JP5707132B2 - コピー数変動の決定、方法およびシステム - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年９月７日に出願された米国仮特許出願第６０／９６７，８９７号（この完全な開示は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、小集団または個体からのゲノム内におけるコピー数変動を決定する方法に関し、生物学および医学の用途に有用である。

「デジタルＰＣＲ」とは、試料中に存在する個々の核酸分子が、一つ以上の標的配列のＰＣＲ増幅の前に、多くの別々の反応体積（例えばチャンバまたはアリコート）に分配される方法をいう。分配後に各反応体積が一つ未満の別々のポリヌクレオチド分子（または連結されたポリヌクレオチド分子の凝集物）を含み、ほとんどのチャンバがゼロまたは一つの分子を含むように、試料中の個々の分子の濃度が調節される。標的配列の増幅の結果、各チャンバが、対応する標的配列の存在を示すＰＣＲ産物を含む、または含まないものとして同定される、２値デジタル出力が生じる。検出可能レベルのＰＣＲ最終産物を含む反応体積の数が、絶対的核酸量の直接的尺度である。一つのデジタルＰＣＲのバージョンでは、別々の反応体積に分割することにより、ポリヌクレオチド分子が分配される。一つの分割方法は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）１２．７６５Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いる。このチップは、試料および試薬の混合物を７６５のナノリットル体積の反応チャンバに分割する、統合チャネルおよびバルブを利用する。各混合物中のＤＮＡ分子が、各パネルの７６５のチャンバにランダムに分割される。そして、チップが温度サイクルされ、ＦｌｕｉｄｉｇｍのＢｉｏＭａｒｋリアルタイムＰＣＲシステムで画像化され、元々１つ以上の分子を含んだ陽性のチャンバが、デジタルアレイ分析ソフトウェアにより計数されうる。デジタルＰＣＲに関する議論については、例えば、非特許文献１；ＭｃＢｒｉｄｅ等、特許文献１、特に実施例５；を参照。

コピー数変動（ＣＮＶ）は、５００塩基以上の大きさ（多くの場合には五千〜五百万塩基の間）の、ゲノム領域の増幅または欠損である。全ゲノム研究により、ヒトにおける多数のＣＮＶ領域の存在と、一般集団における広範な遺伝的多様性が明らかになっている。ＣＮＶは、そのヒトの遺伝障害における役割によって、近年多くの研究の焦点となっている。例えば、参照により各々が本明細書に組み込まれる、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照。トリソミーまたは全染色体欠失等の異数性は、様々なヒト疾患と関係するコピー数変動の限定的なタイプである。

米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号明細書

ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：９２３６−４１ Ｉａｆｒａｔｅ等、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２００４）３６：９４９−９５１ Ｓｅｂａｔ等、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：５２５−５２８ Ｒｅｄｏｎ等、Ｇｌｏｂａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４４：４４４−４５４ Ｗｏｎｇ等、Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（２００７）８０：９１−１０４ Ｒｏｐｅｒｓ、Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（２００７）８１：１９９−２０７ Ｌｕｐｓｋｉ、Ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２００７）３９：Ｓ４３−Ｓ４７

本発明は、小集団または個体からのゲノム内のコピー数変動を決定する方法に関する。本方法は、デジタルＰＣＲによる分析前の、試料における目的遺伝子の前増幅を提供する。前増幅ステップにより、個々の遺伝子コピーの分配が、前増幅を伴わずにデジタルＰＣＲで決定された場合よりも実際のコピー数を表す様式で検出されるように、個々のＰＣＲ反応試料に分配されうる。

本発明のデジタルＰＣＲベースの方法は、遺伝子コピー数における二倍未満の差を、高い精度で区別する能力を有する。例えばこれは、異なる試料における遺伝子の１、２、３および４のコピーを区別できる。異なる試料における遺伝子コピー数の見掛け上の差が現実であり、試料量の差により歪められないようにするために、相対的コピー数と呼ばれる用語を用いる。（ヒトゲノムあたりの）遺伝子の相対的コピー数は、ＤＮＡ試料におけるシングルコピー参照遺伝子のコピー数に対する標的遺伝子のコピー数の比として表すことができ、これは通常１である。例えば、ＲＮａｓｅＰ遺伝子は、ＲＮａｓｅＰ酵素のＲＮＡ部分をコードするシングルコピー遺伝子であり、コピー数アッセイにおいて参照遺伝子として用いられうる。

デジタルＰＣＲを実行するための、図３に示されるような市販のデジタルアレイチップが、試料中のＤＮＡを定量するために用いられている。チップは、試料混合物の導入のための１２の試料インプットポートを有する。各試料混合物が、１２のパネルの各々の７６５の反応チャンバに分割される。文献（例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ等、米国特許出願公開第２００５０２５２７７３号を参照）に記載されるように、試料中のＤＮＡを定量する能力は、適切な量のＤＮＡが導入されると、単一ＤＮＡ分子がチャンバ内にランダムに分配されるという事実に基づく。

一つのチップ上に二つの蛍光色素を伴って、二つの遺伝子（例えばＲＮａｓｅＰおよび別の目的遺伝子）のための二つのアッセイを用いることにより、同じＤＮＡ試料中のＲＮａｓｅＰおよび他の遺伝子を同時に定量し、これらの二つの遺伝子の比および目的遺伝子のコピー数の良好な推定値を得ることができる。

しかし、重複時には、一つの遺伝子の複数のコピーが同じ染色体上で密接に連結され、したがって、Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｒｒａｙ上であっても互いに分割されることができない可能性がある。その結果、複数のコピーが一つの分子としてふるまい、遺伝子のコピー総数が大きく過小評価されうる。

本発明は、プロセスに前増幅ステップを含むことにより、この問題に対処する。前増幅は、目的遺伝子および参照遺伝子（例えばＲＮａｓｅＰ遺伝子）の両方のプライマを伴うＰＣＲ反応である。これは、限定数の温度サイクル（例えば１０サイクル）で典型的に実行される；ＰＣＲ効率が等しいと仮定すれば、両遺伝子のコピー数が、前増幅ステップにおいて比例的に増加される。このプロセスを用いれば、ゲノム上で遺伝子の複数のコピーが連結されている場合でも、前増幅後には、目的遺伝子の各コピーが別々に増幅され、Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｒｒａｙにおいて異なるチャンバに別々に分割される。両遺伝子の新たに生成された分子は、元の比を反映し、もはや連結されていないため、デジタルチップ分析により二つの遺伝子の分子を定量し、二つの遺伝子の比（したがって目的遺伝子のコピー数）を正確に測定できる。

したがって、本発明は、遺伝子ベースの分析を実行するためのシステムおよび関連の方法を提供する。より具体的には、本発明の方法およびシステムは、一般に、被験体からの試料中の目的のポリヌクレオチドのコピー数変動を決定することに関する。

一態様においては、本発明は、被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定する方法であり、
ａ）被験体のゲノムＤＮＡを含む試料における、標的遺伝子配列および参照遺伝子配列を前増幅するステップであり；これにより、増幅された試料を生成するステップと；
ｂ）（ａ）の産物を複数の分離した反応体積に分配し、各反応体積における標的および参照遺伝子配列を増幅し、増幅された試料における、標的および参照遺伝子配列の相対量を決定することにより、デジタルＰＣＲを行うステップであり、増幅された試料における標的および参照遺伝子配列の相対量が、ゲノムにおける標的および参照遺伝子配列の相対量に対応するステップを含む、方法を提供する。

関連した態様においては、本発明は、被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定する方法であり、
被験体のゲノムＤＮＡを含む試料における標的遺伝子配列および参照遺伝子配列を前増幅するステップと；
デジタルＰＣＲにより、前増幅された試料の標的遺伝子配列および参照遺伝子配列をアッセイするステップと；
（ａ）標的遺伝子配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数と、（ｂ）参照遺伝子配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数とを決定し、（ａ）対（ｂ）の比を決定するステップを含む、方法を提供する。

関連した態様においては、本発明は、被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定する方法であり、
被験体から得られたＤＮＡ試料の第一ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、参照配列が所定のゲノムコピー数Ｎを有する、標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列の両者が増幅され、これにより増幅された試料が生成される、ステップと；
増幅された試料の全部または一部を、複数の分離した反応体積に分配するステップと；
各反応体積において、第二ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅され、参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅される、ステップと；
標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ａを決定し、（ｂ）参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ｂを決定するステップ；
を含み、ゲノムにおける標的ポリヌクレオチドのコピー数が、（Ａ）／（Ｂ）×Ｎにほぼ等しい、方法を提供する。

いくつかの実施形態においては、試料はヒトからのものである。特定の実施形態においては、（ａ）対（ｂ）の比は約０．５で、一つの染色体上に（ａ）の欠失があり、または（ａ）対（ｂ）の比が約１．５であり、一つの染色体上に（ａ）の重複がある。いくつかの実施形態においては、１の値から実質的に逸脱する参照遺伝子配列に対する標的遺伝子配列の比は、患者のゲノムにおける異常な標的遺伝子配列コピー数を示す。

いくつかの実施形態においては、第一ポリヌクレオチド増幅を行うステップには、生体試料を、標的ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマと参照ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマとを含む組成物と組み合わせるステップと、標的ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドを実質的に等しい割合で別々に増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）アッセイを行うステップが含まれる。

いくつかの実施形態においては、第一ポリヌクレオチド増幅は、４〜１５の温度サイクルを有する。いくつかの実施形態においては、反応体積が、マイクロ流体デバイス中に配置され、第一ポリヌクレオチド増幅が、マイクロ流体デバイスから分離した反応体積において行われる。

いくつかの実施形態においては、分配するステップより前に、増幅された試料の全部または一部が、標的遺伝子配列および参照遺伝子配列の増幅のために選択される試薬と組み合わせられる。通常は一部が使用され、一部を反応体積に分配する前に、増幅された試料が希釈されうる。いくつかの実施形態においては、増幅は、ＰＣＲ増幅である。

いくつかの実施形態においては、第一ポリヌクレオチド増幅ステップで使用される参照遺伝子配列増幅プライマは、第二ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用されるものと同じである。いくつかの実施形態においては、第一ポリヌクレオチド増幅ステップで使用される標的遺伝子配列増幅プライマは、第二ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用されるものと同じである。いくつかの実施形態においては、試薬は、ポリヌクレオチド増幅に適切な条件下で、標的遺伝子配列に選択的にハイブリダイズする第一プローブと、参照遺伝子配列に選択的にハイブリダイズするおよび第二プローブとを含む。いくつかの実施形態においては、第一および第二プローブは、異なる検出可能標識を含み、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）ベースの重合時の第一もしくは第二プローブの結合、または第一もしくは第二プローブの分解の結果、各検出可能標識の検出可能蛍光の変化が生じる。

いくつかの実施形態においては、参照遺伝子配列は、ＲＮａｓｅＰ酵素、ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨを少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態においては、標的遺伝子配列の相対的コピー数を決定するステップには、被験体のゲノムにおけるヘテロ接合性の消失を検出するステップが含まれる。いくつかの実施形態においては、１より実質的に大きい、または小さい値を有する、標的遺伝子配列 対 参照遺伝子配列の比が、患者のゲノムにおけるヘテロ接合性の消失を示す。

本発明の性質および利点のより完全な理解のために、添付の図面とともに以下の詳細な記載が参照されるべきである。図面は、本発明の実施形態を例示する。本発明は、本発明から逸脱することなく、様々な点で改変が可能である。したがって、これらの実施形態の図面／図および記載は本来例示的であり、制限的ではない。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定する方法であって、該方法は：
該被験体のゲノムＤＮＡを含む試料において、標的遺伝子配列および参照遺伝子配列を前増幅するステップと；
デジタルＰＣＲにより、該前増幅された試料の該標的遺伝子配列および該参照遺伝子配列を、アッセイするステップと；
（ａ）該標的遺伝子配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数と、（ｂ）該参照遺伝子配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数とを決定し、（ａ）対（ｂ）の比を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記試料が、ヒトからのものである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記（ａ）対（ｂ）の比が約０．５であり、一つの染色体上に（ａ）の欠失がある、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記（ａ）対（ｂ）の比が約１．５であり、一つの染色体上に（ａ）の重複がある、項目１に記載の方法。
（項目５）
被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定する方法であり、
被験体から得られたＤＮＡ試料の第一ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、参照配列が所定のゲノムコピー数Ｎを有する、標的ポリヌクレオチド配列および該参照ポリヌクレオチド配列の両者が増幅され、これによって増幅された試料を生成する、ステップと；
該増幅された試料の全てまたは一部を、複数の分離された反応体積に分配するステップと；
各反応体積において、第二ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅され、該参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅される、ステップと；
該標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ａを決定し、（ｂ）該参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ｂを決定するステップと；
を含み、該ゲノムにおける該標的ポリヌクレオチドの該コピー数が、（Ａ）／（Ｂ）×Ｎにほぼ等しい、方法。
（項目６）
上記第一ポリヌクレオチド増幅を行うステップが、上記生体試料を、上記標的ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマと参照ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマとを含む組成物と組み合わせるステップと、標的ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドを実質的に等しい割合で別々に増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）アッセイを行うステップを含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
上記第一ポリヌクレオチド増幅が、４〜１５のサイクルを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記反応体積が、マイクロ流体デバイス中に配置され、該第一ポリヌクレオチド増幅が、上記マイクロ流体デバイスと別個の反応体積において行われる、項目２に記載の方法。
（項目９）
上記分配するステップの前に、上記増幅された試料の全部または一部が、標的遺伝子配列および参照遺伝子配列の定量的増幅のために選択される試薬と合わせられる、項目２に記載の方法。
（項目１０）
上記第一ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用される上記参照遺伝子配列増幅プライマが、上記第二ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用されるものと同じである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記第一ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用される上記標的遺伝子配列増幅プライマが、上記第二ポリヌクレオチド増幅ステップにおいて使用されるものと同じである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記試薬が、ポリヌクレオチド増幅に適切な条件下で、標的遺伝子配列に選択的にハイブリダイズする第一プローブと、参照遺伝子配列に選択的にハイブリダイズする第二プローブとを含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記第一および第二プローブが、異なる検出可能標識を含み、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）ベースの重合の際の該第一もしくは第二プローブの結合、または該第一もしくは第二プローブの分解の結果、該各々の検出可能標識の検出可能蛍光の変化が生じる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記参照遺伝子配列が、ＲＮａｓｅＰ酵素、ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨを少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
１の値から実質的に逸脱する、標的遺伝子配列 対 参照遺伝子配列の比が、患者の上記ゲノムにおける異常な標的遺伝子配列コピー数を示す、項目１または２に記載の方法。
（項目１６）
上記標的遺伝子配列の上記相対的コピー数を決定するステップには、上記被験体の上記ゲノムにおけるヘテロ接合性の消失を検出するステップが含まれる、項目１または２に記載の方法。
（項目１７）
１より実質的に大きい、または小さい値を有する、標的遺伝子配列 対 参照遺伝子配列の比が、患者の上記ゲノムにおけるヘテロ接合性の消失を示す、項目１または２に記載の方法。

