適化され得る。再編成アライメント配列
セレクタについての値は、予め選択された再編成、例えば再編成に対する識別子の関数で
ある。一実施形態において、値は再編成の同一性である。「インデルアライメント配列セ
レクタ」（本明細書中の他の箇所でも定義される。）は、再編成アライメント配列セレク
タの例である。
「試料」、「組織試料」、「患者試料」、「患者細胞または組織試料」または「検体」
はそれぞれ、対象または患者の組織または循環細胞から得られた同様の細胞の集合体を指
す。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結されたおよび／または保存された臓器、組織試料
、生検または吸引物からのような固形組織；血液または何らかの血液成分；脊髄液、羊水
、腹水または間質液などの体液；または対象の妊娠または発生の何れかの時点からの細胞
であり得る。組織試料は、保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定液、栄養剤、抗生物質など、
本来、天然には組織と混合されない化合物を含有し得る。一実施形態において、試料は、
凍結試料として、またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン
包埋（ＦＦＰＥ）組織標本として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えば、
ＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中で包埋され得る。別の実施形態において、試料は血液
試料である。さらに別の実施形態において、試料は骨髄穿刺試料である。
一実施形態において、試料は、腫瘍、例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩ
Ｌ）に関連する細胞である。一実施形態において、試料は腫瘍試料であり、例えば、１つ
以上の前悪性または悪性細胞を含む。一実施形態において、血液悪性腫瘍（または前悪性
腫瘍）、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）から試料が得られ
る。ある一定の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍ま
たは転移性病変から得られる。他の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、切除縁
からの組織または細胞を含む。別の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、１つ以
上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）（例えば血液試料から得られるＣＴＣ）を含む。一実施形態
において、試料は、腫瘍、例えば非腫瘍細胞または末梢血リンパ球に関連しない細胞であ
る。
本明細書中で使用される場合、「感度」は、ある方法の、不均一な配列集団中での予め
選択された配列変異体の検出能の尺度である。予め選択された配列変異体が試料中の配列
の少なくともＦ％として存在する試料が与えられると仮定して、ある方法が予め選択され
たＣ％の信頼度でＳ％の回数で予め選択された配列を検出し得る場合、その方法は、Ｆ％
の変異体に対してＳ％の感度を有する。一例として、予め選択された変異体配列が試料中
の配列の少なくとも５％として存在する試料が与えられると仮定して、ある方法が予め選
択された９９％の信頼度で１０回のうち９回、予め選択された配列を検出し得る場合、そ
の方法は、５％の変異体に対して９０％の感度を有する（Ｆ＝５％；Ｃ＝９９％；Ｓ＝９
０％）。代表的な感度としては、Ｃ＝９０％、９５％、９９％および９９．９％の信頼度
レベルで、Ｆ＝１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％の配列変異体に対して、
Ｓ＝９０％、９５％、９９％の感度が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「特異性」は、ある方法が、真に出現する予め選択され
た配列変異体を配列決定アーチファクトまたは他の密接に関連する配列と区別する能力の
尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、試料調製中の関
心のある配列に導入されるエラー、配列決定エラーまたは偽遺伝子または遺伝子ファミリ
ーのメンバーのような密接に関連する配列の不注意な配列決定から生じ得る。ＸＴｒｕｅ
配列が真に変異体であり、ＸＮｏｔ ｔｒｕｅが真に変異体ではないＮＴｏｔａｌ配列の
試料セットに適用したときに、ある方法が変異体でないものとして真ではない変異体の少
なくともＸ％を選択する場合、この方法はＸ％の特異性を有する。例えば、５００個の配
列が真に変異体であり、５００個が真に変異体ではない１０００個の配列の試料セットに
適用したときに、ある方法が変異体でないものとして５００個の真ではない変異体の９０
％を選択する場合、この方法は９０％の特異性を有する。代表的な特異性としては、９０
、９５、９８および９９％が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「腫瘍核酸試料」は、腫瘍または癌試料からの核酸分子
を指す。典型的には、これは腫瘍または癌試料からのＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、また
はＲＮＡ由来のｃＤＮＡである。ある一定の実施形態において、腫瘍核酸試料が精製また
は単離される（例えばその天然の状態から除去される）。
本明細書中で使用される場合、「対照」または「参照」「核酸試料」は、対照または参
照試料からの核酸分子を指す。典型的には、これは、遺伝子または遺伝子産物の変化また
は変異を含有しないＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに由来するｃＤＮＡであ
る。ある一定の実施形態において、参照または対照核酸試料は、野生型または非突然変異
配列である。ある一定の実施形態において、参照核酸試料が精製または単離される（例え
ばその天然状態から除去される）。他の実施形態において、参照核酸試料は、同じもしく
は異なる対象からの、非腫瘍試料、例えば、血液対照、正常隣接組織（ＮＡＴ）または何
らかの他の非癌性試料からのものである。
核酸分子を「配列決定すること」は、分子（例えばＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはＲＮ
Ａ分子に由来するｃＤＮＡ分子）中の少なくとも１個のヌクレオチドの同一性を決定する
ことを必要とする。実施形態において、分子中のヌクレオチド全てよりも少ない同一性が
決定される。他の実施形態において、分子中のヌクレオチドの大部分または全ての同一性
が決定される。
本明細書中で使用される場合、「閾値」は、対象区間（例えばサブゲノム区間または発
現サブゲノム区間）にヌクレオチド値を割り当てるために存在する必要があるリードの数
の関数である値である。例えば、これは、そのヌクレオチド値をサブゲノム区間中のその
ヌクレオチド位置に割り当てるために必要とされる、ヌクレオチド位置における特定のヌ
クレオチド値、例えばＡを有するリードの数の関数である。閾値は、例えば整数などのリ
ードの数として（またはその関数として）、または予め選択された値を有するリードの割
合として表し得る。例として、閾値がＸであり、「Ａ」のヌクレオチド値を有するＸ＋１
個のリードが存在する場合、「Ａ」の値は、対象区間における予め選択された位置（例え
ばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）に割り当てられる。閾値はまた、突然変異
または変異体予想、突然変異頻度またはベイジアン事前法（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｐｒｉｏ
ｒ）の関数として表し得る。一実施形態において、予め選択された突然変異頻度は、その
ヌクレオチド値を呼び出すために、予め選択された位置でヌクレオチド値、例えばＡまた
はＧを有するリードの予め選択された数または割合を必要とする。実施形態において、閾
値は、突然変異予想、例えば突然変異頻度および腫瘍タイプの関数であり得る。例えば、
予め選択されたヌクレオチド位置の予め選択された変異は、患者が第１の腫瘍タイプを有
する場合、第１の閾値を有し得、患者が第２の腫瘍タイプを有する場合、第２の閾値を有
し得る。
本明細書中で使用される場合、「標的メンバー」は、核酸ライブラリから単離したい核
酸分子を指す。一実施形態において、標的メンバーは、腫瘍メンバー、参照メンバー、対
照メンバーまたは本明細書中に記載のようなＰＧｘメンバーであり得る。
「腫瘍メンバー」または他の同様の用語（例えば「腫瘍または癌関連メンバー」）は、
本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞からの配列を有するメンバーを指す。一実施形態
において、腫瘍メンバーは、癌性表現型に関連する変化（例えば突然変異）を有する配列
（例えばヌクレオチド配列）を有する対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲ
ノム区間）を含む。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、野生型配列（例えば野生型
ヌクレオチド配列）を有する対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間
）を含む。例えば、ヘテロ接合型またはホモ接合型野生型対立遺伝子からの対象区間（例
えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）が癌細胞に存在する。腫瘍メンバーは、
参照メンバーまたはＰＧｘメンバーを含み得る。
本明細書中で使用される場合、「参照メンバー」または他の同様の用語（例えば「対照
メンバー」）は、癌性表現型と関連がない配列（例えばヌクレオチド配列）を有する対象
区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）を含むメンバーを指す。一実施
形態において、参照メンバーは、突然変異した場合に癌性表現型と関連する遺伝子または
遺伝子産物の野生型または非突然変異ヌクレオチド配列を含む。参照メンバーは、癌細胞
または非癌細胞に存在し得る。
本明細書中で使用される場合、「ＰＧｘメンバー」または他の同様の用語は、遺伝子の
薬理遺伝学的または薬理ゲノムプロファイルに関連する対象区間（例えばサブゲノム区間
または発現サブゲノム区間）を含むメンバーを指す。一実施形態において、ＰＧｘメンバ
ーはＳＮＰ（例えば本明細書中に記載のＳＮＰ）を含む。他の実施形態において、ＰＧｘ
メンバーは、表１～４による対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間
）を含む。
本明細書中で使用される場合、「変異体」は、複数の構造、例えば多型遺伝子座におけ
る対立遺伝子を有し得るサブゲノム区間で存在し得る構造を指す。
見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、明細書および特許請求の範囲を単に
読み易くするために与えられる。明細書または特許請求の範囲における見出しの使用は、
段階または要素がアルファベット順または数字順またはそれらが提示される順序で行われ
る必要はない。
遺伝子または遺伝子産物の選択
選択された遺伝子または遺伝子産物（本明細書中で「標的遺伝子または遺伝子産物」と
も呼ぶ。）は、遺伝子内領域または遺伝子間領域を含む対象区間（例えば、サブゲノム区
間、発現サブゲノム区間またはその両方）を含み得る。例えば、対象区間（例えばサブゲ
ノム区間または発現サブゲノム区間）は、エクソンまたはイントロン、またはその断片、
典型的にはエクソン配列またはその断片を含み得る。対象区間（例えばサブゲノム区間ま
たは発現サブゲノム区間）は、コード領域または非コード領域、例えばプロモーター、エ
ンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）または
その断片を含み得る。他の実施形態において、対象区間は、ｃＤＮＡまたはその断片を含
む。他の実施形態において、対象区間は、例えば本明細書中に記載のようなＳＮＰを含む
。
他の実施形態において、対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間また
はその両方）は、ゲノム中の実質的に全てのエクソン、例えば本明細書中に記載のような
対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）の１つ以上（
関心のある選択される遺伝子または遺伝子産物（例えば、本明細書中に記載されているよ
うな癌性表現型に関連する遺伝子または遺伝子産物）からのエクソン）を含む。一実施形
態において、対象区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）には、体細胞
突然変異、生殖細胞系列突然変異またはその両方が含まれる。一実施形態において、対象
区間（例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間）は、変化、例えば、点または単
一突然変異、欠失突然変異（例えばインフレーム欠失、遺伝子内欠失、完全遺伝子欠失）
、挿入突然変異（例えば遺伝子内挿入）、逆位突然変異（例えば染色体内逆位）、連結突
然変異、連結挿入突然変異、逆方向重複突然変異、タンデム重複（例えば染色体内タンデ
ム重複）、転座（例えば、染色体転座、非相反転座）、再編成、遺伝子コピー数の変化ま
たはそれらの組み合わせを含む。ある一定の実施形態において、対象区間（例えばサブゲ
ノム区間または発現サブゲノム区間）は、試料中の腫瘍細胞のゲノムのコード領域の５、
１、０．５、０．１％、０．０１％、０．００１％未満を構成する。他の実施形態におい
て、対象区間（例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方）は、疾患
に関与せず、例えば、本明細書中に記載の癌性表現型と関連しない。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物はバイオマーカーである。本明細書
中で使用される場合、「バイオマーカー」または「マーカー」は、変化し得る遺伝子、ｍ
ＲＮＡまたはタンパク質であり、前記の変化は癌に関連する。この変化は、正常または健
康な組織または細胞（例えば対照）におけるその量、構造および／または活性と比較した
場合の、癌組織または癌細胞における量、構造および／または活性におけるものであり得
、癌などの疾患状態と関連する。例えば、癌に関連するか、または抗癌治療に対する反応
性を予測するマーカーは、正常で健康な組織または細胞と比較した場合、癌組織または癌
細胞では、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発
現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性またはメチル化状態の変化を有し得る。さ
らに、「マーカー」は、その構造が変化している、例えば突然変異している（突然変異を
含有する）分子を含み、例えば、癌などの疾患状態に関連する組織または細胞に存在する
場合、例えば、置換、欠失または挿入によって、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで野
生型配列と異なる。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
別の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物は、小さな欠失、例えば小さな遺伝子内
欠失（例えばインフレームまたはフレームシフト欠失）を有する。さらに別の実施形態に
おいて、標的配列は遺伝子全体の欠失から生じる。さらに別の実施形態において、標的配
列は、小さな挿入、例えば小さな遺伝子内挿入を有する。一実施形態において、標的配列
は、逆位、例えば、染色体内逆位から生じる。別の実施形態において、標的配列は、染色
体間転座から生じる。さらに別の実施形態において、標的配列はタンデム重複を有する。
一実施形態において、標的配列は望ましくない特徴（例えば高ＧＣ含量または反復要素）
を有する。別の実施形態において、標的配列は、例えばその反復性のために、それ自体が
うまく標的化され得ないヌクレオチド配列の部分を有する。一実施形態において、標的配
列はオルタナティブスプライシングから生じる。別の実施形態において、標的配列は、表
１～４による遺伝子または遺伝子産物またはその断片から選択される。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、抗体遺伝子また
は遺伝子産物、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体（例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ
）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））遺伝子または遺伝子産物、またはその断片である。
ヒト抗体分子（およびＢ細胞受容体）は、少なくとも次の３つの遺伝子座上の遺伝子に
よってコードされる定常領域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）の両方を有する重鎖および軽鎖
から構成される。
１．免疫グロブリン重鎖に対する遺伝子セグメントを含有する１４番染色体上の免疫グ
ロブリン重鎖遺伝子座（ＩＧＨ＠）；
２．免疫グロブリン軽鎖に対する遺伝子セグメントを含有する２番染色体上の免疫グロ
ブリンカッパ（κ）遺伝子座（ＩＧＫ＠）；
３．免疫グロブリン軽鎖に対する遺伝子セグメントを含有する２２番染色体上の免疫グ
ロブリンラムダ（λ）遺伝子座（ＩＧＬ＠）。
各重鎖および軽鎖遺伝子は、抗体タンパク質の可変領域に対する３つの異なるタイプの
遺伝子セグメントの複数のコピーを含有する。例えば、免疫グロブリン重鎖領域は、５個
の異なるクラスγ、δ、α、μおよびε、４４個の可変（Ｖ）遺伝子セグメント、２７個
の多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび６個の連結（Ｊ）遺伝子セグメントのうちの１つ
を含有し得る。軽鎖はまた、多数のＶおよびＪ遺伝子セグメントを有し得るが、Ｄ遺伝子
セグメントを有さない。ラムダ軽鎖は７個の可能なＣ領域を有し、カッパ軽鎖は１個を有
する。
免疫グロブリン重鎖遺伝子座（ＩＧＨ＠）は、ヒト抗体（または免疫グロブリン）の重
鎖に対する遺伝子を含有するヒト１４番染色体上の領域である。例えば、ＩＧＨ遺伝子座
は、ＩＧＨＶ（可変）、ＩＧＨＤ（多様性）、ＩＧＨＪ（連結）およびＩＧＨＣ（定常）
遺伝子を含む。免疫グロブリン重鎖をコードする代表的な遺伝子としては、
ＩＧＨＶ１－２，ＩＧＨＶ１－３，ＩＧＨＶ１－８，ＩＧＨＶ１－１２，ＩＧＨＶ１－
１４，ＩＧＨＶ１－１７，ＩＧＨＶ１－１８，ＩＧＨＶ１－２４，ＩＧＨＶ１－４５，Ｉ
ＧＨＶ１－４６，ＩＧＨＶ１－５８，ＩＧＨＶ１－６７，ＩＧＨＶ１－６８，ＩＧＨＶ１
－６９，ＩＧＨＶ１－３８－４，ＩＧＨＶ１－６９－２，ＩＧＨＶ２－５，ＩＧＨＶ２－
１０，ＩＧＨＶ２－２６，ＩＧＨＶ２－７０，ＩＧＨＶ３－６，ＩＧＨＶ３－７，ＩＧＨ
Ｖ３－９，ＩＧＨＶ３－１１，ＩＧＨＶ３－１３，ＩＧＨＶ３－１５，ＩＧＨＶ３－１６
，ＩＧＨＶ３－１９，ＩＧＨＶ３－２０，ＩＧＨＶ３－２１，ＩＧＨＶ３－２２，ＩＧＨ
Ｖ３－２３，ＩＧＨＶ３－２５，ＩＧＨＶ３－２９，ＩＧＨＶ３－３０，ＩＧＨＶ３－３
０－２，ＩＧＨＶ３－３０－３，ＩＧＨＶ３－３０－５，ＩＧＨＶ３－３２，ＩＧＨＶ３
－３３，ＩＧＨＶ３－３３－２，ＩＧＨＶ３－３５，ＩＧＨＶ３－３６，ＩＧＨＶ３－３
７，ＩＧＨＶ３－３８，ＩＧＨＶ３－４１，ＩＧＨＶ３－４２，ＩＧＨＶ３－４３，ＩＧ
ＨＶ３－４７，ＩＧＨＶ３－４８，ＩＧＨＶ３－４９，ＩＧＨＶ３－５０，ＩＧＨＶ３－
５２，ＩＧＨＶ３－５３，ＩＧＨＶ３－５４，ＩＧＨＶ３－５７，ＩＧＨＶ３－６０，Ｉ
ＧＨＶ３－６２，ＩＧＨＶ３－６３，ＩＧＨＶ３－６４，ＩＧＨＶ３－６５，ＩＧＨＶ３
－６６，ＩＧＨＶ３－７１，ＩＧＨＶ３－７２，ＩＧＨＶ３－７３，ＩＧＨＶ３－７４，
ＩＧＨＶ３－７５，ＩＧＨＶ３－７６，ＩＧＨＶ３－７９，ＩＧＨＶ３－３８－３，ＩＧ
ＨＶ３－６９－１，ＩＧＨＶ４－４，ＩＧＨＶ４－２８，ＩＧＨＶ４－３０－１，ＩＧＨ
Ｖ４－３０－２，ＩＧＨＶ４－３０－４，ＩＧＨＶ４－３１，ＩＧＨＶ４－３４，ＩＧＨ
Ｖ４－３９，ＩＧＨＶ４－５５，ＩＧＨＶ４－５９，ＩＧＨＶ４－６１，ＩＧＨＶ４－８
０，ＩＧＨＶ４－３８－２，ＩＧＨＶ５－５１，ＩＧＨＶ５－７８，ＩＧＨＶ５－１０－
１，ＩＧＨＶ６－１，ＩＧＨＶ７－４－１，ＩＧＨＶ７－２７，ＩＧＨＶ７－３４－１，
ＩＧＨＶ７－４０，ＩＧＨＶ７－５６，ＩＧＨＶ７－８１，ＩＧＨＶＩＩ－１－１，ＩＧ
ＨＶＩＩ－１５－１，ＩＧＨＶＩＩ－２０－１，ＩＧＨＶＩＩ－２２－１，ＩＧＨＶＩＩ
－２６－２，ＩＧＨＶＩＩ－２８－１，ＩＧＨＶＩＩ－３０－１，ＩＧＨＶＩＩ－３１－
１，ＩＧＨＶＩＩ－３３－１，ＩＧＨＶＩＩ－４０－１，ＩＧＨＶＩＩ－４３－１，ＩＧ
ＨＶＩＩ－４４－２，ＩＧＨＶＩＩ－４６－１，ＩＧＨＶＩＩ－４９－１，ＩＧＨＶＩＩ
－５１－２，ＩＧＨＶＩＩ－５３－１，ＩＧＨＶＩＩ－６０－１，ＩＧＨＶＩＩ－６２－
１，ＩＧＨＶＩＩ－６５－１，ＩＧＨＶＩＩ－６７－１，ＩＧＨＶＩＩ－７４－１，ＩＧ
ＨＶＩＩ－７８－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－２－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－５－１，ＩＧＨＶＩＩ
Ｉ－５－２，ＩＧＨＶＩＩＩ－１１－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－１３－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－
１６－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－２２－２，ＩＧＨＶＩＩＩ－２５－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－２
６－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－３８－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－４４，ＩＧＨＶＩＩＩ－４７－１
，ＩＧＨＶＩＩＩ－５１－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－６７－２，ＩＧＨＶＩＩＩ－６７－３，
ＩＧＨＶＩＩＩ－６７－４，ＩＧＨＶＩＩＩ－７６－１，ＩＧＨＶＩＩＩ－８２，ＩＧＨ
ＶＩＶ－４４－１，ＩＧＨＤ１－１，ＩＧＨＤ１－７，ＩＧＨＤ１－１４，ＩＧＨＤ１－
２０，ＩＧＨＤ１－２６，ＩＧＨＤ２－２，ＩＧＨＤ２－８，ＩＧＨＤ２－１５，ＩＧＨ
Ｄ２－２１，ＩＧＨＤ３－３，ＩＧＨＤ３－９，ＩＧＨＤ３－１０，ＩＧＨＤ３－１６，
ＩＧＨＤ３－２２，ＩＧＨＤ４－４，ＩＧＨＤ４－１１，ＩＧＨＤ４－１７，ＩＧＨＤ４
－２３，ＩＧＨＤ５－５，ＩＧＨＤ５－１２，ＩＧＨＤ５－１８，ＩＧＨＤ５－２４，Ｉ
ＧＨＤ６－６，ＩＧＨＤ６－１３，ＩＧＨＤ６－１９，ＩＧＨＤ６－２５，ＩＧＨＤ７－
２７，ＩＧＨＪ１，ＩＧＨＪ１Ｐ，ＩＧＨＪ２，ＩＧＨＪ２Ｐ，ＩＧＨＪ３，ＩＧＨＪ３
Ｐ，ＩＧＨＪ４，ＩＧＨＪ５，ＩＧＨＪ６，ＩＧＨＡ１，ＩＧＨＡ２，ＩＧＨＧ１，ＩＧ
ＨＧ２，ＩＧＨＧ３，ＩＧＨＧ４，ＩＧＨＧＰ，ＩＧＨＤ，ＩＧＨＥ，ＩＧＨＥＰ１，Ｉ
ＧＨＭ，およびＩＧＨＶ１－６９Ｄ
が挙げられるが限定されない。
免疫グロブリンカッパ遺伝子座（ＩＧＫ＠）は、抗体（または免疫グロブリン）のカッ
パ（κ）軽鎖に対する遺伝子を含有するヒト２番染色体上の領域である。例えば、ＩＧＫ
遺伝子座は、ＩＧＫＶ（可変）、ＩＧＫＪ（連結）およびＩＧＫＣ（定常）遺伝子を含む
。免疫グロブリンカッパ軽鎖をコードする代表的な遺伝子としては、
ＩＧＫＶ１－５，ＩＧＫＶ１－６，ＩＧＫＶ１－８，ＩＧＫＶ１－９，ＩＧＫＶ１－１
２，ＩＧＫＶ１－１３，ＩＧＫＶ１－１６，ＩＧＫＶ１－１７，ＩＧＫＶ１－２２，ＩＧ
ＫＶ１－２７，ＩＧＫＶ１－３２，ＩＧＫＶ１－３３，ＩＧＫＶ１－３５，ＩＧＫＶ１－
３７，ＩＧＫＶ１－３９，ＩＧＫＶ１Ｄ－８，ＩＧＫＶ１Ｄ－１２，ＩＧＫＶ１Ｄ－１３
，ＩＧＫＶ１Ｄ－１６ ＩＧＫＶ１Ｄ－１７，ＩＧＫＶ１Ｄ－２２，ＩＧＫＶ１Ｄ－２７
，ＩＧＫＶ１Ｄ－３２，ＩＧＫＶ１Ｄ－３３，ＩＧＫＶ１Ｄ－３５，ＩＧＫＶ１Ｄ－３７
，ＩＧＫＶ１Ｄ－３９，ＩＧＫＶ１Ｄ－４２，ＩＧＫＶ１Ｄ－４３，ＩＧＫＶ２－４，Ｉ
ＧＫＶ２－１０，ＩＧＫＶ２－１４，ＩＧＫＶ２－１８，ＩＧＫＶ２－１９，ＩＧＫＶ２
－２３，ＩＧＫＶ２－２４，ＩＧＫＶ２－２６，ＩＧＫＶ２－２８，ＩＧＫＶ２－２９，
ＩＧＫＶ２－３０，ＩＧＫＶ２－３６，ＩＧＫＶ２－３８，ＩＧＫＶ２－４０，ＩＧＫＶ
２Ｄ－１０，ＩＧＫＶ２Ｄ－１４，ＩＧＫＶ２Ｄ－１８，ＩＧＫＶ２Ｄ－１９，ＩＧＫＶ
２Ｄ－２３，ＩＧＫＶ２Ｄ－２４，ＩＧＫＶ２Ｄ－２６，ＩＧＫＶ２Ｄ－２８，ＩＧＫＶ
２Ｄ－２９，ＩＧＫＶ２Ｄ－３０，ＩＧＫＶ２Ｄ－３６，ＩＧＫＶ２Ｄ－３８，ＩＧＫＶ
２Ｄ－４０，ＩＧＫＶ３－７，ＩＧＫＶ３－１１，ＩＧＫＶ３－１５，ＩＧＫＶ３－２０
，ＩＧＫＶ３－２５，ＩＧＫＶ３－３１，ＩＧＫＶ３－３４，ＩＧＫＶ３Ｄ－７，ＩＧＫ
Ｖ３Ｄ－１１，ＩＧＫＶ３Ｄ－１５，ＩＧＫＶ３Ｄ－２０，ＩＧＫＶ３Ｄ－２５，ＩＧＫ
Ｖ３Ｄ－３１．ＩＧＫＶ３Ｄ－３４，ＩＧＫＶ４－１，ＩＧＫＶ５－２，ＩＧＫＶ６－２
１，ＩＧＫＶ６Ｄ－２１，ＩＧＫＶ６Ｄ－４１，ＩＧＫＶ７－３，ＩＧＫＪ１，ＩＧＫＪ
２，ＩＧＫＪ３，ＩＧＫＪ４，ＩＧＫＪ５，およびＩＧＫＣ
が挙げられるが限定されない。
免疫グロブリンラムダ遺伝子座（ＩＧＬ＠）は、抗体（または免疫グロブリン）のラム
ダ（λ）軽鎖に対する遺伝子を含有するヒト２２番染色体上の領域である。例えば、ＩＧ
Ｌ遺伝子座は、ＩＧＬＶ（可変）、ＩＧＬＪ（連結）およびＩＧＬＣ（定常）遺伝子を含
む。免疫グロブリンラムダ軽鎖をコードする代表的な遺伝子としては、
ＩＧＬＶ１－３６，ＩＧＬＶ１－４０，ＩＧＬＶ１－４１，ＩＧＬＶ１－４４，ＩＧＬ
Ｖ１－４７，ＩＧＬＶ１－５０，ＩＧＬＶ１－５１，ＩＧＬＶ１－６２，ＩＧＬＶ２－５
，ＩＧＬＶ２－８，ＩＧＬＶ２－１１，ＩＧＬＶ２－１４，ＩＧＬＶ２－１８，ＩＧＬＶ
２－２３，ＩＧＬＶ２－２８，ＩＧＬＶ２－３３，ＩＧＬＶ２－３４，ＩＧＬＶ３－１，
ＩＧＬＶ３－２，ＩＧＬＶ３－４，ＩＧＬＶ３－６，ＩＧＬＶ３－７，ＩＧＬＶ３－９，
ＩＧＬＶ３－１０，ＩＧＬＶ３－１２，ＩＧＬＶ３－１３，ＩＧＬＶ３－１５，ＩＧＬＶ
３－１６，ＩＧＬＶ３－１７，ＩＧＬＶ３－１９，ＩＧＬＶ３－２１，ＩＧＬＶ３－２２
，ＩＧＬＶ３－２４，ＩＧＬＶ３－２５，ＩＧＬＶ３－２６，ＩＧＬＶ３－２７，ＩＧＬ
Ｖ３－２９，ＩＧＬＶ３－３０，ＩＧＬＶ３－３１，ＩＧＬＶ３－３２，ＩＧＬＶ４－３
，ＩＧＬＶ４－６０，ＩＧＬＶ４－６９，ＩＧＬＶ５－３７，ＩＧＬＶ５－３９，ＩＧＬ
Ｖ５－４５，ＩＧＬＶ５－４８，ＩＧＬＶ５－５２，ＩＧＬＶ６－５７，ＩＧＬＶ７－３
５，ＩＧＬＶ７－４３，ＩＧＬＶ７－４６，ＩＧＬＶ８－６１，ＩＧＬＶ９－４９，ＩＧ
ＬＶ１０－５４，ＩＧＬＶ１０－６７，ＩＧＬＶ１１－５５，ＩＧＬＶＩ－２０，ＩＧＬ
ＶＩ－３８，ＩＧＬＶＩ－４２，ＩＧＬＶＩ－５６，ＩＧＬＶＩ－６３，ＩＧＬＶＩ－６
８，ＩＧＬＶＩ－７０，ＩＧＬＶＩＶ－５３，ＩＧＬＶＩＶ－５９，ＩＧＬＶＩＶ－６４
，ＩＧＬＶＩＶ－６５，ＩＧＬＶＩＶ－６６－１，ＩＧＬＶＶ－５８，ＩＧＬＶＶ－６６
，ＩＧＬＶＶＩ－２２－１，ＩＧＬＶＶＩ－２５－１，ＩＧＬＶＶＩＩ－４１－１，ＩＧ
ＬＪ１，ＩＧＬＪ２，ＩＧＬＪ３，ＩＧＬＪ４，ＩＧＬＪ５，ＩＧＬＪ６，ＩＧＬＪ７，
ＩＧＬＣ１，ＩＧＬＣ２，ＩＧＬＣ３，ＩＧＬＣ４，ＩＧＬＣ５，ＩＧＬＣ６，およびＩ
ＧＬＣ７
が挙げられるが限定されない。
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）は、次の２つの部分から構成される：ｉ）１つのアイソタイプ
の膜結合型免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＤまたはＩｇＭ）。膜内在性ドメインの存
在を除いて、これらはその分泌型と同一であり得る。ｉｉ）シグナル伝達部分、つまりジ
スルフィド架橋によって一緒に結合されたＩｇ－α／Ｉｇ－β（ＣＤ７９）と呼ばれるヘ
テロ二量体。二量体の各メンバーは、原形質膜にまたがり、免疫受容体活性化チロシンモ
チーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質尾部を有する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、２本の異なるタンパク質鎖（すなわちヘテロ二量体）から
構成される。Ｔ細胞のうち９５％において、これはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖か
らなり、一方でＴ細胞のうち５％において、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。
この比率は、個体発生中および病的状態において変化し得る。Ｔ細胞受容体遺伝子は、固
有の抗原受容体とともにその細胞を提供するためにリンパ球の発生中に再編成されるそれ
らのベータおよびデルタ鎖（およびそれらのアルファ鎖およびガンマ鎖におけるＶおよび
Ｊ遺伝子セグメント）中に複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントも含有するという点に
おいて、免疫グロブリン遺伝子と類似している。
Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座（ＴＲＡ）は、ＴＣＲアルファ鎖に対する遺伝子を含有
するヒト１４番染色体上の領域である。例えば、ＴＲＡ遺伝子座は、例えば、ＴＲＡＶ（
可変）、ＴＲＡＪ（連結）およびＴＲＡＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体アルファ
鎖をコードする代表的な遺伝子としては、
ＴＲＡＶ１－１，ＴＲＡＶ１－２，ＴＲＡＶ２，ＴＲＡＶ３，ＴＲＡＶ４，ＴＲＡＶ５
，ＴＲＡＶ６，ＴＲＡＶ７，ＴＲＡＶ８－１，ＴＲＡＶ８－２，ＴＲＡＶ８－３，ＴＲＡ
Ｖ８－４，ＴＲＡＶ８－５，ＴＲＡＶ８－６，ＴＲＡＶ８－７，ＴＲＡＶ９－１，ＴＲＡ
Ｖ９－２，ＴＲＡＶ１０，ＴＲＡＶ１１，ＴＲＡＶ１２－１，ＴＲＡＶ１２－２，ＴＲＡ
Ｖ１２－３，ＴＲＡＶ１３－１，ＴＲＡＶ１３－２，ＴＲＡＶ１４ＤＶ４，ＴＲＡＶ１５
，ＴＲＡＶ１６，ＴＲＡＶ１７，ＴＲＡＶ１８，ＴＲＡＶ１９，ＴＲＡＶ２０，ＴＲＡＶ
２１，ＴＲＡＶ２２，ＴＲＡＶ２３ＤＶ６，ＴＲＡＶ２４，ＴＲＡＶ２５，ＴＲＡＶ２６
－１，ＴＲＡＶ２６－２，ＴＲＡＶ２７，ＴＲＡＶ２８，ＴＲＡＶ２９ＤＶ５，ＴＲＡＶ
３０，ＴＲＡＶ３１，ＴＲＡＶ３２，ＴＲＡＶ３３，ＴＲＡＶ３４，ＴＲＡＶ３５，ＴＲ
ＡＶ３６ＤＶ７，ＴＲＡＶ３７，ＴＲＡＶ３８－１，ＴＲＡＶ３８－２ＤＶ８，ＴＲＡＶ
３９，ＴＲＡＶ４０，ＴＲＡＶ４１，ＴＲＡＪ１，ＴＲＡＪ２，ＴＲＡＪ３，ＴＲＡＪ４
，ＴＲＡＪ５，ＴＲＡＪ６，ＴＲＡＪ７，ＴＲＡＪ８，ＴＲＡＪ９，ＴＲＡＪ１０，ＴＲ
ＡＪ１１，ＴＲＡＪ１２，ＴＲＡＪ１３，ＴＲＡＪ１４，ＴＲＡＪ１５，ＴＲＡＪ１６，
ＴＲＡＪ１７，ＴＲＡＪ１８，ＴＲＡＪ１９，ＴＲＡＪ２０，ＴＲＡＪ２１，ＴＲＡＪ２
２，ＴＲＡＪ２３，ＴＲＡＪ２４，ＴＲＡＪ２５，ＴＲＡＪ２６，ＴＲＡＪ２７，ＴＲＡ
Ｊ２８，ＴＲＡＪ２９，ＴＲＡＪ３０，ＴＲＡＪ３１，ＴＲＡＪ３２，ＴＲＡＪ３３，Ｔ
ＲＡＪ３４，ＴＲＡＪ３５，ＴＲＡＪ３６，ＴＲＡＪ３７，ＴＲＡＪ３８，ＴＲＡＪ３９
，ＴＲＡＪ４０，ＴＲＡＪ４１，ＴＲＡＪ４２，ＴＲＡＪ４３，ＴＲＡＪ４４，ＴＲＡＪ
４５，ＴＲＡＪ４６，ＴＲＡＪ４７，ＴＲＡＪ４８，ＴＲＡＪ４９，ＴＲＡＪ５０，ＴＲ
ＡＪ５１，ＴＲＡＪ５２，ＴＲＡＪ５３，ＴＲＡＪ５４，ＴＲＡＪ５５，ＴＲＡＪ５６，
ＴＲＡＪ５７，ＴＲＡＪ５８，ＴＲＡＪ５９，ＴＲＡＪ６０，ＴＲＡＪ６１，およびＴＲ
ＡＣ
が挙げられるが限定されない。
Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子座（ＴＲＢ）は、ＴＣＲベータ鎖に対する遺伝子を含有する
ヒト７番染色体上の領域である。例えば、ＴＲＢ遺伝子座は、例えばＴＲＢＶ（可変）、
ＴＲＢＤ（多様性）、ＴＲＢＪ（連結）およびＴＲＢＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受
容体ベータ鎖をコードする代表的な遺伝子としては、
ＴＲＢＶ１，ＴＲＢＶ２，ＴＲＢＶ３－１，ＴＲＢＶ３－２，ＴＲＢＶ４－１，ＴＲＢ
Ｖ４－２，ＴＲＢＶ４－３，ＴＲＢＶ５－１，ＴＲＢＶ５－２，ＴＲＢＶ５－３，ＴＲＢ
Ｖ５－４，ＴＲＢＶ５－５，ＴＲＢＶ５－６，ＴＲＢＶ５－７，ＴＲＢＶ６－２，ＴＲＢ
Ｖ６－３，ＴＲＢＶ６－４，ＴＲＢＶ６－５，ＴＲＢＶ６－６，ＴＲＢＶ６－７，ＴＲＢ
Ｖ６－８，ＴＲＢＶ６－９，ＴＲＢＶ７－１，ＴＲＢＶ７－２，ＴＲＢＶ７－３，ＴＲＢ
Ｖ７－４，ＴＲＢＶ７－５，ＴＲＢＶ７－６，ＴＲＢＶ７－７，ＴＲＢＶ７－８，ＴＲＢ
Ｖ７－９，ＴＲＢＶ８－１，ＴＲＢＶ８－２，ＴＲＢＶ９，ＴＲＢＶ１０－１，ＴＲＢＶ
１０－２，ＴＲＢＶ１０－３，ＴＲＢＶ１１－１，ＴＲＢＶ１１－２，ＴＲＢＶ１１－３
，ＴＲＢＶ１２－１，ＴＲＢＶ１２－２，ＴＲＢＶ１２－３，ＴＲＢＶ１２－４，ＴＲＢ
Ｖ１２－５，ＴＲＢＶ１３，ＴＲＢＶ１４，ＴＲＢＶ１５，ＴＲＢＶ１６，ＴＲＢＶ１７
，ＴＲＢＶ１８，ＴＲＢＶ１９，ＴＲＢＶ２０－１，ＴＲＢＶ２１－１，ＴＲＢＶ２２－
１，ＴＲＢＶ２３－１，ＴＲＢＶ２４－１，ＴＲＢＶ２５－１，ＴＲＢＶ２６，ＴＲＢＶ
２７，ＴＲＢＶ２８，ＴＲＢＶ２９－１，ＴＲＢＶ３０，ＴＲＢＶＡ，ＴＲＢＶＢ，ＴＲ
ＢＶ５－８，ＴＲＢＶ６－１，ＴＲＢＤ１，ＴＲＢＤ２，ＴＲＢＪ１－１，ＴＲＢＪ１－
２，ＴＲＢＪ１－３，ＴＲＢＪ１－４，ＴＲＢＪ１－５，ＴＲＢＪ１－６，ＴＲＢＪ２－
１，ＴＲＢＪ２－２，ＴＲＢＪ２－２Ｐ，ＴＲＢＪ２－３，ＴＲＢＪ２－４，ＴＲＢＪ２
－５，ＴＲＢＪ２－６，ＴＲＢＪ２－７，ＴＲＢＣ１，およびＴＲＢＣ２
が挙げられるが限定されない。
Ｔ細胞受容体デルタ遺伝子座（ＴＲＤ）は、ＴＣＲデルタ鎖に対する遺伝子を含有する
ヒト１４番染色体上の領域である。例えば、ＴＲＤ遺伝子座は、例えば、ＴＲＤＶ（可変
）、ＴＲＤＪ（連結）およびＴＲＤＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体デルタ鎖をコ
ードする代表的な遺伝子としては、
ＴＲＤＶ１，ＴＲＤＶ２，ＴＲＤＶ３，ＴＲＤＤ１，ＴＲＤＤ２，ＴＲＤＤ３，ＴＲＤ
Ｊ１，ＴＲＤＪ２，ＴＲＤＪ３，ＴＲＤＪ４，およびＴＲＤＣ
が挙げられるが限定されない。
Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子座（ＴＲＧ）は、ＴＣＲガンマ鎖に対する遺伝子を含有する
ヒト７番染色体上の領域である。例えば、ＴＲＧ遺伝子座は、例えばＴＲＧＶ（可変）、
ＴＲＧＪ（連結）およびＴＲＧＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体ガンマ鎖をコード
する代表的な遺伝子としては、
ＴＲＧＶ１，ＴＲＧＶ２，ＴＲＧＶ３，ＴＲＧＶ４，ＴＲＧＶ５，ＴＲＧＶ５Ｐ，ＴＲ
ＧＶ６，ＴＲＧＶ７，ＴＲＧＶ８，ＴＲＧＶ９，ＴＲＧＶ１０，ＴＲＧＶ１１，ＴＲＧＶ
Ａ，ＴＲＧＶＢ，ＴＲＧＪ１，ＴＲＧＪ２，ＴＲＧＪＰ，ＴＲＧＪＰ１，ＴＲＧＪＰ２，
ＴＲＧＣ１，およびＴＲＧＣ２
が挙げられるが限定されない。
代表的な癌としては、Ｂ細胞癌、例えば多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、肺癌（非小細胞
肺癌またはＮＳＣＬＣなど）、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌
、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内
膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液
腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌、腺癌、炎症性筋線維芽細胞
腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（
ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白
血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、真
性多血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部肉腫、線維肉腫、粘
液肉腫、脂肪肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓ
ａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫
、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気
管支原性肺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫
瘍、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、
血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、濾胞性
リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞癌、甲状腺
癌、胃癌、頭頸部癌、小細胞癌、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、好酸球増加症候
群、全身性肥満細胞症、家族性（ｆａｍｉｌｉａｒ）過好酸球増加症、慢性好酸球性白血
病、神経内分泌性の癌、カルチノイド腫瘍などが挙げられるが限定されない。
一実施形態において、癌は、血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）である。本明細書中で
使用される場合、血液悪性腫瘍は、造血またはリンパ組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄ま
たはリンパ節に影響を与える腫瘍を指す。代表的な造血悪性腫瘍としては、白血病（例え
ば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白
血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性単球性白血病
（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ
）または大型顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚
Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫または結節性リン
パ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホ
ジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ
）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、
前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリン
パ腫（菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、一次
中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢
性骨髄増殖性腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨
髄異形成症候群または骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍が挙げられるが、限定されない。本明
細書中で使用される場合、前悪性腫瘍は、悪性ではないが悪性になると思われる組織を指
す。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、表１～４に記載
の遺伝子または遺伝子産物の何れかから選択される。
Figure 0007245872000002
Figure 0007245872000003
Figure 0007245872000004
Figure 0007245872000005
Figure 0007245872000006
Figure 0007245872000007
Figure 0007245872000008
Figure 0007245872000009
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、癌、例えば血液
悪性腫瘍（または前悪性疾患）に関連する１つ以上の置換、インデルまたはコピー数変化
を有する。代表的な遺伝子または遺伝子産物としては、
ＡＢＬ１，ＡＣＴＢ，ＡＫＴ１，ＡＫＴ２，ＡＫＴ３，ＡＬＫ，ＡＭＥＲ１（ＦＡＭ１
２３ＢまたはＷＴＸ），ＡＰＣ，ＡＰＨ１Ａ，ＡＲ，ＡＲＡＦ，ＡＲＦＲＰ１，ＡＲＨＧ
ＡＰ２６（ＧＲＡＦ）ＡＲＩＤ１Ａ，ＡＲＩＤ２，ＡＳＭＴＬ，ＡＳＸＬ１，ＡＴＭ，Ａ
ＴＲ，ＡＴＲＸ，ＡＵＲＫＡ，ＡＵＲＫＢ，ＡＸＩＮ１，ＡＸＬ，Ｂ２Ｍ，ＢＡＰ１，Ｂ
ＡＲＤ１，ＢＣＬ１０，ＢＣＬ１１Ｂ，ＢＣＬ２，ＢＣＬ２Ｌ２，ＢＣＬ６，ＢＣＬ７Ａ
，ＢＣＯＲ，ＢＣＯＲＬ１，ＢＩＲＣ３，ＢＬＭ，ＢＲＡＦ，ＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２，
ＢＲＤ４，ＢＲＩＰ１（ＢＡＣＨ１），ＢＲＳＫ１，ＢＴＧ２，ＢＴＫ，ＢＴＬＡ，ｃ１
１または，ｆ３０（ＥＭＳＹ），ＣＡＤ，ＣＡＲＤ１１，ＣＢＦＢ，ＣＢＬ，ＣＣＮＤ１
，ＣＣＮＤ２，ＣＣＮＤ３，ＣＣＮＥ１，ＣＣＴ６Ｂ，ＣＤ２２，ＣＤ２７４，（ＰＤＬ
１），ＣＤ３６，ＣＤ５８，ＣＤ７０，ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９Ｂ，ＣＤＣ７３，ＣＤＨ１
，ＣＤＫ１２，ＣＤＫ４，ＣＤＫ６，ＣＤＫ８，ＣＤＫＮ１Ｂ，ＣＤＫＮ２Ａ，ＣＤＫＮ
２Ｂ，ＣＤＫＮ２Ｃ，ＣＥＢＰＡ，ＣＨＤ２，ＣＨＥＫ１，ＣＨＥＫ２，ＣＩＣ，ＣＩＩ
ＴＡ，ＣＫＳ１Ｂ，ＣＰＳ１，ＣＲＥＢＢＰ，ＣＲＫＬ，ＣＲＬＦ２，ＣＳＦ１Ｒ，ＣＳ
Ｆ３Ｒ，ＣＴＣＦ，ＣＴＮＮＡ１，ＣＴＮＮＢ１，ＣＵＸ１，ＣＸＣＲ４，ＤＡＸＸ，Ｄ
ＤＲ２，ＤＤＸ３Ｘ，ＤＮＭ２，ＤＮＭＴ３Ａ，ＤＯＴ１Ｌ，ＤＴＸ１，ＤＵＳＰ２，Ｄ
ＵＳＰ９，ＥＢＦ１，ＥＣＴ２Ｌ，ＥＥＤ，ＥＧＦＲ，ＥＬＰ２，ＥＰ３００，ＥＰＨＡ
３，ＥＰＨＡ５，ＥＰＨＡ７，ＥＰＨＢ１，ＥＲＢＢ２，ＥＲＢＢ３，ＥＲＢＢ４，ＥＲ
Ｇ，ＥＳＲ１，ＥＴＳ１，ＥＴＶ６，ＥＸＯＳＣ６，ＥＺＨ２，ＦＡＦ１，ＦＡＭ４６Ｃ
，ＦＡＮＣＡ，ＦＡＮＣＣ，ＦＡＮＣＤ２，ＦＡＮＣＥ，ＦＡＮＣＦ，ＦＡＮＣＧ，ＦＡ
ＮＣＬ，ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６），ＦＢＸＯ１１，ＦＢＸＯ３１，ＦＢＸＷ７，ＦＧＦ
１０，ＦＧＦ１４，ＦＧＦ１９，ＦＧＦ２３，ＦＧＦ３，ＦＧＦ４，ＦＧＦ６，ＦＧＦＲ
１，ＦＧＦＲ２，ＦＧＦＲ３，ＦＧＦＲ４，ＦＨＩＴ，ＦＬＣＮ，ＦＬＴ１，ＦＬＴ３，
ＦＬＴ４，ＦＬＹＷＣＨ１，ＦＯＸＬ２，ＦＯＸＯ１，ＦＯＸＯ３，ＦＯＸＰ１，ＦＲＳ
２，ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＧＡＴＡ１，ＧＡＴＡ２，ＧＡＴＡ３，ＧＩＤ４（Ｃ１７ｏｒｆ３
９），ＧＮＡ１１，ＧＮＡ１２，ＧＮＡ１３，ＧＮＡＱ，ＧＮＡＳ，ＧＰＲ１２４，ＧＲ
ＩＮ２Ａ，ＧＳＫ３Ｂ，ＧＴＳＥ１，ＨＤＡＣ１，ＨＤＡＣ４，ＨＤＡＣ７，ＨＧＦ，Ｈ
ＩＳＴ１Ｈ１Ｃ，ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ，ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ，ＨＩＳＴ
１Ｈ２ＡＧ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＣ，ＨＩＳＴ
１Ｈ２ＢＪ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ，ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ，ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ，ＨＮＦ１Ａ
