ES2380844T3 - Determinación de la variación en el número de copias, métodos y sistemas - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el número de copias relativo de una secuencia polinucleotídica diana en el genoma de un sujeto, que comprende: preamplificar una secuencia polinucleotídica diana y una secuencia polinucleotídica de referencia en una muestra que contiene ADN genómico del sujeto; ensayar la secuencia polinucleotídica diana y la secuencia polinucleotídica de referencia de la muestra preamplificada mediante una PCR digital; determinar (a) el número de moléculas polinucleotídicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotídica diana, y (b) el número de moléculas polinucleotídicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotídica de referencia, y determinar la proporción de (a) a (b).

Description

Determinaci6n de la variaci6n en el numero de copias, metodos y sistemas

Campo de la invenci6n

La invenci6n se refiere a un metodo para determinar la variaci6n en el numero de copias dentro de un genoma de 5 poblaciones pequefas o de individuos, y encuentra aplicaci6n en biologfa y medicina.

Antecedentes de la invenci6n

Una "PCR digital" se refiere a un metodo en el que moleculas de acidos nucleicos individuales presentes en una muestra se distribuyen en muchos volumenes de reacci6n distintos (por ejemplo, camaras o partes alfcuotas) antes de la amplificaci6n mediante PCR de una o mas secuencias diana. La concentraci6n de moleculas individuales en la 10 muestra se ajusta para que, despues de la distribuci6n, cada volumen de reacci6n contenga menos de una molecula polinucleotfdica discreta (o agregado de moleculas polinucleotfdicas enlazadas), y la mayorfa de las camaras contengan una o ninguna molecula. La amplificaci6n de una secuencia diana produce una salida digital binaria en la que cada camara se identifica como que contiene o que no contiene el producto de la PCR indicativo de la presencia de la correspondiente secuencia diana. Un recuento de los volumenes de reacci6n que contienen niveles 15 detectables de productos finales de la PCR es una medici6n directa de la cantidad absoluta de acidos nucleicos. En una versi6n de la PCR digital, las moleculas polinucleotfdicas se distribuyen mediante su reparto en volumenes de reacci6n separados. Un metodo de reparto emplea la matriz digital BioMark™ 12.765 (Fluidigm Corp., South San Francisco, CA). Este chip utiliza canales integrados y valvulas que reparten mezclas de muestras y reactivos en camaras de reacci6n con un volumen de 765 nanolitros. Las moleculas de ADN en cada mezcla se reparten 20 aleatoriamente en las 765 camaras de cada panel. El chip entonces se somete a termociclado y se forma una imagen en un sistema de PCR a tiempo real BioMark de Fluidigm, y las camaras positivas que originariamente contenfan una o mas moleculas pueden ser contadas por el programa informatico de analisis de matrices digitales. Para unos analisis sobre la PCR digital vease, por ejemplo, Vogelstein y Kinzler, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9236-9241; McBride et al., publicaci6n de la solicitud de patente de EEUU nO 20050252773, en especial el

25 ejemplo 5.

Las variaciones en el numero de copias ("copy number variations", CNV) son las ganancias o las perdidas de regiones gen6micas que varfan en tamafo de 500 bases o mas (a menudo entre cinco mil y cinco millones de bases). Estudios del genoma completo han revelado la presencia de un gran numero de regiones CNV en seres humanos y una amplia gama de diversidad genetica entre la poblaci6n general. Las CNV han sido el foco de muchos 30 estudios recientes debido a su papel en trastornos geneticos humanos. Vease, por ejemplo, Iafrate et al., 2004, Detection of large-scale variation in the human genome, Nat. Genet., 36:949-951; Sebat et al., 2004, Large-scale copy number polymorphism in the human genome, Science, 305:525-528; Redon et al., 2006, Global variation in copy number in the human genome, Nature, 444:444-454; Wong et al., 2007, A comprehensive analysis of common copy-number variations in the human genome, Am. J. Hum. Genet., 80:91-104; Ropers, 2007, New perspectives for

35 the elucidation of genetic disorders, Am. J. Hum. Genet., 81:199-207; Lupski, 2007, Genomic rearrangements and sporadic disease, Nat. Genet., 39:S43-S47. La aneuploidfa, tal como una trisomfa o la delecci6n de un cromosoma completo, es un tipo limitante de variaci6n en el numero de copias asociado con una diversidad de enfermedades humanas.

Breve sumario de la invenci6n

40 La invenci6n proporciona un metodo para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que comprende:

preamplificar una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia en una muestra que contiene ADN gen6mico del sujeto;

ensayar la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia de la muestra 45 preamplificada mediante una PCR digital;

determinar (a) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica diana, y (b) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica de referencia, y determinar la proporci6n de (a) a (b). La invenci6n se refiere a un metodo para determinar la variaci6n en el numero de copias dentro de un genoma de poblaciones pequefas o de individuos.

50 El metodo proporciona la preamplificaci6n del gen de interes en una muestra antes del analisis mediante PCR digital. La etapa de preamplificaci6n permite la distribuci6n de copias individuales del gen en muestras de reacci6n de PCR individuales para la detecci6n de una manera que es mas representativa del numero de copias real que cuando se determina mediante PCR digital sin preamplificaci6n.

Los metodos de la invenci6n basados en la PCR digital tienen la capacidad de distinguir diferencias en menos de 2

55 veces en el numero de copias de genes con gran precisi6n. Por ejemplo, pueden diferenciar entre 1, 2, 3 y 4 copias de genes en diferentes muestras. Para asegurar que la diferencia aparente en el numero de copias de genes en

diferentes muestras es real, y no esta distorsionada por diferencias en las cantidades de muestra, los inventores emplean una expresi6n, el numero de copias relativo. El numero de copias relativo de un gen (por genoma humano) puede expresarse como la proporci6n del numero de copias de un gen diana al numero de copias de un gen de referencia de una sola copia en una muestra de ADN, que habitualmente es 1. Por ejemplo, el gen de la ARNasa P es un gen de una sola copia que codifica el resto de ARN de la enzima ARNasa P, y puede utilizarse como gen de referencia en un ensayo de numero de copias.

Un chip de matriz digital disponible en el mercado, tal como el que se ilustra en la figura 3, para realizar una PCR digital se ha utilizado para cuantificar el ADN en una muestra. El chip tiene 12 puertos de entrada de muestras para la introducci6n de una mezcla de muestra. Cada mezcla de muestra se reparte en 765 camaras de reacci6n en cada uno de los 12 paneles. Tal como se describe en la bibliograffa (vease, por ejemplo, McBride et al., publicaci6n de la solicitud de patente de EEUU nO 20050252773), la capacidad para cuantificar el ADN en muestras se basa en el hecho de que, cuando se introduce una cantidad apropiada de ADN, las moleculas de ADN individuales se distribuyen aleatoriamente en las camaras.

Utilizando dos ensayos para dos genes (por ejemplo, ARNasa P y otro gen de interes) con dos tintes fluorescentes en un chip es posible cuantificar simultaneamente la ARNasa P y el otro gen en la misma muestra de ADN y obtener una buena estimaci6n de la proporci6n de estos dos genes y el numero de copias del gen de interes.

Sin embargo, cuando estan duplicados, multiples copias de un gen pueden estar estrechamente vinculadas en el mismo cromosoma y, por tanto, no pueden separarse entre sf, incluso en la matriz digital. Como resultado, multiples copias se comportarfan como una sola molecula, y el numero total de copias del gen serfa muy subestimado.

La presente invenci6n se ocupa de este problema incluyendo una etapa de preamplificaci6n en el proceso. La preamplificaci6n es una reacci6n de PCR con cebadores para el gen de interes y para un gen de referencia (por ejemplo, el gen ARNasa P). Generalmente se realiza durante un numero limitado de ciclos termicos (por ejemplo, 10 ciclos); suponiendo unas eficacias de PCR iguales, los numeros de copias de ambos genes aumentan proporcionalmente en la etapa de preamplificaci6n. Utilizando este proceso, aunque multiples copias de un gen esten vinculadas entre sf sobre el genoma, despues de la preamplificaci6n cada copia del gen de interes se amplificara por separado, y se repartira por separado en diferentes camaras de la matriz digital. Puesto que la moleculas recien generadas de ambos genes reflejan la proporci6n original y ya no estan vinculadas entre sf, un analisis con un chip digital puede cuantificar las moleculas de los dos genes y medir la proporci6n de los dos genes (y por tanto el numero de copias del gen de interes) de modo preciso.

Por tanto, la presente invenci6n proporciona metodos para realizar analisis basados en genes. De modo mas especffico, los metodos de la presente invenci6n en general se refieren a la determinaci6n de la variaci6n en el numero de copias de un polinucle6tido de interes en una muestra procedente de un sujeto.

La invenci6n proporciona, segun se especifica en las reivindicaciones, un metodo para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que incluye las etapas de:

a) preamplificar una secuencia genica diana y una secuencia genica de referencia en una muestra que contiene ADN gen6mico del sujeto, produciendo con ello una muestra amplificada;

b) realizar una PCR digital distribuyendo el producto de a) en una pluralidad de volumenes de reacci6n aislados, amplificando las secuencias genicas diana y de referencia en cada volumen de reacci6n, y determinando la cantidad relativa de las secuencias genicas diana y de referencia en la muestra amplificada, en el que la cantidad relativa de las secuencias genicas diana y de referencia en la muestra amplificada se corresponde con la cantidad relativa de las secuencias genicas diana y de referencia en el genoma.

Tal como se especifica en las reivindicaciones, la invenci6n proporciona un metodo para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que incluye las etapas de:

preamplificar una secuencia genica diana y una secuencia genica de referencia en una muestra que contiene ADN gen6mico del sujeto;

ensayar la secuencia genica diana y la secuencia genica de referencia de la muestra preamplificada mediante PCR digital;

determinar (a) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia genica diana, y (b) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia genica de referencia, y determinar la proporci6n de (a) a (b).

En una realizaci6n de la invenci6n que se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones, se proporciona un metodo para determinar el numero de copias de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que incluye las etapas de:

realizar una primera amplificaci6n de polinucle6tidos de una muestra de ADN obtenida a partir de un sujeto, en

la que se amplifica una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia, teniendo dicha secuencia de referencia un numero de copias gen6micas predeterminado N, produciendo con ello una muestra amplificada;

distribuir toda o parte de la muestra amplificada en una pluralidad de volumenes de reacci6n aislados;

realizar, en cada volumen de reacci6n, una segunda amplificaci6n de polinucle6tidos en la que la secuencia polinucleotfdica diana o una subsecuencia de esta se amplifica si esta presente, y la secuencia polinucleotfdica de referencia o una subsecuencia de esta se amplifica si esta presente;

determinar (a) el numero de volumenes de reacci6n en los que la secuencia polinucleotfdica diana, o una subsecuencia de esta, esta presente (A), y determinar (b) el numero de volumenes de reacci6n en los que la secuencia polinucleotfdica de referencia, o una subsecuencia de esta, esta presente (B); en el que el numero de copias del polinucle6tido diana en el genoma es aproximadamente igual a (A)/(B) x N.

En algunas realizaciones, segun se especifica en las reivindicaciones, la muestra procede de un ser humano. En realizaciones concretas, la proporci6n de (a) a (b) es de aproximadamente 0,5 y existe una delecci6n de (a) sobre un cromosoma, o la proporci6n de (a) a (b) es de aproximadamente 1,5 y existe una duplicaci6n de (a) sobre un cromosoma. En algunas realizaciones, una proporci6n de la secuencia genica diana a la secuencia genica de referencia que se desvfe sustancialmente de un valor de 1 indica un numero de copias an6malo de la secuencia del gen diana en el genoma del paciente.

En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, la realizaci6n de la primera amplificaci6n de polinucle6tidos incluye combinar la muestra biol6gica con una composici6n que comprende cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica diana, y cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica de referencia, y realizar un ensayo de reacci6n en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar por separado el polinucle6tido diana y el polinucle6tido de referencia en una proporci6n sustancialmente identica.

En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, pero que no se reivindican especfficamente, la primera amplificaci6n de polinucle6tidos tiene de 4 a 15 ciclos termicos. En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, los volumenes de reacci6n se disponen en un dispositivo de microfluidos, y la primera amplificaci6n de polinucle6tidos se realiza en un volumen de reacci6n separado del dispositivo de microfluidos.

En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, antes de la etapa de distribuci6n, toda o parte de la muestra amplificada se combina con reactivos seleccionados para la amplificaci6n de la secuencia genica diana y de la secuencia genica de referencia. Normalmente se emplea una porci6n, y la muestra amplificada puede diluirse antes de la distribuci6n de una porci6n a los volumenes de reacci6n. En algunas realizaciones, la amplificaci6n es una amplificaci6n mediante PCR.

En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, los cebadores de la amplificaci6n de la secuencia genica de referencia utilizados en la primera etapa de amplificaci6n de polinucle6tidos son los mismos que los utilizados en la segunda etapa de amplificaci6n de polinucle6tidos. En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, los cebadores de la amplificaci6n de la secuencia genica diana utilizados en la primera etapa de amplificaci6n de polinucle6tidos son los mismos que los utilizados en la segunda etapa de amplificaci6n de polinucle6tidos. En algunas realizaciones, los reactivos comprende una primera sonda que se hibrida selectivamente con una secuencia genica diana, y una segunda sonda que se hibrida selectivamente con una secuencia genica de referencia bajo condiciones adecuadas para la amplificaci6n de polinucle6tidos. En algunas realizaciones, la primera y la segunda sonda comprenden marcadores detectables diferentes, y la uni6n de la primera o la segunda sonda, o la degradaci6n de la primera o la segunda sonda tras una polimerizaci6n basada en una reacci6n en cadena de polimerasa (PCR), produce un cambio en la fluorescencia detectable del respectivo marcador detectable.

