CN105392903A - 预扩增试验 - Google Patents

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Abstract

本文提供了确定核酸预扩增反应效力的方法和组合物。

Description

预扩增试验
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,921的优先权，在此引入以供所有目的的参考。
背景技术
核酸分析常常需要在进一步下游分析前扩增一条序列或一组序列。这可能是由于被调查的序列在样品中是稀有的，或因为下游分析需要大量的起始材料。然而获自生物来源或环境的样品可能包含抑制扩增的因子。此外，样品之间也有差异.例如来自一个个体的血样可能比来自另一个个体的血样含有更多抑制因子，使得在第一种样品中预扩增步骤效果更差。这些问题可能会使下游分析更困难，或导致样品间的不一致结果。
发明内容
本文提供了能用于建立扩增反应效力的方法和成分。可在样品试验(assay)中加入这些成分，作为扩增反应的内部对照。
本文提供了检测第一核酸扩增反应中的状况(例如由于异常或抑制剂造成扩增比预期少)的方法，该方法包括：
配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板(例如单链或双链核酸)、第二核酸模板、和对第一核酸模板特异性的第一组引物(例如能与第一核酸模板杂交)；
对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物(例如包含第一核酸模板的扩增产物)；
配制第二混合物，其中第二混合物包含所述产物(例如所述产物的等份或稀释等份)、对第二核酸模板特异性的第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物；
对第二混合物进行第二扩增反应；
确定第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq1)和第二核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq2)；和
当达到Cq2所需的循环数和达到Cq1的循环数之间的差异(ΔCq)小于(例如小2％、5％、10％、20％、30％、40％、1-20％、或5-30％)循环数阈值(例如当第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以相同量存在时的第一循环数)时，在第一扩增反应中检测到状况。
在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在分开的核酸分子上。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。参见例如图1C。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。参见例如图1D。
在一些实施方式中，第一混合物还包含样品(例如生物样品或其它怀疑含有感兴趣核酸的样品)。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板(例如包含于怀疑的感兴趣核酸内的模板)特异性的第四组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗传变体(例如CNV、SNP或突变)。在一些实施方式中，第二混合物还包含对样品核酸模板特异性的第五组引物。在一些实施方式中，第四和第五组引物是相同的。在一些实施方式中，第四和第五组引物是不同的(例如与样品核酸模板上的不同序列互补，或不同地标记)。
在一些实施方式中，第一扩增反应是多重的，例如设计为扩增多个样品核酸模板。在一些实施方式中，第一混合物由此还包含对多条/种样品核酸模板特异性的多组引物。在一些实施方式中，所述第二扩增反应是多重的。在一些实施方式中，第二混合物还包含对获自第一扩增反应的样品核酸模板的扩增产物特异性的多组引物。在一些实施方式中，第一扩增产物分成多种“第二”混合物，每种设计用于检测来自第一扩增反应的样品核酸模板的一种或多种不同的扩增产物。
在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以等量存在。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在同一条核酸分子(单链或双链)上。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板长度相同，或长度差别在1-50个核苷酸内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板长50-2000个核苷酸，例如80-120或100-500个核苷酸，或长约100、200、250、300、500或750个核苷酸。
在一些实施方式中，第一组引物与第三组引物相同。在一些实施方式中，第一和第三组引物是不同的(例如与第一核酸模板上的不同或重叠序列互补，或不同地标记)。
在一些实施方式中，所述第一扩增反应是PCR。在一些实施方式中，第一循环数在1-25之间(例如4-10、5-15、2-8、6-20、10-24等)。在一些实施方式中，当达到Cq2所需循环数和达到Cq1所需循环数之间的差异比循环数阈值小约0.01-5个循环(例如0.1-1，小于1、0.01-2、3、4、5、2-5)时，检测到状况(例如异常或抑制)。在一些实施方式中，所述第一扩增反应是逆转录。在一些实施方式中，第一核酸模板是RNA，而第二核酸模板是DNA。在一些实施方式中，当达到Cq2所需循环数和达到Cq1所需循环数之间的差异是0.01-2(例如第一和第二核酸模板量相等(或尽可能接近))时，检测到状况(例如异常或抑制)。在一些实施方式中，第二扩增反应是PCR，例如qPCR(实时PCR或数字PCR)。在一些实施方式中，进行第二循环数的第二扩增反应。在一些实施方式中，第二循环数相当于或大于第一循环数。