，ＨＲＡＳ，ＨＳＰ９０ＡＡ１，ＩＣＫ，ＩＤ３，ＩＤＨ１，ＩＤＨ２，ＩＧＦ１Ｒ，Ｉ
ＫＢＫＥ，ＩＫＺＦ１，ＩＫＺＦ２，ＩＫＺＦ３，ＩＬ７Ｒ，ＩＮＨＢＡ，ＩＮＰＰ４Ｂ
，ＩＮＰＰ５Ｄ（ＳＨＩＰ），ＩＲＦ１，ＩＲＦ４，ＩＲＦ８，ＩＲＳ２，ＪＡＫ１，Ｊ
ＡＫ２，ＪＡＫ３，ＪＡＲＩＤ２，ＪＵＮ，ＫＡＴ６Ａ（ＭＹＳＴ３），ＫＤＭ２Ｂ，Ｋ
ＤＭ４Ｃ，ＫＤＭ５Ａ，ＫＤＭ５Ｃ，ＫＤＭ６Ａ，ＫＤＲ，ＫＥＡＰ１，ＫＩＴ，ＫＬＨ
Ｌ６，ＫＭＴ２Ａ（ＭＬＬ），ＫＭＴ２Ｂ（ＭＬＬ２），ＫＭＴ２Ｃ（ＭＬＬ３），ＫＲ
ＡＳ，ＬＥＦ１，ＬＲＰ１Ｂ，ＬＲＲＫ２，ＭＡＦ，ＭＡＦＢ，ＭＡＧＥＤ１，ＭＡＬＴ
１，ＭＡＰ２Ｋ１，ＭＡＰ２Ｋ２，ＭＡＰ２Ｋ４，ＭＡＰ３Ｋ１，ＭＡＰ３Ｋ１４，ＭＡ
Ｐ３Ｋ６，ＭＡＰ３Ｋ７，ＭＡＰＫ１，ＭＣＬ１，ＭＤＭ２，ＭＤＭ４，ＭＥＤ１２，Ｍ
ＥＦ２Ｂ，ＭＥＦ２Ｃ，ＭＥＮ１，ＭＥＴ，ＭＩＢ１，ＭＩＴＦ，ＭＫＩ６７，ＭＬＨ１
，ＭＰＬ，ＭＲＥ１１Ａ，ＭＳＨ２，ＭＳＨ３，ＭＳＨ６，ＭＴＯＲ，ＭＵＴＹＨ，ＭＹ
Ｃ，ＭＹＣＬ（ＭＹＣＬ１），ＭＹＣＮ，ＭＹＤ８８，ＭＹＯ１８Ａ，ＮＣＯＲ２，ＮＣ
ＳＴＮ，ＮＦ１，ＮＦ２，ＮＦＥ２Ｌ２，ＮＦＫＢＩＡ，ＮＫＸ２－１，ＮＯＤ１，ＮＯ
ＴＣＨ１，ＮＯＴＣＨ２，ＮＰＭ１，ＮＲＡＳ，ＮＴ５Ｃ２，ＮＴＲＫ１，ＮＴＲＫ２，
ＮＴＲＫ３，ＮＵＰ９３，ＮＵＰ９８，Ｐ２ＲＹ８，ＰＡＧ１，ＰＡＫ３，ＰＡＬＢ２，
ＰＡＳＫ，ＰＡＸ５，ＰＢＲＭ１，ＰＣ，ＰＣＢＰ１，ＰＣＬＯ，ＰＤＣＤ１，ＰＤＣＤ
１１，ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤＬ２），ＰＤＧＦＲＡ，ＰＤＧＦＲＢ，ＰＤＫ１，ＰＨＦ
６，ＰＩＫ３ＣＡ，ＰＩＫ３ＣＧ，ＰＩＫ３Ｒ１，ＰＩＫ３Ｒ２，ＰＩＭ１，ＰＬＣＧ２
，ＰＯＴ１，ＰＰＰ２Ｒ１Ａ，ＰＲＤＭ１，ＰＲＫＡＲ１Ａ，ＰＲＫＤＣ，ＰＲＳＳ８，
ＰＴＣＨ１，ＰＴＥＮ，ＰＴＰＮ１１，ＰＴＰＮ２，ＰＴＰＮ６（ＳＨＰ－１），ＰＴＰ
ＲＯ，ＲＡＤ２１，ＲＡＤ５０，ＲＡＤ５１，ＲＡＦ１，ＲＡＲＡ，ＲＡＳＧＥＦ１Ａ，
ＲＢ１，ＲＥＬＮ，ＲＥＴ，ＲＨＯＡ，ＲＩＣＴＯＲ，ＲＮＦ４３，ＲＯＳ１，ＲＰＴＯ
Ｒ，ＲＵＮＸ１，Ｓ１ＰＲ２，ＳＤＨＡ，ＳＤＨＢ，ＳＤＨＣ，ＳＤＨＤ，ＳＥＲＰ２，
ＳＥＴＢＰ１，ＳＥＴＤ２，ＳＦ３Ｂ１，ＳＧＫ１，ＳＭＡＤ２，ＳＭＡＤ４，ＳＭＡＲ
ＣＡ１，ＳＭＡＲＣＡ４，ＳＭＡＲＣＢ１，ＳＭＣ１Ａ，ＳＭＣ３，ＳＭＯ，ＳＯＣＳ１
，ＳＯＣＳ２，ＳＯＣＳ３，ＳＯＸ１０，ＳＯＸ２，ＳＰＥＮ，ＳＰＯＰ，ＳＲＣ，ＳＲ
ＳＦ２，ＳＴＡＧ２，ＳＴＡＴ３，ＳＴＡＴ４，ＳＴＡＴ５Ａ，ＳＴＡＴ５Ｂ，ＳＴＡＴ
６，ＳＴＫ１１，ＳＵＦＵ，ＳＵＺ１２，ＴＡＦ１，ＴＢＬ１ＸＲ１，ＴＣＦ３，ＴＣＬ
１Ａ，ＴＥＴ２，ＴＧＦＢＲ２，ＴＬＬ２，ＴＭＥＭ３０Ａ，ＴＭＳＢ４ＸＰ８（ＴＭＳ
Ｌ３），ＴＮＦＡＩＰ３，ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ，ＴＮＦＲＳＦ１４，ＴＮＦＲＳＦ１７，
ＴＯＰ１，ＴＰ５３，ＴＰ６３，ＴＲＡＦ２，ＴＲＡＦ３，ＴＲＡＦ５，ＴＳＣ１，ＴＳ
Ｃ２，ＴＳＨＲ，ＴＵＳＣ３，ＴＹＫ２，Ｕ２ＡＦ１，Ｕ２ＡＦ２，ＶＨＬ，ＷＤＲ９０
，ＷＨＳＣ１（ＭＭＳＥＴ，または，ＮＳＤ２），ＷＩＳＰ３，ＷＴ１，ＸＢＰ１，ＸＰ
Ｏ１，ＹＹ１ＡＰ１，ＺＭＹＭ３，ＺＮＦ２１７，ＺＮＦ２４（ＺＳＣＡＮ３），ＺＮＦ
７０３，またはＺＲＳＲ２
が挙げられるが限定されない。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、癌、例えば血液
悪性腫瘍（または前悪性疾患）に関連する１つ以上の再編成を有する。代表的な遺伝子ま
たは遺伝子産物としては、
ＡＬＫ，ＢＣＬ６，ＢＲＡＦ，ＣＲＬＦ２，ＥＰＯＲ，ＥＴＶ４，ＥＴＶ６，ＦＧＦＲ
２，ＩＧＫ，ＢＣＬ２，ＢＣＲ，ＣＣＮＤ１，ＥＧＦＲ，ＥＴＶ１，ＥＴＶ５，ＥＷＳＲ
１，ＩＧＨ，ＩＧＬ，ＪＡＫ１，ＫＭＴ２Ａ，（ＭＬＬ），ＮＴＲＫ１，ＰＤＧＦＲＢ，
ＲＡＲＡ，ＲＯＳ１，ＴＲＧ，ＪＡＫ２，ＭＹＣ，ＰＤＧＦＲＡ，ＲＡＦ１，ＲＥＴ，ま
たはＴＭＰＲＳＳ２
が挙げられるが限定されない。
別の実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、癌に関連する
１つ以上の融合を有する。代表的な遺伝子または遺伝子産物としては、
ＡＢＩ１，ＣＢＦＡ２Ｔ３，ＥＩＦ４Ａ２，ＦＵＳ，ＪＡＫ１，ＭＵＣ１，ＰＢＸ１，
ＲＮＦ２１３，ＴＥＴ１，ＡＢＬ１，ＣＢＦＢ，ＥＬＦ４，ＧＡＳ７，ＪＡＫ２，ＭＹＢ
，ＰＣＭ１，ＲＯＳ１，ＴＦＥ３，ＡＢＬ２，ＣＢＬ，ＥＬＬ，ＧＬＩ１，ＪＡＫ３，Ｍ
ＹＣ，ＰＣＳＫ７，ＲＰＬ２２，ＴＦＧ，ＡＣＳＬ６，ＣＣＮＤ１，ＥＬＮ，ＧＭＰＳ，
ＪＡＺＦ１，ＭＹＨ１１，ＰＤＣＤ１ＬＧ２（ＰＤＬ２），ＲＰＮ１，ＴＦＰＴ，ＡＦＦ
１，ＣＣＮＤ２，ＥＭＬ４，ＧＰＨＮ，ＫＡＴ６Ａ（ＭＹＳＴ３），ＭＹＨ９，ＰＤＥ４
ＤＩＰ，ＲＵＮＸ１，ＴＦＲＣ，ＡＦＦ４，ＣＣＮＤ３，ＥＰ３００，ＨＥＲＰＵＤ１，
ＫＤＳＲ，ＮＡＣＡ，ＰＤＧＦＢ，ＲＵＮＸ１Ｔ１（ＥＴＯ），ＴＬＸ１，ＡＬＫ，ＣＤ
２７４（ＰＤＬ１），ＥＰＯＲ，ＨＥＹ１，ＫＩＦ５Ｂ，ＮＢＥＡＰ１（ＢＣＬ８），Ｐ
ＤＧＦＲＡ，ＲＵＮＸ２，ＴＬＸ３，ＡＲＨＧＡＰ２６（ＧＲＡＦ），ＣＤＫ６，ＥＰＳ
１５，ＨＩＰ１，ＫＭＴ２Ａ（ＭＬＬ），ＮＣＯＡ２，ＰＤＧＦＲＢ，ＳＥＣ３１Ａ，Ｔ
ＭＰＲＳＳ２，ＡＲＨＧＥＦ１２，ＣＤＸ２，ＥＲＢＢ２，ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ，ＬＡＳＰ
１，ＮＤＲＧ１，ＰＥＲ１，ＳＥＰＴ５，ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ，ＡＲＩＤ１Ａ，ＣＨＩＣ
２，ＥＲＧ，ＨＬＦ，ＬＣＰ１，ＮＦ１，ＰＨＦ１，ＳＥＰＴ６，ＴＯＰ１，ＡＲＮＴ，
ＣＨＮ１，ＥＴＳ１，ＨＭＧＡ１，ＬＭＯ１，ＮＦ２，ＰＩＣＡＬＭ，ＳＥＰＴ９，ＴＰ
６３，ＡＳＸＬ１，ＣＩＣ，ＥＴＶ１，ＨＭＧＡ２，ＬＭＯ２，ＮＦＫＢ２，ＰＩＭ１，
ＳＥＴ，ＴＰＭ３，ＡＴＦ１，ＣＩＩＴＡ，ＥＴＶ４，ＨＯＸＡ１１，ＬＰＰ，ＮＩＮ，
ＰＬＡＧ１，ＳＨ３ＧＬ１，ＴＰＭ４，ＡＴＧ５，ＣＬＰ１，ＥＴＶ５，ＨＯＸＡ１３，
ＬＹＬ１，ＮＯＴＣＨ１，ＰＭＬ，ＳＬＣ１Ａ２，ＴＲＩＭ２４，ＡＴＩＣ，ＣＬＴＣ，
ＥＴＶ６，ＨＯＸＡ３，ＭＡＦ，ＮＰＭ１，ＰＯＵ２ＡＦ１，ＳＮＸ２９（ＲＵＮＤＣ２
Ａ），ＴＲＩＰ１１，ＢＣＬ１０，ＣＬＴＣＬ１，ＥＷＳＲ１，ＨＯＸＡ９，ＭＡＦＢ，
ＮＲ４Ａ３，ＰＰＰ１ＣＢ，ＳＲＳＦ３，ＴＴＬ，ＢＣＬ１１Ａ，ＣＮＴＲＬ（ＣＥＰ１
１０），ＦＣＧＲ２Ｂ，ＨＯＸＣ１１，ＭＡＬＴ１，ＮＳＤ１，ＰＲＤＭ１，ＳＳ１８，
ＴＹＫ２，ＢＣＬ１１Ｂ，ＣＯＬ１Ａ１，ＦＣＲＬ４，ＨＯＸＣ１３，ＭＤＳ２，ＮＴＲ
Ｋ１，ＰＲＤＭ１６，ＳＳＸ１，ＵＳＰ６，ＢＣＬ２，ＣＲＥＢ３Ｌ１，ＦＥＶ，ＨＯＸ
Ｄ１１，ＭＥＣＯＭ，ＮＴＲＫ２，ＰＲＲＸ１，ＳＳＸ２，ＷＨＳＣ１（ＭＭＳＥＴ，ま
たは，ＮＳＤ２），ＢＣＬ３，ＣＲＥＢ３Ｌ２，ＦＧＦＲ１，ＨＯＸＤ１３，ＭＫＬ１，
ＮＴＲＫ３，ＰＳＩＰ１，ＳＳＸ４，ＷＨＳＣ１Ｌ１，ＢＣＬ６，ＣＲＥＢＢＰ，ＦＧＦ
Ｒ１ＯＰ，ＨＳＰ９０ＡＡ１，ＭＬＦ１，ＮＵＭＡ１，ＰＴＣＨ１，ＳＴＡＴ６，ＹＰＥ
Ｌ５，ＢＣＬ７Ａ，ＣＲＬＦ２，ＦＧＦＲ２，ＨＳＰ９０ＡＢ１，ＭＬＬＴ１（ＥＮＬ）
，ＮＵＰ２１４，ＰＴＫ７，ＳＴＬ，ＺＢＴＢ１６，ＢＣＬ９，ＣＳＦ１，ＦＧＦＲ３，
ＩＧＨ，ＭＬＬＴ１０（ＡＦ１０），ＮＵＰ９８，ＲＡＢＥＰ１，ＳＹＫ，ＺＭＹＭ２，
ＢＣＯＲ，ＣＴＮＮＢ１，ＦＬＩ１，ＩＧＫ，ＭＬＬＴ３，ＮＵＴＭ２Ａ，ＲＡＦ１，Ｔ
ＡＦ１５，ＺＮＦ３８４，ＢＣＲ，ＤＤＩＴ３，ＦＮＢＰ１，ＩＧＬ，ＭＬＬＴ４，（Ａ
Ｆ６），ＯＭＤ，ＲＡＬＧＤＳ，ＴＡＬ１，ＺＮＦ５２１，ＢＩＲＣ３，ＤＤＸ１０，Ｆ
ＯＸＯ１，ＩＫＺＦ１，ＭＬＬＴ６，Ｐ２ＲＹ８，ＲＡＰ１ＧＤＳ１，ＴＡＬ２，ＢＲＡ
Ｆ，ＤＤＸ６，ＦＯＸＯ３，ＩＬ２１Ｒ，ＭＮ１，ＰＡＦＡＨ１Ｂ２，ＲＡＲＡ，ＴＢＬ
１ＸＲ１，ＢＴＧ１，ＤＥＫ，ＦＯＸＯ４，ＩＬ３，ＭＮＸ１，ＰＡＸ３，ＲＢＭ１５，
ＴＣＦ３（Ｅ２Ａ），ＣＡＭＴＡ１，ＤＵＳＰ２２，ＦＯＸＰ１，ＩＲＦ４，ＭＳＩ２，
ＰＡＸ５，ＲＥＴ，ＴＣＬ１Ａ（ＴＣＬ１），ＣＡＲＳ，ＥＧＦＲ，ＦＳＴＬ３，ＩＴＫ
，ＭＳＮ，ＰＡＸ７，ＲＨＯＨ，またはＴＥＣ
が挙げられるが限定されない。
一実施形態において、標的遺伝子または遺伝子産物またはその断片は、表５Ａ～９に記
載の遺伝子または遺伝子産物の何れかから選択される。
Figure 0007245872000010
Figure 0007245872000011
Figure 0007245872000012
Figure 0007245872000013
Figure 0007245872000014
Figure 0007245872000015
「優先度１」は、選択された遺伝子または遺伝子産物の最優先事項を指す。
「癌遺伝子」は、優先度１と比較して優先度が低い、癌関連遺伝子または遺伝子産物を
指す。
「ＰＧｘ遺伝子」は、薬理遺伝学および薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）にとって重要である
遺伝子を指す。
Figure 0007245872000016
Figure 0007245872000017
Figure 0007245872000018
Figure 0007245872000019
実行可能性カテゴリは、以下のように分類される。表６は、異なる癌のタイプにおける
代表的な変化に対する異なるカテゴリの適用のまとめを提供する。
カテゴリＡ：承認／標準的治療に対する感度または耐性を予測する承認／標準変化
転移性結腸癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ
乳癌におけるＥＲＢＢ２増幅
非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ
カテゴリＢ：特定の実験的治療に対する包含または除外基準である変化
結腸癌、肺癌または乳癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ
黒色腫、結腸癌または肺癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ
黒色腫におけるＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ
乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ
乳癌におけるＦＧＦＲ１増幅
乳癌におけるＰＴＥＮ二対立遺伝子不活性化
乳癌または膵臓癌におけるＢＲＣＡ１二対立遺伝子不活性化
カテゴリＣ：標準的または実験的治療に対する感度または耐性を予測する証拠が限定的
な変化（初期臨床データ、相反する臨床データ、前臨床データ、理論）
結腸癌におけるＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ（初期臨床データ）
乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（相反する臨床データ）
結腸癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（相反する臨床データ）
肺癌におけるＥＲＢＢ２突然変異または増幅（症例報告）
肺癌におけるＢＲＡＦ Ｄ５９４Ｇ（前臨床）
乳癌におけるＦＧＦＲ１増幅（前臨床）
乳癌におけるＡＴＭ二対立遺伝子不活性化（前臨床）
結腸癌におけるＴＳＣ１二対立遺伝子不活性化（前臨床）
乳癌におけるＡＴＲ二対立遺伝子不活性化（理論）
肉腫におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突然変異（理論）
カテゴリＤ：癌の特定のサブタイプにおける予後または診断有用性がある変化
結腸癌におけるＭＳＨ２二対立遺伝子不活性化（強力な臨床的証拠）
結腸癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（強力な臨床的証拠）
肺癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ（強力な臨床的証拠）
乳癌におけるＢＲＣＡ１の不活性化（強力な臨床的証拠）
カテゴリＥ：明確な臨床的意義のない、癌における明確な生物学的意義の変化（すなわ
ちドライバー変異）
結腸癌におけるＡＰＣ二対立遺伝子不活性化
乳癌におけるＴＰ５３二対立遺伝子不活性化
黒色腫におけるＭＩＴＦ増幅
卵巣癌におけるＡＲＩＤ１Ａ
カテゴリＦ：癌における既知の生物学的意義のない変化
既知の癌遺伝子における新規変化
治療標的
既知の癌遺伝子の相同分子種
Figure 0007245872000020
Figure 0007245872000021
Figure 0007245872000022
Figure 0007245872000023
Figure 0007245872000024
Figure 0007245872000025
Figure 0007245872000026
Figure 0007245872000027
Figure 0007245872000028
Figure 0007245872000029
Figure 0007245872000030
前述の方法の適用には、医学的検体における配列決定のための特定の１つまたは複数の
遺伝子の全ての既知の配列変異（またはそのサブセット）を含有するオリゴヌクレオチド
のライブラリを使用することが含まれる。
ある一定の実施形態において、本方法またはアッセイは、次のうち１つ以上をさらに含
む：
（ｉ）核酸試料のフィンガープリントを行うこと；
（ｉｉ）核酸試料中の遺伝子または遺伝子産物（例えば本明細書中に記載のような遺伝
子または遺伝子産物）の存在量を定量すること；
（ｉｉｉ）試料中の転写産物の相対的存在量を定量すること；
（ｉｖ）核酸試料を特定の対象（例えば正常対照または癌患者）に属するものとして同
定すること；
（ｖ）核酸試料中の遺伝的形質（例えば１つ以上の対象の遺伝的性質（例えば、民族性
、人種、家族の特徴））を同定すること；
（ｖｉ）核酸試料中の倍数性を決定し；核酸試料中のヘテロ接合性の喪失を判定するこ
と；
（ｖｉｉ）核酸試料中の遺伝子重複事象の有無を判定すること；
（ｖｉｉｉ）核酸試料中の遺伝子増幅事象の有無を判定すること；または
（ｉｘ）核酸試料中の腫瘍／正常細胞混合のレベルを決定すること。
核酸試料
様々な組織試料が、本方法で使用される核酸試料の供給源となり得る。対象の試料（例
えば、腫瘍試料、正常隣接組織（ＮＡＴ）、血液試料、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含有す
る試料または何らかの正常な対照）から、ゲノムまたはサブゲノム核酸（例えばＤＮＡま
たはＲＮＡ）を単離し得る。ある一定の実施形態において、組織試料は、凍結試料として
、またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ
）組織標本として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えば、ＦＦＰＥブロッ
クまたは凍結試料中で包埋され得る。ある一定の実施形態において、組織試料は血液試料
である。他の実施形態において、組織試料は、骨髄穿刺（ＢＭＡ）試料である。単離段階
は、個々の染色体のフローソーティング；および／または対象の試料（例えば、腫瘍試料
、ＮＡＴ、血液試料）を顕微解剖することを含み得る。
「単離」核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されて
いる核酸分子である。ある一定の実施形態において、「単離」核酸分子は、核酸が由来す
る生物のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）
に天然に隣接する配列（タンパク質コード配列など）を含まない。例えば、様々な実施形
態において、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然
に隣接する、約５ｋＢ未満、約４ｋＢ未満、約３ｋＢ未満、約２ｋＢ未満、約１ｋＢ未満
、約０．５ｋＢ未満または約０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、
ＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、例えば、組み換え技術によっ
て作製されるか、または化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない場合、例え
ば化学合成される場合、他の細胞性物質または培地を実質的に含み得ない。
「他の細胞性物質または培地を実質的に含まない」という語は、ある核酸分子が単離さ
れているかまたは組み換え産生される細胞の細胞構成成分から、その分子が分離される、
核酸分子の調製を含む。したがって、実質的に細胞性物質を含まない核酸分子は、約３０
％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満（乾燥重量）の他の細胞性物質ま
たは培地を有する核酸分子の調製を含む。
ある一定の実施形態において、核酸は、経年試料、例えば経年ＦＦＰＥ試料から単離さ
れる。経年試料は、例えば、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年、
２５年、５０年、７５年または１００年以上であり得る。
核酸試料は、様々な大きさの組織試料（例えば、生検、ＦＦＰＥ試料、血液試料または
骨髄穿刺試料）から得ることができる。例えば、核酸は、５～２００μｍまたはそれを超
える組織試料から単離し得る。例えば、組織試料は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０
μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１５０μ
ｍまたは２００μｍまたはそれ以上を測定し得る。
組織試料からのＤＮＡ単離のためのプロトコールを実施例１で提供する。ホルムアルデ
ヒドまたはパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸（例え
ばＤＮＡ）を単離するためのさらなる方法は、例えばＣｒｏｎｉｎ Ｍ．ら（２００４）
Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６４（１）：３５－４２；Ｍａｓｕｄａ Ｎ．ら（１９９９
）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４４３６－４４４３；Ｓｐｅｃ
ｈｔ Ｋ．ら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：４１９－４２９，Ａ
ｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＭ１９７５，Ｓ
ｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８），Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ
ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕ
ａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０
１１），Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（
ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｕｍｂｅｒ
ｓ Ｄ３３９９－００，Ｄ３３９９－０１およびＤ３３９９－０２；Ｊｕｎｅ ２００９
）およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ
（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３７６２５，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００７）で開示されて
いる。ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌ
ａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、高温でキシレンを使用して、パラフィン包埋試料とグラスファイ
バーフィルターを溶解させて核酸を捕捉する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰ
Ｅ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＦＦＰＥ組織の
１～１０μｍ切片からのゲノムＤＮＡの精製のために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６
機器とともに使用される。シリカ被覆常磁性粒子（ＰＭＰ）を用いてＤＮＡを精製し、低
溶出体積で溶出させる。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔは、ゲ
ノムＤＮＡの単離のためにスピンカラムおよび緩衝液系を使用する。ＱＩＡａｍｐ（登録
商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔは、ゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡ
の精製のために、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏテクノロジーを使用する
。血液からのＤＮＡ単離のためのプロトコールは、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）
１６ ＬＥＶ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ ＫｉｔおよびＭａｘｗｅｌｌ １６ Ｂｕｃｃａｌ
Ｓｗａｂ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３３３，Ｊａｎｕａｒ
ｙ １，２０１１）で開示されている。
ＲＮＡ単離のためのプロトコールは、例えばＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｔｏｔ
ａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＢ３５１，Ａｕｇｕｓｔ ２００９
）で開示されている。
単離核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡ試料）は、日常的な技術を実施することによって
断片化またはせん断し得る。例えば、ゲノムＤＮＡは、物理的せん断法、酵素的切断法、
化学的切断法および当業者にとって周知の他の方法によって断片化し得る。核酸ライブラ
リは、ゲノムの複雑性の全てまたは実質的に全てを含み得る。この文脈において「実質的
に全て」という用語は、実際には、手順の最初の段階の間に、ゲノムの複雑性のいくつか
の不必要な喪失があり得る可能性を指す。本明細書中に記載の方法はまた、核酸ライブラ
リがゲノムの一部である場合、すなわちゲノムの複雑性が設計によって減少する場合にも
有用である。いくつかの実施形態において、ゲノムの何らかの選択部分を、本明細書中に
記載の方法とともに使用し得る。ある一定の実施形態において、エクソーム全体またはそ
のサブセットが単離される。
本発明において特徴となる方法は、ライブラリ（例えば、本明細書中に記載のような核
酸ライブラリ）を提供するために核酸試料を単離することをさらに含み得る。ある一定の
実施形態において、核酸試料は、全ゲノム、サブゲノム断片またはその両方を含む。核酸
ライブラリを調製するために、単離された核酸試料を使用し得る。したがって、一実施形
態において、本発明において特徴となる方法は、ライブラリ（例えば、本明細書中に記載
のような核酸ライブラリ）を提供するために核酸試料を単離することをさらに含む。全ゲ
ノムまたはサブゲノム断片からライブラリを単離および調製するためのプロトコールは当
技術分野で公知である（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのゲノムＤＮＡ試料調製キット）。あ
る一定の実施形態において、対象の試料（例えば、腫瘍試料、正常隣接組織（ＮＡＴ）、
血液試料または何らかの正常な対照）から、ゲノムまたはサブゲノムＤＮＡ断片を単離す
る。一実施形態において、試料（例えば腫瘍またはＮＡＴ試料）は保存検体である。例え
ば、試料は、マトリックス、例えば、ＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中で包埋される。
ある一定の実施形態において、単離段階は、個々の染色体のフローソーティング；および
／または対象の試料（例えば、腫瘍試料、ＮＡＴ、血液試料）を顕微解剖することを含む
。ある一定の実施形態において、核酸ライブラリを作製するために使用される核酸試料は
、５マイクログラム未満、１マイクログラム未満または５００ｎｇ未満、２００ｎｇ未満
、１００ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満または１ｎｇ未満である。
さらに他の実施形態において、ライブラリを作製するために使用される核酸試料は、Ｒ
ＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは全細胞
ＲＮＡを含む。他の実施形態において、ある種の大量のＲＮＡ配列（例えばリボソームＲ
ＮＡ）が枯渇している。いくつかの実施形態において、全ＲＮＡ調製物中のポリ（Ａ）尾
部付きｍＲＮＡ分画が濃縮されている。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ラン
ダムプライムｃＤＮＡ合成法によって作製される。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成
は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドで開始させることによって成熟ｍＲＮＡのポ
リ（Ａ）尾部で惹起される。欠失、ポリ（Ａ）濃縮およびｃＤＮＡ合成のための方法は、
当業者にとって周知である。
本方法は、当業者にとって周知である特異的または非特異的核酸増幅法によって核酸試
料を増幅することをさらに含み得る。いくつかの実施形態、ある一定の実施形態において
、核酸試料は、例えばランダムプライム鎖置換増幅などの全ゲノム増幅法によって増幅さ
れる。
他の実施形態において、物理的または酵素的方法により核酸試料を断片化またはせん断
し、合成アダプターに連結させ、（例えば分取ゲル電気泳動により）サイズ選択し、（例
えばＰＣＲにより）増幅させる。他の実施形態において、ハイブリッド選択の前に明確な
サイズ選択または増幅なしに、核酸の断片化およびアダプター連結群を使用する。
他の実施形態において、単離ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）を断片化またはせん断する
。いくつかの実施形態において、ライブラリは、例えば、他の手段によって細分画化され
た、ゲノムの縮小版または定められた部分であるゲノムＤＮＡの細分画など、ゲノムＤＮ
Ａの５０％未満を含む。他の実施形態において、ライブラリは、全てまたは実質的に全て
のゲノムＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、ライブラリは、例えば、他の手段によって細分画化され
た、ゲノムの縮小版または定められた部分であるゲノムＤＮＡの細分画など、ゲノムＤＮ
Ａの５０％未満を含む。他の実施形態において、ライブラリは、全てまたは実質的に全て
のゲノムＤＮＡを含む。全ゲノムまたはサブゲノム断片からライブラリを単離および調製
するためのプロトコールは、当技術分野で公知であり（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａのゲノ
ムＤＮＡ試料調製キット）、実施例において本明細書中に記載されている。ＤＮＡせん断
に対する代替法は、本明細書中で実施例４として記載する。例えば、代替的なＤＮＡせん
断法は、より自動化可能および／またはより効率的であり得る（例えば、分解されたＦＦ
ＰＥ試料を用いる。）。ライブラリ調製中のライゲーション段階を回避するために、ＤＮ
Ａせん断法に対する代替法を使用し得る。
本明細書中に記載の方法は、例えば、供給源ＤＮＡまたはＲＮＡの量が（例えば全ゲノ
ム増幅の後でさえも）制限される場合に、少量の核酸を使用して行われ得る。一実施形態
において、核酸は、約５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．８μｇ、０．７μ
ｇ、０．６μｇ、０．５μｇまたは４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、
５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ未満またはそれ未満の核酸試料を含む。例えば、典
型的には５０～１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて開始し得る。しかし、ハイブリダイゼ
ーション段階、例えば溶液ハイブリダイゼーションの前に、（例えばＰＣＲを使用して）
ゲノムＤＮＡを増幅する場合、より少ない量で開始し得る。したがって、ハイブリダイゼ
ーション、例えば溶液ハイブリダイゼーションの前に、ゲノムＤＮＡを増幅することは可
能であるが必須ではない。
ライブラリを作製するために使用される核酸試料は、ＲＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮ
Ａも含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡを含む。他の実施形
態において、ある種の大量のＲＮＡ配列（例えばリボソームＲＮＡ）が枯渇している。他
の実施形態において、全ＲＮＡ調製物中のポリ（Ａ）尾部付きｍＲＮＡ分画が濃縮されて
いる。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ランダムプライムｃＤＮＡ合成法によ
って作製される。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌ
クレオチドで開始させることによって成熟ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部で惹起される。欠失
、ポリ（Ａ）濃縮およびｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者にとって周知である。
本方法は、当業者にとって公知である特異的または非特異的核酸増幅法によって核酸試
料を増幅することをさらに含み得る。核酸試料は、例えばランダムプライム鎖置換増幅な
どの全ゲノム増幅法によって増幅され得る。
本明細書中に記載のような物理的または酵素的方法により核酸試料を断片化またはせん
断し、合成アダプターに連結し、（例えば分取ゲル電気泳動により）サイズ選択し、（例
えばＰＣＲにより）増幅し得る。ハイブリッド選択の前に明確なサイズ選択または増幅な
しに、核酸の断片化およびアダプター連結群を使用する。
一実施形態において、核酸試料は、非癌細胞または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ
球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）またはその両方を含む。一実施
形態において、核酸試料は、非癌細胞または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球からの
ＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）またはその両方を含み、癌細胞または悪
性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）またはその両方を含まない
か、または基本的これら不含である。
一実施形態において、核酸試料は、癌細胞または悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（また
はＲＮＡ由来のｃＤＮＲ）を含む。一実施形態において、核酸試料は、癌細胞または悪性
細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＲ）を含み、非癌細胞または非悪
性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）
またはその両方を含まないか、または基本的これら不含である。
一実施形態において、核酸試料は、非癌細胞または非悪性細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ
球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）またはその両方および癌細胞ま
たは悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）またはその両方を含
む。
ベイトの設計および構築
ベイトは、ハイブリッド形成し得（例えば相補的であり得る）、それにより標的核酸の
捕捉を可能とする核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。ある一定の実施
形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ分子である。他の実施形態において、標的核酸
は、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡ分子である。一実施形態において、ベイ
トはＲＮＡ分子である。他の実施形態において、ベイトは、例えば、結合実体への結合に
よる、ベイトおよびベイトに対してハイブリッド形成する核酸によって形成されるハイブ
リッドの捕捉および分離を可能にする、結合実体、例えば親和性タグを含む。一実施形態
において、ベイトは溶液相ハイブリダイゼーションに適している。
典型的には、ＲＮＡ分子はベイト配列として使用される。ＲＮＡ－ＤＮＡ２本鎖は、Ｄ
ＮＡ－ＤＮＡ２本鎖よりも安定であり、したがって核酸のより良好である可能性がある捕
捉がもたらされる。
ＲＮＡベイトは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ分子のデノボ化学合
成および転写を含むが限定されない、当技術分野で公知の方法を用いて、本明細書の他の
箇所に記載のように作製され得る。一実施形態において、ベイト配列は、例えばヒトＤＮ
ＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試料を鋳型として用いて、ＰＣＲなどの既知の核酸増幅
法を用いて作製される。その後、オリゴヌクレオチドをＲＮＡベイトに変換し得る。一実
施形態において、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のオリゴヌクレオチドの一
方の末端への付加に基づいて、インビトロ転写を使用する。一実施形態において、ベイト
配列を増幅または再増幅することによって、例えばＰＣＲまたは他の核酸増幅法を用いて
、例えば各標的特異的プライマー対のうち一方のプライマーにＲＮＡプロモーター配列を
尾部付加することによって、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列をベイトの末端に付加
する。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラ
ーゼまたはＴ３ポリメラーゼである。一実施形態において、ＲＮＡベイトはタグ、例えば
親和性タグで標識される。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、例えばビオチン化ＵＴ
Ｐを使用してインビトロ転写によって作製される。別の実施形態において、ＲＮＡベイト
をビオチンなしで作製し、次いでソラレン架橋などの当技術分野で周知の方法を用いてビ
オチンをＲＮＡ分子に架橋する。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、ＲＮａｓｅ耐性
ＲＮＡ分子であり、これは例えば、ＲＮａｓｅ分解に耐性があるＲＮＡ分子を生成させる
ために転写中に修飾ヌクレオチドを用いることによって作製し得る。一実施形態において
、ＲＮＡベイトは、２本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖にのみ対応する。典型的には、このよう
なＲＮＡベイトは自己相補的ではなく、ハイブリダイゼーションドライバーとしてより効
果的である。
ベイトセットは、ベイトが参照配列の標的を選択するのに最適であるように、参照配列
から設計し得る。いくつかの実施形態において、ベイト配列は、混合塩基（例えば縮重）
を用いて設計する。例えば、（１つまたは複数の）混合塩基が共通のＳＮＰまたは突然変
異の（１つまたは複数の）位置でベイト配列中に含まれ得、両方の対立遺伝子（例えばＳ
ＮＰおよび非ＳＮＰ；突然変異体および非突然変異体）を捕捉するためにベイト配列を最
適化し得る。いくつかの実施形態において、混合縮重オリゴヌクレオチドを使用するので
はなく、複数のオリゴヌクレオチドベイトを用いて全ての既知の配列変異体（またはその
サブセット）を標的化し得る。
ある一定の実施形態において、ベイトセットは、約１００ヌクレオチド～３００ヌクレ
オチド長のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。典型的には
、ベイトセットは、約１３０ヌクレオチド～２３０ヌクレオチドまたは約１５０～２００
ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。他の
実施形態において、ベイトセットは、約３００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド長の
オリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド中の標的メンバー特異的配列は、約
４０～１０００ヌクレオチド、約７０～３００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオ
チド長、典型的には約１２０～１７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、ベイトセットは結合実体を含む。結合実体は、各ベイト
配列上の親和性タグであり得る。いくつかの実施形態において、親和性タグはビオチン分
子またはハプテンである。ある一定の実施形態において、結合実体は、アビジン分子など
のパートナー、またはハプテンもしくはその抗原結合断片に結合する抗体に結合すること
によって、ハイブリダイゼーション混合物からベイト／メンバーハイブリッドを分離する
ことを可能にする。
他の実施形態において、ベイトセット中のオリゴヌクレオチドは、同じ標的メンバー配
列に対して順方向および逆方向相補配列を含有し、それによって逆相補的メンバー特異的
な配列を有するオリゴヌクレオチドは逆相補ユニバーサル尾部も保有する。これは、同じ
鎖である、すなわち互いに相補的でない、ＲＮＡ転写産物をもたらし得る。
他の実施形態において、ベイトセットは、１つ以上の位置に縮重または混合塩基を含有
するオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態において、ベイトセットは、単一種
の集団または生物の群集に存在する複数のまたは実質的に全ての既知の配列変異を含む。
一実施形態において、ベイトセットは、ヒト集団に存在する複数のまたは実質的に全ての
既知の配列変異を含む。
他の実施形態において、ベイトセットは、ｃＤＮＡ配列を含むか、またはｃＤＮＡ配列
に由来する。他の実施形態において、ベイトセットは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはク
ローン化ＤＮＡから増幅される増幅産物（例えばＰＣＲ産物）を含む。
他の実施形態において、ベイトセットはＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態におい
て、セットは、より安定でＲＮａｓｅ耐性であるものを含むが限定されない、化学的、酵
素的に修飾された、またはインビトロで転写されたＲＮＡ分子を含む。
さらに他の実施形態において、ベイトは、参照により本明細書中に組み込まれる、米国
特許出願公開第２０１０／００２９４９８およびＧｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９）Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（２）：１８２－１８９に記載の方法によって作製され
る。例えば、最初にマイクロアレイ上で合成された長い合成オリゴヌクレオチドのプール
を得て、ベイト配列を作製するためにオリゴヌクレオチドを増幅することによって、ビオ
チン化ＲＮＡベイトを作製し得る。いくつかの実施形態において、ベイトは、ベイト配列
の一方の末端でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加し、ＲＮＡポリメラーゼを用
いてＲＮＡ配列を合成することによって作製される。一実施形態において、合成オリゴデ
オキシヌクレオチドのライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．などの市販業者から入手し、公知の核酸増幅法を用いて増幅し得る。
したがって、上記のベイトセットを作製する方法が提供される。本方法は、１つ以上の
標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載のような１つ以上
の突然変異捕捉、参照または対照オリゴヌクレオチド配列）を選択すること；標的特異的
ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを得ること（例えばマイクロアレイ合成によって
、標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること）；および場合によ
ってはベイトセットを作製するためにオリゴヌクレオチドを増幅することを含む。
他の実施形態において、本方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを用いてオリゴヌ
クレオチドを（例えばＰＣＲによって）増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態
において、オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイに連結される各オリゴヌクレオチドの
末端にユニバーサル配列を含む。本方法は、オリゴヌクレオチドからユニバーサル配列を
除去することをさらに含み得る。このような方法はまた、オリゴヌクレオチドの相補鎖を
除去し、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、オリゴヌクレオチドを伸長させることも
含み得る。これらの実施形態の一部において、オリゴヌクレオチドを（例えばＰＣＲによ
って）増幅するための方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを使用する。いくつかの
実施形態において、本方法は増幅されたオリゴヌクレオチドのサイズ選択を行うことをさ
らに含む。
一実施形態において、ＲＮＡベイトセットが作製される。本方法は、本明細書中に記載
の方法に従い、ベイト配列のセットを作製し、ベイト配列の一方の末端でＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーター配列を付加し、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ配列を合成すること
を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラー
ゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼから選択され得る。他の実施形態において、ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーター配列は、ベイト配列を（例えばＰＣＲにより）増幅することによ
ってベイト配列の末端で付加される。ベイト配列が、ゲノムまたはｃＤＮＡからの特異的