En algunas realizaciones, la secuencia genica de referencia comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica al menos parcialmente una enzima ARNasa P, beta-actina o GAPDH. En algunas realizaciones, que no se reivindican de modo especffico, la determinaci6n del numero de copias relativo de la secuencia genica diana comprende detectar una perdida de heterocigosidad en el genoma del sujeto. En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, pero que no se reivindican de modo especffico, una proporci6n de secuencia genica diana a secuencia genica de referencia con un valor sustancialmente mayor o menor que 1 indica una perdida de heterocigosidad en el genoma del paciente.

Para comprender mas a fondo la naturaleza y las ventajas de la presente invenci6n, debe hacerse referencia a la posterior descripci6n detallada, tomada en conjunto con los dibujos adjuntos. Los dibujos representan realizaciones de la presente invenci6n como ilustraci6n. La invenci6n puede modificarse en diversos aspectos sin apartarse de la invenci6n. Por consiguiente, los dibujos/figuras y la descripci6n de estas realizaciones son de naturaleza ilustrativa, no restrictiva.

Breve descripci6n de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas generales de un metodo de la invenci6n segun se describe en la presente.

Las figuras 2A-2B ilustran ejemplos de disefos de canales de un dispositivo de microfluidos.

La figura 3 es un diagrama simplificado de un dispositivo de microfluidos.

Las figuras 4A-4C muestran porciones del dispositivo de microfluidos ilustrado, por ejemplo, en la figura 1.

La figura 5 ilustra ejemplos de resultados de variaciones en el numero de copias obtenidos utilizando un dispositivo de microfluidos.

La figura 6 ilustra ejemplos de resultados de perdida de heterocigosidad obtenidos utilizando un dispositivo de microfluidos.

La figura 7 es una grafica que muestra la detecci6n de la perdida de heterocigosidad, segun una realizaci6n de la presente invenci6n que se incluye dentro del alcance de las reivindicaciones, pero que no se reivindica de modo especffico.

La figura 8 es un esquema que muestra los resultados parciales de un experimento imaginario en el que se determina el numero de copias de la secuencia diana T. Se ilustra una matriz de volumenes de reacci6n 64 x 64, en la que una secuencia diana se amplifica y se detecta utilizando sondas marcadas con VIC (amarillo), y se amplifica y se detecta una secuencia de referencia de una sola copia utilizando sondas marcadas con FAM (verde). Se detectaron 19 volumenes de reacci6n con marcadores amarillos y 12 volumenes de reacci6n con marcadores verdes, indicando una proporci6n de aproximadamente 1,5 (19/12 = 1,58 ≈ 1,5), que indica que existen tres copias de la secuencia diana por genoma diploide.

Descripci6n detallada de la invenci6n

La presente invenci6n proporciona un metodo para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que comprende:

preamplificar una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia en una muestra que contiene ADN gen6mico del sujeto;

ensayar la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia de la muestra preamplificada mediante una PCR digital;

determinar (a) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica diana, y (b) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica de referencia, y determinar la proporci6n de (a) a (b).

La presente invenci6n proporciona metodos para determinar el numero de copias de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, incluyendo las variaciones en el numero de copias asociadas con enfermedades geneticas. En particular, los metodos y los sistemas descritos en la presente pueden utilizarse para detectar las variaciones en el numero de copias de un polinucle6tido diana en el genoma de un paciente empleando material gen6mico presente dentro de una muestra derivada del paciente. Las tecnicas de la presente invenci6n emplean generalmente ensayos basados en la amplificaci6n de polinucle6tidos para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia en una muestra. Se conoce el numero de copias gen6micas para la secuencia de referencia. Como tal, el numero de copias del polinucle6tido diana puede analizarse con relaci6n al polinucle6tido de referencia para determinar el numero de copias relativo del polinucle6tido diana. Las secuencias polinucleotfdicas diana y/o de referencia a veces se denomina "genes". Sin embargo, se apreciara que el termino "gen" no indica una secuencia que necesariamente codifique una protefna (o un ARN).

Las tecnicas de detecci6n y analisis del numero de copias pueden utilizar ciertos dispositivos de alta capacidad de procesamiento adecuados para el denominado "analisis digital" o "PCR digital", tales como dispositivos de microfluidos que incluyen un gran numero o una alta densidad de sitios de reacci6n de pequefo volumen (por ejemplo, volumenes de reacci6n o sitios de reacci6n con nanovolumen). Por consiguiente, las tecnicas de detecci6n y analisis de la variaci6n en el numero de copias segun la presente invenci6n, segun se especifica en las reivindicaciones, pueden incluir distribuir o repartir una muestra entre cientos a miles de volumenes de reacci6n dispuestos en una plataforma de reacci6n/ensayo o un dispositivo de microfluidos, incluyendo los ejemplos de dispositivos descritos en la presente.

Los metodos de la presente invenci6n incluyen, segun se especifica en las reivindicaciones, una etapa de preamplificaci6n en la que un ADN (por ejemplo, ADN gen6mico) procedente de una muestra biol6gica se amplifica utilizando la reacci6n de cadena de polimerasa (PCR) u otras tecnicas de amplificaci6n cuantitativas. Los ejemplos

de muestras biol6gicas incluyen celulas (que incluyen celulas lisadas y homogeneizados celulares), suero, y fluidos biol6gicos. Aunque los metodos de la presente en general se describen con respecto al ADN humano (por ejemplo, para determinar la variaci6n en el numero de copias en el genoma de un paciente humano), se reconocera que los metodos pueden modificarse/adaptarse a cualquier muestra que tenga variaciones en las cantidades de material genetico. Por ejemplo, los metodos pueden utilizarse para el analisis genetico de animales, plantas, bacterias y hongos, asf como para el analisis genetico de sujetos humanos. Los metodos para recoger y procesar muestras biol6gicas que contienen ADN son muy conocidos y no es necesario que se analicen en la presente. Para los ensayos de la invenci6n, el ADN puede aislarse a partir de celulas o fluidos biol6gicos, o el ensayo puede realizarse utilizando, por ejemplo, un lisado celular que contenga ADN. Por tanto, tal como se emplea en la presente, una "muestra de ADN" puede referirse a ADN, en especial ADN gen6mico, en forma purificada, semipurificada, o no purificada. Tal como se emplea en la presente, una etapa para "obtener una muestra de ADN de un sujeto" se refiere simplemente al hecho de que la muestra de ADN es el material de partida para posteriores etapas analfticas (por ejemplo, la etapa de preamplificaci6n). "Obtener una muestra de ADN" no implica el acto, por ejemplo, de recoger celulas de un sujeto, o de aislar ADN, sino que simplemente puede ser una cuesti6n de obtener un tubo que contenga ADN recogido previamente.

La figura 1 ilustra las etapas generales para realizar los metodos descritos en la presente. En una realizaci6n ilustrativa, las etapas del metodo implican proporcionar una mezcla maestra de preamplificaci6n que comprende cebadores de ensayo, un sistema tamponante adecuado, nucle6tidos, y una enzima ADN polimerasa (tal como una enzima polimerasa modificada para condiciones de "inicio en caliente"), afadir ADN gen6mico a la mezcla maestra de preamplificaci6n, preamplificar la secuencia o secuencias de interes y la secuencia de referencia, y ensayar las secuencias preamplificadas mediante un analisis de PCR digital (en un ensayo de consumaci6n o en un ensayo a tiempo real), y comparar la frecuencia de la secuencia o secuencias diana con relaci6n a la frecuencia de la secuencia de referencia. Se reconocera que la figura 1 se proporciona para ayudar a comprender la invenci6n, pero no pretende limitar la invenci6n.

En la etapa inicial de la figura 1, la preamplificaci6n, se realiza una primera amplificaci6n de polinucle6tidos de una muestra de ADN obtenida a partir de un sujeto. En la etapa de preamplificaci6n, se amplifica una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia. Los metodos para la amplificaci6n por PCR son muy conocidos y no es necesario describirlos en la presente.

En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, la secuencia diana es una secuencia cuya deleci6n o duplicaci6n esta asociada con un fenotipo de interes. En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, la secuencia diana es una secuencia cuya deleci6n o duplicaci6n no esta asociada con un fenotipo de interes conocido, pero se desea conocer informaci6n acerca de la distribuci6n o correlaci6n de la variaci6n en poblaciones concretas.

La secuencia de referencia es una secuencia que tiene un numero de copias gen6micas conocido (o supuesto). Por tanto, no es probable que una secuencia de referencia este amplificada o delecionada en un genoma. No es necesario determinar empfricamente el numero de copias de la secuencia de referencia en cada ensayo. Por el contrario, el numero de copias puede suponerse basandose en el numero normal de copias en el organismo de interes. Por ejemplo, una secuencia de referencia util en el genoma humano es la secuencia del gen de ARNasa P, un gen de una sola copia presente en dos copias por genoma diploide (y que tiene un numero de copias de 1 por genoma haploide). Como ejemplo, otras secuencias de referencia utiles incluyen β-actina y gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); sin embargo, se apreciara que la invenci6n no se limita a una secuencia de referencia concreta.

La preamplificaci6n puede realizarse como una reacci6n de PCR con cebadores para la ARNasa P (el gen de referencia) y para el gen diana de interes. Generalmente, las reacciones se realizan durante un numero limitado de ciclos termicos (por ejemplo, 5 ciclos o 10 ciclos). En algunas realizaciones de la invenci6n que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones, el numero 6ptimo de ciclos dependera de las eficacias de PCR para el gen de referencia y el gen diana. En ciertas realizaciones, el numero de ciclos termicos durante un ensayo de preamplificaci6n puede variar de aproximadamente 4 a 15 ciclos termicos, o aproximadamente 4-10 ciclos termicos. En ciertas realizaciones, el numero de ciclos termicos puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas de

15.

Las reacciones de preamplificaci6n preferiblemente son cuantitativas o proporcionales. Es decir, el numero relativo (proporci6n) de amplicones de las secuencias diana y de referencia debe reflejar el numero relativo (proporci6n) de la secuencia diana y de referencia en el ADN gen6mico (u otro) que se esta amplificando. Los metodos para la amplificaci6n cuantitativa son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Arya et al., 2005, Basic principles of realtime quantitative PCR, Expert Rev. Mol. Diagn., 5(2):209-219. En el caso de genes duplicados, deben seleccionarse cebadores de modo que cada copia duplicada del gen diana de interes se amplifique por separado. Asf, tras la preamplificaci6n selectiva y la distribuci6n de la muestra en volumenes de reacci6n separados, se distribuira un numero proporcional de amplicones que corresponden a cada secuencia en los volumenes de reacci6n. Debido a que las moleculas recien generadas de ambos genes reflejan la proporci6n original, un posterior analisis del numero de copias puede cuantificar el numero de moleculas del gen diana y del gen de referencia. Como resultado, la proporci6n de los dos genes puede medirse con precisi6n. Debido a que se conoce el numero de copias de la

secuencia de referencia, puede determinarse el numero de copias de la secuencia de interes.

Resulta deseable que las eficacias de la amplificaci6n de las secuencias diana y de referencia sean similares o aproximadamente iguales, para no introducir ningun sesgo en la proporci6n de los numeros de copias de los dos genes. Por esta raz6n, deben seleccionarse parejas de cebadores y condiciones de la amplificaci6n para obtener este resultado. La eficacia de la amplificaci6n de cualquier pareja de cebadores puede determinarse con facilidad utilizando tecnicas habituales (por ejemplo, vease Furtado et al., "Application of real-time quantitative PCR in the analysis of gene expression", DNA amplification: Current Technologies and Applications, Wymondham, Norfolk, Reino Unido, Horizon Bioscience, pp. 131-145, (2004)).

Aunque resulta deseable que las eficacias de la amplificaci6n de las secuencias diana y de referencia sean aproximadamente iguales, el numero limitado de ciclos termicos de preamplificaci6n (generalmente menor que 15, habitualmente 10 o menor que 10, lo mas frecuente aproximadamente 5) mitiga en gran medida cualquier diferencia en la eficacia, de modo que es probable que las diferencias habituales tengan un efecto insignificante sobre los resultados.

Tal como se mencion6, los metodos de amplificaci6n son conocidos en la tecnica. Como ilustraci6n, la mezcla de reacci6n utilizada para el metodo de preamplificaci6n (mezcla o composici6n de preamplificaci6n) generalmente contiene un tamp6n apropiado, una fuente de iones magnesio (Mg2+) en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, nucle6tidos y, opcionalmente, detergentes, y estabilizantes. Un ejemplo de un tamp6n adecuado es el tamp6n TRIS a una concentraci6n de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 85 mM, siendo preferida una concentraci6n de 10 mM a 30 mM. En una realizaci6n, la concentraci6n del tamp6n TRIS es 20 mM en la forma de mezcla de reacci6n de doble potencia (2x). La mezcla de reacci6n puede tener un intervalo de pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9,0, siendo tfpico un intervalo de pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5. La concentraci6n de nucle6tidos puede estar en el intervalo de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 1000 mM, generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 800 mM. Los ejemplos de concentraciones de dNTP son 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 y 800 mM, Tambien pueden incluirse en la mezcla detergentes, tales como Tween™ 20, Triton® X 100, y Nonidet™ P40. Tambien pueden incluirse agentes estabilizantes, tales como ditiotreitol (DTT, reactivo de Cleland) o mercaptoetanol. La mezcla de reacci6n de preamplificaci6n contendra cebadores para la reacci6n de preamplificaci6n. Los cebadores en general tendran la misma secuencia que los utilizados en los posteriores ensayos de PCR que se preparan para la muestra, aunque en general en concentraciones reducidas. La concentraci6n de cebadores puede ser mayor, igual o menor que las concentraciones de cebadores utilizadas en el ensayo de PCR. Las realizaciones incluyen el uso de cebadores que tienen una concentraci6n aproximadamente 50, 25, 20, 10 o 5 veces mayor, igual, o 10, 2, 35, 50, 65, 75, 100, 125, 150, 175 y 200 veces menor que la concentraci6n de cebadores en el ensayo de PCR. Los cebadores utilizados en la preamplificaci6n pueden incluir polfmeros aleatorios, colas de poli-A, y cebadores especfficos disefados para el ensayo PCR de interes.

