JP2018502563A - 腫瘍試料の多重遺伝子分析 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、ASCII形式で電子出願された配列リストを含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2015年12月3日に作成された前記ASCIIコピーは、F2036−7056WO_SL.txtという名称で、サイズは1,172バイトである。
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書ではライブラリキャッチと呼ばれることがある。)を提供するために、ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば、対象区間の増幅配列を提供するために、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅してもよく;
(d)対象区間の1回以上の出現の配列を得て、それによって対象区間のクローンプロファイルを提供または評価する
ことを含む方法を特徴とする。一実施形態において、段階(a)は、対象からの核酸を断片化する、例えばせん断することを含む。
(e)(i)対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)、存在量または同一性、例えば配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または対象区間での複数の配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部でのインデルの形成による、VD、DJまたはVJ連結、またはCDR、例えば重鎖CDR3から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であって、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である値
を得ることをさらに含む。
i)対象の表現型、例えば疾患状態;または
ii)第2の対象区間での遺伝子型、例えば表1〜9から選択される遺伝子またはMHC遺伝子、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII遺伝子の遺伝子型、
を提供することを含む。
感染因子、例えば、細菌、ウイルス、原生動物または真菌による感染;
疾患のステージ;
障害、例えば癌の遺伝子型の変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性;
疾患または障害の進行、再燃、再発または持続;
疾患に関連する薬剤への事前の曝露;
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応;
対象からのプロテオミクスデータ;
年齢;
性別;
体重;
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置;または
環境的もしくは職業的要因
を含む。
(i)対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Vセグメントを含む対象区間の第1の出現およびVセグメントを含む区間の第2の出現の配列を得ることを含み、この第1および第2の出現は、VD、DJまたはVJ連結部での多様性によって異なるか;または
(ii)第1の対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば第1の対象区間は第1の遺伝子からの配列を含み、第2の対象区間は第2の遺伝子からの配列を含む。
対象区間での配列;
対象区間でのシグネチャー;または
対象区間での対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
対象区間での第2の配列;
対象区間での第2のシグネチャー;または
対象区間での第2の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成する第2のベイトセットとライブラリを接触させることを含む。
対象区間からの異なる配列;
対象区間での異なるシグネチャー;または
対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはこれとハイブリッド形成し、
Xは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である。
対象区間での第1の配列および第2の配列;
対象区間での第1のシグネチャーおよび第2のシグネチャー;または
対象区間での第1の対立遺伝子および第2の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む。
対象区間からの少なくともX個の配列;
対象区間での少なくともX個のシグネチャー;または
対象区間での少なくともX個の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、
Xは、独立に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である。
段階(a)、(b)および(c)のうちの1つが、対象区間の第1の出現および対象区間の第2の出現に対して個別に行われ、例えば段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、第1の出現に対して第1の反応混合物中で、および第2の出現に対して第2の反応混合物中で行われる。
複数のうち第2の出現は発現サブゲノム区間を含み、例えばこの発現サブゲノム区間は、VDJ配列、例えば特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む。
段階(a)、(b)および(c)のうちの少なくとも1つが、対象区間の第1の出現に対しておよび対象区間の第2の出現に対して同じ反応混合物中で行われる。
段階(b)において、対象区間の複数の出現の第1のコピーを第1のベイトセットと接触させ、
段階(b)において、対象区間の第2の出現を第2のベイトセット、例えば、第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる。
予め選択された期間の経過;
障害、例えば癌の遺伝子型変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合は、処置に対する攻撃性または耐性における変化、例えば癌の場合は、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性欠如;または
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性。
(a)染色体DNAから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の選択配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
(i)対象区間での対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、対立遺伝子または複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)対象区間でのシグネチャーの分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、対象区間での、相対的存在量、シグネチャー、または複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値;または
(iii)シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異についての値
を得ることを含む。
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;
段階(a)は(i)を含み、段階(b)は(iii)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;
段階(a)は(ii)を含み、段階(b)は(iii)を含むか;
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(i)を含むか;
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(ii)を含むか;または
段階(a)は(iii)を含み、段階(b)は(iii)を含む。
(a)第1の細胞タイプからの、例えば、第1の細胞タイプから作製された、例えば、第1の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの、例えば、第2の細胞タイプから作製された、例えば、第2の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
(a)第1の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
(a)染色体DNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNA、例えばcDNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
(a)第1の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む。
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む。
疾患状態細胞からの第1の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの第2の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む。
前記ライブラリからのメンバー(またはライブラリキャッチ)からの対象区間に対するリードを得て;
複数のメンバーのそれぞれについて、対象区間内のヌクレオチド位置に対するリードからヌクレオチド値を割り当てること
を含む。
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然変異を呼び出す)ことを含む。
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される第2の対象区間の配列を提供すること
を含む。
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される、第2、第3または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。)
を含む。
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される、第1の、第2の、または少なくともX個のさらなる対象区間のクローンプロファイルを評価すること(Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。);および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表1〜9から選択される、(X+1)番目の対象区間の配列を提供すること
を含む。
(a)第1の細胞タイプからの、例えば第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500以上)の対象区間の配列を提供すること
を含む。
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリ、例えば本明細書中に記載のライブラリを得て;
(b)それぞれが第2の(または続く)対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、このライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、第2の(または続く)対象区間の配列を提供することを含む。
(d)(i)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)(ii)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
(d)(iii)予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記のリードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて突然変異を呼び出す)
ことを含む。
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数のものの各メンバーを増幅することによって、複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)全腕または大きな再編成の判定を可能にすることなどのために染色体上に配置される複数の対象区間の配列を得る
ことを含む方法を特色とする。
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下でライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えばメンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、複数の選択メンバーの各メンバーを増幅し;
(d)サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て
それによって対象を評価すること
を含む方法を特徴とし;
(i)本方法は、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットとライブラリを接触させることを含み;
(ii)本方法は、サブゲノム区間を提供する第1のベイトセットおよび発現サブゲノム区間を提供する第2のベイトセットとライブラリを接触させることを含み;
(iii)ライブラリはゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、本方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(iv)ライブラリはゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、本方法は、発現サブゲノム区間を提供するために第2のベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;または
(v)本方法は、第1の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために第1の反応混合物において、および例えばサブゲノム区間に対応する、第2の対象区間、例えば発現サブゲノム区間を提供するために第2の反応混合物において、段階(a)、(b)および(c)のうち1つを実施することを含む。
(a)複数の標的メンバー、例えば腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを試料、例えば腫瘍試料から得て;
(b)選択メンバー(本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることがある。)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させてもよく;
(c)例えば配列決定法によって、例えば次世代配列決定法で、ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからの対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての、例えば複数の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間または両方)のそれぞれ、例えば複数の遺伝子のそれぞれ、における予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えば、突然変異呼び出し、例えばBayeisan法によるもの)、
それによって前記の試料を分析することを含み:ここで、
(i)X個のヌクレオチド位置のそれぞれを、段階(b)、(c)、(d)または(e)のうち1つまたは組み合わせについて固有の条件のセット下で分析してもよい(ここで、固有とは、他のX−1個の条件のセットとは異なることを意味し、Xは少なくとも2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000である。)。例えば、第1の条件のセット、例えば本明細書中に記載の条件のセットは、例えば第1のサブゲノム区間または遺伝子における第1のヌクレオチド位置に対して使用され、第2の条件のセット、例えば本明細書中に記載の第2の条件のセットは、第2のヌクレオチド位置に対して、例えば第2のサブゲノム区間または遺伝子において使用され;
(ii)そのヌクレオチド位置で起こり得る予め選択された改変、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に反応するX個のヌクレオチド位置のそれぞれについて、ヌクレオチド位置を固有の条件セット下で分析する(ここで、固有とは、他のX−1個の条件のセットとは異なることを意味し、Xは少なくとも(at lest)2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000である。)。例えば、第1の対象区間(サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変化、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位置を第1の条件のセット下で分析し、第2の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)におけるヌクレオチド位置で生じ得る予め選択された変化、例えば突然変異の特徴、例えば本明細書中に記載の特徴に応答して、ヌクレオチド位置を第2の条件のセット下で分析する;
(iii)前記の方法が、少なくとも2、5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)、例えば遺伝子におけるヌクレオチド位置に対する95、98または99%感度または特異性を可能にする条件下で、試料、例えば保存腫瘍試料において行われる;または
(iv)本方法は、
a)約500X以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち5%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
b)約200X以上、例えば、約200X〜約500Xの配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち10%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
c)約10〜100X配列決定デプスを提供するために、例えば、a)異なる薬物を患者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)一塩基多型(SNP)またはb)患者を固有に同定するために使用され得るゲノムSNP(例えばフィンガープリント)から選択される1つ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方、例えばエクソン)を配列決定するために、第3の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること;
d)約5〜50X配列決定デプスを提供するために、例えば構造的限界点、例えばゲノム転座またはインデルを検出するために、第4の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること
例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座/インデルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用し得る;または
e)約0.1〜300X配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検出するために、第5の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を配列決定すること
のうち1つ以上または全てを含む。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態において、配列決定デプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。
第1のベイトセットが第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現区間)に対して使用され、第2のベイトセットが第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用され;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第1のアライメント方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第2のアライメント方法が適用され;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第1の突然変異呼び出し法が適用され、第2の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第2の突然変異呼び出し方法が適用されること
を含む。
第1のベイト条件のセット、第1のアライメント方法および第1の突然変異呼び出し方法で第1のヌクレオチド位置を分析し;
前記の第1のベイト条件のセット、第2のアライメント方法および前記の第1の突然変異呼び出し方法で第2のヌクレオチド位置を分析し;
前記の第1のベイト条件のセット、前記の第1のアライメント方法および第2の突然変異呼び出し方法で第3のヌクレオチド位置を分析し、
他の2つの条件と比較したとき、それぞれが固有の条件下で分析された3個のヌクレオチド位置を提供する。
第1のベイトセットが第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用され、第2のベイトセットが第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対して使用される;
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第1のアライメント方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードに第2のアライメント方法が適用される;または
第1の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第1の突然変異呼び出し方法が適用され、第2の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)のヌクレオチド位置に第2の突然変異呼び出し方法が適用されること
を含む。
(i)変化が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子、予め選択されたまたは変異体または変異体のタイプ、例えば突然変異を特徴とする、または予め選択された頻度の突然変異を特徴とする遺伝子または遺伝子のタイプ、または本明細書中に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子のタイプ;
(ii)変化のタイプ、例えば、置換、挿入、欠失または転座;
(iii)変化について分析している試料のタイプ、例えば、FFPE試料、血液試料または骨髄穿刺試料;
(iv)評価している変化のヌクレオチドの位置にあるかまたはその付近にある配列、例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するミスアライメントについての予想される傾向に影響を与え得る配列、例えばヌクレオジテッド(nucleodited)位置にあるかまたはその付近にある反復配列の存在;
(v)例えば予め選択されたタイプの腫瘍における、変化、例えば突然変異を示す選択された型の腫瘍における突然変異を示すリードを観察する事前(例えば文献)期待値;
(vi)塩基呼び出しエラーのみによる変化を示すリードを観察する確率;または
(vii)変化を検出するために所望される予め選択された配列決定のデプス
が挙げられる。
(i)本方法、例えば上記方法の段階(b)は、本明細書中に記載のベイトセット、例えば、「ベイト」という見出しの下で記載されるようなベイトセットの使用を含むか;
(ii)本方法、例えば上記方法の段階(c)は、対象区間のセットまたは群(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して、または本明細書中に記載の遺伝子のセットもしくは群からリードを得ることを含むか;
(iii)本方法、例えば上記方法の段階(d)は、本明細書中に記載の複数のアライメント方法、例えば「アライメント」という見出しの下で記載される方法の使用を含むか;
(iv)本方法、例えば上記方法の段階(e)は、本明細書中に記載の、ヌクレオチド値を予め選択されたヌクレオチド位置に割り当てるための複数の方法、例えば「突然変異呼び出し」の見出しの下で、または「臨床癌検体の次世代配列決定からの、体細胞ゲノム変化の高感度検出のためのベイジアン法」の題名のセクションに記載の方法の使用を含むか;または