なプライマー対を用いてＰＣＲによって増幅される実施形態において、ＲＮＡプロモータ
ー配列を各対の２つの特異的プライマーの一方の５’末端に付加することにより、標準的
な方法を用いて、ＲＮＡベイトに転写し得るＰＣＲ産物が得られる。
他の実施形態において、ベイトセットは、ヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試
料を鋳型として使用して作製し得る。このような実施形態において、オリゴヌクレオチド
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。他の実施形態において、増幅
されたオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅またはハイパーブランチド・ロー
リングサークル増幅によって再増幅される。ヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試
料を鋳型として使用してベイト配列を作製するためにも、同じ方法を使用し得る。制限消
化、パルスフィールドゲル電気泳動、フローソーティング、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離、
選択的動的再会合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
）、染色体調製物の顕微解剖および当業者にとって公知の他の分画化方法を含むが限定さ
れない他の方法によって得られたゲノムの細分画を用いて、ベイト配列を作製するために
も、同じ方法を使用し得る。
ある一定の実施形態において、ベイトセット中のベイト数は１，０００未満である。他
の実施形態において、ベイトセット中のベイト数は、１，０００を超えるか、５，０００
を超えるか、１０，０００を超えるか、２０，０００を超えるか、５０，０００を超える
か、１００，０００を超えるか、または５００，０００を超える。
ベイト配列の長さは、約７０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドであり得る。一実施
形態において、ベイトの長さは、約１００～３００ヌクレオチド、１１０～２００ヌクレ
オチドまたは１２０～１７０ヌクレオチド長である。上記のものに加えて、約７０、８０
、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、
１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、
６００、７００、８００および９００ヌクレオチド長の中間的なオリゴヌクレオチド長を
本明細書中に記載の方法において使用し得る。いくつかの実施形態において、約７０、８
０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０
、１９０、２００、２１０、２２０または２３０塩基のオリゴヌクレオチドを使用し得る
。
各ベイト配列は、一方または両方の末端に標的特異的（例えばメンバー特異的）ベイト
配列およびユニバーサル尾部を含み得る。本明細書で使用される場合、「ベイト配列」と
いう用語は、標的特異的ベイト配列またはオリゴヌクレオチドの標的特異的「ベイト配列
」および他のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド全体を指し得る。ベイト中の標的特
異的配列は、約４０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド長である。一実施形態において
、標的特異的配列は、約７０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド長である。別の実施形態
において、標的特異的配列は、約１００ヌクレオチド～２００ヌクレオチド長である。さ
らに別の実施形態において、標的特異的配列は、約１２０ヌクレオチド～１７０ヌクレオ
チド長、一般的には１２０ヌクレオチド長である。上述のものに加えて、約４０、５０、
６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、
１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、
４００、５００、６００、７００、８００および９００ヌクレオチド長の標的特異的配列
、ならびに上述の間の長さの標的特異的配列など、中間的な長さも、本明細書中に記載の
方法において使用され得る。
一実施形態において、ベイトは、約５０～２００ヌクレオチド長（例えば、５０、６０
、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１
９０または２００ヌクレオチド）のオリゴマー（例えばＲＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴ
マーまたはそれらの組み合わせから成っている。）である。一実施形態において、各ベイ
トオリゴマーは、標的特異的ベイト配列である約１２０～１７０個、または典型的には約
１２０個のヌクレオチドを含む。ベイトは、一方または両方の末端でさらなる非標的特異
的ヌクレオチド配列を含み得る。さらなるヌクレオチド配列は、例えば、ＰＣＴ増幅のた
めに、またはベイト識別子として使用され得る。ある一定の実施形態において、ベイトは
、本明細書中に記載のような結合実体（例えば、ビオチン分子などの捕捉タグ）をさらに
含む。結合実体、例えばビオチン分子は、例えばベイトの５’－、３’－末端または内部
に（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを組み込むことによって）ベイトに付着させ得る。
一実施形態において、ビオチン分子は、ベイトの５’－末端で連結される。
代表的な一実施形態において、ベイトは約１５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド
であり、そのうち１２０ヌクレオチドは標的特異的「ベイト配列」である。他の３０のヌ
クレオチド（例えば各末端で１５ヌクレオチド）は、ＰＣＲ増幅に使用される任意のユニ
バーサル尾部である。尾部は、使用者により選択される何らかの配列であり得る。例えば
、合成オリゴヌクレオチドのプールは、５’－ＡＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＮ１２０
ＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１）の配列のオリゴヌクレオチドを含
み得、Ｎ１２０は標的特異的ベイト配列を示す。
本明細書中に記載のベイト配列は、エクソンおよび短い標的配列の選択のために使用し
得る。一実施形態において、ベイトは、約１００ヌクレオチド～３００ヌクレオチド長で
ある。別の実施形態において、ベイトは、約１３０ヌクレオチド～２３０ヌクレオチド長
である。さらに別の実施形態において、ベイトは、約１５０ヌクレオチド～２００ヌクレ
オチド長である。例えばエクソンおよび短い標的配列の選択のための、ベイト中の標的特
異的配列は、約４０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド長である。一実施形態において
、標的特異的配列は、約７０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド長である。別の実施形態
において、標的特異的配列は、約１００ヌクレオチド～２００ヌクレオチド長である。さ
らに別の実施形態において、標的特異的配列は、約１２０ヌクレオチド～１７０ヌクレオ
チド長である。
いくつかの実施形態において、長いオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉するために
必要なオリゴヌクレオチドの数を最小限にし得る。例えば、エクソン１個あたり１つのオ
リゴヌクレオチドを使用し得る。当技術野で、ヒトゲノム中のタンパク質コードエクソン
の平均および中央値の長さはそれぞれ約１６４および１２０塩基対であることが知られて
いる。長いベイトほど、特異性が高く、短いものよりも良好に捕捉し得る。結果として、
オリゴヌクレオチドベイト配列あたりの成功率は、短いオリゴヌクレオチドの場合よりも
高い。一実施形態において、最小ベイトカバー配列は、例えばエクソンサイズの標的を捕
捉する場合、１個のベイトの大きさ（例えば１２０～１７０塩基）である。ベイト配列の
長さを決定する際、ベイトが不必要に長いと、標的に直接隣接する、より多くの不必要な
ＤＮＡを捕捉することも考慮に入れ得る。長いオリゴヌクレオチドベイトほど、また、短
いものよりもＤＮＡ試料中の標的領域における多型に対してより耐性であり得る。典型的
には、ベイト配列は参照ゲノム配列に由来する。実際のＤＮＡ試料中の標的配列が参照配
列から逸脱する場合、例えば、それが一塩基多型（ＳＮＰ）を含有する場合、それはベイ
トとあまり効率的にハイブリッド形成し得ず、したがって、ベイト配列とハイブリッド形
成させられる配列が提示不十分であるかまたは完全に不在であり得る。例えば１２０～１
７０塩基における単一の誤対合は、それぞれ多重増幅およびマイクロアレイ捕捉における
典型的なベイトまたはプライマー長である２０または７０塩基の単一のミスマッチよりも
ハイブリッドの安定性に対する影響が少なくなり得るという理由から、より長い合成ベイ
ト分子では、ＳＮＰに起因する対立遺伝子の脱落が起こる可能性が低くなり得る。
ゲノム領域など、捕捉ベイトの長さと比較して長い標的の選択の場合、ベイト配列の長
さは、一般的には、隣接配列の標的化を最小限に抑えるという唯一の目的のためにベイト
配列の最大サイズを制限する必要がないことを除いて、上記の短い標的に対するベイトと
同じサイズ範囲にある。あるいは、オリゴヌクレオチドは、はるかに広い枠（一般的には
６００塩基）にわたり表記され得る。この方法は、典型的なエクソンよりもかなり大きい
（例えば約５００塩基）ＤＮＡ断片を捕捉するために使用し得る。結果として、かなりよ
り多くの不必要な隣接非標的配列が選択される。
ベイト合成
ベイトは、何らかのタイプのオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得
る。ＤＮＡまたはＲＮＡベイト（「オリゴベイト」）は、個々に合成し得るか、またはＤ
ＮＡもしくはＲＮＡベイトセットとしてアレイで合成し得る（「アレイベイト」）。オリ
ゴベイトは、アレイ方式で提供されるかまたは単離オリゴとして提供されるかにかかわら
ず、一般的には１本鎖である。ベイトは、本明細書中に記載のような結合実体（例えば、
ビオチン分子などの捕捉タグ）をさらに含み得る。結合実体、例えばビオチン分子は、ベ
イトに、例えばベイトの５’－、３’－末端、一般的にはベイトの５’－末端に付着させ
得る。ベイトセットは、例えば、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレットに記
載のような、当技術分野で記載の方法によって合成され得る。
ハイブリダイゼーション条件
本発明で特徴となる方法は、選択されたライブラリキャッチを提供するために、ライブ
ラリ（例えば核酸ライブラリ）を複数のベイトと接触させる段階を含む。接触段階は溶液
ハイブリダイゼーションで行われ得る。ある一定の実施形態において、本方法は、１回以
上のさらなる溶液ハイブリダイゼーションによってハイブリダイゼーション段階を繰り返
すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、同じまたは異なるベイト収集物
を用いた１回以上のさらなる溶液ハイブリダイゼーションにライブラリキャッチを供する
ことをさらに含む。本明細書における方法での使用に適合させ得るハイブリダイゼーショ
ン法は、例えば、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレットに記載のように、当
技術分野で記載されている。
本発明のさらなる実施形態または特徴は以下のとおりである。
別の態様において、本発明は、上記のベイトセットを作製する方法を特徴とする。本方
法は、１つ以上の標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載
のような遺伝子または遺伝子産物の対象区間（例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区
間またはその両方）に対応するベイト配列の何れか）を選択すること；標的特異的ベイト
オリゴヌクレオチド配列のプールを得ること（例えば、マイクロアレイ合成によって、標
的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること）；場合によってはベイ
トセットを作製するためにオリゴヌクレオチドを増幅することを含む。
さらに別の態様において、本発明は、核酸試料における、癌性表現型（例えば、本明細
書中に記載の遺伝子または遺伝子産物における変化のうち少なくとも１０、２０、３０、
５０個、またはそれ以上）に、例えば陽性または陰性に関連する変化の有無を判定するた
めの方法を特徴とする。本方法は、核酸キャッチを得るために、本明細書中に記載の方法
およびベイトの何れかによる溶液ベースの選択に対して試料中の核酸を接触させ；（例え
ば次世代配列決定によって）核酸キャッチの全てまたはサブセットを配列決定し、それに
よって本明細書中に記載の遺伝子または遺伝子産物における変化の有無を判定することを
含む。
ある一定の実施形態において、ベイトセットは、約１００ヌクレオチド～３００ヌクレ
オチド長のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。典型的には
、ベイトセットは、約１３０ヌクレオチド～２３０ヌクレオチドまたは約１５０～２００
ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。他の
実施形態において、ベイトセットは、約３００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド長の
オリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド中の標的メンバー特異的配列は、約
４０～１０００ヌクレオチド、約７０～３００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオ
チド長、典型的には約１２０～１７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、ベイトセットは結合実体を含む。結合実体は、各ベイト
配列上の親和性タグであり得る。いくつかの実施形態において、親和性タグはビオチン分
子またはハプテンである。ある一定の実施形態において、結合実体は、アビジン分子など
のパートナー、またはハプテンもしくはその抗原結合断片に結合する抗体に結合すること
によって、ハイブリダイゼーション混合物からベイト／メンバーハイブリッドを分離する
ことを可能にする。
他の実施形態において、ベイトセット中のオリゴヌクレオチドは、同じ標的メンバー配
列に対して順方向および逆方向相補配列を含有し、それによって逆相補的メンバー特異的
な配列を有するオリゴヌクレオチドは逆相補ユニバーサル尾部も保有する。これは、同じ
鎖である、すなわち互いに相補的でない、ＲＮＡ転写産物をもたらし得る。
他の実施形態において、ベイトセットは、１つ以上の位置に縮重または混合塩基を含有
するオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態において、ベイトセットは、単一種
の集団または生物の群集に存在する複数のまたは実質的に全ての既知の配列変異を含む。
一実施形態において、ベイトセットは、ヒト集団に存在する複数のまたは実質的に全ての
既知の配列変異を含む。
他の実施形態において、ベイトセットは、ｃＤＮＡ配列を含むか、またはｃＤＮＡ配列
に由来する。一実施形態において、ｃＤＮＡは、ＲＮＡ配列、例えば、腫瘍または癌細胞
由来のＲＮＡ、例えば腫瘍－ＦＦＰＥ試料、血液試料または骨髄穿刺試料から得られるＲ
ＮＡから調製される。他の実施形態において、ベイトセットは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ
またはクローン化ＤＮＡから増幅される増幅産物（例えばＰＣＲ産物）を含む。
他の実施形態において、ベイトセットはＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態におい
て、セットは、より安定でＲＮａｓｅ耐性であるものを含むが限定されない、化学的、酵
素的に修飾された、またはインビトロで転写されたＲＮＡ分子を含む。
さらに他の実施形態において、ベイトは、参照により本明細書中に組み込まれる、米国
特許出願公開第２０１０／００２９４９８およびＧｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９）Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（２）：１８２－１８９に記載の方法によって作製され
る。例えば、最初にマイクロアレイ上で合成された長い合成オリゴヌクレオチドのプール
を得て、ベイト配列を作製するためにオリゴヌクレオチドを増幅することによって、ビオ
チン化ＲＮＡベイトを作製し得る。いくつかの実施形態において、ベイトは、ベイト配列
の一方の末端でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加し、ＲＮＡポリメラーゼを用
いてＲＮＡ配列を合成することによって作製される。一実施形態において、合成オリゴデ
オキシヌクレオチドのライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．などの市販業者から入手し、公知の核酸増幅法を用いて増幅し得る。
したがって、上記のベイトセットを作製する方法が提供される。本方法は、１つ以上の
標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載のような１つ以上
の突然変異捕捉、参照または対照オリゴヌクレオチド配列）を選択すること；標的特異的
ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを得ること（例えばマイクロアレイ合成によって
、標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること）；および場合によ
ってはベイトセットを作製するためにオリゴヌクレオチドを増幅することを含む。
他の実施形態において、本方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを用いてオリゴヌ
クレオチドを（例えばＰＣＲによって）増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態
において、オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイに連結される各オリゴヌクレオチドの
末端にユニバーサル配列を含む。本方法は、オリゴヌクレオチドからユニバーサル配列を
除去することをさらに含み得る。このような方法はまた、オリゴヌクレオチドの相補鎖を
除去し、オリゴヌクレオチドをアニーリングし、オリゴヌクレオチドを伸長させることも
含み得る。これらの実施形態の一部において、オリゴヌクレオチドを（例えばＰＣＲによ
って）増幅するための方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを使用する。いくつかの
実施形態において、本方法は増幅されたオリゴヌクレオチドのサイズ選択を行うことをさ
らに含む。
一実施形態において、ＲＮＡベイトセットが作製される。本方法は、本明細書中に記載
の方法に従い、ベイト配列のセットを作製し、ベイト配列の一方の末端でＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーター配列を付加し、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ配列を合成すること
を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラー
ゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼから選択され得る。他の実施形態において、ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーター配列は、ベイト配列を（例えばＰＣＲにより）増幅することによ
ってベイト配列の末端で付加される。ベイト配列が、ゲノムまたはｃＤＮＡからの特異的
なプライマー対を用いてＰＣＲによって増幅される実施形態において、ＲＮＡプロモータ
ー配列を各対の２つの特異的プライマーの一方の５’末端に付加することにより、標準的
な方法を用いて、ＲＮＡベイトに転写し得るＰＣＲ産物が得られる。
他の実施形態において、ベイトセットは、ヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試
料を鋳型として使用して作製し得る。このような実施形態において、オリゴヌクレオチド
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。他の実施形態において、増幅
されたオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅またはハイパーブランチド・ロー
リングサークル増幅によって再増幅される。ヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試
料を鋳型として使用してベイト配列を作製するためにも、同じ方法を使用し得る。制限消
化、パルスフィールドゲル電気泳動、フローソーティング、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離、
選択的動的再会合（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
）、染色体調製物の顕微解剖および当業者にとって公知の他の分画化方法を含むが限定さ
れない他の方法によって得られたゲノムの細分画を用いて、ベイト配列を作製するために
も、同じ方法を使用し得る。
ある一定の実施形態において、ベイトセット中のベイト数は１，０００未満、例えば２
、３、４、５、１０、５０、１００、５００ベイトである。他の実施形態において、ベイ
トセット中のベイト数は、１，０００を超えるか、５，０００を超えるか、１０，０００
を超えるか、２０，０００を超えるか、５０，０００を超えるか、１００，０００を超え
るか、または５００，０００を超える。
ある一定の実施形態において、ライブラリ（例えば核酸ライブラリ）は、メンバーの集
合を含む。本明細書中に記載の場合、ライブラリメンバーは、標的メンバー（例えば、腫
瘍メンバー、参照メンバーおよび／または対照メンバー；本明細書中でそれぞれ第１、第
２および／または第３のメンバーとも呼ばれる。）を含み得る。ライブラリのメンバーは
、単一個体由来であり得る。一実施形態において、ライブラリは、複数の対象（例えば、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、またはそれ以上の対象）からのメ
ンバーを含み得、例えば、複数の対象からのメンバーを有するライブラリを形成させるた
めに、異なる対象からの２つ以上のライブラリを組み合わせ得る。一実施形態において、
対象は、癌または腫瘍を有するか、または有するリスクがあるヒトである。
本明細書で用いられる場合、「メンバー」または「ライブラリメンバー」または他の同
様の用語は、ライブラリのメンバーである核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
典型的には、メンバーはＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。メンバ
ーは、せん断されたゲノムＤＮＡであり得る。他の実施形態において、メンバーはｃＤＮ
Ａであり得る。他の実施形態において、メンバーはＲＮＡであり得る。メンバーは、対象
からの配列を含み、対象に由来しない配列、例えば同定を可能にする、プライマーまたは
配列、例えば「バーコード」配列も含み得る。
さらに別の実施形態において、本発明において特徴となる方法は、ライブラリ（例えば
、本明細書中に記載のような核酸ライブラリ）を提供するために核酸試料を単離すること
をさらに含む。ある一定の実施形態において、核酸試料は、全ゲノム、サブゲノム断片ま
たはその両方を含む。全ゲノムまたはサブゲノム断片からライブラリを単離および調製す
るためのプロトコールは当技術分野で公知である（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのゲノムＤ
ＮＡ試料調製キット）。ある一定の実施形態において、対象の試料（例えば、腫瘍試料、
正常隣接組織（ＮＡＴ）、血液試料または何らかの正常な対照）から、ゲノムまたはサブ
ゲノムＤＮＡ断片を単離する。一実施形態において、試料（例えば腫瘍またはＮＡＴ試料
）は保存物である。例えば、試料は、マトリックス、例えば、ＦＦＰＥブロックまたは凍
結試料中で包埋される。ある一定の実施形態において、単離段階は、個々の染色体のフロ
ーソーティング；および／または対象の試料（例えば、腫瘍試料、ＮＡＴ、血液試料）を
顕微解剖することを含む。ある一定の実施形態において、核酸ライブラリを作製するため
に使用される核酸試料は、５マイクログラム未満、１マイクログラム未満、または５００
ｎｇ未満（例えば２００ｎｇ以下）である。
さらに他の実施形態において、ライブラリを作製するために使用される核酸試料は、Ｒ
ＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは全細胞
ＲＮＡを含む。他の実施形態において、ある種の大量のＲＮＡ配列（例えばリボソームＲ
ＮＡ）が枯渇している。いくつかの実施形態において、全ＲＮＡ調製物中のポリ（Ａ）尾
部付きｍＲＮＡ分画が濃縮されている。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ラン
ダムプライムｃＤＮＡ合成法によって作製される。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成
は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドで開始させることによって成熟ｍＲＮＡのポ
リ（Ａ）尾部で惹起される。欠失、ポリ（Ａ）濃縮およびｃＤＮＡ合成のための方法は、
当業者にとって周知である。
本方法は、当業者にとって周知である特異的または非特異的核酸増幅法によって核酸試
料を増幅することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態、ある一定の実施形態において、核酸試料は、例えばランダムプラ
イム鎖置換増幅などの全ゲノム増幅法によって増幅される。
他の実施形態において、物理的または酵素的方法により核酸試料を断片化またはせん断
し、合成アダプターに連結させ、（例えば分取ゲル電気泳動により）サイズ選択し、（例
えばＰＣＲにより）増幅させる。他の実施形態において、ハイブリッド選択の前に明確な
サイズ選択または増幅なしに、核酸の断片化およびアダプター連結群を使用する。
他の実施形態において、単離ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）を断片化またはせん断する
。いくつかの実施形態において、ライブラリは、例えば、他の手段によって細分画化され
た、ゲノムの縮小版または定められた部分であるゲノムＤＮＡの細分画など、ゲノムＤＮ
Ａの５０％未満を含む。他の実施形態において、ライブラリは、全てまたは実質的に全て
のゲノムＤＮＡを含む。
ある一定の実施形態において、ライブラリのメンバーは、遺伝子内領域または遺伝子間
領域を含むサブゲノム区間を含む。別の実施形態において、サブゲノム区間は、エクソン
またはイントロン、またはその断片、典型的にはエクソン配列またはその断片を含む。一
実施形態において、サブゲノム区間は、コード領域または非コード領域、例えばプロモー
ター、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、または３’非翻訳領域（３’ＵＴ
Ｒ）またはその断片を含む。他の実施形態において、サブゲノム区間は、ｃＤＮＡまたは
その断片（例えば、腫瘍ＲＮＡ（例えば、腫瘍試料から抽出されたＲＮＡ、例えばＦＦＰ
Ｅ－腫瘍試料から抽出されたＲＮＡ）から得られるｃＤＮＡ）を含む。他の実施形態にお
いて、サブゲノム区間は、例えば本明細書中に記載のようなＳＮＰを含む。他の実施形態
において、標的メンバーは、ゲノム中の実質的に全てのエクソンを含む。他の実施形態に
おいて、標的メンバーは、本明細書中に記載のようなサブゲノム区間、例えば、関心のあ
る選択された遺伝子または遺伝子産物（例えば、本明細書中に記載のような癌性表現型と
関連がある遺伝子または遺伝子産物）からのサブゲノム区間、例えばエクソンを含む。
一実施形態において、サブゲノム区間は、体細胞突然変異、生殖細胞系列突然変異また
はその両方を含む。一実施形態において、サブゲノム区間は、変化、例えば、点または単
一突然変異、欠失突然変異（例えばインフレーム欠失、遺伝子内欠失、完全遺伝子欠失）
、挿入突然変異（例えば遺伝子内挿入）、逆位突然変異（例えば染色体内逆位）、連結突
然変異、連結挿入突然変異、逆方向重複突然変異、タンデム重複（例えば、染色体内タン
デム重複）、転座（例えば、染色体転座、非相反転座）、再編成（例えばゲノム再編成）
、遺伝子コピー数の変化またはそれらの組み合わせを含む。ある一定の実施形態において
、サブゲノム区間は、試料中の腫瘍細胞のゲノムのコード領域の５、１、０．５、０．１
％、０．０１％、０．００１％未満を構成する。他の実施形態において、サブゲノム区間
は、疾患に関与せず、例えば、本明細書中に記載のような癌性表現型と関連しない。
本発明の特色とされる方法は、核酸の選択されたサブグループ、例えばライブラリキャ
ッチを提供するために、１つまたは複数のライブラリ（例えば１つまたは複数の核酸ライ
ブラリ）を複数のベイトに接触させる段階を含む。一実施形態において、接触段階は、固
体支持体、例えばアレイにおいて行われる。ハイブリダイゼーションに対する適した固体
支持体は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ら（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４
（１１）：９０３－５；Ｈｏｄｇｅｓ、Ｅ．ら（２００７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９（
１２）：１５２２－７；Ｏｋｏｕ，Ｄ．Ｔ．ら（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４
（１１）：９０７－９に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる
。他の実施形態において、接触段階は溶液ハイブリダイゼーションにおいて行われる。あ
る一定の実施形態において、本方法は、１回以上のさらなるハイブリダイゼーションによ
ってハイブリダイゼーション段階を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態において、
本方法は、同じまたは異なるベイト収集物を用いた１回以上のさらなるハイブリダイゼー
ションにライブラリキャッチを供することをさらに含む。
他の実施形態において、本発明の特色とされる方法は、（例えばＰＣＲによって）ライ
ブラリキャッチを増幅することをさらに含む。他の実施形態において、ライブラリキャッ
チを増幅しない。
さらに他の実施形態において、本方法は、ライブラリキャッチを分析することをさらに
含む。一実施形態において、ライブラリキャッチは、配列決定方法、例えば、本明細書中
に記載のような次世代配列決定方法によって分析される。本方法は、溶液ハイブリダイゼ
ーションによってライブラリキャッチを単離し、核酸配列決定にそのライブラリキャッチ
を供することを含む。ある一定の実施形態において、ライブラリキャッチを再配列決定し
得る。次世代配列決定方法は当技術分野で公知であり、例えばＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２
０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：３１－４
６に記載されている。
さらに他の実施形態において、本方法は、ライブラリキャッチを遺伝子型判定に供し、
それによって選択された核酸の遺伝子型を同定する段階をさらに含む。
ある一定の実施形態において、本方法は次のうち１つ以上をさらに含む：
ｉ）核酸試料のフィンガープリントを行うこと；
ｉｉ）核酸試料中の遺伝子または遺伝子産物（例えば本明細書中に記載のような遺伝子
または遺伝子産物）の存在量を定量すること（例えば試料中の転写産物の相対的存在量を
定量すること）；
ｉｉｉ）核酸試料を特定の対象（例えば、正常対照または癌患者）に属するものとして
同定すること；
ｉｖ）核酸試料中の遺伝的形質（例えば１つ以上の対象の遺伝的性質（例えば、民族性
、人種、家族の特徴））を同定すること；
ｖ）核酸試料中の倍数性を決定すること；核酸試料中のヘテロ接合性の喪失を判定する
こと；
ｖｉ）核酸試料中の遺伝子重複事象の有無を判定すること；
ｖｉｉ）核酸試料中の遺伝子増幅事象の有無を判定すること；または
ｖｉｉｉ）核酸試料中の腫瘍／正常細胞混合のレベルを決定すること。
本明細書中に記載の方法の何れも、以下の実施形態の１つ以上と組み合わせ得る。
一実施形態において、本方法は、腫瘍および／または対照核酸試料（例えばＦＦＰＥ由
来核酸試料または血液試料もしくは骨髄穿刺試料由来の核酸試料）から得られたヌクレオ
チド配列リードを得ることを含む。
一実施形態において、リードは、次世代配列決定方法によって提供される。
一実施形態において、本方法は、核酸メンバーのライブラリを提供し、前記のライブラ
リの複数のメンバーから、予め選択されたサブゲノム区間を配列決定することを含む。実
施形態において、本方法は、配列決定のための前記のライブラリのサブセットを選択する
段階、例えば溶液ベースの選択、を含み得る。
ある一定の実施形態において、方法は、それぞれが異なるベイト設計ストラテジーを有
する２つ以上の異なる標的カテゴリを捕捉するように設計されるハイブリッド捕捉方法を
含む。ハイブリッド捕捉方法および組成物は、標的配列の定められたサブセット（例えば
標的メンバー）を捕捉し、そのサブセットの外側のカバレッジを最小限にしながら、標的
配列の均質なカバレッジを提供することを目的としている。一実施形態において、標的配
列は、ゲノムＤＮＡからのエクソン全体またはその選択されたサブセットを含む。本明細
書で開示される方法および組成物は、複雑な標的核酸配列（例えばライブラリ）に対する
異なるデプスおよびカバレッジのパターンを達成するための異なるベイトセットを提供す
る。
ある一定の実施形態において、ベイトセットおよび標的の異なるカテゴリは次のとおり
である。
Ａ．低頻度で出現する突然変異に対して高レベルの感度を可能にするために最大デプス
のカバレッジが必要とされる高レベルの標的（例えば１つ以上の腫瘍メンバーおよび／ま
たは参照メンバー、例えば遺伝子、エクソンまたは塩基など）を選択する第１のベイトセ
ット。例えば、約５％以下の頻度で出現する点突然変異の検出（すなわち、試料を調製し
た細胞の５％が、そのゲノム中にこの突然変異を有する）。第１のベイトセットは通常、
高い検出信頼性を確保するために、約５００Ｘ以上の配列決定デプスを必要とする。一実
施形態において、第１のベイトセットは、ある一定のタイプの癌において頻繁に突然変異
が起こっている１つ以上のサブゲノム区間（例えばエクソン）、例えば表１～４による遺
伝子または遺伝子産物を選択する。
Ｂ．高レベル標的より高い頻度で、例えば約１０％の頻度で出現する突然変異に対して
高レベルの感度を可能にするために高いカバレッジが必要とされる中レベルの標的標的（
例えば１つ以上の腫瘍メンバーおよび／または参照メンバー、例えば遺伝子、エクソンま
たは塩基など）を選択する第２のベイトセット。例えば、１０％の頻度で出現する変化（
例えば点突然変異）の検出は、高い検出信頼性を確保するために約２００Ｘ以上の配列決
定デプスを必要とする。一実施形態において、第２のベイトセットは、表１～４による遺
伝子または遺伝子産物から選択される１つ以上のサブゲノム区間（例えばエクソン）を選
択する。
Ｃ．高レベルの感度を可能にするために、例えばヘテロ接合性の対立遺伝子を検出する
ために、低－中程度のカバレッジが必要とされる、低レベルの標的を選択する第３のベイ
トセット（例えば１つ以上のＰＧｘメンバー、例えば遺伝子、エクソンまたは塩基など）
。例えば、ヘテロ接合性の対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために１０～
１００Ｘの配列決定デプスを必要とする。一実施形態において、第３のベイトセットは、
ａ）患者が様々な薬物を代謝する能力を説明し得る薬理ゲノミクスＳＮＰ、ｂ）患者を固
有に同定（フィンガープリント）するために使用され得るゲノムＳＮＰ、ｃ）ゲノムＤＮ
Ａのコピー数増加／減少およびヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）を評価するために使用され得
るゲノムＳＮＰ／遺伝子座から選択される１つ以上のサブゲノム区間（例えばエクソン）
を選択する。
Ｄ．ゲノム転座またはインデルなどの構造的限界点を検出するために、低－中程度のカ
バレッジが必要とされるイントロン標的（例えばイントロンメンバー）を選択する第４の
ベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために５
～５０Ｘの配列対スパニングデプスを必要とする。前記の第４のベイトセットは、例えば
、転座／インデルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
Ｅ．コピー数の変化を検出する能力を向上させるために小さいカバレッジが必要とされ
るイントロン標的（例えばイントロンメンバー）を選択する第５のベイトセット。例えば
、いくつかの末端エクソンの１コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために０
．１～１０Ｘのカバレッジを必要とする。前記の第５のベイトセットは、例えば、増幅／
欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
本発明の特色とされる方法および組成物は、各ベイトセット／標的カテゴリの相対的な
配列カバレッジを調整することを含む。ベイト設計における相対的な配列カバレッジの相
違を実現するための方法は、次のうち１つ以上を含む：
（ｉ）異なるベイトセットの差次的な表示－相対的な標的カバレッジのデプスを増強／
低下させるために、所与の標的（例えば標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設
計は、より多くの／より少ないコピー数に含まれ得る；
（ｉｉ）ベイトセットの差次的な重複（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｖｅｒｌａｐ）
－相対的な標的カバレッジのデプスを増強／低下させるために、所与の標的（例えば標的
メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、近隣ベイト間のより長いかまたはより
短い重複を含み得る；
（ｉｉｉ）差次的ベイトパラメータ－捕捉効率を低下させ、相対的な標的カバレッジの
デプスを低下させるために、所与の標的（例えば標的メンバー）を捕捉するためのベイト
セット設計は、配列修飾／長さがより短いことを含み得る；
（ｉｖ）異なるベイトセットの混合－相対標的カバレッジのデプスを増強／低下させる
ために、異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比率で
混合し得る；
（ｖ）異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットの使用－ある一定の実施形態に
おいて、ベイトセットは次のものを含み得る：
（ａ）１つ以上の化学的に（例えば、非酵素的に）合成された（例えば個別に合成され
た）ベイト、
（ｂ）アレイにおいて合成された１つ以上のベイト、
（ｃ）１つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の何らかの組み合わせ、
（ｅ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば天然または非天然のＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド）、
（ｆ）１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば天然または非天然のＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド）、
（ｇ）（ｅ）および（ｆ）の組み合わせ、または
（ｈ）上記の何れかの組み合わせ。
異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせは、様々な比、例えば、１：１、１：２、１：
３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０；１：１００、１：１０００などか
ら選択される比率で混合され得る。一実施形態において、化学合成されたベイトとアレイ
生成ベイトとの比率は、１：５、１：１０または１：２０から選択される。ＤＮＡまたは
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。ある一定の実施形態におい
て、ベイトは、例えば融解温度を上昇させるために１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む
。代表的な非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが
挙げられる。代表的な修飾ＲＮＡヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり、ＬＮ
Ａヌクレオチドのリボース部分は２’酸素および４’炭素を連結する余分な架橋で修飾さ
れている（Ｋａｕｒ，Ｈ；Ａｒｏｒａ，Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ；Ｍａｉｔｉ，Ｓ；Ａｒｏ
ｒａ，Ａ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｍａｉｔｉ，Ｓ．（２００６）．「Ｔｈｅｒｍｏｄｙ
ｎａｍｉｃ，Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ」．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７－５５）。他の修飾された代表的なＤＮＡおよ
びＲＮＡヌクレオチドとしては、ペプチド結合によって連結される反復Ｎ－（２－アミノ
エチル）－グリシン単位から構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５（６４４６）：５６６－８）；低ＧＣ領域を捕捉する
ように修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）または
架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン；および２，６－ジアミノプ
リンが挙げられるが、限定されない。他の修飾ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは当技術
分野で公知である。
ある一定の実施形態において、標的配列（例えば標的メンバー）の実質的に均一または
均質なカバレッジが得られる。例えば、各ベイトセット／標的カテゴリ内で、ベイトパラ
メータを修飾することによって、例えば次のうち１つ以上によって、カバレッジの均一性
を最適化し得る：
（ｉ）同じカテゴリ中の他の標的に対して過小／過剰にカバーされる標的（例えば標的
メンバー）のカバレッジを拡大／縮小させるために、ベイト表示または重複を増加／減少
させることを使用し得る；
（ｉｉ）低カバレッジのために、標的配列（例えば高ＧＣ含量配列）を捕捉することが
困難である場合、例えば隣接配列（例えばＧＣリッチ度がより低い隣接配列）をカバーす
るようにベイトセットで標的化される領域を拡大する；
（ｉｉｉ）ベイトの二次構造を減少させ、その選択効率を高めるために、ベイト配列の