在一些实施方式中，在配制第二混合物前，至少部分从产物中除去第一组引物。在一些实施方式中，产物在第二混合物中稀释至少2倍(例如5倍、10倍、20倍、10-100倍)，例如作为等分的结果。
还提供了在第一扩增反应中检测状况(例如比预期扩增少)的方法，该方法包括：
配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、和对第一核酸模板特异性的第一组引物；
对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；
配制第二混合物，其中第二混合物含有所述产物、进行第二核酸试验的试剂；
对第二混合物进行第二核酸试验；
测定第二混合物中第一核酸模板量的指示信号和第二混合物中第二核酸模板量的指示信号；和
当第二混合物中第一核酸量不显著高于第二核酸模板量(例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍等)时，检测到状况。
在一些实施方式中，第二核酸试验是定量杂交试验。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第一核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或引物。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第二核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或引物。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第一和第二核酸模板特异性的带标记探针和/或引物。
在一些实施方式中，第一混合物还包含样品(例如生物样品或其它怀疑含有感兴趣核酸的样品)。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板(例如包含于怀疑的感兴趣核酸内的模板)特异性的一组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗传变体(例如CNV、SNP或突变)。
还提供了在预扩增中检测状况(例如异常或抑制)的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含：装有对第一核酸模板特异性的第一组引物的第一容器；装有对第二核酸模板特异性的第二组引物的第二容器；和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物。在一些实施方式中，第三组引物在第二容器内。在一些实施方式中，容器是孔、管、包装、可破裂包装(burstpack)或被包含和确定的区域(例如在表面上干燥)。
在一些实施方式中，第一和第三组引物是不同的。在一些实施方式中，第一和第三组引物是相同的。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第一核酸模板的扩增产物特异性的第一带标记探针。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第二核酸模板的扩增产物特异性的第二带标记探针。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第一核酸模板的扩增产物特异性的第一带标记探针，和对第二核酸模板的扩增产物特异性的第二带标记探针。
在一些实施方式中，第二组引物中的至少一种引物被标记。在一些实施方式中，第三组引物中的至少一种引物被标记。
在一些实施方式中，该试剂盒还包含扩增酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含第一核酸模板和第二核酸模板，例如，在同一核酸分子(单链或双链)或在不同核酸分子(单链或双链)上的第一核酸模板和第二核酸模板。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板在至少一个独立容器内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板在第一容器内。
附图简要说明
图1A、1B、1C和1D描述了PASIC(预扩增加标对照，PreAmpSpike-InControl)技术的一些实施方式。图1A显示了C1和C2DNA模板与其各自的扩增引物。图1B显示了PASIC实施方式的示范步骤。在预扩增混合物中加入C1和C2模板和C1扩增引物，用C1模板进行扩增。下游分析是实时PCR，同时使用两组引物。由于C1模板经预扩增，C1的定量循环数(Cq)将在C2的Cq之前到达。图1C显示了可在一条核酸分子上用C1和C2模板进行该技术，其中C1和C2模板不重叠。图1D显示了可在一条核酸分子上用C1和C2模板进行该技术，其中C1和C2模板重叠。在上述任一个方面，当C1和C2模板重叠，可用插入型染料(例如SYBR绿)或寡核苷酸探针(例如TAQMAN或分子信标探针)进行qPCR定量检测。当C1和C2重叠时，在使用寡核苷酸探针的实施方式中，可以对C1和C2模板使用不同探针，或可使用同时检测C1和C2模板扩增子的共同探针。
图2A、2B、2C、2D和2E显示了使用PASIC扩增TBP(TATA结合蛋白)的代表性数据。这些图显示了在血液(图2B)或巧克力提取物(图2C)样品上进行的预扩增，其水平是在某些情况下已知抑制实时PCR(图2C)，或在无抑制剂的对照(图2A)上进行的预扩增。预扩增进行10轮循环。Cq1和Cq2分析显示血液并不抑制预扩增，因为Cq(Cq2-Cq1)和没有抑制剂的对照一样，为9.6。相反，巧克力提取物显著抑制预扩增，其Cq是0.3。后一结果显示C1模板在预扩增中并未被显著扩增。图2D和2E显示了在血样和无抑制剂对照中TBP表达似乎一样(图2D中轨迹重叠)，而巧克力提取物样品与无抑制剂对照相比，TBP表达似乎低得多(图2E中对于巧克力提取物更高的Cq1和Cq2)。
发明详述
A.引言
本文提供了测定预扩增反应是否有效、如何有效、在特定样品中是否存在抑制因子的方法和组合物。预扩增是设计用于扩增(例如通过PCR，一些其它扩增方法，或逆转录)目标核酸然后用于下游分析的技术。下游分析技术包括定量试验，例如qPCR(例如数字PCR或实时PCR)、高分辨率解链分析、分子信标试验、杂交试验和测序反应。