(v)本方法は、本明細書中に記載の対象区間、例えば「遺伝子選択」という題名のセクションで本明細書中に記載のような、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方のセットにヌクレオチド値を割り当てること
を含む。
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法、例えば本明細書中に記載の癌からの腫瘍試料を分析する方法において、性能を最適化するための複数の個別に調整されたアライメント方法またはアルゴリズムの使用を統合し得る。実施形態において、リードを分析するために、異なる遺伝子における多数の変異体のそれぞれに対して個別にカスタマイズまたは調整される複数のアライメント方法を使用する。実施形態において、調整は、配列決定されている遺伝子(または他のサブゲノムイナーバル(inerval))(のうち1つ以上)の機能、試料中の腫瘍タイプ、配列決定されている変異体または試料もしくは対象の特徴であり得る。配列決定しようとする多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して個々に調整されるアライメント条件の選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。
(a)試料からの複数メンバー、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)例えば選択メンバー(本明細書中では「ライブラリキャッチ」と呼ばれることがある。)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択された配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えばライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間、例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法により、例えば突然変異を呼び出すこと)、
それによって前記の腫瘍試料を分析することを含み、
X個の固有の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれからのリードを、固有のアライメント方法でアライメントしてもよく、ここで、固有の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、他のX−1個の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方)とは異なることを意味し、固有のアライメント方法は、他のX−1個のアライメント方法とは異なることを意味し、Xは少なくとも2である。
前記のアライメント方法は、
(i)腫瘍タイプ、例えば前記の試料中の腫瘍タイプ;
(ii)配列決定されている前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)が位置する遺伝子または遺伝子のタイプ、例えば、予め選択されたまたは変異体もしくは変異体のタイプ、例えば突然変異、または予め選択された頻度の突然変異を特徴とする、遺伝子または遺伝子のタイプ;
(iii)分析されている部位(例えばヌクレオチド位置);
(iv)評価されている対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)内の変異体のタイプ、例えば置換;
(v)試料のタイプ、例えば、FFPE試料、血液試料または骨髄穿刺試料;および
(vi)評価されている前記のサブゲノム区間にあるかまたはその付近にある配列、例えば前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するミスアライメントについての予想される傾向、例えば、前記の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)にあるかまたはその付近にある反復配列の存在
のうち1つ以上または全ての関数であるか、それに対応して選択されるかまたはそれに対して最適化される。
予め選択される再編成とアライメントするために予め選択される再編成参照配列を、リードとのアライメントのために選択すること(この実施形態において、参照配列はゲノム再編成と同一ではない。);
前記の予め選択された再編成参照配列とリードを比較する、例えばアライメントすること;
を含むアライメント方法を使用することを含み得る。
第1のパラメータのセット(例えば、第1のマッピングアルゴリズム、または第1の参照配列を用いて)の下でリードの比較、例えばアライメント比較を行い、前記のリードが第1の所定のアライメント基準を満たすか(例えば、このリードを前記の第1の参照配列と、例えば予め選択されたミスマッチ数未満で、アライメントし得るか)否かを判定し;
前記のリードが第1の所定のアライメント基準に合致しない場合、第2のパラメータのセット(例えば、第2のマッピングアルゴリズム、または第2の参照配列を用いて)の下で第2のアライメント比較を行い;
前記のリードが前記の第2の所定の基準と合致するか(例えば、予め選択されたミスマッチ数未満で前記の第2の参照配列とリードをアライメントし得るか)否かを判定してもよい
ことを含み得、
ここで前記の第2のパラメータのセットは、パラメータのセット、例えば前記の第2の参照配列の使用を含み、これは、前記の第1のパラメータのセットと比較して、予め選択された変異体、例えば再編成、例えば挿入、欠失または転座に対するリードとのアライメントの可能性が高くなる。
本明細書中で開示される方法は、配列決定方法、特に、例えば腫瘍試料からの、例えば本明細書中に記載の癌からの、多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大規模並行配列決定に依存する方法において性能を最適化するために、カスタマイズされているかまたは調整されている突然変異呼び出しパラメータの使用を統合し得る。この方法の実施形態において、多数の予め選択された対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対する突然変異呼び出しは、個別にカスタマイズされるか、または微調整される。カスタマイズ化または調整は、本明細書中に記載の因子の1つ以上、例えば、試料中の癌のタイプ、配列決定しようとする対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)が位置する遺伝子、または配列決定しようとする変異体に基づき得る。配列決定しようとする多数の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対して微調整されるアライメント条件のこの選択または使用は、速度、感度および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)に対するリードのアライメントが最適化される場合に特に有効である。
(a)試料からの複数メンバー、例えば試料、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択されたメンバー、例えばライブラリキャッチを提供するために、例えばライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択された配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の呼び出し方法によって、例えば突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析すること
を含む。
固有の呼び出し方法によって、X個の固有の対象区間(サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにおいヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当ててもよく、ここで固有の対象区間(例えば、サブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、他のX−1個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)とは異なることを意味し、固有の呼び出し方法は、他のX−1個の呼び出し方法とは異なることを意味し、Xは少なくとも2である。呼び出し方法は異なり得、それによって、例えば異なるベイジアン事前値(prior value)に依存することにより、固有であり得る。
前記X個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにおける予め選択されたヌクレオチド位置に対して、
(i)タイプXの腫瘍中の前記の予め選択されたヌクレオチド位置に、予め選択された変異体、例えば突然変異を示すリードを観察する先行(例えば文献)期待値であるかまたはそれを表す第1の値;および
(ii)変異体がある頻度(例えば、1%、5%、10%など)で試料中に存在する場合、および/または変異体が存在しない(例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリードで観察される)場合、前記の予め選択されたヌクレオチド位置で前記の予め選択された変異体を示すリードを観察する確率を表す第2の値のセット
を得ること、
前記の値に応答して、第1の値を使用して第2のセット中の値の間で比較を、例えば本明細書中に記載のベイジアン法によって、推測する(例えば、突然変異の存在の事後確率を計算する)ことにより、前記の予め選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する前記のリードからのヌクレオチド値を割り当て(例えば突然変異を呼び出し)、それによって前記の試料を分析すること。
(i)少なくとも10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくもの;
(ii)割り当ての少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500が、例えば予め選択された腫瘍タイプにおける細胞の、5、10または20%未満で予め選択された変異体が存在する確率の関数である第1の値を用いて行われる、(i)の方法の割り当て;
(iii)少なくともX個の予め選択されたヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、このそれぞれが、予め選択されたタイプの腫瘍、例えば前記の試料の腫瘍タイプ中に存在する(他のX−1個の割り当てとは対照的に)固有の確率を有する予め選択された変異体と関連し、X個の割り当てのそれぞれが、(他のX−1個の割り当てとは対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくものであってもよい(X=2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400または500);
(iv)第1および第2のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の第1のヌクレオチド位置で第1の予め選択された変異体が予め選択されたタイプの腫瘍(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)中に存在する可能性が、前記の第2のヌクレオチド位置に第2の予め選択された変異体が存在する可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30または40倍大きく、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1の値および/または第2の値に基づいていてもよいもの;
(v)複数の予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の複数のものが、次の確率範囲のうち1つ以上、例えば少なくとも3、4、5、6、7または全てに入る変異体に対する割り当てを含むこと:
0.01以下;
0.01より大きく0.02以下;
0.02より大きく0.03以下;
0.03より大きく0.04以下;
0.04より大きく0.05以下;
0.05より大きく0.1以下;
0.1より大きく0.2以下;
0.2より大きく0.5以下;
0.5より大きく1.0以下;
1.0より大きく2.0以下;
2.0より大きく5.0以下;
5.0より大きく10.0以下;
10.0より大きく20.0以下;
20.0より大きく50.0以下;および
50より大きく100.0%以下;
ここで確率範囲は、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が予め選択されたタイプの腫瘍(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)において存在する確率または、予め選択されたヌクレオチド位置での予め選択された変異体が腫瘍試料中の細胞、腫瘍試料からのライブラリまたは予め選択されたタイプ(例えば前記の試料の腫瘍タイプ)に対するそのライブラリからのライブラリキャッチの列挙される%で腫瘍中に存在する確率の範囲であり;
ここで、各割り当ては、固有の第1および/または第2の値に基づいてもよい(例えば、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるかまたは、他の挙げられる確率範囲の1つ以上または全てに対する第1のおよび/または第2の値とは対照的に固有である。)。
(vii)第1および第2のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、前記の試料のDNA中の第1の位置での予め選択された変異体の可能性が、前記の試料のDNA中の前記の第2のヌクレオチド位置での予め選択された変異体の可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30または40倍大きく、各割り当てが、(他の割り当てとは対照的に)固有の第1の値および/または第2の値に基づいてもよいこと;
(viii)次のもののうち1つ以上または全てにおいてヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと):
(1)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の1%未満で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(2)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の1〜2%で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(3)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の2%超から3%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(4)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の3%超から4%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(5)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の4%超から5%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(6)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の5%超から10%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(7)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の10%超から20%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(8)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の20%超から40%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;
(9)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の40%超から50%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;または
(10)前記の試料中の細胞、前記の試料からのライブラリ中の核酸またはそのライブラリからのライブラリキャッチ中の核酸の50%超から100%以下で予め選択された変異体が存在する、少なくとも1、2、3、4または5個の予め選択されたヌクレオチド位置;ここで、各割り当てが、固有の第1および/または第2の値に基づくものであってもよい(例えば、列挙される確率範囲での他の割り当てと対照的に固有であるか(例えば1%未満の(i)における範囲)または、他の挙げられている範囲の1つ以上または全てにおける判定に対する第1および/または第2の値とは対照的に固有である。);または
(ix)他のX−1個のヌクレオチド位置での予め選択された変異体に対する可能性と比較した場合に固有である(前記の試料のDNA中に予め選択された変異体が存在する)可能性をそれぞれが独立に有するX個のヌクレオチド位置のそれぞれでヌクレオチド値を割り当てること(例えば突然変異を呼び出すこと)であって、ここでXが、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000以上であり、各割り当てが、(他の割り当てと対照的に)固有の第1および/または第2の値に基づくもの。
前記のX個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれについて閾値を得ることであって、前記の得られたX個の閾値のそれぞれが、他のX−1個の閾値と比較して固有であり、それによりX個の固有の閾値を提供すること;
前記のX個の対象区間(例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれに対して、予め選択されたヌクレオチド位置における予め選択されたヌクレオチド値を有するリードの数の関数である実測値をその固有の閾値と比較し、それによって前記のX個の対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)のそれぞれにその固有の閾値を適用すること;および
前記の比較の結果に応じて、予め選択されたヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当ててもよいことを含み、
ここでXは2以上である。
Xは、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000以上である。
本明細書中に記載の方法は、配列決定しようとする標的核酸の選択のためのベイト、例えば溶液ハイブリダイゼーションでの使用のためのベイトの適切な選択による、1名以上の対象からの、試料、例えば腫瘍試料、例えば本明細書中に記載の癌からの多数の遺伝子および遺伝子産物の最適化配列決定を提供する。予め選択された選択効率を有するベイトセットに従って、様々な対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)またはそのクラスに対する選択効率を適合させる。このセクションで使用される場合、「選択効率」とは、(1つまたは複数の)標的対象区間(例えば、(1つまたは複数の)サブゲノム区間、(1つまたは複数の)発現サブゲノム区間またはその両方)に従って調節されるような配列カバレッジのレベルまたはデプスを指す。
(a)試料からの複数のメンバー(例えば標的メンバー)、例えば腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択メンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供するために、1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させ;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法を用いて、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間、例えばサブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、例えば突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、 本方法は、複数の、例えば少なくとも2、3、4または5個のベイトまたはベイトセットとライブラリを接触させることを含んでいてもよく、前記の複数の各ベイトまたはベイトセットは、(複数における他のベイトと対照的に)固有の、予め選択された選択に対する効率を有する。例えば、各固有のベイトまたはベイトセットは、配列決定の固有のデプスを提供する。本明細書で使用される場合、「ベイトセット」という用語は、1つのベイトまたは複数のベイト分子をまとめて指す。
a)約500X以上の配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち5%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、サブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
b)約200X以上、例えば、約200X〜約500Xの配列決定デプスを提供するために、例えば試料からの細胞のうち10%を超えないもので存在する突然変異を配列決定するために、サブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
c)約10〜100X配列決定デプスを提供するために、例えば、a)異なる薬物を患者が代謝する能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)一塩基多型(SNP)またはb)患者を固有に同定するために使用され得るゲノムSNP(例えばフィンガープリント)から選択される1つ以上のサブゲノム区間(例えばエクソン)を配列決定するためにサブゲノム区間を含む十分なメンバーを選択するベイトセット;
d)約5〜50X配列決定デプスを提供するために、例えば構造限界点、例えばゲノム転座またはインデルなどを検出するために、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む十分なメンバーを選択するベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。このようなベイトセットは、例えば、転座/インデルが起こり易い癌遺伝子を検出するために使用し得るか;または
e)約0.1〜300X配列決定デプスを提供するために、例えばコピー数の変化を検出するために、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む十分なメンバー選択するベイトセット。一実施形態において、配列決定デプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの配列決定デプスの範囲である。他の実施形態において、配列決定デプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。このようなベイトセットは、例えば、増幅/欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
複数のメンバー、例えば、標的核酸メンバー(例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メンバーおよび/またはPGxメンバーを含む。)を含む1つまたは複数のライブラリ(例えば1つまたは複数の核酸ライブラリ)を提供し;
複数のベイト/メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成するために、複数のベイト(例えばオリゴヌクレオチドベイト)と1つまたは複数のライブラリを、例えば溶液ベースの反応において接触させ;
例えば前記のハイブリダイゼーション混合物を、前記の複数のベイト/メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって前記のハイブリダイゼーション混合物から複数のベイト/メンバーハイブリッドを分離し、
それによってライブラリキャッチ(例えば、1つまたは複数のライブラリからの核酸分子の、選択されたまたは濃縮されたサブグループ)を提供すること
を含み、
この複数のベイトは、次のうち2つ以上を含んでいてもよい:
a)低頻度、例えば約5%以下で出現する(すなわち、試料からの細胞のうち5%がそれらのゲノムにおいて変化を保有する。)変化(例えば1つ以上の突然変異)に対する高レベルの感度を可能にするために最大デプスのカバレッジが必要とされる、高レベルの標的(例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を含む1つ以上の腫瘍メンバー、このような遺伝子、エクソンまたは塩基)を選択する第1のベイトセット。一実施形態において、第1のベイトセットは、約500X以上の配列決定デプスを必要とする変化(例えば点突然変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である。)。