La mezcla de reacci6n puede contener opcionalmente un tinte de referencia para normalizar los posteriores resultados del analisis de la PCR cuantitativa real. Un ejemplo de un tinte de referencia habitual disponible en el mercado es ROX. Una mezcla de reacci6n disponible en el mercado que contiene el tinte ROX es la mezcla de reacci6n CellsDirect 2X, nO de catalogo 11754-100 y 11754-500, disponible en Invitrogen Corporation.

Tambien se afade una enzima ADN polimerasa (por ejemplo, una Taq polimerasa) a la mezcla de reacci6n. En una realizaci6n, una Taq polimerasa, tal como Taq ADN Platinum®, es una Taq ADN polimerasa recombinante complejada con un anticuerpo que inhibe la actividad polimerasa a temperatura ambiente. La actividad polimerasa completa se restablece despues de la etapa de desnaturalizaci6n en PCR, proporcionando un "inicio en caliente".

Las muestras preamplificadas preparadas mediante los metodos de la presente invenci6n son particularmente adecuadas para analisis de PCR digitales y para distinguir la duplicaci6n cromos6mica de genes. En particular, una muestra preamplificada se ensaya en una pluralidad de experimentos de PCR de bajo volumen. En la PCR digital, se ejecutan ensayos identicos (o sustancialmente similares) sobre una muestra del ADN gen6mico. El numero de reacciones individuales para una muestra gen6mica concreta puede variar de aproximadamente 2 a mas de

1.000.000. Preferiblemente, el numero de ensayos realizados sobre una muestra es 100 o mayor, mas preferiblemente 200 o mayor, mas preferiblemente 300 o mayor. Tambien puede realizarse una PCR digital a escala mayor, en la que el numero de ensayos realizados sobre una muestra es 500 o mayor, 700 o mayor, 765 o mayor,

1.000 o mayor, 2.500 o mayor, 5.000 o mayor, 7.500 o mayor, o 10.000 o mayor. El numero de ensayo realizados tambien puede ser significativamente grande, tal como hasta aproximadamente 25.000, hasta aproximadamente 50.000, hasta aproximadamente 75.000, hasta aproximadamente 100.000, o mayor que 1.000.000 ensayos por muestra gen6mica. La cantidad de ADN utilizada en un ensayo de PCR digital en general se selecciona de forma que un fragmento de acido nucleico o menos esta presente en cada reacci6n de PCR digital individual.

Tal como se ilustra en la figura 1, tras la etapa de preamplificaci6n, la muestra (o una porci6n de esta) que comprende el producto de la preamplificaci6n que tiene material genetico proporcionalmente amplificado (por ejemplo, amplicones que corresponden a las secuencias polinucleotfdicas diana y de referencia) se distribuye en volumenes de reacci6n o emplazamientos discretos de modo que cada pocillo de reacci6n incluye, por ejemplo, una

media de no mas de aproximadamente un amplic6n por volumen. Asf, la mayorfa de los volumenes de reacci6n no tendran amplicones, o tendran un amplic6n de la secuencia diana, o un amplic6n de la secuencia de referencia. En general, resulta util diluir la muestra preamplificada (generalamente 1:10-1:20) y/o emplear una porci6n pequefa de la muestra amplificada para ajustar la concentraci6n de amplicones de modo que (de media) sean cero o un amplic6n por volumen de reacci6n. Aunque en algunos casos el producto de la etapa de preamplificaci6n puede utilizarse sin la adici6n de otros reactivos de amplificaci6n (por ejemplo, polimerasa), en general es util afadir nuevos reactivos para la amplificaci6n que incluyen, opcionalmente, diferentes cebadores. Asf, la muestra biol6gica, antes o despues de la distribuci6n, puede combinarse con reactivos seleccionados para una amplificaci6n cuantitativa o no cuantitativa de una secuencia polinucleotfdica diana y de una secuencia polinucleotfdica de referencia 12 (etapa 2).

Ademas, aunque la etapa de preamplificaci6n es, en general, una amplificaci6n de tipo PCR, la segunda amplificaci6n (es decir, la amplificaci6n de las secuencias de amplicones producidas en la preamplificaci6n) puede realizarse utilizando cualquier metodo de amplificaci6n tal como, por ejemplo y sin limitaci6n, Nasba (Compton, 1991, Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature, 350:91-91, 1991) y el protocolo Eberwine (Van Gelder et al., Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990).

Tal como se indic6 anteriormente, se apreciara que la cantidad de moldes de ADN y de amplicones (una funci6n de la cantidad de ADN gen6mico de partida, del numero de ciclos de amplificaci6n, de la eficacia de la amplificaci6n, y del tamafo de los volumenes de reacci6n) se ajustara para lograr la distribuci6n deseada. Los expertos en la tecnica pueden determinar la concentraci6n de ampliciones en los productos de la preamplificaci6n y calcular una cantidad apropiada para su introducci6n. De manera mas conveniente, puede ensayarse un conjunto de diluciones en serie del producto de la preamplificaci6n. Por ejemplo, el dispositivo que aparece en la figura 3 (disponible en el mercado en Fluidigm Corp. como la matriz digital BioMark 12.765) permite ensayar 12 diluciones de modo simultaneo. Opcionalmente, la diluci6n 6ptima puede determinarse generando una grafica de regresi6n lineal. Para la diluci6n 6ptima, la lfnea debe ser recta y pasar a traves del origen. Despues puede calcularse la concentraci6n de las muestras originales a partir de la grafica.

Tras la distribuci6n, el material gen6mico contenido en una pluralidad de camaras de reacci6n puede amplificarse para realizar despues ensayos de muestras para determinar el numero de los volumenes de reacci6n en que los amplicones correspondientes a la secuencia diana o de referencia estan secuestrados (figura 1, 14). La segunda amplificaci6n puede realizarse utilizando los mismos cebadores que los empleados en la preamplificaci6n, o bien cebadores diferentes (por ejemplo, un conjunto anidado).

La detecci6n y el analisis diferencial de la muestra puede realizarse de modo que se distinga una sefal que surja del polinucle6tido diana comparado con el polinucle6tido de referencia (figura 1, 16). Por ejemplo, puede utilizarse un analisis de diferentes sitios de reacci6n para calcular la proporci6n del numero de volumenes de reacci6n que contienen secuencias polinucleotfdicas diana, y el numero de volumenes de reacci6n que contienen secuencias polinucleotfdicas de referencia. Los metodos tambien pueden incluir detectar y analizar informaci6n geneticamente relacionada sobre las secuencias diana en el genoma de un sujeto, incluyendo la detecci6n de deleciones o duplicaciones geneticas, la perdida de heterocigosidad y similares, tal como una aneuploidfa (por ejemplo, trisomia) y numerosas otras anomalfas geneticas. A continuaci6n se proporcionan mas detalles sobre las etapas del metodo, incluyendo diversas tecnicas de detecci6n y analisis diferencial.

Tal como se analiz6 anteriormente, la muestra que contiene el producto de la preamplificaci6n o material genetico no amplificado puede distribuirse en volumenes de reacci6n o emplazamientos discretos de una plataforma de detecci6n y analisis. La distribuci6n de la muestra puede realizarse utilizando una diversidad de tecnicas y dispositivos tales como, por ejemplo, una distribuci6n basada en el flujo en dispositivos de microfluidos que incluyen una pluralidad de sitios de reacci6n/camaras de volumen pequefo. En general, la etapa de distribuci6n de los metodos descritos en la presente se aplica para aislar muestras del material de interes, por ejemplo, secuencias diana y de referencia, en sitios de reacci6n individuales para su posterior detecci6n y analisis.

Dentro de cada uno de una pluralidad de volumenes o sitios de reacci6n pueden realizarse uno o mas ensayos de amplificaci6n, incluyendo reacciones en forma multiplex de detecci6n y analisis cuantitativo/amplificaci6n de la secuencia polinucleotfdica diana y de una secuencia polinucleotfdica de referencia seleccionada. La proporci6n de secuencias detectadas en una muestra puede calcularse utilizando tecnicas de detecci6n, tales comoun analisis de PCR digital, el control mediante curvas de una PCR a tiempo real y/o la comparaci6n de imagenes de consumaci6n de camaras de reacci6n positivas para un ensayo frente a otro ensayo. Como alternativa, puede calcularse la concentraci6n de cualquier secuencia en una muestra de ADN (copias/μl) utilizando el numero de camaras de reacci6n positivas en el dispositivo que contengan al menos una copia de esta secuencia, y puede determinarse una proporci6n de concentraciones de las secuencias diana y de referencia para calcular el numero de copias. Vease la solicitud de patente de EEUU nO 12/170414, en tramitaci6n junto con la presente, "Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR". Vease tambien Dube et al., 2008, "Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device", PLoS ONE, 3(8):e2876.doi:10.1371/journal.pone.0002876.

Tal como se especifica en las reivindicaciones, la presente invenci6n incluye metodos y tecnicas basadas en la

amplificaci6n para determinar la variaci6n en el numero de copias de un polinucle6tido diana, por ejemplo, en el genoma de un paciente. En algunos casos, la etapa de preamplificaci6n puede realizarse antes de la distribuci6n de la muestra en un dispositivo de microfluidos para la posterior amplificaci6n y analisis cuantitativo. La preamplificaci6n puede resultar deseable, por ejemplo, cuando multiples copias de un gen diana estan muy juntas sobre el mismo cromosoma y, por tanto, las secuencias dianas no pueden separarse entre sf de modo 6ptimo durante un analisis cuantitativo, por ejemplo, cuando se distribuyen en un dispositivo de microfluidos. En estos casos, pueden contarse

o cuantificarse un numero menor de las multiples copias del gen diana, y dar un resultado de una molecula en lugar de dos. Por consiguiente, el numero total de copias del gen puede subestimarse.

Segun la presente invenci6n, los calculos de la CNV incluiran el calculo del "numero de copias relativo" para distinguir, de modo ventajoso, las diferencias aparentes en el numero de copias de genes en diferentes muestras de la distorsi6n o ruido/error del ensayo, siendo provocada dicha distorsi6n por diferencias en las cantidades de las muestras. El numero de copias relativo de un gen (por genoma) puede expresarse como la proporci6n del numero de copias de un gen diana al numero de copias de un gen de referencia de una sola copia en una muestra de ADN de concentraci6n (numero de copias) conocida en el genoma del paciente, que generalmente es igual a 1. Utilizando dos ensayos para los dos genes (el polinucle6tido diana y el polinucle6tido de referencia) con dos marcadores diferentes (por ejemplo, tintes fluorescentes) en la misma matriz digital, los metodos descritos en la presente pueden utilizarse para cuantificar de modo simultaneo ambos genes en la misma muestra de ADN. Como alternativa, y de modo menos conveniente, los amplicones diana (procedentes de la preamplificaci6n) pueden amplificarse en un chip de un conjunto de volumenes de reacci6n, y los amplicones de ensayo (procedentes de la preamplificaci6n) pueden ensayarse en un conjunto diferente de amplicones, y los datos se comparan. La proporci6n de estos dos genes es el numero de copias relativo de la secuencia polinucleotfdica diana, o gen de interes, en una muestra de ADN. En una estrategia, este metodo puede resumirse como la determinaci6n del numero de volumenes de reacci6n en que la secuencia polinucleotfdica diana, o una subsecuencia de esta, esta presente (A), y la determinaci6n del numero de volumenes de reacci6n en que la secuencia polinucleotfdica de referencia, o una subsecuencia de esta, esta presente (B), y la determinaci6n de que el numero de copias del polinucl6etido diana en el genoma es aproximadamente igual a (A)/(B) x N, siendo N el numero de copias gen6micas predeterminado de la secuencia de referencia. Se entendera que (A)/(B) x N esta relacionado aproximadamente con el numero de copias, porque la pliodfa en la mayorfa de los organismos es baja (por ejemplo, los seres humanos normalmente tienen dos copias de los cromosomas somaticos), mientras que el numero de amplicones detectados en la presente invenci6n esta inherentemente sometido al error experimental. Por ejemplo, puede determinarse experimentalmente que (A) es 936, y puede determinarse experimentalmente que (B) es 596, y N puede ser 1 por genoma haploide. (A)/(B) x N es igual a 1,57 (aproximadamente 1,5) que se entiende que puede indicar que existen aproximadamente 1,5 copias de A por genoma haploide (es decir, trisomfa de A). Vease la figura 8 y el ejemplo a continuaci6n.

Puede utilizarse una diversidad de plataformas de detecci6n o, en algunos casos, metodos y dispositivos de microfluidos en la practica de la invenci6n. En algunas realizaciones, pueden construirse dispositivos utilizando una amplia diversidad de materiales, tales como vidrio, plastico, silicona, polfmeros elastomericos (por ejemplo, polidimetilsiloxano, poliuretano u otros polfmeros). En algunos casos, los dispositivos de microfluidos utilizados para realizar aspectos de la presente invenci6n pueden construirse generalmente al menos en parte con materiales elastomericos, y construirse mediante tecnicas de litograffa blanda de multiples capas (MSL) y de una sola capa y/o metodos de encapsulaci6n de capa sacrificial (vease, por ejemplo, Unger et al., 2000, Science, 288:113-116, y la publicaci6n PCT WO 01/01025). Utilizando estos metodos, en algunos casos pueden disefarse dispositivos de microfluidos en los que el flujo de la disoluci6n a traves de los canales de flujo del dispositivo se controla, al menos en parte, con uno o mas canales de control que estan separados del canal de flujo mediante un segmento o membrana elastomerica. Este segmento o membrana puede desviarse hacia el interior o retraerse del canal de flujo con el que esta asociado un canal de control, aplicando una fuerza de activaci6n a los canales de control. Mediante el control del grado en que la membrana se desvfa o se retrae del canal de flujo, el flujo de la disoluci6n puede frenarse o bloquearse por completo a traves del canal de flujo. Utilizando combinaciones de canales de control y de flujo de este tipo puede prepararse una diversidad de diferentes tipos de valvulas y bombas para regular el flujo de la disoluci6n segun se describe en detalle en Unger et al., supra, publicaci6n PCT WO 02/43615 y WO 01/01025.