例如，在标准核酸分析中，包含核酸的样品可与如下物质混合：(i)设计扩增目标核酸节段的DNA引物，(ii)聚合酶，例如Taq或其它扩增酶(RNA或DNA聚合酶或转录酶)，以及(iii)合适的试剂(例如dNTP、缓冲液等)。预扩增后，将产物(可任选稀释或处理以分离扩增产物)加到下游分析反应中。预扩增步骤提高可用于进一步分析的目标核酸量，因此能用于检测、定量、和分析稀有序列(例如低拷贝数突变)。
本发明的方法和组合物可用作预扩增和随后分析的内部对照。在这种情况下，内部对照方法称作PASIC(预扩增加标对照)。PASIC可用于涉及qPCR，测序，检测表达水平，检测SNP、CNV或其它遗传变体的下游分析。
当用作怀疑含有待预扩增目标核酸的样品的内部对照时，混合入(i)第一和第二已知模板(例如合成或重组产生的核酸分子)(加标)，以及(ii)对第一模板特异性的扩增引物，(iii)对目标核酸特异性的扩增引物，和(iv)合适的试剂(例如聚合酶、dNTP、缓冲液等)。进行预扩增反应。如果在样品或反应中存在抑制剂或一些其它异常，不会如预期那样多地扩增第一模板。这可在本文所述的下游过程(例如第二扩增反应)中测定。第一模板扩增中检测到异常表示样品中的目标核酸可能也不会被有效预扩增。
在一些实施方式中，预扩增是对DNA模板，并使用例如PCR。在一些情况下，预扩增进行约4-24轮(例如10-20、10-24、5-15轮等)循环，视目标核酸的期望浓度以及反应中的第一和第二模板量而定。第二模板不在预扩增中扩增。然而，在下游处理步骤(例如定量扩增反应)中存在同时对第一和第二模板特异性的引物。
假设第二核酸试验是定量PCR，而第一混合物中第一和第二核酸模板量相等。如果预扩增完美进行，在第二扩增中达到第二模板扩增产物预定浓度所需的循环数将比获得相同浓度第一模板扩增产物所需的循环数多出预扩增循环数。用户可决定确定“异常”的阈值。例如，如果预扩增进行10轮，在第二扩增中确定为异常的阈值可定为约9轮(例如在约1或2轮内，8.5、8.75、9.1、9.2、9.4、9.5、9.6、9.7等)。换言之，如果第二模板扩增产物在第二扩增中于少于9轮的循环内达到与第一模板扩增产物的相同浓度，预扩增被确定为异常。
在多重反应中可用预扩增对照，在一些实施方式中，可将来自预扩增(第一扩增)的产物分成多个“第二”核酸试验。例如，预扩增反应可包含多组对样品中不同靶核酸特异性的扩增引物。在一些实施方式中，将预扩增产物分成用于多种下游分析，例如每种针对样品中一种或多种不同靶核酸，以及针对第一和第二核酸模板对照。
例如，预扩增反应可包含上面列出的那些要素：(i)第一和第二已知模板(例如相等或已知量)；(ii)对第一模板特异性的扩增引物，(iii)怀疑含有靶核酸的样品；(iv)对靶核酸特异性的扩增引物；和(v)合适的试剂(扩增酶、核苷酸、缓冲液等)。然后进行预扩增产生产物。假定预扩增成功，样品中至少包含一些靶核酸，产物将会包含来自样品的靶核酸和第一核酸模板的扩增产物。可将第一扩增的产物加入到单种反应混合物中用于第二核酸分析，或可分配在多根试管(或孔、容器或位置)用于第二核酸分析。例如，如果第二核酸分析是qPCR，反应混合物可包含第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸模板特异性引物，多组靶核酸扩增产物特异性引物，以及合适的试剂。或者，可分配产物，使得每种反应混合物包含第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸模板特异性引物，对一种或一亚组来自样品的靶核酸扩增产物特异性的引物，以及合适的试剂。
在一些实施方式中，第一扩增是逆转录反应。这种情况下，第一核酸模板是RNA，第一组引物可以仅包含一种引物，例如聚-T寡核苷酸或对已知的第一核酸模板特异性的寡核苷酸序列。逆转录反应可包括已知的第一核酸模板(RNA)，已知的第二核酸模板(RNA或DNA)，怀疑包含靶RNA模板的样品，第一核酸模板特异性引物，靶RNA模板特异性引物，和合适的试剂(例如逆转录酶、dNTP，缓冲液等)。在一些实施方式中，第二核酸分析是PCR，第二核酸反应混合物包含逆转录反应的产物，第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸模板特异性引物，来自样品的靶核酸扩增产物特异性引物，以及合适的试剂。假定第一RNA模板和第二核酸模板的量在逆转录反应中已知，可计算确定异常的阈值。这种变化也适用于多重试验，用于检测样品中的多种目标。
可根据许多可控因子预测性计算确定预扩增中异常的阈值。这些包括但不限于预扩增中第一和第二核酸模板的相对浓度，对各模板特异性的引物的可得性，第一和第二模板的相对长度以及G-C含量。在一些实施方式中，预扩增中第一和第二核酸模板的浓度是相等的(例如两种模板存在于一条核酸上)，第一和第二模板长度相同(例如约50-500个核苷酸，80-150个核苷酸，或约100-200个核苷酸)或在几个核苷酸(例如在1-10％的总长度内)的差异内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板的GC含量相同，或在2-5个核苷酸的差异内。
在一些实施方式中，包含第一和第二已知核酸模板以及第一核酸模板特异性探针的预扩增反应与样品的预扩增反应并列进行，例如在分开的孔或多孔板中，或在分开的试管中进行。在一些实施方式中，对于多重、相继的预扩增反应，包含第一和第二已知核酸模板以及第一核酸模板特异性探针的预扩增反应在对照孔中进行。
如果确定当包含样品时预扩增异常，用户可回到样品并尝试将核酸与非核酸物质分离，例如使用层析方法或通过沉淀和重悬浮核酸，或加入试剂中和可疑污染物。如果确定预扩增在不存在样品时是异常的，用户可检查例如扩增仪器的温度、湿度等。不论何种情况，用户可检查以确保所有的合适的试剂被加入到预扩增反应中。
