CN101821619A - 拷贝数变化确定、方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的用于确定受试者基因组中靶多核苷酸拷贝数变化的方法和系统包括基于扩增的技术。所述方法可以包括预扩增样品，及随后分配样品和许多反应体积，定量检测靶多核苷酸和参考多核苷酸，和分析以确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数。
Description
对相关申请的交叉参考
本申请按照35U.S.C.§119(e)，要求2007年9月7日提交的美国临时专利申请号60/967,897的权利，通过参考将其全部公开内容引入本文。
发明领域
本发明涉及用于确定来自小群体或个体基因组内拷贝数变化的方法并发现在生物学和医学中的应用。
发明背景
“数字PCR”指这样的方法，其中在PCR扩增一种以上靶序列之前，将样品中存在的单个核酸分子分配到许多单独的反应体积(例如，室或等分试样)中。调节样品中单个分子的浓度，以使得在分配后，每个反应体积包含少于一个离散的多核苷酸分子(或连接的多核苷酸分子的集合)，且大部分室包含0或一个分子。靶序列的扩增导致二进制数字输出，其中每个室被确定为包含或不包含表示相应靶序列存在的PCR产物。包含可检测的PCR终产物水平的反应体积的计数是绝对核酸量的直接测量。在一种数字PCR版本中，多核苷酸分子通过分隔它们而被分配到单独的反应体积中。一种分隔方法使用BioMarkTM 12.765数字阵列(Fluidigm Corp.，South San Franscisco，CA)。该芯片利用将样品混合物和试剂分隔到765个纳升体积反应室中的集成电路通道和电子管。将每个混合物中的DNA分子随机分隔到每组的765个室中。然后热循环该芯片，并在Fluidigm′sBioMark实时PCR系统上成像，且最初包含1个以上分子的阳性室可以通过数字阵列分析软件来计数。关于数字PCR的讨论，参见，例如，Vogelstein和Kinzler，1999，Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院学报)96：9236-41；McBride等，美国专利申请公开号20050252773，特别是实施例5；
拷贝数变化(CNVs)是基因组区域的获得或缺失，其尺寸在500个碱基以上的范围内(通常在5千和5百万碱基之间)。全基因组研究已经揭示了大量CNV区域在人中的存在和遗传多样性在一般人群中广阔范围。CNV由于其在人遗传病症中的作用，一直是许多近期研究的焦点。参见，例如Iafrate等，2004，Detection of large-scale variation in the human genome(检测人基因组中的大规模变化).Nat Genet(自然遗传学)36：949-951；Sebat等，2004，Large-scale copy number polymorphism in the human genome(人基因组中的大规模拷贝数多形性).Science(科学)305：525-528；Redon等，2006，Global variation in copy number in the human genome(人基因组中拷贝数的综合变化).Nature(自然)444：444-454；Wong等，2007，Acomprehensive analysis of common copy-number variations in the humangenome(人基因组中常见拷贝数变化的综合分析).Am J Hum Genet(美国人类遗传学杂志)80：91-104；Ropers，2007，New perspectives for theelucidation of genetic disorders(阐明遗传病症的新观点).Am JHum Genet(美国人类遗传学杂志)81：199-207；Lupski，2007，Genomicrearrangements and sporadic disease(基因组重排和偶发性疾病).Nat Genet(自然遗传学)39：S43-S47，通过参考将其每篇引入。非整倍性，诸如三体性或全染色体缺失，是与许多人类疾病有关的局限型拷贝数变化。
发明简述
本发明涉及用于确定来自小群体或个体的基因组中拷贝数变化的方法。所述方法在通过数字PCR分析之前，提供目的基因在样品中的预扩增。预扩增步骤容许将基因的各个拷贝的分布分配到各个PCR反应样品中，从而以这样的方式检测，所述方式是比在无预扩增条件下由数字PCR确定时更能代表实际的拷贝数。
本发明的基于数字PCR的方法具有以非常高的精确性辨别基因拷贝数小于2倍的差别的能力。例如，它可以在不同样品中的1，2，3和4个基因拷贝之间作出区分。为了确保不同样品中基因拷贝数的表观差异是真实的，且不受由样品量的差异而失真，我们使用称为相对拷贝数的术语。基因的相对拷贝数(/人基因组)可以表述为靶基因拷贝数与DNA样品中单拷贝参考基因的拷贝数的比，通常是1。例如，RNA酶P基因是编码RNA酶P的RNA结构部分的单拷贝基因，且可以用作拷贝数测定中的参考基因。
可商购的用于进行数字PCR的数字阵列芯片，诸如图3中举例说明的，已经用于量化样品中的DNA。所述芯片具有12个用于引入样品混合物的样品输入端口。将每个样品混合物分隔到12个组的每一个组的765个反应室中。如文献(参见，例如，McBride等，美国专利申请公开号20050252773)中所述，量化样品中DNA的能力基于这样的事实，即当引入适当量的DNA时，单DNA分子随机分配到所述室中。
通过利用在一个芯片上使用两种荧光染料的两种基因(例如RNA酶P和另一种目的基因)的两种测定，可能同时量化同一DNA样品中的RNA酶P和另一种基因并获得这两种基因比例和目的基因拷贝数的良好评估。
然而，当复制时，一种基因的多拷贝可以紧密连接在相同染色体上并因此不能彼此分隔开，即使在数字阵列上。结果，多拷贝应该表现为一个分子，并且会非常低估基因拷贝总数。
本发明通过在该过程中包括预扩增步骤解决这个问题。预扩增是使用目的基因和参考基因(例如，RNA酶P基因)的引物的PCR反应。其典型地进行有限次数的热循环(例如10次循环)；假定相等的PCR效率，这两种基因的拷贝数在预扩增步骤中按比例增加。利用该过程，即使基因多拷贝在基因组上连接在一起，但是，预扩增后，目的基因的每个拷贝应该分别扩增，且应该分别分隔到数字阵列的不同室中。由于两种基因新产生的分子反映最初的比例且它们不再连接，所以数字芯片分析可以精确量化这两种基因的分子和测量这两种基因的比例(因此，目的基因的拷贝数)。
因此，本发明提供用于进行基于基因的分析的系统和相关方法。更具体地，本发明的方法和系统通常涉及确定来自受试者的样品中目的多核苷酸的拷贝数变化。
在一个方面，本发明提供用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数的方法，包括以下步骤：
a)预扩增包含受试者基因组DNA的样品中的靶基因序列和参考基因序列；由此生成扩展的样品；
b)通过将(a)的产物分配到许多独立的反应体积中进行数字PCR，在各个反应体积中扩增靶基因序列和参考基因序列，和确定扩增样品中靶基因序列和参考基因序列的相对量，其中扩增样品中靶基因序列和参考基因序列的相对量对应于基因组中靶基因序列和参考基因序列的相对量。
在相关的方面中，本发明提供用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列相对拷贝数的方法，包括以下步骤：
预扩增包含受试者基因组DNA的样品中的靶基因序列和参考基因序列；
通过数字PCR测定预扩增样品的靶基因序列和参考基因序列；
确定(a)包含靶基因序列的扩增的多核苷酸分子数和(b)包含参考基因序列的扩增多核苷酸分子数和确定(a)与(b)的比例。
在相关的方面中，本发明提供用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的拷贝数的方法，包括以下步骤：
进行获自受试者的DNA样品的第一次多核苷酸扩增，其中靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列，扩增所述具有预确定基因组拷贝数N的参考序列，由此生成扩增的样品；
将扩增的样品的全部或一部分分配到许多孤立的反应体积中；
在各个反应体积中进行第二次多核苷酸扩增，其中靶多核苷酸序列或其子序列(subsequence)如果存在，则被扩增，且参考多核苷酸序列或其子序列如果存在，则被扩增；
确定其中存在靶多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量A和确定
(b)其中存在参考多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量B；
其中基因组中的靶多核苷酸的拷贝数大约等于(A)/(B)x N。
在一些实施方案中，样品来自人。在具体的实施方案中，(a)与(b)的比是约0.5且在一个染色体上存在(a)的缺失，或(a)与(b)的比是约1.5且在一个染色体上存在(a)的重复。在一些实施方案中，靶基因序列与参考基因序列的比显著偏离数值1显示患者基因组中的异常靶基因序列拷贝数。
在一些实施方案中，进行第一次多核苷酸扩增包括组合生物样品和包含特异于靶多核苷酸序列的引物和特异于参考多核苷酸序列的引物的组合物，和进行聚合酶链反应(PCR)测定从而以基本相等的比例分别扩增靶多核苷酸和参考多核苷酸。
在一些实施方案中，第一次多核苷酸扩增具有4-15个热循环。在一些实施方案中，将反应体积置于微观流体装置中，且第一次多核苷酸扩增在与所述微观流体装置分开的反应体积中进行。
在一些实施方案中，在分配步骤前，扩增的样品的全部或一部分与为了扩增靶基因序列和参考基因序列选择的试剂组合。通常使用一部分，且扩增的样品可以在将一部分分配到反应体积中之前稀释。在一些实施方案中，所述扩增是PCR扩增。
在一些实施方案中，在第一次多核苷酸扩增步骤中所用的参考基因序列扩增引物与在第二次多核苷酸扩增步骤中所用的那些相同。在一些实施方案中，在第一次多核苷酸扩增步骤中所用的靶基因序列扩增引物与在第二次多核苷酸扩增步骤中所用的那些相同。在一些实施方案中，所述试剂包括在适合于多核苷酸扩增的条件下与靶基因序列选择性杂交的第一探针和与参考基因序列选择性杂交的第二探针。在一些实施方案中，所述第一和第二探针包括不同的可检测的标记物，且其中当基于聚合酶链反应(PCR)聚合时，所述第一或第二探针的结合或所述第一或第二探针的降解导致各自可检测的标记物的可检测的荧光的变化。
在一些实施方案中，参考基因序列包括至少部分编码RNA酶P，β-肌动蛋白或GAPDH的多核苷酸序列。在一些实施方案中，确定靶基因序列的相对拷贝数包括检测受试者基因组中杂合性的减少。在一些实施方案中，靶基因序列与参考基因序列的比显著大于或小于1的数值显示患者基因组中杂合性的减少。
为了进一步理解本发明的性质和优势，应该联合附图参考以下具体说明。附图通过举例说明的方式代表本发明的实施方案。本发明能够在不偏离本发明的条件下在不同方面进行改变。因此，这些实施方案的附图/图和说明实质上是示范性的，而非限制性的。
附图简述
图1是举例说明如本文中所述本发明方法一般步骤的流程图。
图2A-2B举例说明按照本发明实施方案的微观流体装置的示范性通道设计。
图3是按照本发明实施方案的微观流体装置的简图。
图4A-4C描述例如图1中举例说明的微观流体装置的部分。
图5举例说明利用微观流体装置进行的示范性拷贝数变化结果。