d)例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造的限界点を検出するために、低中程度のカバレッジが必要とされる第1のイントロン標的(例えば、イントロン配列を含むメンバー)を選択する第4のベイトセット。例えば、イントロン限界点の検出は、高い検出信頼性を確保するために5〜50Xの配列対スパニングデプスを必要とする。前記の第4のベイトセットは、例えば、転座/インデル傾向のある癌遺伝子を検出するために使用し得;または
e)コピー数の変化を検出する能力を向上させるために低密度のカバレッジが必要とされる第2のイントロン標的(例えばイントロンメンバー)を選択する第5のベイトセット。例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために0.1〜300Xのカバレッジを必要とする。一実施形態において、カバレッジのデプスは、コピー数の変化を検出するために約0.1〜10Xの範囲である。他の実施形態において、カバレッジのデプスは、ゲノムDNAのコピー数の増加/減少またはヘテロ接合性喪失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300Xの範囲である。前記の第5のベイトセットは、例えば、増幅/欠失が起こり易い癌遺伝子を検出するために使用され得る。
(i)第1の予め選択された効率は、少なくとも約500X以上の配列決定デプスである第1の選択効率についての値を有する(例えば、第2、第3、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。(例えば、第2の選択効率についての値よりも約2〜3倍大きく;第3の選択効率についての値よりも約5〜6倍大きく;第4の選択効率についての値よりも約10倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約50〜5000倍大きい。);
(ii)第2の予め選択された効率は、少なくとも約200X以上の配列決定デプスである第2の選択効率についての値を有し、例えば、第3、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する。(例えば、第3の選択効率についての値よりも約2倍大きく;第4の選択効率についての値よりも約4倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約20〜2000倍大きい。);
(iii)第3の予め選択された効率は、少なくとも約100X以上の配列決定デプスである第3の選択効率についての値を有し、例えば、第4または第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する(例えば、第4の選択効率についての値よりも約2倍大きく;第5の選択効率についての値よりも約10〜1000倍大きい。);
(iv)第4の予め選択された効率は、少なくとも約50X以上の配列決定デプスである第4の選択効率についての値を有し、例えば、第5の予め選択された選択効率よりも大きい選択効率についての値を有する(例えば、第5の選択効率についての値よりも約50〜500倍大きい。);または
(v)第5の予め選択された効率は、少なくとも約10X〜0.1X配列決定デプスである第5の選択効率についての値を有する。
(i)異なるベイトセットの差次的な表示−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、より多くの/より少ないコピー数に含まれ得る;
(ii)ベイトセットの差次的な重複(differential overlap)−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、近隣ベイト間のより長いかまたはより短い重複を含み得る;
(iii)差次的ベイトパラメータ−捕捉効率を低下させ、相対的な標的カバレッジのデプスを低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、配列修飾/長さがより短いことを含み得る;
(iv)異なるベイトセットの混合−相対標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比率で混合し得る;
(v)異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットの使用−ある一定の実施形態において、ベイトセットは次のものを含み得る:
(a)1つ以上の化学的に(例えば非酵素的に)合成された(例えば個別に合成された)ベイト、
(b)アレイにおいて合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト;
(d)(a)、(b)および/または(c)の何らかの組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記の何れかの組み合わせ。
(i)同じカテゴリ中の他の標的に対して過小/過剰にカバーされる標的(例えば標的メンバー)のカバレッジを拡大/縮小させるために、ベイト表示または重複を増加/減少させることを使用し得る;
(ii)低カバレッジのために、標的配列(例えば高GC含量配列)を捕捉することが困難である場合、例えば隣接配列(例えばGCリッチ度がより低い隣接配列)をカバーするようにベイトセットで標的化される領域を拡大する;
(iii)ベイトの二次構造を減少させ、その選択効率を高めるために、ベイト配列の修飾をなし得る;
(iv)同じカテゴリ内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、ベイトの長さの変更を使用し得る。(長さが様々なベイトを作製することによって)直接、または(一貫した長さのベイトを作製し、ベイト末端を任意の配列で置き換えることによって)間接的にベイト長を変更し得る;
(v)同じ標的領域(すなわちフォワードおよびリバース鎖)に対して異なる向きのベイトを修飾することで、結合効率が異なり得る。各標的に対して最適のカバレッジを提供する何れかの方向性を有するベイトセットを選択し得る;
(vi)各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ(例えばビオチン)の量を変更することは、その結合効率に影響を及ぼし得る。相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、特定の標的を標的とするベイトのタグレベルを増加/減少させることを使用し得る;
(vii)標的への結合親和性に影響を及ぼし、相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、異なるベイトに対して使用されるヌクレオチドのタイプを変更し得る;または
(viii)高GC含量に対して低いまたは通常のGC含量の領域間での融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、修飾オリゴヌクレオチドベイトを用いること、例えばより安定な塩基対形成を有することを使用し得る。
分析のための予め選択された対象区間、例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方、例えば遺伝子および他の領域のセットまたは群に対するサブゲノム区間の群またはセットが本明細書中で記載される。
(a)試料からの複数メンバー、例えば、血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)、例えば本明細書中に記載の血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)からの腫瘍試料からの複数の腫瘍メンバーを含む1つまたは複数のライブラリを得て;
(b)選択メンバー(例えばライブラリキャッチ)を提供するために、例えば1つまたは複数のライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、予め選択した配列に対して1つまたは複数のライブラリを濃縮してもよく;
(c)例えば配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記のライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーから、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)に対するリードを得て;
(d)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記のリードをアライメントし;
(e)予め選択されたヌクレオチド位置についての前記のリードからヌクレオチド値を割り当て(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法により、突然変異を呼び出し)、それにより前記の腫瘍試料を分析することを含み、
本方法は、試料からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の、表1〜4から選択される、遺伝子または遺伝子産物からの対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)を例えば次世代配列決定法によって配列決定することを含んでいてもよい。
A)表1〜4による突然変異型または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物からの、少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方;
B)腫瘍または癌に関連する遺伝子または遺伝子産物(例えば陽性または陰性処置反応予測因子であるか、陽性または陰性予後因子であるかまたは腫瘍もしくは癌の鑑別診断を可能とするもの、例えば表1〜4による遺伝子または遺伝子産物)からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方);
C)表1〜4から選択される、薬物代謝、薬物反応性または毒性の1つ以上に関連する遺伝子または遺伝子産物(そこでPGx遺伝子とも呼ばれる。)に存在するサブゲノム区間の突然変異型または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば一塩基多型(SNP))からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方);
D)表1〜4から選択される、(i)薬物で処置された癌患者のより良好な生存率(例えばパクリタキセルで処置された乳癌患者のより良好な生存率);(ii)パクリタキセル代謝;(iii)薬物に対する毒性;または(iv)薬物に対する副作用のうち1つ以上に関連する遺伝子または遺伝子産物中に存在する対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)の突然変異型もしくは野生型PGx遺伝子または遺伝子産物(例えば一塩基多型(SNP))からの少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間またはその両方);
E)表1〜4による少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500個、またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化;
F)表1〜4から選択される少なくとも5個の遺伝子または遺伝子産物であって、例えば予め選択された位置での対立遺伝子の多様性が予め選択されたタイプの腫瘍と関連し、前記の対立遺伝子の多様性が、前記の腫瘍タイプにおける細胞の5%未満で存在するもの;
G)GCリッチ領域に埋め込まれている表1〜4から選択される少なくとも5個の遺伝子または遺伝子産物;または
H)癌発症のための遺伝(例えば、生殖系列リスク)要因(例えば、遺伝子または遺伝子産物は表1〜4から選択される。)を示す少なくとも5個の遺伝子または遺伝子産物。
選択された遺伝子または遺伝子産物(本明細書中で「標的遺伝子または遺伝子産物」とも呼ぶ。)は、遺伝子内領域または遺伝子間領域を含む対象区間(例えば、サブゲノム区間、発現サブゲノム区間またはその両方)を含み得る。例えば、対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、エクソンまたはイントロン、またはその断片、典型的にはエクソン配列またはその断片を含み得る。対象区間(例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間)は、コード領域または非コード領域、例えばプロモーター、エンハンサー、5’非翻訳領域(5’UTR)または3’非翻訳領域(3’UTR)またはその断片を含み得る。他の実施形態において、対象区間は、cDNAまたはその断片を含む。他の実施形態において、対象区間は、例えば本明細書中に記載のようなSNPを含む。
2.免疫グロブリン軽鎖に対する遺伝子セグメントを含有する2番染色体上の免疫グロブリンカッパ(κ)遺伝子座(IGK@);
3.免疫グロブリン軽鎖に対する遺伝子セグメントを含有する22番染色体上の免疫グロブリンラムダ(λ)遺伝子座(IGL@)。
IGHV1−2,IGHV1−3,IGHV1−8,IGHV1−12,IGHV1−14,IGHV1−17,IGHV1−18,IGHV1−24,IGHV1−45,IGHV1−46,IGHV1−58,IGHV1−67,IGHV1−68,IGHV1−69,IGHV1−38−4,IGHV1−69−2,IGHV2−5,IGHV2−10,IGHV2−26,IGHV2−70,IGHV3−6,IGHV3−7,IGHV3−9,IGHV3−11,IGHV3−13,IGHV3−15,IGHV3−16,IGHV3−19,IGHV3−20,IGHV3−21,IGHV3−22,IGHV3−23,IGHV3−25,IGHV3−29,IGHV3−30,IGHV3−30−2,IGHV3−30−3,IGHV3−30−5,IGHV3−32,IGHV3−33,IGHV3−33−2,IGHV3−35,IGHV3−36,IGHV3−37,IGHV3−38,IGHV3−41,IGHV3−42,IGHV3−43,IGHV3−47,IGHV3−48,IGHV3−49,IGHV3−50,IGHV3−52,IGHV3−53,IGHV3−54,IGHV3−57,IGHV3−60,IGHV3−62,IGHV3−63,IGHV3−64,IGHV3−65,IGHV3−66,IGHV3−71,IGHV3−72,IGHV3−73,IGHV3−74,IGHV3−75,IGHV3−76,IGHV3−79,IGHV3−38−3,IGHV3−69−1,IGHV4−4,IGHV4−28,IGHV4−30−1,IGHV4−30−2,IGHV4−30−4,IGHV4−31,IGHV4−34,IGHV4−39,IGHV4−55,IGHV4−59,IGHV4−61,IGHV4−80,IGHV4−38−2,IGHV5−51,IGHV5−78,IGHV5−10−1,IGHV6−1,IGHV7−4−1,IGHV7−27,IGHV7−34−1,IGHV7−40,IGHV7−56,IGHV7−81,IGHVII−1−1,IGHVII−15−1,IGHVII−20−1,IGHVII−22−1,IGHVII−26−2,IGHVII−28−1,IGHVII−30−1,IGHVII−31−1,IGHVII−33−1,IGHVII−40−1,IGHVII−43−1,IGHVII−44−2,IGHVII−46−1,IGHVII−49−1,IGHVII−51−2,IGHVII−53−1,IGHVII−60−1,IGHVII−62−1,IGHVII−65−1,IGHVII−67−1,IGHVII−74−1,IGHVII−78−1,IGHVIII−2−1,IGHVIII−5−1,IGHVIII−5−2,IGHVIII−11−1,IGHVIII−13−1,IGHVIII−16−1,IGHVIII−22−2,IGHVIII−25−1,IGHVIII−26−1,IGHVIII−38−1,IGHVIII−44,IGHVIII−47−1,IGHVIII−51−1,IGHVIII−67−2,IGHVIII−67−3,IGHVIII−67−4,IGHVIII−76−1,IGHVIII−82,IGHVIV−44−1,IGHD1−1,IGHD1−7,IGHD1−14,IGHD1−20,IGHD1−26,IGHD2−2,IGHD2−8,IGHD2−15,IGHD2−21,IGHD3−3,IGHD3−9,IGHD3−10,IGHD3−16,IGHD3−22,IGHD4−4,IGHD4−11,IGHD4−17,IGHD4−23,IGHD5−5,IGHD5−12,IGHD5−18,IGHD5−24,IGHD6−6,IGHD6−13,IGHD6−19,IGHD6−25,IGHD7−27,IGHJ1,IGHJ1P,IGHJ2,IGHJ2P,IGHJ3,IGHJ3P,IGHJ4,IGHJ5,IGHJ6,IGHA1,IGHA2,IGHG1,IGHG2,IGHG3,IGHG4,IGHGP,IGHD,IGHE,IGHEP1,IGHM,およびIGHV1−69D
が挙げられるが限定されない。
IGKV1−5,IGKV1−6,IGKV1−8,IGKV1−9,IGKV1−12,IGKV1−13,IGKV1−16,IGKV1−17,IGKV1−22,IGKV1−27,IGKV1−32,IGKV1−33,IGKV1−35,IGKV1−37,IGKV1−39,IGKV1D−8,IGKV1D−12,IGKV1D−13,IGKV1D−16 IGKV1D−17,IGKV1D−22,IGKV1D−27,IGKV1D−32,IGKV1D−33,IGKV1D−35,IGKV1D−37,IGKV1D−39,IGKV1D−42,IGKV1D−43,IGKV2−4,IGKV2−10,IGKV2−14,IGKV2−18,IGKV2−19,IGKV2−23,IGKV2−24,IGKV2−26,IGKV2−28,IGKV2−29,IGKV2−30,IGKV2−36,IGKV2−38,IGKV2−40,IGKV2D−10,IGKV2D−14,IGKV2D−18,IGKV2D−19,IGKV2D−23,IGKV2D−24,IGKV2D−26,IGKV2D−28,IGKV2D−29,IGKV2D−30,IGKV2D−36,IGKV2D−38,IGKV2D−40,IGKV3−7,IGKV3−11,IGKV3−15,IGKV3−20,IGKV3−25,IGKV3−31,IGKV3−34,IGKV3D−7,IGKV3D−11,IGKV3D−15,IGKV3D−20,IGKV3D−25,IGKV3D−31.IGKV3D−34,IGKV4−1,IGKV5−2,IGKV6−21,IGKV6D−21,IGKV6D−41,IGKV7−3,IGKJ1,IGKJ2,IGKJ3,IGKJ4,IGKJ5,およびIGKC
が挙げられるが限定されない。
IGLV1−36,IGLV1−40,IGLV1−41,IGLV1−44,IGLV1−47,IGLV1−50,IGLV1−51,IGLV1−62,IGLV2−5,IGLV2−8,IGLV2−11,IGLV2−14,IGLV2−18,IGLV2−23,IGLV2−28,IGLV2−33,IGLV2−34,IGLV3−1,IGLV3−2,IGLV3−4,IGLV3−6,IGLV3−7,IGLV3−9,IGLV3−10,IGLV3−12,IGLV3−13,IGLV3−15,IGLV3−16,IGLV3−17,IGLV3−19,IGLV3−21,IGLV3−22,IGLV3−24,IGLV3−25,IGLV3−26,IGLV3−27,IGLV3−29,IGLV3−30,IGLV3−31,IGLV3−32,IGLV4−3,IGLV4−60,IGLV4−69,IGLV5−37,IGLV5−39,IGLV5−45,IGLV5−48,IGLV5−52,IGLV6−57,IGLV7−35,IGLV7−43,IGLV7−46,IGLV8−61,IGLV9−49,IGLV10−54,IGLV10−67,IGLV11−55,IGLVI−20,IGLVI−38,IGLVI−42,IGLVI−56,IGLVI−63,IGLVI−68,IGLVI−70,IGLVIV−53,IGLVIV−59,IGLVIV−64,IGLVIV−65,IGLVIV−66−1,IGLVV−58,IGLVV−66,IGLVVI−22−1,IGLVVI−25−1,IGLVVII−41−1,IGLJ1,IGLJ2,IGLJ3,IGLJ4,IGLJ5,IGLJ6,IGLJ7,IGLC1,IGLC2,IGLC3,IGLC4,IGLC5,IGLC6,およびIGLC7
が挙げられるが限定されない。
TRAV1−1,TRAV1−2,TRAV2,TRAV3,TRAV4,TRAV5,TRAV6,TRAV7,TRAV8−1,TRAV8−2,TRAV8−3,TRAV8−4,TRAV8−5,TRAV8−6,TRAV8−7,TRAV9−1,TRAV9−2,TRAV10,TRAV11,TRAV12−1,TRAV12−2,TRAV12−3,TRAV13−1,TRAV13−2,TRAV14DV4,TRAV15,TRAV16,TRAV17,TRAV18,TRAV19,TRAV20,TRAV21,TRAV22,TRAV23DV6,TRAV24,TRAV25,TRAV26−1,TRAV26−2,TRAV27,TRAV28,TRAV29DV5,TRAV30,TRAV31,TRAV32,TRAV33,TRAV34,TRAV35,TRAV36DV7,TRAV37,TRAV38−1,TRAV38−2DV8,TRAV39,TRAV40,TRAV41,TRAJ1,TRAJ2,TRAJ3,TRAJ4,TRAJ5,TRAJ6,TRAJ7,TRAJ8,TRAJ9,TRAJ10,TRAJ11,TRAJ12,TRAJ13,TRAJ14,TRAJ15,TRAJ16,TRAJ17,TRAJ18,TRAJ19,TRAJ20,TRAJ21,TRAJ22,TRAJ23,TRAJ24,TRAJ25,TRAJ26,TRAJ27,TRAJ28,TRAJ29,TRAJ30,TRAJ31,TRAJ32,TRAJ33,TRAJ34,TRAJ35,TRAJ36,TRAJ37,TRAJ38,TRAJ39,TRAJ40,TRAJ41,TRAJ42,TRAJ43,TRAJ44,TRAJ45,TRAJ46,TRAJ47,TRAJ48,TRAJ49,TRAJ50,TRAJ51,TRAJ52,TRAJ53,TRAJ54,TRAJ55,TRAJ56,TRAJ57,TRAJ58,TRAJ59,TRAJ60,TRAJ61,およびTRAC
が挙げられるが限定されない。
TRBV1,TRBV2,TRBV3−1,TRBV3−2,TRBV4−1,TRBV4−2,TRBV4−3,TRBV5−1,TRBV5−2,TRBV5−3,TRBV5−4,TRBV5−5,TRBV5−6,TRBV5−7,TRBV6−2,TRBV6−3,TRBV6−4,TRBV6−5,TRBV6−6,TRBV6−7,TRBV6−8,TRBV6−9,TRBV7−1,TRBV7−2,TRBV7−3,TRBV7−4,TRBV7−5,TRBV7−6,TRBV7−7,TRBV7−8,TRBV7−9,TRBV8−1,TRBV8−2,TRBV9,TRBV10−1,TRBV10−2,TRBV10−3,TRBV11−1,TRBV11−2,TRBV11−3,TRBV12−1,TRBV12−2,TRBV12−3,TRBV12−4,TRBV12−5,TRBV13,TRBV14,TRBV15,TRBV16,TRBV17,TRBV18,TRBV19,TRBV20−1,TRBV21−1,TRBV22−1,TRBV23−1,TRBV24−1,TRBV25−1,TRBV26,TRBV27,TRBV28,TRBV29−1,TRBV30,TRBVA,TRBVB,TRBV5−8,TRBV6−1,TRBD1,TRBD2,TRBJ1−1,TRBJ1−2,TRBJ1−3,TRBJ1−4,TRBJ1−5,TRBJ1−6,TRBJ2−1,TRBJ2−2,TRBJ2−2P,TRBJ2−3,TRBJ2−4,TRBJ2−5,TRBJ2−6,TRBJ2−7,TRBC1,およびTRBC2
が挙げられるが限定されない。
TRDV1,TRDV2,TRDV3,TRDD1,TRDD2,TRDD3,TRDJ1,TRDJ2,TRDJ3,TRDJ4,およびTRDC
が挙げられるが限定されない。
TRGV1,TRGV2,TRGV3,TRGV4,TRGV5,TRGV5P,TRGV6,TRGV7,TRGV8,TRGV9,TRGV10,TRGV11,TRGVA,TRGVB,TRGJ1,TRGJ2,TRGJP,TRGJP1,TRGJP2,TRGC1,およびTRGC2
が挙げられるが限定されない。