修飾をなし得る；
（ｉｖ）同じカテゴリ内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション速度を等しくす
るために、ベイトの長さの変更を使用し得る。（長さが様々なベイトを作製することによ
って）直接、または（一貫した長さのベイトを作製し、ベイト末端を任意の配列で置き換
えることによって）間接的にベイト長を変更し得る；
（ｖ）同じ標的領域（すなわちフォワードおよびリバース鎖）に対して異なる向きのベ
イトを修飾することで、結合効率が異なり得る。各標的に対して最適のカバレッジを提供
する何れかの方向性を有するベイトセットを選択し得る；
（ｖｉ）各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ（例えばビオチン）の量を変
更することは、その結合効率に影響を及ぼし得る。相対標的カバレッジを拡大／縮小させ
るために、特定の標的を標的とするベイトのタグレベルを増加／減少させることを使用し
得る；
（ｖｉｉ）標的への結合親和性に影響を及ぼし、相対標的カバレッジを拡大／縮小させ
るために、異なるベイトに対して使用されるヌクレオチドのタイプを変更し得る；または
（ｖｉｉｉ）高ＧＣ含量に対して低いまたは通常のＧＣ含量の領域間での融解ハイブリ
ダイゼーション速度を等しくするために、修飾オリゴヌクレオチドベイトを用いること、
例えばより安定な塩基対形成を有することを使用し得る。
例えば、異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットを使用し得る。
一実施形態において、選択効率についての値は、予め選択された標的領域を包含するた
めに異なるタイプのベイトオリゴヌクレオチドを使用することによって修正される。例え
ば、大きな標的領域（例えば１～２ＭＢの全標的領域）をカバーするために、第１のベイ
トセット（例えば１０，０００～５０，０００のＲＮＡまたはＤＮＡベイトを含むアレイ
に基づくベイトセット）を使用し得る。予め選択された標的領域（例えば、標的領域の関
心のある全域、例えば２５０ｋｂ以下の選択されたサブゲノム区間）をカバーするために
、第２のベイトセット（例えば５，０００個未満のベイトを含む個別に合成されたＲＮＡ
またはＤＮＡベイトセット）および／またはより高い二次構造、例えばより高いＧＣ含量
の領域を第１のベイトセットに添加し得る。関心のある選択されたサブゲノム区間、は、
本明細書中に記載の遺伝子もしくは遺伝子産物またはその断片のうち１つ以上に対応し得
る。第２のベイトセットは、所望のベイト重複に応じて、約２，０００～５，０００ベイ
トを含み得る。さらに他の実施形態において、第２のベイトセットは、第１のベイトに添
加される選択されたオリゴベイト（例えば、４００、２００、１００、５０、４０、３０
、２０、１０個未満のベイト）を含み得る。第２のベイトセットは、個々のオリゴベイト
のあらゆる比率で混合され得る。例えば、第２のベイトセットは、１：１の等モル比とし
て存在する個々のベイトを含み得る。あるいは、第２のベイトセットは、例えば、ある一
定の標的（例えば、ある一定の標的は、他の標的と比較して５～１０Ｘの第２のベイトを
有し得る。）の捕捉を最適化するために、異なる比率（例えば、１：５、１：１０、１：
２０）で存在する個々のベイトを含み得る。
配列決定
本発明はまた、核酸を配列決定する方法も含む。これらの方法において、核酸ライブラ
リメンバーは、例えば、溶液ハイブリダイゼーションを用いて本明細書中に記載の方法を
使用することによって単離され、それによりライブラリキャッチを提供する。ライブラリ
キャッチまたはそのサブグループの配列決定を行い得る。したがって、本発明の特色とさ
れる方法は、ライブラリキャッチを分析することをさらに含む。一実施形態において、ラ
イブラリキャッチは、配列決定方法、例えば、本明細書中に記載のような次世代配列決定
方法によって分析される。本方法は、溶液ハイブリダイゼーションによってライブラリキ
ャッチを単離し、核酸配列決定にそのライブラリキャッチを供することを含む。ある一定
の実施形態において、ライブラリキャッチを再配列決定し得る。
当技術分野で公知の何らかの配列決定方法を使用し得る。選択方法によって単離された
核酸の配列決定は、一般的には、次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いて行われる。本明細書
中での使用に適切な配列決定方法は、例えば、国際公開第２０１２／０９２４２６号パン
フレットに記載のように、当技術分野で記載される。
ＮＧＳリードが作製された後、それらは既知の参照配列とアライメントされ得るか、ま
たは新規にアセンブリされ得る。例えば、ＮＧＳリードを参照配列（例えば野生型配列）
とアライメントすることによって、試料（例えば腫瘍試料）中の一塩基多型および構造変
異体などの遺伝子変異の同定を達成し得る。ＮＧＳに対する配列アライメントの方法は、
例えばＴｒａｐｎｅｌｌ Ｃ．およびＳａｌｚｂｅｒｇ Ｓ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ．，２００９，２７：４５５－４５７に記載されている。デノボアセンブリの例
は、例えば、Ｗａｒｒｅｎ Ｒ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，２３：
５００－５０１；Ｂｕｔｌｅｒ Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８
１０－８２０；およびＺｅｒｂｉｎｏ Ｄ．Ｒ．およびＢｉｒｎｅｙ Ｅ．，Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８２１－８２９に記載されている。配列アライメントま
たはアセンブリは、１つ以上のＮＧＳプラットフォームからのリードデータを使用して、
例えば、Ｒｏｃｈｅ／４５４およびＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａリードデータを混合
して、行い得る。
アライメント
アライメントとは、リードをある位置、例えばゲノムの位置と適合させる工程である。
ミスアライメント（例えば、ゲノム中の正しくない位置での短いリードからの塩基対の配
置）、例えば、実際の癌突然変異の周辺のリードの配列状況（例えば反復配列の存在）に
よるミスアライメントは、代替対立遺伝子のリードが、代替対立遺伝子リードの主な集積
を回避し得るので、突然変異検出の感度低下につながり得る。実際の突然変異が存在しな
い場合に問題のある配列状況が生じる場合、ミスアライメントは、参照ゲノム塩基の実際
のリードを誤った位置に配置することにより、「突然変異が起こる」対立遺伝子のアーチ
ファクトのリードを導入し得る。増加した多重遺伝子分析のための突然変異呼び出しアル
ゴリズムは、存在量が少ない突然変異に対しても高感度であるべきなので、これらのミス
アライメントは偽陽性発見率を増加させ／特異性を減少させ得る。
本明細書で論じられるように、実際の突然変異に対する感度の低下は、分析されている
遺伝子における予想される突然変異部位の周囲のアライメントの質を（手作業でまたは自
動化方式で）評価することによって対処し得る。評価しようとする部位は、癌突然変異の
データベース（例えばＣＯＳＭＩＣ）から得ることができる。問題があると特定される領
域は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントなどのより遅いがより正確な
アライメントアルゴリズムを用いたアライメント最適化（または再アライメント）によっ
て、関連する配列状況においてより良好な性能を与えるように選択されたアルゴリズムを
使用して修正され得る。一般的なアライメントアルゴリズムが問題を修正することができ
ない場合、例えば、置換を含有する可能性が高い遺伝子に対する極大差ミスマッチペナル
ティパラメータの調整；ある一定の腫瘍タイプで共通する特定の突然変異タイプ（例えば
黒色腫におけるＣ→Ｔ）に基づいて特定のミスマッチペナルティパラメータを調整するこ
と；またはある一定の試料タイプで共通する特定の突然変異タイプに基づく特定のミスマ
ッチペナルティパラメータ（例えば、ＦＦＰＥで共通する置換）を調整することによって
、カスタマイズされたアライメントアプローチを作成し得る。
ミスアライメントによる評価遺伝子領域における特異性低下（偽陽性率の増加）は、配
列決定された試料中の全ての突然変異呼び出しの手動または自動検査によって評価し得る
。ミスアライメントのために偽の突然変異呼び出しを起こし易いことが分かった領域に対
して上記と同じアライメント修正を行い得る。可能なアルゴリズム修正が見つからない場
合、問題領域からの「突然変異」を試験パネルから分類または選別して排除し得る。
本明細書中で開示される方法によって、再編成、例えばインデルが関連するサブゲノム
区間の配列決定において、特に、例えば腫瘍試料からの、多数の多様な遺伝子における多
数の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法において、性能を最適化する
ための複数の個別に調整されたアライメント方法またはアルゴリズムの使用が可能になり
得る。実施形態において、リードを分析するために、異なる遺伝子における多数の再編成
のそれぞれに対して個別にカスタマイズまたは調整される複数のアライメント方法を使用
する。実施形態において、調整は、（１つ以上の）配列決定されている遺伝子（または他
のサブゲノム区間）の機能、試料中の腫瘍タイプ、配列決定されている変異体または試料
もしくは対象の特徴であり得る。配列決定しようとする多数のサブゲノム区間に対して微
調整されるアライメント条件のこの選択または使用によって、速度、感度および特異性の
最適化が可能になる。本方法は、比較的多数の多様なサブゲノム区間に対するリードのア
ライメントが最適化される場合に特に有効である。実施形態において、本方法は、再編成
に最適化されたアライメント方法および、再編成に関連しないサブゲノム区間に対して最
適化された他の方法の使用を含む。
したがって、一実施形態において、本明細書中に記載の方法、例えば腫瘍試料を分析す
る方法は、本明細書中に記載の再編成のためのアライメント方法を含む。
一般的に、インデル突然変異の正確な検出は、本明細書中では無効である配列決定プラ
ットフォーム上の偽のインデル率が比較的低いので、アライメントにおける演習である（
したがって、正しくアライメントされたインデルの僅かな観察でさえ、突然変異の強力な
証拠となり得る。）。しかし、インデルの存在下での正確なアライメントは困難であり得
る（特にインデル長が長くなる場合）。例えば置換の、アライメントに関連する一般的な
問題に加えて、インデル自体がアライメントに問題を引き起こし得る。（例えば、ジヌク
レオチド反復の２ｂｐの欠失は、容易かつ断定的に判別し得ない。）。より短い（＜１５
ｂｐ）明らかなインデル含有リードの誤った配置によって、感度および特異性の両方が低
下し得る。より大きいインデル（個々のリードの長さ－発明者らの工程では３６ｂｐ－に
より近付く。）によって、リードを全くアライメントすることができなくなり、標準的な
一連のアライメントリードにおいてインデルの検出が不可能になる。
これらの問題に対処し、性能を改善するために、癌突然変異のデータベースを使用し得
る。偽陽性インデル発見を減少させるために（特異性改善）、一般的に予想されるインデ
ル周辺の領域を配列状況に起因する問題のあるアライメントについて調べ、上記の置換と
同様に扱い得る。インデル検出の感度を向上させるために、癌で予想されるインデルにお
ける情報を使用するいくつかの異なるアプローチを使用し得る。例えば、予想されるイン
デルを含有した短いリードを模擬実験し、アライメントを試み得る。アライメントを試験
し得、問題のあるインデル領域は、例えば、ギャップオープン／伸長ペナルティを低下さ
せることによって、または部分的なリード（例えば、リードの前半または後半）をアライ
メントすることによって、アライメントパラメータを調整し得る。
あるいは、正常な参照ゲノムだけでなく、既知または可能性のある癌インデル突然変異
のそれぞれを含有するゲノムの代替バージョンでも最初のアライメントを試み得る。この
アプローチにおいて、最初にアライメントできなかったかまたはアライメントが不正確で
あったインデルのリードが、ゲノムの代替（突然変異）バージョンにおいて首尾よく配置
される。
このようにして、インデルのアライメント（したがって呼び出し）を、予想される癌遺
伝子／部位に対して最適化し得る。本明細書中で使用される場合、配列アライメントアル
ゴリズムは、リード配列と参照配列との間の類似性を評価することによって、リード配列
（例えば次世代配列決定からの、例えば短いリード配列）がゲノム中のどこから由来する
可能性が最も高いかを同定するために使用される計算方法またはアプローチを具体化する
。配列アライメントの問題に対して、様々なアルゴリズムを適用し得る。いくつかのアル
ゴリズムは比較的遅いが、比較的高い特異性を可能にする。これらには、例えばダイナミ
ックプログラミングに基づくアルゴリズム（ａｌｇｒｉｔｈｍｓ）が含まれる。ダイナミ
ックプログラミングは、問題をより単純な段階に分解することによって複雑な問題を解決
するための方法である。他のアプローチは比較的より効率的であるが、一般的にはあまり
完璧なものではない。これらは、例えば、発見的アルゴリズムおよび大規模データベース
検索のために設計された確率的方法を含む。
アライメントパラメータは、アルゴリズムの性能を調整するために、例えば、リード配
列と参照配列との間で最適な網羅的または局所的アライメントを生成させるために、アラ
イメントアルゴリズムにおいて使用される。アライメントパラメータは、マッチ、ミスマ
ッチおよびインデルに対して重みを与え得る。例えば、重みが低いほど、多くのミスマッ
チおよびインデルとのアライメントが可能になる。
配列状況、例えば反復配列（例えば、タンデムリピート、散在反復）、低複雑性領域、
インデル、偽遺伝子またはパラログの存在は、アライメント特異性に影響を及ぼし得る（
例えばミスアライメントを引き起こす）。本明細書で使用される場合、ミスアライメント
とは、ゲノム中の不正確な位置での短いリードからの塩基対の配置を指す。
アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが腫瘍タ
イプ、例えば特定の突然変異または突然変異タイプを有する傾向のある腫瘍タイプに基づ
いて調整される場合、アライメントの感度を向上させ得る。
アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが特定の
遺伝子タイプ（例えば癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子）に基づいて調整される場合、アライメ
ントの感度を向上させ得る。癌関連遺伝子の異なるタイプにおける突然変異は、癌表現型
に対して異なる影響を有し得る。例えば、突然変異癌遺伝子対立遺伝子が一般的に優性で
ある。突然変異体腫瘍抑制対立遺伝子は、一般的に劣性であり、これは、殆どの場合、影
響が現れる前に、腫瘍抑制遺伝子の両方の対立遺伝子に波及されなければならないことを
意味する。
アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが突然変
異タイプ（例えば一塩基多型、インデル（挿入または欠失）、逆位、転座、タンデムリピ
ート）に基づいて調整される場合、アライメントの感度を調整し（例えば向上させ）得る
。
アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが突然変
異部位（例えば突然変異ホットスポット）に基づいて調整される場合、アライメントの感
度を調整し（例えば向上させ）得る。突然変異ホットスポットは、突然変異が通常の突然
変異率よりも１００倍頻繁に生じるゲノム中の部位を指す。
アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが試料タ
イプ（例えばＦＦＰＥ試料）に基づいて調整される場合、アライメントの感度／特異性を
調整し（例えば向上させ）得る。
アライメントアルゴリズムは、試料タイプ（例えば、ＦＦＰＥ試料、血液試料または骨
髄穿刺試料）に基づいて、アライメント感度／特異性を調整する（例えば増加させる）よ
うに選択し得る。
アライメントの最適化は、例えば、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレット
に記載のように、当技術分野で記載されている。
突然変異呼び出し
塩基呼び出しとは配列決定装置の生の結果を指す。突然変異呼び出しは、配列決定され
ているヌクレオチド位置についてヌクレオチド値、例えばＡ、Ｇ、ＴまたはＣを選択する
工程を指す。典型的には、ある位置に対する配列決定リード（または塩基呼び出し）は、
複数の値を提供し、例えば一部のリードはＴを与え、一部はＧを与える。突然変異呼び出
しは、ヌクレオチド値、例えばこれらの値のうち１つを配列に割り当てる工程である。こ
れは「突然変異」呼び出しと呼ばれるが、何らかのヌクレオチド位置、例えば突然変異体
対立遺伝子、野生型対立遺伝子、突然変異体または野生型の何れとも特徴付けられていな
い対立遺伝子に対応する位置に、または可変性を特徴としない位置に、ヌクレオチド値を
割り当てるためにこれを適用し得る。突然変異呼び出しのための方法は、次のうち１つ以
上を含み得る：参照配列における各位置での情報に基づいて独立呼び出しを生成すること
（例えば配列リードを調べること；塩基呼び出しおよび品質スコアを調べること；可能性
のある遺伝子型を考慮し、観察される塩基および品質スコアの確率を計算すること；およ
び（例えばベイズ規則を使用して）遺伝子型を割り当てること）；偽陽性を除去すること
（例えば、リードデプスが予想よりもかなり低いかまたは高いＳＮＰを拒絶するためにデ
プス閾値を使用すること；小さなインデルに起因する偽陽性を除去するための局所的な再
アライメント）；および呼び出しを改良するための連鎖不均衡（ＬＤ）／インピュテーシ
ョンに基づく分析を行うこと。
特異的な遺伝子型および位置に関連する遺伝子型尤度を計算するための式は、例えば、
Ｌｉ Ｈ．およびＤｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０；２６（
５）：５８９－９５に記載されている。ある一定の癌タイプにおける特定の突然変異に対
する事前予想は、その癌タイプからの試料を評価する際に使用し得る。このような尤度は
、癌突然変異の公開データベース、例えばＣａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ），ＨＧＭＤ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ），Ｔｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＢＩＣ）およ
びＢｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢＣＧＤ）由来であり得
る。
ＬＤ／インピュテーションに基づく分析の例は、例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ Ｂ．Ｌ．
およびＹｕ Ｚ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９，８５（６）：８４７－６１
に記載されている。低カバレッジＳＮＰ呼び出し方法の例は、例えば、Ｌｉ Ｙ．ら、Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９，１０：３８７－４
０６に記載されている。
アライメントの後、呼び出し方法、例えば、ベイジアン突然変異呼び出し法を使用して
置換の検出を行い得；これはサブゲノム区間のそれぞれ、例えば評価しようとする遺伝子
のエクソンにおける各塩基に適用され、代替的対立遺伝子の存在が観察される。この方法
は、塩基呼び出しエラーのみの存在下でリードデータを観察する確率と、突然変異の存在
下でリードデータを観察する確率を比較する。この比較が突然変異の存在を十分に強く支
持する場合、突然変異が呼び出され得る。
癌ＤＮＡの分析のための５０％または１００％の頻度からの限定的な逸脱に対処する方
法が開発されている（例えば、ＳＮＶＭｉｘ－Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０
Ｍａｒｃｈ １５；２６（６）：７３０－７３６）。しかし、本明細書中で開示される
方法によって、試料ＤＮＡの１％～１００％の全範囲で、特に５０％未満のレベルで突然
変異対立遺伝子の存在の可能性を考慮することができるようになる。このアプローチは、
天然（多クローン性）腫瘍ＤＮＡの低純度ＦＦＰＥ試料における突然変異の検出に特に重
要である。
ベイジアン突然変異検出アプローチの利点は、突然変異の存在の確率と、塩基呼び出し
エラーのみの確率との比較を、その部位での突然変異の存在の事前予想によって重み付け
し得ることである。所与の癌タイプに対する頻繁に突然変異が起こる部位で代替対立遺伝
子のいくつかのリードが観察される場合、突然変異の証拠の量が通常の閾値を満たさなく
ても、突然変異の存在が確信的に呼び出され得る。次いで、より希少な突然変異／より低
い純度の試料に対してさえも検出感度を向上させるために、または、リードカバレッジを
縮小させるためにその試験をよりロバストなものにするために、この柔軟性を使用し得る
。癌で突然変異が起こっているゲノム中の無作為な塩基対の尤度は約１ｅ－６である。典
型的な多重遺伝子癌ゲノムパネルにおける多くの部位での特異的な突然変異の尤度は、数
桁高いものであり得る。これらの尤度は、癌突然変異の公開データベース（例えばＣＯＳ
ＭＩＣ）由来であり得る。インデル呼び出しは、挿入または削除によって参照配列と異な
る配列決定データにおいて塩基を探す工程であり、通常、関連する信頼スコアまたは統計
学的証拠の計量を含む。
インデル呼び出しの方法は、候補インデルを同定し、局所再アライメントを通じて遺伝
子型尤度を計算し、ＬＤに基づく遺伝子型推測および呼び出しを行う段階を含み得る。典
型的には、可能性のあるインデル候補を得るために、ベイジアン法を使用し、次にこれら
の候補をベイジアンフレームワークにおいて参照配列と一緒に試験する。
候補インデルを生成させるためのアルゴリズムは、例えば、ＭｃＫｅｎｎａ Ａ．ら、
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０；２０（９）：１２９７－３０３；Ｙｅ Ｋ．ら、Ｂｉ
ｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９；２５（２１）：２８６５－７１；Ｌｕｎｔｅｒ
Ｇ．およびＧｏｏｄｓｏｎ Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０，印刷物に先行して電
子版で公開；Ｌｉ Ｈ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９，Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ ２５（１６）：２０７８－９に記載されている。
インデル呼び出しおよび個々のレベルの遺伝子型尤度を生成させるための方法には、例
えば、Ｄｉｎｄｅｌアルゴリズム（Ａｌｂｅｒｓ Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．
２０１１；２１（６）：９６１－７３）が含まれる。例えば、リードを分析し、最初のイ
ンデル呼び出しを生成させ、各候補インデルに対して遺伝子型尤度を生成させるためにベ
イジアンＥＭアルゴリズムを使用し得、続いて、例えばＱＣＡＬＬ（Ｌｅ Ｓ．Ｑ．およ
びＤｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１；２１（６）：９５２－６０）を
用いて遺伝子型のインピュテーションを行う。パラメータ、例えばインデルを観察すると
いう事前予想などは、インデルの大きさまたは場所に基づいて調整し得る（例えば、増加
または減少させ得る。）。
突然変異呼び出しの最適化は、例えば、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレ
ットに記載のように、当技術分野で記載されている。
他の実施形態
本明細書中に記載の方法の実施形態において、本方法における下流の段階またはパラメ
ータを修正するために、本方法における段階またはパラメータを使用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の単離；ライブラリ構築；ベイトの設計ま
たは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異呼び出
し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーションのうち１つ以上または全
てにおいて下流の段階またはパラメータを修正するために、腫瘍試料の特徴を使用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の単離；ライブラリ構築；ベイトの設計ま
たは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異呼び出
し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーションのうち１つ以上または全
てにおいて下流の段階またはパラメータを変更するために、単離した腫瘍または対照、核
酸の特徴を使用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の再単離；続くライブラリ構築；ベイトの
設計または選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異
呼び出し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーションのうち１つ以上ま
たは全てにおいて下流の段階またはパラメータを修正するために、ライブラリの特徴を使
用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の再単離；続くライブラリ構築；ベイトの
設計または選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異
呼び出し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーションのうち１つ以上ま
たは全てにおいて下流の段階またはパラメータを修正するために、ライブラリ－キャッチ
の特徴を使用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の再単離；続くライブラリ構築；ベイトの
設計または選択；ハイブリダイゼーション条件の続く決定；続く配列決定；リードマッピ
ング；突然変異呼び出し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーションの
うち１つ以上または全てにおいて下流の段階またはパラメータを修正するために、配列決
定方法の特徴を使用する。
一実施形態において、前記の試料からの核酸の再単離；続くライブラリ構築；ベイトの
設計または選択；ハイブリダイゼーション条件の続く決定；続く配列決定；続くリードマ
ッピング；突然変異呼び出し方法の選択；突然変異呼び出しまたは突然変異アノテーショ
ンのうち１つ以上または全てにおいて下流の段階またはパラメータを修正するために、マ
ッピングしたリードの収集物の特徴を使用する。
一実施形態において、本方法は、腫瘍試料の特徴についての値を得ること、例えば、前
記の試料中の腫瘍細胞の割合についての、前記の腫瘍試料の細胞性についての；または腫
瘍試料の画像からの値を得ることを含む。
実施形態において、本方法は、腫瘍試料の特徴に対する前記の得られた値に応答して、
腫瘍試料からの核酸の単離、ライブラリ構築；ベイト設計または選択；ベイト／ライブラ
リメンバーハイブリダイゼーション；配列決定；または突然変異呼び出しに対してパラメ
ータを選択することを含む。
一実施形態において、方法は、前記の腫瘍試料中に存在する腫瘍組織の量についての値
を得て、前記の得られた値を参照基準と比較し、前記の参照基準が満たされる場合に、前
記の腫瘍試料を許容し、例えば前記の腫瘍試料が３０、４０または５０％を超える腫瘍細
胞を含有する場合に前記の腫瘍試料を許容することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、例えば、前記の腫瘍試料からの、参照基準に合わない腫
瘍試料からの腫瘍組織をマクロダイセクションすることによって、腫瘍細胞に対して濃縮
されたサブ試料を得ることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、一次対照、例えば血液試料が利用可能であるか否かを判
定し、もしそうであれば、前記の一次対照から対照核酸（例えばＤＮＡ）を単離すること
をさらに含む。
一実施形態において、方法は、前記の腫瘍試料中にＮＡＴが存在するか否かを判定する
こと（例えば利用可能な一次対照試料がない場合）をさらに含む。
一実施形態において、方法は、例えば、一次対照がない腫瘍試料中の前記のＮＡＴから
の非腫瘍組織をマクロダイセクションすることによって、非腫瘍細胞に対して濃縮された
サブ試料を得ることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、利用可能な一次対照およびＮＡＴがないことを判定し、
合致する対照なしで分析について前記の腫瘍試料をマーキングすることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、単離腫瘍核酸試料を提供するために前記の腫瘍試料から
核酸を単離することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、単離対照核酸試料を提供するために対照から核酸を単離
することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、検出可能な核酸がない試料を拒絶することをさらに含む
。
一実施形態において、方法は、前記の単離核酸試料中での核酸収率についての値を得て
、得られた値を参照基準と比較することをさらに含み、例えば、前記の得られた値が前記
の参照基準未満である場合、ライブラリ構築前に前記の単離核酸試料を増幅することを含
む。
一実施形態において、方法は、前記の単離核酸試料中の核酸断片の大きさについての値
を得ることおよび得られた値を参照基準、例えば少なくとも３００、６００または９００
ｂｐの大きさ、例えば平均の大きさと比較することをさらに含む。この決定に反応して、
本明細書中に記載のパラメータを調整または選択し得る。
一実施形態において、方法は、ライブラリを得ることをさらに含み、ここで前記の核酸
断片の大きさは、参照値未満であるかまたはこれと等しく、前記のライブラリは、ＤＮＡ
単離とライブラリ作製との間の断片化段階なく作製される。
一実施形態において、方法は、核酸断片を得ることをさらに含み、前記の核酸断片の大
きさが参照値と等しいかまたはこれより大きい場合、それを断片化して、次いでライブラ
リにする。
一実施形態において、方法は、例えば複数のメンバーのそれぞれに識別可能な別個の核
酸配列（バーコード）を付加することによって、複数のライブラリメンバーのそれぞれに
標識することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、複数のライブラリメンバーのそれぞれにプライマーを付
着させることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、複数のベイトを提供することおよび複数のベイトを選択
することをさらに含み、前記の選択は、次のものに反応するものである：１）患者の特徴
、例えば年齢、腫瘍のステージ、以前の処置または耐性；２）腫瘍タイプ；３）腫瘍試料
の特徴；４）対照試料の特徴；５）対照の存在またはタイプ；６）単離腫瘍（または対照
）核酸試料の特徴；７）ライブラリの特徴；８）腫瘍試料中の腫瘍のタイプと関連するこ
とが知られる突然変異；９）腫瘍試料中の腫瘍のタイプと関連することが知られていない
突然変異；１０）予め選択された配列の配列を決定する（またはそれとハイブリッド形成
するかまたはそれを回収する）または予め選択された突然変異、例えば高ｇｃ領域または
再編成がある配列と関連する難しさを同定する能力、；または１１）配列決定されている
遺伝子。
一実施形態において、方法は、例えば前記の腫瘍試料中の少数の腫瘍細胞の判定に対応
して、ベイトまたは複数のベイトを選択し、第２の遺伝子のメンバーと比較した場合、第
１の遺伝子からのメンバーの捕捉を比較的高く効率的にすることをさらに含み、例えば第
１の遺伝子における突然変異は腫瘍試料の腫瘍タイプに対する腫瘍表現型と関連する。
一実施形態において、方法は、ライブラリ－キャッチの特徴についての値、例えば核酸
濃度または表示を得ることおよび得られた値を核酸濃度に対するかまたは表示に対する参
照基準と比較することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、手直しに対する参照基準を満たさないライブラリの特徴
についての値を有するライブラリを選択することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、ライブラリ定量化に対する参照基準を満たすライブラリ
の特徴についての値を有するライブラリを選択することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、対象に対する腫瘍タイプ、遺伝子および遺伝子変化（Ｔ
ＧＡ）の関連付けを提供することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、複数の要素を有する予め選択されたデータベースを提供
することをさらに含み、各要素はＴＧＡを含む。
一実施形態において、方法は、
予め選択されたデータベース、例えば検証されたＴＧＡのデータベースにおいて前記の
ＴＧＡが存在するか否かを判定し；
前記の対象からの前記ＴＧＡ（アノテーションすること）と予め選択されたデータベー
スからのＴＧＡに対する情報を結合させ；
前記の予め選択されたデータベースにおいて前記の対象に対する第２または次のＴＧＡ
が存在するか否かを判定してもよく、そうである場合、予め選択されたデータベースから
の第２または次のＴＧＡに対する情報を前記の患者に存在する前記の第２のＴＧＡと関連
させること
を含む、対象のＴＧＡの特徴を調べることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、レポートを作成するために対象のＴＧＡの有無、および
場合によっては関連するアノテーションを提出（ｍｅｍｏｒｉａｌｉｚｉｎｇ）すること
をさらに含む。
一実施形態において、方法は、受領者側に前記のレポートを送付することをさらに含む
。
一実施形態において、方法は、
予め選択されたデータベース、例えば検証されたＴＧＡのデータベースにおいて前記の
ＴＧＡが存在するか否かを判定し；
前記の予め選択されたデータベースにないＴＧＡが既知の臨床的に関連するＧまたはＡ
を有することを判定し、そうである場合、前記の予め選択されたデータベースにおいて前
記のＴＧＡに対するエントリーを提供する
ことを含む、対象のＴＧＡの特徴を調べることをさらに含む。
一実施形態において、方法は、レポートを作成するために対象からの腫瘍試料のＤＮＡ
で見られる突然変異の有無を提出（ｍｅｍｏｒｉａｌｉｚｉｎｇ）することをさらに含む
。
一実施形態において、方法は、レポートを作成するために対象のＴＧＡの有無、および
場合によっては関連するアノテーションを提出（ｍｅｍｏｒｉａｌｉｚｉｎｇ）すること
をさらに含む。
一実施形態において、方法は、受領者側に前記のレポートを送付することをさらに含む
。
本開示はまた、次の付番された段落の何れかも含む：
１．対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間（また
はそれを含有する細胞）のクローンプロファイルを評価または提供する方法であって、
（ａ）各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または
血液悪性腫瘍（または前悪性腫瘍）試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラ
リを得て；
（ｂ）それぞれが前記対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部（本明細書で
はライブラリキャッチと呼ばれることがある。）を提供するために、前記ライブラリをベ
イトセットと接触させ；
（ｃ）例えば、前記対象区間の増幅配列を提供するために、前記複数の選択メンバーの
各メンバーを増幅してもよく；
（ｄ）前記対象区間の１回以上の出現の配列を得て；それによって前記対象区間のクロ
ーンプロファイルを提供または評価すること
を含む方法。
２．段階（ａ）が前記対象からの核酸を断片化する、例えばせん断することを含む、段
落１の方法。
３．段階（ｂ）が、溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイ
トセットと接触させることを含む、段落１または２の方法。
４．段階（ｂ）が、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを
前記ベイトセットと接触させることを含む、段落１または２の方法。
５．段階（ｂ）が、表面上の前記ベイトセット、例えば複数のベイトを含む基材上に配
置されたベイトセットと前記ライブラリを接触させる段階を含む、段落４の方法。
６．段階（ｃ）が、前記メンバー中の標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存す
るかまたはそれを含む方法によって、例えば、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合す
るプライマーを用いて、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、
前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む、段落１～５の何れかの方法
。
７．段階（ｃ）が、プライマー対を用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅
し、前記メンバー中の標的／対象核酸に前記プライマー対の少なくとも１つのメンバーが
結合しない、段落１～５の何れかの方法。
８．段階（ｃ）が、前記メンバー中の標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存し
ないか、またはそれを含まない方法によって前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅
すること含む、段落１～５の何れかの方法。
９．段階（ｃ）が、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマー対を用い
て前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバ
ーの各メンバーを増幅することを含む、段落１～５の何れかの方法。
１０．前記対象区間がサブゲノム区間を含む、段落１～９の何れかの方法。
１１．前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、段落１～９の何れかの方法。
１２．サブゲノム区間および発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価するこ
とを含む、段落１～１１の何れかの方法。
１３．前記対象区間での第１の対立遺伝子またはシグネチャー（例えば第１のＶセグメ
ント）の配列を比較値、例えば予め選択された値、例えば第２の対立遺伝子またはシグネ
チャー（例えば第２のＶセグメント）の配列の関数である値と比較することを含む、段落
１～１２の何れかの方法。
１４．（ｅ）（ｉ）対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現（
サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル）、存在量または同一性、例え
ば配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または対象区間での複数の配
列、シグネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値；または
（ｉｉ）可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部での
インデルの形成による、ＶＤ、ＤＪ、またはＶＪ連結、またはＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ
３から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であ
って、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の対象区間について存在する異
なる変異体の数の関数である値
を得ることをさらに含む、段落１～１３の何れかの方法。
１５．（ｉ）が、前記対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在
量に対する、前記対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在
量についての値を得ることを含む、段落１４の方法。
１６．（ｉ）が、第２の対象区間での第２の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存
在量に対する、前記対象区間での第１の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存
在量についての値を得ることを含む、段落１４の方法。
１７．（ｉ）が、発現サブゲノム区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例
えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることを含む、段落１４の
方法。
１８．対応するサブゲノム区間で、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編
成、例えば転座の出現またはレベル、についての値を得ることをさらに含む、段落１７の
方法。
１９．（ｉｉ）が、対象区間で生じる異なる配列、対立遺伝子またはシグネチャーの数
についての値を得ることを含む、段落１４の方法。
２０．（ｅ）（ｉ）を得ることを含む、段落１４の方法。
２１．シグネチャーに対して（ｅ）（ｉ）を得ることを含む、段落１４の方法。
２２．対立遺伝子に対して（ｅ）（ｉ）を得ることを含む、段落１４の方法。
２３．（ｅ）（ｉｉ）を得ることを含む、段落１４の方法。
２４．第１の対象区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えばＶセグメン
ト、またはＶＤＪもしくはＶＪ再編成のクローンプロファイル；および
ｉ）前記対象の表現型、例えば疾患状態；または
ｉｉ）第２の対象区間での遺伝子型、例えば表１～４もしくは表５Ａ～９またはＭＨＣ
遺伝子、例えばＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子から選択される遺伝子の遺
伝子型
を提供することを含む、段落１～２３の何れかの方法。
２５．前記表現型が、
感染因子、例えば、細菌、ウイルス、原生動物または真菌による感染；
疾患のステージ；
障害、例えば癌の遺伝子型の変化；
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における
変化、例えば癌の場合、転移の発現；
処置発現（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｓ）への反応性；
疾患または障害の進行、再燃、再発または持続；
疾患に関連する薬剤への事前の曝露；
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応；
対象からのプロテオミクスデータ；
年齢；
性別；
体重；
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置；または
環境的もしくは職業的要因
を含む、段落２４の方法。
２６．前記第２の対象区間での遺伝子型が、例えば表１～４または表５Ａ～９からの遺
伝子における、体細胞突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む、段落２４の方法。