図１は、本明細書に記載される本発明の方法の、一般的なステップを示す流れ図である。 図２Ａは、本発明の実施形態による、マイクロ流体デバイスの例示的なチャネル設計を示す。図２Ｂは、本発明の実施形態による、マイクロ流体デバイスの例示的なチャネル設計を示す。 本発明のある実施形態による、マイクロ流体デバイスの単純化された図である。 図４Ａは、例えば図１に示されるマイクロ流体デバイスの一部を示す。図４Ｂは、例えば図１に示されるマイクロ流体デバイスの一部を示す。図４Ｃは、例えば図１に示されるマイクロ流体デバイスの一部を示す。 マイクロ流体デバイスを用いて実行される、例示的なコピー数変動の結果を示す。 マイクロ流体デバイスを用いて実行される、例示的なヘテロ接合性の消失の結果を示す。 本発明の一実施形態による、ヘテロ接合性の消失の検出を示すグラフである。 標的配列Ｔのコピー数が決定される架空の実験の部分的結果を示す概略図である。ＶＩＣ標識（黄）プローブを用いて標的配列が増幅および検出され、ＦＡＭ標識（緑）プローブを用いてシングルコピー参照配列が増幅および検出された、６４×６４マトリックスの反応体積が示される。黄色の標識を伴う１９の反応体積と、緑色の標識を伴う１２の反応体積が検出され、約１．５（１９／１２＝１．５８≒１．５）の比を示し、二倍体ゲノムにつき三つの標的配列のコピーがあることを示す。

遺伝病に関係するコピー数の変動を含む、患者のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定するための、本発明の方法およびシステム。特に、本明細書に記載の方法およびシステムは、患者由来の試料中に存在するゲノム材料を用いて、患者のゲノムにおける標的ポリヌクレオチドのコピー数変動を検出するために用いることができる。本発明の技術は、ポリヌクレオチド増幅ベースのアッセイを典型的に用いて、試料中の標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列の相対コピー数を決定する。ゲノムコピー数は、参照配列につき既知である。したがって、標的ポリヌクレオチドの相対的コピー数を決定するために、標的ポリヌクレオチドのコピー数が参照ポリヌクレオチドに対して分析されうる。標的および／または参照ポリヌクレオチド配列は、時に「遺伝子」と呼ばれる。しかし、当然のことながら、「遺伝子」という用語は、配列が必ずしもタンパク質（またはＲＮＡ）をコードすることを示すものではない。

コピー数検出および分析技術は、多数または高密度の小体積反応部位（例えばナノ−体積反応部位または反応体積）を含むマイクロ流体デバイスなど、いわゆる「デジタル分析」または「デジタルＰＣＲ」に適する一定のハイスループットデバイスを利用できる。したがって、本発明のコピー数変動の検出および分析技術は、本明細書に記載の例示的なデバイスを含む反応／アッセイプラットフォームまたはマイクロ流体デバイス中に配置される何百〜何千の反応体積の間で試料を分配または分割するステップを含みうる。

本発明の方法には、生体試料からのＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）が、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）または他の定量的増幅技術を用いて増幅される、前増幅ステップが含まれる。典型的な生体試料には、細胞（溶解細胞および細胞ホモジネートｈｏｍｏｇｉｎａｔｅｓを含む）、血清、および生物流体が含まれる。本明細書の方法は、（例えば、ヒト患者のゲノムにおけるコピー数変動を決定するために）一般にヒトＤＮＡに関して記載されるが、当然のことながら、本方法は、遺伝物質の量の変動を有する任意の試料のために改変／適用されうる。例えば、動物、植物、細菌および真菌類の遺伝分析、ならびにヒト被験体の遺伝分析に、本方法が用いられうる。ＤＮＡを含む生体試料を収集および処理する方法は公知であり、ここで論議される必要はない。本発明のアッセイでは、ＤＮＡが細胞または生物流体から単離され、または、例えばＤＮＡを含む細胞可溶化物を用いてアッセイが行われうる。したがって、本明細書において用いられるところの「ＤＮＡ試料」は、精製、半精製、非精製の形のＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡを意味しうる。本明細書で使用されるところの、「被験体からＤＮＡ試料を得る」ステップは、単に、ＤＮＡ試料が後の分析ステップ（例えば前増幅ステップ）の出発物質であるという事実をさす。「ＤＮＡ試料を得る」とは、例えば被験体から細胞を収集する、またはＤＮＡを単離する行為を意味しないが、単に予め収集されたＤＮＡを含むチューブを得ることでありうる。

図１は、本明細書に記載の方法を実行するための一般的なステップを示す。一つの例示的実施形態においては、本方法のステップには、アッセイプライマ、適切なバッファー系、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば「ホットスタート」条件のために修飾されたポリメラーゼ酵素）を含む前増幅マスターミックスを提供するステップと、前増幅マスターミックスにゲノムＤＮＡを加えるステップと、目的配列（単数または複数）および参照配列を前増幅するステップと、前増幅された配列をデジタルＰＣＲ分析（エンドポイントアッセイまたはリアルタイムアッセイにおいて）によりアッセイするステップと、標的配列（単数または複数）の頻度を参照配列の頻度に対して比較するステップを伴う。当然のことながら、図１は、本発明の理解を助けるように提供されるが、本発明を制限することを意図するものではない。

図１の最初のステップである前増幅においては、被験体から得られたＤＮＡ試料の第一ポリヌクレオチド増幅が行われる。前増幅ステップにおいては、標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列の両者が増幅される。ＰＣＲ増幅のための方法は周知であり、ここで説明する必要はない。

いくつかの実施形態においては、標的配列は、欠失または重複が目的の表現型と関係する配列である。いくつかの実施形態においては、標的配列は、欠失または重複が公知の目的の表現型と関係しないが、特定の集団における変動の分布または相関に関する情報が求められる配列である。

参照配列は、公知（または推定）のゲノムコピー数を有する配列である。したがって参照配列は、ゲノムにおいて増幅または欠失される見込みのないものである。各アッセイにおいて参照配列のコピー数を実験的に（ｅｍｐｅｒｉｃａｌｌｙ）に決定する必要はない。むしろコピー数は、目的の生物における通常のコピー数に基づいて推定されうる。例えば、ヒトゲノムにおける一つの有用な参照配列は、二倍体ゲノムにつき二つのコピーにおいて存在するシングルコピー遺伝子である、ＲＮａｓｅＰ遺伝子の配列である（一倍体ゲノムにつき１のコピー数を有する）。例示の目的で他の有用な参照配列には、β−アクチンおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）が含まれるが、当然のことながら、本発明は特定の参照配列に限られない。

前増幅は、ＲＮａｓｅＰ（参照遺伝子）および目的標的遺伝子の両者のプライマを用いたＰＣＲ反応として実行されうる。反応が、限定数の温度サイクル（例えば５サイクル、または１０サイクル）で実行されるのが典型的である。いくつかの実施形態においては、最適なサイクル数は、参照遺伝子および標的遺伝子のＰＣＲ効率による。ある実施形態では、前増幅アッセイの間の温度サイクル数は、約４〜１５温度サイクル、または約４〜１０温度サイクルの範囲でありうる。ある実施形態においては、温度サイクル数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはｌ５より多くありうる。

前増幅反応は、好ましくは定量的または比例的である。すなわち、標的および参照配列のアンプリコンの相対数（比）が、増幅されるゲノム（または他の）ＤＮＡにおける標的および参照配列の相対数（比）を反映するはずである。定量的増幅のための方法は、公知技術である。例えば、Ａｒｙａ等、２００５，Ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．５（２）：２０９−１９を参照。重複遺伝子の場合には、目的標的遺伝子の各重複コピーが別々に増幅されるように、プライマが選択されねばならない。したがって、選択的前増幅および別個の反応体積への試料分配の後、各配列に対応する比例数のアンプリコンが、反応体積中に分配される。両遺伝子の新たに生成された分子は、元の比を反映するため、後のコピー数分析により、標的遺伝子および参照遺伝子の分子数を定量できる。その結果、二つの遺伝子の比が正確に測定されうる。参照配列のコピー数は既知であるため、目的配列のコピー数を決定することができる。

二つの遺伝子コピー数の比に一切のバイアスを導入しないために、標的および参照配列の増幅効率が類似またはほぼ等しいのが望ましい。そのため、このような結果を得るように、プライマ対および増幅条件が選択されねばならない。任意のプライマ対の増幅効率は、通常の技術を用いて容易に決定されうる（例えば、Ｆｕｒｔａｄｏ等、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｐ．１３１−１４５（２００４）を参照）
標的および参照配列の増幅効率がほぼ等しいことが望ましいが、限定数の前増幅の温度サイクル（典型的には１５未満、通常１０または１０未満、最も多くの場合には約５）により効率の任意の差が大きく軽減されることで、通常の差が結果に与える影響は有意でなくなる。

前述のように、増幅方法は公知技術である。例示のため、前増幅法（前増幅組成物またはミックス）に用いられる反応混合物は、適切なバッファー、約１〜約１０ｍＭの範囲、好ましくは約２〜約８ｍＭの範囲のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）源、ヌクレオチド、および任意に界面活性剤、および安定剤を典型的に含む。一つの適切なバッファーの例は、約５ｍＭ〜約８５ｍＭの濃度のＴＲＩＳバッファーであり、１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度が好ましい。一実施形態においては、ＴＲＩＳバッファー濃度は、反応ミックス中２０ｍＭ、二倍強度（２Ｘ）の形である。反応ミックスは、約７．５〜約９．０のｐＨ範囲を有し、約８．０〜約８．５のｐＨ範囲が典型的でありうる。ヌクレオチドの濃度は、約２５ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲であり、典型的に約１００ｍＭ〜約８００ｍＭの範囲でありうる。ｄＮＴＰ濃度の例は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、および８００ｍＭである。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、およびＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０等の界面活性剤も、反応混合物に含まれうる。ジチオトレイトール（ＤＴＴ、クリーランド試薬）またはメルカプトエタノール等の安定化剤も、含まれうる。前増幅反応ミックスは、前増幅反応のためのプライマを含む。プライマは一般に、試料が調製される後のＰＣＲアッセイにおいて用いられるものと同じ配列であるが、一般に濃度は低い。プライマ濃度は、ＰＣＲアッセイにおいて用いられるプライマ濃度よりも高く、等しく、または低くなりうる。実施形態は、ＰＣＲアッセイのプライマ濃度よりも約５０、２５、２０、１０または５倍高い、等しい、またはその１０分の１、２０分の１、３５分の１、５０分の１、６５分の１、７５分の１、１００分の１、１２５分の１、１５０分の１、１７５分の１、および２００分の１であるプライマの使用を含む。前増幅において用いられるプライマには、ランダムプライマ、ポリＡテール、および目的のＰＣＲアッセイのために設計された特異的プライマが含まれうる。

反応ミックスは、後のリアル定量ＰＣＲ分析の結果を正規化するための参照色素を任意に含みうる。一般的な市販の参照色素の例は、ＲＯＸである。ＲＯＸ色素を含む市販の反応ミックスは、ＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ ２Ｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ，Ｃａｔ．Ｎｏｓ．１１７５４−１００および１１７５４−５００であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。

ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えばＴａｑポリメラーゼ）も、反応ミックスに加えられる。一実施形態においては、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ等のＴａｑポリメラーゼは、周囲温度でポリメラーゼ活性を阻害する抗体と複合体化された、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。ＰＣＲにおける変性ステップの後に、完全なポリメラーゼ活性が回復され、「ホットスタート」が提供される。

本発明の方法により調製される前増幅試料は、デジタルＰＣＲ分析、および遺伝子の染色体重複を区別するために特に適する。特に、前増幅された試料が、複数の低体積ＰＣＲ実験においてアッセイされる。デジタルＰＣＲにおいて、同一（または実質的に類似）のアッセイが、ゲノムＤＮＡの試料に行われる。所与のゲノム試料についての個々の反応の数は、約２〜１，０００，０００以上の範囲で変化しうる。好ましくは、試料に実行されるアッセイの数は、１００以上、より好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上である。試料に実行されるアッセイの数が５００以上、７００以上、７６５以上、１，０００以上、２，５００以上５，０００以上７，５００以上、または１０，０００以上である、より大規模のデジタルＰＣＲも行われうる。実行されるアッセイの数は、ゲノム試料につき最大約２５，０００、最大約５０，０００、最大約７５，０００、最大約１００，０００、最大約２５０，０００、最大約５００，０００、最大約７５０，０００、最大約１，０００，０００、または１，０００，０００超のアッセイ等、著しく大きくてもよい。デジタルＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡの量は、個々のデジタルＰＣＲ反応物に一つの核酸フラグメントまたはそれ未満が存在するように、一般に選択される。