ABL1,ACTB,AKT1,AKT2,AKT3,ALK,AMER1(FAM123BまたはWTX),APC,APH1A,AR,ARAF,ARFRP1,ARHGAP26(GRAF)ARID1A,ARID2,ASMTL,ASXL1,ATM,ATR,ATRX,AURKA,AURKB,AXIN1,AXL,B2M,BAP1,BARD1,BCL10,BCL11B,BCL2,BCL2L2,BCL6,BCL7A,BCOR,BCORL1,BIRC3,BLM,BRAF,BRCA1,BRCA2,BRD4,BRIP1(BACH1),BRSK1,BTG2,BTK,BTLA,c11または,f30(EMSY),CAD,CARD11,CBFB,CBL,CCND1,CCND2,CCND3,CCNE1,CCT6B,CD22,CD274,(PDL1),CD36,CD58,CD70,CD79A,CD79B,CDC73,CDH1,CDK12,CDK4,CDK6,CDK8,CDKN1B,CDKN2A,CDKN2B,CDKN2C,CEBPA,CHD2,CHEK1,CHEK2,CIC,CIITA,CKS1B,CPS1,CREBBP,CRKL,CRLF2,CSF1R,CSF3R,CTCF,CTNNA1,CTNNB1,CUX1,CXCR4,DAXX,DDR2,DDX3X,DNM2,DNMT3A,DOT1L,DTX1,DUSP2,DUSP9,EBF1,ECT2L,EED,EGFR,ELP2,EP300,EPHA3,EPHA5,EPHA7,EPHB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4,ERG,ESR1,ETS1,ETV6,EXOSC6,EZH2,FAF1,FAM46C,FANCA,FANCC,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCG,FANCL,FAS(TNFRSF6),FBXO11,FBXO31,FBXW7,FGF10,FGF14,FGF19,FGF23,FGF3,FGF4,FGF6,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4,FHIT,FLCN,FLT1,FLT3,FLT4,FLYWCH1,FOXL2,FOXO1,FOXO3,FOXP1,FRS2,GADD45B,GATA1,GATA2,GATA3,GID4(C17orf39),GNA11,GNA12,GNA13,GNAQ,GNAS,GPR124,GRIN2A,GSK3B,GTSE1,HDAC1,HDAC4,HDAC7,HGF,HIST1H1C,HIST1H1D,HIST1H1E,HIST1H2AC,HIST1H2AG,HIST1H2AL,HIST1H2AM,HIST1H2BC,HIST1H2BJ,HIST1H2BK,HIST1H2BO,HIST1H3B,HNF1A,HRAS,HSP90AA1,ICK,ID3,IDH1,IDH2,IGF1R,IKBKE,IKZF1,IKZF2,IKZF3,IL7R,INHBA,INPP4B,INPP5D(SHIP),IRF1,IRF4,IRF8,IRS2,JAK1,JAK2,JAK3,JARID2,JUN,KAT6A(MYST3),KDM2B,KDM4C,KDM5A,KDM5C,KDM6A,KDR,KEAP1,KIT,KLHL6,KMT2A(MLL),KMT2B(MLL2),KMT2C(MLL3),KRAS,LEF1,LRP1B,LRRK2,MAF,MAFB,MAGED1,MALT1,MAP2K1,MAP2K2,MAP2K4,MAP3K1,MAP3K14,MAP3K6,MAP3K7,MAPK1,MCL1,MDM2,MDM4,MED12,MEF2B,MEF2C,MEN1,MET,MIB1,MITF,MKI67,MLH1,MPL,MRE11A,MSH2,MSH3,MSH6,MTOR,MUTYH,MYC,MYCL(MYCL1),MYCN,MYD88,MYO18A,NCOR2,NCSTN,NF1,NF2,NFE2L2,NFKBIA,NKX2−1,NOD1,NOTCH1,NOTCH2,NPM1,NRAS,NT5C2,NTRK1,NTRK2,NTRK3,NUP93,NUP98,P2RY8,PAG1,PAK3,PALB2,PASK,PAX5,PBRM1,PC,PCBP1,PCLO,PDCD1,PDCD11,PDCD1LG2(PDL2),PDGFRA,PDGFRB,PDK1,PHF6,PIK3CA,PIK3CG,PIK3R1,PIK3R2,PIM1,PLCG2,POT1,PPP2R1A,PRDM1,PRKAR1A,PRKDC,PRSS8,PTCH1,PTEN,PTPN11,PTPN2,PTPN6(SHP−1),PTPRO,RAD21,RAD50,RAD51,RAF1,RARA,RASGEF1A,RB1,RELN,RET,RHOA,RICTOR,RNF43,ROS1,RPTOR,RUNX1,S1PR2,SDHA,SDHB,SDHC,SDHD,SERP2,SETBP1,SETD2,SF3B1,SGK1,SMAD2,SMAD4,SMARCA1,SMARCA4,SMARCB1,SMC1A,SMC3,SMO,SOCS1,SOCS2,SOCS3,SOX10,SOX2,SPEN,SPOP,SRC,SRSF2,STAG2,STAT3,STAT4,STAT5A,STAT5B,STAT6,STK11,SUFU,SUZ12,TAF1,TBL1XR1,TCF3,TCL1A,TET2,TGFBR2,TLL2,TMEM30A,TMSB4XP8(TMSL3),TNFAIP3,TNFRSF11A,TNFRSF14,TNFRSF17,TOP1,TP53,TP63,TRAF2,TRAF3,TRAF5,TSC1,TSC2,TSHR,TUSC3,TYK2,U2AF1,U2AF2,VHL,WDR90,WHSC1(MMSET,または,NSD2),WISP3,WT1,XBP1,XPO1,YY1AP1,ZMYM3,ZNF217,ZNF24(ZSCAN3),ZNF703,またはZRSR2
が挙げられるが限定されない。
ALK,BCL6,BRAF,CRLF2,EPOR,ETV4,ETV6,FGFR2,IGK,BCL2,BCR,CCND1,EGFR,ETV1,ETV5,EWSR1,IGH,IGL,JAK1,KMT2A,(MLL),NTRK1,PDGFRB,RARA,ROS1,TRG,JAK2,MYC,PDGFRA,RAF1,RET,またはTMPRSS2
が挙げられるが限定されない。
ABI1,CBFA2T3,EIF4A2,FUS,JAK1,MUC1,PBX1,RNF213,TET1,ABL1,CBFB,ELF4,GAS7,JAK2,MYB,PCM1,ROS1,TFE3,ABL2,CBL,ELL,GLI1,JAK3,MYC,PCSK7,RPL22,TFG,ACSL6,CCND1,ELN,GMPS,JAZF1,MYH11,PDCD1LG2(PDL2),RPN1,TFPT,AFF1,CCND2,EML4,GPHN,KAT6A(MYST3),MYH9,PDE4DIP,RUNX1,TFRC,AFF4,CCND3,EP300,HERPUD1,KDSR,NACA,PDGFB,RUNX1T1(ETO),TLX1,ALK,CD274(PDL1),EPOR,HEY1,KIF5B,NBEAP1(BCL8),PDGFRA,RUNX2,TLX3,ARHGAP26(GRAF),CDK6,EPS15,HIP1,KMT2A(MLL),NCOA2,PDGFRB,SEC31A,TMPRSS2,ARHGEF12,CDX2,ERBB2,HIST1H4I,LASP1,NDRG1,PER1,SEPT5,TNFRSF11A,ARID1A,CHIC2,ERG,HLF,LCP1,NF1,PHF1,SEPT6,TOP1,ARNT,CHN1,ETS1,HMGA1,LMO1,NF2,PICALM,SEPT9,TP63,ASXL1,CIC,ETV1,HMGA2,LMO2,NFKB2,PIM1,SET,TPM3,ATF1,CIITA,ETV4,HOXA11,LPP,NIN,PLAG1,SH3GL1,TPM4,ATG5,CLP1,ETV5,HOXA13,LYL1,NOTCH1,PML,SLC1A2,TRIM24,ATIC,CLTC,ETV6,HOXA3,MAF,NPM1,POU2AF1,SNX29(RUNDC2A),TRIP11,BCL10,CLTCL1,EWSR1,HOXA9,MAFB,NR4A3,PPP1CB,SRSF3,TTL,BCL11A,CNTRL(CEP110),FCGR2B,HOXC11,MALT1,NSD1,PRDM1,SS18,TYK2,BCL11B,COL1A1,FCRL4,HOXC13,MDS2,NTRK1,PRDM16,SSX1,USP6,BCL2,CREB3L1,FEV,HOXD11,MECOM,NTRK2,PRRX1,SSX2,WHSC1(MMSET,または,NSD2),BCL3,CREB3L2,FGFR1,HOXD13,MKL1,NTRK3,PSIP1,SSX4,WHSC1L1,BCL6,CREBBP,FGFR1OP,HSP90AA1,MLF1,NUMA1,PTCH1,STAT6,YPEL5,BCL7A,CRLF2,FGFR2,HSP90AB1,MLLT1(ENL),NUP214,PTK7,STL,ZBTB16,BCL9,CSF1,FGFR3,IGH,MLLT10(AF10),NUP98,RABEP1,SYK,ZMYM2,BCOR,CTNNB1,FLI1,IGK,MLLT3,NUTM2A,RAF1,TAF15,ZNF384,BCR,DDIT3,FNBP1,IGL,MLLT4,(AF6),OMD,RALGDS,TAL1,ZNF521,BIRC3,DDX10,FOXO1,IKZF1,MLLT6,P2RY8,RAP1GDS1,TAL2,BRAF,DDX6,FOXO3,IL21R,MN1,PAFAH1B2,RARA,TBL1XR1,BTG1,DEK,FOXO4,IL3,MNX1,PAX3,RBM15,TCF3(E2A),CAMTA1,DUSP22,FOXP1,IRF4,MSI2,PAX5,RET,TCL1A(TCL1),CARS,EGFR,FSTL3,ITK,MSN,PAX7,RHOH,またはTEC
が挙げられるが限定されない。
転移性結腸癌におけるKRAS G13D
乳癌におけるERBB2増幅
非小細胞肺癌におけるEGFR L858R
カテゴリB:特定の実験的治療に対する包含または除外基準である変化
結腸癌、肺癌または乳癌におけるKRAS G13D
黒色腫、結腸癌または肺癌におけるBRAF V600E
黒色腫におけるNRAS Q61K
乳癌におけるPIK3CA H1047R
乳癌におけるFGFR1増幅
乳癌におけるPTEN二対立遺伝子不活性化
乳癌または膵臓癌におけるBRCA1二対立遺伝子不活性化
カテゴリC:標準的または実験的治療に対する感度または耐性を予測する証拠が限定的な変化(初期臨床データ、相反する臨床データ、前臨床データ、理論)
結腸癌におけるKRAS Q61H(初期臨床データ)
乳癌におけるPIK3CA H1047R(相反する臨床データ)
結腸癌におけるBRAF V600E(相反する臨床データ)
肺癌におけるERBB2突然変異または増幅(症例報告)
肺癌におけるBRAF D594G(前臨床)
乳癌におけるFGFR1増幅(前臨床)
乳癌におけるATM二対立遺伝子不活性化(前臨床)
結腸癌におけるTSC1二対立遺伝子不活性化(前臨床)
乳癌におけるATR二対立遺伝子不活性化(理論)
肉腫におけるBRAF V600E突然変異(理論)
カテゴリD:癌の特定のサブタイプにおける予後または診断有用性がある変化
結腸癌におけるMSH2二対立遺伝子不活性化(強力な臨床的証拠)
結腸癌におけるBRAF V600E(強力な臨床的証拠)
肺癌におけるKRAS G13D(強力な臨床的証拠)
乳癌におけるBRCA1の不活性化(強力な臨床的証拠)
カテゴリE:明確な臨床的意義のない、癌における明確な生物学的意義の変化(すなわちドライバー変異)
結腸癌におけるAPC二対立遺伝子不活性化
乳癌におけるTP53二対立遺伝子不活性化
黒色腫におけるMITF増幅
卵巣癌におけるARID1A
カテゴリF:癌における既知の生物学的意義のない変化
既知の癌遺伝子における新規変化
治療標的
既知の癌遺伝子の相同分子種
(i)核酸試料のフィンガープリントを行うこと;
(ii)核酸試料中の遺伝子または遺伝子産物(例えば本明細書中に記載のような遺伝子または遺伝子産物)の存在量を定量すること;
(iii)試料中の転写産物の相対的存在量を定量すること;
(iv)核酸試料を特定の対象(例えば正常対照または癌患者)に属するものとして同定すること;
(v)核酸試料中の遺伝的形質(例えば1つ以上の対象の遺伝的性質(例えば、民族性、人種、家族の特徴))を同定すること;
(vi)核酸試料中の倍数性を決定し;核酸試料中のヘテロ接合性の喪失を判定すること;
(vii)核酸試料中の遺伝子重複事象の有無を判定すること;
(viii)核酸試料中の遺伝子増幅事象の有無を判定すること;または
(ix)核酸試料中の腫瘍/正常細胞混合のレベルを決定すること。
様々な組織試料が、本方法で使用される核酸試料の供給源となり得る。対象の試料(例えば、腫瘍試料、正常隣接組織(NAT)、血液試料、循環腫瘍細胞(CTC)を含有する試料または何らかの正常な対照)から、ゲノムまたはサブゲノム核酸(例えばDNAまたはRNA)を単離し得る。ある一定の実施形態において、組織試料は、凍結試料として、またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)組織標本として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えば、FFPEブロックまたは凍結試料中で包埋され得る。ある一定の実施形態において、組織試料は血液試料である。他の実施形態において、組織試料は、骨髄穿刺(BMA)試料である。単離段階は、個々の染色体のフローソーティング;および/または対象の試料(例えば、腫瘍試料、NAT、血液試料)を顕微解剖することを含み得る。
ベイトは、ハイブリッド形成し得(例えば相補的であり得る)、それにより標的核酸の捕捉を可能とする核酸分子、例えばDNAまたはRNA分子であり得る。ある一定の実施形態において、標的核酸は、ゲノムDNA分子である。他の実施形態において、標的核酸は、RNA分子またはRNA分子由来のcDNA分子である。一実施形態において、ベイトはRNA分子である。他の実施形態において、ベイトは、例えば、結合実体への結合による、ベイトおよびベイトに対してハイブリッド形成する核酸によって形成されるハイブリッドの捕捉および分離を可能にする、結合実体、例えば親和性タグを含む。一実施形態において、ベイトは溶液相ハイブリダイゼーションに適している。
ベイトは、何らかのタイプのオリゴヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAであり得る。DNAまたはRNAベイト(「オリゴベイト」)は、個々に合成し得るか、またはDNAもしくはRNAベイトセットとしてアレイで合成し得る(「アレイベイト」)。オリゴベイトは、アレイ方式で提供されるかまたは単離オリゴとして提供されるかにかかわらず、一般的には1本鎖である。ベイトは、本明細書中に記載のような結合実体(例えば、ビオチン分子などの捕捉タグ)をさらに含み得る。結合実体、例えばビオチン分子は、ベイトに、例えばベイトの5’−、3’−末端、一般的にはベイトの5’−末端に付着させ得る。ベイトセットは、例えば、国際公開第2012/092426号パンフレットに記載のような、当技術分野で記載の方法によって合成され得る。
本発明で特徴となる方法は、選択されたライブラリキャッチを提供するために、ライブラリ(例えば核酸ライブラリ)を複数のベイトと接触させる段階を含む。接触段階は溶液ハイブリダイゼーションで行われ得る。ある一定の実施形態において、本方法は、1回以上のさらなる溶液ハイブリダイゼーションによってハイブリダイゼーション段階を繰り返すことを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、同じまたは異なるベイト収集物を用いた1回以上のさらなる溶液ハイブリダイゼーションにライブラリキャッチを供することをさらに含む。本明細書における方法での使用に適合させ得るハイブリダイゼーション法は、例えば、国際公開第2012/092426号パンフレットに記載のように、当技術分野で記載されている。
i)核酸試料のフィンガープリントを行うこと;
ii)核酸試料中の遺伝子または遺伝子産物(例えば本明細書中に記載のような遺伝子または遺伝子産物)の存在量を定量すること(例えば試料中の転写産物の相対的存在量を定量すること);
iii)核酸試料を特定の対象(例えば、正常対照または癌患者)に属するものとして同定すること;
iv)核酸試料中の遺伝的形質(例えば1つ以上の対象の遺伝的性質(例えば、民族性、人種、家族の特徴))を同定すること;
v)核酸試料中の倍数性を決定すること;核酸試料中のヘテロ接合性の喪失を判定すること;
vi)核酸試料中の遺伝子重複事象の有無を判定すること;
vii)核酸試料中の遺伝子増幅事象の有無を判定すること;または
viii)核酸試料中の腫瘍/正常細胞混合のレベルを決定すること。
(i)異なるベイトセットの差次的な表示−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、より多くの/より少ないコピー数に含まれ得る;
(ii)ベイトセットの差次的な重複(differential overlap)−相対的な標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、近隣ベイト間のより長いかまたはより短い重複を含み得る;
(iii)差次的ベイトパラメータ−捕捉効率を低下させ、相対的な標的カバレッジのデプスを低下させるために、所与の標的(例えば標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計は、配列修飾/長さがより短いことを含み得る;
(iv)異なるベイトセットの混合−相対標的カバレッジのデプスを増強/低下させるために、異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比率で混合し得る;
(v)異なるタイプのオリゴヌクレオチドベイトセットの使用−ある一定の実施形態において、ベイトセットは次のものを含み得る:
(a)1つ以上の化学的に(例えば、非酵素的に)合成された(例えば個別に合成された)ベイト、
(b)アレイにおいて合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト;
(d)(a)、(b)および/または(c)の何らかの組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば天然または非天然のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記の何れかの組み合わせ。
(i)同じカテゴリ中の他の標的に対して過小/過剰にカバーされる標的(例えば標的メンバー)のカバレッジを拡大/縮小させるために、ベイト表示または重複を増加/減少させることを使用し得る;
(ii)低カバレッジのために、標的配列(例えば高GC含量配列)を捕捉することが困難である場合、例えば隣接配列(例えばGCリッチ度がより低い隣接配列)をカバーするようにベイトセットで標的化される領域を拡大する;
(iii)ベイトの二次構造を減少させ、その選択効率を高めるために、ベイト配列の修飾をなし得る;
(iv)同じカテゴリ内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、ベイトの長さの変更を使用し得る。(長さが様々なベイトを作製することによって)直接、または(一貫した長さのベイトを作製し、ベイト末端を任意の配列で置き換えることによって)間接的にベイト長を変更し得る;
(v)同じ標的領域(すなわちフォワードおよびリバース鎖)に対して異なる向きのベイトを修飾することで、結合効率が異なり得る。各標的に対して最適のカバレッジを提供する何れかの方向性を有するベイトセットを選択し得る;
(vi)各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ(例えばビオチン)の量を変更することは、その結合効率に影響を及ぼし得る。相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、特定の標的を標的とするベイトのタグレベルを増加/減少させることを使用し得る;
(vii)標的への結合親和性に影響を及ぼし、相対標的カバレッジを拡大/縮小させるために、異なるベイトに対して使用されるヌクレオチドのタイプを変更し得る;または
(viii)高GC含量に対して低いまたは通常のGC含量の領域間での融解ハイブリダイゼーション速度を等しくするために、修飾オリゴヌクレオチドベイトを用いること、例えばより安定な塩基対形成を有することを使用し得る。
本発明はまた、核酸を配列決定する方法も含む。これらの方法において、核酸ライブラリメンバーは、例えば、溶液ハイブリダイゼーションを用いて本明細書中に記載の方法を使用することによって単離され、それによりライブラリキャッチを提供する。ライブラリキャッチまたはそのサブグループの配列決定を行い得る。したがって、本発明の特色とされる方法は、ライブラリキャッチを分析することをさらに含む。一実施形態において、ライブラリキャッチは、配列決定方法、例えば、本明細書中に記載のような次世代配列決定方法によって分析される。本方法は、溶液ハイブリダイゼーションによってライブラリキャッチを単離し、核酸配列決定にそのライブラリキャッチを供することを含む。ある一定の実施形態において、ライブラリキャッチを再配列決定し得る。
アライメントとは、リードをある位置、例えばゲノムの位置と適合させる工程である。ミスアライメント(例えば、ゲノム中の正しくない位置での短いリードからの塩基対の配置)、例えば、実際の癌突然変異の周辺のリードの配列状況(例えば反復配列の存在)によるミスアライメントは、代替対立遺伝子のリードが、代替対立遺伝子リードの主な集積を回避し得るので、突然変異検出の感度低下につながり得る。実際の突然変異が存在しない場合に問題のある配列状況が生じる場合、ミスアライメントは、参照ゲノム塩基の実際のリードを誤った位置に配置することにより、「突然変異が起こる」対立遺伝子のアーチファクトのリードを導入し得る。増加した多重遺伝子分析のための突然変異呼び出しアルゴリズムは、存在量が少ない突然変異に対しても高感度であるべきなので、これらのミスアライメントは偽陽性発見率を増加させ/特異性を減少させ得る。
塩基呼び出しとは配列決定装置の生の結果を指す。突然変異呼び出しは、配列決定されているヌクレオチド位置についてヌクレオチド値、例えばA、G、TまたはCを選択する工程を指す。典型的には、ある位置に対する配列決定リード(または塩基呼び出し)は、複数の値を提供し、例えば一部のリードはTを与え、一部はGを与える。突然変異呼び出しは、ヌクレオチド値、例えばこれらの値のうち1つを配列に割り当てる工程である。これは「突然変異」呼び出しと呼ばれるが、何らかのヌクレオチド位置、例えば突然変異体対立遺伝子、野生型対立遺伝子、突然変異体または野生型の何れとも特徴付けられていない対立遺伝子に対応する位置に、または可変性を特徴としない位置に、ヌクレオチド値を割り当てるためにこれを適用し得る。突然変異呼び出しのための方法は、次のうち1つ以上を含み得る:参照配列における各位置での情報に基づいて独立呼び出しを生成すること(例えば配列リードを調べること;塩基呼び出しおよび品質スコアを調べること;可能性のある遺伝子型を考慮し、観察される塩基および品質スコアの確率を計算すること;および(例えばベイズ規則を使用して)遺伝子型を割り当てること);偽陽性を除去すること(例えば、リードデプスが予想よりもかなり低いかまたは高いSNPを拒絶するためにデプス閾値を使用すること;小さなインデルに起因する偽陽性を除去するための局所的な再アライメント);および呼び出しを改良するための連鎖不均衡(LD)/インピュテーションに基づく分析を行うこと。
本明細書中に記載の方法の実施形態において、本方法における下流の段階またはパラメータを修正するために、本方法における段階またはパラメータを使用する。
予め選択されたデータベース、例えば検証されたTGAのデータベースにおいて前記のTGAが存在するか否かを判定し;
前記の対象からの前記TGA(アノテーションすること)と予め選択されたデータベースからのTGAに対する情報を結合させ;
前記の予め選択されたデータベースにおいて前記の対象に対する第2または次のTGAが存在するか否かを判定してもよく、そうである場合、予め選択されたデータベースからの第2または次のTGAに対する情報を前記の患者に存在する前記の第2のTGAと関連させること
を含む、対象のTGAの特徴を調べることをさらに含む。
予め選択されたデータベース、例えば検証されたTGAのデータベースにおいて前記のTGAが存在するか否かを判定し;
前記の予め選択されたデータベースにないTGAが既知の臨床的に関連するGまたはAを有することを判定し、そうである場合、前記の予め選択されたデータベースにおいて前記のTGAに対するエントリーを提供する
ことを含む、対象のTGAの特徴を調べることをさらに含む。
1.対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法であって、
(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが前記対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書ではライブラリキャッチと呼ばれることがある。)を提供するために、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば、前記対象区間の増幅配列を提供するために、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅してもよく;
(d)前記対象区間の1回以上の出現の配列を得て;それによって前記対象区間のクローンプロファイルを提供または評価すること
を含む方法。
(ii)可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部でのインデルの形成による、VD、DJ、またはVJ連結、またはCDR、例えば重鎖CDR3から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であって、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である値
を得ることをさらに含む、段落1〜13の何れかの方法。
i)前記対象の表現型、例えば疾患状態;または
ii)第2の対象区間での遺伝子型、例えば表1〜4もしくは表5A〜9またはMHC遺伝子、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII遺伝子から選択される遺伝子の遺伝子型
を提供することを含む、段落1〜23の何れかの方法。
感染因子、例えば、細菌、ウイルス、原生動物または真菌による感染;
疾患のステージ;
障害、例えば癌の遺伝子型の変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性;
疾患または障害の進行、再燃、再発または持続;
疾患に関連する薬剤への事前の曝露;
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応;
対象からのプロテオミクスデータ;
年齢;
性別;
体重;
