JP2021159040A - 標的核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的核酸と第一核酸と第二核酸とにより形成される第一開裂構造の第一フラップを切断すること、第三核酸と切断された第一フラップと第四核酸とにより形成される第二開裂構造の第二フラップを切断すること、切断された第二フラップを検出することで標的核酸の存在を検出することを含み、第一フラップを切断すること、及び第二フラップを切断することが、フラップエンドヌクレアーゼで第一フラップ及び第二フラップを切断することにより行われ、フラップエンドヌクレアーゼは、サーモコッカス目に属する菌及びメタノバクテリア目に属する菌からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が65%以上であるアミノ酸配列を有する、標的核酸の検出方法。
【選択図】なし
Description
表1に示す様々な種のフラップエンドヌクレアーゼ(FEN)タンパク質をコードする遺伝子をPCR法又は化学合成により取得し、取得した遺伝子を大腸菌用の発現ベクター(pET21a)に組み換えた。化学合成により取得した遺伝子の場合は、C末端にヒスチジン6残基を付与するように遺伝子を合成した。なお、試験No.1(略称Afu)のFENタンパク質は、従来ICA法に使用されていた酵素である(特表2001−518805号公報参照)。
試験例1で精製したFENタンパク質のフラップ切断活性を評価した。開裂構造は、標的核酸(5’−GGTGATCGTTCGCTACATGTCGTCAGGATTCCAGGCAG−3’:配列番号1)、第一核酸(5’−FITC−AGACACATGGTATGTAGCGAACGATCACC−3’:配列番号2)及び第二核酸(5’−CTGCCTGGAATCCTGACGAC−3’:配列番号3)により形成した。当該開裂構造では、第一核酸の5’側の部分配列(5’端から下線を付したTまでの11塩基)がフラップとして1本鎖で突き出している。
フラップ切断活性=(11塩基の位置のバンドの蛍光強度)/{(11塩基の位置のバンドの蛍光強度)+(38塩基の位置のバンドの蛍光強度)}×100(%)
試験例2でフラップ切断活性が認められたFENタンパク質に対し、ICA法で通常採用されている2段階のフラップ切断反応におけるフラップ切断活性を評価した。評価系の概要は図2に示すとおりである。図2に示す評価系は、アレルプローブを蛍光標識することで、FENタンパク質による1段階目のフラップ切断反応(第一開裂構造の第一フラップを切断する反応)を検出可能にした点以外は、ICA法で一般に用いられる反応系と同等である。
試験No.3(略称Mth)及び試験No.6(略称Tko)のFENタンパク質を使用して、試験例3と同様の評価系で、フラップ切断反応の反応条件の検討を行った。
反応液組成は、pHをpH7.5、pH8.0、pH8.5又はpH9.0に調整した50mM Tris−HClをベースに、1μM アレルプローブ(第一核酸)、1μM インベーダーオリゴヌクレオチド(第二核酸)、2μM 検出用核酸(第三核酸及び第四核酸)、0.05v/v% Tween20、2.5mM MgCl2、0.5μM FENタンパク質、0M、100pM又は1nM 標的核酸を含む組成とした。反応液量は、10μLとした。反応溶液を調製した後、LightCycler480(登録商標)(Roche Diagnostics製)を使用してリアルタイムで蛍光強度を測定しながら、67℃で60分間インキュベートしてフラップ切断反応を行った。なお、pHの検討には、試験No.6(略称Tko)のFENタンパク質のみを使用した。
反応液組成は、1μM アレルプローブ(第一核酸)、1μM インベーダーオリゴヌクレオチド(第二核酸)、2μM 検出用核酸(第三核酸及び第四核酸)、50mM Tris−HCl(pH8.5)、0.05v/v% Tween20、2.5mM MgCl2、0.5μM FENタンパク質、0M、30pM又は1nM 標的核酸とした。反応液量は、10μLとした。反応溶液を調製した後、LightCycler480(登録商標)(Roche Diagnostics製)を使用してリアルタイムで蛍光強度を測定しながら、55℃、60℃、65℃、67℃又は70℃で60分間インキュベートしてフラップ切断反応を行った。
反応液組成は、1μM アレルプローブ(第一核酸)、1μM インベーダーオリゴヌクレオチド(第二核酸)、2μM 検出用核酸(第三核酸及び第四核酸)、50mM Tris−HCl(pH8.5)、0.05v/v% Tween20、1mM、2.5mM、5mM、10mM又は20mM MgCl2、0.5μM FENタンパク質、0M、100pM又は1nM 標的核酸とした。反応液量は、10μLとした。反応溶液を調製した後、LightCycler480(登録商標)(Roche Diagnostics製)を使用してリアルタイムで蛍光強度を測定しながら、67℃で60分間インキュベートしてフラップ切断反応を行った。なお、Mg2+イオン濃度の検討には、試験No.6(略称Tko)のFENタンパク質のみを使用した。
反応液組成は、1μM アレルプローブ(第一核酸)、1μM インベーダーオリゴヌクレオチド(第二核酸)、2μM 検出用核酸(第三核酸及び第四核酸)、50mM Tris−HCl(pH8.5)、0.05v/v% Tween20、2.5mM MgCl2、0mM、25mM、50mM、100mM又は200mM KCl、0.5μM FENタンパク質、0M、1nM又は10nM 標的核酸とした。反応液量は、10μLとした。反応溶液を調製した後、LightCycler480(登録商標)(Roche Diagnostics製)を使用してリアルタイムで蛍光強度を測定しながら、67℃で60分間インキュベートしてフラップ切断反応を行った。