La distribuci6n de la muestra en los dispositivos de microfluidos descritos en la presente puede aplicarse en parte debido a ciertas propiedades de los materiales elastomericos, que son reconocidas en general en la tecnica. Por ejemplo, Allcock et al. (Contemporary Polymer Chemistry, 2a ed.) describen "elast6meros" o "materiales elastomericos" en general como polfmeros que existen a una temperatura entre su temperatura detransici6n vftrea y la temperatura de licuefacci6n. Los materiales elastomericos muestran propiedades elasticas porque las cadenas polimericas sufren con facilidad un movimiento torsional para permitir el desenrrollamiento del esqueleto de las cadenas en respuesta a una fuerza, volviendose a enrrollar el esqueleto de las cadenas para adoptar la forma anterior en ausencia de la fuerza. En general, los elast6meros se deforman cuando se aplica una fuerza, pero vuelven a su forma original cuando la fuerza se retira. La elasticidad mostrada por los materiales elastomericos puede caracterizarse mediante el m6dulo de Young. Los materiales elastomericos utilizados en los dispositivos de microfluidos descritos en la presente generalmente tienen un m6dulo de Young de entre aproximadamente 1 Pa-1 TPa, en otros casos entre aproximadamente 10 Pa-100 GPa, en otros casos entre aproximadamente 20 Pa-1 GPa, en otros casos entre aproximadamente 50 Pa-10 MPa, y en ciertos casos entre aproximadamente 100 Pa-1 MPa. Tambien pueden utilizarse materiales elastomericos que tenganun m6dulo de Young fuera de estos intervalos

dependiendo de las necesidades de una aplicaci6n concreta.

Dada la tremenda diversidad de qufmicas de polfmeros, precursores, metodos sinteticos, condiciones de reacci6n, y aditivos potenciales, puede seleccionarse una amplia gama de propiedades para ciertos usos y aplicaciones. Por tanto, con respecto a la presente invenci6n, existe un gran numero de posibles sistemas de elast6meros que pueden utilizarse para fabricar bombas y microvalvulas elastomericas monolfticas. Algunos de los dispositivos de microfluidos descritos en la presente se fabrican con un polimero elastomerico tal como GE RTV 615 (formulaci6n), un elast6mero de silicona (familia) de tipo vinil-silano reticulado. Sin embargo, los presentes sistemas de microfluidos no se limitan a esta formulaci6n, tipo o incluso a esta familia de polfmeros; por el contrario, casi cualquier polfmero elastomerico resulta adecuado. La elecci6n de materiales depende generalmente de las propiedades del material concreto (por ejemplo, resistencia a disolventes, rigidez, permeabilidad a gases y/o estabilidad frente a la temperatura) requeridas para realizar la aplicaci6n. Otros detalles con respecto al tipo de materiales elastomericos que pueden utilizarse para la fabricaci6n de los componentes de los dispositivos de microfluidos descritos en la presente se indican en Unger et al., 2000, Science, 288:113-116, y las publicaciones PCT WO 02/43615 y WO 01/01025.

Fabricaci6n de dispositivos y termociclado

Tal como se ha indicado, las tecnicas de la presente invenci6n pueden incorporar el uso de una amplia diversidad de plataformas de detecci6n, incluyendo dispositivos de microfluidos de alta capacidad de procesamiento adecuados para el analisis digital o PCR digital. Los aspectos de la fabricaci6n de dispositivos, componentes del sistema, y aspectos del termociclado se describen con mas detalle a continuaci6n.

En algunos casos, pueden construirse dispositivos de microfluidos adecuados para su uso en la presente invenci6n utilizando tecnicas de litograffa blanda de multiples capas (MSL) y de una sola capa y/o metodos de encapsulaci6n de capa sacrificial. Una estrategia de MSL basica implica moldear una serie de capas elastomericas sobreun molde micromecanizado, retirar las capas del molde y despues fusionar las capas entre sf. En la estrategia de encapsulaci6n de capa sacrificial, se depositan patrones de compuestos fotorresistentes donde se desea una canal. Estas tecnicas y su uso para la producci6n de dispositivos de microfluidos se analizan en detalle, por ejemplo, en Unger et al. (2000), Science, 288:113-116, y en Chou et al. (2000), "Integrated Elastomer Fluidic Lab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagnostics", en Proceedings of the Solid State Actuator and Sensor Workshop, Hilton Head, S.C., y en la publicaci6n PCT WO 01/01025.

Brevemente, los anteriores ejemplos de metodos de fabricaci6n implican inicialmente la fabricaci6n de moldes madre para las capas superiores (por ejemplo, la capa elastomerica con los canales de control) y para las capas inferiores (por ejemplo, la capa elastomerica con los canales de flujo) sobre obleas de silicona mediante fotolitograffa con compuestos fotorresistentes (Shipley SJR 5740). La altura de los canales puede controlarse con precisi6n mediante la velocidad de revestimiento por rotaci6n. Los canales de compuestos fotorresistentes se forman exponiendo el compuesto fotorresistente a luz UV, seguido de un revelado. El proceso de reflujo de calor y el tratamiento de protecci6n generalmente pueden lograrse como se describe en M.A. Unger, H.-P. Chou, T. Throsen, A. Scherer, y

S.R. Quake, Science (2000), 288:113. Un elast6mero de silicona de dos partes mixto (GE RTV 615) entonces se hace rotar en el molde inferior y se vierte sobre el molde superior, respectivamente. El revestimiento por rotaci6n puede utilizarse para controlar el espesor de la capa de fluido polimerico inferior. La capa superior parcialmente curada se despega del molde despues de cocer en la estufa a 80 OC durante 25 minutos, se alinea y se ensambla con la capa inferior. Se emplea un cocido final de 1,5 horas a 80 OC para unir estas dos capas de modo irreversible. Tras despegarse del molde madre inferior de silicona, este dispositivo RTV generalmente se trata con HCl (0,1 M, 30 min a 80 OC). Este tratamiento actua para romper algunos de los enlaces Si-O-Si, exponiendo con ello a los grupos hidroxi que hacen que los canales sean mas hidr6filos.

El dispositivo despues opcionalmente puede ser hermeticamente sellado a un soporte. El soporte puede estar fabricado con casi cualquier material, aunque la superficie debe ser plana para asegurar un buen sellado, puesto que el sellado se forma principalmente debido a fuerzas adhesivas. Los ejemplos de soportes adecuados incluyen vidrio, plastico y similares.

Los dispositivos formados segun el anterior metodo resultan en que el sustrato (por ejemplo, lamina de vidrio) forma una pared del canal de flujo. Como alternativa, el dispositivo, tras retirarlo del molde madre, se sella a una membrana elastomerica delgada de modo que el canal de flujo esta totalmente encerrado en material elastomerico. El dispositivo elastomerico resultante despues puede unirse opcionalmente a un soporte de sustrato.

Formaci6n de capas

En algunos casos, los dispositivos de microfluidos, incluyendo aquellos en que los reactivos se depositan en los sitios de reacci6n durante la fabricaci6n, pueden estar formados por tres capas. La capa inferior es la capa sobre la cual se depositan los reactivos. La capa inferior puede estar formada por diversos materiales elastomericos, segun se describe en las referencias bibliograficas citas anteriormente en los metodos de MLS. Generalmente, el material es un elast6mero de polidimetilsiloxano (PDMS). Basandose en la disposici6n y el emplazamiento de los sitios de reacci6n que se desean para el dispositivo concreto, se pueden determinar las localizaciones sobre la capa inferior

sobre las que deben rociarse los reactivos apropiados. Debido a que el PDMS es hidr6fobo, las gotas acuosas depositadas se encogen para formar una gota muy pequefa. Los reactivos opcionalmente depositados se depositan de modo que no se forme un enlace covalente entre el reactivo y la superficie del elast6mero porque, tal como se describi6 anteriormente, se pretende que los reactivos se disuelvan en la disoluci6n de muestra cuando se introduce en el sitio de reacci6n.

Las otras dos capas del dispositivo son la capa en la que se forman los canales de flujo, y la capa en la que se forman los canales de control y, opcionalmente, de guardia. Estas dos capas se preparan segun los metodos generales indicados anteriormente en esta secci6n. La estructura de dos capas resultante entonces se coloca sobre la parte superior de la primera capa sobre la cual se han depositado los reactivos. Un ejemplo especffico de la composoici6n de las tres capas es el siguiente (proporci6n del componente A al componente B): primera capa (capa de muestras) 30:1 (en peso); segunda capa (capa de los canales de flujo) 30:1; y tercera capa (capa de control) 4:1. Sin embargo, se anticipa que tambien podran utilizarse otras composiciones y proporciones de los componentes elastomericos. Durante este proceso, los sitios de reacci6n se alinean con los reactivos depositados de modo que los reactivos se colocan dentro del sitio de reacci6n apropiado.

Segun la presente invenci6n, tal como se especifica en las reivindicaciones, puede realizarse un termociclado en los dispositivos de microfluidos. En particular, el termiciclado puede utilizarse para ejecutar reacciones de amplificaci6n que faciliten el analisis de la muestra distribuida dentro de las camaras de reacci6n.

Una serie de diferentes opciones de diversa sofisticaci6n esta disponible para controlar la temperatura dentro de regiones seleccionadas del dispositivo de microfluidos o del dispositivo completo. Asf, tal como se emplea en la presente, la expresi6n controlador de la temperatura pretende referirse, en sentido amplio, a un dispositivo o elemento que puede regular la temperatura del dispositivo de microfluidos completo o de una porci6n del dispositivo de microfluidos (por ejemplo, de una regi6n de temperatura concreta, o en una o mas uniones en una matriz de un dispositivo de microfluidos del tipo de canales ciegos).

En general, los dispositivos se colocan en una placa de termociclado para someter el dispositivo a un termociclado. Una diversidad de dichas placas puede obtenerse con facilidad a partir de fuentes comerciales incluyendo, por ejemplo, ThermoHybaid Px2 (Fraklin, MA), MJ Research PTC-200 (South San Francisco, CA), Eppendorf parte nO E5331 (Westbury, NY), Techne parte nO 205330 (Princeton, NJ).

Para asegurar la eficacia de las etapas de termociclado, en ciertos dispositivos resulta util incorporar detectores para detectar la temperatura en diversas regiones del dispositivo. Una estructura para detectar la temperatura es un termopar. Este termopar puede crearse como una pelfcula fina de cables que forman patrones sobre el material de sustrato subyacente, o como cables incorporados directamente sobre el propio material elast6mero microfabricado.

Pueden incluirse diversos medios de detecci6n/control de la temperatura en el sistema/dispositivo descrito en la presente. Por ejemplo, la temperatura tambien puede detectarse mediante un cambio en la resistencia electrica. Los materiales termocromaticos son otro tipo de estructuras disponibles para detectar la temperatura en regiones de un dispositivo de amplificaci6n. Otra estrategia para detectar la temperatura es mediante el uso de una camara de infrarrojos. Otra estrategia para la detecci6n de la temperatura es mediante el uso de detectores piroelectricos. Otros fen6menos electricos, tales como la capacitancia y la inductancia, pueden aprovecharse para detectar la temperatura. Utilizando ecuaciones conocidas para la difusividad termica y los valores apropiados para los elast6meros y el vidrio utilizados en el dispositivo, se puede calcular el tiempo requerido para que la temperatura dentro del sitio de reacci6n alcance la temperatura que el controlador desea mantener.

Ademas de las diversas propiedades y composiciones de materiales potencialmente adecuadas, los dispositivos de microfluidos adecuados para su uso en la presente invenci6n pueden incluir una diversidad de caracterfsticas, disefos, arquitecturas de los canales y similares. Los dispositivos incluiran generalmente una pluralidad de "canales de flujo", que se refieren en general a una ruta de flujo a traves del cual puede fluir una disoluci6n. Ademas, los dispositivos pueden incluir "canales de control", o canales disefados para formar una interfase con los canales de flujo de forma que pueden utilizarse para impulsar el flujo dentro de los canales de flujo. Los dispositivos tambien pueden incluir caracterfsticas para regular aun mas el flujo de fluidos, tales como una "valvula", que puede incluir una configuraci6n en la que un canal de flujo y un canal de control se cruzan y estan separados por una membrana elastomerica que puede desviarse hacia el interior o retraerse del canal de flujo en respuesta a una fuerza de activaci6n. Ademas, ciertos dispositivos puede incluir una "vfa", que se refiere a un canal formado en el dispositivo elastomerico para proporcionar un acceso fluido entre un puerto externo del dispositivo y uno o mas canales de flujo. Por tanto, una vfa puede actuar como entrada o salida de muestras, por ejemplo.