图6举例说明利用微观流体装置进行的示范性杂合性减少结果。
图7是描述按照本发明实施方案检测杂合性减少的图。
图8是显示假象实验部分结果的示意图，其中确定靶序列T的拷贝数。示范了64x64的反应体积矩阵，其中靶序列被扩增并利用VIC标记的(黄色)探针检测，并且单拷贝参考序列被扩增并利用FAM标记的(绿色)探针检测。检测到19个具有黄色标记物的反应体积和12个具有绿色标记物的反应体积，这说明比例约为1.5(19/12＝1.58≈1.5)，说明存在3个靶序列拷贝/二倍体基因组。
发明详述
本发明用于确定患者基因组中靶多核苷酸序列拷贝数的方法和系统，包括与遗传疾病有关的拷贝数的变化。具体地，本文中所述的方法和系统可以用于利用源自患者的样品中存在的基因组物质，检测患者基因组中靶多核苷酸拷贝数变化。本发明的技术应该典型地使用基于多核苷酸扩增的测定，以确定样品中的靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列的相对拷贝数。已知基因组拷贝数是参考序列。同样地，靶多核苷酸拷贝数可以相对于参考多核苷酸进行分析，从而确定靶多核苷酸的相对拷贝数。靶和/或参考多核苷酸序列有时称为“基因”。然而，应该理解术语“基因”不表示必然编码蛋白的序列(或RNA)。
拷贝数检测和分析技术可以利用某些适合所谓的“数字分析”或“数字PCR”的高通量装置，诸如微观流体装置，其包括大量或高密度的小体积反应位点(例如，纳米-体积反应位点或反应体积)。因此，本发明的拷贝数变化的检测和分析技术可以包括将样品分配或分隔到处于反应/测定平台或微观流体装置，包括本文中所述的示范性装置中的数百到数千个反应体积中。
本发明的方法包括预扩增步骤，其中利用聚合酶链反应(PCR)或其他定量扩增技术来扩增来自生物样品的DNA(例如，基因组DNA)。示范性生物样品包括细胞(包括溶解的细胞和细胞匀浆(homoginates))，血清，和生物流体。尽管本文中的方法一般针对人DNA描述(例如，用于确定人患者基因组中的拷贝数变化)，但是应该公认该方法可以被改进/应用到任何具有遗传物质量变化的样品。例如，该方法可以用于动物、植物、细菌和真菌的遗传分析，以及用于人受试者的遗传分析。用于收集和处理包含DNA的生物样品的方法是公知的且不需要在本文中讨论。关于本发明的测定，DNA可以由细胞或生物流体分离，或测定可以利用，例如，包含DNA的细胞溶解产物进行。因此，用于本文中时，“DNA样品”可以指采用纯化、半纯化或未纯化形式的DNA，尤其是基因组DNA。用于本文中时，“由受试者获得DNA样品”的步骤仅指这样的事实，即DNA样品是用于随后分析步骤(例如，预扩增步骤)的起始物质。“获得DNA样品”不意味着这样的行为，例如，由受试者收集细胞，或分离DNA，而可以仅是获得装有预收集的DNA的管的事件。
图1举例说明用于进行本文中所述方法的一般步骤。在一个示范性实施方案中，本方法的步骤涉及提供预扩增主混合物，其包括测定引物、合适的缓冲系统、核苷酸和DNA聚合酶(诸如改进用于“热起始”条件的聚合酶)，将基因组DNA加入到预扩增主混合物中，预扩增目的序列和参考序列，和通过数字PCR分析(在终点测定或实时测定中)测定预扩增的序列，和相对于参考序列频率比较靶序列频率。应该公认提供图1是为了帮助理解本发明，而不意欲限制本发明。
在图1的最初步骤中，进行预扩增，即获自受试者的DNA样品的第一次多核苷酸扩增。在预扩增步骤中，靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列二者均扩增。用于PCR扩增的方法是公知的且需要在本文中描述。
在一些实施方案中，靶序列是这样的序列，关于所述序列的缺失或重复与目的表型有关。在一些实施方案中，靶序列是这样的序列，关于所述序列的缺失或重复与已知的目的表型无关，但需要关于所述序列在具体种群中的变化的分布或相关性的信息。
参考序列是具有已知的(或假定的)基因组拷贝数的序列。因此参考序列是基因组中不可能扩增或缺失的序列。不需要在每个测定中通过经验(emperically)确定参考序列的拷贝数。相反地，该拷贝数可以基于目的生物体中的正常拷贝数来假定。例如，人基因组中的一种有效的参考序列是RNA酶P基因的序列，所述RNA酶P基因是以两拷贝/二倍体基因组存在(且具有1的拷贝数/单倍体基因组)的单拷贝基因。为了举例说明，其他有效的参考序列包括β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；然而，应该理解本发明不局限于具体的参考序列。
预扩增可以作为使用关于RNA酶P(参考序列)和目的靶基因二者的引物的PCR反应来进行。典型地，反应进行有限次数的热循环(例如，5次循环，或10次循环)。在一些实施方案中，最佳循环次数应该取决于关于参考基因和靶基因的PCR效率。在某些实施方案中，预扩增测定过程中的热循环次数可以在约4-15次热循环，或约4-10次热循环的范围内。在某些实施方案中，热循环的次数可以是3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或大于15。
预扩增反应优选是定量的或按比例的。即靶序列和参考序列的扩增子的相对数量(比)应该反映被扩增的基因组(或其他)DNA中靶序列和参考序列的相对数量(比)。定量扩增的方法是本领域中已知的。参见，例如，Arya等，2005，Basic principles ofreal-time quantitative PCR(实时定量PCR的基本原则)，Expert Rev Mol Diagn(分子诊断的专家综述).5(2)：209-19。在重复基因的情形中，应该选择引物，以使得目的靶基因的每个重复拷贝被分别扩增。因此，在选择性预扩增和将样品分配到单独的反应体积中后，应该将与每种序列相对应的成比例数量的扩增子分配到反应体积中。因为这两种基因的新产生的分子反映初始的比例，所以随后的拷贝数分析可以量化靶基因和参考基因的分子数。结果，可以精确测量两种基因的比。因为已知参考序列的拷贝数，所以可以确定目的序列的拷贝数。
需要靶序列和参考序列的扩增效率近似或大致相等，从而不在两种基因拷贝数的比例中引入任何偏见。为了该原因，应该选择引物对和扩增条件，以获得这种结果。任何引物对的扩增效率可以容易地利用常规技术确定(参见，例如，Furtado等，″Application ofreal-time quantitative PCR in theanalysis of gene expression(实时定量PCR在分析基因表达中的应用).″DNA amplification：Current Technologies and Applications(DNA扩增：当前技术和应用).Wymondham，Norfolk，UK：Horizon Bioscience(英国：地平线生物科学)第131-145页(2004))。
尽管需要靶序列和参考序列的扩增效率大致相等，但是有限次数的预扩增热循环(典型地少于15，通常10以下，最经常约5)极大地减少效率中的任何差异，这样通常的差异可能对我们的结果具有不显著的影响。
如注意到地，扩增方法是本领域中已知的。为了举例说明，用于预扩增方法的反应混合物(预扩增组合物或混合物)典型地包含适当的缓冲液，约1-约10mM范围内，优选约2-约8mM范围内的镁离子(Mg2+)源，核苷酸，和任选地，去污剂，和稳定剂。一种合适的缓冲液的实例是浓度为约5mM-约85mM，优选浓度为10mM-30mM的TRIS缓冲液。在一个实施方案中，TRIS缓冲液浓度在反应混合物双倍强度(2X)形式中是20mM。反应混合物可以具有约7.5-约9.0的pH范围，以约8.0-约8.5的pH范围为典型。核苷酸浓度可以在约25mM-约1000mM的范围内，典型地在约100mM-约800mM的范围内。dNTP浓度的实例是100，200，300，400，500，600，700，和800mM。去污剂诸如吐温TM 20，
X 100，和NonidetTM P40也可以包括在反应混合物中。还可以包括稳定剂诸如二硫苏糖醇(DTT，Cleland试剂)或巯基乙醇。预扩增反应混合物应该包含用于预扩增反应的引物。该引物通常是与用于随后PCR测定的那些相同的序列，为了所述随后的PCR测定制备样品，尽管通常以减小的浓度制备。引物浓度可以比PCR测定中使用的引物浓度更大，相等，或更小。实施方案包括使用比PCR测定中引物浓度大约50，25，20，10或5倍，相等，或小10，20，35，50，65，75，100，125，150，175，和200倍的引物。预扩增中使用的引物可以包括随机引物，多聚A尾部，和设计用于目的PCR测定的特异性引物。
反应混合物任选包含用于标准化随后的实时定量PCR分析结果的参考染料。常用可商购参考染料的实例是ROX。包含ROX染料的可商购反应混合物是CellsDirect 2X反应混合物，目录号11754-100和11754-500，可购自Invitrogen Corporation(英杰公司)。
DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)也加入到反应混合物中。在一个实施方案中，Taq聚合酶诸如
Taq DNA是与在环境温度下抑制聚合酶活性的抗体复合的重组Taq DNA聚合酶。全部聚合酶活性在PCR变性步骤后恢复，从而提供“热起始”。
通过本发明的方法制备的预扩增样品特别适合于数字PCR分析和适合于区分基因的染色体重复。具体地，预扩增样品在许多低体积PCR实验中测定。在数字PCR中，对基因组DNA样品运行相同(或基本类似)的测定。关于给定基因组样品的单独反应的数量可以在从约2到超过1,000,000变化。优选地，对样品进行的测定的数量是100以上，更优选200以上，更优选300以上。较大规模的数字PCR还可以这样进行，其中对样品进行的测定的数量是500以上，700以上，765以上，1,000以上，2,500以上5,000以上，7,500以上，或10,000以上。进行的测定的数量还可以显著大，如至多约25,000，至多约50,000，至多约75,000，至多约100,000，至多约250,000，至多约500,000，至多约750,000，至多约1,000,000，或多于1,000,000测定/基因组样品。数字PCR测定中所用的DNA的量一般选择为使得各个单独数字PCR反应中存在一个以下核酸片段。
如图1中举例说明地，在预扩增步骤后，将包含具有成比例扩增的遗传物质的预扩增产物(例如与靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列相对应的扩增子)的样品(或其一部分)分配到离散的位置或反应体积中，以使得每个反应孔包括，例如，不超过约一个扩增子/体积的平均值。因此，大多数反应体积应该不具有扩增子，具有一个靶序列扩增子，或一个参考序列扩增子。一般地，稀释预扩增样品(典型地1∶10-1∶20)和/或使用扩增的样品的一小部分是有效的，从而调节扩增子的浓度，以使得仅(平均地)存在0或1个扩增子/反应体积。尽管在一些情形中，预扩增步骤的产物可以在不添加其他扩增试剂(例如，聚合酶)的条件下使用，但是添加用于扩增的新试剂包括，任选地，不同的引物通常是有效的。因此，生物样品，在分配之前或之后，可以与选择用于定量或不定量扩增靶多核苷酸序列和参考多核苷酸12的试剂组合(步骤2)。