B.定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。这些术语和标准技术描述于例如：Lackie,细胞和分子生物学字典,Elsevier(第四版2007)；Sambrook等,分子克隆：实验手册,ColdSpringsHarborPress(冷泉湾,NY1989)；寡核苷酸合成(Gait编，最新版)；核酸杂交(Hames&Higgins编,最新版)；转录和翻译(Hames&Higgins编，最新版)；细小病毒CRC手册，卷I&II(Tijessen编)；基础病毒学，第二版，卷I&II(Fields和Knipe编)所述。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或元素之前的时候，是用来表示可任选地添加其它步骤或元素，是非排它性的。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
本文所用的扩增反应中的“状况”或“异常”指任何导致扩增水平比对于已知模板、模板浓度和扩增条件所预测的低的因素。例子包括那些限制扩增的因素，例如对扩增酶活力的干扰或活性减低，或对引物或模板的干扰。异常还可能是由于会影响扩增的仪器或反应的问题(例如没有达到变性温度等)。除非另外说明，异常并不是指对一种目标样品核酸预扩增特异性的问题，例如对所需模板的染色质干扰或样品模板中难以扩增的重复序列。
“循环”指扩增循环，通常包括引物与模板核酸杂交，引物延伸/聚合，模板和新形成的链变性。在PCR中，每一轮循环使得模板量倍增，重复循环导致模板对数扩增([模板]x2n,其中n＝循环数)。
术语“定量循环”(Cq)指达到设定阈值荧光信号(例如定量扩增反应的定量区)所需的循环数。选择阈值水平在反应对数期内捕获数据。为了确定Cq值，可从原始荧光数据中扣除背景荧光水平。背景可基于开始几轮循环在可检测扩增之前的最初稳定的荧光水平。在一些实施方式中，用仪器专用算法或手工选择荧光阈值。对每一个样品用数据分析法搜寻数据曲线，并从阈值内推出该样品的Cq值。具体Cq是相对值，相对于起始模板拷贝数，且对仪器、试剂、扩增效率以及反应灵敏度等是特异性的。越低Cq表明起始模板量越高，扩增越有效等。
本文所用的“样品”指怀疑携带感兴趣核酸的标本。样品可以是生物学样品，或从环境中回收的，例如从表面拭得，食物样品，来自水处理设施等。可在试验之前对样品进行加工以例如去除非核酸碎片。该术语包含获得后经处理的样品，如试剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。感兴趣的核酸可以是遗传变体(例如拷贝数变体，多态性，或突变)，表达产物(例如RNA或其扩增产物)，或来自感染介质(例如细菌、噬菌体、病毒或真菌)。
本文所述的“阈值”是用户根据特定试验条件选择的一个数值，用于确定预扩增反应是否有某种异常，例如不是最佳或根据能够控制的条件(例如模板浓度和长度，引物浓度等)比起预期的要低。在一些实施方式中，阈值指第一和第二模板扩增的ΔCq与已知扩增循环数(例如在预扩增步骤中的循环数)之间可容忍的差异。在一些实施方式中，阈值指一个反应内(例如在定量杂交或测序反应内测定的)第一和第二核酸量之间可容忍的差异。在一些实施方式中，阈值指反应内第一和第二核酸量之间的预期差与定量试验中实测量之间可容忍的差异。在一些实施方式中，阈值允许离预期值1-20％变动(例如1-10％、1-5％、5-10％变动)。例如，如果预期的第一和第二模板扩增的Cq是10，用于确定存在异常的阈值可定为0.1-2循环，例如约0.5循环。
术语“生物样品”包括从生物体中得到的多种样品类型。该术语包括体液，如血液、血液组分、唾液、血清、血浆、尿液和其它生物来源的液体样品、固体组织活检、组织培养物或取自培养细胞的上清。可在试验之前对生物样品进行加工以例如去除细胞或细胞碎片。该术语包含获得后经处理的样品，如试剂处理、溶解、沉降或对某些组分的富集。
“对照”、“对照样品”、“标准对照”或“对照值”是指用作参比，通常是已知参比的样品，其用于与测试样品比较。例如，可从怀疑患有疾病或携带多态性的患者采集测试样品，与患有已知疾病的患者、多态性携带者，或已知正常(无疾病)个体的样品比较。对照还可代表从一群类似个体(例如具有类似医疗背景、同样年龄、体重等的患者或健康个体)收集的平均值。还可从同一个体，例如从较早获得的样品，疾病之前，或治疗之前获得对照值。“内部对照”是与要测试的反应或试验同时，通常在同一试管、孔、表面或容器内进行的反应或试验的对照。可用内部对照检测样品内的异常。例如，检测样品内核酸的PCR反应的内部对照包括已知的PCR引物和模板，其能在不存在抑制剂或反应内一些其它的异常的情况下扩增。
本领域技术人员会认识到可设计对照来评价任意数量的参数。本领域技术人员会理解何种对照在给定的情况中有价值，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照物对于确定数据的显著性也具有价值。例如，如果给定参数的值在对照物中是广泛变化的，则不认为测试样品中的变化是显著的。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物，及其互补物。“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或本文所用的语法等同形式指至少两个共价连接在一起的核苷酸。寡核苷酸通常长约5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多个核苷酸，直至约100个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物，包括较长的长度，例如长200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。术语“核苷酸”一般指多核苷酸的一个单位，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。
“核酸模板”指包含目标序列，例如要扩增或被检测的序列，的单链或双链核酸分子。例如，可用与5’PCR引物和3’PCR引物杂交的序列确定核酸模板。核酸模板可比被检测的部分长，例如当用代表核酸模板子序列的探针检测时。例如，通过扩增引物确定的给定的核酸模板可包含作为下游分析(例如检测、定量、测序等)焦点的遗传变体.