図１に示されるように、前増幅ステップに続き、比例的に増幅された遺伝物質（例えば標的および参照ポリヌクレオチド配列に対応するアンプリコン）を有する前増幅産物を含む試料（またはこれらの部分）が、各反応ウェルが例えば、体積あたり平均約一以下のアンプリコンを含むように、別々の位置または反応体積に分配される。したがって、ほとんどの反応体積はアンプリコンを有さず、一つの標的配列アンプリコンを有し、または一つの参照配列アンプリコンを有する。反応体積あたり（平均して）ゼロまたは一アンプリコンにとどまるようにアンプリコンの濃度を調節するために、前増幅された試料を希釈（典型的に１：１０〜１：２０）し、および／または増幅された試料のわずかな一部を使用することが、一般に有用である。一部のケースでは、前増幅ステップの産物がさらなる増幅試薬（例えばポリメラーゼ）を追加することなく使用されうるが、異なるプライマを任意に含む、増幅のための新しい試薬を加えることが一般に有用である。したがって、生体試料が、分配の前または後に、標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド１２の両方の定量的または非定量的増幅のために選択された試薬と合わせられうる（ステップ２）。

さらに、前増幅ステップは一般にＰＣＲ−タイプの増幅であるが、第二増幅（すなわち、前増幅で生成されたアンプリコン配列の増幅）は、例えば限定されないが、Ｎａｓｂａ（Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９１，１９９１）およびＥｂｅｒｗｉｎｅプロトコル（Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ等、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｍｉｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃＤＮＡ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０）等の、任意の増幅方法を用いて行われうる。

上記のように、当然のことながら、ＤＮＡテンプレートおよびアンプリコンの量（開始ゲノムＤＮＡ量、増幅サイクル数、増幅効率および反応体積サイズの関数）は、所望の分配を達成するために調節される。当業者は、前増幅産物中のアンプリコンの濃度を決定し、インプットに適切な量を計算できる。より好都合には、前増幅産物の一連の段階希釈がテストされうる。例えば、図３に示されるデバイス（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．からＢｉｏＭａｒｋ １２．７６５ Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｒｒａｙとして市販される）は、１２の希釈を同時にテストすることを可能にする。任意で、線形回帰プロットを生成することにより、最適な希釈が決定されうる。最適な希釈には、線が直線であり、原点を通らねばならない。その後、元の試料の濃度がプロットから計算されうる。

分配後、複数の反応チャンバに含まれるゲノム材料が、標的または参照配列に対応するアンプリコンが隔離された反応体積の数を決定するために試料アッセイをさらに行うために、増幅されうる（図１、１４）。第二増幅は、前増幅において用いられたのと同じプライマ、または異なるプライマ（例えばネステッドセット）を用いて行われうる。

参照ポリヌクレオチドと比較して標的ポリヌクレオチドから生じるシグナルを区別するために、試料の分別検出および分析が行われうる（図１、１６）。例えば、別個の反応部位の分析を用いて、標的ポリヌクレオチド配列を含む反応体積数と参照ポリヌクレオチド配列を含む反応体積数との比を計算しうる。方法は、遺伝子欠失または重複、ヘテロ接合性の消失の検出など、例えば異数性（例えばトリソミー）および他の多くの遺伝的異常を含む、被験体のゲノムにおける標的配列についての遺伝学的に関係がある情報を検出および分析するステップを、さらに含みうる。様々な分別検出および分析技術を含む、方法ステップに関するさらなる詳細が、以下に提供される。

上に開示されるように、前増幅産物または非増幅遺伝物質を含む試料が、検出および分析プラットフォームの別々の位置または反応体積に分配されうる。試料の分配は、例えば、複数の小体積反応部位／チャンバを含むマイクロ流体デバイスにおけるフローベースの分配等、様々な技術およびデバイスを用いて行われうる。一般に、本明細書に記載される方法の分配ステップが、目的の試料材料、例えば標的および参照配列を、後の検出および分析のために個々の反応部位に分離するために実施される。

複数の反応部位または体積の各々の中で、標的ポリヌクレオチド配列および選択された参照ポリヌクレオチド配列の多重反応検出定量分析／増幅を含む、一つ以上の増幅アッセイが行われうる。試料中の検出配列の比が、デジタルＰＣＲ分析、リアルタイムＰＣＲ曲線のモニタリングおよび／または一つのアッセイ対別のアッセイの陽性反応チャンバのエンドポイントイメージの比較等の検出技術を使用して計算されうる。あるいは、ＤＮＡ試料中の任意の配列の濃度（コピー数／μＬ）が、その配列のコピーを少なくとも一つ含むデバイス内の陽性反応チャンバの数を用いて計算され、コピー数を計算するために、標的および参照配列の濃度の比が決定されうる。一切の目的で参照により本明細書に組み込まれる、同時係属出願である米国特許出願第１２／１７０４１４号、“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ”を参照。一切の目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｂｅ等、２００８，“Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｏｎ ａ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（８）：ｅ２８７６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００２８７６も参照。

上述の通り、本発明は、例えば患者のゲノムにおける、標的ポリヌクレオチドのコピー数変動を決定する方法および増幅ベースの技術を含み、いくつかの場合には、後の定量的増幅および分析のためのマイクロ流体デバイスにおける試料の分配前に、前増幅ステップが行われうる。前増幅は、例えば一つの標的遺伝子の複数のコピーが、同じ染色体上で密接するために、定量分析の間、例えばマイクロ流体デバイス中に分配される際に標的配列を最適に分割できない場合に所望されうる。そのような場合には、標的遺伝子の複数のコピーが、二つではなく一つの分子として過小計数または定量されうる。そのため、遺伝子コピーの総数が、過小評価されうる。

本発明によれば、ＣＮＶ計算は、異なる試料における遺伝子コピー数の見掛け上の差を、試料量の差により生じる歪み等の歪みまたはアッセイノイズ／エラーから都合よく区別するために、「相対的コピー数」の計算を典型的に含む。（ゲノムあたりの）遺伝子の相対的コピー数は、患者のゲノムにおける既知の濃度（コピー数）のＤＮＡ試料中のシングルコピー参照遺伝子のコピー数に対する、標的遺伝子のコピー数の比として表すことができ、これは典型的に１に等しい。同じデジタルアレイ上に二つの異なる標識（例えば蛍光色素）を伴って、二つの遺伝子（標的ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチド）のための二つのアッセイを利用することにより、本明細書に記載の方法を用いて、同じＤＮＡ試料中の両遺伝子を同時に定量することができる。あるいは、さほど都合よくはないが、（前増幅からの）標的アンプリコンが、一つの反応体積組のチップ上で増幅され、（前増幅からの）テストアンプリコンが、異なるアンプリコン組においてアッセイされ、データが比較されうる。これらの二つの遺伝子の比は、ＤＮＡ試料中の標的ポリヌクレオチド配列、または目的遺伝子の相対的コピー数である。一つのアプローチにおいては、この方法は、標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積数（Ａ）を決定するステップと、参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積数（Ｂ）を決定するステップと、Ｎが所定の参照配列のゲノムコピー数である場合において、ゲノムにおける標的ポリヌクレオチドのコピー数が（Ａ）／（Ｂ）×Ｎにほぼ等しいことを決定するステップとして要約されうる。当然のことながら、ほとんどの生物において多倍数性が低い（例えばヒトは通常、二つの体細胞染色体のコピーを有する）一方で、本発明において検出されるアンプリコンの数が本来的に実験誤差を伴うため、（Ａ）／（Ｂ）×Ｎはコピー数にほぼ関連する。例えば、（Ａ）は、実験的に９３６と決定され、（Ｂ）は実験的に５９６と決定され、Ｎは一倍体ゲノムにつき１でありうる。（Ａ）／（Ｂ）×Ｎは、１．５７（約１．５）に等しく、これは、一倍体ゲノムあたりＡのコピーが約１．５であることを示すものと理解されよう（すなわちＡのトリソミー）。図８および以下の実施例を参照。

様々な検出プラットフォームまたはマイクロ流体デバイスおよび方法が、本発明の実行に用いられうる。いくつかの実施形態においては、ガラス、プラスチック、シリコン、弾性ポリマー類（例えばポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、または他のポリマー類）等の様々な材料を用いて、デバイスが構築されうる。本発明のある実施形態においては、本発明の態様を実施するために用いられるマイクロ流体デバイスは、少なくとも部分的にエラストマー材料から典型的に構築され、単層および多層ソフトリソグラフィ（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法により構築される（例えば、一切の目的のためにいずれも参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｕｎｇｅｒ等、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６，および国際公開第０１／０１０２５号を参照）。このような方法を利用して、デバイスのフローチャネルを通る溶液流が、エラストマー膜またはセグメントによりフローチャネルから分離された一つ以上のコントロールチャネルにより少なくとも部分的に制御される、マイクロ流体デバイスが設計されうる。この膜またはセグメントは、コントロールチャネルに作動力を行使することにより、コントロールチャネルが伴うフローチャネル内へ偏向され、または引き込められうる。膜がフローチャネル内に偏向され、またはフローチャネルから引き込められる程度を制御することにより、フローチャネルを通じた溶液流が遅くされ、または完全に遮断されうる。このタイプのコントロールおよびフローチャネルの組み合わせを用いて、Ｕｎｇｅｒ等、上記、国際公開第０２／４３６１５号および０１／０１０２５号に詳述されるように、溶液流を調節するための多様なタイプのバルブおよびポンプを準備できる。

本明細書に記載のマイクロ流体デバイスにおける試料分配は、部分的に従来技術において一般に認識されるエラストマー材料の一定の特性により実施されうる。例えば、Ａｌｌｃｏｃｋら（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．）は、そのガラス転移温度と融解温度の間の温度で存在するポリマー類として、「エラストマー」または「エラストマー材料」を一般的に記載する。エラストマー材料は、ポリマー鎖が容易にねじれ運動を行い、力に応答した主鎖の非コイル化と、力の非存在下で主鎖が再度コイル化して元の形をとることを可能にするため、弾性を呈する。一般に、エラストマーは力が加えられると変形するが、力が除去されると元の形に戻る。エラストマー材料により呈される弾力性は、ヤング係数により特徴付けられる。本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスにおいて利用されるエラストマー材料は、典型的に、１Ｐａ−１ＴＰａの間、他の場合には約１０Ｐａ−１００ＧＰａの間、さらに他の場合には約２０Ｐａ−１ＧＰａの間、さらに他の場合には約５０Ｐａ−１０ＭＰａの間、ある場合には約１００Ｐａ−１ＭＰａの間のヤング係数を有する。これらの範囲外のヤング係数を有するエラストマー材料も、具体的場合の必要性に応じて利用できる。

ポリマー化学、前駆体、合成方法、反応条件、および添加物候補の相当の多様性を前提として、さまざまな特性がある用途および応用のために選択されうる。したがって、本発明に関しては、モノリシックのエラストマー超小型バルブおよびポンプを作るために使用できる、多数の可能なエラストマー系がある。本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのいくつかは、ＧＥ ＲＴＶ６１５（製剤）、ビニルシランクロスリンク（タイプ）シリコンエラストマー（ファミリー）等の弾性ポリマーから製造される。しかし、本発明のマイクロ流体システムは、ポリマーのこの一つの製剤、タイプまたはこのファミリーにさえ限定されず、むしろ、ほぼ任意の弾性ポリマーが適切である。材料の選択は典型的に、行われる利用に必要とされる特定の材料の特性（例えば耐溶剤性、硬さ、気体透過性、および／または温度安定性）に依存する。本明細書に開示のマイクロ流体デバイスの要素の製造において使用できるエラストマー材料のタイプに関するさらなる詳細は、Ｕｎｇｅｒ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６、および国際公開第０２／４３６１５号および第０１／０１０２５号に記載され、それらは一切の目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。

デバイス製造および温度サイクリング。

示されるように、本発明の技術は、デジタル分析またはデジタルＰＣＲに適した高処理量マイクロ流体デバイスを含む、多様な検出プラットフォームの使用を取り入れうる。デバイス製造、システム要素の態様、および温度サイクリングの態様が、後にさらに詳述される。

一実施形態においては、本発明の使用に適するマイクロ流体デバイスは、単層および多層ソフトリソグラフィ（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法を利用して構築されうる。一つの基本的なＭＳＬアプローチは、一連のエラストマー層を微小機械加工モールドにキャスティングし、モールドから層を除去し、層を融合させるステップを含む。犠牲層カプセル化アプローチにおいては、チャネルが求められる場所にフォトレジストのパターンが堆積される。これらの技術およびマイクロ流体デバイスの作成におけるその使用は、例えば、各々が一切の目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｕｎｇｅｒ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６，およびＣｈｏｕ等、（２０００）“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ−Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，”ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ａｃｔｕａｔｏｒ ａｎｄ Ｓｅｎｓｏｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｈｉｌｔｏｎ Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｃ．；および国際公開第０１／０１０２５号により詳述される。