而且，尽管预扩增步骤通常是PCR-型扩增，但是第二次扩增(即，扩增预扩增中产生的扩增子序列)可以利用任何扩增方法诸如，例如，且不仅限于，Nasba(Compton，，1991.Nucleic Acid Sequence-based Amplification(基于核酸序列的扩增)，Nature(自然)350：91-91，1991)和Eberwine方案(Van Gelder等，Amplified RNA synthesized from limited quantities ofheterogeneous cDNA(扩增的由有限量异源cDNA合成的RNA).Proc NatlAcad Sci U SA(美国国家科学院学报).1990)来进行。
如上注意到地，应该理解应该调节DNA模板和扩增子的量(起始基因组DNA，扩增循环次数，扩增效率和反应体积尺寸的函数)以获得理想的分布。本领域中技术人员可以确定预扩增产物中的扩增子浓度和计算用于输入的合适量。更方便地，可以测试预扩增产物的一组连续稀释物。例如，图3中所示的装置(商购自Fluidigm Corp.如BioMark 12.765数字阵列)容许12个稀释物同时检测。任选地，最佳稀释度可以通过生成线性回归图确定。对于最佳稀释度，该线应该是直的并经过原点。随后，可以由该图计算初始样品的浓度。
分配后，许多反应室中包含的基因组物质可以被扩增，从而进一步进行样品测定，以确定其中隔离与靶序列或参考序列相对应的扩增子的反应体积的数量(图1，14)。第二次扩增利用与预扩增中所用的相同的引物或不同的引物(例如嵌套组)进行。
可以进行样品的不同检测和分析，从而与参考多核苷酸相比，区分源自靶多核苷酸的信号(图1，16)。例如，单独的反应位点的分析可以用于计算包含靶多核苷酸序列的反应体积数和包含参考多核苷酸序列的反应体积数的比。方法还可以包括检测和分析关于受试者基因组中靶序列的遗传相关信息，包括检测遗传缺失或重复，杂合性减少，等，诸如非整倍性(例如三体性)和许多其他遗传异常。下文提供关于方法步骤的其他详细信息，包括多种不同检测和分析技术。
如上公开地，可以将包含预扩增产物或非扩增遗传物质的样品分配到检测和分析平台上的离散位置或反应体积中。样品的分配可以利用多种技术和装置诸如，例如，在包括许多小体积反应位点/室的微观流体装置中的基于流动的分配来进行。通常，执行本文中所述方法的分配步骤，以将目的样品物质，例如，靶序列和参考序列分隔到各个反应位点中，从而进行后继的检测和分析。
在许多反应位点或体积中的每一个中，可以进行一种或多种扩增测定，包括靶多核苷酸序列和选择的参考多核苷酸序列的多元反应检测定量分析/扩增。样品中检测到的序列的比可以利用检测技术，诸如数字PCR分析，监测实时PCR曲线和/或比较一种测定对比另一种测定的阳性反应室终点图像来计算。备选地，DNA样品中任何序列的浓度(拷贝数/μL)可以利用包含该序列至少一个拷贝的装置中的阳性反应室的数量计算，且可以确定靶序列和参考序列的浓度比，以计算拷贝数。参见，共同待审的美国专利申请号12/170414，″Method and Apparatus for Determining CopyNumber Variation Using Digital PCR(用于利用数字PCR确定拷贝数变化的方法和仪器)，″通过参考将其引入以实现所有目的。还参见Dube等，2008，″Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample UsingDigital PCR on a Nanofluidic Device(利用纳米流体装置上的数字PCR数学分析拷贝数变化)″PLoS ONE 3(8)：e2876.doi：10.1371/joumal.pone.0002876，通过参考将其引入以实现所有目的。
如上所述，本发明包括用于确定例如，患者基因组中靶多核苷酸拷贝数变化的方法和基于扩增的技术，且在一些情形中，预扩增步骤可以在将样品分配到微观流体装置中以用于随后定量扩增和分析之前进行。预扩增可以是理想的，例如，当一种靶基因的多拷贝在同一染色体上间隔很近，且因此靶序列不能最理想地在定量分析过程中彼此分隔开，例如，如被分配到微观流体装置中时。在这样的情形中，靶基因的多拷贝可能被少计或少量化为一个分子而不是两个。因此，可能低估基因的拷贝总数。
根据本发明，CNV计算应该典型地包括“相对拷贝数”的计算，从而方便地区分来自失真或测定无用数据(noise)/误差，诸如由样品量的差异引起的失真的不同样品中基因拷贝数的明显差别。基因的相对拷贝数(/基因组)可以表示为患者基因组中已知浓度(拷贝数)的DNA样品中靶基因的拷贝数与单拷贝参考基因的拷贝数的比，其典型地等于1。通过用于在同一数字阵列上具有两种不同标记物(例如，荧光染料)的两种基因(靶多核苷酸和参考多核苷酸)的两种测定，本文中所述的方法可以用于同时量化同一DNA样品中的这两种基因。备选地，且较不方便地，靶扩增子(来自预扩增)可以在反应体积组的一个芯片上扩增，并且可以在不同扩增子组中测定测试扩增子(来自预扩增)，并比较数据。这两种基因的比是DNA样品中靶多核苷酸序列，或目的基因的相对拷贝数。在一种方法中，可以将该方法概括为确定其中存在靶多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量(A)和确定其中存在参考多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量(B)，并确定基因组中的靶多核苷酸的拷贝数大约等于(A)/(B)xN，其中N是预确定的参考序列基因组拷贝数。应该理解，(A)/(B)x N与拷贝数密切相关，因为大部分生物体中的倍性很低(例如，人通常具有两拷贝的体染色体)而本发明中检测的扩增子的数量固有地经历实验误差。例如，(A)可以通过实验确定为是936且(B)可以通过实验确定为是596，且N可以是1/单倍体基因组。(A)/(B)x N等于1.57(约1.5)，这应该理解为表示约1.5拷贝A/单倍体基因组(即，A的三体性)。参见图8和以下实施例。
多种检测平台或微观流体装置和方法可以用于实践本发明。在一些实施方案中，装置可以利用广泛多样的材料，诸如玻璃、塑料、硅、弹性聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷，聚氨基甲酸酯，或其他聚合物)构建。在本发明的某些实施方案中，用于执行本发明方面的微观流体装置典型地，至少部分地由弹性物质构建和通过单和多层软平版印刷术(MSL)技术和/或牺牲层(sacrificial-layer)包封法(参见，例如，Unger等，2000，Science(科学)288：113-116，和PCT公开号WO 01/01025，通过参考将二者整体引入本文，以获得所有目的)构建。利用所述方法，可以设计微观流体装置，其中经由装置的液流通道的溶液流动至少部分地受到通过弹性膜或片与液流通道分开的一个以上控制通道的控制。该膜或片可以偏斜到液流通道中或由液流通道中缩回，在具有所述膜或片的条件下，通过对控制通道施加冲力(actuation force)连接控制通道。通过控制膜偏斜进入液流通道或由液流通道中缩回的程度，溶液流经过液流通道可以被减慢或完全阻断。利用这种类型的控制通道和液流通道的组合，可以制备多种不同类型的用于调节溶液流的阀和泵，如Unger等，见上，PCT公开号WO 02/43615和WO01/01025中广泛详细记述的。
本文中所述微观流体装置中的样品分配可以进行，这部分地归因于弹性材料的某些特性，这是本领域中普遍公认的。例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry(当代聚合物化学)，第二版)将“弹性体”或“弹性材料”一般描述为在其玻璃化转变温度和液化温度之间存在的聚合物。弹性材料表现出弹性特性，因为聚合物链容易经历扭转运动，从而允许对力响应而解开主链，其主链再盘绕用于呈现缺乏力条件下的先前形状。通常，弹性体在施加力时变形，但然后在去除力后恢复到它们的初始形状。由弹性材料表现出的弹性可以通过杨氏模量来表征。本文中公开的微观流体装置中所用的弹性材料典型地具有约1Pa-1Tpa，在其他情形中约10Pa-100Gpa，在另外其他情形中约20Pa-1Gpa，在再其他情形中约50Pa-10MPa，和在某些情形中约100Pa-1MPa的杨氏模量。根据具体应用的需要，也可以使用具有这些范围以外的杨氏模量的弹性材料。
假设聚合物化学、前体、合成方法、反应条件、和潜在添加剂的极大多样性，可以选择广阔范围的性能以用于特定用途和应用。因此，关于本发明，存在大量可以用于制造单片式(monolithic)弹性微阀和泵的可能的弹性体系统。本文中所述的微观流体装置中的一些由弹性聚合物诸如GERTV 615(制剂)，乙烯基-硅烷交联的(型)硅弹性体(家族)来制造。然而，本发明的微流体系统不局限于这一种制剂、类型或甚至这个聚合物家族，而是，近乎任何弹性聚合物都适合。材料选择典型地取决于进行应用所需的具体材料的特性(例如，耐溶剂性、硬度、气体渗透性、和/或温度稳定性)。关于可以用于制造本文中公开的微观流体装置的组件的弹性材料类型的另外详细信息记述在Unger等(2000)Science(科学)288：113-116，和PCT公开号WO 02/43615，和WO 01/01025中，且通过参考将其整体引入本文，以实现所有目的。
装置制造和热循环。
如所示，本发明的技术可以引入使用广泛多样的检测平台，包括适合于数字分析或数字PCR的高通量微观流体装置。装置制造方面、系统组件、和热循环方面更详细地记述在下文中。
在一个实施方案中，适合用于本发明中的微观流体装置可以利用单和多层软平版印刷术(MSL)技术和/或牺牲层包封法构建。一种基本的MSL方法涉及在微型机械模上铸造一系列弹性层，从所述铸模去除所述层和然后将所述层融合在一起。在牺牲层包封法中，在需要通道处沉积(deposit)光致抗蚀剂图案。这些技术及其在生成微观流体装置中的应用详细地，例如，通过Unger等(2000)Science(科学)288：113-116，和通过Chou，等(2000)″Integrated Elastomer Fluidic Lab-on-a-chip-Surface Patterning andDNA Diagnostics(芯片表面上的完整弹性体流体实验室生理模式疗法和DNA诊断学)，″在Proceedings of the Solid State Actuator and SensorWorkshop(固态制动器和传感器工场学报)中，Hilton Head，S.C.；和在PCT公开号WO 01/01025中讨论，通过参考将其中每篇整体引入本文，以实现所有目的。
简言之，前述示范性制造法最初涉及通过使用光致抗蚀剂(Shipley SJR5740)的照相平版印刷术为硅片上的顶层(例如，具有控制通道的弹性层)和底层(例如，具有液流通道的弹性层)制造母模。通道的高度可以受到旋转涂镀速度的精确控制。光致抗蚀剂通道通过使光致抗蚀剂暴露于UV光随后显影形成。热回流过程和保护处理典型地如由M.A.Unger，H.-P.Chou，T.Throsen，A.Scherer和S.R.Quake，Science(科学)(2000)288：113所述实现，通过参考将其整体引入本文。然后将混合的两部分硅弹性体(GERTV 615)分别旋压到底模中和倒到顶模上。旋转涂镀可以用于控制底聚合物流体层的厚度。在80℃烤箱中焙烤25分钟后，将部分硬化的顶层从其模上剥离，与底层对齐并组装。在80℃的1.5小时最后焙烤用于不可逆地结合这两层。一旦由底硅母模中剥离，该RTV装置典型地用HCL(0.1N，在80℃30分钟)处理。该处理起断裂一些Si-O-Si键的作用，由此暴露出使通道更具亲水性的羟基。
所述装置然后可以任选地密封地与支持物密封在一起。所述支持物可以由基本上任何材料制造，尽管表面应该是平的以确保良好的密封，因为形成的密封主要归因于粘着力。合适的支持物的实例包括玻璃、塑料等。