Pueden aplicarse numerosos tipos de arquitecturas o disefos de canales. Tal como se ilustra en la figura 2A, un tipo de disefo de canales que puede incluirse en un dispositivo incluye un disefo de canales abiertos. Los "canales abiertos" o "canales de extremo abierto" se refieren a un canal de flujo dispuesto entre vfas separadas, de modo que el canal de flujo tiene una entrada separada de una salida. En general, un disefo de red de caneles abiertos incluye al menos dos entradas o vfas de canales de flujo opuestas, que pueden estar conectadas a aproximadamente uno o a una pluralidad de canales de flujo ramificados para formar una red de canales abiertos. Una o mas valvulas formadas por un canal de control adyacente/superpuesto pueden accionarse para aislar regiones discretas de los

canales ramificados para formar sitios de reacci6n. Estas valvulas proporcionan un mecanismo para aislar, de forma controlable, una pluralidad de sitios de reacci6n. Tal como se describe en la presente, los dispositivos pueden incluir uno o mas canales de flujo abiertos a partir de los cuales se ramifican uno o mas canales. Una o mas regiones de reacci6n o sitios de reacci6n pueden disponerse en cualquier lugar a lo largo de la longitud de un canal de flujo. Una valvula formada por un canal de flujo superpuesto puede accionarse para aislar el sitio o sitios de reacci6n dispuestos a lo largo del canal, proporcionando con ello un mecanismo para aislar, de forma controlable, los sitios de reacci6n. Por tanto, cada dispositivo puede incluir un gran numero de sitios de reacci6n (por ejemplo, 10.000+) y puede lograr altas densidades de sitios de reacci6n, permitiendo con ello una reducci6n significativa en el tamafo de estos dispositivos comparado con los dispositivos de microfluidos tradicionales. Los disefos de canales abiertos pueden tener, por ejemplo, canales de flujo ramificados a los que puede accederse desde mas un emplazamiento/vfa. Este aspecto del disefo puede ser particularmente ventajoso, por ejemplo, si un canal/canal de flujo ramificado concreto se obstruye o se bloquea (por ejemplo, debido a variaciones en la fabricaci6n, defectos, etc.), puesto que el fluido puede entrar desde diferentes direcciones y llenar un canal hasta los lados opuestos de un bloqueo u obstrucci6n concreto. En contraste, un canal al que s6lo se pueda acceder desde un unico extremo que tenga un bloqueo s6lo puede llenarse hasta el punto del bloqueo u obstrucci6n, y si existen sitios de reacci6n mas alla del bloqueo, estos sitios pueden resultar inutilizados.

Tal como se muestra en la figura 2B, los dispositivos de microfluidos adecuados para su uso segun la presente invenci6n pueden utilizar un disefo de "canal ciego" o "relleno ciego". Estos dispositivos se caracterizan en parte por que tienen uno o mas canales ciegos, o canales de flujo que tienen un extremo sin salida o un extremo aislado, de modo que la disoluci6n s6lo puede entrar y salir del canal ciego por un extremo (es decir, no existe una entrada y una salida distintas para el canal ciego). Estos dispositivos requieren s6lo una unica valvula para cada canal ciego para aislar una regi6n del canal ciego para formar un sitio de reacci6n aislado. Durante la fabricaci6n de este tipo de dispositivo, uno o mas reactivos para realizar un analisis pueden depositarse opcionalmente en el sitio de reacci6n, lo cual da como resultado una reducci6n significativa en el numero de entradas y de salidas. Por tanto, puede configurarse una red de canales de flujo en comunicaci6n con los canales ciegos de modo que muchos sitios de reacci6n puedan llenarse con una unica entrada o un numero limitado de entradas (por ejemplo, menos de 5 o menos de 10). La capacidad para llenar un canal de flujo ciego es posible porque los dispositivos estan fabricados con un material elastomerico suficientemente poroso, de modo que el aire dentro de los canales de flujo y de los canales ciegos puede salir a traves de estos poros a medida que la disoluci6n se introduce en los canales. La falta de porosidad de los materiales utilizados en otros dispositivos de microfluidos impide el uso del disefo de canales ciegos, porque el aire en un canal ciego no puede escapar a medida que se inyecta la disoluci6n.

En otro caso, los dispositivos de microfluidos pueden incluir opcionalmente canales de guardia, ademas de los canales de flujo y de valvulas o canales de control. Para reducir la evaporaci6n de la muestra y de los reactivos desde los dispositivos de microfluidos elastomericos que se proporcionan en la presente, puede formarse una pluralidad de canales de guardia en los dispositivos. Los canales de guardia son similares a los canales de control porque generalmente se forman en una capa de elast6mero superpuesta a los canales de flujo y/o al sitio de reacci6n. Asf, al igual que los canales de control, los canales de guardia estan separados de los canales de flujo y/o sitios de reacci6n subyacentes por una membrana o segmento de un material elastomerico. Sin embargo, a diferencia de los canales de control, los canales de guardia tienen un area de corte transversal considerablemente menor. En general, una membrana con un area mas pequefa se desviara menos que una membrana con un area mayor bajo la misma presi6n aplicada. Los canales de guardia se disefan para ser presurizados para permitir que la disoluci6n (generalmente agua) pueda fluir hacia el canal de guardia. El vapor de agua que se origina del canal de guardia puede difundirse hacia los poros del elast6mero adyacente a un canal de flujo o sitio de reacci6n, aumentando con ello la concentraci6n de vapor de agua adyacente al canal de flujo o sitio de reacci6n, y reduciendo la evaporaci6n de la disoluci6n desde estos. Para un analisis mas a fondo de los canales de guardia dispuestos en dispositivos de microfluidos y que son adecuados para su uso segun la presente invenci6n, vease McBride et al., publicaci6n de solicitud de patente de EEUU nO 20050252773.

Los dispositivos tambien incluyen una pluralidad de sitios de reacci6n, o volumenes de reacci6n, con los que pueden reaccionar los reactivos, y un dispositivo puede incorporar diversos medios (por ejemplo, bombas y valvulas) para aislar selectivamente sitios de reacci6n. Los sitios de reacci6n pueden localizarse en cualquiera de una serie de diferentes emplazamientos dentro del dispositivo.

Debido a que los dispositivos pueden incluir materiales elastomericos que sean relativamente transparentes 6pticamente, las reacciones pueden controlarse con facilidad utilizando una diversidad de diferentes sistemas de detecci6n en casi cualquier emplazamiento en el dispositivo de microfluidos. Cuando se emplean dispositivos de tipo MSL, la detecci6n mas habitual se produce en el propio sitio de reacci6n. El hecho de que estos dispositivos se fabrican con materiales sustancialmente transparentes tambien significa que pueden emplearse ciertos sistemas de detecci6n con los dispositivos actuales que no podrfan utilizarse con los dispositivos de microfluidos con base de silicona tradicionales. La detecci6n puede lograrse utilizando detectores que estan incorporados al dispositivo, o que estan separados del dispositivo pero alineados con la regi6n del dispositivo que se va a detectar.

En ciertas realizaciones de la presente invenci6n, las reacciones dentro de los volumenes de reacci6n se realizan utilizando mezclas o reactivos que primero se mezclan (por ejemplo, se mezclan con la muestra) en una disoluci6n separada del chip y de otros componentes del sistema, y despues se introducen en la disoluci6n.

Generalmente los dispositivos se disefaran y configuraran para realizar reacciones de temperatura controlada, tales como reacciones de amplificaci6n con termociclado. Por tanto, un dispositivo puede configurarse/disefarse para su uso en reacciones con control de la temperatura (por ejemplo, reacciones de termociclado) dentro de volumenes de reacci6n. Un dispositivo o una porci6n de este, por ejemplo, el dispositivo elastomerico, puede fijarse a un soporte (por ejemplo, una lamina de vidrio). La estructura resultante entonces puede colocarse sobre una placa de control de la temperatura, por ejemplo, para controlar la temperatura en los diversos sitios de reacci6n. En el caso de las reacciones de termociclado, el dispositivo puede colocarse sobre cualquiera de una serie de placas de termociclado.

Tal como se ilustr6 anteriormente, el uso opcional de dispositivos de microfluidos para aplicar los metodos de la presente invenci6n puede llevarse a cabo empleando una amplia diversidad de disefos y caracterfsticas del dispositivo. La siguiente descripci6n describe con mas detalle ejemplos de configuraciones que pueden utilizarse para realizar una diversidad de analisis, incluyendo analisis que requieren el control de la temperatura (por ejemplo, reacciones de amplificaci6n de acidos nucleicos). Sin embargo, debe entenderse que estas configuraciones son ejemplos y que para los expertos en la tecnica seran evidentes modificaciones de estos sistemas.

La figura 3 es un diagrama simplificado de un dispositivo de microfluidos. Tal como se ilustra en la figura 3, el dispositivo de microfluidos, tambien denominado matriz digital, puede incluir un soporte 20, que puede estar fabricado con materiales que proporcionen un soporte mecanico adecuado para los diversos elementos del dispositivo de microfluidos. Como ejemplo, el dispositivo se fabrica utilizando un polfmero elastomerico. La porci6n externa del dispositivo tiene la misma huella que una microplaca de 384 pocillos convencional, y permite un funcionamiento de valvulas aut6nomo. Tal como se describe a continuaci6n, existen 12 puertos de entrada que se corresponden con 12 entradas de muestra separadas al dispositivo. El dispositivo puede tener 12 paneles 22 y cada uno de los 12 paneles puede contener 765 camaras de reacci6n de 6 nl con un volumen total de 4,95 μl por panel. Los canales de microfluidos 24 pueden conectar las diversas camaras de reacci6n sobre los paneles con las fuentes de fluidos segun se describe mas a fondo a continuaci6n.

Puede aplicarse presi6n a un acumulador 26 para abrir y cerrar las valvulas que conectan las camaras de reacci6n con las fuentes de fluidos. Tal como se ilustra en la figura 3, pueden proporcionarse 12 entradas 28 para cargar la mezcla de reactivos y muestras. Se emplean 48 entradas 28 en algunas aplicaciones para proporcionar una fuente de reactivos, que se suministran al biochip cuando se aplica presi6n al acumulador 26. En aplicaciones en que no se utilizan reactivos, las entradas 28 y el acumulador lateral de reactivos 26 pueden no utilizarse. Ademas, se proporcionan dos entradas 30 en el dispositivo ilustrado en la figura 3 para proporcionar hidrataci6n al biochip. Las entradas de hidrataci6n 30 estan en comunicaci6n fluida con el dispositivo para facilitar el control de la humedad asociada con las camaras de reacci6n. Tal como entenderan los expertos en la tecnica, algunos materiales elastomericos utilizados en la fabricaci6n del dispositivo son permeables a gases, lo cual permite que los gases evaporados o los vapores procedentes de las camaras de reacci6n pasen a traves del material elastomerico hacia la atm6sfera circundante. Los conductos de fluidos localizados en porciones perifericas del dispositivo pueden proporcionar un escudo de lfquido de hidrataci6n, por ejemplo, un tamp6n o mezcla maestra, en porciones perifericas del biochip que rodean los paneles de las camaras de reacci6n, reduciendo o evitando con ello la evaporaci6n de los lfquidos presentes en las camaras de reacci6n. Por tanto, la humedad en las porciones perifericas del dispositivo puede aumentarse afadiendo un lfquido volatil, por ejemplo agua, a las entradas de hidrataci6n 30. En un caso especffico, una primera entrada esta en comunicaci6n fluida con los conductos de fluido de hidrataci6n que rodean los paneles sobre un primer lateral del biochip, y la segunda entrada esta en comunicaci6n fluida con los conductos de fluido de hidrataci6n que rodean los paneles sobre el otro lateral del biochip.

Aunque los dispositivos y la distribuci6n de la muestra descritos anteriormente son un ejemplo de sistema para realizar los metodos de la presente invenci6n, los expertos en la tecnica reconoceran muchas variaciones, modificaciones y alternativas para disefar los dispositivos para microfluidos descritos en la presente. Por ejemplo, aunque el dispositivo de microfluidos ilustrado en la figura 2 incluye 12 paneles, cada uno con 765 camaras de reacci6n con un volumen de 6 nl por camara de reacci6n, esto no es necesario para la presente invenci6n. La geometrfa concreta de la matriz digital dependera de las aplicaciones concretas. Asf, el dispositivo, por ejemplo, no se limita a las matrices digitales con 12 paneles que tienen 765 camaras de reacci6n, sino que se incluyen otras combinaciones. Otra descripci6n relacionada con matrices digitales adecuada para su uso en realizaciones de la presente invenci6n se proporciona en la publicaci6n de solicitud de patente de EEUU nO 2005/0252773.

El ensayo de grandes cantidades de muestras replicadas puede requerir cantidades significativas de reactivos. En una realizaci6n de la presente invenci6n, se realiza una PCR digital en microvolumenes. Las camaras de reacci6n para realizar una PCR de volumen pequefo pueden ser de aproximadamente 2 nl a aproximadamente 500 nl. Cuanto mas pequefo sea el volumen de la camara de reacci6n, mayor sera el numero de ensayos individuales que se puedan hacer (utilizando diferentes conjuntos de sondas y cebadores, o como replicados de los mismos conjuntos de sondas y cebadores, o cualquier combinaci6n de una serie de replicados y de una serie de ensayos diferentes). En una realizaci6n, la camara de reacci6n es de aproximadamente 2 nl a aproximadamente 50 nl, preferiblemente de 2 nl a aproximadamente 25 ml, mas preferiblemente de aproximadamente 4 nl a aproximadamente 15 nl. En algunas realizaciones, el volumen de la camara de reacci6n es de aproximadamente 4 nl, aproximadamente 5 nl, aproximadamente 6 nl, aproximadamente 7 nl, aproximadamente 8 nl, aproximadamente 9 nl, aproximadamente 10 nl, aproximadamente 11 nl, o aproximadamente 12 nl. Las camaras de las muestras

pueden fabricarse de vidrio, plastico, silicona, polfmeros elastomericos tales como polidimetilsiloxano, poliuretano u otros polfmeros. Las muestras procesadas mediante el metodo de la invenci6n son adecuadas para su uso en un analisis del numero de copias variable empleando el sistema BioMark™ (Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA). El sistema BioMark™ utiliza un dispositivo de microfluidos de polidimetilsiloxano que proporciona la ejecuci6n de multiples ensayos sobre multiples muestras.

Los dispositivos de microfluidos Fluidigm (matrices digitales) estan fabricados por Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA). Los chips se fabrican siguiendo la metodologfa de litograffa blanda de multiples capas (MSL) (Unger, M.A., Chou, H.P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S.R., Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography, Science, 2000, 288:113-116). El chip tiene canales de muestras que tienen una profundidad semielfptica media de 10 μm, una anchura de 70 μm, con un espaciamiento paralelo de 200 μm sobre el centro. Los microfluidos de muestras estan fabricados mediante un proceso de molde de dos capas para crear camaras de divisi6n de 265 μm (profundidad) x 150 μm x 150 μm dispuestas a lo largo de cada canal de muestras. En una capa de silicona separada, los canales de control del chip tienen un recorrido perpendicular a los canales de muestras. Las intersecciones de los canales forman valvulas deflectoras para dirigir a los fluidos. Tras la presurizaci6n de los canales de control, una membrana fina entre las capas cierra los canales de muestras para aislar camaras de divisi6n individuales. Los canales de control tienen una profundidad de 15 μm, una anchura de 50 μm con un espaciamiento paralelo de 300 μm sobre el centro.