簡潔にいうと、前述の例示的な製造方法は、最初にフォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ ＳＪＲ５７４０）を用いたフォトリソグラフィにより、上層（例えば、コントロールチャネルを伴うエラストマー層）および下層（例えば、フローチャネルを伴うエラストマー層）のための母型をシリコンウエハ上に製造するステップを伴う。チャネル高さは、スピンコーティング速度により正確に制御されうる。フォトレジストを紫外光に曝した後、現像することにより、フォトレジストチャネルが形成される。熱再流プロセスおよび保護処理は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ａ．Ｕｎｇｅｒ，Ｈ．−Ｐ．Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｔｈｒｏｓｅｎ，Ａ．ＳｃｈｅｒｅｒおよびＳ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８：１１３により記載されるように、典型的に達成される。そして、混合された二成分系シリコンエラストマー（ＧＥ ＲＴＶ６１５）がそれぞれ底部モールド内にスピンされ、上部モールド上へ注がれる。底部ポリマー流体層の厚さを制御するために、スピンコーティングが利用されうる。８０℃のオーブンで２５分間焼いた後、一部硬化された上層が型から剥がされ、下層と位置をそろえてまとめられる。これらの二層を不可逆的に結合するために、８０℃での１．５時間の最終焼きが用いられる。底部シリコン母型から剥がされたこのＲＴＶデバイスは、ＨＣＬ（０．１Ｎ，８０℃で３０分）で、典型的に処理される。この処理は、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合の一部を切断するように作用し、それによりヒドロキシ基が曝されてチャネルの親水性が高まる。

それから、デバイスが任意に支持材に密封されうる。支持材は、基本的に任意の材料で製造されうるが、形成される封止は主に接着力によるため、良好な封止を確保するために表面は平坦でなければならない。好適な支持材の例には、ガラス、プラスチック等が含まれる。

デバイスが前述の方法により形成される結果、担体（例えばガラススライド）がフローチャネルの一つの壁を形成する。あるいは、フローチャネルがエラストマー材料に完全に封入されるように、母型から一旦除去されたデバイスが薄いエラストマー膜に封止される。それから、得られたエラストマーデバイスが、担体支持材に任意に合わせられうる。

層形成
一実施形態においては、製造中に試薬が反応部位に堆積されるものを含む、マイクロ流体デバイスは、三層から形成される。下層は、試薬が上に堆積される層である。下層は、ＭＬＳ方法につき上記される引用文献に記載されるように、様々なエラストマー材料から形成されうる。典型的には、材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマーである。特定のデバイスに所望される反応部位の配置および位置に基づいて、適切な試薬がスポットされるべき下層上の位置を決定できる。ＰＤＭＳは疎水性であるため、堆積された水性のスポットは縮小して非常に小さなスポットを形成する。前述のように、反応部位に導入された試薬は試料溶液中に溶解することが意図されるため、任意に堆積される試薬は、試薬とエラストマー表面の間に共有結合が形成されないように堆積される。

デバイスの他の二層は、フローチャネルが形成される層、およびコントロールチャネルならびに任意にガードチャネルが形成される層である。これらの二層は、本セクションに前述される一般的な方法にしたがって準備される。それから、得られた二層構造が、試薬が上に堆積されている第一層の上に配置される。三層の組成の具体例は、以下の通りである（成分Ａの成分Ｂに対する割り当て）：第一層（試料層）３０：１（重量）；第二層（フローチャネル層）３０：１；および第三層（コントロール層）４：１。しかし、エラストマー成分の他の組成および比も同様に利用されうることが予想される。このプロセスの間には、適切な反応部位内に試薬が配置されるように、反応部位が堆積された試薬と位置をそろえられる。

本発明によれば、マイクロ流体デバイスに、温度サイクリングが実行されうる。特に、温度サイクリングを用いて、反応チャンバ内に分配された試料の分析を促進する増幅反応を行いうる。

様々な精巧さの多様な選択肢が、マイクロ流体デバイスの選択された領域内またはデバイス全体の温度制御のために利用可能である。したがって、本明細書で用いられるところで、温度コントローラという用語は、マイクロ流体デバイス全体、またはマイクロ流体デバイスの一部（例えば特定の温度域内、またはブラインドチャネルタイプのマイクロ流体デバイスのマトリックスにおける一つ以上の接合部で）の温度を調節できる、デバイスまたは素子を広く意味するものである。

一般に、デバイスを温度サイクルするために、デバイスが温度サイクリングプレート上に配置される。例えばＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ Ｐｘ２（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐａｒｔ＃Ｅ５３３１（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、Ｔｅｃｈｎｅ Ｐａｒｔ＃２０５３３０（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を含む、様々なこのようなプレートが、商業上のソースから容易に入手可能である。

温度サイクリングステップの精度を確保するために、あるデバイスにおいては、デバイスの様々な領域で温度を検知するセンサを組み込むことが有用である。温度を検知するための一つの構造は、熱電対である。このような熱電対は、下の基板材料にパターニングされた薄膜ワイヤとして、または微細製造されたエラストマー材料自体に直接組み込まれたワイヤとしてつくられうる。

温度検出／モニタリングの様々な手段が、本発明のシステム／デバイスに含まれうる。例えば、電気抵抗の変化により温度が検出されてもよい。熱変色性材料は、増幅デバイスの領域上の温度を検出するために利用可能な、別のタイプの構造である。温度を検出する別のアプローチは、赤外線カメラを用いることによる。温度検出のさらに別のアプローチは、焦電センサを用いることによる。キャパシタンスおよびインダクタンス等、他の電気現象は、本発明の実施形態により温度を検出するために利用されうる。熱拡散率についての公知の方程式およびデバイスで利用されるエラストマーおよびガラスの適切な値を用いて、反応部位内の温度が、コントローラが維持しようとする温度に達するのに要する時間を計算できる。

適切である可能性のある様々な材料組成および特性に加えて、本発明に用いるのに適切なマイクロ流体デバイスは、様々な特徴、設計、チャネル構造等を含みうる。デバイスは、溶液が中を流れることができる流路を一般に意味する、複数の「フローチャネル」を典型的に含む。さらに、デバイスは「コントロールチャネル」、あるいは、フローチャネル内の流れを作動するために使用できるようにフローチャネルと連結するように設計されたチャネルを含みうる。デバイスは、「バルブ」等、流体の流れをさらに調節するための特徴をさらに含むことができ、これには、中でフローチャネルとコントロールチャネルが交差し、作動力に応じてフローチャネル内に偏向され、または引き込められうるエラストマー膜により分離される、構成が含まれうる。また、ある実施形態は、デバイスの外部ポートと一つ以上のフローチャネルの間に流体アクセスを提供するようにエラストマーデバイス内に形成されるチャネルをさす、「ビア」を含みうる。したがって、ビアは、例えば試料インプットまたはアウトプットとして役立ちうる。

多くのタイプのチャネル構造または設計が、本発明において実施されうる。図２Ａに示されるように、本発明のデバイスに含まれうるチャネル設計の一つのタイプは、オープンチャネル設計を含む。「オープンチャネル」または「オープンエンドチャネル」は、フローチャネルが出口（例えばアウトレット）と別個の入口（例えばインレット）を有するように、別個のビアの間に配置されたフローチャネルをさす。一般に、オープンチャネルネットワーク設計は、一つまたは複数のブランチフローチャネルのまわりに接続されてオープンチャネルネットワークを形成しうる、少なくとも二つの対向するフローチャネルビアまたはインレットを含む。隣接した／重なり合ったコントロールチャネルにより形成される一つ以上のバルブが作動されて、ブランチチャネルの別々の領域を分離し、反応部位を形成しうる。このようなバルブは、複数の反応部位を切り替え可能に分離するための機構を提供する。本明細書に記載されるように、デバイスは、一つ以上チャネルが分岐する一つ以上のオープンフローチャネルを含みうる。一つ以上の反応領域または反応部位が、フローチャネルの長さに沿って任意の場所に配置されうる。重なり合ったフローチャネルにより形成されるバルブが作動されて、チャネルに沿って配置された反応部位（単数または複数）を分離し、これにより、反応部位を切り替え可能に分離するための機構を提供しうる。したがって、各デバイスが、多数の反応部位（例えば１０，０００＋）を含むことができ、高い反応部位密度を達成でき、これにより、従来のマイクロ流体デバイスと比較して、これらのデバイスのサイズの大幅な縮小が可能になる。オープンチャネル設計は、例えば、二つ以上の位置／ビアからアドレスされうるブランチフローチャネルを有しうる。この設計態様は、例えば特定のチャネル／ブランチフローチャネルが妨害または遮断（例えば製造上のばらつき、欠陥等により）された場合に、流体を異なる方向から入れることができ、特定の遮断または閉塞の反対側までチャネルを満たしうるため、特に有利でありうる。これに対して、閉塞を有する一端からしかアクセス可能でないチャネルは、妨害または遮断のポイントまでしか満たせず、反応部位が閉塞を越えたところに存在する場合には、それらの部位が使用不可能となりうる。

図２Ｂに示されるように、本発明にしたがった使用に適したマイクロ流体デバイスは、「ブラインドチャネル」または「ブラインドフィル」設計を利用しうる。このようなデバイスは、一つ以上のブラインドチャネル、すなわち溶液が一端からしかブラインドチャネルに出入りできないように終端または単一端を有するフローチャネルを有する（すなわち、ブラインドチャネルの別個のインレットおよびアウトレットがない）ことにより、部分的に特徴付けられうる。これらのデバイスは、ブラインドチャネルの領域を分離して孤立反応部位を形成するために、各ブラインドチャネルに一つしかバルブを要しない。このタイプのデバイスの製造の間には、分析を行うための一つ以上の試薬が、反応部位に任意に堆積され、これにより、インプットおよびアウトプット数の大幅な減少がもたらされうる。したがって、多くの反応部位が単一または限定数のインレット（例えば５未満または１０未満）により満たされうるように、ブラインドチャネルと連絡するフローチャネルネットワークが設定されうる。溶液がチャネルに導入される際にフローチャネルおよびブラインドチャネル内の空気がこれらの孔から逃れうるように、デバイスが十分に多孔性のエラストマー材料から作られるため、ブラインドフローチャネルを満たす能力が実現される。他のマイクロ流体デバイスにおいて利用される材料の多孔性の欠如は、溶液が注入される際にブラインドチャネル内の空気に出口がないため、ブラインドチャネル設計の使用を排除する。

さらに別の実施形態においては、本発明のマイクロ流体デバイスは、フローチャネルおよびバルブまたはコントロールチャネルに加えて、ガードチャネルをさらに任意に含みうる。本明細書に提供されるエラストマーマイクロ流体デバイスからの、試料および試薬の蒸発を減らすために、デバイス内に複数のガードチャネルが形成されうる。ガードチャネルは、フローチャネルおよび／または反応部位に重なり合うエラストマーの層において典型的に形成されるという点で、コントロールチャネルと類似する。そのためガードチャネルは、コントロールチャネルと同様、エラストマー材料の膜またはセグメントにより、下のフローチャネルおよび／または反応部位から分離される。しかし、ガードチャネルは、コントロールチャネルと異なり、断面積が相当に小さい。一般に、面積が小さな膜は、同じ加圧力下で、大きな面積の膜よりも偏向が少なくなる。ガードチャネルは、加圧されて、溶液（典型的には水）がガードチャネルに流し込まれるのを許容するように設計される。ガードチャネルから生じる水蒸気は、フローチャネルまたは反応部位に隣接するエラストマーの孔内に拡散でき、したがってフローチャネルまたは反応部位に隣接する水蒸気濃度が増加し、そこからの溶液の蒸発が減少する。マイクロ流体デバイスに配置され、本発明にしたがった使用に適するガードチャネルに関するさらなる議論については、一切の目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる、ＭｃＢｒｉｄｅ等、米国特許出願公開第２００５０２５２７７３号を参照。

デバイスは、試薬が反応させられる複数の反応部位または反応体積をさらに含み、デバイスは、反応部位を選択的に分離するための様々な手段（例えばポンプおよびバルブ）を組み込みうる。反応部位は、デバイス内の多数の異なる位置の任意の位置に設置されうる。

デバイスは、比較的光透過性のエラストマー材料を含みうるため、マイクロ流体デバイス上の基本的に任意の位置で多様な検出システムを用いて、反応が容易にモニタされうる。ＭＳＬ−タイプのデバイスが使用されるときには、反応部位自体で検出が行われるのが最も典型的である。そのようなデバイスが実質的に透明な材料から製造されるという事実は、一定の検出システムが、従来のシリコンベースのマイクロ流体デバイスとともに使用できない現在のデバイスとともに利用されうることも意味する。デバイス中に組み込まれた検出器、またはデバイスから分離しているがデバイスの検出領域と位置が合わせられたものを用いて、検出が達成されうる。

本発明のある実施形態においては、最初にチップおよび他のシステム要素からから分離した溶液において混合（例えば、試料と混合）されてから溶液中に導入される、ミックスまたは試薬を用いて、反応体積中の反応が行われる。

デバイスは、温度サイクリング増幅反応等の温度制御された反応を行うために、典型的に設計および設定される。したがってデバイスは、反応体積中における温度制御反応（例えば温度サイクリング反応）用に、設定／設計されうる。デバイスまたはその一部、例えばエラストマーデバイスが、支持材（例えばガラススライド）に固定されうる。そして、得られた構造物が、例えば様々な反応部位での温度を制御するために、温度制御プレート上に配置されうる。温度サイクリング反応の場合には、多数の温度サイクリングプレートのいずれかの上にデバイスが配置されうる。