按照前述方法形成装置导致底物(例如玻璃载玻片)形成液流通道的一个壁。备选地，所述装置一旦从母模中去除，便与薄弹性膜密封在一起，从而使流体通道完全封在弹性材料中。由此生成的弹性装置可以然后任选地与底物支持物相连接。
层形成
在一个实施方案中，微观流体装置，包括其中在制造过程中将试剂置于反应位点处的那些，由三层形成。底层是在其上放置试剂的层。底层可以由多种弹性材料形成，如以上关于MLS法所引用的参考文献所述。典型地，所述材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体。基于具体装置所需的反应位点排列和位置，可以确定底层上应该点样合适试剂的位置。因为PDMS是疏水性的，放置的水性斑点缩小，从而形成非常小的斑点。任选放置的试剂这样放置，以使得在试剂和弹性体表面之间不形成共价键，因为，如先前所述，所述试剂一旦被引入到反应位点中，意欲溶入样品溶液。
所述装置的其他两层是其中形成液流通道的层和其中形成控制和任选保护通道的层。这两层按照本部分中先前所述的一般方法制备。然后将由此产生的两层结构置于在其上放置了试剂的第一层上。三层组合物的具体实例如下所述(组分A与组分B的比)：第一层(样品层)30∶1(重量)；第二层(液流通道层)30∶1；和第三层(控制层)4∶1。然而，预期也可以使用弹性成分的其他组合和比例。在该过程中，反应位点与放置的试剂对齐，以使得试剂位于合适的反应位点内。
根据本发明，热循环可以在微观流体装置上进行。具体地，热循环可以用于运行扩增反应，所述扩增反应促进在反应室中分配的样品的分析。
可以使用许多不同复杂度的不同选择来在微观流体装置的选定区域或整个装置内控制温度。因此用于本文中时，术语温度控制器最广义地意指可以调节整个微观流体装置或微观流体装置的一部分中(例如，在具体的温度区内或在盲通道型微观流体装置矩阵中的一处以上连接处)的温度的装置或元件。
一般，将装置置于热循环板上以使装置热循环。许多这样的板可以方便地由商业来源获得，包括例如ThermoHybaid Px2(Franklin，MA)，MJ研究PTC-200(南旧金山，CA)，Eppendorf Part#E5331(Westbury，NY)，TechnePart#205330(普林斯顿，NJ)。
为了确保热循环步骤的精确性，在某些装置中有效地在该装置的不同区域处引入检测温度的传感器。一种用于检测温度的结构是热电偶。这样的热电偶可以构建为在下面的底物材料上形成图案的细膜丝，或直接引入到微制造的弹性体材料本身中的丝。
温度检测/监测的不同手段可以包括在本发明的系统/装置中。例如，温度还可以通过电阻变化感受到。热-彩色材料是另一种可用于检测扩增装置区域上温度的结构。另一种检测温度的方法通过使用红外照相机。再一种温度检测方法通过使用热电传感器。按照本发明的实施方案，其他电学现象，诸如电容和电感，可以用于检测温度。利用已知的关于热扩散系数方程式和关于装置中使用的弹性体和玻璃的合适数值，可以计算反应位点内温度达到控制器试图维持的温度所需的时间。
除多种潜在合适的材料组合和特性外，适合用于本发明的微观流体装置可以包括多种形状、设计、通道构造，等。装置应该典型地包括许多“液流通道”，其一般指溶液可以经由其流动的流动途径。另外，所述装置可以包括“控制通道”，或设计与液流通道连接的通道，以使得其可以用于驱动在液流通道内流动。装置还可以包括进一步调节流体流动的特征，诸如“阀”，其可以包括这样的构造，其中液流通道和控制通道交叉且由弹性膜分开，所述弹性膜可以响应冲力偏斜到液流通道中或由液流通道中缩回。而且，某些实施方案可以包括“通路(via)”，其指在弹性装置中形成的用于提供流体接近到装置外部和一个以上液流通道之间的通道。因此，通路可以起例如样品输入端或输出端的作用。
本发明中可以实现许多类型的通道构造或设计。如图2A中举例说明地，本发明的装置中可以包括的一种类型的通道设计包括开放式通道设计。“开放式通道”或“开口端通道”指处于分开的道之间的液流通道，这样该液流通道具有与出口(exit)(例如，出口(outlet))分开的入口(entrance)(例如，入口(inlet))。一般地，开放式通道网络设计包括至少2个反向的液流通道通路或入口，其可以连接约一个或许多分支液流通道以形成开式通道网络。可以驱动一个以上由相邻的/覆盖的控制通道形成的阀，以分隔分支通道的离散区域，从而形成反应位点。这样的阀提供关于可切换地分隔许多反应位点的机制。如本文中所述，装置可以包括一个以上开放式液流通道，一个以上通道由所述开式液流通道分支出来。一个以上反应区域或反应位点可以置于沿着液流通道长度的任何位置。可以驱动由覆盖的液流通道形成的阀，以分隔沿通道放置的反应位点，由此提供关于可切换地分隔反应位点的机制。因此，每个装置可以包括大量反应位点(例如，10,000+)且可以获得高反应位点密度，由此容许这些装置与传统微观流体装置相比尺寸的显著减小。开放式通道设计可以，例如，具有分支液流通道，可以从多于1个位置/通路连通所述分支液流通道。该设计方面可能特别有利，例如，如果具体通道/分支液流通道被阻隔或阻断(例如，由于制造变化、缺陷等)，因为流体可以由不同方向进入并填充通道以到达具体阻塞物或阻碍物的对侧。相反，仅由单端进入的具有阻塞物的通道仅可以被填充到阻塞物或阻碍物所在处并且，如果在阻塞物的另一边存在反应位点，则可以致使那些位点不能被使用。
如图2B中所示，适合按照本发明使用的微观流体装置可以利用“盲通道”或“盲填充”设计。这样的装置的部分特征在于具有一个以上盲通道，或具有封闭端的或孤立端的液流通道，这样溶液仅能在一端进和出盲通道(即，对于盲通道不存在分开的入口和出口)。这些装置对于每个盲通道仅需要单阀，以分隔盲通道区域，从而形成孤立的反应位点。在制造这种类型的装置过程中，一种以上用于进行分析的试剂可以任选地置于反应位点处，由此导致输入端和输出端数量的显著减少。因此，与盲通道相通的液流通道网络可以如此设置，以使得许多反应位点可以充满着单或有限量的入口(例如，小于5或小于10)。因为该装置由弹性材料制成，所述弹性材料足够多孔以使得液流通道和盲通道内的空气可以在将溶液引入到通道中时经由这些孔溢出，所以填充盲液流通道的能力变得可能。其他微观流体装置中所用材料的多孔性的缺乏排除盲通道的使用，因为盲通道中的空气在注入溶液时无法溢出。
在另一个实施方案中，本发明的微观流体装置可以除液流通道和阀或控制通道外，还任选地包括保护通道。为了减少样品和试剂从本文中提供的弹性微观流体装置中蒸发，可以在装置中形成许多保护通道。保护通道与控制通道类似，因为典型地它们在覆盖液流通道和/或反应位点的弹性体层中形成。因此，如控制通道一样，保护通道通过弹性材料膜或片断与其下面的液流通道和/或反应位点分开。然而，与控制通道不同地，保护通道的横断面面积更小得多。一般地，在相同施加的压力下，具有较小面积的膜应该比具有较大面积的膜偏斜更少。保护通道被设计为受压的，从而容许溶液(典型地水)流入保护通道。来源于保护通道的水汽可以扩散进入邻近液流通道或反应位点的弹性体的孔中，由此增加邻近液流通道或反应位点的水汽浓度并减少溶液从那里蒸发。为了进一步讨论微观流体装置中安装的并适合于按照本发明使用的保护通道，参见，McBride等，美国专利申请公开号20050252773，通过参考将其整体引入本文，以实现所有目的。
所述装置进一步包括许多反应位点，或反应体积，在所述反应位点或反应体积处容许试剂反应，并且装置可以结合不同工具(例如，泵和阀)，以选择性分隔反应位点。反应位点可以位于所述装置的大量不同位置中的任何位置处。
因为装置可以包括相对视觉上透明的弹性材料，所以反应可以容易地利用多种不同的检测系统，在微观流体装置上的基本任何位置处监测。当使用MSL型装置时，最典型地，检测出现在反应位点本身。这样的事实，即所述装置由基本透明的材料制成也意味着某些检测系统可以与目前不能与传统基于硅的微观流体装置一起使用的装置一起使用。检测可以利用结合到所述装置中的或与所述装置分开但与待检测装置区域对齐的检测器执行。
在本发明的某些实施方案中，反应体积内的反应利用混合物或试剂进行，所述混合物或试剂首先在与芯片分离的溶液中和其他系统成分混合(例如，与样品混合)并然后引入溶液中。
装置应该典型地设计和设置为进行温控反应，诸如热循环扩增反应。因此，装置可以被设置/设计为用于反应体积中的温控反应(例如，热循环反应)。装置或其部分，例如，弹性装置，可以固定到支持物(例如，玻璃载玻片)上。然后可以将由此形成的结构置于温控板上，例如，从而在不同反应位点处控制温度。在热循环反应的情形中，所述装置可以置于大量热循环板中任一个上。
如上所示，任选使用微观流体装置执行本发明的方法可以利用广泛多样的装置特征和设计来进行。以下说明更详细地描述可以用于进行多种分析，包括需要温控的分析(例如核酸扩增反应)的示范性设置。然而，应该理解，这些设置是示范性的且这些系统的改变对于本领域中技术人员应该是显然的。
图3是按照本发明的示范性实施方案的微观流体装置的简图。如图3所示，微观流体装置，也称为数字阵列，可以包括载体20，其可以由为微观流体装置的不同元件提供合适的机械支持的材料制成。作为实例，所述装置利用弹性聚合物制成。装置的外部具有与标准384-孔微量板相同的轨迹(footprint)并容许独立的阀运作。如下所述，存在12个输入端口，其对应于装置的12个分开的样品输入。该装置可以具有12个组22且这12个组的每一个可以包含765个6nL的反应室，其总体积为4.59μL/组。微粒体通道24可以将组上的不同反应室与流体源相连接，如下更完整记述地。
压力可以向蓄压器26施加，从而开启和关闭连接反应室和流体源的阀。如图3所示，可以提供12个入口28，以加样样品试剂混合物。在一些应用中使用48个入口28，以提供试剂源，当对蓄压器26施加压力时，所述试剂被供给到生物芯片。在其中不使用试剂的应用中，可以不使用入口28和试剂侧蓄压器(side accumulator)26。另外，在图3中所示的示范性实施方案中提供2个入口30，以提供对生物芯片的水合。水合入口30与装置流体相通，从而促进与反应室有关的湿度的控制。如本领域中技术人员应该理解地，制造所述装置中使用的一些弹性物质是可透气的，从而容许由反应室中蒸发的气体或水汽经过弹性物质进入周围大气中。在具体的实施方案中，位于装置外周部分的流体线在围绕反应室的组的生物芯片的外周部分提供水合液体例如缓冲液或主混合物屏蔽。因此，装置外周部分的湿度可以通过向水合入口30中添加挥发性液体，例如水来增大。在具体的实施方案中，第一入口与围绕生物芯片一侧上的组的水合流体线流体相通，且第二入口与围绕生物芯片另一侧上的组的水合流体线流体相通。
尽管上述装置和样品分布是进行本发明方法的一种示范性系统，但是本领域中技术人员应该公认用于设计本文中所述的微粒体装置的许多变化，变更，和备选方案。例如，尽管图3中所示的微观流体装置包括12个组，每个具有765个具有6nL/反应室的体积的反应室，但是这不是本发明所必需的。数字阵列的具体几何排列应该取决于具体的应用。因此，例如，本发明的范围不局限于具有12个组的数字阵列，所述组具有765个反应室，而是在本发明的范围内包括其他组合。与适合用于本发明的实施方案的数字阵列有关的其他说明在美国专利申请公开号2005/0252773中提供，通过参考引入本文。