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置;または
環境的もしくは職業的要因
を含む、段落24の方法。
(i)前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Vセグメントを含む対象区間の第1の出現および前記Vセグメントを含む区間の第2の出現の配列を得ることを含み、前記第1および第2の出現が、VD、DJまたはVJ連結部での多様性によって異なるか;または
(ii)前記対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば前記第1の対象区間が第1の遺伝子からの配列を含み、前記第2の対象区間が第2の遺伝子からの配列を含む、
段落1〜26の何れかの方法。
前記対象区間の複数の出現の第2の出現が、発現サブゲノム区間、例えばそのサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これが例えば、ゲノム、例えば体細胞ゲノムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその発現の相対的存在量の評価を可能にする、段落27または28の方法。
前記対象区間でのシグネチャー;または
前記対象区間での対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと、前記ライブラリを接触させることを含む、段落1〜108の何れかの方法。
前記対象区間での第2のシグネチャー;または
前記対象区間での第2の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成する、第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、段落1〜109の方法。
前記対象区間からの異なる配列;
前記対象区間での異なるシグネチャー;または
前記対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成し、
Xが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、
段落1〜106の何れかの方法。
前記対象区間での第1のシグネチャーおよび第2のシグネチャー;または
前記対象区間での第1の対立遺伝子および第2の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、段落1〜111の何れかの方法。
前記対象区間での少なくともX個のシグネチャー;または
前記対象区間での少なくともX個の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、
Xが、独立に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、
段落1〜112の何れかの方法。
段階(a)、(b)および(c)のうちの1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および前記対象区間の第2の出現に対して個別に行われ、例えば段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の出現に対して第1の反応混合物中で、および前記第2の出現に対して第2の反応混合物中で行われる、段落1〜136の何れかの方法。
前記複数のうち第2の出現が発現サブゲノム区間を含み、例えば前記発現サブゲノム区間が、VDJ配列、例えば特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む、段落137〜140の何れかの方法。
段階(a)、(b)および(c)のうちの少なくとも1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および対象区間の第2の出現に対して同じ反応混合物中で行われる、段落1〜136の何れかの方法。
段階(b)において、前記対象区間の複数の出現の第2のコピーを第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、
段落137〜145の何れかの方法。
段階(b)において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーを同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ(1つまたは複数の)ベイトを含む、
段落137〜145の何れかの方法。
(1つまたは複数の)段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の対象区間に対して第1の反応混合物、および前記第2の対象区間に対して第2の反応混合物中で行われる、
段落1〜147の何れかの方法。
段階(a)、(b)および(c)のうち少なくとも1つが、前記第1の対象区間に対しておよび第2の対象区間に対して同じ反応混合物中で行われる、段落1〜154の何れかの方法。
段階(b)において、第2の対象区間を第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、段落155または156の方法。
段階(b)において、第2の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが(1つまたは複数の)同じベイトを含む、
段落155または156の方法。
障害、例えば癌の遺伝子型における変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性または耐性の変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現への反応性欠如;
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性
の後に、段階(a)〜(d)を反復することを含む、段落159の方法。
(b)RNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の選択された配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落1〜162の何れかの方法。
(i)前記対象区間での対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、対立遺伝子または前記対象区間での複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)前記対象区間でのシグネチャーの分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、シグネチャー、または前記対象区間での複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値;または
(iii)シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異についての値
を得ることを含む、
段落163の方法。
段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(ii)を含む;
段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(iii)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(i)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(iii)を含む;
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(i)を含む;
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;または
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(iii)を含む、段落164の方法。
(b)第2の細胞タイプからの、例えば、前記第2の細胞タイプから作製される、例えば、前記第2の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落1〜177の何れかの方法。
(b)第2の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落1〜178の何れかの方法。
(b)RNA、例えばmRNA、例えばcDNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落1〜179の何れかの方法。
(b)第2の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、段落1〜180の何れかの方法。
第2の疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む、段落1〜182の何れかの方法。
疾患状態細胞からの第2の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む、段落1〜183の何れかの方法。
前記ライブラリからのメンバー(またはライブラリキャッチ)からの対象区間に対するリードを得て;
複数のメンバーのそれぞれについて、前記対象区間内のヌクレオチド位置に対する前記リードからヌクレオチド値を割り当てること
を含む、段落1〜195の何れかの方法。
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)ことを含む、段落1〜205の何れかの方法。
段落1〜206の何れかの方法。
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される第2の対象区間の配列を提供すること
を含む、段落1〜212の何れかの方法。
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される、第2、第3または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。)
を含む、段落1〜212の何れかの方法。
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表1〜9から選択される、(X+1)番目の対象区間の配列を提供すること
を含む、段落1〜212の何れかの方法。
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間の配列を提供すること
を含む、段落1〜212の何れかの方法。
(b)それぞれが前記第2の(または続く)対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、前記第2の(または続く)対象区間の配列を提供することを含む、段落207〜218の何れかの方法。
(d)(i)例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)(ii)アライメント方法、例えば本明細書中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
(d)(iii)予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えばベイジアン法または本明細書中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)こと
を含む、段落219の方法。
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)全腕または大きな再編成の決定を可能にすることなどのために、染色体上に配置される複数の対象区間の配列を得ること
を含む方法。
(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択されたメンバーまたはその一部(本明細書中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で、このライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的な相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数の選択されたメンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択されたメンバーの各メンバーを増幅し;
(d)サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て
それによって対象を評価すること
を含み;
(i)前記方法が、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;
(ii)前記方法が、サブゲノム区間を提供する第1のベイトセットおよび発現サブゲノム区間を提供する第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;
(iii)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触されるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(iv)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するために第2のベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(v)前記方法が、第1の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために第1の反応混合物中で、および例えばこのサブゲノム区間に対応する、第2の対象区間、例えば発現サブゲノム区間を提供するために、第2の反応混合液において、段階(a)、(b)および(c)のうち1つを行うことを含む。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明を限定するものとして解釈すべきではない。本願を通して引用される全ての参考文献、図面、配列リスト、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
様々なタイプの試料、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)、血液および骨髄穿刺(BMA)試料から核酸(DNAおよびRNA)を単離した。
Quant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNA試薬(Life Technologiesカタログ#P7581)を用いて単離DNAを定量した。Quant−iT(商標)RiboGreen(登録商標)RNA試薬(Life Technologiesカタログ#R11491)を用いて単離RNAを定量した。
循環式冷却器を備えたCovaris(商標)E210装置を4℃に設定した。機器水タンクに満水ライン上のレベル「6」まで蒸留/脱イオン水を充填した。SonoLab(商標)ソフトウェアを起動し、入力を要求されたときに、システムがホーミング配列を実行するようにした。試料をせん断する前に、機器タンク内の水を少なくとも45分間脱気した。
この実施例は、実施例3からのDNAせん断の代替方法を記載する。
cDNA合成
ライブラリ構築前に、単離RNAを2本鎖cDNAに変換し、これはアダプター連結配列決定ライブラリを作製するためのインプットとなった。
エンドリペア反応
エンドリペア試薬(NEB #E6050L)を凍結融解し、エンドリペアマスター混合液を氷上で調製した。1試料あたり70μLのマスター混合液を調製するために、55μLのヌクレアーゼ不含水を10μLの10xエンドリペア反応緩衝液および5μLのエンドリペア酵素混合物と混合した。次いで、70μLのマスター混合液を氷上の96ウェルPCRプレート中の30μLの各せん断DNA試料に添加した。反応系を20℃でサーモサイクラー中で30分間温置した。QIAGEN MinElute(登録商標)カラムを用いて、各試料を精製した。簡潔に述べると、5xQIAGEN PBI緩衝液を1.5mLの微量遠心管中の試料に添加した(例えば、100μLの試料に500μLのPBI緩衝液を添加した。)。各試料をボルテックスし、短時間スピンダウンし、MinEluteスピンカラムに移した。MinEluteスピンカラムを13,000rpmで1分間遠心し、フロースルーを廃棄した。750μLのQIAGEN PE緩衝液をカラムに添加し、13,000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。スピンカラムを13,000rpmで1分間再び遠心し、清潔な1.5mL微量遠心管に移した。カラムを2〜3分間風乾した。最初の溶出のために、22μLのQIAGEN Elution Buffer(10mM Tris、pH8.5)を各カラムに添加し、2〜3分間温置し、次いで13,000rpmで1分間遠心した。2回目の溶出のために、22μLのQIAGEN Elution Bufferを添加し、1分間温置し、次いで13,000rpmで1分間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラムを廃棄した。
A−塩基付加試薬(NEB#E6053L)を氷上で凍結融解し、A−塩基付加マスター混合液を氷上で調製した。1試料あたり10μLのマスター混合液を調製するために、2μLのヌクレアーゼ不含水を5μLの10xdA−テーリング反応緩衝液および3μLのKlenow断片(3’−>5’エクソ−)と混合した。10μLのマスター混合液を氷上の96ウェルPCRプレート中の40μLの各精製エンドリペア試料に添加した。反応系を37℃でサーモサイクラー中で30分間温置した。QIAGEN MinElute(登録商標)カラムを用いて、各試料を精製した。簡潔に述べると、5xQIAGEN PBI緩衝液を1.5mLの微量遠心管中で試料に添加した(例えば、50μLの試料に250μLのPBI緩衝液を添加した。)。各試料をボルテックスし、短時間スピンダウンし、MinEluteスピンカラムに移した。MinEluteスピンカラムを13,000rpmで1分間遠心し、フロースルーを廃棄した。750μLのQIAGEN PE緩衝液をカラムに添加し、13,000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。スピンカラムを13,000rpmで1分間再び遠心し、清潔な1.5mL微量遠心管に移した。カラムを2〜3分間風乾した。最初の溶出のために、13μLのQIAGEN Elution Buffer(10mM Tris、pH8.5)を各カラムに添加し、2〜3分間温置し、次いで13,000rpmで1分間遠心した。2回目の溶出のために、13μLのQIAGEN Elution Bufferを添加し、1分間温置し、次いで13,000rpmで1分間遠心した。溶出物を回収し、スピンカラムを廃棄した。
ライゲーション試薬(NEB #E6056L)を凍結融解し、ライゲーションマスター混合液を氷上で調製した。1試料あたり36μLのマスター混合液を調製するために、12μLの5xQuick Ligation反応緩衝液を3.3μLのIllumina Multiplex Adaptor(15μM、Illuminaカタログ#PE−400−1001に含まれる。)に添加した(3.3μLアダプター/1μg開始インプットDNAを使用した。)。例えば、500ngのインプットDNAの1つの試料に対して、最初にアダプターを水中で希釈し(2μLアダプター+2μL H2O)、次いで、ライゲーション反応系に対して、3.3μLのこの希釈アダプター混合液、15.7μLのヌクレアーゼ不含水および5μLのQuickT4 DNAリガーゼを添加した。>1μgの出発材料に対して、>3.3μLのアダプターを使用した。したがって、希釈されたアダプター混合液およびヌクレアーゼ不含水の総体積を19μLに保つために、より少ない水を添加した。
PCR試薬を凍結融解し、PCRマスター混合液を氷上で調製した。1試料あたり62μLのマスター混合液に対して、HF緩衝液(Finnzyme、NEBカタログ番号F−531S)入りの50μLの2X Phusion High Fidelityマスター混合液、8μLのヌクレアーゼ不含水、2μLのIllumina Primer 1.0(25μM)および2μLのIllumina Primer 2.0(0.5μM)を使用した。次いで、96ウェルPCRプレート中で、適切なバーコード付きの2μLのIllumina Index Primer(25μM、Illuminaカタログ#PE−400−1001に含まれる。)および36μLの連結DNA試料と62μLのマスター混合液を混合した。反応系を以下のようにサーモサイクラー中で温置した:
1サイクル 98℃ 30秒
18サイクル 98℃ 10秒
65℃ 30秒
72℃ 30秒
1サイクル 72℃ 5分
4℃ 維持
1.8x体積のAMPureXPビーズ(Agencourt;Beckman Coulter Genomics Cat.#A6388)で各PCR反応物に対してサイズ選択を行った。簡潔に述べると、1.8xのAMPureXPビーズを1.5mLの微量遠心管中の試料に添加し(例えば、180μLのビーズを100μLの試料に添加した。)、ボルテックスし、転倒混合しながら5分間温置した。溶液が透明になるまで(2分間)、チューブをマグネットスタンド上に置いた。マグネット上に捕捉されたビーズを乱さずに上清を廃棄した。新たに作製した600μLの70%エタノールをビーズ(beards)に添加し、1分間温置し、続いてエタノールを除去した。新たに作製した600μLの70%エタノールの第2のアリコートをビーズに添加し、1分間温置し、エタノールを除去した。ビーズを再捕捉するために、チューブをマグネットスタンド上に1〜2分間戻した。残りのエタノールを全て除去し、ビーズを室温で5〜10分間風乾させた。30μLのQIAGEN溶出緩衝液をビーズに添加し、ボルテックスし、2分間温置した。溶液が透明になるまで(2分間)、チューブをマグネットスタンド上に戻した。上清を新しい1.5mLチューブに移し、ビーズを廃棄した。Q−PCRアッセイを用いて、溶出DNA試料を定量した。これらの定量化により、プールされたハイブリッド捕捉選択内の各ライブラリの等しい提示を確保するために等モルでプールすることが可能になる。
プール指標付き試料ライブラリ
Q−PCRによって、指標を付け、精製し、定量したライブラリのプール(12−plexまで)を氷上で作製した。各試料がハイブリッド選択工程において同等に示されたことを確実にするために、1.5mLの微量遠心管中で等モルのプールを調製した。これらのプールのそれぞれに対するDNAの総インプットは、2000ng〜500ngの範囲であり得る。通常、総インプットDNAは2000ngである。したがって、12個の試料をプールする場合、合計2000ngにするために、それぞれ166.67ngをプールし得る。2000ngのライブラリプールの最終体積は4μLとなるはずである。指標付きライブラリの濃度が様々であるがゆえに、何らかのより大きな体積でプールが作製され得るが、このプールはスピードバック(低熱使用)で乾燥させ、4μLのヌクレアーゼ不含水で再構成するべきである。
i.ハイブリダイゼーション緩衝液#1(Agilent)−25μL
ii.ハイブリダイゼーション緩衝液#2(Agilent)−1μL
iii.ハイブリダイゼーション緩衝液#3(Agilent)−10μL
iv.ハイブリダイゼーション緩衝液#4(Agilent)−13μL
b.ブロッキング混合液(反応あたり8μL):
i.SureSelect Block#1(Agilent)−2.5μL
ii.SureSelect Block#2(Agilent)−2.5μL
iii.対となるエンドプライマー1.0ブロック(IDT、H2Oで200μMに再懸濁)−1.5μL
iv.インデックスプライマー1〜12ブロック(IDT、H2Oで200μMに再懸濁)−1.5μL
c.RNaseブロックの希釈
i.<3Mbの領域を有するカスタムビオチン化RNA−ベイトについて:1μLのRNase Block(Agilent)を9μLの水中で希釈した。
d.ベイト混合物:(反応あたり7μL)
i.RNAベイト−2μL(>3Mbのベイト領域を有するベイトについて、5μLのベイトを使用した。)
ii.希釈RNaseブロック−5μL(>3Mbのベイト領域を有するベイトについて、上で示されるように希釈した2μLのRNaseブロックを使用した。)
ハイブリダイゼーション緩衝混合液、ブロッキング混合液およびベイト混合液を調製したら、ハイブリダイゼーション緩衝混合液をボルテックスし、スピンダウンし、加熱ブロック中で65℃に加熱した。ハイブリッド選択しようとする各プール試料ライブラリ4μLを、96ウェルPCRプレート中で8μLのブロッキング混合液と混合した。反応系を95℃でサーモサイクラー中で5分間温置し、次いで65℃で維持した。プール試料ライブラリ/ブロッキング混合液を95℃で5分間、次いで65℃で2.5分間温置していたときに、ベイト混合物(=ベイト/RNAseブロック混合液)を65℃のヒートブロックに2.5分間入れた。ハイブリダイゼーション緩衝液含有チューブを素早くスピンダウンし、次いですぐに65℃ヒートブロックに戻した。96ウェルプレートを65℃のサーモサイクラー中に残したまま、13μLの加熱したハイブリダイゼーション緩衝混合液を各試料ライブラリ/ブロック混合液にピペットで入れた。96ウェルプレートを65℃のサーモサイクラー中に残したまま、ベイト混合物を65℃で2.5分間温置した後、7μLのベイト混合物を各試料ライブラリ/ブロック/ハイブリダイゼーション緩衝混合液に添加した。反応系(全体積32μL)を、サーモサイクラー中、65℃で24時間温置した。