上に示されるように、本発明の方法を実施するためのマイクロ流体デバイスの任意の使用は、様々なデバイス特性および設計を用いて行われうる。以下の記載は、温度制御を必要とする分析（例えば核酸増幅反応）を含む様々な分析を行うために利用できる例示的な設定を、より詳細に説明する。しかし、当然のことながら、これらの設定は例示的であり、これらのシステムの改変は当業者に明らかである。

図３は、本発明の例示的実施形態による、マイクロ流体デバイスの単純化された図である。図３に示されるように、デジタルアレイとも呼ばれるマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの様々な要素に適切な機械的支持を提供する材料から作成されうる、キャリア２０を含みうる。例えば、弾性ポリマーを用いてデバイスが作成される。デバイスの外側部分は、標準の３８４−ウェルマイクロプレートと同じ設置面積を有し、独立したバルブ操作を可能にする。以下に述べるように、デバイスへの１２の別個の試料インプットに対応する、１２のインプットポートがある。デバイスは１２のパネル２２を有し、１２のパネルの各々が、パネルあたり４．５９μＬの全容積で、７６５の６ｎＬ反応チャンバを含みうる。マイクロ流体チャネル２４は、以下に詳述するように、パネル上の様々な反応チャンバを流体源に接続しうる。

反応チャンバを流体源に接続するバルブを開閉するために、アキュムレータ２６が加圧されうる。図３に示されるように、試料試薬混合物のローディングのために、１２のインレット２８が提供されうる。一部の応用においては、４８のインレット２８を用いて、アキュムレータ２６に加圧されたときにバイオチップに供給される試薬のソースが提供される。試薬が利用されない応用においては、インレット２８および試薬側アキュムレータ２６は使用されなくてよい。さらに、バイオチップに水和を提供するために、二つのインレット３０が図３に示される例示的実施形態に提供される。水和インレット３０は、反応チャンバに伴う湿度の制御を促進するために、デバイスと流体連通している。当業者には当然のことながら、デバイスの製造において利用される一部のエラストマー材料は、ガス透過性であり、反応チャンバからの蒸発したガスまたは蒸気が、エラストマー材料から周囲大気中へと通過できる。特定の実施形態では、デバイスの周辺部分に設置される流体管路が、反応チャンバのパネルを囲むバイオチップの周辺部分で、水和液体、例えばバッファー、またはマスターミックスの保護を提供し、したがって反応チャンバ内に存在する液体の蒸発を減少または防止する。したがって、揮発性液体、例えば水を水和インレット３０に加えることにより、デバイスの周辺部分での湿度が高められうる。特定の実施形態においては、第一インレットが、バイオチップの第一側面のパネルを囲む水和流体管路と流体連通し、第二インレットが、バイオチップの反対側のパネルを囲む水和流体管路と流体連通している。

上記のデバイスおよび試料分配は、本発明の方法を行うための一つの例示的なシステムであるが、従来技術の当業者は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスの設計の多くの変化形、改変形、および代替物を認識するであろう。例えば、図３に示されるマイクロ流体デバイスは、反応チャンバあたり６ｎＬの体積の７６５の反応チャンバをそれぞれ有する１２のパネルを含むが、これは本発明に要求されるものではない。デジタルアレイの具体的外形は、具体的応用による。したがって、例えば本発明の範囲は、７６５の反応チャンバを有する１２のパネルのデジタルアレイに限定されず、他の組み合わせが本発明の範囲内に含まれる。本発明の実施形態における使用に適するデジタルアレイに関連したさらなる説明は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号に提供される。

多数の反復試験試料を流すには、相当量の試薬を要しうる。本発明の実施形態においては、微小体積においてデジタルＰＣＲが行われる。低体積ＰＣＲを行うための反応チャンバは、約２ｎＬ〜約５００ｎＬでありうる。反応チャンバ体積が小さいほど、行われうる個々のアッセイ数が多くなる（異なるプローブおよびプライマセットを用いて、または同じプローブおよびプライマセットの複製として、または任意に入れ替えた多数の複製および多数の異なるアッセイ）。一実施形態においては、反応チャンバは約２ｎＬ〜約５０ｎＬ、好ましくは２ｎＬ〜約２５ｎＬ、より好ましくは約４ｎＬ〜約１５ｎＬである。いくつかの実施形態においては、反応チャンバ体積は、約４ｎＬ、約５ｎＬ、約６、ｎＬ、約７ｎＬ、約８、ｎＬ、約９ｎＬ、約１０ｎＬ、約１１ｎＬ、または約１２、ｎＬである。試料チャンバは、ガラス、プラスチック、シリコン、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン等の弾性ポリマー類または他のポリマー類からつくられうる。本発明の方法により処理される試料は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いたコピー数変動分析に適する。ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システムは、複数の試料での複数のアッセイの実施を提供する、ポリジメチルシロキサンマイクロ流体デバイスを用いる。

Ｆｌｕｉｄｉｇｍマイクロ流体デバイス（デジタルアレイ）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により製造される。Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（ＭＳＬ）法により、チップが製造される（Ｕｎｇｅｒ ＭＡ，Ｃｈｏｕ ＨＰ，Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｔ，Ｓｃｈｅｒｅｒ Ａ，Ｑｕａｋｅ ＳＲ，Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ ｐｕｍｐｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００；２８８：１１３−１１６）。チップは、平均１０μｍの半楕円形の深さ、７０μｍの幅を有し、心々２００μｍの平行間隔を伴う、試料チャネルを有する。試料流体工学は、各試料チャネルに沿って配置された２６５μｍ（深さ）×１５０μｍ×１５０μｍの分割チャンバをつくるための二層成形プロセスを用いて製造される。別のシリコーン層に、チップのコントロールチャネルが、試料チャネルと直角にはしる。チャネルの交差により、流体の経路を定めるための偏向バルブが形成される。コントロールチャネルの加圧時には、層間の薄膜が試料チャネルを遮断して、個々の分割チャンバを分離する。コントロールチャネルは、深さ１５μｍ、幅５０μｍであり、心々に３００μｍの平行間隔をおく。

ＰＣＲミックス、試料ミックス、前増幅生成物試料ミックス等の反応ミックスが、各パネルにロードされ、単一のＤＮＡ分子が様々な反応チャンバにランダムに分割される。パネルおよび反応チャンバのローディングの後、デジタルアレイが温度サイクルされてから、適切な読み取り器、例えば本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）機器で画像化されうる。生成されたデータが、本譲受人から入手可能なＤｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアまたは他の適切な分析ソフトウェアを用いて分析される。本発明の実施形態における使用に適する例示的な検出および／または分析技術のさらなる記載は、“Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ”と題した米国特許出願公開第１２／１７０，４１４号に提供され、これは同時係属中で同一出願人による出願であり、一切の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

図４Ａ〜４Ｃは、図３に示されるデバイス／バイオチップの一部の単純化された図である。図４Ａは、１２のパネル２２を示し、パネルの各々が多数の反応チャンバを含む。図４Ｂは、パネルに含まれる多数の反応チャンバ４０の外形を示す。反応チャンバ４０は、図示されるように心々に２００μｍの間隔がおかれる。図４Ｃは、パネルの一部の蛍光画像を示す。図の左側は、全ての反応チャンバが濃く示されるコントロールセクションである。図の右側は、典型的な実験において反応チャンバの多くが有意な蛍光発光を生成せず、濃い４２様子を示す。しかし、反応チャンバの一部は蛍光放出を有し、「陽性」の反応チャンバ４４を示す。図２Ｂで上述したとおり、試料チャネルは、個々の反応チャンバを接続して、左から右にはしり、コントロールチャネルは下層において上から下にはしる。コントロールチャネルの加圧時には、層間の薄膜が試料チャネルを遮断して、個々の反応チャンバを分離する。バルブは、ＰＣＲ実験の間に閉じたまま保たれる個々のチャンバを分割する。

本明細書の全体にわたりより十分に説明されるように、チップは温度サイクルされ、本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムにより画像化され、本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ等のＤｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、各パネルにおける陽性チャンバの数が計数された。複合デジタルＰＣＲ反応において二つの蛍光色素による二つのアッセイが使用される場合には、二つの遺伝子が独立して定量されうる。デジタルアレイを用いてコピー数変動を研究するために、この遺伝子を独立して定量する能力が、本明細書に記載のように用いられる。一つのＰＣＲ反応において独立して定量できる遺伝子の数は、利用可能な蛍光色素およびフィルタの数に依存する。

上記の一般的な方法ステップにて説明したように、試料の分配後、追加的ステップには、増幅ステップと、これに続く結果の検出および分析が含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、二つのステップを調和させる方法、例えば定量的ＰＣＲを用いて、増幅および検出／分析が行われうる。一般に、各反応部位中で分離されたポリヌクレオチドが、様々な可能な戦略を用いて増幅、検出、および分析されうる。一つの例示的な戦略は、増幅された産物を用いて標的ポリヌクレオチドの濃度および参照ポリヌクレオチドの濃度を決定できるように、標的および参照ポリヌクレオチドを増幅するステップを伴う。増幅を行うために、増幅のために必要な試薬が試料と合わせられ、ポリヌクレオチド増幅に適切な条件下で標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする第一プローブと、参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする第二プローブを含みうる。第一および第二プローブは、標的および参照ポリヌクレオチド増幅産物を識別するために、異なる検出可能標識を含みうる。さらに、標的および参照ポリヌクレオチドの区別により、被験体のゲノムにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定するための、参照ヌクレオチド分子の比としての標的ヌクレオチド分子の濃度の計算がさらに提供されうる。

検出および分析に先立つ一般的な増幅ステップは、多数の方法を用いて実行されうる。

明細書の全体にわたり説明される方法およびシステムの理解を増強するために、技術用語を、以下に一般的に説明する。「試薬」という用語は、反応において使用される任意の薬剤を広くさす。試薬は、それ自体がモニタされうる単剤（例えば加熱中にモニタされる物質）、または二つ以上の薬剤の混合物を含みうる。試薬は、生きていても（例えば細胞）または生きていなくてもよい。核酸増幅反応のための例示的な試薬には、バッファー、金属イオン、ポリメラーゼ、プライマ、テンプレート核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼ等が含まれるがこれに限定されない。酵素反応のための試薬には、例えば、基質、補助因子、共役酵素、バッファー、金属イオン、阻害剤および活性化剤が含まれる。細胞ベースの反応のための試薬には、細胞、細胞特異的色素および細胞レセプタと結合するリガンド（例えばアゴニストおよびアンタゴニスト）が含まれるがこれに限定されない。試薬は、試料溶液に含まれればよく、または様々な方法で任意に固定されうる（例えば共有結合的、非共有結合的に、適切なリンカー分子を介して）。オンチップ核酸増幅反応においては、例えば伸長反応を行う際に使用される一つ以上の試薬が、（例えばスポッティングにより）デバイスの製造の間に各反応部位に堆積されうる。

「標識」という用語は、物理的、化学的、電磁的、および他の関連の分析技術により検出できる分子または分子の態様をいう。利用できる検出可能標識の例には、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性の分子、酵素、補助因子、核酸プローブに連結された酵素および酵素基質が含まれるがこれに限定されない。「検出可能に標識された」という用語は、薬剤が標識に接合され、または、薬剤が別個の標識に接合されなくても検出されるのを可能にする固有の特性（例えばサイズ、形または色）を有することを意味する。

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むがこれに限られない、任意の長さのポリマー形のヌクレオチドを含むものとして使用される。これらの用語の間には、長さの差異は意図されない。さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみをさす。したがって、ある実施形態では、これらの用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖ＲＮＡを含みうる。これらは、例えばメチル化による、および／またはキャッピングによる修飾形、およびポリヌクレオチドの非修飾形も含む。より具体的には、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー類、例えばポリアミド（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販される）ポリマー類、および他の合成配列特異的核酸ポリマー類を含み、このポリマー類は、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見られるように、塩基対合および塩基スタッキングを許容する構成の核酸塩基を含むことを条件とする。

「プローブ」は、一つ以上のタイプの化学結合により、通常は相補的塩基対合により、通常は水素結合形成により、相補配列の標的核酸に結合し、したがって二重鎖構造を形成できる核酸である。プローブは、「プローブ結合部位」に結合またはハイブリダイズする。プローブは、特に一度、プローブが、その相補的標的にハイブリダイズすると、プローブの、安易な検出を可能にするために、検出可能標識で標識されうる。プローブに結合される標識は、例えば化学的または物理的手段により検出できる公知技術の多様な標識の任意のものを含みうる。プローブに結合できる好適な標識には、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性の分子、酵素、補助因子、および酵素基質が含まれるがこれに限定されない。プローブは、サイズが大きく異なりうる。一部のプローブは、比較的短い。一般に、プローブは、長さが少なくとも７〜１５ヌクレオチドである。他のプローブは、少なくとも２０、３０または、４０ヌクレオチドの長さである。さらに他のプローブはやや長めであり、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチドの長さである。さらに他のプローブは、さらに長く、少なくとも１００、１５０、２００またはそれを上回るヌクレオチドの長さである。プローブは、前述の範囲内に収まる任意の特定の長さでもありうる。

「プライマ」は、適切なバッファー中適切な温度で、適切な条件下で（すなわち、四つの異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたはリバーストランスクリプターゼ等、重合のための薬剤の存在下で）のテンプレート指向性ＤＮＡ合成の開始点としての役割を果たしうる一本鎖ポリヌクレオチドである。プライマの適切な長さは、プライマの使用目的によるが、典型的に少なくとも７ヌクレオチド長であり、より典型的には１０〜３０ヌクレオチドの範囲の長さである。他のプライマは、やや長めであり、３０〜５０ヌクレオチド長等でありうる。短いプライマ分子は、一般にテンプレートと十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を要する。プライマは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。「プライマ部位」または「プライマ結合部位」という用語は、プライマがハイブリダイズする標的ＤＮＡのセグメントを意味する。「プライマ対」という用語は、増幅されるＤＮＡ配列の５’末端の相補鎖とハイブリダイズする５’「上流プライマ」と、増幅される配列の３’末端とハイブリダイズする３’「下流プライマ」とを含むプライマセットを意味する。