运行大量重复样品可以需要显著量的试剂。在本发明的实施方案中，数字PCR在微量体积中进行。用于运行低体积PCR的反应室可以是约2nL-约500nL。反应室体积越低，可以运行(利用不同的探针和引物组或作为相同探针和引物组的重复或重复数量和不同测定数量的任何排列)的单独测定的数量越多。在一个实施方案中，反应室是约2nL-约50nL，优选2nL-约25nL，更优选约4nL-约15nL。在一些实施方案中，反应室体积是约4nL，约5nL，约6nL，约7nL，约8nL，约9nL，约10nL，约11nL，或约12nL。样品室可以由玻璃，塑料，硅，弹性聚合物诸如聚二甲基硅氧烷，聚氨基甲酸酯，或其他聚合物构建。通过本发明的方法处理的样品充分适合用于利用BioMarkTM系统(Fluidigm Corporation，South SanFrancisco(南旧金山)，CA)的可变拷贝数分析。BioMarkTM系统使用为了对多样品运行多测定而提供的聚二甲基硅氧烷微观流体装置。
Fluidigm微观流体装置(数字阵列)由Fluidigm Corporation(South SanFrancisco(南旧金山)，CA)制造。芯片按照多层软平版印刷术(MSL)方法学制造(Unger MA，Chou HP，Thorsen T，Scherer A，Quake SR，Monolithicmicrofabricated valves and pumps by multilayer soft Lithography(通过多层软平版印刷术单片式微制造的阀和泵)，Science(科学)2000；288：113-116)。芯片具有样品通道，所述样品通道具有10μm的平均半椭圆形深度，70μm的宽度，具有200μm的中心平行间距。样品射流(sample fluidics)使用双层模方法制造，从而创建沿着每个样品通道排列的265μm(深度)x 150μm x150μm的分隔室。在单独的硅层上，芯片的控制通道与样品通道垂直延伸。通道的交点形成用于定向流体的可偏斜的阀。在对控制通道加压时，层之间的薄膜关闭样品通道，从而分隔各个分隔室。控制通道是15μm深，50μm宽，具有300μm的中心平行间距。
将反应混合物，诸如PCR混合物，样品混合物，预扩增产物样品混合物，加样到每个组中，并将单DNA分子随机分隔到不同反应室中。对所述组和反应室加样后，数字阵列可以热循环并然后在合适的读数器，例如，可获自本受让人的BioMarkTM仪上成像。产生的数据利用可获自本受让人的数字PCR分析软件或其他合适的分析软件来分析。关于适合用于本发明实施方案的示范性检测和/或分析技术的其他说明在美国专利申请公开号美国申请号12/170,414，名称为″Copy Number Variation Determination byDigital PCR(通过数字PCR的拷贝数变化确定)，″中记述，其是共同待审且共同转让的，并因此通过参考引入本文以实现所有目的。
图4A-4C是图3中所示的装置/生物芯片的一部分的简图。图4A举例说明12个组22，每个组包括大量反应室。图4B举例说明组中包含的大量反应室40的几何排列。反应室40中心间隔200μm，如所示。图4C举例说明组的一部分的荧光图像。该图示的左侧是对照部分，其全部反应室以黑色表示。该图示的右侧显示在典型的实验中的情况，许多反应室是黑色的42，不产生显著的荧光发射。然而，一部分反应室具有荧光发射，这指示“阳性”反应室44。如上在图2B中所述，样品通道由左向右延伸，连接各个反应室，且控制通道在较下层中由上向下延伸。在对控制通道加压时，层之间的薄膜关闭样品通道，从而分隔各个反应室。阀分隔在PCR实验过程中保持关闭的各个室。
如贯穿本说明书更完整记述地，热循环芯片并在可获自本受让人的BioMarkTM实时PCR系统上成像，且数字PCR分析软件，诸如可获自本受让人的BioMarkTM数字PCR分析用于计数每个组中阳性室的数量。当两种使用两种荧光染料的测定用于多元数字PCR反应中时，可以独立地量化两种基因。这种独立量化基因的能力如本文中所述用于利用数字阵列研究拷贝数变化。可以在单PCR反应中独立量化的基因的数量取决于可用的荧光染料和滤光器的数量。
如上在一般方法步骤中所述，在样品分配后，另外的步骤包括扩增步骤，及随后检测和分析结果。在本发明的一些实施方案中，扩增和检测/分析可以利用将两步骤协调在一起的方法，例如定量PCR进行。一般地，每个反应位点内分隔的多核苷酸可以利用一定范围的可能的策略来扩增，检测和分析。一种示范性策略涉及扩增靶多核苷酸和参考多核苷酸，从而使扩增产物可以用于确定靶多核苷酸的浓度和参考多核苷酸的浓度。为了进行扩增，扩增所必需的试剂与样品组合，并包括在适合于多核苷酸扩增的条件下与靶多核苷酸选择性杂交的第一探针和与参考多核苷酸选择性杂交的第二探针。所述第一和第二探针可以包括不同的可检测的标记物，以使得在靶多核苷酸和参考多核苷酸扩增产物之间作出区分。此外，可以提供靶多核苷酸和参考多核苷酸的区别，从而进一步将靶核苷酸分子的浓度计算为参考核苷酸分子的比，由此确定受试者基因组内靶多核苷酸序列的相对拷贝数。
一般的扩增步骤及随后的检测和分析可以利用许多方式进行。
为了增强对贯穿本说明书所述的方法和系统的理解，技术术语一般地记述如下。术语“试剂”广义地指反应中使用的任何试剂。试剂可以包括自身可以被监测的单试剂(例如，加热时被监测的物质)或2种以上试剂的混合物。试剂可以是活体的(例如，细胞)或非活体的。用于核酸扩增反应的示范性试剂包括，但不仅限于，缓冲液，金属离子，聚合酶，引物，模板核酸，核苷酸，标记物，染料，核酸酶等。用于酶反应的试剂包括，例如，底物，辅因子，偶联酶，缓冲液，金属离子，抑制剂和活化剂。用于基于细胞的反应的试剂包括，但不仅限于，细胞，细胞特异性染料和结合细胞受体的配体(例如，激动剂和拮抗剂)。试剂可以包括在样品溶液中，或可以任选地以多种方式(例如，共价，非共价，通过合适的连接体分子)固定。在芯片上的核酸扩增反应中，例如，一种以上用于执行延伸反应的试剂在制造装置过程中，可以置于(例如，通过点样)每个反应位点处。
术语“标记物”指可以通过物理、化学、电磁和其他相关分析技术检测的分子或分子的示象(aspect)。可以使用的可检测的标记物的实例包括，但不仅限于，放射性同位素，荧光团，发色团，质量标记物，密电子颗粒，磁性粒子，自旋标记物(spin labels)，发射化学发光的分子，电化学活性分子，酶，辅因子，与核酸探针相连的酶和酶底物。术语“可检测地标记的”意指试剂已经与标记物缀合或试剂已经具有一些固有特性(例如，尺寸、形状或颜色)，所述固有特性容许其在不必须与单独的标记物缀合的条件下被检测。
术语“核酸”，“多核苷酸”，和“寡核苷酸”在本文中用于包括任何长度的核苷酸多聚体形式，包括，但不仅限于，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语之间不意欲存在长度差别。此外，这些术语仅指分子的一级结构。因此，在某些实施方案中，这些术语可以包括三-链，双链-和单-链DNA，以及三-链，双-链和单-链RNA。它们还包括修饰，诸如通过甲基化和/或加帽，和多核苷酸的未修饰形式。更具体地，术语“核酸”，“多核苷酸”，和“寡核苷酸”包括多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)，作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的多核苷酸的任何其他类型，和包含非核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和聚吗啉代(可商购自Anti-Virals，Inc.(抗病毒公司)，Corvallis，俄勒冈州，如Neugene)聚合物，和其他合成序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物包含处于这样的构象的核碱基(nucleobases)，所述构象容许碱基配对和碱基堆积，诸如DNA和RNA中存在的。
“探针”是这样的核酸，其能够通过一种以上类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成结合互补序列的靶核酸，由此形成双链体结构。探针与“探针结合位点”结合或杂交。探针可以用可检测的标记物来标记，从而允许探针的轻易检测，尤其是探针一旦与其互补靶标杂交。附着于探针的标记物可以包括本领域中已知可以通过例如，化学或物理方法检测的任何多种不同的标记物。可以附着于探针的合适标记物包括，但不仅限于，放射性同位素，荧光团，发色团，质量标记物，密电子颗粒，磁性粒子，自旋标记物，发射化学发光的分子，电化学活性分子，酶，辅因子，和酶底物。探针尺寸可以显著变化。一些探针相对短。一般地，探针长度是至少7-15个核苷酸。其他探针是至少20，30或40个核苷酸长。再其他探针还更长，且是至少50，60，70，80，90个核苷酸长。另外其它探针还更长，且是至少100，150，200或更多个核苷酸长。探针可以是也落入前述范围内的任何具体长度。
“引物”是这样的单链多核苷酸，其能够在适当的条件下(即，在存在四种不同三磷酸核苷和用于聚合的试剂，诸如，DNA或RNA聚合酶或反转录酶的条件下)，在适当的缓冲液中和在合适的温度下，起模板指导的DNA合成的起始点的作用。引物的合适长度取决于引物预期用途，但典型地是至少7个核苷酸长，且更典型地，长度在10-30个核苷酸范围内。其他引物可以稍微再长点，诸如3-50个核苷酸长。短引物分子通常需要较低的温度来与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的准确序列，但是必须充分互补，以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”指引物与之杂交的靶DNA片段。术语“引物对”意指一组引物，其包括与待扩增的DNA序列的5’末端的补体杂交的5’“上游引物”和与待扩增的序列的3’末端杂交的3’“下游引物”。
“完全互补的”引物具有在整个引物长度上完全互补的序列，并没有错配。引物典型地与靶序列的一部分(子序列)完全互补。“错配”指引物中的核苷酸和与其进行比对的靶核酸中的核苷酸不互补的位点。术语“基本互补的”用于涉及引物时，意指引物不完全与其靶序列互补，而是，该引物仅充分互补，从而在需要的引物结合位点处与其各自的链选择性杂交。
术语“互补的”意指一个核酸与另一个核酸分子相同，或选择性杂交。杂交的选择性在杂交发生时存在，即比完全缺乏特异性更具选择性。典型地，当在一段至少14-25个核苷酸上存在至少约55％，优选至少65％，更优选至少75％，和最优选至少90％的同一性时，将发生选择性杂交。优选地，一种核酸与另一种核酸特异性杂交。参见M.Kanehisa，Nucleic AcidsRes(核酸研究).12：203(1984)。
检测发生在“检测部位”，或“检测区域”。这些术语和其他相关术语指在该处发生检测的微观流体装置部分。如上所示，使用利用某些设计(例如，开放式通道设计，盲通道设计，等)的装置，检测部位通常是通过与每个反应位点有关的阀分隔开的反应位点。关于基于矩阵的装置的检测部位通常在邻近交叉点的液流通道区域内，交叉点本身内，或包括交叉点和周围区域的区域内。
如上讨论地，示范性拷贝数变化分析可以利用芯片上的定量PCR方法进行。具体地，定量PCR可以涉及多核苷酸的扩增和扩增产物的检测/分析。除qPCR外，多种所谓的“实时扩增”方法或“实时定量PCR”方法也可以用于通过测量在扩增过程自身过程中或之后形成的扩增产物的量来确定样品中存在的靶核酸的量。荧光团核酸酶测定是可以利用本文所述的装置成功使用的实时量化方法的一个具体实例。这种监测扩增产物形成的方法涉及利用双标记的荧光团寡核苷酸探针连续测量PCR产物的累积——一种在文献中经常称为“TaqMan”法的方法。