２７．段階（ｄ）が：
（ｉ）前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Ｖセグメントを含
む対象区間の第１の出現および前記Ｖセグメントを含む区間の第２の出現の配列を得るこ
とを含み、前記第１および第２の出現が、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部での多様性によっ
て異なるか；または
（ｉｉ）前記対象区間および第２の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば前
記第１の対象区間が第１の遺伝子からの配列を含み、前記第２の対象区間が第２の遺伝子
からの配列を含む、
段落１～２６の何れかの方法。
２８．段階（ｄ）が、前記対象区間の複数の出現、例えば、ＶＤＪ配列を含む対象区間
の複数の出現、例えば、特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特定のＪセグメ
ントを含むＶＤＪ配列を含む対象区間の複数の出現、のそれぞれの配列を得ることを含む
、段落１～２７の何れかの方法。
２９．対象区間の複数の出現の第１の出現がサブゲノム区間を含む、段落２７または２
８の方法。
３０．前記対象区間の複数の出現の第２の出現がサブゲノム区間を含む、段落２９の方
法。
３１．前記対象区間の複数の出現の第１の出現が発現サブゲノム区間を含む、段落２７
または２８の方法。
３２．前記対象区間の複数の出現の第２の出現が発現サブゲノム区間を含む、段落３１
の方法。
３３．前記対象区間の複数の出現の第１の出現が、サブゲノム区間、例えば再編成、例
えば転座を含み；
前記対象区間の複数の出現の第２の出現が、発現サブゲノム区間、例えばそのサブゲノ
ム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これが例えば、ゲノム、例えば体細胞ゲノ
ムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその発現の相対的存在量
の評価を可能にする、段落２７または２８の方法。
３４．サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価するこ
とを含む、段落３３の方法。
３５．段階（ｄ）が、第１の対象区間および第２の異なる対象区間の配列を得ることを
含み、例えば、前記第１および第２の区間が、前記対象区間からの異なるゲノム配列、例
えば第１の遺伝子からの配列および第２の遺伝子からの配列に対応する、段落１～３４の
何れかの方法。
３６．前記第１の対象区間がＶＤＪセグメントの第１の組み合わせを含み、前記第２の
対象区間がＶＤＪセグメントの第２の組み合わせを含み、例えば前記第１の対象区間が第
１のＶセグメントを含み、前記の第２の対象区間が第２のＶセグメントを含む、段落３５
の方法。
３７．前記の第１の対象区間が第１のサブゲノム区間を含み、前記の第２の対象区間が
第２のサブゲノム区間を含む、段落３５の方法。
３８．前記第１の対象区間が第１の発現サブゲノム区間を含み、前記第２の対象区間が
第２の発現サブゲノム区間を含む、段落３５の方法。
３９．前記第１の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第２の対象区間が発現サブゲ
ノム区間を含む、段落３５の方法。
４０．評価することが、癌のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを
含む、段落１～３９の何れかの方法。
４１．評価することが、癌の第２のクローンに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落４０の方法。
４２．評価することが、例えば参照物に対する、例えば癌の前記第２のクローンの存在
量に対する、前記癌の第１クローンの存在量についての値を提供することを含む、段落４
１の方法。
４３．遺伝子型を含む癌の第１のクローンおよび第２の遺伝子型を含む第２のクローン
の相対的存在量を提供することを含む、段落４２の方法。
４４．第１の突然変異、例えば再編成を含む癌の第１のクローンおよび前記の突然変異
を含まない第２のクローンの相対的存在量を提供することを含む、段落４２の方法。
４５．第１の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む癌の第１のクローンおよび第
２の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む第２のクローンの相対的存在量を提供す
ることを含む、段落４２の方法。
４６．評価することが、第１のＶセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落１～４５の何れかの方法。
４７．評価することが、第２のＶセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落４６の方法。
４８．評価することが、第１のＶセグメントおよび第２のＶセグメントの相対的存在量
についての値を提供することを含む、段落４６の方法。
４９．評価することが、第１のＤセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落１～４８の何れかの方法。
５０．評価することが、第２のＤセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落４９の方法。
５１．評価することが、第１のＤセグメントおよび第２のＤセグメントの相対的存在量
についての値を提供することを含む、段落４９の方法。
５２．評価することが、第１のＪセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落１～５１の何れかの方法。
５３．評価することが、第２のＪセグメントに対するクローンプロファイルを提供する
ことを含む、段落５２の方法。
５４．評価することが、第１のＪセグメントおよび第２のＪセグメントの相対的存在量
についての値を提供することを含む、段落５２の方法。
５５．評価することが、第１のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対するクローンプロフ
ァイルを提供することを含む、段落１～５４の何れかの方法。
５６．評価することが、第２のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対するクローンプロフ
ァイルを提供することを含む、段落５５の方法。
５７．評価することが、第１のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせおよび第２のＶＤＪまた
はＶＪの組み合わせの相対的存在量についての値を提供することを含む、段落５５の方法
。
５８．評価することが、抗体軽鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む
、段落１～５７の何れかの方法。
５９．評価することが、抗体重鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む
、段落５８の方法。
６０．評価することが、抗体軽鎖および抗体重鎖の相対的存在量についての値を提供す
ることを含む、段落５８の方法。
６１．評価することが、サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャー
に対するクローンプロファイルを提供することを含む、段落１～６０の何れかの方法。
６２．評価することが、発現サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチ
ャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む、段落６１の方法。
６３．評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーにつ
いての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての
、相対的存在量に対する値を提供することを含む、段落６１の方法。
６４．評価することが、対象区間中の遺伝子座、例えばＶ、ＤまたはＪセグメントにお
ける高頻度変異に対する可変性を提供することを含む、段落１～６３の何れかの方法。
６５．評価することが、例えば対象区間でＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部にインデルを形
成することによって、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部から生じる可変性を提供することを含
む、段落１～６４の何れかの方法。
６６．評価することが、サブゲノム区間中のＣＤＲ、例えば重鎖ＣＤＲ３における可変
性を提供することを含む、段落１～６５の何れかの方法。
６７．評価することが、表１０からの配列（または前記配列を含む細胞）に対するクロ
ーンプロファイルを提供することを含む、段落１～６６の何れかの方法。
６８．（ｅ）（ｉ）についての値を得ることを含む、段落１４の方法。
６９．前記（ｅ）（ｉ）の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば第２の配列
、シグネチャーまたは対立遺伝子（例えば第２のＶセグメント）の存在量の関数である値
に対する、対象区間における配列、シグネチャーまたは対立遺伝子（例えば第１のＶセグ
メント）の存在量についての値を含む、段落６８の方法。
７０．前記（ｅ）（ｉ）の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば事象を欠く
配列、例えばある対象区間中の非突然変異または非再編成配列の存在量の関数である値に
対する、前記対象区間における事象、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例え
ば突然変異または再編成の存在量についての値を含む、段落６８の方法。
７１．前記（ｅ）（ｉ）の値が、対象区間でＸ個の固有の（すなわち互いに異なる）配
列、シグネチャーまたは対立遺伝子のそれぞれについての相対的存在量の値を含む、段落
６８の方法。
７２．Ｘが、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００ま
たは２００以上である、段落７１の方法。
７３．Ｘが１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，
０００，０００または５０，０００，０００以上である、段落７２の方法。
７４．例えば、存在量の関数、例えば相対的存在量として、例えばヒストグラムとして
、（ｅ）（ｉ）の値を表示することをさらに含む、段落６８～７３の何れかの方法。
７５．前記対象区間が、Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えばＴ細胞受容体またはＢ
細胞受容体からの配列を含む、段落６８～７４の何れかの方法。
７６．前記対象区間が、Ｖセグメント、ＤセグメントまたはＪセグメントからの配列を
含む、段落６８～７５の何れかの方法。
７７．前記対象区間が表１０からの配列を含む、段落６８～７６の何れかの方法。
７８．Ｖセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提
供することを含む、段落６８～７７の何れかの方法。
７９．複数のＶセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在
量を提供することを含む、段落６８～７８の何れかの方法。
８０．Ｊセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提
供することを含む、段落６８～７９の何れかの方法。
８１．複数のＪセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在
量を提供することを含む、段落６８～８０の何れかの方法。
８２．Ｄセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提
供することを含む、段落６８～８１の何れかの方法。
８３．複数のＤセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在
量を提供することを含む、段落６８～８２の何れかの方法。
８４．クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在
量を提供することを含む、段落６８～８３の何れかの方法。
８５．複数のクラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対
的存在量を提供することを含む、段落６８～８４の何れかの方法。
８６．（ｅ）（ｉｉ）についての値を得ることを含む、段落１４の方法。
８７．体細胞高頻度変異からの可変性についての値を得ることを含む、段落８６の方法
。
８８．例えば、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部でのインデルの形成によってＶＤ、ＤＪま
たはＶＪ連結部から生じる可変性についての値を得ることを含む、段落８６または８７の
方法。
８９．ＣＤＲの、例えば重鎖ＣＤＲ３の、可変性から生じる可変性についての値を得る
ことを含む、段落８６～８８の何れかの方法。
９０．前記対象区間が表１０からの配列を含む、段落８６～８９の何れかの方法。
９１．前記対象区間の複数の固有のコピー、例えば、前記対象区間での複数の固有のシ
グネチャー、の配列を得ることを含む、段落８６～９０の何れかの方法。
９２．前記（ｅ）（ｉｉ）における値が、前記対象区間に対する複数の、例えばＸ個の
シグネチャーにおける配列多様性についての値を含む、段落８６～９１の何れかの方法。
９３．前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの数を含む、段落８６～９
２の何れかの方法。
９４．前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの表示、記録または一覧を
含む、段落８６～９３の何れかの方法。
９５．前記値が、例えば、前記対象区間の全コピーの関数としての固有のコピーの数の
尺度を含む、段落８６～９４の何れかの方法。
９６．Ｘが、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、
２００、３００、４００または５００以上である、段落９２～９５の何れかの方法。
９７．Ｘが、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０
，０００，０００または５０，０００，０００以上である、段落９２～９６の何れかの方
法。
９８．前記複数のシグネチャーが全て、単一のＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対する
ものであり、例えば、選択されたＶＤＪまたはＶＪの組み合わせにおける配列多様性につ
いての値を提供する、段落８６～９７の何れかの方法。
９９．前記可変性が、セグメント連結、例えば、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部における
多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、段落８６～９８
の何れかの方法。
１００．前記可変性が、体細胞高頻度変異からの可変性を含む、段落８６～９９の何れ
かの方法。
１０１．前記複数のシグネチャーのそれぞれが、異なるＶＤＪまたはＶＪの組み合わせ
に対するものである、段落８６～１００の何れかの方法。
１０２．前記可変性が、セグメント連結、例えば、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部におけ
る多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、段落８６～１
０１の何れかの方法。
１０３．前記ライブラリが、Ｂ細胞、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む対象、例えばマン
トル細胞癌を含む対象、から作製される、段落８６～１０２の何れかの方法。
１０４．前記対象区間が、Ｂ細胞受容体からの、Ｖ、ＤもしくはＪセグメントまたはＶ
ＤもしくはＤＪ連結部をコードする配列を含む、段落８６～１０３の何れかの方法。
１０５．可変性、例えば体細胞高頻度変異、の量を比較値と比較することをさらに含み
、前記比較値との予め選択された関係、例えば前記比較値より大きいことが、疾患の、転
帰、予後またはステージを示す、段落８６～１０４の何れかの方法。
１０６．（ｅ）（ｉ）および（ｅ）（ｉｉ）を得ることを含む、段落１４～１０５の何
れかの方法。
１０７．前記ライブラリを単一のベイトセットと接触させることを含む、段落１～１０
６の何れかの方法。
１０８．前記ライブラリを複数のベイトセットと接触させることを含む、段落１～１０
６の何れかの方法。
１０９．前記対象区間での配列；
前記対象区間でのシグネチャー；または
前記対象区間での対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適
化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと、前記ライブラリを接
触させることを含む、段落１～１０８の何れかの方法。
１１０．前記対象区間での第２の配列；
前記対象区間での第２のシグネチャー；または
前記対象区間での第２の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適
化されている、またはそれとハイブリッド形成する、第２のベイトセットと前記ライブラ
リを接触させることを含む、段落１～１０９の方法。
１１１．複数の、例えば少なくともＸ個の固有のベイトセットと接触させる段階を含み
、前記複数のベイトセットのそれぞれが、
前記対象区間からの異なる配列；
前記対象区間での異なるシグネチャー；または
前記対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化
されている、またはそれとハイブリッド形成し、
Ｘが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００または２００と同等であ
る、
段落１～１０６の何れかの方法。
１１２．前記対象区間での第１の配列および第２の配列；
前記対象区間での第１のシグネチャーおよび第２のシグネチャー；または
前記対象区間での第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適
化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む
、段落１～１１１の何れかの方法。
１１３．前記対象区間からの少なくともＸ個の配列；
前記対象区間での少なくともＸ個のシグネチャー；または
前記対象区間での少なくともＸ個の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適
化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み
、
Ｘが、独立に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００または２００と
同等である、
段落１～１１２の何れかの方法。
１１４．前記対象もしくは試料中において対象区間で存在しない、第１の配列、対立遺
伝子またはシグネチャーを、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉す
る、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセット
と接触させることを含む、段落１～１１３の何れかの方法。
１１５．前記対象区間が表１０からの配列を含む、段落１～１１４の何れかの方法。
１１６．第１のＶ、ＤまたはＪセグメントからの配列および第２のＶ、ＤまたはＪセグ
メントからの配列を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕
捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触
させることを含む、段落１～１１５の何れかの方法。
１１７．前記対象区間が、Ｖ、ＤまたはＪセグメントの配列を含む、段落１～１１６の
何れかの方法。
１１８．Ｖセグメント（ＤまたはＪセグメントではない。）を捕捉するように最適化さ
れているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させ
ることを含む、段落１～１１７の何れかの方法。
１１９．Ｄセグメント（ＶまたはＪセグメントではない。）を捕捉するように最適化さ
れているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させ
ることを含む、段落１～１１７の何れかの方法。
１２０．Ｊセグメント（ＶまたはＤセグメントではない。）を捕捉するように最適化さ
れているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させ
ることを含む、段落１～１１７の何れかの方法。
１２１．Ｖセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド
形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１１７の何れ
かの方法。
１２２．Ｄセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド
形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１１７または
１２１の何れかの方法。
１２３．Ｊセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド
形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１１７、１２
１または１２２の何れかの方法。
１２４．ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部にまたがる（１つまたは複数の）ベイトを含むベ
イトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１１７または１２１～１
２３の何れかの方法。
１２５．再編成されたＶＤＪまたはＶＪ配列にまたがる（１つまたは複数の）ベイトを
含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１１７または１２
１～１２４の何れかの方法。
１２６．核酸類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または
二環式核酸（ＢＮＡ）を含む（１つまたは複数の）ベイトを含むベイトセットと前記ライ
ブラリを接触させることを含む、段落１～１２５の何れかの方法。
１２７．機能的であるために十分に長いが、親和性最適化に十分短い（１つまたは複数
の）ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落１～１２
６の何れかの方法。
１２８．前記対象区間がサブゲノム区間を含む、段落１～１２７の何れかの方法。
１２９．前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、段落１～１２７の何れかの方法。
１３０．サブゲノム区間の配列を得ることおよび発現サブゲノム区間の配列を得ること
を含む、段落１～１２７の何れかの方法。
１３１．サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、段落１～１３
０の何れかの方法。
１３２．発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、段落１～
１３０の何れかの方法。
１３３．サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することおよび発現サブゲノム
区間のクローンプロファイルを評価することを含む、段落１～１３０の何れかの方法。
１３４．サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価する
ことを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲ
ノム区間に存在する、段落１～１３３の何れかの方法。
１３５．サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価する
ことを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲ
ノム区間における存在量の関数である、段落１～１３４の何れかの方法。
１３６．評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーに
ついての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについて
の相対的存在量に対する値を提供することを含む、段落１～１３５の何れかの方法。
１３７．前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み；
段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの１つが、前記対象区間の第１の出現に対して
、および前記対象区間の第２の出現に対して個別に行われ、例えば段階（ａ）、（ｂ）お
よび（ｃ）のうち１つが、前記第１の出現に対して第１の反応混合物中で、および前記第
２の出現に対して第２の反応混合物中で行われる、段落１～１３６の何れかの方法。
１３８．（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）および（ｂ）；（
ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が個別に行
われる、段落１３７の方法。
１３９．前記対象区間の複数の固有のコピーの第１のコピーがサブゲノム区間を含む、
段落１３７または１３８の方法。
１４０．前記対象区間の複数の固有のコピーの第２のコピーが、サブゲノム区間、例え
ば前記サブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含む、段落１３７～１３９の何れ
かの方法。
１４１．前記複数のうち第１の出現がサブゲノム区間を含み、例えば前記サブゲノム区
間が、ＶＤＪ配列、例えば、特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特定のＪセ
グメントを含むＶＤＪ配列を含み；
前記複数のうち第２の出現が発現サブゲノム区間を含み、例えば前記発現サブゲノム区
間が、ＶＤＪ配列、例えば特定のＶセグメント、特定のＤセグメントおよび特定のＪセグ
メントを含むＶＤＪ配列を含む、段落１３７～１４０の何れかの方法。
１４２．前記対象区間の第１の出現が、発現サブゲノム区間を含む、段落１４１の方法
。
１４３．前記対象区間の第２の出現が、発現サブゲノム区間を含む、段落１４１または
１４２の方法。
１４４．前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み；
段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１つが、前記対象区間の第１の出
現に対して、および対象区間の第２の出現に対して同じ反応混合物中で行われる、段落１
～１３６の何れかの方法。
１４５．（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）および（ｂ）；（
ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の全て
が同じ反応混合物中で行われる、段落１４４の方法。
１４６．段階（ｂ）において、前記対象区間の複数の出現の第１のコピーを第１のベイ
トセットと接触させ、
段階（ｂ）において、前記対象区間の複数の出現の第２のコピーを第２のベイトセット
、例えば、前記第１のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む
第２のベイトセットと接触させる、
段落１３７～１４５の何れかの方法。
１４７．段階（ｂ）において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第１のコピーをベ
イトセットと接触させ；
段階（ｂ）において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第２のコピーを同じベイト
セットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ（１つまたは複数の）ベイトを含む
、
段落１３７～１４５の何れかの方法。
１４８．第１の対象区間および第２の異なる対象区間（異なるとは、異なる染色体位置
から、を意味する。）の配列を得ることを含み、
（１つまたは複数の）段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち１つが、前記第１の対象
区間に対して第１の反応混合物、および前記第２の対象区間に対して第２の反応混合物中
で行われる、
段落１～１４７の何れかの方法。
１４９．（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）および（ｂ）；（
ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の全て
が個別に行われる、段落１４８の方法。
１５０．前記第１の対象区間がサブゲノム区間を含む、段落１４８または１４９の方法
。
１５１．前記第２の異なる対象区間がサブゲノム区間を含む、段落１５０の方法。
１５２．前記第１の対象区間が発現サブゲノム区間を含む、段落１４８または１４９の
方法。
１５３．前記第２の異なる対象区間が発現サブゲノム区間を含む、段落１５２の方法。
１５４．前記第１の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第２の異なる対象区間が発
現サブゲノム区間を含む、段落１４８または１４９の方法。
１５５．前記対象区間および第２の異なる対象区間（異なるとは、異なる染色体位置か
ら、を意味する。）の配列を得ることを含み、
段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち少なくとも１つが、前記第１の対象区間に対し
ておよび第２の対象区間に対して同じ反応混合物中で行われる、段落１～１５４の何れか
の方法。
１５６．（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）および（ｂ）；（
ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の全て
が同じ反応混合物中で行われる、段落１５５の方法。
１５７．段階（ｂ）において、第１の対象区間を第１のベイトセットと接触させ；
段階（ｂ）において、第２の対象区間を第２のベイトセット、例えば、前記第１のベイ
トセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第２のベイトセットと接触
させる、段落１５５または１５６の方法。
１５８．段階（ｂ）において、第１の対象区間をベイトセットと接触させ；
段階（ｂ）において、第２の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベ
イトセットが（１つまたは複数の）同じベイトを含む、
段落１５５または１５６の方法。
１５９．段階（ａ）～（ｄ）を反復することを含む、段落１～１５８の何れかの方法。
１６０．予め選択された期間の経過；
障害、例えば癌の遺伝子型における変化；
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性または耐性の変化、例
えば癌の場合、転移の発現；
処置発現への反応性欠如；
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性
の後に、段階（ａ）～（ｄ）を反復することを含む、段落１５９の方法。
１６１．前記ライブラリが染色体ＤＮＡから作製される、段落１～１６０の何れかの方
法。
１６２．前記ライブラリがＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製される、段落１～１６０の
何れかの方法。
１６３．（ａ）染色体ＤＮＡから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクロー
ンプロファイルを評価すること；
（ｂ）ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間の
クローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の選択された配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否か
を判定するために、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落１～１６２の何れかの方法。
１６４．段階（ａ）およびまたは（ｂ）が、
（ｉ）前記対象区間での対立遺伝子の分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写コピ
ーの出現またはレベル）存在量または同一性、例えば、相対的存在量、対立遺伝子または
前記対象区間での複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値；または
（ｉｉ）前記対象区間でのシグネチャーの分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写
コピーの出現またはレベル）存在量または同一性、例えば、相対的存在量、シグネチャー
、または前記対象区間での複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値；
または
（ｉｉｉ）シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異について
の値
を得ることを含む、
段落１６３の方法。
１６５．段階（ａ）が（ｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉ）を含む；
段階（ａ）が（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉ）を含む；または
段階（ａ）が（ｉｉｉ）を含み、段階（ｂ）が（ｉｉｉ）を含む、段落１６４の方法。
１６６．前記ライブラリが、疾患状態組織から、例えば癌細胞から作製される、段落１
～１６５の何れかの方法。
１６７．前記ライブラリが、固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫瘍からの細胞
から作製される、段落１～１６５の何れかの方法。
１６８．前記ライブラリが、浸潤固形腫瘍、例えば本明細書中に記載の固形腫瘍を有す
る細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞から作製される、段落１～１６５の何れかの方法。
１６９．前記ライブラリが、血液悪性腫瘍、例えば、本明細書中に記載の血液悪性腫瘍
からの細胞から作製される、段落１～１６５の何れかの方法。
１７０．前記ライブラリが無細胞ＤＮＡから作製される、段落１～１６５の何れかの方
法。
１７１．前記ライブラリが非疾患状態の組織から作製される、段落１～１６５の何れか
の方法。
１７２．前記ライブラリが、末梢血、骨髄、腫瘍組織、腫瘍浸潤物、リンパ球、Ｂ細胞
、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞または無細胞ＤＮＡから作製される、段落１～１６５
の何れかの方法。
１７３．前記ライブラリが、腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤Ｂ細胞、プレＢ細胞、成熟
Ｂ細胞またはＴ細胞から作製される、段落１～１６５の何れかの方法。
１７４．前記ライブラリが、末梢Ｂ細胞、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞またはＴ細胞、例え
ばＣＤ４＋またはＣＤ８＋、Ｔ細胞から作製される、段落１～１６５の何れかの方法。
１７５．非疾患状態組織、例えば腫瘍を付随しない細胞、例えば非腫瘍細胞、または末
梢血リンパ球に対するクローンプロファイルを評価することを含む、段落１～１６５の何
れかの方法。
１７６．疾患状態組織、例えば腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞、または非癌性障害に対す
るクローンプロファイルを評価することを含む、段落１～１６５の何れかの方法。
１７７．前記ライブラリがＴ細胞から作製され、前記サブゲノム区間がＴ細胞受容体、
例えばアルファ／ベータまたはデルタ／ガンマ、ＴＣＲ鎖をコードする配列を含む、段落
１～１６５の何れかの方法。
１７８．（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば、前記第１の細胞タイプから作製され
る、例えば、前記第１の細胞タイプからの染色体ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡか
ら作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば、前記第２の細胞タイプから作製される、例え
ば、前記第２の細胞タイプからの染色体ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡから作製さ
れたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落１～１７７の何れかの方法。
１７９．（ａ）第１の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価するこ
と；
（ｂ）第２の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること；およ
び
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落１～１７８の何れかの方法。
１８０．（ａ）染色体ＤＮＡから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロ
ファイルを評価すること；
（ｂ）ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばｃＤＮＡから作製されたライブラリからの対象
区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落１～１７９の何れかの方法。
１８１．（ａ）第１の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
（ｂ）第２の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために
、段階（ａ）および（ｂ）で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落１～１８０の何れかの方法。
１８２．前記第１の期間が予め選択された事象の前であり、第２の期間が予め選択され
た事象の後であり、前記予め選択された事象が、感染、医学的または外科的手順、例えば
移植を受けること、診断または処置、例えば第１選択の処置もしくは第二選択の処置の投
与、再発または再燃または疾患を含み得る、段落１８１の方法。
１８３．疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーの
クローンプロファイルを評価すること；および
第２の疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのク
ローンプロファイルを評価すること
を含む、段落１～１８２の何れかの方法。
１８４．疾患状態細胞からの第１の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチ
ャーのクローンプロファイルを評価すること；および
疾患状態細胞からの第２の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャ
ーのクローンプロファイルを評価すること
を含む、段落１～１８３の何れかの方法。
１８５．前記対象が癌を有する、段落１～１８４の何れかの方法。
１８６．前記対象が血液癌を有する、段落１～１８４の何れかの方法。
１８７．前記対象が固形腫瘍を有する、段落１～１８４の何れかの方法。
１８８．前記ライブラリがＢ細胞から作製され、前記対象がＢ細胞悪性腫瘍、例えばマ
ントル細胞癌を有する、段落１～１８７の何れかの方法。
１８９．前記対象が癌以外の障害を有する、段落１～１８４の何れかの方法。
１９０．前記対象が、免疫障害、例えば自己免疫障害、免疫不全、例えば遺伝性または
後天性免疫不全、例えばＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染を有する、段落１～１８４の何れかの
方法。
１９１．前記対象が、移植片レシピエント、例えば、骨髄レシピエント、実質臓器レシ
ピエントまたは皮膚移植片レシピエントである、段落１～１８４の何れかの方法。
１９２．前記対象が、感染または感染性疾患、例えば、ウイルス性、細菌性、原生動物
性または真菌性の感染もしくは疾患を有する、段落１～１８４の何れかの方法。
１９３．前記対象区間が、クローン事象を代表する、ヌクレオチド位置または連結部ま
たは配列を含む、段落１～１９２の何れかの方法。
１９４．前記対象区間が、Ｔ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを代表する、ヌクレオ
チド位置または連結部または配列を含む、段落１～１９３の何れかの方法。
１９５．段階（ｃ）または前記方法が、メンバー中の標的／対象核酸との配列特異的相
互作用に依存する方法によって、例えば、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合するプ
ライマーを用いて、前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のも
のの各メンバーまたは何れかのメンバーを増幅することを含まない、段落１～１９４の何
れかの方法。
１９６．段階（ｄ）が、
前記ライブラリからのメンバー（またはライブラリキャッチ）からの対象区間に対する
リードを得て；
複数のメンバーのそれぞれについて、前記対象区間内のヌクレオチド位置に対する前記
リードからヌクレオチド値を割り当てること
を含む、段落１～１９５の何れかの方法。
１９７．前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の５’または３’末端に
アダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、段落１～１９６の何れかの方
法。
１９８．前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の５’および３’末端に
アダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、段落１～１９６の何れかの方
法。
１９９．前記複数のメンバーの各メンバーが、５’から３’方向に、５’アダプター配
列、対象配列（例えば、ゲノムまたは転写配列）および３’アダプターを含む、段落１～
１９６の何れかの方法。
２００．前記複数のメンバーの各メンバーが、５’から３’方向に、５’アダプター配
列、対象配列（例えば、ゲノムまたは転写配列）および３’アダプターを含み、前記アダ
プターのうち１つが、識別子、例えばバーコードとして機能し得る配列を含む、段落１～
１９６の何れかの方法。
２０１．前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーで
増幅される、段落１～２００の何れかの方法。
２０２．前記複数のものの各メンバーが、前記５’アダプターに結合するプライマーま
たは前記３’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅され