「完全に相補的」なプライマは、プライマの全長にわたり完全に相補的な配列を有し、ミスマッチを有しない。プライマは典型的には、標的配列の一部（部分配列）に、完全に相補的である。「ミスマッチ」は、プライマのヌクレオチドと位置が合わせられた標的核酸のヌクレオチドが相補的でない部位をいう。プライマに関して使用される場合の、「実質的に相補的」という用語は、プライマがその標的配列に完全に相補的でないことを意味する；その代わりに、プライマは、所望のプライマ結合部位でその各鎖に選択的にハイブリダイズするために十分に相補的であるにとどまる。

「相補的」という用語は、一つの核酸が別の核酸分子と同一であり、または選択的にハイブリダイズすることを意味する。特異性の完全な欠如よりも選択的であるハイブリダイゼーションが生じるとき、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにおいて少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性があるときに、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。一つの核酸が他の核酸に特異的にハイブリダイズするのが好ましい。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照。

「検出セクション」、または「検出領域」で検出が生じる。これらの用語および他の関連の用語は、検出が生じるマイクロ流体デバイスの部分をさす。上記のように、ある設計（例えばオープンチャネル設計、ブラインドチャネル設計等）を利用するデバイスでは、検出セクションは一般に、各反応部位に伴うバルブにより分離された、反応部位である。マトリックスベースのデバイスの検出セクションは、通常、交差点に隣接するフローチャネルの領域内、交差点自体、または交差点を含む領域および周囲領域である。

上記のように、例示的なコピー数変動分析は、オンチップの定量的ＰＣＲ法を用いて行われうる。特に、定量的ＰＣＲは、ポリヌクレオチドの増幅および増幅産物の検出／分析の両方を伴いうる。ｑＰＣＲに加えて、様々ないわゆる「リアルタイム増幅」法または「リアルタイム定量的ＰＣＲ」法も、増幅プロセス自体の間または後に形成される増幅産物の量を計量することにより試料中に存在する標的核酸の量を決定するために、利用されうる。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイは、本明細書に記載のデバイスとともにうまく用いられうるリアルタイム定量法の一つの具体例である。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法は、二重標識された蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いた、ＰＣＲ産物蓄積の連続測定を伴う。これは、文献において「ＴａｑＭａｎ」法としてしばしば引用されるアプローチである。

このようなアッセイにおいて用いられるプローブは、典型的に、二つの異なる蛍光色素で標識された、短い（例えば約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドである。プローブの５’末端が、典型的にレポーター色素に結合され、３’末端は消光色素に結合されるが、色素がプローブ上の他の位置で結合されてもよい。プローブは、少なくとも標的核酸上のプローブ結合部位と実質的配列相補性を有するように設計される。プローブ結合部位に隣接する領域と結合する、上流および下流ＰＣＲプライマも、反応混合物に含まれる。

プローブが完全なときに、二つのフルオロフォア間のエネルギー転移が生じ、クエンチャーがレポーターからの発光を消光する。ＰＣＲの伸長段階の間に、プローブが、Ｔａｑポリメラーゼ等の核酸ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断され、これにより、ポリヌクレオチドクエンチャーからレポーターが放出され、適切な検出器で測定できるレポーター放出強度の増加が生じる。

蛍光発生アッセイの間に生成されるもののような蛍光放出の測定のために特に構成される一つの検出器は、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により製造されるＡＢＩ７７００である。機器とともに提供されるコンピュータソフトウェアは、増幅の間のレポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録することが可能である。そして、これらの記録値を用いて、正規化されたレポーター放出強度の増加を連続的に計算し、増幅されるｍＲＮＡの量を最終的に定量しうる。

増幅産物の濃度のリアルタイム測定を行うための、蛍光発生法の理論および実施に関する追加的な詳細は、例えば、参照により各々が全体として本明細書に組み込まれる、Ｇｅｌｆａｎｄに対する米国特許第５，２１０，０１５号，Ｌｉｖａｋ等に対する第５，５３８，８４８号、およびＨａａｌａｎｄに対する第５，８６３，７３６号、ならびにＨｅｉｄ，Ｃ．Ａ．等、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：９８６−９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．Ｍ，等、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９９５−１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０，（１９９１）；およびＬｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．等、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７−３６２（１９９５）に記載される。したがって、増幅反応が進行するとともに、より多量の色素が結合し、随伴するシグナルの増加を伴う。

オンチップの増幅アッセイを実行する際には、温度サイクリングプロセスの間に、例えば各々が特定の目的の標的核酸（例えば標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列）に特異的な複数のプライマを利用することにより、単一の反応部位内で多重増幅が行われうる。異なる増幅産物の存在が、定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行うために異なって標識されたプローブを用いて、または、異なって標識された分子ビーコンを用いて検出されうる（上記参照）。このようなアプローチにおいては、各々の異なって標識されたプローブは、特定の増幅された標的だけにハイブリダイズするように設計される。利用される異なる標識の賢明な選択により、異なる標識が単一反応において異なる波長で励起および／または検出される、分析が行われうる。このようなアプローチにおいて適切な蛍光標識の選択に関係するさらなるガイダンスには、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｐｅｓｃｅ等編）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｗｈｉｔｅ等、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２^ｎｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｕｒ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７６）；Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｂｉｓｈｏｐ編）．Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２３；およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ（１９９２）が含まれる。

オープンチャネルまたはブラインドチャネル設計デバイス等のマイクロ流体デバイスが、核酸増幅反応を実行するために利用されるときには、反応部位内に堆積されうる試薬は、所望のタイプの増幅反応を実行するのに必要な試薬である。通常これは、以下の一部または全部が堆積されることを意味する、例えばプライマ、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、金属イオン、バッファー、および補助因子。そのような場合に、反応部位に導入される試料は、核酸テンプレートである。しかし、代替的に、テンプレートが堆積され、増幅試薬が反応部位に流し込まれてもよい。増幅反応を行うためにマトリックスデバイスが利用されるときには、核酸テンプレートを含む試料が垂直のフローチャネルに流され、増幅試薬が水平のフローチャネルに流され、またはその逆でありうる。

一般に、複数の遺伝子タイピングおよび発現分析が、例えば各反応部位で行われうる。標的ＤＮＡを含む試料が、マイクロ流体デバイス上の反応部位に導入されうる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）等の定量的ＰＣＲ法では、目的の標的ＤＮＡの異なる領域を増幅するためのプライマが、単一の反応部位内に含まれる。形成される産物、例えば標的および参照ポリヌクレオチドを区別するために、各領域に対する、異なって標識されたプローブが利用される。プローブが相補的なアレルが標的ＤＮＡ中に存在する場合には、増幅がおこり、これにより検出可能シグナルが生じる。異なったシグナルのいずれが得られるかにより、多形部位におけるヌクレオチドの同一性が決定されうる。両方のシグナルが検出される場合には、両方のアレルが存在する。反応の間の温度サイクリングは、上記温度コントロールセクションで記載したように、実行される。

本発明のいくつかの実施形態においては、対立形質の各々に相補的な異なって標識されたプローブが試薬として、プライマ、ヌクレオチドおよびポリメラーゼとともに含まれうる。しかし、反応は一つのプローブのみにより行われうるが、これにより、シグナルの欠如が特定のアレルの非存在に起因するものか単に反応の失敗によるものかについてが曖昧になりうる。多形部位に二つのアレルが可能である典型的な両アレルの場合には、各々がアレルの一つに完全に相補的な、二つの異なって標識されたプローブが、通常、増幅プライマ、ヌクレオチドおよびポリメラーゼとともに試薬混合物に含まれる。

図４Ｃにより示されるように、各反応部位からのシグナルが検出され、試料に関する情報を決定するために、さらに分析されうる。例えば、本発明の方法により処理される試料は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）．およびＢｉｏＭａｒｋ（商標）蛍光画像化サーマルサイクラシステムを用いたコピー数変動分析に使用するのに適する。ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システムは、複数の試料への複数のアッセイの実施を提供する、ポリジメチルシロキサンマイクロ流体デバイスを使用する。

本明細書の全体にわたりより完全に記載されるように、いくつかの実施形態においては、チップが、温度サイクルされ、本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムにより画像化され、本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ等のＤｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、各パネル中の陽性チャンバの数が計数された。複合デジタルＰＣＲ反応において二つの蛍光色素による二つのアッセイが使用される場合には、二つの遺伝子が独立して定量されうる。遺伝子を独立して定量するこの能力は、本明細書に記載の通り、デジタルアレイを用いたコピー数変動の研究に使用される。

上に一般的に記載されるように、ＰＣＲミックス等の反応ミックスが、各パネルにロードされ、単一のＤＮＡ分子が、様々な反応チャンバにランダムに分割されうる。パネルおよび反応チャンバのローディングの後、デジタルアレイが温度サイクルされた後、例えば本譲受人から入手可能なＢｉｏＭａｒｋ（商標）機器等の適切な読み取り器で画像化される。生成されたデータが、本譲受人から入手可能なＤｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアまたは他の適切な分析ソフトウェアを用いて分析される。

上述の通り、本発明のある実施形態を行うために、オンチップの定量的ＰＣＲが用いられうる。しかし、多様な検出戦略が、上記のマイクロ流体デバイスとともに利用されうる。適切なシステムの選択は、デバイスのタイプ、検出されるイベントおよび／または薬剤のタイプに、部分的に特徴付けられる。検出器は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、発色団、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性の分子、酵素、補助因子、核酸プローブに連結される酵素、および酵素基質からのシグナルを含むがこれに限定されない、多様なシグナルタイプを検出するように設計されうる。

例示的な検出方法論には、光散乱、マルチチャネル蛍光検出、ＵＶおよび可視波長吸収、発光、反射因子差、および共焦レーザスキャニングが含まれるがこれに限定されない。ある利用において使用されうる追加的な検出法には、シンチレーション近接アッセイ技術、放射化学検出、蛍光偏光法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、時間分解エネルギー転移（ＴＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、およびバイオルミネセンス共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）等のバリエーションが含まれる。検出の追加的な選択肢には、電気抵抗、比抵抗、インピーダンス、および電圧感知が含まれる。

検出セクションは、特定のイベントおよび／または薬剤と関係するシグナルを検出するために協働する一つ以上の顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス（例えばレーザ）、光電増倍管、プロセッサおよび前述の組み合わせと連絡しうる。多くの場合には、検出されるシグナルは、光学式検出器により検出セクションにおいて検出される、光学シグナルである。光学検出器は、一つ以上のフォトダイオード（例えばアバランシェフォトダイオード）、例えば光電増倍管、顕微鏡、および／またはビデオカメラ（例えばＣＣＤカメラ）につながる光ファイバー光導体を含みうる。

検出器は、マイクロ流体デバイス内に微細製造され、または別個の要素でありうる。検出器が別個の要素として存在し、マイクロ流体デバイスが複数の検出セクションを含む場合には、任意の時に単一の検出セクション内で、検出が生じうる。あるいは、スキャニングシステムが用いられうる。例えば、一定の自動化されたシステムは、マイクロ流体デバイスに対して光源を走査し、他のシステムは、検出器上での放出光を走査し、またはマルチチャネル検出器を含む。具体例として、マイクロ流体デバイスが、並進可能なステージに取り付けられ、顕微鏡対物レンズ下で走査されうる。そして、このようにして得られたシグナルが、シグナル解釈および処理のためにプロセッサに送られる。光電増倍管のアレイも、利用されうる。さらに、各セクションからのシグナルを決定するとともに、全ての異なる検出セクションから同時にシグナルを収集する能力を有する光学系が、利用されうる。

提供されるデバイスは完全に、または大部分が、モニタされる波長で光透過性である材料で製造されるため、外部検出器が使用可能である。この特徴により、本明細書に記載のデバイスが、従来のシリコンベースのマイクロ流体デバイスでは不可能な、多数の光学検出システムを利用することが可能になる。

一実施形態においては、検出器は、各反応チャンバから集められる光の量を最大化するために、大きな視野および高い開口数を提供するＣＣＤカメラおよび光路を用いる。この点に関しては、ＣＣＤが、アレイの画像を生成するために用いられるのではなく、各ピクセルまたはピクセル群が反応チャンバに対応する、光検出器のアレイとして使用される。したがって、画質が減少またはデフォーカスされて光学系の被写界深度が増加し、各反応チャンバからより多くの光が集められるように、光学が変更されうる。

検出器は、検出可能なシグナルを生成するレポーターを刺激するための光源を含みうる。利用される光源のタイプは、活性化されるレポーターの性質に部分的に依存する。好適な光源には、レーザ、レーザダイオード、および高輝度ランプが含まれるがこれに限定されない。レーザが利用される場合には、一組の検出セクション全体または単一の検出セクションを走査するために、レーザが利用されうる。レーザダイオードが、マイクロ流体デバイス自体の中に微細製造されうる。あるいは、ダイオードからのレーザ光が検出セクションに導かれるように、温度サイクリング反応を行うために利用されるマイクロ流体デバイスに隣接して配置される、別のデバイス内に、レーザダイオードが製造されうる。

検出には、多数の非光学的アプローチも伴いうる。例えば検出器は、例えば、温度センサ、導電率センサ、電位差センサ（例えばｐＨ電極）および／または電流測定センサ（例えば酸化および還元反応をモニタする）も含みうる。