所述测定中使用的探针典型是用两种不同荧光染料标记的短(例如，约20-25个碱基)多核苷酸。该探针的5’端典型地附着报道染料且3’端附着猝灭染料，尽管染料也可以附着在探针上的其他位置。探针设计为至少具有与靶核酸上的探针结合位点互补的基本序列。与侧邻探针结合位点的区域结合的上游和下游PCR引物也包括在反应混合物中。
当探针完整时，两个荧光团之间发生能量转移且猝灭剂猝灭来自报道分子的发射。在PCR的延长期间内，探针被核酸聚合酶诸如Taq聚合酶的5’核酸酶活性裂解，由此从多核苷酸-猝灭剂释放报道分子，并导致报道分子发射强度的增大，所述发射强度可以通过合适的检测器测量。
特别适合于测量荧光发射诸如在荧光团测定过程中形成的那些的一种检测器是由位于Foster City，CA的Applied Biosystems，Inc.(应用化学系统公司)制造的ABI 7700。与该仪器一起提供的计算机软件能够在扩增过程中记录报道分子和猝灭剂的荧光强度。这些记录的数值可以然后用于计算在连续基础上的标准化报道分子发射强度的增加并最终量化扩增的mRNA的量。
关于用于进行实时确定扩增产物浓度的荧光团法的理论和操作的其他详细信息记述在，例如，Gelfand的美国专利号5,210,015，Livak，等的5,538,848，和Haaland的5,863,736，以及Heid，C.A.，等，Genome Research(基因组研究)，6：986-994(1996)；Gibson，U.E.M，等，Genome Research(基因组研究)6：995-1001(1996)；Holland，P.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)88：7276-7280，(1991)；和Livak，K.J.，等，PCRMethods and Applications(PCR方法和应用)357-362(1995)中，通过参考将每篇整体引入。因此，在扩增反应进行时，渐增量的染料结合并伴随着信号的附随增大。
在进行芯片上的扩增测定中，多元扩增可以在单反应位点内，通过，例如，利用许多引物来进行，每种引物在热循环过程中特异于具体的目的靶核酸(例如，靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列)。不同的扩增产物的存在可以利用区别标记以进行定量RT-PCR反应的探针或通过利用区别性标记的分子信标(beacons)来检测(见上)。在这样的方法中，将每种区别性标记的探针设计为仅与具体的扩增靶标杂交。通过明智地选择所用的不同标记物，可以进行这样的分析，其中单反应中的不同标记物在不同波长处受到激发和/或检测。关于选择适合于所述方法的适当荧光标记物的其他指导包括：Fluorescence Spectroscopy(荧光光谱学)(Pesce等，编)MarcelDekker，纽约，(1971)；White等，Fluorescence Analysis：A PracticalApproach(荧光分析：实践方法)，Marcel Dekker，纽约，(1970)；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules(芳香族分子荧光光谱手册)，第2版，Academic Press(学术出版社)，纽约，(1971)；Griffiths，Colour and Constitution of Organic Molecules(有机分子颜色和构造)，Academic Press(学术出版社)，纽约，(1976)；Indicators(指示剂)(Bishop，编).Pergamon出版社，牛津，19723；和Haugland，Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(荧光探针和研究化学制品手册)，MolecularProbes(分子探针)，Eugene(1992)。
当使用微观流体装置诸如开放式通道或盲通道设计装置进行核酸扩增反应时，可以置于反应位点内的试剂是进行所需类型的扩增反应所必需的那些试剂。通常，这意味着将放置一些或全部以下各项：例如，引物、聚合酶、核苷酸、金属离子、缓冲液、和辅因子。在这种情形中引入反应位点的样品是核酸模板。然而，备选地，模板可以被放置且扩增试剂可以流入反应位点中。当使用矩阵装置进行扩增反应时，包含核酸模板的样品可以流过垂直液流通道且扩增试剂流过水平液流通道或反之亦然。
一般地，多元基因型分型和表达分析可以，例如，在各个反应位点处进行。包含靶DNA的样品可以被引入到微观流体装置上的反应位点中。关于定量PCR方法诸如
用于扩增目的靶DNA的不同区域的引物包括在单一反应位点中。使用各个区域区别性标记的探针区分形成的产物，例如，靶多核苷酸和参考多核苷酸。如果靶DNA中存在探针与之互补的等位基因，则扩增发生，由此导致可检测的信号。基于获得哪种不同信号，可以确定多形性位点处的核苷酸身份。如果检测到两个信号，则存在两个等位基因。反应过程中的热循环如前在温控部分中所述地进行。
在本发明的一些实施方案中，可以包括与每个等位基因形式互补的区别性标记探针，其与引物、核苷酸和聚合酶一起作为试剂。然而，反应可以仅使用单一探针进行，尽管这可以造成关于信号的缺乏是由于缺乏特定等位基因还是由于仅是失败的反应的不明确性。对于典型的双等位基因的情形，其中2个等位基因对于多形性位点是可能的，2个区别性标记的探针，其分别与所述等位基因之一完全互补，通常与扩增引物，核苷酸和聚合酶一起，包括在试剂混合物中。
如图4C所示，可以检测和进一步分析来自每个反应位点的信号，以确定关于该样品的信息。例如，通过本发明的方法处理的样品充分适合用于利用BioMarkTM系统(Fluidigm Corporation，South San Francisco(南旧金山)，CA)和BioMarkTM荧光成像热循环系统的可变拷贝数分析。BioMarkTM系统使用聚二甲基硅氧烷微观流体装置，该装置提供对多样品运行多测定。
如贯穿本说明书更完整记述地，芯片，在一些实施方案中，可以被热循环并在可获自本受让人的BioMarkTM实时PCR系统上成像，且数字PCR分析软件，诸如可获自本受让人的BioMarkTM数字PCR分析用于计数每个组中阳性室的数量。当两种使用两种荧光染料的测定用于多元数字PCR反应中时，可以独立地量化两种基因。这种独立量化基因的能力如本文中所述用于利用数字阵列研究拷贝数变化。
如上一般所述，反应混合物，诸如PCR混合物，可以加样到每个组中，且可以将单DNA分子随机分隔到不同的反应室中。对所述组和反应室加样后，将数字阵列热循环并然后在合适的读数器，例如，可获自本受让人的BioMarkTM仪上成像。产生的数据利用可获自本受让人的数字PCR分析软件或其他合适的分析软件来分析。
如上所述，芯片上的定量PCR可以用于实施本发明的某些实施方案。虽然，许多不同的检测策略可以利用上述微观流体装置来使用。合适系统的选择部分地根据被检测的装置，事件和/或试剂的类型得知。检测器可以设计为用于检测许多不同的信号类型包括，但不仅限于，来自放射性同位素，荧光团，发色团，密电子颗粒，磁性粒子，自旋标记物，发射化学发光的分子，电化学活性分子，酶，辅因子，与核酸探针相连的酶和酶底物的信号。
例证性检测方法包括，但不仅限于，光散射，多通道荧光检测，UV和可见波长吸收，发光，不同反射率，和共焦激光扫描。可以用于某些应用的其他检测方法包括闪烁近程测定技术(scintillation proximity assaytechniques)，放射化学检测，荧光偏振，荧光相关谱(FCS)，时间分辨能量转移(TRET)，荧光共振能量转移(FRET)和变化诸如生物发光共振能量转移(BRET)。另外的检测选择包括电阻，电阻系数，阻抗，和电压传感。
检测部分可以与一种以上显微镜、二极管、光激发装置(例如，激光)、光电倍增管、处理器和前述的组合相连通，它们协作检测与具体事件和/或试剂有关的信号。被检测的信号经常是通过光学检测器在检测部分中检测到的光信号。光学检测器可以包括一种以上光电二极管(例如，雪崩光电二极管)，通向，例如，光电倍增管的光纤光导，显微镜，和/或摄影机(例如，CCD相机)。
检测器可以在微观流体装置中被微制造，或可以是单独的元件。如果检测器作为单独的元件存在，且微观流体装置包括多个检测部分，则检测可以在任何给定时刻，在单一检测部分内发生。备选地，可以使用扫描系统。例如，某些自动化系统扫描关于微观流体装置的光源；其他系统扫描检测器上面的发射光，或包括多通道检测器。作为具体的例证性实例，微观流体装置可以连接可转移的镜台(translatable stage)并在显微镜物镜下扫描。这样获得的信号再发送到用于信号解释和处理的处理器中。也可以利用光电倍增管的阵列。另外，可以使用具有在确定来自每个部分的信号的同时由所有不同的检测部分同时收集信号的能力的光学系统。
外部检测器是可用的，因为其所提供的装置完全或主要由在监测波长处光学透明的物质制成。该特性容许本文中所述的装置使用大量对于常规基于硅的微观流体装置不可能的光学检测系统。
在一个实施方案中，检测器使用CCD相机和提供大视野和高数字光圈的光径，从而最大化由每个反应室收集的光的量。在这一点上，使用CCD作为光检测器的阵列，其中每个像素或每组像素对应于反应室而非用于生成阵列的图像。因此，光学可以改变，以使得图像质量下降或散焦，从而增加光学系统的景深，以使从每个反应室收集更多光。
检测器可以包括用于激发产生可检测的信号的报道分子的光源。所用光源的类型部分取决于被激活的报道分子的性质。合适的光源包括，但不仅限于，激光，激光二极管和高强度照明器。如果使用激光，则激光可以用于横穿一组检测部分或单一检测部分来扫描。激光二极管可以被微装配到微观流体装置本身中。备选地，激光二极管可以被装配到位于邻近所用的微观流体装置的另一种装置中，从而进行热循环反应，以使得来自二极管的激光被指导到检测部分中。
检测还可以涉及许多非光学方法。例如，检测器还可以包括，例如，温度传感器，传导率传感器，电势传感器(例如，pH电极)和/或电流传感器(例如，用于监测氧化和还原反应)。
可以使用许多可商购的外部检测器。这些中的许多是荧光检测器，这归因于制备荧光标记的试剂的容易性。可用的检测器的具体实例包括，但不仅限于，Applied Precision ArrayWoRx(Applied Precision(应用精密)，Issaquah，WA))。
在一些实施方案中，使用基于FRET的检测方法。这种类型的检测方法涉及来自供体/受体荧光体对中的供体(报道分子)和/或受体(猝灭剂)荧光团的荧光的变化。选择供体和受体荧光团对，以使得供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠。因此，当使得荧光团对彼此足够接近时，发生由供体到受体的能量转移。该能量转移可以检测到。参见，美国专利号5,945,283和PCT公开WO 97/22719。
分子信标提供特别有效的方法。使用分子信标，探针在与扩增产物的互补区域杂交时的构象变化导致可检测的信号的形成。探针本身包括2个片段：5’末端处的片段和3’末端处的另一个片段。这些片段侧邻与探针结合位点退火的探针片段，并彼此互补。一个末端片段典型地附着报道染料且另一个末端片段通常附着猝灭染料。