る、段落１～２０１の何れかの方法。
２０３．前記複数のものの各メンバーが、前記５’アダプターに結合するプライマーを
含むプライマーセットを用いて増幅される、段落１～２０２の何れかの方法。
２０４．前記複数のものの各メンバーが、前記３’アダプターに結合するプライマーを
含むプライマーセットを用いて増幅される、段落１～２０２の何れかの方法。
２０５．前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーお
よび前記メンバーにおける標的／対象核酸に特異的なプライマーを用いて増幅される、段
落１～２００の何れかの方法。
２０６．段階（ｄ）が、
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば
前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対す
るリードを得て；
アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記リードを
アライメントし；
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる
（例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び
出す）ことを含む、段落１～２０５の何れかの方法。
２０７．第２の対象区間、例えば表１～４または表５Ａ～９から選択される、例えば本
明細書中に記載の遺伝子からの配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、
段落１～２０６の何れかの方法。
２０８．第２の対象区間、例えばｍｉＲＮＡ、プロモーターまたは他の要素をコードす
る配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、段落１～２０７の何れかの方
法。
２０９．免疫グロブリンまたはＴ細胞またはＢ細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのも
のである第２の対象区間の配列を提供することをさらに含む、段落１～２０８の何れかの
方法。
２１０．例えば表１～４または表５Ａ～９から選択される、第３の、または少なくとも
Ｘ個のさらなる対象区間の配列を提供することを含み、Ｘが４、５、６、７、８、９、１
０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５
００と等しい、段落２０７～２０９の何れかの方法。
２１１．前記第３の、またはＸ個のさらなる対象区間が、免疫グロブリン、Ｂ細胞受容
体またはＴ細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである、段落２１０の方法。
２１２．Ｘが、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０
、３００、３５０、４００、４５０または５００以上である、段落２１１の方法。
２１３．（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば前記第１の細胞タイプ、例えば非癌細
胞または非悪性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例え
ば表１０から選択される第１の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば前記第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪
性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される第２の対象区間
の配列を提供すること
を含む、段落１～２１２の何れかの方法。
２１４．（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば前記第１の細胞タイプ、例えば非癌細
胞または非悪性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例え
ば表１０から選択される第１の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば前記第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪
性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される、第２、第３ま
たは少なくともＸ個のさらなる対象区間の配列を提供すること（Ｘは、４、５、６、７、
８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５
０または５００に等しい。）
を含む、段落１～２１２の何れかの方法。
２１５．（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば前記第１の細胞タイプ、例えば非癌細
胞または非悪性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例え
ば表１０から選択される、第１の、第２の、または少なくともＸ個のさらなる対象区間の
クローンプロファイルを評価し（Ｘは、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１０
０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００に等しい。
）；
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば前記第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪
性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表１～９から選択される、（Ｘ＋１）
番目の対象区間の配列を提供すること
を含む、段落１～２１２の何れかの方法。
２１６．（ａ）第１の細胞タイプからの、例えば前記第１の細胞タイプ、例えば非癌細
胞または非悪性細胞（例えば腫瘍浸潤リンパ球）から作製されたライブラリからの、例え
ば表１０から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５
０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、また
はそれ以上）の対象区間のクローンプロファイルを評価すること；および
（ｂ）第２の細胞タイプからの、例えば前記第２の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪
性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表１～９から選択される１つ以上（例え
ば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、
３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上）の対象区間の配列を提供す
ること
を含む、段落１～２１２の何れかの方法。
２１７．前記第１の細胞タイプまたは前記第１の細胞タイプから作製されたライブラリ
が、前記第２の細胞タイプまたは前記第２の細胞タイプから作製されたライブラリが得ら
れる試料と同じ試料から得られる、段落２１３～２１６の何れかの方法。
２１８．前記第１の細胞タイプまたは前記第１の細胞タイプから作製されたライブラリ
が、前記第２の細胞タイプまたは前記第２の細胞タイプから作製されたライブラリが得ら
れる試料とは異なる試料から得られる、段落２１３～２１６の何れかの方法。
２１９．（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラ
リ、例えば段落１に記載のライブラリを得て；
（ｂ）それぞれが前記第２の（または続く）対象区間を含む複数の選択メンバーまたは
その一部（本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例
えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセット
と接触させ；
（ｃ）例えば前記メンバー中での標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない
方法によって、例えば、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用い
て前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを
増幅し；
（ｄ）対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、前記第２の（または続く）対象区間の配列を提供することを含む、段落２０７
～２１８の何れかの方法。
２２０．段階（ｄ）が、
（ｄ）（ｉ）例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メン
バー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノ
ム区間に対するリードを得て；
（ｄ）（ｉｉ）アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によっ
て前記リードをアライメントし；
（ｄ）（ｉｉｉ）予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチ
ド値を割り当てる（例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて、例えば
突然変異を呼び出す）こと
を含む、段落２１９の方法。
２２１．例えば、染色体腕の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７
０、８０もしくは９０％または全てを含む、全腕または大きな再編成、例えば再編成、例
えば転座、複製、挿入または欠失の出現について対象を評価する方法であって；
（ａ）各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て
；
（ｂ）それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部（本明細書中でラ
イブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼー
ションの条件下で前記ライブラリをベイトセットと接触させ；
（ｃ）例えば前記メンバー中での標的／対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない
方法によって、例えば、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用い
て前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを
増幅し；
（ｄ）全腕または大きな再編成の決定を可能にすることなどのために、染色体上に配置
される複数の対象区間の配列を得ること
を含む方法。
２２２．前記大きな再編成が、例えば染色体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３
０％、４０％もしくは５０％、または染色体の腕（例えば長腕または短腕）の少なくとも
約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％も
しくは１００％に影響を及ぼす、段落２２１の方法。
２２３．対象を評価する方法であって、
（ａ）各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料から
の複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て；
（ｂ）それぞれが対象区間を含む複数の選択されたメンバーまたはその一部（本明細書
中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。）を提供するために、例えば溶液ハイブリダ
イゼーションの条件下で、このライブラリをベイトセットと接触させ；
（ｃ）例えば前記メンバー中での標的／対象核酸との配列特異的な相互作用に依存しな
い方法によって、例えば、前記メンバー中の標的／対象核酸に結合しないプライマーを用
いて前記複数の選択されたメンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選
択されたメンバーの各メンバーを増幅し；
（ｄ）サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て
それによって対象を評価すること
を含み；
（ｉ）前記方法が、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイト
セットと前記ライブラリを接触させることを含み；
（ｉｉ）前記方法が、サブゲノム区間を提供する第１のベイトセットおよび発現サブゲ
ノム区間を提供する第２のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み；
（ｉｉｉ）前記ライブラリがゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセ
ットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと
接触されるｃＤＮＡを含む第２のライブラリをさらに含み；
（ｉｖ）前記ライブラリがゲノムＤＮＡを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセッ
トと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するために第２のベイトセッ
トと接触させられるｃＤＮＡを含む第２のライブラリをさらに含み；
（ｖ）前記方法が、第１の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために第１の反
応混合物中で、および例えばこのサブゲノム区間に対応する、第２の対象区間、例えば発
現サブゲノム区間を提供するために、第２の反応混合液において、段階（ａ）、（ｂ）お
よび（ｃ）のうち１つを行うことを含む。
２２４．（１つまたは複数の）段階（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ａ）および（ｂ）；（
ａ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｃ）；または段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の全て
が個別に行われる、段落２２３の方法。
２２５．前記サブゲノム区間および発現サブゲノム区間が、独立して、表１～４から選
択される、段落２２３または２２４の方法。
２２６．少なくともＸ個の対象区間の配列を提供することを含み、Ｘが、２、３、４、
５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０
、４００、４５０、５００と等しいかまたはこれを超える、段落２２３～２２５の何れか
の方法。
２２７．前記サブゲノム区間および前記発現サブゲノム区間が、同じ対象区間に対応し
、例えば、同じ遺伝子からの配列を含む、段落２２３～２２６の何れかの方法。
腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態のフローチャート図を図１で提供す
る。
例証
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明を限定するものとし
て解釈すべきではない。本願を通して引用される全ての参考文献、図面、配列リスト、特
許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例１］腫瘍試料からの核酸単離
様々なタイプの試料、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、血液およ
び骨髄穿刺（ＢＭＡ）試料から核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を単離した。
例えば、ＦＦＰＥ試料からの単離ゲノムＤＮＡに対して、ボルテックスすることによっ
て、パラフィンブロックから切り出された３ｘ２０μｍ切片を４００μＬの緩衝液ＦＴＬ
と混合し、１．５ｍＬの遠心管中で９０℃にて１５分間温置した。温置に対して８８～９
２℃の範囲が許容可能であった。次に、試料を２０μＬのプロテイナーゼＫとともに５５
℃で６時間温置し、１０μＬのＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）とともに室温で５分間温置し
た。次に、４６０μＬの緩衝液ＢＬおよび５００μＬの無水エタノールを試料に添加した
。得られた試料溶液をその後の使用まで室温で維持した。
ＤＮＡ結合用のカラムを調製するために、１００μＬの平衡緩衝液をＭｉｃｒｏＥｌｕ
ｔｅカラムに添加し、カラムを１０，０００ｘｇで３０秒間遠心した。上記の７００μＬ
の試料溶液をＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに移し、カラムを１０，０００ｘｇで１分間遠
心した。流体がＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを完全に通過しなかった場合、遠心段階を反
復した。残りの試料溶液を上記と同じ方法でＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに適用した。次
いで、ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを５００μＬの緩衝液ＨＢで処理し、１０，０００ｘ
ｇで１分間遠心した。次に、エタノールで希釈した７００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液をＭｉ
ｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに添加し、カラムを１０，０００ｘｇで１分間遠心した。エタノ
ールで希釈した７００μＬのＤＮＡ洗浄緩衝液を用いてＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを再
び洗浄し、１０，０００ｘｇで１分間遠心し、カラムを乾燥させるために、＞１３，００
０ｘｇで３分間遠心した。上部を取り除いた標準的な１．５ｍＬ遠心管にＭｉｃｒｏＥｌ
ｕｔｅカラムを置いた。７０℃に予熱した５０～７５μＬの溶出緩衝液をカラムに添加し
、室温で３分間温置した。＞１３，０００ｘｇで１分間、回収チューブ中でカラムを遠心
した。７０℃に予熱したさらなる５０～７５μＬの溶出緩衝液をＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカ
ラムに添加し、室温で３分間温置した。＞１３，０００ｘｇで１分間、回収チューブ中で
カラムを再び遠心した。溶液全体を新しい１．５ｍＬ遠心管に移し、－２０℃で保存した
。
Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ，
Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ；Ｃａｔ．Ｎｏｓ．Ｄ３３９９－００，Ｄ３３９９－０１および
Ｄ３３９９－０２）において、ＦＴＬ緩衝液、プロテイナーゼＫ、ＢＬ緩衝液、平衡緩衝
液、ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラム、緩衝液ＨＢ、ＤＮＡ洗浄緩衝液および溶出緩衝液が提
供された。
ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織
から核酸（例えばＤＮＡ）を単離するためのさらなる方法は、例えばＣｒｏｎｉｎ Ｍ．
ら、（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６４（１）：３５－４２；Ｍａｓｕｄａ
Ｎ．ら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４４３６－４
４４３；Ｓｐｅｃｈｔ Ｋ．ら（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：４
１９－４２９，Ａｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．
ＡＭ１９７５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８），Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｆ
ＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉ
ｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３４９，Ｆｅｂ
ｒｕａｒｙ ２０１１）およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３７６２５，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２
００７）で開示されている。ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、高温でキシレンを使用して、パラフィン包
埋試料とグラスファイバーフィルターを溶解させて核酸を捕捉する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登
録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔは、ＦＦＰＥ組織の１～１０μｍ切片からのゲノムＤＮＡの精製のために、Ｍａｘｗｅ
ｌｌ（登録商標）１６機器とともに使用される。シリカ被覆常磁性粒子（ＰＭＰ）を用い
てＤＮＡを精製し、低溶出体積で溶出させる。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰ
Ｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔは、ゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡの精製のために、ＱＩ
Ａａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏテクノロジーを使用する。
ＦＦＰＥ、血液および骨髄穿刺液からの単離核酸（例えばＲＮＡおよびＤＮＡ）に対す
るさらなる代表的な方法を以下のとおり記載する。Ｍａｘｗｅｌｌ ＣＳＣ（登録商標）
（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ａ１Ｓ１３１１）用のＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６Ｌ
ＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔを用いて、新鮮または凍結ＰＡＸｇｅｎ
ｅ（登録商標）ＲＮＡ血液チューブからのＲＮＡを抽出した。Ｍａｘｗｅｌｌ ＣＳＣ（
登録商標）用のＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｂｌｏ
ｏｄ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃Ａ１Ｓ１３１１）およびＭａｘｗｅｌｌ（登録
商標）ＣＳＣ用のＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃ＡＳ１０１０）をそれぞれ用いて骨髄
穿刺液からのＲＮＡおよびＤＮＡを抽出した。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＣＳＣ
ＲＮＡ ＦＦＰＥキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃ＡＳ１３６０）およびＭａｘｗｅ
ｌｌ １６ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ ＬＥＶ ＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ
＃ＡＳ１１３０）をそれぞれ使用して、ＦＦＰＥ試料からのＲＮＡおよびＤＮＡを同時抽
出した。ＦＦＰＥ試料の脱パラフィンは、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ＃０４－３５５－１２
１）を用いて行った。マクスウェルＣＳＣ（登録商標）用のＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）
１６ ＬＥＶ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ＃
Ａ１Ｓ１３１１）およびＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＣＳＣ用のＭａｘｗｅｌｌ（登録商
標）１６ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａカ
タログ＃ＡＳ１０１０）をそれぞれ用いて細胞株からのＤＮＡおよびＲＮＡを精製した。
［実施例２］単離核酸の定量
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ＃Ｐ７５８１）を用いて単離ＤＮＡを定量した。Ｑ
ｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ＃Ｒ１１４９１）を用いて単離ＲＮＡを定量した。
［実施例３］ＤＮＡのせん断
循環式冷却器を備えたＣｏｖａｒｉｓ（商標）Ｅ２１０装置を４℃に設定した。機器水
タンクに満水ライン上のレベル「６」まで蒸留／脱イオン水を充填した。ＳｏｎｏＬａｂ
（商標）ソフトウェアを起動し、入力を要求されたときに、システムがホーミング配列を
実行するようにした。試料をせん断する前に、機器タンク内の水を少なくとも４５分間脱
気した。
せん断のためにゲノムＤＮＡ試料を調製するために、マイクロプレートリーダー（Ｓｐ
ｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上でＰｉｃｏＧｒｅｅ
ｎ（登録商標）アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて試料を最初に定量した。濃度
に基づいて、低ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）ととも
に１２０μＬの所望のインプットＤＮＡ（２ｎｇ／μＬ）を実験に対して使用した。１０
０μＬの個々の試料を、チューブの蓋の隔壁を通じてＣｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢ
Ｅ（Ｃｏｖａｒｉｓカタログ＃５２００４５）にゆっくりとピペットで移した。次いで、
Ｃｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢＥをＣｏｖａｒｉｓ Ｅシリーズチューブラックに置
いた。２００ｂｐのせん断については、次のように設定した：１０％デューティサイクル
、５の強度、２００サイクル／バースト、時間１８０秒および周波数掃引モード。せん断
後、ミニ遠心分離機で適切なアダプターを用いてＣｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢＥを
短時間スピンダウンし、せん断試料を清潔な１．５ｍＬ微量遠心管に移した。ＱＩＡＧＥ
Ｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを用いて、各せん断ＤＮＡ試料を精製した。簡
潔に述べると、５ｘＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝液を１．５ｍＬ微量遠心管中の試料に添加
した（例えば、１００μＬの試料に５００μＬのＰＢＩ緩衝液を添加した。）。各試料を
ボルテックスし、短時間スピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。Ｍｉ
ｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、フロースルーを廃棄し
た。７５０μＬのＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝液をカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１
分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。スピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間
再び遠心し、清潔な１．５ｍＬ微量遠心管に移した。カラムを２～３分間風乾した。最初
の溶出のために、１８μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを各カラムに
添加し、２～３分間温置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。２回目の溶出
のために、１５μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間温
置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラムを廃
棄した。
典型的には、２００ｎｇをＤＮＡせん断に使用するが、ＤＮＡの量は２０～２００ｎｇ
またはそれを超える範囲であり得る。
［実施例４］ＤＮＡせん断に対する代替方法
この実施例は、実施例３からのＤＮＡせん断の代替方法を記載する。
二本鎖ゲノムＤＮＡを最初に変性させて１本鎖ＤＮＡにし、次にプライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼ（例えばＥｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰおよび少量のｄｄＮＴＰと
混合する。プライマー配列は、ランダムヘキサマーまたは５’末端にアダプター配列でタ
グ付加されたランダムヘキサマーであり得る。少量のＤＮＡをクローニングおよび配列決
定するためのタグ付きランダムヘキサマー増幅を使用するための方法は、例えばＷｏｎｇ
Ｋ．Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６；２４（１９）：３７７
８－８３に記載されている。プライマー－鋳型アニーリングおよびＤＮＡ合成を可能にす
る条件下で反応を温置する。ＤＮＡ合成は、ｄｄＮＴＰが新たに合成された第１鎖に組み
込まれた際に終了する。合成された第１鎖ＤＮＡの長さは、ｄＮＴＰ対ｄｄＮＴＰの比に
よって調節し得る。例えば、ｄＮＴＰ対ｄｄＮＴＰのモル比は、少なくとも約１０００：
１、約５０００：１または約１００００：１である。第１鎖合成の後、短い断片（例えば
、プライマーおよび短い合成第１鎖ＤＮＡおよびｄｄＮＴＰなど）は、サイズ選択（例え
ば、サイズ選択スピンカラムを使用）によって除去し得る。得られた第１鎖ＤＮＡをプラ
イマー（例えば、ランダムヘキサマーまたはアダプター配列でタグ付加されたランダムヘ
キサマー）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＥｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼ）およびｄＮＴＰ
と混合する。第１鎖ＤＮＡから末端３’－ｄｄＮＴＰを除去するために、または第２の開
始部位にわたり平滑末端を生成させるためにも、Ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを使用し得
る。次いで、プライマー－鋳型アニーリングおよびＤＮＡ合成を可能にする条件下で反応
系を温置する。第２鎖の合成後、得られた２本鎖ＤＮＡ断片を精製し、ライブラリ構築に
おいて直接使用し得る。あるいは、アダプター配列が第１鎖および第２鎖合成のためのプ
ライマーに含まれている場合には、これらのアダプター配列を含有するプライマーを用い
て、２本鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し得る。ＰＣＲ増幅のためのプライマーはまた、配列
全体および／またはバーコード配列も含み得る。
［実施例５］
ｃＤＮＡ合成
ライブラリ構築前に、単離ＲＮＡを２本鎖ｃＤＮＡに変換し、これはアダプター連結配
列決定ライブラリを作製するためのインプットとなった。
２本鎖ｃＤＮＡは二段階工程で作製した。最初に、ランダムヘキサマー（Ｎ６）および
オリゴｄＴ ＤＮＡプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ（ＩＤＴ））の混合物と全ＲＮＡをハイブリッド形成させた。鋳型としてＲＮＡ鎖を
使用し、インプットＲＮＡに相補的な１本鎖ＤＮＡを生成させる逆転写酵素（ＲＴ）（Ｐ
ｒｏｍｅｇａカタログ＃Ｍ３６８３）によって、ハイブリッド形成プライマーを伸長させ
た。第１鎖合成（ＦＳＳ）中に生成されたＤＮＡの第１鎖は、反応終了時にＲＮＡ鋳型と
ハイブリッド形成したままであった。次に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼおよび
ＲＮａｓｅＨを含有する混合物をＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂｓ カタログ＃Ｅ６１１１Ｌ）に添加したときに、第２鎖合成（ＳＳＳ）
が起こった。ＲＮａｓｅＨはＤＮＡに結合したＲＮＡにニックを入れ、したがって、ＤＮ
Ａポリメラーゼによって使用されたＲＮＡプライマーを作製し、第１のＤＮＡ鎖を鋳型と
して用いて第２のＤＮＡ鎖の合成を開始させた。第２鎖合成の生成物は、ライブラリ構築
に適合する２本鎖ＤＮＡであった。
インプットＲＮＡの品質に基づくアッセイ設定および実行で相違が最小限である半自動
ワークフローを使用して、高品質（例えば、適切に回収され、保存された新鮮凍結インプ
ット（例えば細胞ペレット）、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡ血液チューブ、ＲＮＡｌａｔｅｒ
中の骨髄穿刺液）および低品質（例えばＦＦＰＥから精製されたＲＮＡ）インプットの両
方の処理に対応するように、ｃＤＮＡ合成プロトコールを設計した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚ
ｅｒ上でＲＮＡの品質を分析した。明確なリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のピークは、ｍ
ＲＮＡがほぼ完全長であることを示した。
低品質ＲＮＡインプットからの典型的なｃＤＮＡ断片の長さは１００～５００ｂｐであ
り、ライブラリ構築を開始する前に追加の処理（例えば断片化）を必要としなかった。高
品質のＲＮＡインプットからの典型的なｃＤＮＡ断片の長さは一般に５００ｂｐを超え（
２～３ｋｂｐまで）、ライブラリ構築のためのインプットとして使用する前にｃＤＮＡを
断片化した。断片化は、ゲノムＤＮＡに対して使用したものと同じプロトコール（実施例
３）を使用して、超音波処理によって行った。
ＦＦＰＥ試料から単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのさらなる代表的な
方法を以下に記載する。例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅキットを使用して単一
の５～１０μｍ ＦＦＰＥ組織切片から抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ランダムヘキサマープライマーを用
いてｃＤＮＡに逆転写した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを作製し、ＦＦＰＥ ＤＮＡ試料に対するようにライブラリ
構築、ハイブリッド捕捉および配列決定へのインプットとして使用した。発現レベルの分
析は、分析ツールの組み合わせを用いて行った。
［実施例６］ライブラリ調製
エンドリペア反応
エンドリペア試薬（ＮＥＢ ＃Ｅ６０５０Ｌ）を凍結融解し、エンドリペアマスター混
合液を氷上で調製した。１試料あたり７０μＬのマスター混合液を調製するために、５５
μＬのヌクレアーゼ不含水を１０μＬの１０ｘエンドリペア反応緩衝液および５μＬのエ
ンドリペア酵素混合物と混合した。次いで、７０μＬのマスター混合液を氷上の９６ウェ
ルＰＣＲプレート中の３０μＬの各せん断ＤＮＡ試料に添加した。反応系を２０℃でサー
モサイクラー中で３０分間温置した。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラ
ムを用いて、各試料を精製した。簡潔に述べると、５ｘＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝液を１
．５ｍＬの微量遠心管中の試料に添加した（例えば、１００μＬの試料に５００μＬのＰ
ＢＩ緩衝液を添加した。）。各試料をボルテックスし、短時間スピンダウンし、ＭｉｎＥ
ｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで
１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。７５０μＬのＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝液をカラ
ムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。スピン
カラムを１３，０００ｒｐｍで１分間再び遠心し、清潔な１．５ｍＬ微量遠心管に移した
。カラムを２～３分間風乾した。最初の溶出のために、２２μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕ
ｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラムに添加し、２～
３分間温置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。２回目の溶出のために、２
２μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間温置し、次いで
１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラムを廃棄した。
３’Ａ－塩基付加
Ａ－塩基付加試薬（ＮＥＢ＃Ｅ６０５３Ｌ）を氷上で凍結融解し、Ａ－塩基付加マスタ
ー混合液を氷上で調製した。１試料あたり１０μＬのマスター混合液を調製するために、
２μＬのヌクレアーゼ不含水を５μＬの１０ｘｄＡ－テーリング反応緩衝液および３μＬ
のＫｌｅｎｏｗ断片（３’－＞５’エクソ－）と混合した。１０μＬのマスター混合液を
氷上の９６ウェルＰＣＲプレート中の４０μＬの各精製エンドリペア試料に添加した。反
応系を３７℃でサーモサイクラー中で３０分間温置した。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔ
ｅ（登録商標）カラムを用いて、各試料を精製した。簡潔に述べると、５ｘＱＩＡＧＥＮ
ＰＢＩ緩衝液を１．５ｍＬの微量遠心管中で試料に添加した（例えば、５０μＬの試料
に２５０μＬのＰＢＩ緩衝液を添加した。）。各試料をボルテックスし、短時間スピンダ
ウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３
，０００ｒｐｍで１分間遠心し、フロースルーを廃棄した。７５０μＬのＱＩＡＧＥＮ
ＰＥ緩衝液をカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを
廃棄した。スピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間再び遠心し、清潔な１．５ｍＬ微
量遠心管に移した。カラムを２～３分間風乾した。最初の溶出のために、１３μＬのＱＩ
ＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラ
ムに添加し、２～３分間温置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。２回目の
溶出のために、１３μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分
間温置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラム
を廃棄した。
多重アダプターの連結
ライゲーション試薬（ＮＥＢ ＃Ｅ６０５６Ｌ）を凍結融解し、ライゲーションマスタ
ー混合液を氷上で調製した。１試料あたり３６μＬのマスター混合液を調製するために、
１２μＬの５ｘＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液を３．３μＬのＩｌｌｕｍｉｎ
ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｄａｐｔｏｒ（１５μＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ＃ＰＥ
－４００－１００１に含まれる。）に添加した（３．３μＬアダプター／１μｇ開始イン
プットＤＮＡを使用した。）。例えば、５００ｎｇのインプットＤＮＡの１つの試料に対
して、最初にアダプターを水中で希釈し（２μＬアダプター＋２μＬ Ｈ２Ｏ）、次いで
、ライゲーション反応系に対して、３．３μＬのこの希釈アダプター混合液、１５．７μ
Ｌのヌクレアーゼ不含水および５μＬのＱｕｉｃｋＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。＞
１μｇの出発材料に対して、＞３．３μＬのアダプターを使用した。したがって、希釈さ
れたアダプター混合液およびヌクレアーゼ不含水の総体積を１９μＬに保つために、より
少ない水を添加した。
３６μＬのマスター混合液および２４μＬの各ｄＡ尾部付加ＤＮＡ試料を氷上の９６ウ
ェルＰＣＲプレートのウェルに添加した。反応系を２５℃でサーモサイクラー中で３０分
間温置した。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを用いて、各試料を精
製した。簡潔に述べると、５ｘＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝液を１．５ｍＬの微量遠心管中
の試料に添加した（例えば、６０μＬの試料に３００μＬのＰＢＩ緩衝液を添加した。）
。各試料をボルテックスし、短時間スピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移
した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、フロースル
ーを廃棄した。７５０μＬのＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝液をカラムに添加し、１３，０００
ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。スピンカラムを１３，０００ｒｐ
ｍで１分間再び遠心し、清潔な１．５ｍＬ微量遠心管に移した。カラムを２～３分間風乾
した。最初の溶出のために、２０μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラムに添加し、２～３分間温置し、次いで１３
，０００ｒｐｍで１分間遠心した。２回目の溶出のために、２０μＬのＱＩＡＧＥＮ Ｅ
ｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間温置し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分
間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラムを廃棄した。
ＰＣＲ濃縮
ＰＣＲ試薬を凍結融解し、ＰＣＲマスター混合液を氷上で調製した。１試料あたり６２
μＬのマスター混合液に対して、ＨＦ緩衝液（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、ＮＥＢカタログ番号Ｆ