多数の市販の外部検出器が、利用されうる。蛍光標識された試薬を調製するのが容易であるため、これらの多くは蛍光検出器である。利用可能な検出器の具体例には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＡｒｒａｙＷｏＲｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ））を含むがこれに限定されない。

いくつかの実施形態においては、ＦＲＥＴベースの検出法が使用される。このタイプの検出法は、ドナー／アクセプターフルオロフォア対におけるドナー（レポーター）および／またはアクセプター（クエンチャー）フルオロフォアからの蛍光の変化を検出するステップを伴う。ドナーおよびアクセプターフルオロフォア対は、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルに重なるように、選択される。したがって、フルオロフォア対が互いに十分に近づけられると、ドナーからアクセプターへのエネルギー転移が生じうる。このエネルギー転移が、検出されうる。米国特許第５，９４５，２８３号および国際公開第９７／２２７１９号を参照。

分子ビーコンは、特に有用なアプローチを提供する。分子ビーコンにより、増幅産物の相補的領域にハイブリダイズする時のプローブのコンフォメーションの変化が、検出可能シグナルの形成をもたらす。プローブ自体は、二つのセクションを含む：５’末端の一つのセクションと、３’末端の他のセクションである。これらのセクションは、プローブ結合部位にアニールするプローブのセクションに隣接し、互いに相補的である。一方の末端セクションは、典型的にレポーター色素に結合され、他方の末端セクションは通常クエンチャー色素に結合される。

溶液中で、二つの末端セクションが互いにハイブリダイズしてヘアピンループを形成しうる。このコンフォメーションにおいては、レポーターおよびクエンチャー色素が十分に近接するため、レポーター色素からの蛍光が、クエンチャー色素によって効果的に消光される。これに対して、ハイブリダイズしたプローブは、消光の程度が減じられる線形化されたコンフォメーションを生じる。したがって、二つの色素につき発光変化をモニタリングすることにより、増幅産物の形成を間接的にモニタすることが可能である。このタイプのプローブおよびその使用は、例えばＰｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３５９−６３（１９９８）；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８（１９９６）；およびＴｙａｇｉ，Ｓ．等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３（１９９８）によりさらに記載され、各々が一切の目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。

他の周知の増幅／検出方法（例示のためであり制限のためではない）には、Ｉｎｖａｄｅｒ（Ｎｅｒｉ，Ｂ．Ｐ．等、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３８２６：１１７−１２５，２０００を参照）；Ｎａｓｂａ（例えばＣｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９１，１９９１を参照）； Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ Ｎ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８：３７５２−３７６１，２０００を参照）；およびＣａｐａｃｉｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（例えばＳｏｈｎ等、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１０６８７−１０６９０を参照）が含まれる。これらの参考文献の各々は、一切の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

上記のように、本発明の方法は、様々な試薬、組成物、バッファー、添加物等を必要とする様々な反応／増幅アッセイを行うステップを含む。反応混合物は、少なくとも部分的に、アッセイプラットフォームまたはマイクロ流体チップ／デバイスとは別に、またはデバイス自体の反応部位の中（例えばスポッティング）に調製されうる。ある反応混合物または組成物は、キットまたはシステムの一部として調製され、含まれうる。例えば、システムは、前増幅混合物／組成物、増幅アッセイ組成物、および増幅およびコピー数検出アッセイを実行するためのマイクロ流体デバイスを含みうる。システムの二つ以上の要素が、まとめられ、キットまたはシステムの一部として提供されうる。

本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスにより行われる反応は、本発明の反応（例えば前増幅、定量的増幅等）を行うために調製されうる様々な試薬、バッファー、組成物、添加物等を用いて行われうる。したがって例えば、試薬が堆積されるデバイスの場合には、例えば、反応部位に一つ以上の反応物を伴って試薬がスポットされうる。他の実施形態においては、例えばオンチップスポッティングが行われないときには、チップまたは他のシステム要素から独立したミックスまたは試薬体積において試薬が提供されうる。添加物の一つのセットは、エラストマー基質上のタンパク質結合部位をブロックするブロッキング試薬である。多数の異なるタンパク質類（例えばゼラチンおよび様々なウシ血清アルブミン等のアルブミンタンパク質）およびグリセロールを含めて、様々なこのような化合物が利用されうる。界面活性添加剤も、有用でありうる。多数の異なる界面活性剤の任意のものが利用されうる。例には、ＳＤＳおよび様々なトリトン界面活性剤が含まれるがこれに限定されない。

核酸増幅反応の特定のケースにおいては、多数の異なるタイプの試薬および／または添加剤が含まれうる。一つのカテゴリーは、増幅反応を促進するエンハンサである。このような添加剤には、核酸における二次構造を減じる薬剤（例えばベタイン）、およびミスプライミングイベントを減じる薬剤（例えば塩化テトラメチルアンモニウム）が含まれるがこれに限定されない。

一般に、ＣＮＶ計算は、異なる試料における遺伝子コピー数の見掛け上の差が試料量の差により歪められないように、「相対的コピー数」に基づきうる。遺伝子の（ゲノムあたりの）相対的コピー数は、ＤＮＡ試料におけるシングルコピー参照遺伝子のコピー数に対する標的遺伝子のコピー数の比として表すことができ、これは典型的に１である。同じデバイス上に二つの異なる蛍光色素を伴って、二つの遺伝子（標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列）のために二つのアッセイを用いることにより、同じＤＮＡ試料中の両遺伝子が同時に定量されうる。したがって、二つの遺伝子の比が、ＤＮＡ試料における標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数である。

本発明の一実施形態においては、ＲＮａｓｅＰ酵素、リボヌクレオタンパク質のＲＮＡ部分をコードするシングルコピー遺伝子である、ＲＮａｓｅＰ等の参照遺伝子を用いて、前増幅が行われうる。

多数の反復試験試料を流すには、相当量の試薬を必要としうる。本発明の実施形態においては、微小体積においてデジタルＰＣＲが行われる。低体積ＰＣＲを行うための反応チャンバは、約２ｎＬ〜約５００ｎＬでありうる。反応チャンバ体積が低いほど、行われうる個々のアッセイ数が多くなる（異なるプローブおよびプライマセットを用いて、または同じプローブおよびプライマセットの複製として、または任意に入れ替えた多数の複製および多数の異なるアッセイ）。一実施形態においては、反応チャンバは、約２ｎＬ〜約５０ｎＬ、好ましくは２ｎＬ〜約２５ｎＬ、より好ましくは約４ｎＬ〜約１５ｎＬである。いくつかの実施形態においては、反応チャンバ体積は、約４ｎＬ、約５ｎＬ、約６、ｎＬ、約７ｎＬ、約８、ｎＬ、約９ｎＬ、約１０ｎＬ、約１１ｎＬ、または約１２、ｎＬである。試料チャンバは、ガラス、プラスチック、シリコン、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン等の弾性ポリマー類または他のポリマー類から構築されうる。本発明の方法により処理される試料は、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いたコピー数変動分析用に適切である。ＢｉｏＭａｒｋシステムは、複数の試料への複数のアッセイの実施を提供する、ポリジメチルシロキサンマイクロ流体デバイスを用いる。

Ｆｌｕｉｄｉｇｍデバイス／ナノ流体チップ（デジタルアレイ）およびＢｉｏＭａｒｋ蛍光画像化温度サイクラシステムは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により製造される。図５に示される例示的なチップは１２のパネルを有し、１２のパネルのそれぞれが、パネルあたり４．５９μＬの全容積で、７６５の６ｎＬチャンバを含む。チップは、Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（ＭＳＬ）方法論にしたがって製造される。Ｕｎｇｅｒ ＭＡ，Ｃｈｏｕ ＨＰ，Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｔ，Ｓｃｈｅｒｅｒ Ａ，Ｑｕａｋｅ ＳＲ．Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ ｐｕｍｐｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００；２８８：１１３−１１６。チップは、平均１０μｍの半楕円形の深さ、７０μｍの幅を有し、心々に２００μｍの平行間隔を伴う試料チャネルを有する。試料流体工学は、各試料チャネルに沿って配置された２６５μｍ（深さ）×１５０μｍ×１５０μｍの分割チャンバをつくるため、二層成形プロセスを用いて製造される。別のシリコーン層に、チップのコントロールチャネルが、試料チャネルと直角にはしる。チャネルの交差により、流体の進路を決定するための偏向バルブが形成される。コントロールチャネルの加圧時には、層間の薄膜が試料チャネルを遮断して個々の分割チャンバを分離する。コントロールチャネルは、深さ１５μｍ、幅５０μｍであり、心々に３００μｍの平行間隔をおく。外側部分は、標準の３８４−ウェルマイクロプレートと同じ設置面積を有し、独立したバルブ操作を可能にする。チップへの１２の別個の試料インプットに対応する、１２のインプットポートがある。使用されるチップは、試料インプットあたり７６５の６ｎＬ分割チャンバ、チップあたり合計で最高１４，４００のチャンバを組み込みうる。この特定の実施形態では、試料チャネルが、個々の反応チャンバを接続して左から右にはしり、コントロールチャネルは、下層において上から下にはしる。コントロールチャネルの加圧時には、層間の薄膜が試料チャネルを遮断して、個々の反応チャンバを分離する。バルブは、ＰＣＲ実験の間に閉じたまま保たれる個々のチャンバを分割する。

リアルタイムＰＣＲ反応を行うために、マスター増幅ミックス（例えば「マスターミックス」）が、前増幅アッセイの産物を含む試料と組み合わせられる。マスターミックスは、適切なバッファー、約１〜約１０ｍＭの範囲、好ましくは約２〜約８ｍＭの範囲のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）源、ヌクレオチド、および任意に界面活性剤、および安定剤を含む。適切なバッファーの一例は、約５ｍＭ〜約８５ｍＭの濃度のＴＲＩＳバッファーであり、１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度が好ましい。一実施形態においては、ＴＲＩＳバッファー濃度は、反応ミックス中二倍強度（２Ｘ）形の２０ｍＭである。反応ミックスは、約７．５〜約９．０のｐＨ範囲を有し得、約８．０〜約８．５のｐＨ範囲が典型的である。ヌクレオチドの濃度は、約２５ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲であり得、典型的には約１００ｍＭ〜約８００ｍＭの範囲である。ｄＮＴＰ濃度の例は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、および８００ｍＭである。Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、およびＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０等の界面活性剤も、反応混合物に含まれうる。ジチオトレイトール（ＤＴＴ，クリーランド試薬）またはメルカプトエタノール等の安定化剤も、含まれうる。

ＤＯ ＷＥ ＮＥＥＤ ＴＨＩＳ ＰＡＲＡＧＲＡＰＨ？さらに、マスターミックスは、ｄＵＴＰならびにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ，ＵＮＧ）を任意に含みうる。ＵＮＯは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｎｇ遺伝子の産物であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニング、配列決定、および発現されている。ウラシル−ＤＮＡ−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）は、ＤＮＡ（一本鎖および二本鎖）から、ＤＮＡ糖−ホスホジエステル骨格を破壊せずにウラシル残基を除去し、したがって、ハイブリダイゼーション標的としての、またはＤＮＡポリメラーゼのテンプレートとしてのその使用を防ぐ。結果として生じる無塩基部位は、高温で加水開裂され易い。したがって、ウラシル塩基の除去は、通常ＤＮＡのフラグメンテーションを伴う。Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．Ｋ．およびＣｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ａ．（１９８４）ＧＥＮＥ ２８，２１１，Ｖａｒｓｈｎｅｙ，Ｕ．，Ｈｕｔｃｈｅｏｎ，Ｔ．およびｖａｎ ｄｅ Ｓａｎｄｅ，Ｊ．Ｈ．（１９８８）１．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７７７６。マスターミックスは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販される（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ｃａｔ．ｎｏｓ．４３０４４３７，４３１８１５７、および４３２６７０８）。ＵＮＧの使用は、典型的にデジタルＰＣＲアッセイに制限され、前増幅アッセイにおいては使用されない。

複合的利用では、異なる蛍光レポーター色素が、異なる遺伝子の定量のために別個のプライマまたはプローブを標識するために用いられる。複合ＰＣＲを用いた相対的発現研究では、参照および試料遺伝子の増幅の間の競合を回避するために、参照遺伝子（例えばβ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ）のプライマの量が、限定されるべきである。一般に、参照遺伝子プライマの最終濃度は、２５〜１００ｎＭの間であるべきである。プライマ滴定が、最適化に有用でありうる。

本発明の一つの例示的実施形態においては、ＣＹＰ２Ｄ６のコピー数が、前増幅を伴って、または伴わずに決定された。前増幅を用いて、一つの試料中のＣＹＰ２Ｄ６が、重複を有することが発見されたが（コピー数は３）、前増幅を伴わない場合には、同じ試料はコピー数２を示した。

本発明の方法により調製された試料でＰＣＲアッセイを行うのに有用なＰＣＲマスターミックスは、以下の組成で調製されうる：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ（商標）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４００ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０８Ｕ／μＬ ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの組換え形である。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主においてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することにより得られる。これは、天然ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのように、エンドヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。

一実施例における前増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）で、ＩｘＰｒｅＡｍｐマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）、２２５ｎＭプライマ（参照ポリヌクレオチドとしてＲＮａｓｅＰ）および目的の標的配列）、および１μＬのＤＮＡ試料を含む５μＬ反応物において、実行された。温度サイクリング条件は、９５℃、１０分ホットスタートおよび１０サイクル９５℃１５秒間、６０℃１分間であった。２０μＬの水が、前増幅後に各反応物に加えられ、試料がデジタルアレイ上で分析された。