如上所述，“遗传变体”指突变，单核苷酸多态性(SNP)，缺失变体，错义变体，插入变体，反转，或拷贝数变体(CNV)。遗传变体可用作生物标记，并导致增加或减少的表达水平，或差异修饰。
本公开包括与已知标记或序列具有基本相似的序列相同性的多核苷酸和多肽。如本文所用，当在两条多核苷酸或多肽的氨基酸序列之间具有至少约70％序列相同性，至少约80％序列相同性，至少约90％序列相同性，至少约95％序列相同性，至少约99％序列相同性，或100％序列相同性，或当多核苷酸(例如编码多肽的多核苷酸)能彼此在严格杂交条件或实施者定义的条件下形成稳定的双链体时，这两条多核苷酸或多肽具有“大体序列相同性”。本领域技术人员应理解，可在比全长基因序列短的序列中或在限定基因序列外检测遗传变体，例如可采用PCR扩增包含遗传变体位点，或采用与包括遗传变体位点的序列互补的探针。在有关序列相同性的方面或实施方式中，如本文公开，序列相同性可以与序列一部分(例如长15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、500、1000或更多核酸碱基或氨基酸)相关。
术语“探针”或“引物”指一个或多个核酸片段，可检测其与样品的特异性杂交。探针或引物可以是任何长度，视要使用的具体技术而定。例如，PCR引物通常长10-40个核苷酸，而核酸探针通常更长，例如25-100个或100个以上核苷酸，例如长100-500个核苷酸。可如下文所述不标记或标记探针或引物，使得其与靶序列的结合可被检测(例如用荧光团)。可根据染色体的一个或多个特定(预选)的区域(例如一个或多个克隆，分离的完整染色体或染色体片段，或聚合物链式反应(PCR)扩增产物的一个集合)设计探针或引物。固定在目标元件上的核酸长度和复杂性对本发明不关键。本领域技术人员能调节这些因素，来提供对给定的杂交和检测过程的最佳杂交和信号产生，并提供在不同基因或基因组位置之间所需的分辨率。
还可将探针和引物固定在固体表面(例如硝基纤维素、玻璃、石英、融合的二氧化硅载玻片)，以阵列形式。产生高密度阵列的技术也可用于此目的(见例如Fodor(1991)Science767-773；Johnston(1998)Curr.Biol.8:R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques23:1087-1092；Kern(1997)Biotechniques23:120-124；美国专利号5,143,854).本领域技术人员应认识到可从目标序列一定程度改变特定探针和引物的确切序列，以产生“大体相同”或“大体互补于”靶序列的探针，但仍然保留其与其衍生来源的同一目标特异性结合(例如特异性杂交)的能力。
如果探针或引物能够大体与核酸序列或与覆盖或接近遗传变体的区域互补，则其对该核酸序列或遗传变体具有“特异性”或对其“能检测”。例如，为了检测SNP，引物可以设计成在SNP的任一侧，用引物延伸测定在SNP位点上的核苷酸相同性。在一些实施方式中，在探针仅与遗传变体杂交或仅与优势序列杂交的条件下使用探针。
另外，对于核酸来说，术语“能够与……杂交”表示多核苷酸序列与互补序列形成华生克里克键。本领域技术人员理解互补百分数根据多核苷酸长度、互补区长度(例如长5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多碱基)和条件的严格程度，无需100％来发生杂交。例如，多核苷酸(例如引物或探针)可以随着互补区的延伸与具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性的多核苷酸结合。对于检测遗传变体的情况，容忍的互补百分数或错配数目可随检测所用技术变化(见下文)。
“杂交试验”是依靠互补核酸链之间的华生-克里克键合的试验。杂交可涉及引物(例如在扩增或测序反应中)或探针(例如分子信标、或相互作用FRET探针)。在一些实施方式中，引物和/或探针被标记。在一些实施方式中，杂交试验包括使用插入型染料。
对于核酸的情形，术语“扩增产物”指扩增反应(例如PCR及其派生方法，逆转录，链置换反应(SDR)，连接酶链式反应(LCR)，转录介导的扩增(TMA)或Qβ复制)得到的核酸(例如多核苷酸)。可用热稳定聚合酶，例如Taq避免在涉及循环或极端温度的扩增过程(例如PCR及其派生方法)中重复加入聚合酶。
除非另外说明，广义使用术语“试剂”以包括试验组分，例如酶、抗体、探针、结合试剂(例如受体或靶)、样品、洗涤液、缓冲液、检测剂等。
术语“标记物”、“可检测部分”、“可检测试剂”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料、发光试剂、放射性同位素(例如32P、3H)、电子密集试剂、酶、生物素、地高辛、或半抗原，以及能够通过例如亲和力检测的蛋白质或其它实体。可以采用本领域已知的用于将标签偶联到核酸或其它生物分子的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(BioconjugateTechniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)。术语“标签”和与术语“标记物”作为同义词使用，但是一般指基于亲和性的部分，例如，用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。
“带标记的”分子(例如，核酸、蛋白质或抗体)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。来自标记物的信号可表示带标记分子的量。
福斯特共振能量转移(缩写为FRET)，也称作荧光共振能量转移是一种描述两个生色团之间能量转移的机制。供体生色团(FRET供体)最初为电子激发态，可通过非辐射性偶极-偶极偶联将能量转移给受体生色团(FRET受体)，该受体生色团通常距离不超过10nm。当FRET供体和受体接近时，转移到FRET受体的能量作为光(能量)发射被检测。因此，“FRET信号”是受体光发射产生的信号。相隔距离为R的供体和受体染料之间福斯特共振能量转移的效率表示成E＝1/[1+(R/R0)6]，其中R0是E＝1/2时供体-受体对的福斯特半径。R0对于常用的染料对(例如Cy3-Cy5)大约为FRET信号随距离的六次方变化。如果供体-受体对位于R0左右，可以最大信噪比在到范围内测定距离的微小改变。用目前技术，能对许多单一的FRET对实现1ms或更快的平行显像。
“FRET对”指能FRET检测的FRET供体和FRET受体对。
本文中除非另外说明，以相同含义使用术语“荧光团”、“染料”、“荧光分子”、“荧光染料”、“FRET染料”等。
C.扩增反应
本文公开的试验和方法可包括使用一定范围的核酸扩增技术，例如PCR及其派生方法(例如TaqMan、实时PCR、定量PCR)，逆转录，链置换反应(SDR)，连接酶链式反应(LCR)，转录介导的扩增(TMA)或Qβ复制。可用热稳定聚合酶，例如Taq避免在涉及循环或极端温度的扩增过程(例如PCR及其派生方法)中重复加入聚合酶。这些方法是本领域已知的，例如衣原体检测的PCR、LCR、TMA和SDR的并列比较，描述于Gaydos等(2004)J.Clin.Microbiol.42:3041.