－５３１Ｓ）入りの５０μＬの２Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマス
ター混合液、８μＬのヌクレアーゼ不含水、２μＬのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐｒｉｍｅｒ
１．０（２５μＭ）および２μＬのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐｒｉｍｅｒ ２．０（０．５μ
Ｍ）を使用した。次いで、９６ウェルＰＣＲプレート中で、適切なバーコード付きの２μ
ＬのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ（２５μＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａカタロ
グ＃ＰＥ－４００－１００１に含まれる。）および３６μＬの連結ＤＮＡ試料と６２μＬ
のマスター混合液を混合した。反応系を以下のようにサーモサイクラー中で温置した：
１サイクル ９８℃ ３０秒
１８サイクル ９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ３０秒
１サイクル ７２℃ ５分
４℃ 維持
１．８ｘ体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏ
ｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃａｔ．＃Ａ６３８８）で各ＰＣＲ反応物に対してサイ
ズ選択を行った。簡潔に述べると、１．８ｘのＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを１．５ｍＬの微
量遠心管中の試料に添加し（例えば、１８０μＬのビーズを１００μＬの試料に添加した
。）、ボルテックスし、転倒混合しながら５分間温置した。溶液が透明になるまで（２分
間）、チューブをマグネットスタンド上に置いた。マグネット上に捕捉されたビーズを乱
さずに上清を廃棄した。新たに作製した６００μＬの７０％エタノールをビーズ（ｂｅａ
ｒｄｓ）に添加し、１分間温置し、続いてエタノールを除去した。新たに作製した６００
μＬの７０％エタノールの第２のアリコートをビーズに添加し、１分間温置し、エタノー
ルを除去した。ビーズを再捕捉するために、チューブをマグネットスタンド上に１～２分
間戻した。残りのエタノールを全て除去し、ビーズを室温で５～１０分間風乾させた。３
０μＬのＱＩＡＧＥＮ溶出緩衝液をビーズに添加し、ボルテックスし、２分間温置した。
溶液が透明になるまで（２分間）、チューブをマグネットスタンド上に戻した。上清を新
しい１．５ｍＬチューブに移し、ビーズを廃棄した。Ｑ－ＰＣＲアッセイを用いて、溶出
ＤＮＡ試料を定量した。これらの定量化により、プールされたハイブリッド捕捉選択内の
各ライブラリの等しい提示を確保するために等モルでプールすることが可能になる。
［実施例７］ハイブリッド選択
プール指標付き試料ライブラリ
Ｑ－ＰＣＲによって、指標を付け、精製し、定量したライブラリのプール（１２－ｐｌ
ｅｘまで）を氷上で作製した。各試料がハイブリッド選択工程において同等に示されたこ
とを確実にするために、１．５ｍＬの微量遠心管中で等モルのプールを調製した。これら
のプールのそれぞれに対するＤＮＡの総インプットは、２０００ｎｇ～５００ｎｇの範囲
であり得る。通常、総インプットＤＮＡは２０００ｎｇである。したがって、１２個の試
料をプールする場合、合計２０００ｎｇにするために、それぞれ１６６．６７ｎｇをプー
ルし得る。２０００ｎｇのライブラリプールの最終体積は４μＬとなるはずである。指標
付きライブラリの濃度が様々であるがゆえに、何らかのより大きな体積でプールが作製さ
れ得るが、このプールはスピードバック（低熱使用）で乾燥させ、４μＬのヌクレアーゼ
不含水で再構成するべきである。
ライブラリ構築において収率が高いほど、ライブラリの複雑性が高まる。
プールしたＤＮＡライブラリをビオチン化ＲＮＡベイトとハイブリッド形成させる。
この実験において、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉ
ｃｈｍｅｎｔ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄキット（＃Ｇ３３６０Ａ－Ｊ）を使用した。ハイブ
リダイゼーション緩衝液＃３、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ＃１、ＳｕｒｅＳｅｌ
ｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ＃２、Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ １．０ブロック、Ｉｎ
ｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ １－１２ブロック、ＲＮＡｓｅブロックおよびビオチン化ＲＮＡ
ベイトを氷上で凍結融解させた。次のマスター混合液を調製した。
ａ．ハイブリダイゼーション緩衝混合液（反応あたり１３μＬ）：
ｉ．ハイブリダイゼーション緩衝液＃１（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２５μＬ
ｉｉ．ハイブリダイゼーション緩衝液＃２（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１μＬ
ｉｉｉ．ハイブリダイゼーション緩衝液＃３（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１０μＬ
ｉｖ．ハイブリダイゼーション緩衝液＃４（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１３μＬ
ｂ．ブロッキング混合液（反応あたり８μＬ）：
ｉ．ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ＃１（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２．５μＬ
ｉｉ．ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ＃２（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２．５μＬ
ｉｉｉ．対となるエンドプライマー１．０ブロック（ＩＤＴ、Ｈ２Ｏで２００μＭに再
懸濁）－１．５μＬ
ｉｖ．インデックスプライマー１～１２ブロック（ＩＤＴ、Ｈ２Ｏで２００μＭに再懸
濁）－１．５μＬ
ｃ．ＲＮａｓｅブロックの希釈
ｉ．＜３Ｍｂの領域を有するカスタムビオチン化ＲＮＡ－ベイトについて：１μＬのＲ
Ｎａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を９μＬの水中で希釈した。
ｉｉ．＞３Ｍｂのベイト領域を有するカスタムベイトの場合：１μＬのＲＮａｓｅブロ
ックを３μＬの水中で希釈した（依然として７μＬの捕捉反応あたり０．５μＬのＲＮａ
ｓｅブロック）
ｄ．ベイト混合物：（反応あたり７μＬ）
ｉ．ＲＮＡベイト－２μＬ（＞３Ｍｂのベイト領域を有するベイトについて、５μＬの
ベイトを使用した。）
ｉｉ．希釈ＲＮａｓｅブロック－５μＬ（＞３Ｍｂのベイト領域を有するベイトについ
て、上で示されるように希釈した２μＬのＲＮａｓｅブロックを使用した。）
ハイブリダイゼーション緩衝混合液、ブロッキング混合液およびベイト混合液を調製し
たら、ハイブリダイゼーション緩衝混合液をボルテックスし、スピンダウンし、加熱ブロ
ック中で６５℃に加熱した。ハイブリッド選択しようとする各プール試料ライブラリ４μ
Ｌを、９６ウェルＰＣＲプレート中で８μＬのブロッキング混合液と混合した。反応系を
９５℃でサーモサイクラー中で５分間温置し、次いで６５℃で維持した。プール試料ライ
ブラリ／ブロッキング混合液を９５℃で５分間、次いで６５℃で２．５分間温置していた
ときに、ベイト混合物（＝ベイト／ＲＮＡｓｅブロック混合液）を６５℃のヒートブロッ
クに２．５分間入れた。ハイブリダイゼーション緩衝液含有チューブを素早くスピンダウ
ンし、次いですぐに６５℃ヒートブロックに戻した。９６ウェルプレートを６５℃のサー
モサイクラー中に残したまま、１３μＬの加熱したハイブリダイゼーション緩衝混合液を
各試料ライブラリ／ブロック混合液にピペットで入れた。９６ウェルプレートを６５℃の
サーモサイクラー中に残したまま、ベイト混合物を６５℃で２．５分間温置した後、７μ
Ｌのベイト混合物を各試料ライブラリ／ブロック／ハイブリダイゼーション緩衝混合液に
添加した。反応系（全体積３２μＬ）を、サーモサイクラー中、６５℃で２４時間温置し
た。
磁気ビーズの調製
ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ＃２は、ヒートブロック中で６５℃で
予熱した。Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ビーズ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）をボルテックスし、再懸濁した。５０μＬのＤｙｎａｌビーズあたり２０
０μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加することによって
ビーズを洗浄した（例えば、３００μＬのＤｙｎａｌビーズを調製するために１２００μ
ＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを使用した。）。ビーズを５
秒間ボルテックスし、短時間スピンダウンした。ビーズを約１５秒間または全ビーズが捕
捉されるまでマグネットスタンド上に置いた。上清を除去し、廃棄した。ＳｕｒｅＳｅｌ
ｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒでさらに２回洗浄を繰り返し、合計３回洗浄した
。洗浄後、５０μＬのＤｙｎａｌビーズあたり２００μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中でビーズを再懸濁した（例えば、３００μＬのＤｙｎａｌビ
ーズを調製するために１２００μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆ
ｅｒを使用した。）。再懸濁したビーズをボルテックスし、短時間スピンダウンした。２
００μＬの再懸濁ビーズを個々の１．５ｍＬ微量遠心管に分注した。
ハイブリッド捕捉ＤＮＡの選択
２４時間の温置後、６５℃のサーモサイクラー中のＰＣＲプレートからの各ハイブリッ
ド形成試料を室温で２００μＬの調製済みビーズを含有するチューブに素早くピペットで
入れた。試料およびビーズの混合物を５秒間ボルテックスし、的確な混合を確保するため
に室温で３０分間回転子上で温置した。次いで、チューブを素早くスピンダウンした。ビ
ーズをマグネット上で捕捉し（２分間）、上清を除去して廃棄した。低ストリンジェンシ
ー洗浄の場合、ビーズを５００μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ＃
１中で再懸濁した。試料を５秒間ボルテックスし、マグネットなしで室温で１５分間温置
した。試料を３～５分ごとに５秒間ボルテックスした。チューブをすぐにスピンダウンし
た。次いで、ビーズをマグネットスタンド上で２分間捕捉し、上清を除去して廃棄した。
非標的物質を除去するための高ストリンジェンシー洗浄の場合、６５℃に予熱したＳｕｒ
ｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ＃２でビーズを洗浄した。簡潔に述べると、５
００μＬの予熱したＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ＃２中でビーズを再
懸濁し、５秒間ボルテックス上で混合して、ビーズを再懸濁した。遠心分離機で短時間ビ
ーズをスピンダウンし、室温で５秒間時おりボルテックスして混合しながら、ヒートブロ
ック中で６５℃で１０分間温置した。次いで、ビーズを遠心分離機で短時間スピンダウン
し、マグネット上で２分間捕捉した。予熱したＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆ
ｆｅｒ＃２で６５℃にてさらに２回洗浄を繰り返し、全部で３回洗浄した。次いで、洗浄
緩衝液を完全に除去し、５０μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅ
ｒをビーズに添加し、続いて、５秒間ボルテックスしてビーズを混合した。試料を室温で
１０分間温置し、ボルテックス混合を時おり５秒間行った。ビーズを遠心分離機中で短時
間スピンダウンし、マグネットスタンド上で捕捉した。捕捉したＤＮＡを含有する上清を
新しい１．５ｍＬ微量遠心管にピペットで移した。５０μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｎ
ｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを捕捉ＤＮＡに添加した。試料を５秒間ボル
テックスし、遠心分離機で短時間スピンダウンし、１．８ｘ体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビー
ズを用いて精製した。４０μＬのヌクレアーゼ不含水中でＤＮＡを溶出させた。
捕捉ＤＮＡのＰＣＲ濃縮
ＰＣＲ試薬を凍結融解し、ＰＣＲマスター混合液を氷上で調製した。１試料あたり６０
μＬのマスター混合液に対して、ＨＦ緩衝液入りの５０μＬの２Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈ
ｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスター混合液（ＮＥＢ＃Ｆ－５３１Ｓ）を、８μＬのヌクレ
アーゼ不含水、１μＬのＱＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ １．１（Ｈ２Ｏ中１００μＭ）および
１μＬ ＱＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２．１（Ｈ２Ｏ中１００μＭ）と混合した。Ｑ－ＰＣＲ
用のプライマー配列は次のとおりである：
ＱＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ１．１（ＩＤＴからＨＰＬＣ精製）：
５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴ３’（配列番号２）
ＱＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ２．１（ＩＤＴからＨＰＬＣ精製）：
５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ３’（配列番号３）
６０μＬのマスター混合液を９６ウェルＰＣＲプレート中の４０μＬの各精製捕捉ＤＮ
Ａ試料に添加した。反応系を以下のようにサーモサイクラー中で温置した：
１サイクル ９８℃ ３０秒
１２サイクル ９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ３０秒
１サイクル ７２℃ ５分
４℃ 維持
各１００μＬのＰＣＲ反応液を１．８ｘ体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズで精製し、３５
μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）中で溶出させた。Ｑ－ＰＣＲアッ
セイを用いて、ハイブリッド選択／捕捉ＤＮＡ試料を定量した。Ｑ－ＰＣＲアッセイはエ
ンドアダプターを検出し、リードは、適切なクラスター密度を得るために各試料のどの程
度を配列決定フローセルに載せるべきかを示した。
［実施例８］配列決定方法
次のものは、本実施例による変化を同定するために使用される方法および実験条件のあ
る一定の実施形態を例示する。さらなる転座のスクリーニングは、例えば、予め選択され
た腫瘍試料から調製されたｃＤＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ分析の何れかを用いて行い得る。
ＦＦＰＥ、血液および骨髄穿刺試料から単離された核酸を用いて遺伝子変化を同定する
ために、ＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ－ｓｅｑ）およびＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）の
両方を行った。例えば、保管された固定パラフィン包埋組織から単離されたＤＮＡを用い
て、ハイブリダイゼーション捕捉された、アダプターライゲーションに基づくライブラリ
上で大規模並列ＤＮＡ配列決定を行った。データを分析し、ＤＮＡ変化呼び出しを割り当
てるために、分析ツールの組み合わせを用いた。凍結腫瘍から調製したｃＤＮＡのｑＲＴ
－ＰＣＲ分析または保管ＦＦＰＥ検体のＩＨＣ評価の何れかを用いて、さらなる転座スク
リーニングを行った。ＦＦＰＥ組織から単離されたＲＮＡを用いて、両方の新規転座の発
現を確認するために、大規模並行ｃＤＮＡ配列決定を行った。再編成の体細胞起源を確認
するために、指標ＮＳＣＬＣ患者について、血液からの適合した正常参照ゲノムＤＮＡを
配列決定した。
ゲノムＤＮＡ配列決定
保管ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍検体からのＤＮＡを用いて、１４
５種類の癌遺伝子の２５７４個のエクソンの配列決定を行ったが；２４個はＮＳＣＬＣ患
者由来であった。ゲノムＤＮＡを用いたアダプターライゲーション法、続いて最適化ＲＮ
Ａハイブリダイゼーション捕捉プローブ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔカスタ
ムキット）によるハイブリダイゼーション選択によって、配列決定ライブラリを構築した
。ＨｉＳｅｑ２０００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での配列決定は、３６ｘ３６対のリード
を用いて平均デプス２５３Ｘまで行った。塩基置換、インデル、コピー数変化およびゲノ
ム再編成のためのデータ処理および突然変異の割り当ては、腫瘍組織からの突然変異呼び
出しのために最適化されたツールの組み合わせを用いて行った。
［実施例９］多重分析のための代表的な選択遺伝子および変異体
多重分析のために選択された代表的な遺伝子、変異体および癌のタイプを表１～９に記
載する。
［実施例１０］臨床癌検体の次世代配列決定からの、体細胞ゲノム変化の高感度検出の
ためのベイジアン法
本明細書中に記載のベイジアン法を続く実施例で実行した。
このアプローチの有用性は、臨床背景に関連するより低い範囲の突然変異頻度での置換
検出に対するデータ駆動事前分布（ｐｒｉｏｒｓ）の影響を説明する出力計算によって例
証される。図２で示されるように、事前予測（例えば１ｅ－６または１０％事前分布（ｐ
ｒｉｏｒ））および突然変異頻度（例えば１％、５％または１５％突然変異）の値は、そ
れぞれ「臨床癌検体の次世代配列決定からの、体細胞ゲノム変化の高感度検出のためのベ
イジアン法」の（ｉ）および（ｉｉ）に記載の値に対応する。図２は、事前予測を組み込
むことにより、例えば突然変異部位での必要なカバレッジデプスを小さくすることによっ
て、または突然変異を検出するための推定出力（感度）を上昇させることによって、より
稀な突然変異に対する検出力を向上させ得ることを示す。
様々な試料（例えば、構築された低純度マルチクローン試料、肺および結腸腫瘍試料お
よび乳癌試料）に対する、および希少な変異を検出するためのベイジアン法の適用を示す
さらなる例は、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレットで開示されている。
［実施例１１］個別に合成されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを用いた高性能の溶
液ベースの標的選択
溶液ベースのゲノム標的選択技術が利用可能であることにより、標的配列決定アプリケ
ーションの迅速な開発が可能になり、そのうちの一部が臨床配列決定試験の導入につなが
った。市販のハイブリダイゼーション捕捉試薬は、ビオチン化ＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブ（「ベイト」）に変換されるアレイ合成オリゴヌクレオチドに基づく。しかし、これら
の複雑なプローブプールを作製する方法は、例えば高ＧＣ含量標的を捕捉することなど、
性能面の課題に直面する。
５７個の臨床的に関連し、実用可能な癌関連遺伝子に相当する約１３０ｋｂの標的領域
を捕捉するために個別に合成された５’－ビオチン化オリゴヌクレオチド（「オリゴ－ベ
イト」）を用いる代替的なアプローチを本明細書中で記載する。２４時間のハイブリダイ
ゼーション手順でこれらのオリゴベイトを用いて選択された指標付き配列決定ライブラリ
は、５０００倍の標的濃縮をもたらした。５０Ｍ ４９ｘ４９対のエンドリードは、標準
偏差５６８ｘ（２７％）で２１００ｘの平均標的カバレッジを生じさせた。全ての標的が
首尾よくカバーされ、＞５００ｘで標的塩基の９９．９５％がカバーされた。さらに、標
的カバレッジにはＧＣバイアスが実質的になかった。ＧＣ含量＞７０％の標的は、平均す
ると１，９７５ｘカバレッジ、ＧＣ含量＜３５％の標的は平均すると１，９９６ｘカバレ
ッジであった。
より短いハイブリダイゼーション時間を使用しても高い性能が維持され：標的塩基の９
９．３％が、２．５時間のハイブリダイゼーション後、＞５００ｘでカバーされた。
ＳＳＰＥ（サケ精子、ＰＥ）／デンハートの使用は、ＴＥＡＣｌ、ＴＭＡＣｌおよび／
または硫酸デキストランを含有するｈｙｂ／洗浄緩衝液よりも優れていた。
別の方法では捕捉が困難な（例えば高ＧＣ％）領域のカバレッジを拡大するために、ま
たは新しい遺伝子含量を迅速に追加するために、アレイ由来のベイトプールにオリゴ－ベ
イトを添加し得る。このアプローチは、高性能の標的臨床配列決定試験を開発するための
非常に有効で拡張可能な方法をもたらす。
捕捉ベイトを最適化する代表的な方法およびベイトセットを評価するための実験条件は
、国際公開第２０１２／０９２４２６号パンフレットで開示されている。
［実施例１２］ホルマリン固定組織に由来するＤＮＡの低インプットを用いた高感度腫
瘍プロファイリングのための日常的な超ディープ配列決定
ハイスループットＤＮＡ配列決定技術の幅広い採用により、癌ゲノミクスにおける急速
な進歩が促進された。しかし、ゲノム癌診断における標準治療は、依然として個々の遺伝
子および特定の突然変異に焦点を当てた検査を含む。臨床的に実施可能な突然変異の数が
増加するにつれて、特に組織検体が、生検の場合に一般的であるように、限定的である場
合、試験の枠組みに対するこの単一の突然変異が実行不可能になる。腫瘍試料の包括的な
ゲノムプロファイリングに対する臨床的ニーズに対処するために、発明者らは、２００＋
の癌関連遺伝子に対する大規模並列配列データを送達する臨床テストを開発した。さらに
、この検査は臨床的に重要であることが示され、ＤＮＡインプットが５０ｎｇ程度と低い
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料および１１年間経過しているという
古い試料から超ディープ配列決定データを生成させた。
多岐にわたる試料でのこの検査の性能を評価するために、経年ブロックセット由来の９
６個のＦＦＰＥ検体からＤＮＡを単離したが、これには、次の経過年数：１、３、５、７
、９および１１年にわたり各組織に対して均一に分布した、乳房、結腸、肺および腎組織
のそれぞれからの１２対の腫瘍／正常ペアが含まれていた。指標付加配列決定ライブラリ
を構築するために、２００ｎｇおよび／または５０ｎｇのインプットＤＮＡを使用し、そ
の後、溶液ベースのハイブリッド捕捉法を用いて２００＋個の癌関連遺伝子を濃縮し、Ｉ
ｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（商標）２０００プラットフォーム上で配列決定した。
ライブラリ構築のために少なくとも２００ｎｇのＤＮＡを生成させる７６試料の場合、
配列決定カバレッジは、ＰＣＲ複製物の除去後に平均して１，０００ｘであり、試料の＞
９５％が＞３５０ｘの中央値カバレッジを生じた。ライブラリ構築に対して５０ｎｇを使
用した試料の場合、カバレッジの平均は４５０ｘであった。配列決定性能は、全ての試料
組織タイプおよび経過年数にわたって一貫していた。このような超ディープ配列決定は、
５～１０％程度の低い頻度で存在する突然変異の高信頼度検出を可能にする。
［実施例１３］循環腫瘍細胞を用いた腫瘍ゲノムのプロファイリング
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、低侵襲性の連続方式でヒト悪性腫瘍を試料採取するための
優れた機会を提供する。癌ゲノムの分子の特徴評価のためのＣＴＣの使用には、２つの重
要な課題がある。第１に、ＣＴＣは血液から効率的に単離されなければならず、この場合
、ＣＴＣは非腫瘍細胞よりも１０７倍以上少ないものであり得る。第２に、ＣＴＣ試料中
に存在する限られた数の腫瘍ゲノムは、物質の損失および偏りの導入を最小限に抑えなが
ら、利用可能な形態で捕捉しなければならない。
以前のＣＴＣの遺伝子解析は、対立遺伝子特異的ＰＣＲを使用しており；これらの方法
は、野生型配列の≧１０４倍のバックグラウンドで非常に低いコピー数の特異的突然変異
の検出を可能にする。ＣＴＣの存在量および捕捉効率の二重の課題に対処する一方で、こ
のアプローチは、本質的に、選択された予め指定された変異体の狭い特徴評価に限定され
る。ゲノム時代に分子ＣＴＣ解析を持ち込むために、発明者らは、単一ＣＴＣ試料からの
２００個を超える癌関連遺伝子のディープ再配列決定を可能にする次世代プラットフォー
ムと、数万ではなく僅か数百個の白血球細胞のバックグラウンドでＣＴＣの回収を可能に
する微小流体希少細胞捕捉系を結合させた。
対立遺伝子頻度（Ｒ２約０．９０）をほぼ維持しながら、１０個以下の癌細胞株の複合
混合物を使用して、全部で１００個ほどの少ない細胞から高感度突然変異検出（対立遺伝
子≧１０％存在量に対して約９４％）である。全血に添加された培養細胞を再捕捉するこ
とにより、１０個程度の少ない癌細胞を含有する検体からの多重遺伝子突然変異プロフィ
ールを得た。この感度レベルは、大多数の臨床ＣＴＣ試料をＮＧＳ分析の範囲内に置く。
乳癌患者からの一連の血液試料において、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ陽性細胞の頻度を体細胞突然変
異陽性ＤＮＡの相対的存在量と比較することによって、潜在的なＣＴＣの不均一性を調べ
た。
［実施例１４］ＦＦＰＥ腫瘍試料の標的ＤＮＡおよびＲＮＡのディープシークエンシン
グの統合を通じた癌関連突然変異、転座および遺伝子発現の変化の検出
個別化療法の癌への広範な適用には、腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームに存在
する多様な逸脱の、包括的で、高感度で時宜を得た特徴評価が必要である。ホルマリン固
定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックとして一般的に保存されている殆どの臨床癌試料
からのＲＮＡおよびＤＮＡは、品質が低く、分子プロファイリングに対して使用すること
が困難であった。新たに出現した次世代ＤＮＡ配列決定アッセイは、損傷があるＤＮＡで
うまく機能し、多くのタイプのゲノム逸脱を検出するのに十分に感度が高い。現在、ＦＦ
ＰＥ腫瘍試料からのトランスクリプトームの包括的な分析のための同等のＲＮＡ配列決定
プロトコールはない。
結果：
２００を超える癌関連遺伝子における突然変異、再編成および発現変化の高感度検出の
ためのＦＦＰＥ適合標的ＲＮＡ配列決定および分析方法が開発された。プロトコールは細
胞株ＲＮＡ上で検証し、５０個を超えるＦＦＰＥ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍を研究
するためにこれを使用した。既知の突然変異および遺伝子融合（例えばＢＣＲ－ＡＢＬ１
）が細胞系で検出された。デジタル発現プロファイリングにおける技術的再現性は、細胞
株およびＦＦＰＥ ＲＮＡについてそれぞれＲ２＝０．９９および＞０．９を超えていた
。癌ゲノムで予想されるように、ＲＮＡ－ｓｅｑから、既知の癌遺伝子を含む点突然変異
および新規の再編成を含む、ゲノムにおける逸脱の証拠が提供された。ＥＧＦＲ、ＦＧＦ
Ｒ３、ＣＤＨ５、ＫＩＴおよびＲＥＴを含む癌遺伝子の非常に顕著な差次的発現が、様々
な腫瘍にわたり２．５～７０倍の範囲で明らかになった。同一のＦＦＰＥ試料上のＲＮＡ
およびＤＮＡ配列決定データの組み合わせは、ゲノム変化の機能的な結果を裏付け；例と
しては、突然変異ＴＰ５３対立遺伝子の発現、およびＤＮＡレベルでヘテロ接合性喪失を
示した腫瘍におけるＳＴＫ１１発現の減少が挙げられた。次世代配列決定技術をＦＦＰＥ
ＲＮＡに適用し、実存のＤＮＡ配列決定法と統合することで、臨床的に関連する癌生物
学の理解が深まり、患者のケアを改善することが期待される。
方法：
製造者の指示に従い、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｋｉｔを
用いて、ＦＦＰＥ組織切片、一般的には１または２個の１０μｍのカール（ｃｕｒｌ）か
らＲＮＡを抽出する。抽出したＲＮＡを－８０℃で保存する。ＲＮＡ収率および品質は、
製造者の指示に従い、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＢｉｏａｎａ
ｌｙｚｅｒ ＲＮＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってそれぞれ評価する
。一般的な収率は５００ｎｇ～２μｇであり、ＲＩＮスコアは４未満である。
プライマーとして５５０ｐｍｏｌのランダムヘキサマーを用いて、製造者のプロトコー
ルに従い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２０
μＬの反応系で１００～６００ｎｇのＦＦＰＥ ＲＮＡから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の第１鎖を作製する。製造者のプロトコールに従い、６０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｓｅｃ
ｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）マスター混合液を添加し、１６℃で１５０分間温置することにより、第
１鎖合成の直後に、完全な２本鎖ｃＤＮＡを生成させるための第２鎖合成を行う。２本鎖
ｃＤＮＡの品質および収率は、それぞれＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）お
よびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌ
ｅｎｔ）を用いて評価し得る。一般に、全ｃＤＮＡ合成収率は、標準的なＦＭＩライブラ
リ構築プロトコールへのインプットとして使用される。
本明細書中に記載のＦＦＰＥ ＤＮＡに対するものと同様のプロトコールを使用して対
形成末端適合性配列決定ライブラリの構築およびその後のハイブリッド選択およびＦＦＰ
Ｅ ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡの配列決定を行うが、ＦＦＰＥ ＲＮＡが高度に断片
化されていることによりせん断する必要がなくなるため、エンドリペア段階から直接開始
する。
ＦＦＰＥ ＲＮＡからの配列決定データの分析は、当技術分野で公知の方法を用いて行
い得る。例えば、ＦＦＰＥ ＲＮＡからの配列決定データの分析は、全てのリード対を参
照ゲノム配列（ｈｇ１９）および／または参照トランスクリプトーム（既知の転写産物の
配列の全て、例えばＲｅｆＳｅｑ）に対してマッピングすることによって行い得る。次い
で、遺伝子融合、遺伝子配列における突然変異、オルタナティブスプライシングを同定す
るために、および、例えばＢｅｒｇｅｒら（２０１０） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０（
４）：４１３－２７（ＰＭＩＤ ２０１７９０２２）およびＧａｒｂｅｒら（２０１１）
Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．８（６）：４６９－７７（ＰＭＩＤ ２１６２３３５３）によ
る文献に記載されるように遺伝子発現を定量するために、マッピングされたリードを使用
する。Ｌｅｖｉｎら（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０（１０）：Ｒ１１５（Ｐ
ＭＩＤ １９８３５６０６）により明らかにされるように、選択された一連の遺伝子にお
ける突然変異検出および融合発見を改善するために、標的ＲＮＡ－ｓｅｑを使用し得、発
現プロファイリングのための定量的情報を保存する。
［実施例１５］臨床腫瘍試料の超ディープ配列決定による高感度で正確な突然変異呼び
出し
癌ゲノミクスの理解の急速な進歩および利用可能な標的治療数の増加は、包括的な腫瘍
プロファイリングに基づく有効な癌処置のための機会の拡大をもたらす。研究の場では次
世代配列決定によって腫瘍ゲノムを分析するための実験的および計算論的アプローチにお
ける重要な進歩があったが、これらの技術の臨床への拡張は重大なさらなる課題がある。
これらの中でも重要であるのは、幅広い範囲の臨床で使用できる可能性がある突然変異に
対して高感度および高精度を提供するという要件と相まって、臨床検体の純度および不均
一性が限定的であることである。
この課題に取り組むために、発明者らは、通例のＦＦＰＥ腫瘍試料から２００＋個の癌
関連遺伝子の超ディープ配列データ（＞７００ｘ）を生成させることが可能な臨床テスト
および低い割合で存在する様々なタイプの突然変異に対して高レベルの感度および精度を
提供するためにこのデプスを活用可能である計算ツールを開発した。発明者らの分析パイ
プラインは、既知の突然変異頻度を考慮したマッピング配列データにおける短い変異体を
検出し、代替法によって見逃されることが多いより大きい挿入および欠失を同定するため
に、切断点検出およびローカルアセンブリを組み合わせる。さらに、重要な癌遺伝子を含
むコピー数の変化および再編成が同定される。
発明者らの新規開発方法の分析性能を検証するために、発明者らは、２０種類の正常な
ＨａｐＭａｐ細胞株および２８種類の個別に特徴評価された癌細胞株を含め、異種ＤＮＡ
における稀な事象に対するモデルとして、試料混合物の広範な研究を計画し、実施した。
発明者らは、両者ともＰＰＶ＞９９％で、置換に対して１００％の感度および混合物の＞
１０％に存在する長さ１～５０ｂｐのインデルに対して＞９０％の感度を報告する。発明
者らの試験を２２７検体の黒色腫、前立腺、乳房、大腸および肺の腫瘍試料のコホートに
適用したところ、４２７個の既知の有力な体細胞ドライバー変異が明らかになり、そのう
ち４０％が２０％を下回る試料画分に存在し、１８％が１０％を下回る分画に存在し、高
感度の突然変異呼び出しの重要性が明確に示される。
切除縁における癌突然変異の検出のための方法は、国際公開第２０１２／０９２４２６
号パンフレットに記載されている。
［実施例１６］Ｂ細胞血液悪性腫瘍におけるハイブリッド捕捉に基づく次世代配列決定
を用いた免疫グロブリン配列の包括的プロファイリング
免疫グロブリンをコードする遺伝子を配列決定することは、Ｂ細胞白血病、リンパ腫お
よび多発性骨髄腫を含むリンパ性悪性腫瘍を有する患者におけるクローン細胞集団の検出
ならびに予後および治療的判断を行うことにおいて非常に重要である。Ｂ細胞悪性腫瘍に
おける再編成免疫グロブリン配列を同定するための現在のアッセイは、一般的に、保存的
な免疫グロブリン（ＩＧ）領域の配列特異的ＰＣＲに基づく増幅に依存する。この例は、
重鎖および軽鎖可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列および体細胞高頻度変異（
ＳＨＭ）状態の同定を可能にする、免疫グロブリン鎖を配列決定するための新規のハイブ
リッド捕捉に基づくアプローチを記載する。
可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、連結（Ｊ）およびクラスセグメントを含む生殖系列免疫グロ
ブリン（ＩＧ）配列は、重鎖については１４番染色体上で１ＭＢにわたり、ラムダ軽鎖に
ついては２２番染色体上で３４４ｋｂにわたり、カッパ軽鎖については２番染色体上で４
７７ｋｂにわたり広がる。正常なＢ細胞発生中のＶＤＪ組み換えの間に、１つの単一Ｖ－
Ｄ－Ｊ（約３２０塩基）配列が生じる。２つの主要なストラテジーを試験した。第１のス
トラテジーは、Ｄ、Ｊおよびクラスセグメントのみを引き付けることを含んだ。このスト
ラテジーはＲＮＡで成功することが示された。第２のストラテジーには、Ｖセグメントの
付加または単離において引き付けることが含まれた。このストラテジーによって、ＲＮＡ
およびＤＮＡ中のＩＧＨＶ配列の同定が可能となった。
方法：
７種類のマントル細胞リンパ腫細胞（ＭＣＬ）株および５３検体の臨床の慢性リンパ球
性白血病（ＣＬＬ）骨髄穿刺液を含む６０検体からＲＮＡおよびＤＮＡが首尾よく抽出さ
れた。免疫グロブリン可変、連結およびクラスセグメントを標的とするカスタムベイトセ
ットを用いた溶液ハイブリダイゼーションによって、アダプター連結ＤＮＡおよびｃＤＮ
Ａ配列決定ライブラリを捕捉した。全ての捕捉ライブラリは、ＣＬＩＡ認定研究室（Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）において高デプス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅ
ｑ）に対して配列決定を行った。
対になった末端配列決定リードは、免疫グロブリン可変ドメインの反復領域と同じ長さ
のスケール（約５０塩基）であることが多い。個々のＶドメインのフレームワークおよび
ＣＤＲ領域は、互いに既知の相同性を有する。したがって、フレームワーク領域に対する
１つの５０塩基対のリードは、いくつかの異なる可変セグメントにマッピングされ得る可
能性がある。さらに、アライメントにおいて使用されるＨｇ１９参照配列には、既知の生
殖系列可変セグメント配列の全てが含有される訳ではない。例えば、４個の対立遺伝子Ｉ
ＧＨＶ３－２１＊０１、ＩＧＨＶ３－２１＊０２、ＩＧＨＶ３－２１＊０３、ＩＧＨＶ３
－２１＊０４があるが、Ｈｇ１９はＩＧＨＶ３－２１＊０１、すなわち第１の対立遺伝子
を含有する。これらの問題を解決するために、以下に記載の分析方法を設計した。
下記のプログラムを用いてクローンおよびＳＨＭを呼び出すための分析を行った。本プ
ログラムは、例えば次の段階を含む：（１）ＩＧクラスまたは連結セグメントに対するキ
メラリードを選択すること；（２）ＩＧＨＶ、ＩＧＫＶまたはＩＧＬＶセグメントに向か
うリードについてこれらのリードをフィルタリングすること；（３）段階（２）における
各候補Ｖセグメントに対してＶドメインコンセンサス配列を構築すること（例えば、１～
３００塩基対長配列を構築するために、マッピングされたリードから各５０塩基対を取り
出すこと。）；および（４）ＩｇＢｌａｓｔプログラムを通じて、段階（３）で構築した
配列を実行する（これはＶドメインを同定し、％ＳＨＭ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ
ｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）の計算を与える。）。ＩｇＢｌａｓｔは、ＳＨＭ％計
算およびＣＤＲ３配列の同定を可能にするＩＧＭＴ配列データベース中の最も近い生殖系
列適合ＶＤＪに対する配列決定されたＩＧ鎖のアライメントのための、周知の有効な業界
標準ツールである。
上記の自動化呼び出しを確認するために、各候補の手動レビューを行った。手動レビュ
ー（自動化し得る。）は、例えば、次の段階を含む：（１）アライメント長に対するＩｇ
Ｂｌａｓｔ出力を選定すること（例えば、２００塩基長を下回るアライメントは考慮しな
い。）；および（２）例えばＣＤＲ３配列が所与のクローンに対してほぼ同一であり、ｓ
ｎｐｓは所与のリードクラスターに対してほぼ同一であり、マッピングされたリードが概
して固有であり、リードが非ギャップのＦＲ１からＣＤＲ３領域全体に位置することを確
認すること。
成熟Ｂ細胞に由来する腫瘍細胞は、再編成された可変および連結セグメントを有する可
能性が高いので、この分析は、腫瘍純度が比較的低い（例えば約２０％の純度）場合でも
強いシグナルを与えた。
結果：
ＣＬＩＡ認定の商業的なＰＣＲに基づくアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ）を用い
てプロファイリングされた、７種類のＭＣＬ細胞株および５３種類のＣＬＬ試料を用いて
、捕捉に基づくアプローチを検証した。７種類のＭＣＬ細胞系に由来する免疫グロブリン
配列は、公開されている重鎖および軽鎖可変ドメインおよびパーセントＳＨＭの同定と１
００％一致した。以前に臨床的検査を行った５３検体の試料と比較することから、クロー
ン集団の存在を同定するための９８％（５２／５３）の一致およびＩＧＨＶドメインの同
定に対して１００％（３９／３９）の一致が示された。ＳＨＭについて以前に検査した５
０検体のＣＬＬ試料との比較の結果、ＳＨＭなしの場合は９４％（３１／３３）、ＳＨＭ
が存在する場合は１００％（１７／１７）の一致で、全体では９６％（４８／５０）の一
致となった。さらに、二次クローンを１１検体の試料で同定した。
健常血液試料および濃縮血液試料を陰性対照として使用した。これらの試料は、ＶＤＪ
再編成を有すべきであるが、モノクローナル集団は有さない。３検体の正常全血試料につ
いて、腫瘍クローンは同定されなかった。濃縮Ｂ細胞集団には、ＩＧＨＶクラスター呼び
出しがあった。全てがポリクローナルであることが分かり、腫瘍クローンとは呼ばれなか
った。６つの陰性腫瘍クローン試料との１００％一致があった。
結論：
この研究から、クローン性腫瘍Ｂ細胞集団の免疫グロブリン配列を包括的に特徴評価す
るために、ハイブリッド捕捉に基づく標的ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定を使用し得ること
が明らかになった。この能力により、ＳＨＭの定量および可変ドメイン、ＣＤＲ３配列お
よびクラス制限の同定が可能になる。包括的なゲノムプロファイリングアプローチとのこ
の方法論との統合は、血液悪性腫瘍がある患者におけるこのようなアッセイの臨床的有用
性を拡大し、固形腫瘍を有する患者を含む免疫療法に対する患者の免疫腫瘍学および反応
における重要な洞察を提供し得る。
［実施例１７］標的ＤＮＡ配列決定およびＲＮＡ配列決定を用いた血液悪性腫瘍に対す
る多重遺伝子分析
この実施例は、多くの血液悪性腫瘍試料から抽出されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ上
で標的ＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ－ｓｅｑ）およびＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を組
み合わせることによる、臨床的に関連する条件下での様々なクラスのゲノム変化の高感度
で特異的な検出を記載する。試験したゲノム変化としては、例えば塩基置換（Ｓｕｂｓ）
、挿入および欠失（インデル）、局限的なコピー数変化（ＣＮＡ）およびゲノム再編成が
挙げられる。典型的な血液悪性腫瘍試料、例えばＦＦＰＥ、血液および骨髄穿刺液を試験
した。
この実施例に記載の試験は、ＤＮＡ－ｓｅｑベイトセットを含み、標的ＲＮＡ－ｓｅｑ
成分を組み込む。標的ＲＮＡ－ｓｅｑ成分は、ｇＤＮＡではなく相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）に変換されたＲＮＡをインプットとして利用する。ＤＮＡ－ｓｅｑ単独と比較した場合
、ＤＮＡ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑを組み合わせる統合アッセイは、ゲノム再編成の
検出に対する感度の改善をもたらす。
ゲノム再編成は、例えば、ｈｇ１９参照ヒトゲノムアセンブリ、ゲノム配列および構造
と比較した場合、非参照生成物を生成させるためのヒトゲノムの２つ以上の異なる領域の
連結から生じる変化の異種クラスを含む。ゲノム配列再編成の結果として、非参照配列Ｒ
ＮＡ転写産物もまた転写され得る。ゲノム再編成は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）遺伝子の
外側（すなわち遺伝子外）または遺伝子のイントロンおよびエクソン内（すなわち遺伝子
内）で生じるものの何れかとして分類し得る。例えば、ＭＹＣおよびＩＧＨを含むプロモ