SureSelect Wash Buffer#2は、ヒートブロック中で65℃で予熱した。Dynal MyOne Streptavidin T1ビーズ(Invitrogen)をボルテックスし、再懸濁した。50μLのDynalビーズあたり200μLのSureSelect Binding Bufferを添加することによってビーズを洗浄した(例えば、300μLのDynalビーズを調製するために1200μLのSureSelect Binding Bufferを使用した。)。ビーズを5秒間ボルテックスし、短時間スピンダウンした。ビーズを約15秒間または全ビーズが捕捉されるまでマグネットスタンド上に置いた。上清を除去し、廃棄した。SureSelect Binding Bufferでさらに2回洗浄を繰り返し、合計3回洗浄した。洗浄後、50μLのDynalビーズあたり200μLのSureSelect Binding Buffer中でビーズを再懸濁した(例えば、300μLのDynalビーズを調製するために1200μLのSureSelect Binding Bufferを使用した。)。再懸濁したビーズをボルテックスし、短時間スピンダウンした。200μLの再懸濁ビーズを個々の1.5mL微量遠心管に分注した。
24時間の温置後、65℃のサーモサイクラー中のPCRプレートからの各ハイブリッド形成試料を室温で200μLの調製済みビーズを含有するチューブに素早くピペットで入れた。試料およびビーズの混合物を5秒間ボルテックスし、的確な混合を確保するために室温で30分間回転子上で温置した。次いで、チューブを素早くスピンダウンした。ビーズをマグネット上で捕捉し(2分間)、上清を除去して廃棄した。低ストリンジェンシー洗浄の場合、ビーズを500μLのSureSelect Wash Buffer#1中で再懸濁した。試料を5秒間ボルテックスし、マグネットなしで室温で15分間温置した。試料を3〜5分ごとに5秒間ボルテックスした。チューブをすぐにスピンダウンした。次いで、ビーズをマグネットスタンド上で2分間捕捉し、上清を除去して廃棄した。非標的物質を除去するための高ストリンジェンシー洗浄の場合、65℃に予熱したSureSelect Wash Buffer#2でビーズを洗浄した。簡潔に述べると、500μLの予熱したSureSelect Wash Buffer#2中でビーズを再懸濁し、5秒間ボルテックス上で混合して、ビーズを再懸濁した。遠心分離機で短時間ビーズをスピンダウンし、室温で5秒間時おりボルテックスして混合しながら、ヒートブロック中で65℃で10分間温置した。次いで、ビーズを遠心分離機で短時間スピンダウンし、マグネット上で2分間捕捉した。予熱したSureSelect Wash Buffer#2で65℃にてさらに2回洗浄を繰り返し、全部で3回洗浄した。次いで、洗浄緩衝液を完全に除去し、50μLのSureSelect Elution Bufferをビーズに添加し、続いて、5秒間ボルテックスしてビーズを混合した。試料を室温で10分間温置し、ボルテックス混合を時おり5秒間行った。ビーズを遠心分離機中で短時間スピンダウンし、マグネットスタンド上で捕捉した。捕捉したDNAを含有する上清を新しい1.5mL微量遠心管にピペットで移した。50μLのSureSelect Neutralization Bufferを捕捉DNAに添加した。試料を5秒間ボルテックスし、遠心分離機で短時間スピンダウンし、1.8x体積のAMPureXPビーズを用いて精製した。40μLのヌクレアーゼ不含水中でDNAを溶出させた。
PCR試薬を凍結融解し、PCRマスター混合液を氷上で調製した。1試料あたり60μLのマスター混合液に対して、HF緩衝液入りの50μLの2X Phusion High Fidelityマスター混合液(NEB#F−531S)を、8μLのヌクレアーゼ不含水、1μLのQPCR Primer 1.1(H2O中100μM)および1μL QPCR Primer2.1(H2O中100μM)と混合した。Q−PCR用のプライマー配列は次のとおりである:
QPCR Primer1.1(IDTからHPLC精製):
5’AATGATACGGCGACCACCGAGAT3’(配列番号2)
QPCR Primer2.1(IDTからHPLC精製):
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGA3’(配列番号3)
60μLのマスター混合液を96ウェルPCRプレート中の40μLの各精製捕捉DNA試料に添加した。反応系を以下のようにサーモサイクラー中で温置した:
1サイクル 98℃ 30秒
12サイクル 98℃ 10秒
65℃ 30秒
72℃ 30秒
1サイクル 72℃ 5分
4℃ 維持
各100μLのPCR反応液を1.8x体積のAMPureXPビーズで精製し、35μLの溶出緩衝液(10mM Tris、pH8.5)中で溶出させた。Q−PCRアッセイを用いて、ハイブリッド選択/捕捉DNA試料を定量した。Q−PCRアッセイはエンドアダプターを検出し、リードは、適切なクラスター密度を得るために各試料のどの程度を配列決定フローセルに載せるべきかを示した。
次のものは、本実施例による変化を同定するために使用される方法および実験条件のある一定の実施形態を例示する。さらなる転座のスクリーニングは、例えば、予め選択された腫瘍試料から調製されたcDNAのqRT−PCR分析の何れかを用いて行い得る。
保管ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍検体からのDNAを用いて、145種類の癌遺伝子の2574個のエクソンの配列決定を行ったが;24個はNSCLC患者由来であった。ゲノムDNAを用いたアダプターライゲーション法、続いて最適化RNAハイブリダイゼーション捕捉プローブ(Agilent SureSelectカスタムキット)によるハイブリダイゼーション選択によって、配列決定ライブラリを構築した。HiSeq2000装置(Illumina)での配列決定は、36x36対のリードを用いて平均デプス253Xまで行った。塩基置換、インデル、コピー数変化およびゲノム再編成のためのデータ処理および突然変異の割り当ては、腫瘍組織からの突然変異呼び出しのために最適化されたツールの組み合わせを用いて行った。
多重分析のために選択された代表的な遺伝子、変異体および癌のタイプを表1〜9に記載する。
本明細書中に記載のベイジアン法を続く実施例で実行した。
溶液ベースのゲノム標的選択技術が利用可能であることにより、標的配列決定アプリケーションの迅速な開発が可能になり、そのうちの一部が臨床配列決定試験の導入につながった。市販のハイブリダイゼーション捕捉試薬は、ビオチン化DNAまたはRNAプローブ(「ベイト」)に変換されるアレイ合成オリゴヌクレオチドに基づく。しかし、これらの複雑なプローブプールを作製する方法は、例えば高GC含量標的を捕捉することなど、性能面の課題に直面する。
ハイスループットDNA配列決定技術の幅広い採用により、癌ゲノミクスにおける急速な進歩が促進された。しかし、ゲノム癌診断における標準治療は、依然として個々の遺伝子および特定の突然変異に焦点を当てた検査を含む。臨床的に実施可能な突然変異の数が増加するにつれて、特に組織検体が、生検の場合に一般的であるように、限定的である場合、試験の枠組みに対するこの単一の突然変異が実行不可能になる。腫瘍試料の包括的なゲノムプロファイリングに対する臨床的ニーズに対処するために、発明者らは、200+の癌関連遺伝子に対する大規模並列配列データを送達する臨床テストを開発した。さらに、この検査は臨床的に重要であることが示され、DNAインプットが50ng程度と低いホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料および11年間経過しているという古い試料から超ディープ配列決定データを生成させた。
循環腫瘍細胞(CTC)は、低侵襲性の連続方式でヒト悪性腫瘍を試料採取するための優れた機会を提供する。癌ゲノムの分子の特徴評価のためのCTCの使用には、2つの重要な課題がある。第1に、CTCは血液から効率的に単離されなければならず、この場合、CTCは非腫瘍細胞よりも107倍以上少ないものであり得る。第2に、CTC試料中に存在する限られた数の腫瘍ゲノムは、物質の損失および偏りの導入を最小限に抑えながら、利用可能な形態で捕捉しなければならない。
個別化療法の癌への広範な適用には、腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームに存在する多様な逸脱の、包括的で、高感度で時宜を得た特徴評価が必要である。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックとして一般的に保存されている殆どの臨床癌試料からのRNAおよびDNAは、品質が低く、分子プロファイリングに対して使用することが困難であった。新たに出現した次世代DNA配列決定アッセイは、損傷があるDNAでうまく機能し、多くのタイプのゲノム逸脱を検出するのに十分に感度が高い。現在、FFPE腫瘍試料からのトランスクリプトームの包括的な分析のための同等のRNA配列決定プロトコールはない。
200を超える癌関連遺伝子における突然変異、再編成および発現変化の高感度検出のためのFFPE適合標的RNA配列決定および分析方法が開発された。プロトコールは細胞株RNA上で検証し、50個を超えるFFPE非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘍を研究するためにこれを使用した。既知の突然変異および遺伝子融合(例えばBCR−ABL1)が細胞系で検出された。デジタル発現プロファイリングにおける技術的再現性は、細胞株およびFFPE RNAについてそれぞれR2=0.99および>0.9を超えていた。癌ゲノムで予想されるように、RNA−seqから、既知の癌遺伝子を含む点突然変異および新規の再編成を含む、ゲノムにおける逸脱の証拠が提供された。EGFR、FGFR3、CDH5、KITおよびRETを含む癌遺伝子の非常に顕著な差次的発現が、様々な腫瘍にわたり2.5〜70倍の範囲で明らかになった。同一のFFPE試料上のRNAおよびDNA配列決定データの組み合わせは、ゲノム変化の機能的な結果を裏付け;例としては、突然変異TP53対立遺伝子の発現、およびDNAレベルでヘテロ接合性喪失を示した腫瘍におけるSTK11発現の減少が挙げられた。次世代配列決定技術をFFPE RNAに適用し、実存のDNA配列決定法と統合することで、臨床的に関連する癌生物学の理解が深まり、患者のケアを改善することが期待される。
製造者の指示に従い、Roche High Pure Paraffin Kitを用いて、FFPE組織切片、一般的には1または2個の10μmのカール(curl)からRNAを抽出する。抽出したRNAを−80℃で保存する。RNA収率および品質は、製造者の指示に従い、RiboGreen(Invitrogen)およびBioanalyzer RNA Pico Chip(Agilent)によってそれぞれ評価する。一般的な収率は500ng〜2μgであり、RINスコアは4未満である。
癌ゲノミクスの理解の急速な進歩および利用可能な標的治療数の増加は、包括的な腫瘍プロファイリングに基づく有効な癌処置のための機会の拡大をもたらす。研究の場では次世代配列決定によって腫瘍ゲノムを分析するための実験的および計算論的アプローチにおける重要な進歩があったが、これらの技術の臨床への拡張は重大なさらなる課題がある。これらの中でも重要であるのは、幅広い範囲の臨床で使用できる可能性がある突然変異に対して高感度および高精度を提供するという要件と相まって、臨床検体の純度および不均一性が限定的であることである。
免疫グロブリンをコードする遺伝子を配列決定することは、B細胞白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を含むリンパ性悪性腫瘍を有する患者におけるクローン細胞集団の検出ならびに予後および治療的判断を行うことにおいて非常に重要である。B細胞悪性腫瘍における再編成免疫グロブリン配列を同定するための現在のアッセイは、一般的に、保存的な免疫グロブリン(IG)領域の配列特異的PCRに基づく増幅に依存する。この例は、重鎖および軽鎖可変ドメイン、相補性決定領域(CDR)配列および体細胞高頻度変異(SHM)状態の同定を可能にする、免疫グロブリン鎖を配列決定するための新規のハイブリッド捕捉に基づくアプローチを記載する。
7種類のマントル細胞リンパ腫細胞(MCL)株および53検体の臨床の慢性リンパ球性白血病(CLL)骨髄穿刺液を含む60検体からRNAおよびDNAが首尾よく抽出された。免疫グロブリン可変、連結およびクラスセグメントを標的とするカスタムベイトセットを用いた溶液ハイブリダイゼーションによって、アダプター連結DNAおよびcDNA配列決定ライブラリを捕捉した。全ての捕捉ライブラリは、CLIA認定研究室(Foundation Medicine)において高デプス(Illumina HiSeq)に対して配列決定を行った。
CLIA認定の商業的なPCRに基づくアッセイ(Invivoscribe)を用いてプロファイリングされた、7種類のMCL細胞株および53種類のCLL試料を用いて、捕捉に基づくアプローチを検証した。7種類のMCL細胞系に由来する免疫グロブリン配列は、公開されている重鎖および軽鎖可変ドメインおよびパーセントSHMの同定と100%一致した。以前に臨床的検査を行った53検体の試料と比較することから、クローン集団の存在を同定するための98%(52/53)の一致およびIGHVドメインの同定に対して100%(39/39)の一致が示された。SHMについて以前に検査した50検体のCLL試料との比較の結果、SHMなしの場合は94%(31/33)、SHMが存在する場合は100%(17/17)の一致で、全体では96%(48/50)の一致となった。さらに、二次クローンを11検体の試料で同定した。
この研究から、クローン性腫瘍B細胞集団の免疫グロブリン配列を包括的に特徴評価するために、ハイブリッド捕捉に基づく標的DNAおよびRNA配列決定を使用し得ることが明らかになった。この能力により、SHMの定量および可変ドメイン、CDR3配列およびクラス制限の同定が可能になる。包括的なゲノムプロファイリングアプローチとのこの方法論との統合は、血液悪性腫瘍がある患者におけるこのようなアッセイの臨床的有用性を拡大し、固形腫瘍を有する患者を含む免疫療法に対する患者の免疫腫瘍学および反応における重要な洞察を提供し得る。
この実施例は、多くの血液悪性腫瘍試料から抽出されたゲノムDNAおよび全RNA上で標的DNA配列決定(DNA−seq)およびRNA配列決定(RNA−seq)を組み合わせることによる、臨床的に関連する条件下での様々なクラスのゲノム変化の高感度で特異的な検出を記載する。試験したゲノム変化としては、例えば塩基置換(Subs)、挿入および欠失(インデル)、局限的なコピー数変化(CNA)およびゲノム再編成が挙げられる。典型的な血液悪性腫瘍試料、例えばFFPE、血液および骨髄穿刺液を試験した。
表1〜4に列挙した遺伝子を標的とするベイト配列を設計した。このベイトはUltramer合成化学を用いてIntegrated DNA Technology(IDT)で合成された。RNA−seqおよびDNA−seqベイトセット試薬を作製するために、IDTから受領した適切なベイトセットサブプールの等モル混合物を調製した。次いで、ベイトセット試薬を一回使用アリコートに分割し、−20℃で保存した。DNA−seqベイトセットの性能は、標準自動ハイブリッド捕捉プロトコールを用いてHapMapライブラリを捕捉することにより確認した。標準プロトコールを用いてHapMapライブラリおよびユニバーサルヒト参照RNA(UHRR)ライブラリを捕捉することにより、RNA−seqベイトセットの性能を確認した。
ゲノムDNA抽出、定量、せん断、ライブラリ構築、ハイブリッド捕捉および配列決定の方法は、実施例1〜6に記載されている。
RNAワークフローは、通常、同じ試料から抽出された適合RNAおよびDNAにおけるDNA−seqワークフローと並行して実行された。例えば、抽出されたRNAを最初にRNA特異的蛍光色素であるRibogreenで定量し、高品質インプット(例えば血液、BMA)からの300ngまでのRNAまたは低品質インプット(例えばFFPE)からの500ngのRNAを、2段階cDNA合成プロトコールのためのインプットとして正規化した。cDNA合成の第1段階において、インプットRNAに相補的な1本鎖DNA鎖が生成された。cDNA合成の第2段階において、1本鎖cDNAを2本鎖DNAに変換した。次いで2本鎖cDNAをライブラリ構築のためのインプットとして使用した。cDNAを高品質RNAから合成した場合、挿入物長が配列決定と適合することを確保するために、ライブラリ構築において使用する前にcDNAをせん断した。ライブラリ構築、ハイブリッド捕捉、定量および配列決定段階は、RNA−seqベイトセット試薬および関連する分析ファイルおよびプロトコールの使用を除いて、全て標準DNA−seqライブラリと同様に行う。
DNA−seqワークフローで偽陽性の変化の呼び出しを最小限に抑えるために、正常なHapMap細胞株から潜在的な配列決定アーチファクトのデータベースを作成した。例えば、20個の個々のHapMap細胞株からの200ngのDNAを標準ライブラリ構築のためのインプットとして使用した。次に、各ライブラリ2μgをDNA配列ベイトセットで捕捉した。捕捉ライブラリの配列決定を行い、標準分析パイプラインを通じて全データを処理した後、遺伝子に存在するあらゆる変異体呼び出しに基づいてアーチファクトデータベースを作成した。試料は正常なHapMap細胞株由来であったため、遺伝子中で検出された何れの非SNP変化も、アーチファクトであると考えられ、試験データをフィルタリングするために使用される。
RNA−seqワークフローを用いた偽陽性ゲノム再編成の検出を最小限に抑えるために、RNA−seqデータにおける潜在的な工程関連、配列決定および分析アーチファクトのデータベースを作成した。例えば、8検体の正常血液試料からの300ngのRNAを高品質cDNA合成プロトコール用のインプットとして使用し、6検体の正常FFPE試料からの500ngのRNAを、低品質cDNA合成プロトコール用のインプットとして使用した。cDNA反応の全収量をライブラリ構築に対するインプットとして使用した。次に、各ライブラリの2μgをRNA−seqベイトセットで捕捉した。捕捉ライブラリの配列決定を行い、RNA−seq分析パイプラインを通じ全てのデータを処理した後、ゲノム再編成のアーチファクトデータベースを作成した。血液およびFFPE試料は正常ドナー由来であったため、検出された何れのゲノム再編成も人為的現象または生殖系列事象であると考えられ、試験データをフィルタリングするために使用される。
DNA−seqベイトセットは、塩基置換、短い挿入および欠失の検出、および非同定臨床試料での局限的なコピー数変化について、非常に均一なカバレッジおよび精度を達成した。DNA−seqおよびRNA−seqからの統合的な結果は、細胞株混合物におけるゲノム再編成/遺伝子融合の検出に対して高い感度および特異性を達成した。このアッセイは非常に再現性が高く、ワークフローは、FFPE、血液および骨髄穿刺液を含む通例の血液腫瘍学臨床試料と広く適合していた。その結果は、76個の非同定臨床試料から得られた標準治療CLIA認証試験結果ともよく一致していた。
個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるように、本明細書中で言及される刊行物、特許および特許出願は全て、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書中のあらゆる定義を含め、本出願が支配する。
当業者は、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができよう。このような同等物は、続く特許請求の範囲によって包含されるものとする。
Claims (227)
- 対象における、対象区間、例えばサブゲノム区間または発現サブゲノム区間(またはそれを含有する細胞)のクローンプロファイルを評価または提供する方法であって、
(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば固形腫瘍または血液悪性腫瘍(または前悪性腫瘍)試料からの複数の腫瘍メンバー、を含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが前記対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願ではライブラリキャッチと呼ばれることがある)を提供するために、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば、前記対象区間の増幅配列を提供するために、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅してもよく;
(d)前記対象区間の1回以上の出現の配列を得て、それによって前記対象区間のクローンプロファイルを提供または評価すること
を含む方法。 - 段階(a)が前記対象からの核酸を断片化する、例えばせん断することを含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(b)が、溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(b)が、表面ベースのハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリを前記ベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(b)が、表面上の前記ベイトセット、例えば複数のベイトを含む基材上に配置されたベイトセットと前記ライブラリを接触させる段階を含む、請求項4に記載の方法。
- 段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存するかまたはそれを含む方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(c)が、プライマー対を用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含み、前記メンバー中の標的/対象核酸に前記プライマー対の少なくとも1つのメンバーが結合しない、請求項1に記載の方法。
- 段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しないか、またはそれを含まない方法によって前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅すること含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(c)が、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマー対を用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間および発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間での第1の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第1のVセグメント)の配列を比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の対立遺伝子またはシグネチャー(例えば第2のVセグメント)の配列の関数である値と比較することを含む、請求項1に記載の方法。
- (e)(i)前記対象区間での配列、シグネチャーまたは対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)、存在量または同一性、例えば配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子の相対的存在量、または前記対象区間での複数の配列、シグネチャーもしくは対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)可変性、例えば、体細胞高頻度変異から生じる配列可変性、例えば連結部でのインデルの形成による、VD、DJもしくはVJ連結、またはCDR、例えば重鎖CDR3から生じる配列可変性、シグネチャーまたは対象区間内の配列可変性についての値であって、例えば、可変性についての値が、対象または試料中の前記対象区間について存在する異なる変異体の数の関数である、値
を得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - (i)が、前記対象区間での複数の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、前記対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- (i)が、第2の対象区間での第2の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの存在量に対する、前記対象区間での第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーの相対的存在量についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- (i)が、発現サブゲノム区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベルについての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- 対応するサブゲノム区間で、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば再編成、例えば転座の出現またはレベル、についての値を得ることをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- (ii)が、対象区間で生じる異なる配列、対立遺伝子またはシグネチャーの数についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- (e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- シグネチャーに対して(e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- 対立遺伝子に対して(e)(i)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- (e)(ii)を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- 第1の対象区間での、配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えばVセグメント、またはVDJもしくはVJ再編成のクローンプロファイル;および