聚合酶链式反应(PCR)是最常用的技术。PCR能产生大量特异性DNA片段，其长度和序列都由核酸模板和5’及3’引物确定。主要步骤包括双链目标核酸的热变性，引物对其互补序列退火，退火的引物通过DNA聚合酶的酶合成进行延伸。可使用Taq或其它热稳定聚合物(例如Pfu,Paq5000,PhusionDNA聚合酶)。通过引物与目标核酸的结合位置确定要扩增的部分(模板)。见例如Dieffenbach&DvekslerPCR引物:实验手册(冷泉港实验室出版社，ColdSpringHarborLaboratoryPress2003)。
用定量PCR(qPCR)扩增并同时对一种或多种目标核酸模板定量。数量可以是拷贝的绝对数量，或当对已知DNA输入值(例如内部或外部对照)或对其它标准化基因(例如，管家基因，如β-肌动蛋白)标准化时的相对量。两种常用的qPCR检测方法是：(1)非特异性荧光染料，其插入双链DNA，和(2)用荧光报道物标记的序列特异性探针，其仅能在探针杂交后检测(例如分子信标)。
可用逆转录扩增RNA模板。对这种情况，加入逆转录酶和dNTP以及引发的RNA分子来产生cDNA。在第一扩增反应是逆转录的实施方式中，“第一组引物”可包含仅一种引物，例如聚T寡核苷酸，或与模板转录物上或其它模板RNA分子上的已知序列杂交的引物。接着，逆转录产生的单链cDNA用于随后的PCR。该方法可被称作RT-PCR(逆转录PCR)，而不与实时PCR混淆，后者也可用一样的首字母缩写。
转录介导的扩增(TMA)是一种使用RNA转录(RNA聚合酶)和DNA合成(逆转录)从靶核酸产生RNA扩增子的方法。TMA可针对RNA和DNA两者使用。TMA是等温的，每个循环可产生100-1000个拷贝，与每轮仅产生两个拷贝的PCR形成对比。这可在约15-30分钟内使拷贝增加10x109倍。TMA还产生RNA扩增子，而不是DNA扩增子。见例如Kamisango等，(1999)J.Clin.Microbiol.37:310.
LCR是基于连接邻近核酸探针的DNA扩增技术。探针设计成恰好匹配特异性靶DNA的两条相邻序列。在过量探针存在下，以三步重复链反应：(1)双链DNA的热变性，(2)探针与靶DNA退火，和(3)通过热稳定DNA连接酶连接探针。重复反应(例如20-30轮循环)后，测定已连接引物的产生。
可用实时PCR和TaqDNA聚合酶的5’-核酸酶活性检测遗传变体。本试验需要正向和反相PCR引物，其能扩增出包含变异位点的区域。可用FRET以及一或两种与变异位点杂交的等位基因特异性探针实现变体甄别。探针还具有与其5’端连接的荧光团和与其3’端连接的淬灭分子。当探针是完整时，淬灭剂留在荧光团附近，消除荧光信号。在PCR扩增步骤期间，如果变体特异性探针与变体等位基因完美互补，其将与靶DNA链结合，然后在Taq聚合酶使DNA从PCR引物延伸时，被其5’核酸酶活性降解。探针降解导致荧光团与淬灭剂分子分离，产生可检测信号。如果变体特异性探针没有完美互补，则其解链温度会降低，因此不能有效结合。这防止了核酸酶与探针作用。
在数字PCR(dPCR或液滴数字PCR，ddPCR)中，稀释样品，将其分配到多个(几百或甚至几百万份)独立反应室，使得各室含有一个或不含感兴趣序列的拷贝。通过阳性分配室(其中检测到序列)对阴性分配室(其中未检测到序列)的计数，研究人员可以准确确定在原始样品中有多少个DNA分子的拷贝(见例如Sykes等(1992)Biotechniques13:444；Baker(2012)NatureMethods9:541)。由于其卓越的灵敏性，dPCR可用于鉴别等位基因或疾病基因的差异表达，病毒水平，或检测外周血中的胎儿DNA。虽然概念简单，dPCR通常依赖于纳米制造和微流体装置，例如来自和Life
福斯特共振能量转移(FRET)检测可用于检测引物延伸和连接反应，其中将两个标记物彼此靠近。其还可用于5’核酸酶反应，分子信标反应，以及插入切割反应，其中相邻的供体/受体对通过切割或打断使其靠近的茎环结构而分离。当符合两个条件时，发生FRET。第一，荧光供体染料的发射光谱必须与受体染料的激发波长重叠。第二，两种染料必须互相非常靠近，因为能量转移随距离迅速下降。靠近这一要求使得FRET成为许多等位基因甄别机制的良好检测方法。
FRET可使用各种染料，它们是本领域已知的。最常见的是荧光素、氰染料(Cy3到Cy7),罗丹明染料(例如罗丹明6G),Alexa系列染料(Alexa405到Alexa730)。这些染料中的一些已被用于FRET网络(包含多种供体和受体)。使所有这些染料显像的光学仪器需要检测从UV到近红外(例如Alex405到Cy7),以及Atto系列染料(Atto-TecGmbH)。用于FRET标记的示范性染料对包括Alexa-405/Alex-488,Alexa-488/Alexa-546,Alexa-532/Alexa-594,Alexa-594/Alexa-680,Alexa-594/Alexa-700,Alexa-700/Alexa-790,Cy3/Cy5,Cy3.5/Cy5.5,和罗丹明-绿/罗丹明-红等。也可使用荧光金属纳米颗粒，例如银和金纳米簇团(Richards等(2008)JAmChemSoc130:5038-39；Vosch等(2007)ProcNatlAcadSciUSA104:12616-21；Petty和Dickson(2003)JAmChemSoc125:7780-81。可用的滤波片，二向色、多向色镜和激光能影响染料选择。
D.其它核酸试验
本文公开的预扩增验证方法可与扩增反应或其它核酸分析，例如高分辨率解链(HRM)试验、分子信标试验和核酸测序联用。可用这些方法检测遗传变体，例如单核苷酸多态性(SNP)、等位基因差异(合子型)和突变。
HRM试验通常涉及使用与双链DNA结合的插入型染料，该染料只要分子仍然保持双链就可发荧光。逐渐加热双链DNA样品直至解链，荧光减弱。可用于这些试验的插入型荧光染料包括例如Green,LCGreen,LCGreenPlus,ResoLight,Chromofy,GreenERTM,和SYTO9。
可用HRM试验检测突变、合子型、和SNP。例如，如果用于预扩增的引物跨越一基因序列中等位基因差异点，可产生两种扩增产物，每种对应一种等位基因。对每一种等位基因的纯合子相较于杂合子具有较高解链温度(荧光减弱较晚)，因为所有核酸链基本将100％杂交(考虑到扩增酶有很小百分比的不精确性)。在杂合子中，更显著百分数的扩增产物将在等位差异位点与错配杂交。
这些方法见例如Reed等(2007)Pharmacogenetics8:597；Krypuy等(2007)BMCCancer7:168。HRM也可用于检测甲基化，见例如Wojdacz&Dobrovic(2007)Nucl.AcidsRes.35:e41,以及用于鉴别样品，见例如Zianni等(2013)J.Biomol.Tech.24:1。