ーターまたはエンハンサー関連事象などの遺伝子外再編成は、所与のｍＲＮＡ転写産物ま
たは経路の発現の制御に影響を及ぼし得るが、ｍＲＮＡ配列を必ずしも変化させない。遺
伝子内再編成は、２つ以上の遺伝子のエクソンおよび／またはイントロンを含み、ゲノム
の異なる遺伝子および／または領域（例えば、異なる染色体、同じ染色体の異なる鎖）に
由来する配列から構成されるキメラｍＲＮＡ転写産物を生成させ得る。遺伝子融合は、２
つ以上の遺伝子からの特定の反復的に再編成されたイントロンにおいて生じるゲノム再編
成によって生成され得る。イントロンは、サイズ（＞１ｋｂ）および／または配列（例え
ば反復構造）の制約ゆえに、十分なデプスまでＤＮＡ－ｓｅｑによりカバーすることが困
難であり得る。さらに、関連する限界点が知られていない可能性があるか、または遺伝子
融合ｍＲＮＡ転写産物が複雑な再編成から生じ得、そのためＤＮＡ－ｓｅｑによって関連
する融合パートナーを同定することができない可能性があり得る。ＲＮＡ－ｓｅｑは、イ
ントロンの配列決定およびＤＮＡ配列データからのｍＲＮＡ構造の推定に依存するという
のではなく、遺伝子融合のｍＲＮＡ産物を直接特徴評価することによって、検出感度を改
善する。
それ自体、代表的なＤＮＡ－ｓｅｑベイトセットは、４６４個の遺伝子の完全エクソン
カバレッジ（表１）、癌において反復的に再編成された３１個の遺伝子における選択イン
トロンのカバレッジ（表２）および９１個のさらなる遺伝子の完全なエクソンカバレッジ
（表４）を含み；代表的なＲＮＡ－ｓｅｑ構成要素は、血液悪性腫瘍において反復的に再
編成されることが知られている３３３個の遺伝子のエクソンを標的とするためにＲＮＡ－
ｓｅｑベイトセットを使用する（表３）。
ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＤＮＡ－ｓｅｑベイトセット試薬の調製
表１～４に列挙した遺伝子を標的とするベイト配列を設計した。このベイトはＵｌｔｒ
ａｍｅｒ合成化学を用いてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤ
Ｔ）で合成された。ＲＮＡ－ｓｅｑおよびＤＮＡ－ｓｅｑベイトセット試薬を作製するた
めに、ＩＤＴから受領した適切なベイトセットサブプールの等モル混合物を調製した。次
いで、ベイトセット試薬を一回使用アリコートに分割し、－２０℃で保存した。ＤＮＡ－
ｓｅｑベイトセットの性能は、標準自動ハイブリッド捕捉プロトコールを用いてＨａｐＭ
ａｐライブラリを捕捉することにより確認した。標準プロトコールを用いてＨａｐＭａｐ
ライブラリおよびユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（ＵＨＲＲ）ライブラリを捕捉することに
より、ＲＮＡ－ｓｅｑベイトセットの性能を確認した。
ＤＮＡ－ｓｅｑワークフロー
ゲノムＤＮＡ抽出、定量、せん断、ライブラリ構築、ハイブリッド捕捉および配列決定
の方法は、実施例１～６に記載されている。
ＲＮＡ－ｓｅｑワークフロー
ＲＮＡワークフローは、通常、同じ試料から抽出された適合ＲＮＡおよびＤＮＡにおけ
るＤＮＡ－ｓｅｑワークフローと並行して実行された。例えば、抽出されたＲＮＡを最初
にＲＮＡ特異的蛍光色素であるＲｉｂｏｇｒｅｅｎで定量し、高品質インプット（例えば
血液、ＢＭＡ）からの３００ｎｇまでのＲＮＡまたは低品質インプット（例えばＦＦＰＥ
）からの５００ｎｇのＲＮＡを、２段階ｃＤＮＡ合成プロトコールのためのインプットと
して正規化した。ｃＤＮＡ合成の第１段階において、インプットＲＮＡに相補的な１本鎖
ＤＮＡ鎖が生成された。ｃＤＮＡ合成の第２段階において、１本鎖ｃＤＮＡを２本鎖ＤＮ
Ａに変換した。次いで２本鎖ｃＤＮＡをライブラリ構築のためのインプットとして使用し
た。ｃＤＮＡを高品質ＲＮＡから合成した場合、挿入物長が配列決定と適合することを確
保するために、ライブラリ構築において使用する前にｃＤＮＡをせん断した。ライブラリ
構築、ハイブリッド捕捉、定量および配列決定段階は、ＲＮＡ－ｓｅｑベイトセット試薬
および関連する分析ファイルおよびプロトコールの使用を除いて、全て標準ＤＮＡ－ｓｅ
ｑライブラリと同様に行う。
ＤＮＡ－ｓｅｑアーチファクトデータベースの作成
ＤＮＡ－ｓｅｑワークフローで偽陽性の変化の呼び出しを最小限に抑えるために、正常
なＨａｐＭａｐ細胞株から潜在的な配列決定アーチファクトのデータベースを作成した。
例えば、２０個の個々のＨａｐＭａｐ細胞株からの２００ｎｇのＤＮＡを標準ライブラリ
構築のためのインプットとして使用した。次に、各ライブラリ２μｇをＤＮＡ配列ベイト
セットで捕捉した。捕捉ライブラリの配列決定を行い、標準分析パイプラインを通じて全
データを処理した後、遺伝子に存在するあらゆる変異体呼び出しに基づいてアーチファク
トデータベースを作成した。試料は正常なＨａｐＭａｐ細胞株由来であったため、遺伝子
中で検出された何れの非ＳＮＰ変化も、アーチファクトであると考えられ、試験データを
フィルタリングするために使用される。
Ｒ２ ＲＮＡ－ｓｅｑアーチファクトデータベースの作成
ＲＮＡ－ｓｅｑワークフローを用いた偽陽性ゲノム再編成の検出を最小限に抑えるため
に、ＲＮＡ－ｓｅｑデータにおける潜在的な工程関連、配列決定および分析アーチファク
トのデータベースを作成した。例えば、８検体の正常血液試料からの３００ｎｇのＲＮＡ
を高品質ｃＤＮＡ合成プロトコール用のインプットとして使用し、６検体の正常ＦＦＰＥ
試料からの５００ｎｇのＲＮＡを、低品質ｃＤＮＡ合成プロトコール用のインプットとし
て使用した。ｃＤＮＡ反応の全収量をライブラリ構築に対するインプットとして使用した
。次に、各ライブラリの２μｇをＲＮＡ－ｓｅｑベイトセットで捕捉した。捕捉ライブラ
リの配列決定を行い、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析パイプラインを通じ全てのデータを処理した後
、ゲノム再編成のアーチファクトデータベースを作成した。血液およびＦＦＰＥ試料は正
常ドナー由来であったため、検出された何れのゲノム再編成も人為的現象または生殖系列
事象であると考えられ、試験データをフィルタリングするために使用される。
検証
ＤＮＡ－ｓｅｑベイトセットは、塩基置換、短い挿入および欠失の検出、および非同定
臨床試料での局限的なコピー数変化について、非常に均一なカバレッジおよび精度を達成
した。ＤＮＡ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑからの統合的な結果は、細胞株混合物におけ
るゲノム再編成／遺伝子融合の検出に対して高い感度および特異性を達成した。このアッ
セイは非常に再現性が高く、ワークフローは、ＦＦＰＥ、血液および骨髄穿刺液を含む通
例の血液腫瘍学臨床試料と広く適合していた。その結果は、７６個の非同定臨床試料から
得られた標準治療ＣＬＩＡ認証試験結果ともよく一致していた。
このアッセイは、塩基置換、インデル、局限的なＣＮＡおよびゲノム再編成／遺伝子融
合の検出において高い精度を達成した。ＤＮＡ－ｓｅｑデータは、５２検体の非同定臨床
試料にわたる塩基置換、インデルおよび局限的なＣＮＡの検出に対するＣＬＩＡ認定のＤ
ＮＡ－ｓｅｑアッセイとよく一致していた（＞９７％）。ＤＮＡ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－
ｓｅｑデータセットからの統合的な結果は、３９個の細胞株混合物にわたるゲノム再編成
の検出に対して高い感度および特異性を達成した。この結果は、臨床試料をアッセイする
ために通例使用される外部基準ＣＬＩＡ認定の試験によって検出された塩基置換、インデ
ルおよびゲノム再編成ともまた９９％（１０１個の変化のうち１００個）一致した。
１３検体の試料の５回の異なる実施にわたりこのアッセイにより観察された精度は、性
能仕様に合格し；試験内の精度は９７％、試験間の精度は９７％であった。カバレッジ基
準に合格した試料に対する精選された既知のおよび可能性が高い塩基置換、インデル、局
限的ＣＮＡおよびゲノム再編成／遺伝子融合の試験間の比較に基づいて精度を評価した。
塩基置換、インデルおよびＣＮＡに対するこのアッセイの感度は、５２検体の非同定臨
床試料にわたるＤＮＡ－ｓｅｑの結果を、ＣＬＩＡ認定のＤＮＡ－ｓｅｑアッセイで以前
に得られた結果と比較することによって評価した。この結果は、９７．７％の一致度（１
７１のうち１６７；９５％ＣＩ：９４～９９％）であり、標準アッセイ結果から、このア
ッセイが、塩基置換、インデルおよびＣＮＡの検出について標準アッセイと同じ高い感度
を有することが明らかになった。
ゲノム再編成／遺伝子融合に対するこのアッセイの感度は、既知のゲノム再編成を伴う
２１種類の細胞株の３９種類の混合物（１０％～５０％の混合比）から構成されるモデル
系を用いて決定した。このアッセイは、ゲノム再編成の検出に対する非常に高い感度を達
成し、全ての混合物にわたり１６７のうち１６５（９８．５％；９５％ＣＩ：９６～９９
％）の再編成を検出し、１０％混合物において６６のうち６４（９７％；９５％ＣＩ：８
９～９９）のゲノム再編成を検出した。
塩基置換、インデルおよびＣＮＡに対するこのアッセイの特異性は、５２検体の非同定
臨床試料にわたるＤＮＡ－ｓｅｑの結果を、ＣＬＩＡ認定のＤＮＡ－ｓｅｑアッセイで以
前に得られた結果と比較することによって評価した。この結果は、９７．７％の一致度（
１７１のうち１６７；９５％ＣＩ：９４～９９％）であり、標準アッセイ結果から、この
アッセイが、塩基置換、インデルおよびＣＮＡの検出について標準アッセイと同じ高い特
異性を有することが明らかになった。
ゲノム再編成／遺伝子融合に対するこのアッセイの特異性は、既知のゲノム再編成を伴
う２１種類の細胞株の３９種類の混合物（１０％～５０％の混合比）から構成されるモデ
ル系を用いて決定した。このアッセイはゲノム再編成の検出に対する非常に高い特異性を
達成し、全ての混合物にわたり１６５の真の陽性再編成のうち４個の偽陽性再編成を呼び
出した。
参照による組み込み
個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み込ま
れることが示されるように、本明細書中で言及される刊行物、特許および特許出願は全て
、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。矛盾する場合には、
本明細書中のあらゆる定義を含め、本出願が支配する。
ｔｉｇｒ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ上でＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ
Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）および／またはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されている
ものなどの公開データベースにおいてエントリーと相関する受託番号を参照するあらゆる
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もそれらの全体において参照により組み込まれ
る。
同等物
当業者は、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識
するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができよう。このような同等物は
、続く特許請求の範囲によって包含されるものとする。

Claims (28)

  1. 対象について、体細胞高頻度変異またはＶ（Ｄ）Ｊ体細胞再編成に関連する第１の対象区間のクローンプロファイル、および、免疫グロブリンまたはＴ細胞またはＢ細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである第２の対象区間の配列を提供する方法であって、
    （ａ）各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て；
    （ｂ）それぞれが前記第１および前記第２の対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部を含むライブラリキャッチを提供するために、前記ライブラリをベイトセットと接触させ；
    （ｃ）前記ライブラリキャッチ内において前記第１および前記第２の対象区間の１回以上の出現の配列を得ること
    を含む方法。
  2. 第１の細胞タイプにおける前記第１の対象区間のクローンプロファイルが提供され、かつ、第２の細胞タイプにおける前記第２の対象区間の配列が提供される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の細胞タイプは非悪性細胞であり、前記第２の細胞タイプは悪性細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１の細胞タイプは、前記対象から得られた試料における腫瘍浸潤リンパ球であり、前記第２の細胞タイプは、同じ試料における悪性細胞である、請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記第１の対象区間または前記第２の対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現、存在量または同一性についての値を得ることを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記第１の対象区間での第２の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量に対する、前記第１の対象区間での第１の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量、または、
    前記第１の対象区間での複数の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量に対する、前記第１の対象区間での第１の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量
    についての値を得ることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記第２の対象区間での第２の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量に対する、前記第１の対象区間での第１の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の存在量についての値を得ることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第１または前記第２の対象区間内での可変性についての値を得ることを含み、
    可変性についての前記値が、前記第１または第２の対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 下記（ｉ）～（ｖｉ）：
    （ｉ）段階（ａ）が前記対象からの核酸を断片化することを含む、
    （ｉｉ）段階（ｂ）が、溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、
    （ｉｉｉ）段階（ｂ）が、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、
    （ｉｖ）複数の選択されたメンバーを増幅すること、
    （ｖ）段階（ｃ）が、前記ライブラリまたはライブラリキャッチからのメンバーからの対象区間に対するリードを得て、複数のメンバーのそれぞれについて、前記対象区間内のヌクレオチド位置に対する前記リードからヌクレオチド値を割り当てることを含む、または、
    （ｖｉ）段階（ｃ）が、メンバーからのサブゲノム区間に対するリードを得て、アライメント方法によって前記リードをアライメントし、予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てることを含む、
    のうちの１以上を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記第２の対象区間が、以下：
    ABCB1, ABCC2, ABCC4, ABCG2, ABI1, ABL1, ABL2, ACSL3, ACSL6, ACTB, ACVR1B, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AFF1, AFF4, AKAP9, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, ALPHA, ALO17, ALOX12B, AMER1, APC, APCDD1, APH1A, AR, ARAF, ARFRP1, ARHGAP26, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID1B, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASMTL, ASXL1, ATF1, ATG5, ATIC, ATM, ATR, ATRX, ATXN1, AURKA, AURKB, AXIN1, AXL, B2M, BACH1, BAP1, BARD1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCORL1, BCR, BIRC3, BLM, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIP1, BRSK1, BTG1, BTG2, BTK, BTLA, c1orf144, c11orf30, c12orf9, c15orf21, c17orf39, CAD, CALR, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CASP8, CBFA2T1, CBFA2T3, CBFB, CBL, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCT6B, CD22, CD247, CD36, CD58, CD70, CD74, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDH11, CDH2, CDH20, CDH5, CDK12, CDK4, CDK6, CDK8, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CHCHD7, CHD2, CHEK1, CHEK2, CHIC2, CHN1, CHTOP, CHUK, CIC, CIITA, CKS1B, CLP1, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNTRL, COL1A1, COX6C, CPS1, CRBN, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRKL, CRLF2, CRTC3, CSF1, CSF1R, CSF3R, CTCF, CTNNA1, CTNNB1, CUL4A, CUL4B, CUX1, CXCR4, CYP1B1, CYP17A1, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, D10S170, DAXX, DDIT3, DDR1, DDR2, DDX5, DDX10, DDX3X, DDX6, DEK, DIS3, DKC1, DLEU2, DNM2, DNMT3A, DOT1L, DPYD, DTX1, DUSP2, DUSP22, DUSP9, DUX4, EBF1, ECT2L, EED, EGFR, EIF4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, ELP2, EML4, EMSY, EP300, EPHA3, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHB1, EPHB4, EPHB6, EPOR, EPS15, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC2, ERG, ESR1, ESR2, ETS1, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EXOSC6, EZH2, FACL6, FAF1, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FANG, FANCL, FANCM, FAS, FAT3, FBXO11, FBXO31, FBXW7, FCGR2B, FCGR3A, FCRL4, FEV, FGF1, FGF10, FGF12, FGF14, FGF19, FGF23, FGF3, FGF4, FGF6, FGF7, FGFR1, FGFR1OP, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FHIT, FIP1L1, FLCN, FLI1, FLT1, FLT3, FLT4, FLU, FLYWCH1, FNBP1, FOP, FOXL2, FOXO1, FOXO3, FOXO3A, FOXO4, FOXO1A, FOXP1, FOXP4, FRS2, FSTL3, FUS, FVT1, GADD45B, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GID4, GLI1, GLIS2, GMPS, GNA11, GNA12, GNA13, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPHN, GPR124, GRAF, GRIN2A, GSK3B, GSTP1, GTSE1, GUCY1A2, H4, HCMOGT-1, HDAC1, HDAC4, HDAC7, HEAB, HEI10, HERPUD1, HEY1, HGF, HIP1, HIST1H1A, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H2AC, HIST1H2AG, HIST1H2AL, HIST1H2AM, HIST1H2BC, HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BO, HIST1H3B, HIST1H4I, HLA-A, HLF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNF1A, HNRNPA2B1, HOOK3, HOX11, HOXA11, HOXA13, HOXA3, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, HSP90AA1, HSP90AB1, HSPCA, HSPCB, ICK, ID3, IDH1, IDH2, IGF1, IGF1R, IGF2, IGF2R, IGH, IGK, IGL, IKBKE, IKZF1, IKZF2, IKZF3, IL2, IL21R, IL3, IL7R, INHBA, INPP4B, INPP5D, INSR, IRF1, IRF4, IRF8, IRS2, IRTA1, ITPA, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JARID2, JAZF1, JUN, KAT6A, KDM2B, KDM4C, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KDSR, KEAP1, KIF5B, KIT, KLHL6, KIAA1549, KLK2, KMT2A, KMT2B, KMT2C, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LEF1, LHFP, LHX4, LIFR, LMO1, LMO2, LPP, LRP1B, LRP2, LRP6, LRRK2, LTK, LYL1, MAF, MAFB, MAGEA5, MAGED1, MALT1, MAML2, MAN1B1, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAP3K1, MAP3K13, MAP3K14, MAP3K6, MAP3K7, MECT1, MCL1, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECOM, MECT1, MED12, MEF2B, MEF2C, MEN1, MET, MHC2TA, MIB1, MITF, MKI67, MKL1, MKL2, MLF1, MLH1, MLL2, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MLST8, MN1, MNX1, MORF, MPL, MRE11A, MSF, MSH2, MSH3, MSH6, MSI2, MSN, MTAP, MTCP1, MTHFR, MTOR, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYO18A, MYST3, MYST4, NACA, NBEAP1, NBN, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NCOR1, NCOR2, NCSTN, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKBIA, NFKB1, NFKB2, NFKBIE, NIN, NKX2-1, NOD1, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NPM1, NQO1, NR4A3, NRP2, NRAS, NSD1, NT5C2, NTRK1, NTRK2, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP93, NUP98, NUT, NUTM2A, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PAG1, PAK3, PAK7, PALB2, PARP1, PARP2, PARP3, PARP4, PALB2, PASK, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PC, PCBP1, PCLO, PCM1, PCSK7, PDCD1, PDCD11, PDCD1LG2, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PDK1, PDL1, PER1, PHF1, PHF6, PHLPP2, PHOX2B, PICALM, PIK3C2G, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIM1, PKHD1, PLAG1, PLCG1, PLCG2, PML, PMS2, PMX1, PNRC1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP1CB, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRKAR1A, PRKDC, PRRX1, PRO1073, PRSS8, PSIP1, PSIP2, PTCH1, PTCH2, PTEN, PTK2, PTK2B, PTK7, PTPN11, PTPN2, PTPN6, PTPRD, PTPRO, RAB5EP, RABEP1, RAD21, RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D,RAD51L1, RAD52, RAD54L, RAF1, RALGDS, RANBP17, RAP1GDS1, RARA, RASGEF1A, RB1, RBM15, RCOR1, REL, RELN, RET, RHEB, RHOA, RHOH, RICTOR, RMRP, RNF213, RNF43, ROCK1, ROS1, RPA1, RPL11, RPL13, RPL15, RPL22, RPL35A, RPN1, RPS14, RPS15, RPS19, RPS26, RPTOR, RUNX1, RUNX1T1, RUNX2, RUNXBP2, RUNXT1, S1PR2, SBDS, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SEC31A, SEPT5, SEPT6, SEPT9, SERP2, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SGK1, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC1A2, SLC19A1, SLC22A2, SLC45A3, SLCO1B3, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMARCA1, SMARCA4, SMARCB1, SMARCD1, SMC1A, SMC3, SMO, SNX29, SPOP, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOD2, SOX10, SOX2, SPEN, SPOP, SRC, SRGAP3, SRSF2, SRSF3, SS18, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAG2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, STK11, STK12, STL, SUFU, SULT1A1, SUZ12, SYK, TAF1, TAF15, TAL1, TAL2, TBL1XR1, TBX22, TBX23, TBX3, TCEA1, TCF12, TCF3, TCL1A, TCL6, TEC, TET1, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, TGFBR2, THRAP3, TIF1, TIPARP, TLL2, TLX1, TLX3, TMEM30A, TMPRSS2, TMSB4XP8, TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFSF9, TNKS, TNKS2, TOP1, TP53, TP63, TPM3, TPM4, TPMT, TPR, TRA, TRAF2, TRAF3, TRAF5, TRB, TRD, TRG, TRIM24, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TRRAP, TSC, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, TUSC3, TYK2, TYMS, U2AF1, U2AF2, UG T1A1, UMPS, USP6, USP9X, VHL, WDR90, WHSC1, WHSC1L1, WISP3, WT1, XBP1, XPO1, XRCC3, YPEL5, YY1AP1, ZBTB16, ZMYM2, ZMYM3, ZNF145, ZNF198, ZNF217, ZNF24, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF703, ZNF9, ZNFN1A1, ZRSR2, およびMHC遺伝子
    からなる群より選択される遺伝子からのものである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記第１の対象区間が、以下：
    抗体をコードする配列;
    抗体軽鎖をコードする配列;
    抗体重鎖をコードする配列;
    可変領域をコードする配列;
    重鎖可変領域をコードする配列;
    軽鎖可変領域をコードする配列;
    定常領域をコードする配列;
    重鎖定常領域をコードする配列;
    軽鎖定常領域をコードする配列;
    カッパ軽鎖配列；
    ラムダ軽鎖配列；
    Igクラスおよびサブクラスのうち1つ以上を識別し得る、定常領域の一部；
    CDR；
    軽鎖CDR1；
    軽鎖CDR2；
    軽鎖CDR3；
    重鎖CDR1；
    重鎖CDR2；
    重鎖CDR3;
    T細胞受容体；
    T細胞受容体のアルファ鎖；
    T細胞受容体のベータ鎖；
    T細胞受容体のデルタ鎖；
    T細胞受容体のガンマ鎖；
    抗体可変領域をコードする配列;
    B細胞受容体可変領域をコードする配列;
    T細胞受容体可変領域をコードする配列;
    抗体多様性領域をコードする配列；
    B細胞受容体多様性領域をコードする配列;
    T細胞受容体、多様性領域をコードする配列;
    抗体連結領域をコードする配列;
    B細胞受容体連結領域をコードする配列;
    T細胞受容体連結領域をコードする配列;
    抗体スイッチ領域をコードする配列;
    B細胞受容体スイッチ領域をコードする配列;
    T細胞受容体スイッチ領域をコードする配列;
    抗体定常領域をコードする配列；
    B細胞受容体定常領域をコードする配列；
    T細胞受容体定常領域をコードする配列；
    抗体のVセグメントをコードする配列(再編成の前);
    Igスーパーファミリー受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の前);
    免疫グロブリン遺伝子のVセグメントをコードする配列(再編成の前);
    T細胞受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の前);
    B細胞受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の前);
    抗体のVセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の後);
    免疫グロブリン遺伝子のVセグメントをコードする配列(再編成の後);
    T細胞受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の後);
    B細胞受容体のVセグメントをコードする配列(再編成の後);
    抗体のDセグメントをコードする配列(再編成の前);
    Igスーパーファミリー受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の前);
    免疫グロブリン遺伝子のDセグメントをコードする配列(再編成の前);
    T細胞受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の前);
    B細胞受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の前);
    抗体のDセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の後);
    免疫グロブリン遺伝子のDセグメントをコードする配列(再編成の後);
    T細胞受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の後);
    B細胞受容体のDセグメントをコードする配列(再編成の後);
    抗体のJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    Igスーパーファミリー受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    免疫グロブリン遺伝子のJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    T細胞受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    B細胞受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    抗体のJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    免疫グロブリン遺伝子のJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    T細胞受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    B細胞受容体のJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    抗体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    Igスーパーファミリー受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    免疫グロブリン遺伝子のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    T細胞受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    B細胞受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    抗体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    免疫グロブリン遺伝子のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    T細胞受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    B細胞受容体のV、DおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    抗体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    Igスーパーファミリー受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    免疫グロブリン遺伝子のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    T細胞受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    B細胞受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の前);
    抗体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    免疫グロブリン遺伝子のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    T細胞受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    B細胞受容体のVおよびJセグメントをコードする配列(再編成の後);
    Igスーパーファミリー受容体のVD連結を含む配列;
    免疫グロブリン遺伝子のVD連結を含む配列;
    T細胞受容体のVD連結を含む配列;
    B細胞受容体のVD連結を含む配列;
    Igスーパーファミリー受容体のDJ連結を含む配列;
    免疫グロブリン遺伝子のDJ連結を含む配列;
    T細胞受容体のDJ連結を含む配列;
    B細胞受容体のDJ連結を含む配列;
    Igスーパーファミリー受容体のVJ連結を含む配列;
    免疫グロブリン遺伝子のVJ連結を含む配列;
    T細胞受容体のVJ連結を含む配列;または
    B細胞受容体のVJ連結を含む配列;
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 段階（ｃ）が、前記第１および第２の対象区間の複数の出現を配列決定することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記クローンプロファイルが、がんに関するクローンプロファイルである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記がんが、血液悪性腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
  16. 第１のＶセグメント、または、第１のＶセグメントおよび第２のＶセグメントに対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 第１のＤセグメント、または、第１のＤセグメントおよび第２のＤセグメントに対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 第１のＪセグメント、または、第１のＪセグメントおよび第２のＪセグメントに対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ＶＤＪまたはＶＪの組み合わせに対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 抗体軽鎖、抗体重鎖、または、抗体軽鎖および抗体重鎖に対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. サブゲノム区間または発現サブゲノム区間における、配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルが提供される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記クローンプロファイルが、
    （ｉ）前記対象区間中の、Ｖ、ＤまたはＪセグメントから選択される遺伝子座における高頻度変異に対する可変性；
    （ｉｉ）前記対象区間中の連結部におけるインデルの形成によって、ＶＤ、ＤＪまたはＶＪ連結部から生じる可変性；または
    （ｉｉｉ）サブゲノム区間中のＣＤＲにおける可変性
    を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第１の対象区間が、Ｖ、ＤまたはＪセグメントを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ベイトセットが、
    （ｉ）Ｖセグメント（ＤまたはＪセグメントではない。）；Ｄセグメント（ＶまたはＪセグメントではない。）；Ｊセグメント（ＶまたはＤセグメントではない。）；Ｖセグメント；Ｄセグメント；またはＪセグメントを捕捉するかまたはそれとハイブリッド形成するよう構成されているか、または
    （ｉｉ）ＶＤ連結部、ＤＪ連結部、ＶＪ連結部、再編成されたＶＤＪ、または、再編成されたＶＪ配列にまたがる、１つまたは複数のベイトを含む、
    請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１つが、前記第１の対象区間に対して第１の反応混合物中、および、前記第２の対象区間に対して第２の反応混合物中で行われる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 段階（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１つが、前記第１の対象区間および前記第２の対象区間に対して、同じ反応混合物中で行われる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ライブラリが、疾患状態組織、癌細胞、固形腫瘍、浸潤固形腫瘍を有するＢ細胞またはＴ細胞、血液悪性腫瘍、無細胞ＤＮＡ、非疾患状態の組織、末梢血、骨髄、腫瘍組織、腫瘍浸潤、リンパ球、Ｂ細胞、末梢Ｂ細胞、プレＢ細胞、成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞、または、腫瘍浸潤細胞から作製される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. （ａ）第１の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること；
    （ｂ）第２の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること
    を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
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