在溶液中，两个末端片段可以彼此杂交形成发夹环。在该构象中，报道染料和猝灭染料足够靠近，以使得来自报道染料的荧光有效地被猝灭染料猝灭。杂交的探针，相反，导致线性化构象，其中猝灭程度减小。因此，通过监测两种染料的发射变化，可能间接监测扩增产物的形成。这种类型的探针及其使用方法进一步，例如，通过Piatek，A.S.，等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)16：359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F.R.，NatureBiotechnology(自然生物技术)14：303-308(1996)；和Tyagi，S.等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)16：49-53(1998)记述，通常参考将其每篇整体引入本文，以实现全部目的。
其他公知的扩增/检测方法(为了举例说明而非限制)包括Invader(参见Neri，B.P.，等，Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis(核酸和蛋白质分析进展)3826：117-125，2000)；Nasba(参见，例如，Compton，J.NucleicAcid Sequence-based Amplification(基于核酸序列的扩增)，Nature(自然)350：91-91，1991)；Scorpion(参见Thelwell N.，等Nucleic Acids Research(核酸研究)，28：3752-3761，2000)；和电容性DNA检测(参见，例如，Sohn，等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)97：10687-10690)。通过参考将这些参考文献中的每一篇引入本文，以实现所有目的。
如上所示，本发明的方法包括进行需要不同试剂、组合物、缓冲液、添加剂等的不同反应/扩增测定。反应混合物可以至少部分地与测定平台或微流体芯片/装置分开，或在装置本身的反应位点内(例如，点样)制备。某些反应混合物或组合物可以作为试剂盒或系统的一部分来制备或被包括。例如，系统可以包括预扩增混合物/组合物，扩增测定组合物，和进行扩增和拷贝数检测测定的微观流体装置。所述系统的2个以上部件可以作为试剂盒或系统的一部分来装配和提供。
使用本文中公开的微观流体装置进行的反应可以利用不同试剂、缓冲液、组合物、添加剂等进行，可以配制所述不同试剂、缓冲液、组合物、添加剂等以进行本发明的反应(例如，预扩增，定量扩增，等)。因此，例如，在其中放置试剂的装置的情形中，例如，试剂可以与一种以上反应物点样在反应位点处。在其他实施方案中，例如，当芯片上的点样不发生时，试剂可以以与芯片或其他系统部件分开的混合物或试剂体积的形式提供。一组添加剂是阻断试剂，其阻断弹性底物上的蛋白结合位点。可以使用广泛多样的这样的化合物，包括大量不同的蛋白(例如，明胶和多种清蛋白，诸如牛血清清蛋白)和甘油。去污剂添加剂也可以是有效的。可以使用大量不同去污剂中的任一种。实例包括，但不仅限于，SDS和多种Triton去污剂。
在核酸扩增反应的具体情形中，可以包括大量不同类型的试剂和/或添加物。一类是促进扩增反应的增强剂。所述添加剂包括，但不仅限于，减少核酸中二级结构的试剂(例如，甜菜碱)，和减少错误引发事件的试剂(例如，四甲基氯化铵)。
一般地，CNV计算基于“相对拷贝数”，因此不同样品中基因拷贝数的明显区别不由样品量的差别引起失真。基因的相对拷贝数(/基因组)可以表示为DNA样品中靶基因的拷贝数与单拷贝参考基因的拷贝数的比，其典型为1。通过使用关于两种基因(靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列)的在同一装置上使用两种不同荧光染料的两种测定，可以同时量化相同DNA样品中的两种基因。因此，两种基因的比是DNA样品中靶核苷酸序列的相对拷贝数。
在本发明的一个实施方案中，预扩增可以利用参考基因诸如RNA酶P来进行，所述RNA酶P是编码RNA酶P，即核糖核蛋白的RNA部分的单拷贝基因。
运行大量重复样品可以需要显著量的试剂。在本发明的实施方案中，数字PCR以微体积(microvolume)进行。用于运行低体积PCR的反应室可以是约2nL-约500nL。反应室体积越低，可以运行(使用不同的探针和引物组或作为相同探针和引物组的重复或重复数量和不同测定数量的任何排列)的单独的测定的数量越多。在一个实施方案中，反应室是约2nL-约50nL，优选2nL-约25nL，更优选约4nL-约15nL。在一些实施方案中，反应室体积是约4nL，约5nL，约6nL，约7nL，约8nL，约9nL，约10nL，约11nL，或约12nL。样品室可以由玻璃，塑料，硅，弹性聚合物诸如聚二甲基硅氧烷，聚氨基甲酸酯，或其他聚合物构建。通过本发明的方法处理的样品充分适合用于利用BioMarkTM系统(Fluidigm Corporation，South San Francisco(南旧金山)，CA)的可变拷贝数分析。BioMarkTM系统使用为了对多样品运行多测定而提供的聚二甲基硅氧烷微观流体装置。
Fluidigm装置/纳米流体芯片(数字阵列)和BioMark荧光成像热循环系统由Fluidigm Corporation(South San Francisco(南旧金山)，CA)制造。图5中举例说明的示范性芯片具有12个组并且这12个组中的每组包含765个6-nL的室，其总体积为4.59μL/组。芯片按照多层软平版印刷术(MSL)方法学制造。Unger MA，Chou HP，Thorsen T，Scherer A，Quake SR，Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft Lithography(通过多层软平版印刷术单片式微制造的阀和泵)，Science(科学)2000；288：113-116。芯片具有样品通道，所述样品通道具有10μm的平均半椭圆形深度，70μm的宽度，具有200μm的中心平行间距。样品射流使用双层模方法制造，从而创建沿着每个样品通道排列的265μm(深度)x 150μm x150μm的分隔室。在单独的硅层上，芯片的控制通道与样品通道垂直延伸。通道的交点形成用于定向流体的可偏斜的阀。在对控制通道加压时，层之间的薄膜关闭样品通道，从而分隔各个分隔室。控制通道是15μm深，50μm宽，具有300μm的中心平行间距。外部具有与标准384-孔微量板相同的轨迹(footprint)并容许独立的阀运作。存在12个输入端口，其对应于通向芯片的12个分开的样品输入。所用的芯片可以合并765个6nL的反应室/样品输入，其总数至多14,400个室/芯片。在该具体实施方案中，样品通道由左向右延伸，连接各个反应室，且控制通道在较下层中由上向下延伸。在对控制通道加压时，层之间的薄膜关闭样品通道，从而分隔各个反应室。阀分隔在PCR实验过程中保持关闭的各个室。
为了运行实时PCR反应，主扩增混合物(例如“主混合物”)与包括预扩增测定产物的样品组合。主混合物包含适当的缓冲液，约1-约10mM范围内，优选约2-约8mM范围内的镁离子(Mg2+)源，核苷酸，和任选地，去污剂，和稳定剂。一种合适的缓冲液的实例是浓度为约5mM-约85mM，优选浓度为10mM-30mM的TRIS缓冲液。在一个实施方案中，TRIS缓冲液浓度在反应混合物双倍强度(2X)形式中是20mM。反应混合物可以具有约7.5-约9.0的pH范围，以约8.0-约8.5的pH范围为典型。核苷酸浓度可以在约25mM-约1000mM的范围内，典型地在约100mM-约800mM的范围内。dNTP浓度的实例是100，200，300，400，500，600，700，和800mM。去污剂诸如吐温TM 20，
X 100，和NonidetTM P40也可以包括在反应混合物中。还可以包括稳定剂诸如二硫苏糖醇(DTT，Cleland试剂)或巯基乙醇。
我们是否需要这段？另外，主混合物可以任选地包含dUTP以及尿嘧啶DNA糖基化酶(尿嘧啶-N-糖基化酶，UNG)。UNO是大肠杆菌(Escherichia coli)ung基因的产物，且已在大肠杆菌中克隆，测序和表达。尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UNG)在不破坏DNA糖-磷酸二酯主链的条件下，从DNA(单-和双链)中去除尿嘧啶残基；因此，阻止其作为杂交靶标或作为DNA聚合酶的模板来使用。由此生成的脱碱基位点在升高温度下易受水解裂解的影响。因此，去除尿嘧啶碱基通常通过DNA断裂实现。Duncan，B.K.，和Chambers，J.A.(1984)GENE(基因)28，211，Varshney，U.，Hutcheon，T.，和van de Sande，J.H.(1988)1.Biol.Chem.(生物化学)263，7776.主混合物可商购自Applied Biosystems(应用的生物系统)，FosterCity，CA，(
通用主混合物，目录号4304437，4318157，和4326708)。UNG的应用典型地局限于数字PCR测定且不用在预扩增测定中。
为了多元应用，使用不同的荧光报道染料来标记用于量化不同基因的单独的引物或探针。关于利用多元PCR的相对表达研究，参考基因(例如，β-肌动蛋白或GAPDH)的引物的量应该是有限的，以避免参考和样品基因扩增之间的竞争。通常，参考基因引物的最终浓度应该在25-100nM。引物滴定可以有效用于最优化。
实施例
在本发明的一个示范性实施方案中，在进行和不进行预扩增的条件下，确定CYP2D6的拷贝数。利用预扩增，发现一份样品中的CYP2D6具有复制(拷贝数为3)，而在不预扩增条件下，相同样品表现出拷贝数2。
有效用于运行关于通过本发明方法制备的样品的PCR测定的PCR主混合物可以利用以下组成制备：20mM Tris，pH8.0，100mM KCl，1％甘油，0.04％吐温TM，5mM MgCl2，400mM dNTPs，0.08U/μL
Gold酶(Applied Biosystems(应用化学系统)，Foster City，CA)。AmpliTaq DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶的重组形式。其通过在大肠杆菌宿主中表达TaqDNA聚合酶基因获得。如同天然Taq DNA聚合酶，其缺少内切核酸酶和3′-5′外切核酸酶活性，但具有5′-3′外切核酸酶活性。
一个实施例中的预扩增在GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems(应用化学系统)，CA)上，在5μL含有I×PreAmp主混合物(Applied Biosystems，CA)，225nM引物(RNA酶P作为参考多核苷酸)和目的靶序列)，和1μL DNA样品的反应中进行。热循环条件是95℃，10分钟热开始和95℃15秒和60℃1分钟的10次循环。预扩增后将20μL水添加到每个反应中，并在数字阵列上分析样品。
在数字芯片上分析5份Coriell DNA样品。每份样品相同体积(4.59μL)中的CYP2D6和RNA酶P分子数量通过使用BioMark数字PCR分析软件，利用Poisson校正以及Simant运算法则来计数(参见Dube等，见上)。代表性热图谱以简化的黑白图示显示在图5中。尽管为了图示的目的以白色、黑色、和灰色事件显示，但是事件可以记录和绘图显示为彩色的，诸如黄色、绿色、或红色，其分别对应于RNA酶P基因(VIC，黄色)，CYP2D6基因(FAM，红色)，和无基因。在组1和12中运行无模板对照(NTC)。
获得关于5份样品的CYP2D6基因与RNA酶P基因的分子数的比。这些比例中的2个是约0.5，这意味着在这两份样品的每个细胞中仅存在CYP2D6基因的一个拷贝(RNA酶P是单拷贝基因且每个细胞中通常存在该基因的2个拷贝)。因此，从中收集DNA样品的个体必须在一个染色体上具有CYP2D6基因的缺失。其他三份样品具有约1的比例，但是这不排除复制的可能性，因为两个靠近相连的拷贝应该在一个分子上并不能被分开。对这5份样品进行预扩增反应并且在数字芯片上分析预扩增产物(表2)。