还可用分子信标检测遗传变体，例如突变、合子型、和SNP。该方法利用特别工程改造的单链寡核苷酸探针。寡核苷酸设计成在每一端具有互补区，而探针序列位于两者之间。该设计使得探针能在天然、分离的状态下形成发夹或茎环结构。荧光团与探针一端结合，荧光淬灭剂与另一端结合。由于探针的茎环结构，荧光团与淬灭剂彼此非常靠近，因此防止分子发射任何荧光。还对分子进行了工程改造，使得仅探针分子与目标基因组DNA序列互补。
如果分子信标的探针序列在试验中遇到其靶基因组DNA序列，它将退火并杂交。由于探针序列的长度，探针的发夹区段将变性，有利于形成较长、更稳定的探针-靶标杂交物。该构型改变使得荧光团和淬灭剂不再彼此由于发夹结合紧密靠近，从而分子发荧光。
如果在另一方面，探针遇到带有少至只有一个非互补核苷酸的目标序列，分子信标优势维持其天然发夹状态，而观察不到荧光，因为荧光团仍然被淬灭。分子信标设计实现了能鉴定给定位置错配的简单诊断试验。如果一个分子信标设计成与野生型等位基因匹配，另一个设计成与等位基因的突变体匹配，它们能用于鉴定个体的基因型。如果仅第一个探针的荧光团波长在试验中被检测到，那么个体是野生型纯合子。如果仅第二个探针的波长被检测，则个体是突变等位基因纯合子。最后，如果两种波长都被检测到，则两个分子信标都必须与其互补物结合，则个体必然含有两种等位基因，是杂合子。
E.阈值计算
本文所述的方法的计算可能涉及基于计算机的计算和工具。例如，给定核酸的浓度(或两种或多种核酸之间的浓度差异)，或扩增反应的Cq(或两种或多种扩增反应的Cq)可通过计算机将其与阈值比较，如本文所述。工具有利地以计算机程序形式提供，可用常规设计的通用计算机系统(本文称作“主机”)执行。主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准元件例如显示器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络连接时，可通过任何合适的传输介质(例如接线、光学和/或无线介质)和任何合适的通讯协议(例如TCP/IP)提供连接；主机可以包含合适的联网硬件(例如调制解调器、以太网卡、WIFI卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、MicrosoftWindows、MacOS或任何其他操作系统。
可以多种语言书写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言书写或分配，例如汇编语言或机器语言。
主机系统有利地提供界面，用户可通过该界面控制工具的操作。软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准命令行界面起始。可适当调整命令以适应操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本文公开的方法不限于以任何特定用户界面使用。
如本文所述的插入数据点和运算的脚本或程序可在任何用于存储和/或传输的计算机可读介质上编码。合适的介质的示例包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循各种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
F.试剂盒
还提供了包含用于PASIC的组分的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒提供了建立预扩增反应效力的内部对照组分。
试剂盒可包含(例如在独立容器、独立区室、孔、管、包装、可破裂包装、或在所包含的确定的区域内(例如在表面上干燥))(i)对第一核酸模板特异性的第一组引物；(ii)对第二核酸模板特异性的第二组引物；和(iii)对第一核酸模板扩增产物特异性的第三组引物。第一和第三组引物可以是相同的，如此其包含在相同容器或区室内。第一和第三组引物还可以是不同的，例如与第一核酸模板上的不同或重叠序列杂交，或不同地标记。试剂盒还可包含(iv)包含第一核酸模板的核酸(DNA或RNA)；(v)包含第二核酸模板的核酸(DNA或RNA)。在一些情况下，组分(iv)和(v)在同一容器/区室内以等量存在，或第一和第二核酸模板在同一核酸上。
试剂盒还可包含(vi)对第一核酸模板的扩增产物特异性的第一带标记探针，和/或(vii)对第二核酸模板的扩增产物特异性的第二带标记探针。
试剂盒还可包含进行预扩增和下游分析的试剂，例如扩增酶(Taq，逆转录酶，或其它RNA或DNA聚合酶)，缓冲液，单核苷酸混合物，插入型染料等。试剂盒还可包含用于进行预扩增和下游分析的耗材，例如多孔板、试管、样品池、滴管等。试剂盒还可包含扩增抑制剂，例如作为帮助确定预扩增反应中异常的阈值的对照。
G.实施例
实施例1
材料
试管1混合物(50x):模板1+S1引物(2.5-5μM)
模板2(与模板1浓度相同)
qPCR混合物：S1引物+S2引物+扩增酶
方案：
将1μL试管1混合物掺入包含样品的预扩增反应中，进行N轮循环的预扩增反应。用预扩增产物进行qPCR(定量PCR)。模板1的Cq(Cq1)比模板2的Cq(Cq2)小约N轮循环，表示在预扩增反应中不存在异常。可选对照：(1)将1μl试管1混合物掺入qPCR中，而不进行预扩增。Cq1和Cq2应当是相同的(排除T1和T2扩增之间的热动力学差异)；(2)进行不含样品的预扩增，然后qPCR。Cq1和Cq2应当是相同的，除非样品包含抑制因子。
特征
该方法显示了预扩增是否运作以及运作至何种程度。试管1混合物可用作内部对照，例如校验相续多孔板中运行的反应。可对每个样品检测抑制因子的存在。
实施例2
材料
试管1混合物(50x):180聚体DNA，包含Sp-1和Sp-2靶模板序列
Sp-1引物(2.5-5μM)
试管2:Sp-1qPCR引物(20x)
试管3:Sp-2qPCR引物(20x)
方案：
将1μL试管1混合物掺入包含样品的预扩增反应中，进行N轮循环的预扩增反应。用各1μl的试管2和试管3对预扩增产物进行qPCR。模板1的Cq(Cq1)比模板2的Cq(Cq2)小约N轮循环，表示在预扩增反应中不存在异常。可选对照：(1)将1μl试管1混合物掺入qPCR中，而不进行预扩增。Cq1和Cq2应当是相同的(排除T1和T2扩增之间的热动力学差异)；(2)进行不含样品的预扩增，然后qPCR。Cq1和Cq2应当是相同的，除非样品包含抑制因子。
特征
该方法显示了预扩增是否运作以及运作至何种程度。试管1混合物可用作内部对照，例如来校验相继多孔板内进行的反应。可对每个样品检测抑制因子的存在。另外，由于对照模板都在同一核酸上，模板浓度必定相同。
提供上述公开内容用于说明而非限制本发明的范围。本发明的变化形式对于本领域普通技术人员将是显而易见的并包括在所附权利要求中。通过引用将本文引用的所有发表物、数据库、网络资源、专利、专利申请和登录号全部纳入本文用于所有目的。

Claims (33)

1.一种检测第一扩增反应中的状况的方法，其特征在于，包括：
配制第一混合物，其中所述第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、对第一核酸模板特异性的第一组引物、和包含样品核酸的样品；