Las mezclas de reacci6n, tales como mezclas de PCR, mezclas de muestras, mezclas de muestras de productos de la preamplificaci6n, se cargan en cada panel y se reparten aleatoriamente moleculas individuales de ADN en las diversas camaras de reacci6n. Despues de cargar los paneles y las camaras de reaci6n, la matriz digital puede termociclarse y despues formarse imagenes en un lector apropiado, por ejemplo un instrumento BioMark™ que ofrece el presente cesionario. Los datos producidos se analizan utilizando un programa informatico para el analisis de PCR digital que ofrece el presente cesionario u otro programa informatico de analisis adecuado.

Las figuras 4A-4C son diagramas simplificados de una porci6n de dispositivo/biochip ilustrado en la figura 3. La figura 4A ilustra los 12 paneles 22, y cada uno de los paneles incluye un numero de camaras de reacci6n. La figura 4B ilustra la geometrfa de una serie de camaras de reacci6n 40 contenidas en un panel. Las camaras de reacci6n 40 estan espaciadas sobre centros de 200 μm, segun se ilustra. La figura 4C ilustra una imagen de fluorescencia de una porci6n de un panel. El lado izquierdo de la ilustraci6n es una secci6n de control, ilustrandose todas las camaras de reacci6n en oscuro. El lado derecho de la ilustraci6n muestra c6mo en un experimento tfpico, muchas de las camaras de reacci6n estan oscuras 42, y no generan una emisi6n fluorescente significativa. Sin embargo, una porci6n de las camaras de reacci6n presentan emisi6n fluorescente, lo cual indica una camara de reacci6n "positiva"

44. Tal como se describi6 anteriormente en la figura 2B, los canales de muestras tienen un recorrido de izquierda a derecha conectando camaras de reacci6n individuales, y los canales de control tienen un recorrido de arriba abajo en la capa superior. Tras la presurizaci6n de los canales de control, una membrana fina entre las capas cierra los canales de muestras para aislar las camaras de reacci6n individuales. Las valvulas dividen las camaras individuales que se mantienen cerradas durante el experimento de PCR.

Tal como se describe mas a fondo a lo largo de la presente solicitud, el chip se termocicl6 y se formaron imagenes en un sistema de PCR a tiempo real BioMark™ que ofrece el presente cesionario, y se utiliz6 un programa informatico de analisis de PCR digital, tal como el analisis de PCR digital BioMark™ que ofrece el presente cesionario, para contar el numero de camaras positivas en cada panel. Cuando se emplean dos ensayos con dos tintes fluorescentes en una reacci6n de PCR digital en forma multiplex pueden cuantificarse independientemente dos genes. Esta capacidad para cuantificar independientemente genes se emplea segun se describe en la presente para estudiar las variaciones en el numero de copias utilizando la matriz digital. El numero de genes que pueden cuantificarse independientemente en una unica reacci6n de PCR depende del numero de tintes fluorescentes y filtros disponibles.

Segun se describi6 en las etapas de metodos generales anteriormente, tras la distribuci6n de la muestra, otras etapas incluyen una etapa de amplificaci6n seguida de la deteccion y el analisis de los resultados. En algunas realizaciones de la presente invenci6n, la amplificaci6n y la detecci6n/analisis pueden realizarse utilizando metodos que coordinan las dos etapas entre sf, por ejemplo una PCR cuantitativa. En general, los polinucle6tidos que se aislan dentro de cada sitio de reacci6n pueden amplificarse, detectarse y analizarse utilizando una gama de estrategias posibles. Un ejemplo de estrategia implica amplificar los polinucle6tidos diana y de referencia de modo que el producto amplificado pueda utilizarse para determinar una concentraci6n del polinucle6tido diana y una concentraci6n del polinucle6tido de referencia. Para realizar la amplificaci6n, los reactivos necesarios para la amplificaci6n se combinan con la muestra, y pueden incluir una primera sonda que se hibrida selectivamente con un polinucle6tido diana y una segunda sonda que se hibrida selectivamente con un polinucle6tido de referencia bajo condiciones que son adecuadas para la amplificaci6n de polinucle6tidos. La primera y la segunda sonda pueden incluir diferentes marcadores detectables, para diferenciar entre los productos de la amplificaci6n de los polinucle6tidos diana y de referencia. Ademas, la diferenciaci6n de los polinucle6tidos diana y de referencia puede posibilitar el calculo posterior de la concentraci6n de moleculas nucleotfdicas diana como una proporci6n de las moleculas nucleotfdicas de referencia para determinar el numero de copias relativo de la secuencia polinucleotfdica diana en el genoma del sujeto.

Las etapas generales de una amplificaci6n seguida de una detecci6n y un analisis pueden realizarse mediante una serie de formas.

Para aumentar la comprensi6n de los metodos y de los sistemas descritos a lo largo de la memoria descriptiva, a continuaci6n se describen en general los terminos y las expresiones de la tecnica. El termino "reactivo" se refiere, en sentido amplio, a cualquier agente utilizado en una reacci6n. Un reactivo puede incluir un unico agente que en sf mismo pueda controlarse (por ejemplo, una sustancia que pueda controlarse a medida que se calienta) o una mezcla de dos o mas agentes. Un reactivo puede estar vivo (por ejemplo, una celula) o no vivo. Los ejemplos de reactivos para la reacci6n de amplificaci6n de acidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a tamp6n, iones metalicos, polimerasa, cebadores, acidos nucleicos de molde, nucle6tidos, marcadores, tintes, nucleasas y similares. Los reactivos para las reacciones enzimaticas incluyen, por ejemplo, sustratos, cofactores, enzimas acoplantes, tamp6n, iones metalicos, inhibidores y activadores. Los reactivos para reacciones basadas en celulas incluyen, pero no se limitan a celulas, tintes especfficos de celulas, y ligandos (por ejemplo, agonistas y antagonistas) que se unen a receptores celulares. Los reactivos pueden incluirse en la disoluci6n de muestra, u opcionalmente pueden inmovilizarse de una diversidad de formas (por ejemplo, de modo covalente, no covalente, a traves de moleculas conectoras adecuadas). En las reacciones de amplificaci6n de acidos nucleicos en chip, por ejemplo, uno o mas reactivos utilizados para realizar las reacciones de extensi6n pueden depositarse (por ejemplo, mediante rociado) en cada uno de los sitios de reacci6n durante la fabricaci6n del dispositivo.

El termino "marcador" se refiere a una molecula o un aspecto de una molecula que puede detectarse mediante tecnicas ffsicas, qufmicas, electromagneticas y otras tecnicas analfticas relacionadas. Los ejemplos de marcadores detectables que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a radiois6topos, fluor6foros, crom6foros, marcadores de masa, partfculas electrodensas, partfculas magneticas, marcadores de espfn, moleculas que emiten quimioluminiscencia, moleculas electroqufmicamente activas, enzimas, cofactores, enzimas ligados a sondas de acidos nucleicos, y sustratos de enzimas. La expresi6n "marcado de modo detectable" significa que un agente se ha conjugado con un marcador, o que un agente tiene algunas caracterfsticas inherentes (por ejemplo, tamafo, forma o color) que permite que sea detectado sin tener que estar conjugado con un marcador distinto.

La expresi6n "acido nucleico", y los terminos "polinucle6tido" y "oligonucle6tido" se emplean en la presente para incluir una forma polimerica de nucle6tidos de cualquier longitud que incluyen, pero no se limitan a ribonucle6tidos o desoxirribonucle6tidos. No hay una distinci6n intencionada en la longitud entre estos terminos y expresi6n. Ademas, estos terminos y expresi6n se refieren s6lo a la estructura primaria de la molecula. Por tanto, en ciertas realizaciones, estos terminos y expresi6n pueden incluir ADN monocatenario, bicatenario y tricatenario, asf como ARN monocatenario, bicatenario y tricatenario. Tambien incluyen modificaciones, tales como mediante metilaci6n y/o formaci6n de casquetes, y las formas no modificadas del polinucle6tido. Mas en concreto, la expresi6n "acido nucleico", y los terminos "polinucle6tido" y "oligonucle6tido" incluyen polidesoxirribonucle6tidos (que contienen 2desoxi-D-ribosa), polirribonucle6tidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucle6tido que sea un N-o C-glic6sido de una base de purina o de pirimidina, y otros polfmeros que contienen esqueletos no nucleotfdicos, por ejemplo, polfmeros de poliamida (por ejemplo, acido nucleicos peptfdicos (PNA)) y de polimorfolino (disponibles en el mercado en Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg6n, como Neugene), y otros polfmeros de acidos nucleicos de secuencia especffica sinteticos con la condici6n de que los polfmeros contengan nucleobases en una configuraci6n que permita el apareamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como aparecen en el ADN y ARN.

Una "sonda" es un acido nucleico capaz de unirse a un acido nucleico diana con una secuencia complementaria a traves de uno o mas tipos de enlaces qufmicos, habitualmente a traves de apareamiento de bases complementarias, normalmente a traves de la formaci6n de enlaces de hidr6geno, formando con ello una estructura en duplex. La sonda se une o se hibrida con un "sitio de uni6n a la sonda". La sonda puede marcarse con un marcador detectable para permitir una detecci6n facil de la sonda, en particular despues de que la sonda se haya hibridado con su diana complementaria. El marcador unido a la sonda puede incluir cualquiera de una diversidad de marcadores diferentes conocidos en la tecnica que pueden detectarse por medios qufmicos o ffsicos, por ejemplo. Los marcadores adecuados que pueden unirse a sondas incluyen, pero no se limitan a radiois6topos, fluor6foros, crom6foros, marcadores de masa, partfculas electrodensas, partfculas magneticas, marcadores de espfn, moleculas que emiten quimioluminiscencia, moleculas electroqufmicamente activas, enzimas, cofactores, y sustratos de enzimas. Las sondas pueden variar significativamente en tamafo. Algunas sondas son relativamente cortas. En general, las sondas tienen una longitud de al menos 7 a 15 nucle6tidos. Otras sondas tienen una longitud de al menos 20, 30 o 40 nucle6tidos. Otras sondas son un poco mas largas, y tienen una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90 nucle6tidos. Otras sondas son aun mas largas, y tienen una longitud de al menos 100, 150, 200 o mas nucle6tidos. Las sondas tambien pueden tener cualquier longitud que este dentro de los anteriores intervalos.

Un "cebador" es un polinucle6tido monocatenario capaz de actuar como punto de inicio de la sfntesis de ADN dirigida por moldes bajo condiciones apropiadas (es decir, en presencia de cuatro nucleosido trifosfatos diferentes y un agente para la polimerizaci6n, tal como ADN o ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tamp6n apropiado y a una temperatura adecuada. La longitud aproximada de un cebador depende del uso previsto del cebador, pero generalmente tiene una longitud de al menos 7 nucle6tidos, y de forma mas tfpica su longitud varfa de 10 a 30 nucle6tidos. Otros cebadores son un poco mas largos, tal como una longitud de 30 a 50 nucle6tidos. Las moleculas de cebadores cortas en general requieren una temperaturas mas frfas para formar complejos hfbridos suficientemente estables con el molde. No es necesario que un cebador refleje la secuencia exacta del molde, pero

debe ser lo suficientemente complementario para hibridarse con un molde. La expresi6n "sitio del cebador" o "sitio de uni6n al cebador" se refiere al segmento del ADN diana al cual se hibrida un cebador. La expresi6n "par de cebadores" significa un conjunto de cebadores que incluye un "cebador cadena arriba" 5' que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ADN que se va a amplificar, y un "cebador cadena abajo" 3' que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia que se va a amplificar.

Un cebador que es "perfectamente complementario" tiene una secuencia totalmente complementaria a lo largo de la longitud completa del cebador y no tiene desapareamientos. El cebador generalmente es perfectamente complementario a una porci6n (subsecuencia) de una secuencia diana. Un "desapareamiento" se refiere a un sitio en que el nucle6tido en el cebador y el nucle6tido en el acido nucleico diana con el que se alinea no son complementarios. La expresi6n "sustancialmente complementario", cuando se emplea con referencia a un cebador, significa que un cebador no es perfectamente complementario con su secuencia diana; en lugar de ello, el cebador s6lo es suficientemente complementario para hibridarse selectivamente con su respectiva hebra en el sitio de uni6n al cebador deseado.

El termino "complementario" significa que un acido nucleico se identico, o se hibrida selectivamente con otra molecula de acido nucleico. La selectividad de la hibridaci6n existe cuando se produce una hibridaci6n que es mas selectiva que la falta total de especificidad. Generalmente la hibridaci6n selectiva se produce cuando existe al menos aproximadamente 55% de coincidencia a lo largo de un tramo de al menos 14-25 nucle6tidos, preferiblemente al menos 65%, mas preferiblemente al menos 75%, y lo mas preferiblemente al menos 90%. Preferiblemente, un acido nucleico se hibrida especfficamente con el otro acido nucleico. Vease M. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203 (1984).

La detecci6n se produce en una "secci6n de detecci6n" o "regi6n de detecci6n". Estas expresiones y otras relacionadas se refieren a la porci6n del dispositivo de microfluidos en la que se produce la detecci6n. Tal como se indic6 anteriormente, con los dispositivos que emplean ciertos disefos (por ejemplo, disefos de canales abiertos, disefos de canales ciegos, etc.), la secci6n de detecci6n es, en general, el sitio de reacci6n aislado por la valvula asociada con cada sitio de reacci6n. La secci6n de detecci6n para los dispositivos con una base de matriz normalmente esta dentro de regiones de los canales de flujo que estan adyacentes a una intersecci6n, en la propia intersecci6n, o en una regi6n que incluye la intersecci6n y una regi6n circundante.