表2.预扩增区分基因染色体复制的应用
| 样品 | 数字PCRCYP2D6/RNA酶P | 预扩增-数字PCRCYP2D6/RNA酶P | CYP2D6的拷贝数 |
| NA12155 | 0.49 | 0.52 | 1 |
| NA12872 | 0.97 | 0.87 | 2 |
| NA07357 | 0.85 | 0.98 | 2 |
| NA12873 | 0.49 | 0.52 | 1 |
| NA11994 | 1.06* | 1.49* | 3 |
*样品NA11994在一个染色体上具有CYP2D6基因的复制
图表2所示，2份在使用基因组DNA时具有CYP2D6与RNA酶P比约0.5的样品，在使用本发明的预扩增过程时仍提供约0.5的比。0.5的比表示缺失。2份使用基因组DNA时具有约1的比的样品，在使用预扩增产物时也具有约1的比，这表示正常的等位基因状态。但是，1份在分析基因组DNA时具有约1的比的样品，在使用预扩增过程时具有1.5的比。这说明该样品具有CYP2D6基因的复制。
检测杂合性减少
所述确定具体目的基因拷贝数变化的方法的一种有效应用包括检测杂合性的减少(LOH)。本文中公开的技术可以在检测杂合性减少中提供新的灵敏性和灵活性水平。示范性应用包括检测和/或研究异常X染色体拷贝数，或非整倍体。杂合性的减少(LOH)指从正常基因组中的杂合状态到匹配的(paired)肿瘤基因组中纯合状态的改变。研究显示整个X染色体的缺失参与许多癌症。Moertel，C.A.等，Cancer Genet.Cytogenet.(癌症遗传学和细胞遗传学)67：21-27(1993)。例如，40％的卵巢癌与X染色体区域的LOH有关。Osboume，R.J.和Leech，V.，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)69：429-438(1994)。而且，X染色体的获得已经显示出在白血病和淋巴瘤中相对普遍。Sandberg AA.“The X chromosome in human neoplasia，including sex chromatin and congenital conditions with X-chromosomeanomalies(人瘤形成中的X染色体，包括性染色质和具有X染色体异常的先天性病症)。在：Sandberg AA，editor.Cytogenetics of the mammalian Xchromosome，part B：X chromosome anomalies and their clinicalmanifestations(哺乳动物X染色体的细胞遗传学，B部：X染色体异常及其临床表现).New York(纽约)：Alan R.Liss，459-98(1983)中。
为了进行LOH实验，可以提供如本文中所述的微观流体装置。图3显示在一个实施例中用于确定杂合性减少的示范性装置的构造(参见，例如，以上关于更多装置详细信息的讨论)。简言之，装置包括具有12个组的综合流体回路(IFC)，每个具有样品或测定混合物的流动输入。在一个实例中，样品向芯片转移以加样，并通过将数字阵列置于IFC控制器上和利用软件界面将测定成分压力加样到分开组的765个反应中来加样。将与主混合物和引物-探针组预混合的12份样品中的每一份分配到芯片框上的分开的入口中。在每个组中，将单样品分隔到765个单独的6nL实时PCR反应中。对样品进行PCR。将数字阵列置于实时PCR系统上，以进行热循环和荧光检测。来自该实验的结果利用
应用软件观察和分析。记录阳性室的实时PCR曲线或终点图像，从而比较一个测定和另一个测定，例如，计算DNA样品中任意两种序列的比。为了分析，数字阵列提供改善的线性、灵敏性和使用的容易度。
在所述实施例中，获得来自包含X染色体(Coriell Institute for MedicalResearch(Coriell医学研究所)，Camden，NJ)的1，2，3，4或5个拷贝的细胞系的DNA。使用数字阵列，针对三个不同的X染色体引物-探针组——FAM-标记的123B，SMS，和YY2(BioSearch Technologies(生物搜索技术)，Novato，CA)——其在存在单-拷贝-靶向的，VIC-标记的“参考”序列的条件下共扩增，测试每份样品。
图6显示黑白图表，其图示检查所述杂合性减少的基于彩色的结果，且还图示每个测试在数字阵列内的以复制组运行。图6还显示该装置组4的近视图。在每个组中，关于多种染料/室，计数和校正靶阳性(浅灰色，其对应于一种颜色，例如，黄色)和参考阳性(深灰色，其对应于第二种颜色，例如，红色)室的数目。由这些结果，确定靶与参考的粗比例。在组1和12中使用无模板对照(NTC)。应该理解，实践中，实验可以记录不同的颜色且结果以彩色，诸如红色和黄色图示，这在图6中以黑白图示表示为灰色。
使用简单的线性拟合来确定拷贝数。图7显示相对已知的X染色体拷贝数(X轴)绘图的三种不同的测定比的平均值(Y轴)，包括表示平均值标准误差的误差柱。所述比例生成关于已知含有X染色体的1，2，3，4或5个拷贝的DNA样品的斜率。每个粗比例测量值乘以2并平均化以获得拷贝数/二倍体基因组。关于所有测定的平均响应，超过1-5个拷贝数的变化，是0.994的r2值，表示高线性测定表现。
表3列举在微观流体装置上运行的各个X染色体测试的
引物探针组的粗比例。X染色体平均拷贝数/基因组通过将平均比例乘以2来确定。右侧最后一栏表示平均值的标准误差(SEM)。如表3中所示，平均拷贝数/基因组充分对应于样品的已知X染色体拷贝数。
表3.每个X染色体测定的粗比例
| 已知X染色体拷贝数 | 粗FAM123比 | 粗SMS比 | 粗YY2比 | 平均拷贝/基因组 | SEM |
| 1X Chr. | 0.51 | 0.49 | 0.61 | 1.0 | 0.07 |
| 2X Chr. | 0.77 | 1.15 | 0.96 | 1.9 | 0.22 |
| 已知X染色体拷贝数 | 粗FAM123比 | 粗SMS比 | 粗YY2比 | 平均拷贝/基因组 | SEM |
| 3X Chr. | 1.10 | 1.19 | 1.86 | 2.8 | 0.48 |
| 4X Chr. | 1.63 | 2.05 | 1.79 | 3.6 | 0.24 |
| 5X Chr. | 2.03 | 2.34 | 2.90 | 4.8 | 0.51 |
这些结果例证本文中所述的方法和装置容许检测和区分高度复杂的基因组DNA样品内基因拷贝数的微小但在生物学上相关的差异。选择用于这些测试的样品与如Visakorpi等，1994，Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)，145：624-630和Pinkel等，1998，Nat.Genet.(自然遗传学)20：207-211中所述的CGH测定和基于MIP的微阵列研究中检查的那些类似或相同。利用使用数字阵列的本发明方法的本发明结果可以引起拷贝数评估，所述拷贝数评估至少与已知的CGH和MIP方法具一样的辨别力，同时减少动手技术操作且，因此，需要更少的劳力和增高的效率。而且，以数字PCR格式运行多
测定的能力提供生物强度和测定冗余性，这补偿测定-与-测定的扩增差异。如果同时靶向多基因座，全部测定结果都有效，即使在定位的引物-探针结合位点处存在单突变或缺失。而且，功效可以通过在将样品转移到微观流体装置上以进行分析之前，使用预扩增步骤来提高。
尽管本发明参考以上实施例来描述，但是应该理解变更和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求以及其全部等价范围的限制。
Claims (17)
1.用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的相对拷贝数的方法，包括：
预扩增包含所述受试者基因组DNA的样品中的靶基因序列和参考基因序列；
通过数字PCR测定预扩增样品的靶基因序列和参考基因序列；
确定(a)包含所述靶基因序列的扩增多核苷酸分子数和(b)包含所述参考基因序列的扩增多核苷酸分子数并确定(a)与(b)的比。
2.权利要求1的方法，其中所述样品来自人。
3.权利要求1的方法，其中所述(a)与(b)的比是约0.5且在一个染色体上存在(a)的缺失。
4.权利要求1的方法，其中所述(a)与(b)的比是约1.5且在一个染色体上存在(a)的复制。
5.用于确定受试者基因组中靶多核苷酸序列的拷贝数的方法，包括：
进行获自受试者的DNA样品的第一次多核苷酸扩增，其中扩增靶多核苷酸序列和参考多核苷酸序列，所述参考序列具有预确定基因组拷贝数N，由此生成扩增的样品；
将所述扩增的样品的全部或一部分分配到许多独立的反应体积中；
在各个反应体积中进行第二次多核苷酸扩增，其中靶多核苷酸序列或其子序列如果存在，则被扩增，且参考多核苷酸序列或其子序列如果存在，则被扩增；
确定其中存在靶多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量A和确定(b)其中存在参考多核苷酸序列或其子序列的反应体积的数量B；
其中所述基因组中的靶多核苷酸的拷贝数大约等于(A)/(B)xN。
6.权利要求2的方法，其中进行所述第一次多核苷酸扩增包括组合生物样品和组合物，所述组合物包含特异于所述靶多核苷酸序列的引物和特异于所述参考多核苷酸序列的引物，和进行聚合酶链反应(PCR)测定从而以基本相等的比例分别扩增靶多核苷酸和参考多核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中所述第一次多核苷酸扩增包括4-15个循环。
8.权利要求2的方法，其中将所述反应体积置于微观流体装置中，且所述第一次多核苷酸扩增在与所述微观流体装置分开的反应体积中进行。
9.权利要求2的方法，其中在所述分配步骤前，所述扩增的样品的全部或一部分与为了定量扩增靶基因序列和参考基因序列而选择的试剂组合。
10.权利要求9的方法，其中在所述第一次多核苷酸扩增步骤中所用的参考基因序列扩增引物与在所述第二次多核苷酸扩增步骤中所用的那些相同。
11.权利要求10的方法，其中在所述第一次多核苷酸扩增步骤中所用的靶基因序列扩增引物与在所述第二次多核苷酸扩增步骤中所用的那些相同。
12.权利要求9的方法，其中所述试剂包括在适合于多核苷酸扩增的条件下与靶基因序列选择性杂交的第一探针和与参考基因序列选择性杂交的第二探针。
13.权利要求12的方法，其中所述第一和第二探针包括不同的可检测的标记物，且其中当基于聚合酶链反应(PCR)聚合时，所述第一或第二探针的结合或所述第一或第二探针的降解导致所述各自可检测的标记物的可检测的荧光的变化。
14.权利要求1的方法，其中所述参考基因序列包括至少部分编码RNA酶P，β-肌动蛋白或GAPDH的多核苷酸序列。
15.权利要求1或2的方法，其中显著偏离数值1的靶基因序列与参考基因序列的比显示患者基因组中异常的靶基因序列拷贝数。
16.权利要求1或2的方法，其中确定所述靶基因序列的相对拷贝数包括检测所述受试者基因组中杂合性的缺失。
17.权利要求1或2的方法，其中靶基因序列与参考基因序列的比显著大于或小于1的数值显示患者基因组中杂合性的缺失。
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