对所述第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；
配制第二混合物，其中所述第二混合物包含产物、对第二核酸模板特异性的第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物；
对所述第二混合物进行第二扩增反应，其中所述第二扩增反应是定量的；
确定和比较第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数(Cq1)和第二模板扩增达到Cq所需循环数(Cq2)；和
当达到Cq2所需的循环数和达到Cq1的循环数之间的差异小于循环数阈值时，在所述第一扩增反应中检测到状况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述循环数阈值与第一循环数相差1个循环以内。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一混合物还包含对样品核酸模板特异性的第四组引物。
4.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板在所述第一混合物中等量存在。
5.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。
6.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。
7.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一组引物和所述第三组引物相同。
8.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一扩增反应是PCR。
9.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一循环数是10-20。
10.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述第一扩增反应是逆转录，所述第一核酸模板是RNA。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二核酸模板是DNA。
12.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板长度相同或相差在10个核苷酸内。
13.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第二扩增反应是实时PCR或数字PCR。
14.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，在配制所述第二混合物前从所述产物除去所述第一组引物。
15.如前任一权利要求所述的方法，其特征在于，在所述第二混合物中所述产物至少稀释10倍。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
装有对第一核酸模板特异性的第一组引物的第一容器；
装有对第二核酸模板特异性的第二组引物的第二容器；
第一核酸模板和第二核酸模板；和
对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引物。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板在第一容器内。
18.如权利要求16或19所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板等量存在。
19.如权利要求16-20中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述第三组引物在第二容器内。
20.如权利要求16-21中任一所述的试剂盒，其还包含对第一核酸模板的扩增产物特异性的第一带标记探针，和对第二核酸模板的扩增产物特异性的第二带标记探针。
21.如权利要求16-20中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述第二和第三组引物中的至少一种引物被标记。
22.如权利要求16-21中任一所述的试剂盒，其还包含扩增酶。
23.如权利要求16-22中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。
24.一种检测第一扩增反应中的状况的方法，其特征在于，包括：
配制第一混合物，其中所述第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、对第一核酸模板特异性的第一组引物、和包含样品核酸的样品；
对所述第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物；
配制第二混合物，其中所述第二混合物包含产物、进行第二核酸试验的试剂，其中第二核酸试验是定量的；
对所述第二混合物进行第二核酸试验；
确定并比较所述第二混合物中第一核酸模板扩增产物量的指示信号和所述第二混合物中第二核酸模板量的指示信号；和
其中当所述第二混合物中第一核酸模板扩增产物量和第二核酸模板量之间的差异小于阈值时，在第一扩增反应中检测到状况。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述第二核酸试验是杂交试验。
26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述进行第二核酸试验的试剂包括对第一核酸模板扩增产物特异性的带标记探针和对第二核酸模板特异性的带标记探针。
27.如权利要求24-26中任一所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中等量存在。
28.如权利要求24-27中任一所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。
29.如权利要求24-27中任一所述的方法，其特征在于，所述第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。
30.如权利要求24-28中任一所述的方法，其特征在于，所述第一扩增反应是PCR。
31.如权利要求24-30中任一所述的方法，其特征在于，所述第一混合物还包含对样品核酸模板特异性的第三组引物。
32.如权利要求24-31中任一所述的方法，其特征在于，所述第一循环数是10-20。
33.如权利要求24-32中任一所述的方法，其特征在于，所述阈值是第二核酸模板量的210-220倍。
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