反応液組成は、1μM アレルプローブ(第一核酸)、1μM インベーダーオリゴヌクレオチド(第二核酸)、2μM 検出用核酸(第三核酸及び第四核酸)、5mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM又は500mM Tris−HCl(pH8.5)、0.05v/v% Tween20、5mM MgCl2、0.5μM FENタンパク質、0M、100pM又は1nM 標的核酸とした。反応液量は、10μLとした。反応溶液を調製した後、LightCycler480(登録商標)(Roche Diagnostics製)を使用してリアルタイムで蛍光強度を測定しながら、67℃で60分間インキュベートしてフラップ切断反応を行った。
試験No.1(略称Afu)及び試験No.6(略称Tko)のFENタンパク質を使用して、デジタル計測による標的核酸の検出効率を評価した。
Claims (16)
- 標的核酸と第一核酸と第二核酸とにより形成される第一開裂構造の第一フラップを切断すること、
第三核酸と切断された第一フラップと第四核酸とにより形成される第二開裂構造の第二フラップを切断すること、
切断された第二フラップを検出することで標的核酸の存在を検出することを含み、
前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、フラップエンドヌクレアーゼで前記第一フラップ及び前記第二フラップを切断することにより行われ、
前記フラップエンドヌクレアーゼは、サーモコッカス目(Thermococcales)に属する菌及びメタノバクテリア目(Methanobacteriales)に属する菌からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が65%以上であるアミノ酸配列を有する、標的核酸の検出方法。 - 前記フラップエンドヌクレアーゼが、サーモコッカス・コダカレンシス(Thermococcus kodakarensis)KOD1株、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)GE5株、及びメタノサーモバクター・サームオートトロフィカス(Methanothermobacter Thermautotrophicus)Delta H株からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が65%以上であるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸がDNAである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、pH7.5以上9.0以下の条件下で行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、温度55℃以上70℃以下の条件下で行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、水性溶媒中で行われ、前記水性溶媒がMg2+を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水性溶媒中のMg2+濃度が2.5mM以上20mM以下である、請求項6に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、水性溶媒中で行われ、前記水性溶媒中のK+濃度が0mM以上100mM以下である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、水性溶媒中で行われ、前記水性溶媒中のトリスヒドロキシメチルアミノメタン濃度が0mM超300mM以下である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、水性溶媒中で行われ、前記水性溶媒中の前記フラップエンドヌクレアーゼ濃度が0.5μM以上8μM以下である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一フラップを切断すること、及び前記第二フラップを切断することが、水性溶媒中で行われ、前記水性溶媒の容積が10aL以上10μL以下である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第三核酸と前記第四核酸とが、リンカー分子によって結合されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断された第二フラップを蛍光を検出することにより検出する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
前記第三核酸と、前記第四核酸と、前記フラップエンドヌクレアーゼと、前記標的核酸の塩基配列に応じて第一核酸及び第二核酸の塩基配列を設計する指針を示す説明書と、を含む、キット。 - サーモコッカス目(Thermococcales)に属する菌及びメタノバクテリア目(Methanobacteriales)に属する菌からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が65%以上であるアミノ酸配列をコードする核酸配列と、前記核酸配列に作動可能に連結された1又は複数の調節配列とを有する、発現ベクター。
- プラスミドである、請求項15に記載の発現ベクター。
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