i)前記対象の表現型、例えば疾患状態;または
ii)第2の対象区間での遺伝子型、例えば表1〜4もしくは表5A〜9またはMHC遺伝子、例えばMHCクラスIまたはMHCクラスII遺伝子から選択される遺伝子の遺伝子型
を提供することを含む、請求項1に記載の方法。 - 表現型が、
感染因子、例えば、細菌、ウイルス、原生動物または真菌による感染;
疾患のステージ;
障害、例えば癌の遺伝子型の変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性もしくは耐性における変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現(treatment develops)への反応性;
疾患または障害の進行、再燃、再発または持続;
疾患に関連する薬剤への事前の曝露;
抗原またはワクチンへの事前の曝露もしくは反応;
対象からのプロテオミクスデータ;
年齢;
性別;
体重;
病歴、例えば、疾患の既往歴もしくは以前の処置;または
環境的もしくは職業的要因
を含む、請求項24に記載の方法。 - 前記第2の対象区間での遺伝子型が、例えば表1〜4または表5A〜9からの遺伝子における、体細胞突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む、請求項24に記載の方法。
- 段階(d)が:
(i)前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得て、例えば、Vセグメントを含む対象区間の第1の出現および前記Vセグメントを含む区間の第2の出現の配列を得ることを含み、前記第1および第2の出現が、VD、DJまたはVJ連結部での多様性によって異なるか;または
(ii)前記対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば前記第1の対象区間が第1の遺伝子からの配列を含み、前記第2の対象区間が第2の遺伝子からの配列を含む、請求項1に記載の方法。 - 段階(d)が、前記対象区間の複数の出現、例えば、VDJ配列を含む対象区間の複数の出現、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む対象区間の複数の出現、のそれぞれの配列を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現の第1の出現がサブゲノム区間を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現の第2の出現がサブゲノム区間を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現の第1の出現が発現サブゲノム区間を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現の第2の出現が発現サブゲノム区間を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現の第1の出現が、サブゲノム区間、例えば再編成、例えば転座を含み;
前記対象区間の複数の出現の第2の出現が、発現サブゲノム区間、例えばそのサブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含み、これが例えば、ゲノム、例えば体細胞ゲノムの再編成の発現の評価を可能にし、例えばゲノム再編成およびその発現の相対的存在量の評価を可能にする、請求項27に記載の方法。 - サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含む、請求項33に記載の方法。
- 段階(d)が、前記対象区間および第2の異なる対象区間の配列を得ることを含み、例えば、前記第1および第2の区間が、前記対象区間からの異なるゲノム配列、例えば第1の遺伝子からの配列および第2の遺伝子からの配列に対応する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の対象区間がVDJセグメントの第1の組み合わせを含み、前記第2の対象区間がVDJセグメントの第2の組み合わせを含み、例えば前記第1の対象区間が第1のVセグメントを含み、前記の第2の対象区間が第2のVセグメントを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記の第1の対象区間が第1のサブゲノム区間を含み、前記の第2の対象区間が第2のサブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記第1の対象区間が第1の発現サブゲノム区間を含み、前記第2の対象区間が第2の発現サブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記第1の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第2の対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項35に記載の方法。
- 評価することが、癌のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、癌の第2のクローンに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項40に記載の方法。
- 評価することが、例えば参照物に対する、例えば癌の前記第2のクローンの存在量に対する、前記癌の第1クローンの存在量についての値を提供することを含む、請求項41に記載の方法。
- 遺伝子型を含む癌の第1のクローンおよび第2の遺伝子型を含む第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。
- 第1の突然変異、例えば再編成を含む癌の第1のクローンおよび前記の突然変異を含まない第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。
- 第1の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む癌の第1のクローンおよび第2の突然変異、例えば再編成、例えば転座を含む第2のクローンの相対的存在量を提供することを含む、請求項42に記載の方法。
- 評価することが、第1のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、第2のVセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項46に記載の方法。
- 評価することが、前記第1のVセグメントおよび前記第2のVセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項46に記載の方法。
- 評価することが、第1のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、第2のDセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項49に記載の方法。
- 評価することが、前記第1のDセグメントおよび前記第2のDセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項49に記載の方法。
- 評価することが、第1のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、第2のJセグメントに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項52に記載の方法。
- 評価することが、前記第1のJセグメントおよび前記第2のJセグメントの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項52に記載の方法。
- 評価することが、第1のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、第2のVDJまたはVJの組み合わせに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項55に記載の方法。
- 評価することが、前記第1のVDJまたはVJの組み合わせおよび前記第2のVDJまたはVJの組み合わせの相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項55に記載の方法。
- 評価することが、抗体軽鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、抗体重鎖に対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項58に記載の方法。
- 評価することが、抗体軽鎖および抗体重鎖の相対的存在量についての値を提供することを含む、請求項58に記載の方法。
- 評価することが、サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、発現サブゲノム区間における配列、対立遺伝子またはシグネチャーに対するクローンプロファイルを提供することを含む、請求項61に記載の方法。
- 評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、相対的存在量に対する値を提供することを含む、請求項61に記載の方法。
- 評価することが、対象区間中の遺伝子座、例えばV、DまたはJセグメントにおける高頻度変異に対する可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、例えば対象区間でVD、DJまたはVJ連結部にインデルを形成することによって、VD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、サブゲノム区間中のCDR、例えば重鎖CDR3における可変性を提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- (e)(i)についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記(e)(i)の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば第2の配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第2のVセグメント)の存在量の関数である値に対する、対象区間における配列、シグネチャーまたは対立遺伝子(例えば第1のVセグメント)の存在量についての値を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記(e)(i)の値が、比較値、例えば予め選択された値、例えば事象を欠く配列、例えばある対象区間中の非突然変異または非再編成配列の存在量の関数である値に対する、前記対象区間における事象、例えば配列、対立遺伝子またはシグネチャー、例えば突然変異または再編成の存在量についての値を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記(e)(i)の値が、対象区間でX個の固有の(すなわち互いに異なる)配列、シグネチャーまたは対立遺伝子のそれぞれについての相対的存在量の値を含む、請求項68に記載の方法。
- Xが、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100または200以上である、請求項71に記載の方法。
- Xが1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である、請求項72に記載の方法。
- 例えば、存在量の関数、例えば相対的存在量として、例えばヒストグラムとして、前記(e)(i)の値を表示することをさらに含む、請求項68に記載の方法。
- 前記対象区間が、Igスーパーファミリー受容体、例えばT細胞受容体またはB細胞受容体からの配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記対象区間が、Vセグメント、DセグメントまたはJセグメントからの配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項68に記載の方法。
- Vセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- 複数のVセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- Jセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- 複数のJセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- Dセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- 複数のDセグメント配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- クラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- 複数のクラススイッチ領域配列、シグネチャーまたは対立遺伝子についての相対的存在量を提供することを含む、請求項68に記載の方法。
- (e)(i)および(e)(ii)を得ることを含む、請求項68に記載の方法。
- (e)(ii)についての値を得ることを含む、請求項14に記載の方法。
- 体細胞高頻度変異からの可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。
- 例えば、VD、DJまたはVJ連結部でのインデルの形成によってVD、DJまたはVJ連結部から生じる可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。
- CDRの、例えば重鎖CDR3の、可変性から生じる可変性についての値を得ることを含む、請求項87に記載の方法。
- 前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の固有のコピーの配列、例えば、前記対象区間における複数の固有のシグネチャーを得ることを含む、請求項87に記載の方法。
- 前記(e)(ii)における値が、前記対象区間に対する複数の、例えばX個のシグネチャーにおける配列多様性についての値を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの数を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記値が、前記対象区間における固有のシグネチャーの表示、記録または一覧を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記値が、例えば、前記対象区間の全コピーの関数としての固有のコピーの数の尺度を含む、請求項87に記載の方法。
- Xが、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400または500以上である、請求項87に記載の方法。
- Xが1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000または50,000,000以上である、請求項87に記載の方法。
- 前記複数のシグネチャーが全て、単一のVDJまたはVJの組み合わせに対するものであり、例えば、選択されたVDJまたはVJの組み合わせにおける配列多様性についての値を提供する、請求項87に記載の方法。
- 前記可変性が、セグメント連結、例えば、VD、DJまたはVJ連結部における多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記可変性が、体細胞高頻度変異からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記複数のシグネチャーのそれぞれが、異なるVDJまたはVJの組み合わせに対するものである、請求項87に記載の方法。
- 前記可変性が、セグメント連結、例えば、VD、DJまたはVJ連結部における多様性、例えば前記連結部における挿入または欠損からの可変性を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記ライブラリが、B細胞、例えば、B細胞悪性腫瘍を含む対象、例えばマントル細胞癌を含む対象、から作製される、請求項87に記載の方法。
- 前記対象区間が、B細胞受容体からの、V、DもしくはJセグメントまたはVDもしくはDJ連結部をコードする配列を含む、請求項87に記載の方法。
- 可変性、例えば体細胞高頻度変異、の量を比較値と比較することをさらに含み、前記比較値との予め選択された関係、例えば前記比較値より大きいことが、疾患の、転帰、予後またはステージを示す、請求項87に記載の方法。
- 前記ライブラリを単一のベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリを複数のベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間での配列;
前記対象区間でのシグネチャー;または
前記対象区間での対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと、前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記対象区間での第2の配列;
前記対象区間での第2のシグネチャー;または
前記対象区間での第2の対立遺伝子
を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成する、第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。 - 複数の、例えば少なくともX個の固有のベイトセットと接触させる段階を含み、前記複数のベイトセットのそれぞれが、
前記対象区間からの異なる配列;
前記対象区間での異なるシグネチャー;または
前記対象区間での異なる対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成し、
Xが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、請求項1に記載の方法。 - 前記対象区間での第1の配列および第2の配列;
前記対象区間での第1のシグネチャーおよび第2のシグネチャー;または
前記対象区間での第1の対立遺伝子および第2の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記対象区間からの少なくともX個の配列;
前記対象区間での少なくともX個のシグネチャー;または
前記対象区間での少なくともX個の対立遺伝子
を捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含み、
Xが、独立に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100または200と同等である、請求項1に記載の方法。 - 前記対象もしくは試料中において対象区間で存在しない、第1の配列、対立遺伝子またはシグネチャーを、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間が表10からの配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のV、DまたはJセグメントからの配列および第2のV、DまたはJセグメントからの配列を、捕捉する、特異的に捕捉する、予め選択された効率で捕捉する、捕捉するように最適化されている、またはそれとハイブリッド形成するベイトセットと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間が、V、DまたはJセグメントの配列を含む、請求項1に記載の方法。
- Vセグメント(DまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- Dセグメント(VまたはJセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- Jセグメント(VまたはDセグメントではない。)を捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- Vセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- Dセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- Jセグメントを捕捉するように最適化されているかまたはそれとハイブリッド形成するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- VD、DJまたはVJ連結部にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 再編成されたVDJまたはVJ配列にまたがる(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸類似体、例えばロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)または二環式核酸(BNA)を含む(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 機能的であるために十分に長いが、親和性最適化に十分短い(1つまたは複数の)ベイトを含むベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間の配列を得ることおよび発現サブゲノム区間の配列を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- 発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することおよび発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲノム区間に存在する、請求項1に記載の方法。
- サブゲノム区間に存在するシグネチャーの発現の出現またはレベルを評価することを含み、例えば、前記シグネチャー、例えば再編成、例えば転座が、対応するサブゲノム区間における存在量の関数である、請求項1に記載の方法。
- 評価することが、サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての、および発現サブゲノム区間中の配列、対立遺伝子またはシグネチャーについての相対的存在量に対する値を提供することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;
段階(a)、(b)および(c)のうちの1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および前記対象区間の第2の出現に対して個別に行われ、例えば段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の出現に対して第1の反応混合物中で、および前記第2の出現に対して第2の反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。 - (1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)が個別に行われる、請求項137に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーがサブゲノム区間を含む、請求項137に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーが、サブゲノム区間、例えば前記サブゲノム区間に対応する発現サブゲノム区間を含む、請求項137に記載の方法。
- 前記複数のうち第1の出現がサブゲノム区間を含み、例えば前記サブゲノム区間が、VDJ配列、例えば、特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含み;
前記複数のうち第2の出現が発現サブゲノム区間を含み、例えば前記発現サブゲノム区間が、VDJ配列、例えば特定のVセグメント、特定のDセグメントおよび特定のJセグメントを含むVDJ配列を含む、請求項137に記載の方法。 - 前記対象区間の第1の出現が、発現サブゲノム区間を含む、請求項141に記載の方法。
- 前記対象区間の第2の出現が、発現サブゲノム区間を含む、請求項142に記載の方法。
- 前記対象区間の複数の出現のそれぞれの配列を得ることを含み;
段階(a)、(b)および(c)のうちの少なくとも1つが、前記対象区間の第1の出現に対して、および対象区間の第2の出現に対して同じ反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。 - (1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる、請求項144に記載の方法。