Tal como se analiz6 anteriormente, un ejemplo de analisis de la variaci6n en el numero de copias puede realizarse utilizando metodos de PCR cuantitativa en chip. En particular, la PCR cuantitativa puede implicar tanto la amplificaci6n de los polinucle6tidos como la detecci6n/analisis de los productos amplificados. Ademas de la PCR cuantitativa tambien puede utilizarse una diversidad de los denominados metodos de "amplificaci6n a tiempo real" o metodos de "PCR cuantitativa a tiempo real" para determinar la cantidad de acido nucleico diana presente en una muestra midiendo la cantidad de producto de la amplificaci6n formado durante o despues del propio proceso de amplificaci6n. Los ensayos con nucleasa fluorogenicos son un ejemplo especffico de un metodo de cuantificaci6n a tiempo real que puede utilizarse con exito con los dispositivos descritos en la presente. Este metodo para controlar la formaci6n del producto de la amplificaci6n implica la medici6n continua de la acumulaci6n de los productos de la PCR utilizando una sonda oligonucleotfdica fluorogenica marcada de forma dual, una estrategia que en la bibliografia se denomina con frecuencia metodo "TaqMan".

La sonda utilizada en estos ensayos generalmente es un polinucle6tido corto (por ejemplo, aproximadamente 20-25 bases) que esta marcado con dos tintes fluorescentes diferentes. El terminal 5' de la sonda generalmente esta unido a un tinte indicador, y el terminal 3' esta unido a un tinte extintor, aunque los tintes tambien pueden estar unidos a otros emplazamientos sobre la sonda. La sonda se disefa para que tenga una complementariedad de secuencia al menos sustancial con el sitio de uni6n a la sonda sobre el acido nucleico diana. Tambien se incluyen enla mezcla de reacci6n cebadores de PCR cadena arriba y abajo que se unen a regiones que flanquean al sitio de uni6n a la sonda.

Cuando la sonda esta intacta, se produce la transferencia de energfa entre los dos fluor6foros y el extintor extingue la emisi6n desde el indicador. Durante la fase de extensi6n de la PCR, la sonda se rompe por la actividad 5' nucleasa de una acido nucleico polimerasa, tal como Taq polimerasa, liberando asf el indicador del polinucle6tidoextintor, y dando como resultado un aumento en la intensidad de emisi6n del indicador que puede ser medida mediante un detector apropiado.

Un detector que esta especfficamente adaptado para medir emisiones de fluorescencia, tales como las creadas durante un ensayo fluorogenico es el ABI 7700 fabricado por Applied Biosystems, Inc., en Foster City, CA. El programa informatico suministrado junto con el instrumento es capaz de registrar la intensidad de fluorescencia del indicador y extintor a lo largo de la amplificaci6n. Estos valores registrados entonces pueden utilizarse para calcular el aumento en la intensidad de emisi6n del indicador normalizada sobre una base continua y, en ultimo termino, cuantificar la cantidad de ARNm que se esta amplificando.

Otros detalles con respecto a la teorfa y el funcionamiento de los metodos fluorogenicos para realizar determinaciones a tiempo real de la concentraci6n de los productos de la amplificaci6n se describen, por ejemplo, en las patentes de EEUU nO 5.210.015 de Gelfand, 5.538.848 de Livak, et al., y 5.863.736 de Haaland, asf como en

Heid, C.A., et al., Genome Research, 6:986-994 (1996); Gibson, U.E.M., et al., Genome Research, 6:995-1001 (1996); Holland, P.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280 (1991); y Livak, K.J., et al., PCR Methods and Applications, 357-362 (1995). Asf, a medida que avanza la reacci6n de amplificaci6n, una cantidad cada vez mayor de tinte se une y esto se ve acompafado de un aumento concomitante en la sefal.

Cuando se realizan los ensayos de amplificaci6n en chips, pueden realizarse amplificaciones en forma multiplex dentro de un unico sitio de reacci6n, por ejemplo, utilizando una pluralidad de cebadores, cada uno especffico para un acido nucleico diana de interes concreto (por ejemplo, una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia), durante el proceso de termociclado. La presencia de diferentes productos amplificados puede detectarse utilizando sondas marcadas de modo diferenciado para realizar una reacci6n de RT-PCR cuantitativa, o utilizando balizas moleculares marcadas de modo diferenciado (vease anteriormente). En estas estrategias, cada sonda marcada de modo diferenciado se disefa para que se hibride s6lo con una diana amplificada concreta. Mediante la elecci6n sensata de los diferentes marcadores que se utilizan pueden realizarse analisis en los que los diferentes marcadores se excitan y/o se detectan a diferentes longitudes de onda en una unica reacci6n. Otras indicaciones con respecto a la selecci6n de marcadores fluorescentes apropiados que son adecuados en estas estrategias se incluyen en Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., eds.), Marcel Dekker, Nueva York (1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, Nueva York (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a ed., Academic Press, Nueva York (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, Nueva York (1976); Indicators (Bishop, ed.), Pergamon Press, Oxford, 19723; y Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992).

Cuando se utilizan dispositivos de microfluidos, tales como dispositivos con disefo de canales abiertos o de canales ciegos, para realizar las reacciones de amplificaci6n de acidos nucleicos, los reactivos que pueden depositarse dentro de los sitios de reacci6n son los reactivos necesarios para realizar el tipo deseado de reacci6n de amplificaci6n. Habitualmente, esto significa que algunos o todos los siguientes se depositan: cebadores, polimerasa, nucle6tidos, iones metalicos, tamp6n, y cofactores, por ejemplo. La muestra introducida en el sitio de reacci6n en estos casos es el molde de acido nucleico. Sin embargo, como alternativa, el molde puede depositarse y los reactivos de amplificaci6n hacerse fluir hacia los sitios de reacci6n. Cuando se utiliza el dispositivo de matriz para realizar una reacci6n de amplificaci6n, las muestras que contienen el molde de acido nucleico pueden hacerse fluir a traves de los canales de flujo verticales, y los reactivos de amplificaci6n a traves de los canales de flujo horizontales, o viceversa.

En general, pueden realizarse multiples analisis de genotipificaci6n y expresi6n, por ejemplo, en cada sitio de reacci6n. La muestra que contiene el ADN diana puede introducirse en los sitios de reacci6n de un dispositivo de microfluidos. Para los metodos de PCR cuantitativa, tales como TaqMan®, los cebadores para amplificar diferentes regiones de un ADN diana de interes se incluyen dentro de un unico sitio de reacci6n. Se emplean sondas para cada regi6n marcadas de modo diferenciado para distinguir el producto que se forma, por ejemplo los polinucle6tidos diana y de referencia. Si el alelo con el que la sonda es complementaria esta presente en el ADN diana entonces se produce la amplificaci6n, dando como resultado con ello una sefal detectable. Basandose en cual es la sefal diferente obtenida, puede determinarse la identidad del nucle6tido en el sitio polim6rfico. Si ambas sefales se detectan, entonces ambos alelos estan presentes. Se realiza un termociclado durante la reacci6n segun se describe en la secci6n de control de la temperatura anterior.

En algunas realizaciones de la presente invenci6n, pueden incluirse como reactivos sondas marcadas de modo diferenciado complementarias con cada una de las formas alelicas, junto con cebadores, nucle6tidos y polimerasa. Sin embargo, las reacciones pueden realizarse s6lo con una unica sonda, aunque esto puede crear una ambiguedad con respecto a si una falta de sefal es debida a la ausencia de un alelo concreto o simplemente a una reacci6n fallida. Para el caso bialelico tfpico, en el que son posibles dos alelos para un sitio polim6rfico, normalmente se incluyen en la mezcla de reacci6n dos sondas marcadas de modo diferenciado, cada una perfectamente complementaria con uno de los alelos, junto con cebadores de la amplificaci6n, nucle6tidos y polimerasa.

Tal como se indica en la figura 4C, la sefal de cada sitio de reacci6n puede detectarse y despues analizarse para determinar informaci6n acerca de la muestra. Por ejemplo, las muestras procesadas mediante los metodos de la invenci6n son muy adecuadas para su uso en un analisis del numero de copias variable utilizando el sistema BioMark™ (Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA) y el sistema de termociclado con formaci6n de imagenes de fluorescencia BioMark™. El sistema BioMark™ utiliza un dispositivo de microfluidos de polidimetilsiloxano que posiblita la ejecuci6n de multiples ensayos sobre multiples muestras.

Tal como se describe mas a fondo a lo largo de la presente descripci6n, el chip, en algunas realizaciones, puede termociclarse y se pueden formar imagenes en el sistema de PCR a tiempo real BioMark™ que ofrece el presente cesionario, y se emplea un programa de analisis de PCR digital, tal como el analisis de PCR digital BioMark™, que ofrece el presente cesionario, para contar el numero de camaras positivas en cada panel. Cuando se emplean dos ensayos con dos tintes fluorescentes en una reacci6n de PCR digital en forma multiplex pueden cuantificarse dos genes de modo independiente. Esta capacidad para cuantificar genes de modo independiente se emplea segun se describe en la presente para estudiar las variaciones en el numero de copias utilizando la matriz digital.

Tal como se describe en general anteriormente, las mezclas de reacci6n, tales como las mezclas de PCR, pueden cargarse en cada panel y pueden repartirse aleatoriamente moleculas individuales de ADN en las diversas camaras de reacci6n. Despues de cargar los paneles y las camaras de reacci6n, la matriz digital se termocicla y despues se forman imagenes en un lector apropiado, por ejemplo, un instrumento BioMark™ que ofrece el presente cesionario. Los datos producidos se analizan utilizando el programa informatico de analisis de PCR digital que ofrece el presente cesionario u otro programa informatico de analisis adecuado.

Tal como se describi6 anteriormente, puede utilizarse una PCR cuantitativa en chip para realizar ciertas realizaciones de la presente invenci6n. No obstante puede utilizarse una serie de estrategias de detecci6n diferentes con los dispositivos de microfluidos descritos anteriormente. La selecci6n del sistema apropiado depende en parte del tipo de dispositivo, acontecimiento y/o agente que se esta detectando. Los detectores pueden disefarse para detectar una serie de diferentes tipos de sefales que incluyen, pero no se limitan a sefales procedentes de radiois6topos, fluor6foros, crom6foros, partfculas electrodensas, partfculas magneticas, marcadores de espfn, moleculas que emiten quimioluminiscencia, moleculas electroqufmicamente activas, enzimas, cofactores, enzimas ligados a sondas de acidos nucleicos, y sustratos de enzimas.

Los ejemplos de metodologfas de detecci6n incluyen, pero no se limitan a dispersi6n de luz, detecci6n de fluorescencia multicanal, absorci6n en la longitud de onda UV y visible, luminiscencia, reflectividad diferencial, y dispersi6n de laser confocal. Otros metodos de detecci6n que pueden utilizarse en ciertas aplicaciones incluyen tecnicas de ensayo de proximidad de centelleo, detecci6n radioqufmica, polarizaci6n de fluorescencia, espectroscopfa de correlaci6n de fluorescencia (FCS), transferencia de energfa con resoluci6n temporal (TRET), transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) y variaciones, tales como transferencia de energfa de resonancia de bioluminiscencia (BRET). Otras opciones de detecci6n incluyen resistencia electrica, resistividad, impedancia, y detecci6n de voltaje.

La secci6n de deteci6n puede estar en comunicaci6n con uno o mas microscopios, diodos, dispositivos estimuladores de luz (por ejemplo, laseres), tubos fotomultiplicadores, procesadores y combinaciones de los anteriores, que cooperan para detectar una sefal asociada con un acontecimiento y/o agente concreto. A menudo, la sefal que se esta detectando es una sefal 6ptica que es detectada en la secci6n de detecci6n por un detector 6ptico. El detector 6ptico puede incluir uno o mas fotodiodos (por ejemplo, fotodiodos de avalancha), una gufa de luz de fibra 6ptica que conduzca, por ejemplo, a un tubo fotomultiplicador, un microscopio y/o una camara de video (por ejemplo, una camara CCD).

Los detectores pueden microfabricarse dentro del dispositivo de microfluidos, o pueden ser un elemento separado. Si el detector existe como un elemento separado y el dispositivo de microfluidos incluye una pluralidad de secciones de detecci6n, la detecci6n puede producirse dentro de una unica secci6n de detecci6n en cualquier momento dado. Como alternativa, pueden utilizarse sistemas de detecci6n. Por ejemplo, ciertos sistemas automaticos barren la fuente de luz relacionada con el dispositivo de microfluidos; otros sistemas barren la luz emitida sobre un detector, o incluyen un detector multicanal. Como ejemplo ilustrativo especffico, el dispositivo de microfluidos puede unirse a una etapa traducible y barrerse bajo el objetivo de un microscopio. Una sefal adquirida de esta manera entonces se envfa a un procesador para la interpretaci6n y el procesamiento de la sefal. Tambien pueden utilizarse matrices de tubos fotomultiplicadores. Ademas pueden emplearse sistemas 6pticos que tienen la capacidad de recoger sefales de todos los sistemas de detecci6n diferentes simultaneamente mientras se determina la sefal de cada secci6n.

Pueden utilizarse detectores externos porque los dispositivos proporcionados estan fabricados por completo o en gran parte con materiales que son 6pticamente transparentes a la longitud de onda que se esta controlando. Esta caracterfstica permite a los dispositivos descritos en la presente utilizar una serie de sistemas de detecci6n 6pticos que no serfa posible utilizar con dispositivos de microfluidos basados en silicio convencionales.

En un caso, un detector emplea una camara CCD y un paso 6ptico que proporciona un amplio campo de visi6n y una alta apertura numerica para maximizar la cantidad de luz recogida desde cada camara de reacci6n. A este respecto, la CCD se utiliza como una matriz de fotodetectores en la que cada pixel o grupo de pfxeles se corresponde con una camara de reacci6n, en lugar de ser utilizada para producir una imagen de la matriz. Por tanto, la 6ptica puede alterarse de modo que se reduce la calidad de la imagen o se desenfoca para aumentar la profundidad de campo del sistema 6ptico para recoger mas luz desde cada camara de reacci6n.