五つのＣｏｒｉｅｌｌ ＤＮＡ試料が、デジタルチップ上で分析された。各試料の同じ体積（４．５９μＬ）中のＣＹＰ２Ｄ６およびＲＮａｓｅＰ分子の数が、Ｐｏｉｓｓｏｎ補正ならびにＳｉｍａｎｔのアルゴリズムを用いたＢｉｏＭａｒｋ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて計数された（Ｄｕｂｅ等上記を参照）。代表的なヒートマップが、単純化された白黒の図で図５に示される。図示の目的のために、白、黒、および灰色で示されるが、イベントは、記録され、ＲＮａｓｅＰ遺伝子（ＶＩＣ、黄）、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（ＦＡＭ、赤）、および遺伝子なしにそれぞれ対応した黄、緑、または赤等の色として視覚的に示されうる。ノーテンプレートコントロール（ＮＴＣ）が、パネル１および１２に行われた。

ＲＮａｓｅＰ遺伝子に対するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の分子数の比が、五つの試料につき得られた。比のうち二つは約０．５であり、これは、これらの二つの試料の各細胞中にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の複製が一つだけであることを意味する（ＲＮａｓｅＰはシングルコピー遺伝子であり、各細胞に必ず遺伝子の二つの複製がある）。したがって、ＤＮＡ試料が集められた個体は、一つの染色体上にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の欠失を有するはずである。他の三つの試料は約１の比を有したが、二つの密接に連結された複製は一つの分子上にあり、分離できないため、これは重複の可能性を排除しない。前増幅反応がこれら五つの試料に実行され、前増幅産物がデジタルチップ上で分析された（表２）。

^＊試料ＮＡ１１９９４は、一つの染色体上にＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の重複を有する。

表２に示されるように、ゲノムＤＮＡが使用されたときに、ＲＮａｓｅＰに対するＣＹＰ２Ｄ６の比が約０．５の二つの試料は、本発明の前増幅プロセスが用いられたときにも、なお約０．５の比を与えた。０．５の比は、欠失を示す。ゲノムＤＮＡが用いられたときに比が約１の二つの試料も、前増幅産物で約１の比を有し、これは正常な対立遺伝子状態を示した。しかし、ゲノムＤＮＡが分析されたときに比が約１だった一つの試料は、前増幅プロセスが用いられたときに１．５の比を有した。これは、試料がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の重複を有することを示す。

ヘテロ接合性の消失の検出
特定の目的遺伝子のコピー数変動を決定する記載の方法の一つの有用な応用には、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の検出が含まれる。本明細書に開示される技術は、ヘテロ接合性の減少の検出において、新たなレベルの感度および柔軟性を提供できる。例示的な応用には、検出および／または異常なＸ染色体コピー数、または異数性の研究が含まれる。ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、正常なゲノムにおけるヘテロ接合状態から対合腫瘍ゲノムにおけるホモ接合状態への変化をさす。調査により、Ｘ染色体全体の消失が、多数の癌に関わることが示される。Ｍｏｅｒｔｅｌ，ＣＡ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．６７：２１−２７（１９９３）。例えば、卵巣癌の４０％が、Ｘ染色体の領域のＬＯＨを伴う。Ｏｓｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．Ｊ．およびＬｅｅｃｈ，Ｖ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６９：４２９−４３８（１９９４）。また、Ｘ染色体の増加が、白血病およびリンパ腫において比較的一般的であることが示されている。Ｓａｎｄｂｅｒｇ ＡＡ．“Ｔｈｅ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｅｘ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｎｄ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｘ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｏｍａｌｉｅｓ．Ｉｎ：Ｓａｎｄｂｅｒｇ ＡＡ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ｐａｒｔ Ｂ：Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｏｍａｌｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，４５９−９８（１９８３）。

ＬＯＨ実験を行うために、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスが提供されうる。図３は、一実施例においてヘテロ接合性の消失を決定するために用いられた、例示的なデバイスの構造を示す（デバイスのさらなる詳細については、例えば上記記載を参照）。簡単に言うと、デバイスは、各々が試料またはアッセイ混合物のためのフローインプットを有する、１２のパネルを有する集積流体回路（ＩＦＣ）を含む。一実施例においては、試料がローディングのためチップに移動され、デジタルアレイをＩＦＣコントローラ上に配置し、ソフトウェアインターフェイスを用いて、アッセイ成分を７６５個の反応の別々のパネルに加圧ローディングすることにより、ロードされた。マスターミックスおよびプライマ−プローブセットと予め混合された十二の試料の各々が、チップのフレーム上の別々のインレットに分配された。各パネル中では、一つの試料が、７６５の個々の６ｎＬリアルタイムＰＣＲ反応物に分割された。ＰＣＲが、試料で実行された。デジタルアレイが、温度サイクリングおよび蛍光検出のためにリアルタイムＰＣＲシステム上に配置された。実験からの結果が、ＢｉｏＭａｒｋ（登録商標）アプリケーションソフトウェアを用いて見られ、分析された。一のアッセイを別のアッセイと比較するために、リアルタイムＰＣＲ曲線または陽性のチャンバの終点画像が記録され、例えばＤＮＡ試料中の任意の二つの配列の比が計算された。デジタルアレイは、分析に直線性、感度、および使いやすさの改善を提供する。

記載の実施例においては、Ｘ染色体の１、２、３、４または５つのコピーを含む細胞系統からのＤＮＡが得られた（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）。デジタルアレイを用いて、各試料が、シングルコピー標的、ＶＩＣ標識「参照」配列の存在下で同時増幅された三つの別個のＸ染色体ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマ−プローブセット−ＦＡＭ標識１２３Ｂ、ＳＭＳ、およびＹＹ２（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）−に対してテストされた。

図６は、記載のようにヘテロ接合性の消失を検査する色ベースの結果を示す、白黒の図を示し、デジタルアレイ内で二連のパネルで行われる各試験をさらに示す。図６は、デバイスのパネル４のクローズアップ図も示す。各パネルにおいて、標的陽性（薄灰色であり、一つの色、例えば黄色に対応する）および参照陽性（濃い目の灰色であり、第二の色、例えば赤に対応する）チャンバの数が計数され、チャンバあたり複数の色素につき補正された。これらの結果から、参照に対する標的の生の比が、決定された。ノーテンプレートコントロール（ＮＴＣ）が、パネル１および１２において使用された。当然のことながら、実際には、実験が赤および黄色等、異なる色および色で示された結果を記録することができるが、これが図６においては白黒の図中灰色として示される。

コピー数を決定するために、単純な線形フィッティングが用いられた。図７は、平均値の標準誤差を示すエラーバーを含む、既知のＸ染色体コピー数（Ｘ軸）に対してプロットされる、三つの別個のアッセイ比の平均（Ｙ軸）を示す。比は、Ｘ染色体の１、２、３、４または５つのコピーを含むことが分かっているＤＮＡ試料の傾斜を生成した。個々の生の比の測定値に２を掛け合わせ、平均して二倍体ゲノムあたりのコピー数が得られた。１〜５のコピー数改変体の全てのアッセイの平均反応は、０．９９４のｒ^２値であり、高い線形アッセイ性能を示した。

表３は、マイクロ流体デバイスで行われた個々のＸ染色体テストの、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマプローブセットからの生の比をリストする。平均比に２を掛け合わせることにより、ゲノムあたりのＸ染色体平均コピーが決定された。右側の最後の欄は、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。表３に示されるように、ゲノムあたりの平均コピーは、試料の既知のＸ染色体コピー数と良好に対応した。

これらの結果は、本明細書に記載の方法およびデバイスが、高度に複雑なゲノムＤＮＡ試料中の小さいが生物学的に関連した遺伝子コピー数の差を検出および区別を可能にすることを示す。これらのテストのために選択される試料は、Ｖｉｓａｋｏｒｐｉ等、１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１４５：６２４−６３０およびＰｉｎｋｅｌ等、１９９８，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２０７−２１１に記載のようなＣＧＨアッセイおよびＭＩＰ−ベースのマイクロアレイ研究において検査されるものと類似または同一である。本発明の方法をデジタルアレイとともに用いた本結果は、手動の技術的操作を減らし、したがってより少ない労力を要し、効率を高めるとともに、公知のＣＧＨおよびＭＩＰ方法と少なくとも同程度に差別的にコピー数の推定を生成しうる。そのうえ、デジタルＰＣＲフォーマットで複数のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを行う能力は、生物学的ロバストネスおよびアッセイ重複性の両方を提供し、アッセイ間増幅差が補正される。複数の遺伝子座が同時に標的化される場合は、局所的プライマ−プローブ結合部位に単一の突然変異または欠失がある場合にも、全体的なアッセイ結果が有効である。さらに、分析のために試料をマイクロ流体デバイス上に移動する前に前増幅ステップを用いることにより、効力が増強されうる。

本発明が、上記実施例に関して記載されているが、当然のことながら、修正および変更が本発明の精神と範囲内に含まれる。したがって、本発明は、以下の請求項とその等価物の完全な範囲によってのみ制限される。

Claims (19)

1. 生物のゲノムＤＮＡにおける標的ポリヌクレオチド配列の相対的コピー数を決定する方法であって、該方法は：
   該生物のゲノムＤＮＡを含む試料において、標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列を前増幅するステップと；
   デジタルＰＣＲにより、該前増幅された試料の該標的ポリヌクレオチド配列および該参照ポリヌクレオチド配列を、アッセイするステップと；
   （ａ）該標的ポリヌクレオチド配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数と、（ｂ）該参照ポリヌクレオチド配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数とを決定し、（ａ）対（ｂ）の比を決定するステップと
   を含む、方法。
2. 前記生物がヒトである、請求項１に記載の方法。
3. 前記生物が非ヒト動物である、請求項１に記載の方法。
4. 前記生物が植物である、請求項１に記載の方法。
5. 前記（ａ）対（ｂ）の比が０．５であり、一つの染色体上に前記標的ポリヌクレオチド配列の欠失がある、請求項１に記載の方法。
6. 前記（ａ）対（ｂ）の比が１．５であり、一つの染色体上に前記標的ポリヌクレオチド配列の重複がある、請求項１に記載の方法。
7. 生物のゲノムＤＮＡにおける標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を決定する方法であり、
   該生物から得られたＤＮＡ試料の第一ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、参照配列が所定のゲノムコピー数Ｎを有する、標的ポリヌクレオチド配列および該参照ポリヌクレオチド配列の両者が増幅され、これによって増幅された試料を生成する、ステップと；
   該増幅された試料の全てまたは一部を、少なくとも５０００の分離された反応体積に分配するステップと；
   各反応体積において、第二ポリヌクレオチド増幅を行うステップであり、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅され、該参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が、存在する場合には増幅される、ステップと；
   該標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ａを決定し、該参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ｂを決定するステップと；
   を含み、該ゲノムにおける該標的ポリヌクレオチドの該コピー数が、（Ａ）／（Ｂ）×Ｎにほぼ等しい、方法。
8. 前記前増幅を行うステップが、前記試料を、前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマと前記参照ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマとを含む組成物と組み合わせるステップと、標的ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドを実質的に等しい割合で別々に増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を行うステップを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記反応体積が、マイクロ流体デバイス中に配置され、前記前増幅が、該マイクロ流体デバイスと別個の反応体積において行われる、請求項７に記載の方法。
10. デジタルＰＣＲにより、前記前増幅された試料の前記標的ポリヌクレオチド配列および前記参照ポリヌクレオチド配列を、アッセイするステップの前に、該前増幅された試料の全部または一部が、標的ポリヌクレオチド配列および参照ポリヌクレオチド配列の定量的増幅のために選択される試薬と合わせられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記前増幅ステップにおいて使用される前記参照ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマが、デジタルＰＣＲにより、前記前増幅された試料の該参照ポリヌクレオチド配列を、アッセイするステップにおいても使用される、請求項８に記載の方法。
12. 前記前増幅ステップにおいて使用される前記標的ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマが、デジタルＰＣＲにより、前記前増幅された試料の該標的ポリヌクレオチド配列を、アッセイするステップにおいても使用される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試薬が、ポリヌクレオチド増幅に適切な条件下で、標的ポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする第一プローブと、参照ポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする第二プローブとを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記第一プローブおよび前記第二プローブが、異なる検出可能標識を含み、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）ベースの重合の際の該第一プローブもしくは該第二プローブの結合、または該第一プローブもしくは該第二プローブの分解の結果、該各々の検出可能標識の検出可能蛍光の変化が生じる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記参照ポリヌクレオチド配列が、ＲＮａｓｅＰ酵素、ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨを少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
16. １の値から実質的に逸脱する、標的ポリヌクレオチド配列 対 参照ポリヌクレオチド配列の比が、前記被験体の前記ゲノムにおける異常な標的ポリヌクレオチド配列コピー数を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記参照ポリヌクレオチド配列が、所定のゲノムコピー数Ｎを有し；
    前記標的ポリヌクレオチド配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数を決定することが、該標的ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ａを決定することを含み、
    該参照ポリヌクレオチド配列を含む増幅されたポリヌクレオチド分子の数を決定することが、該参照ポリヌクレオチド配列またはその部分配列が存在する反応体積の数Ｂを決定することを含み；
    前記ゲノムにおける該標的ポリヌクレオチドの相対的コピー数が、（Ａ）／（Ｂ）×Ｎにほぼ等しい、請求項１に記載の方法。
18. 前記増幅された試料の全てまたは一部を、少なくとも１０，０００の分離した反応体積に分配するステップを含む、請求項７に記載の方法。
19. 前記反応体積が、２ｎＬ〜５０ｎＬである、請求項７に記載の方法。