- 段階(b)において、前記対象区間の複数の出現の第1のコピーを第1のベイトセットと接触させ、
段階(b)において、前記対象区間の複数の出現の第2のコピーを第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、請求項144に記載の方法。 - 段階(b)において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第1のコピーをベイトセットと接触させ;
段階(b)において、前記対象区間の複数の固有のコピーの第2のコピーを同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが同じ(1つまたは複数の)ベイトを含む、請求項144に記載の方法。 - 前記対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、
(1つまたは複数の)段階(a)、(b)および(c)のうち1つが、前記第1の対象区間に対して第1の反応混合物、および前記第2の対象区間に対して第2の反応混合物中で行われる、
請求項1に記載の方法。 - (1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる、請求項148に記載の方法。
- 前記対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。
- 前記第2の異なる対象区間がサブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。
- 前記第1の対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。
- 前記第2の異なる対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。
- 前記第1の対象区間がサブゲノム区間を含み、前記第2の異なる対象区間が発現サブゲノム区間を含む、請求項148に記載の方法。
- 前記対象区間および第2の異なる対象区間(異なるとは、異なる染色体位置から、を意味する。)の配列を得ることを含み、
段階(a)、(b)および(c)のうち少なくとも1つが、前記第1の対象区間に対しておよび第2の対象区間に対して同じ反応混合物中で行われる、請求項1に記載の方法。 - (1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが同じ反応混合物中で行われる、請求項155に記載の方法。
- 段階(b)において、第1の対象区間を第1のベイトセットと接触させ;
段階(b)において、第2の対象区間を第2のベイトセット、例えば、前記第1のベイトセット中の何れのベイトとも異なる配列を含むベイトを含む第2のベイトセットと接触させる、請求項155に記載の方法。 - 段階(b)において、第1の対象区間をベイトセットと接触させ;
段階(b)において、第2の対象区間を同じベイトセットと接触させ、例えば両方のベイトセットが(1つまたは複数の)同じベイトを含む、請求項155に記載の方法。 - 段階(a)〜(d)を反復することを含む、請求項1に記載の方法。
- 予め選択された期間の経過;
障害、例えば癌の遺伝子型における変化;
障害の発現における変化、例えば癌の場合、処置に対する攻撃性または耐性の変化、例えば癌の場合、転移の発現;
処置発現への反応性欠如;
疾患もしくは障害の進行、再燃、再発または持続性
の後に、段階(a)〜(d)を反復することを含む、請求項159に記載の方法。 - 前記ライブラリが染色体DNAから作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリがRNA、例えばmRNAから作製される、請求項1に記載の方法。
- (a)染色体DNAから作製されたライブラリからのサブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの発現サブゲノム区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の選択された配列、対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)およびまたは(b)が、
(i)前記対象区間での対立遺伝子の分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、対立遺伝子または前記対象区間での複数の対立遺伝子のそれぞれの相対的存在量についての値;または
(ii)前記対象区間でのシグネチャーの分布、発現(サブゲノムシグネチャーの転写コピーの出現またはレベル)存在量または同一性、例えば、相対的存在量、シグネチャー、または前記対象区間での複数のシグネチャーのそれぞれの相対的存在量についての値;または
(iii)シグネチャーまたは対象区間内の可変性、例えば体細胞高頻度変異についての値
を得ることを含む、請求項163に記載の方法。 - 段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(i)を含む;
段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(ii)を含む;
段階(a)が(i)を含み、段階(b)が(iii)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(i)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;
段階(a)が(ii)を含み、段階(b)が(iii)を含む;
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(i)を含む;
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(ii)を含む;または
段階(a)が(iii)を含み、段階(b)が(iii)を含む、
請求項164に記載の方法。 - 前記ライブラリが、疾患状態組織から、例えば癌細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、固形腫瘍、例えば本願中に記載の固形腫瘍からの細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、浸潤固形腫瘍、例えば本願中に記載の固形腫瘍を有する細胞、例えばB細胞またはT細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、血液悪性腫瘍、例えば、本願中に記載の血液悪性腫瘍からの細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが無細胞DNAから作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、非疾患状態の組織から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、末梢血、骨髄、腫瘍組織、腫瘍浸潤物、リンパ球、B細胞、プレB細胞、成熟B細胞、T細胞または無細胞DNAから作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、腫瘍浸潤細胞、例えば腫瘍浸潤B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリが、末梢B細胞、プレB細胞、成熟B細胞またはT細胞、例えばCD4+またはCD8+、T細胞から作製される、請求項1に記載の方法。
- 非疾患状態組織、例えば腫瘍を付随しない細胞、例えば非腫瘍細胞、または末梢血リンパ球に対するクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- 疾患状態組織、例えば腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞、または非癌性障害に対するクローンプロファイルを評価することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリがT細胞から作製され、前記サブゲノム区間がT細胞受容体、例えばアルファ/ベータまたはデルタ/ガンマ、TCR鎖をコードする配列を含む、請求項1に記載の方法。
- (a)第1の細胞タイプからの、例えば、前記第1の細胞タイプから作製される、例えば、前記第1の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの、例えば、前記第2の細胞タイプから作製される、例えば、前記第2の細胞タイプからの染色体DNAまたはRNA、例えばmRNAから作製されたライブラリからの、対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)第1の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の細胞タイプからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)染色体DNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)RNA、例えばmRNA、例えばcDNAから作製されたライブラリからの対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)第1の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;
(b)第2の期間に対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
例えば対象区間の対立遺伝子またはシグネチャーが発現されるか否かを判定するために、段階(a)および(b)で提供される評価を比較してもよいこと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の期間が予め選択された事象の前であり、第2の期間が予め選択された事象の後であり、前記予め選択された事象が、感染、医学的または外科的手順、例えば移植を受けること、診断または処置、例えば第1選択の処置もしくは第二選択の処置の投与、再発または再燃または疾患を含み得る、請求項181に記載の方法。
- 疾患状態細胞からの対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの前記対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 疾患状態細胞からの第1の対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること;および
疾患状態細胞からの第2の異なる対象区間からの、配列、対立遺伝子またはシグネチャーのクローンプロファイルを評価すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記対象が癌を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が血液癌を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が固形腫瘍を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ライブラリがB細胞から作製され、前記対象がB細胞悪性腫瘍、例えばマントル細胞癌を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が癌以外の障害を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、免疫障害、例えば自己免疫障害、免疫不全、例えば遺伝性または後天性免疫不全、例えばAIDSまたはHIV感染を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、移植片レシピエント、例えば、骨髄レシピエント、実質臓器レシピエントまたは皮膚移植片レシピエントである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、感染または感染性疾患、例えば、ウイルス性、細菌性、原生動物性または真菌性の感染もしくは疾患を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記対象区間が、クローン事象を代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象区間が、T細胞クローンまたはB細胞クローンを代表する、ヌクレオチド位置または連結部または配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(c)または前記方法が、メンバー中の標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存する方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合するプライマーを用いて、前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーまたは何れかのメンバーを増幅することを含まない、請求項1に記載の方法。
- 段階(d)が、
前記ライブラリからのメンバー(またはライブラリキャッチ)からの対象区間に対するリードを得て;
複数のメンバーのそれぞれについて、前記対象区間内のヌクレオチド位置に対する前記リードからヌクレオチド値を割り当てること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’または3’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のメンバーの各メンバー中の対象からの核酸の5’および3’末端にアダプター配列を付着させる、例えば連結することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のメンバーの各メンバーが、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えば、ゲノムまたは転写配列)および3’アダプターを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のメンバーの各メンバーが、5’から3’方向に、5’アダプター配列、対象配列(例えば、ゲノムまたは転写配列)および3’アダプターを含み、前記アダプターのうち1つが、識別子、例えばバーコードとして機能し得る配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーで増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のものの各メンバーが、前記5’アダプターに結合するプライマーまたは前記3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のものの各メンバーが、前記5’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のものの各メンバーが、前記3’アダプターに結合するプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のものの各メンバーが、前記アダプター配列に特異的なプライマーおよび前記メンバーにおける標的/対象核酸に特異的なプライマーを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。
- 段階(d)が、
例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
アライメント方法、例えば本願中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイジアン法または本願中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)ことを含む、請求項1に記載の方法。 - 第2の、例えば第2の対象区間、例えば表1〜4または表5A〜9から選択される、例えば本願中に記載の遺伝子からの配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第2の、例えば第2の対象区間、例えばmiRNA、プロモーターまたは他の要素をコードする配列を含む対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 免疫グロブリンまたはT細胞またはB細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである第2の対象区間の配列を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 例えば表1〜4または表5A〜9から選択される、第3の、または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供することを含み、Xが4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500と等しい、請求項1に記載の方法。
- 前記第3の、またはX個のさらなる対象区間が、免疫グロブリン、B細胞受容体またはT細胞受容体遺伝子以外の遺伝子からのものである、請求項1に記載の方法。
- Xが、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500以上である、請求項211に記載の方法。
- (a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される第2の対象区間の配列を提供すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される第1の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される、第2、第3または少なくともX個のさらなる対象区間の配列を提供すること(Xは、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。)
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される、第1の、第2の、または少なくともX個のさらなる対象区間のクローンプロファイルを評価し(Xは、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500に等しい。);
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば、表1〜9から選択される、(X+1)番目の対象区間の配列を提供すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)第1の細胞タイプからの、例えば前記第1の細胞タイプ、例えば非癌細胞または非悪性細胞(例えば腫瘍浸潤リンパ球)から作製されたライブラリからの、例えば表10から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間のクローンプロファイルを評価すること;および
(b)第2の細胞タイプからの、例えば前記第2の細胞タイプ、例えば癌細胞または悪性細胞から作製されたライブラリからの、例えば表1〜9から選択される1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、またはそれ以上)の対象区間の配列を提供すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第1の細胞タイプまたは前記第1の細胞タイプから作製されたライブラリが、前記第2の細胞タイプまたは前記第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料と同じ試料から得られる、請求項216に記載の方法。
- 前記第1の細胞タイプまたは前記第1の細胞タイプから作製されたライブラリが、前記第2の細胞タイプまたは前記第2の細胞タイプから作製されたライブラリが得られる試料とは異なる試料から得られる、請求項216に記載の方法。
- (a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリ、例えば請求項1に記載のライブラリを得て;
(b)それぞれが前記第2の(または続く)対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液または表面ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)対象区間のそれぞれの配列を得ること
によって、前記第2の(または続く)対象区間の配列を提供することを含む、請求項1に記載の方法。 - 段階(d)が、
(d)(i)例えば、配列決定を含む方法によって、例えば次世代配列決定法で、メンバー、例えば前記ライブラリまたはライブラリキャッチからの腫瘍メンバーからサブゲノム区間に対するリードを得て;
(d)(ii)アライメント方法、例えば本願中に記載のアライメント方法によって前記リードをアライメントし;
(d)(iii)予め選択されたヌクレオチド位置に対して前記リードからヌクレオチド値を割り当てる(例えばベイジアン法または本願中に記載の方法を用いて、例えば突然変異を呼び出す)こと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 例えば、染色体腕の少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80もしくは90%または全てを含む、全腕または大きな再編成、例えば再編成、例えば転座、複製、挿入または欠失の出現について対象を評価する方法であって;
(a)各メンバーが対象からの核酸を含む複数のメンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数のものの各メンバーを増幅することによって、前記複数のものの各メンバーを増幅し;
(d)全腕または大きな再編成の決定を可能にすることなどのために、染色体上に配置される複数の対象区間の配列を得ること
を含む方法。 - 前記大きな再編成が、例えば染色体の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%もしくは50%、または染色体の腕(例えば長腕または短腕)の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%に影響を及ぼす、請求項221に記載の方法。
- 対象を評価する方法であって、
(a)各メンバーが前記対象からの核酸を含む複数のメンバー、例えば血液癌試料からの複数の腫瘍メンバーを含む核酸ライブラリを得て;
(b)それぞれが対象区間を含む複数の選択メンバーまたはその一部(本願中でライブラリキャッチと呼ぶときがある。)を提供するために、例えば溶液ハイブリダイゼーションの条件下で、前記ライブラリをベイトセットと接触させ;
(c)例えば前記メンバー中での標的/対象核酸との配列特異的相互作用に依存しない方法によって、例えば、前記メンバー中の標的/対象核酸に結合しないプライマーを用いて前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅することによって、前記複数の選択メンバーの各メンバーを増幅し;
(d)サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の配列を得て;
それによって前記対象を評価すること
を含み;
(i)前記方法が、サブゲノム区間および発現サブゲノム区間の両方を提供するベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;
(ii)前記方法が、サブゲノム区間を提供する第1のベイトセットおよび発現サブゲノム区間を提供する第2のベイトセットと前記ライブラリを接触させることを含み;
(iii)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するためにベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(iv)前記ライブラリがゲノムDNAを含み、サブゲノム区間を提供するベイトセットと接触させられ、前記方法が、発現サブゲノム区間を提供するために第2のベイトセットと接触させられるcDNAを含む第2のライブラリをさらに含み;
(v)前記方法が、第1の反応混合物において、第1の対象区間、例えばサブゲノム区間を提供するために、および第2の反応混合物において、例えば前記サブゲノム区間に対応する、第2の対象区間、例えば発現サブゲノム区間を提供するために、段階(a)、(b)および(c)のうち1つを実施することを含む、方法。 - (1つまたは複数の)段階(a);(b);(c);(a)および(b);(a)および(c);(b)および(c);または段階(a)、(b)および(c)の全てが個別に行われる、請求項223に記載の方法。
- 前記サブゲノム区間および発現サブゲノム区間が、独立して、表1〜4から選択される、請求項223に記載の方法。
- 少なくともX個の対象区間の配列を提供することを含み、Xが、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500と等しいかまたはこれを超える、請求項223に記載の方法。
- 前記サブゲノム区間および前記発現サブゲノム区間が、同じ対象区間に対応し、例えば、同じ遺伝子からの配列を含む、請求項223に記載の方法。
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