Un detector puede incluir una fuente de luz para estimular un indicador que genera una sefal detectable. El tipo de fuente de luz utilizada dependera, en parte, de la naturaleza del indicador que se esta activando. Las fuentes de luz adecuadas incluyen, pero no se limitan a laseres, diodos de laser, y bombillas de alta intensidad, Si se utiliza un laser, este puede emplearse para barrer un conjunto de secciones de detecci6n o una unica secci6n de detecci6n. Los diodos de laser pueden microfabricarse en el propio dispositivo de microfluidos. Como alternativa, los diodos de laser pueden fabricarse en otro dispositivo que se coloca adyacente al dispositivo de microfluidos que se esta utilizando para realizar una reacci6n de termociclado, de modo que la luz de laser procedente del diodo se dirige a la secci6n de detecci6n.

La detecci6n puede implicar tambien una serie de estrategias no 6pticas. Por ejemplo, el detector tambien puede incluir, por ejemplo, un detector de temperatura, un detector de conductividad, un detector potenciometrico (por

ejemplo, un electrodo de pH) y/o un detector amperometrico (por ejemplo, para controlar las reacciones de oxidaci6n y reducci6n).

Puede emplearse una serie de detectores externos disponibles en el mercado. Muchos de estos son detectores fluorescentes por la facilidad de preparar reactivos marcados de modo fluorescente. Los ejemplos especfficos de detectores que estan disponibles incluye, pero no se limitan a Applied Precision ArrayWoRx (Applied Precision, Issaquah, WA).

En algunas realizaciones se emplean metodos de detecci6n basados en FRET. Los metodos de detecci6n de este tipo implican detectar un cambio en la fluorescencia desde un fluor6foro donador (indicador) y/o aceptor (extintor) en una pareja de fluor6foros de donador/aceptor. La pareja de fluor6foros de donador y aceptor se selecciona de modo que el espectro de emisi6n del donador se solape con el espectro de excitaci6n del aceptor. Asf, cuando la pareja de fluor6foros se acercan lo suficiente, puede producirse la transferencia de energfa desde el donador al aceptor. Esta transferencia de energfa puede detectarse. Vease la patente de EEUU nO 5.945.273, y la publicaci6n PCT WO 97/22719.

Las balizas moleculares proporcionan una estrategia particularmente eficaz. Con las balizas moleculares, un cambio en la conformaci6n de la sonda a medida que se hibrida con una regi6n complementaria del producto amplificado da como resultado la formaci6n de una sefal detectable. La propia sonda incluye dos secciones: una secci6n en el extremo 5' y otra secci6n en el extremo 3'. Estas secciones flanquean la secci6n de la sonda que se aparea con el sitio de uni6n a la sonda y son complementarias entre sf. Una secci6n terminal generalmente esta asociada con un tinte indicador, y la otra secci6n terminal habitualmente esta unida a un tinte extintor.

En disoluci6n, las dos secciones terminales pueden hibridarse entre sf para formar un bucle de horquilla. En esta conformaci6n, los tintes indicador y extintor estan lo suficientemente cerca para que la fluorescencia desde el tinte indicador pueda ser extinguida de modo eficaz por el tinte extintor. En contraste, la sonda hibridada produce una conformaci6n linealizada en la que el grado de extinci6n disminuye. Por tanto, mediante el control de los cambios de emisi6n en los dos tintes es posible controlar indirectamente la formaci6n del producto de la amplificaci6n. Las sondas de este tipo y los metodos para su uso se describen mas a fondo, por ejemplo, en Piatek, A.S. et al., Nat. Biotechnol., 16:359-363 (1998); Tyagi, S. y Kramer, F.R., Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996); y Tyagi, S. et al., Nat. Biotechnol., 16:49-53 (1998).

Otros metodos de amplificaci6n/detecci6n muy conocidos (como ilustraci6n y no como limitaci6n) incluyen Invader (vease Neri, B.P. et al., Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis, 3826:117-125, 2000); Nasba (vease, por ejemplo, Compton, J., Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature, 350:91-91, 1991); Scorpion (vease Thelwell, N. et al., Nucleic Acids Research, 28:3752-3761, 2000); y detecci6n de ADN capacitativa (vease, por ejemplo, Sohn et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:10687-10690).

Tal como se indic6 anteriormente, los metodos de la presente invenci6n incluyen realizar diversas reacciones/ensayos de amplificaci6n que requieren diversos reactivos, composiciones, tampones, aditivos y similares. Las mezclas de reacci6n pueden prepararse al menos parcialmente de forma separada de una plataforma de ensayo o chip/dispositivo de microfluidos, o dentro de sitios de reacci6n dentro del propio dispositivo (por ejemplo, rociado). Ciertas mezclas de reacci6n o composiciones pueden prepararse e incluirse como parte de un kit

o sistema. Por ejemplo, un sistema puede incluir una composici6n/mezcla de preamplificaci6n, una composici6n de ensayo de amplificaci6n, y un dispositivo de microfluidos para realizar la amplificaci6n y los ensayos de detecci6n del numero de copias. Dos o mas componentes del sistema pueden ensamblarse y proporcionarse como parte de un kit

o sistema.

Las reacciones realizadas con los dispositivos de microfluidos descritos en la presente pueden llevarse a cabo con diversos reactivos, tampones, composiciones, aditivos y similares, que pueden formularse para realizar reacciones de la presente invenci6n (por ejemplo, preamplificaci6n, amplificaci6n cuantitativa, etc.). Asf, por ejemplo, en el caso de dispositivos en los que los reactivos se depositan, estos pueden rociarse con uno o mas reactantas en el sitio de reacci6n, por ejemplo. En otras realizaciones, por ejemplo, cuando no se produce el rociado sobre el chip, los reactivos pueden proporcionarse en mezclas o volumenes de reactivos separados del chip u otros componentes del sistema. Un conjunto de aditivos son los reactivos de bloqueo que bloquean los sitios de uni6n a protefnas sobre el sustrato elastomerico. Puede utilizarse una amplia diversidad de dichos compuestos, incluyendo una serie de diferentes protefnas (por ejemplo, gelatina y diversas protefnas de albumina, tales como albumina de suero bovino) y glicerol. Tambien puede resultar util un aditivo detergente. Puede utilizarse cualquiera de una serie de detergentes diferentes. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a SDS y los diversos detergentes Triton.

En el caso especffico de las reacciones de amplificaci6n de acidos nucleicos, puede incluirse una serie de tipos diferentes de reactivos y/o aditivos. Una categorfa son los potenciadores que estimulan la reacci6n de amplificaci6n. Estos aditivos incluyen, pero no se limitan a reactivos que reducen la estructura secundaria en el acido nucleico (por ejemplo, betafna), y agentes que reducen los acontecimientos de cebado err6neo (por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio).

En general, el calculo de las CNV se basa en el "numero de copias relativo", de modo que las diferencias aparentes

en el numero de copias de genes en diferentes muestras no se ven distorsionadas por las diferencias en las cantidades de muestra. El numero de copias relativo de un gen (por genoma) puede expresarse como la proporci6n del numero de copias de un gen diana al numero de copias de un gen de referencia de una sola copia en una muestra de ADN, que generalmente es 1. Utilizando dos ensayos para los dos genes (la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia) con dos tintes fluorescentes diferentes sobre el mismo dispositivo, ambos genes en la misma muestra de ADN pueden cuantificarse de modo simultaneo. Por consiguiente, la proporci6n de los dos genes es el numero de copias relativo de la secuencia nucleotfdica diana en una muestra de ADN.

En una realizaci6n de la presente invenci6n, la preamplificaci6n puede realizarse utilizando un gen de referencia, tal como una ARNasa P, que es un gen de una sola copia que codifica el resto de ARN para la enzima ARNasa P, una ribonucleoprotefna.

El desarrollo de un gran numero de muestras replicadas puede requerir cantidades significativas de reactivos. En una realizaci6n de la presente invenci6n se realiza una PCR digital en microvolumenes. Las camaras de reacci6n para realizar una PCR de volumen pequefo pueden ser de aproximadamente 2 nl a aproximadamente 500 nl. Cuanto mas pequefo sea el volumen de la camara de reacci6n, mayor sera el numero de ensayos individuales que se puedan hacer (utilizando diferentes conjuntos de sondas y cebadores, o como replicados de los mismos conjuntos de sondas y cebadores, o cualquier combinaci6n de una serie de replicados y de una serie de ensayos diferentes). En una realizaci6n, la camara de reacci6n es de aproximadamente 2 nl a aproximadamente 50 nl, preferiblemente de 2 nl a aproximadamente 25 nl, mas preferiblemente de aproximadamente 4 nl a aproximadamente 15 nl. En algunas realizaciones, el volumen de la camara de reacci6n es de aproximadamente 4 nl, aproximadamente 5 nl, aproximadamente 6 nl, aproximadamente 7 nl, aproximadamente 8 nl, aproximadamente 9 nl, aproximadamente 10 nl, aproximadamente 11 nl, o aproximadamente 12 nl. Las camaras de las muestras pueden fabricarse de vidrio, plastico, silicona, polfmeros elastomericos tales como polidimetilsiloxano, poliuretano u otros polfmeros. Las muestras procesadas mediante el metodo de la presente invenci6n son adecuadas para su uso en un analisis del numero de copias variable empleando el sistema BioMark™ (Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA). El sistema BioMark™ utiliza un dispositivo de microfluidos de polidimetilsiloxano que proporciona la ejecuci6n de multiples ensayos sobre multiples muestras.

Los chips/dispositivos de nanofluidos Fluidigm (matrices digitales) y el sistema de termociclado de formaci6n de imagenes de fluorescencia BioMark estan fabricados por Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA). Un ejemplo de chip segun se ilustra en la figura 5 tiene 12 paneles, y cada uno de los 12 paneles contiene 765 camaras de 6 nl con un volumen total de 4,59 μl por panel. Los chips se fabrican siguiendo la metodologfa de la litograffa blanda de multiples capas (MSL) (Unger, M.A., Chou, H.P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S.R., Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography, Science, 2000, 288:113-116). El chip tiene canales de muestras que tienen una profundidad semielfptica media de 10 μm, una anchura de 70 μm, con un espaciamiento paralelo de 200 μm sobre el centro. Los microfluidos de muestras estan fabricados mediante un proceso de molde de dos capas para crear camaras de divisi6n de 265 μm (profundidad) x 150 μm x 150 μm dispuestas a lo largo de cada canal de muestras. En una capa de silicona separada, los canales de control del chip tienen un recorrido perpendicular a los canales de muestras. Las intersecciones de los canales forman valvulas deflectoras para dirigir a los fluidos. Tras la presurizaci6n de los canales de control, una membrana fina entre las capas cierra los canales de muestras para aislar camaras de divisi6n individuales. Los canales de control tienen una profundidad de 15 μm, una anchura de 50 μm con un espaciamiento paralelo de 300 μm sobre el centro. La porci6n externa del dispositivo tiene la misma huella que una microplaca de 384 pocillos convencional, y permite un funcionamiento de valvulas aut6nomo. Existen 12 puertos de entrada que se corresponden con 12 entradas de muestra separadas al chip. Los chips utilizados pueden incorporar 765 camaras de divisi6n de 6 nl por entrada de muestra, para un total de hasta

14.400 camaras por chip. En esta realizaci6n particular, los canales de muestras discurren de izquierda a derecha conectando las camaras de reacci6n individuales, y los canales de control discurren de arriba abajo en la capa inferior. Tras la presurizaci6n de los canales de control, una membrana fina entre las capas cierra los canales de muestras para aislar camaras de divisi6n individuales. Las valvulas dividen las camaras individuales que se mantienen cerradas durante el experimento de PCR.

Para realizar reacciones de PCR a tiempo real, una mezcla de amplificaci6n maestra (por ejemplo, "mezcla maestra") se combina con la muestra que incluye el producto del ensayo de preamplificaci6n. Las mezclas maestras contienen un tamp6n apropiado, una fuente de iones magnesio (Mg2+) en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, nucle6tidos y, opcionalmente, detergentes, y estabilizantes. Un ejemplo de un tamp6n adecuado es el tamp6n TRIS a una concentraci6n de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 85 mM, siendo preferida una concentraci6n de 10 mM a 30 mM. En una realizaci6n, la concentraci6n del tamp6n TRIS es 20 mM en la forma de mezcla de reacci6n de doble potencia (2x). La mezcla de reacci6n puede tener un intervalo de pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 9,0, siendo tfpico un intervalo de pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5. La concentraci6n de nucle6tidos puede estar en el intervalo de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 1000 mM, generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 800 mM. Los ejemplos de concentraciones de dNTP son 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 y 800 mM. Tambien pueden incluirse en la mezcla de reacci6n detergentes, tales como Tween™ 20, Triton® X 100, y Nonidet™ P40. Tambien pueden incluirse agentes

estabilizantes, tales como ditiotreitol (DTT, reactivo de Cleland) o mercaptoetanol.

Ademas, las mezclas maestras pueden contener opcionalmente dUTP, asf como uracil ADN glicosilasa (uracil-Nglicosilasa, UNG). UNO es el producto del gen ung de Escherichia coli, y se ha clonado, secuenciado y expresado en E. coli. La uracil-ADN-N-glicosilasa (UNG) elimina los restos uracilo del ADN (monocatenario y bicatenario) sin destruir el esqueleto de azucar-fosfodiester del ADN y, asf, evita su uso como diana de hibridaci6n o como molde para ADN polimerasas. Los sitios abasicos resultantes son susceptibles de una ruptura hidrolftica a temperaturas elevadas. Asf, la eliminaci6n de bases de uracilo normalmente viene acompafada de la fragmentaci6n de ADN (Duncan, B.K., y Chambers, J.A. (1984), GENE, 28, 211; Varshney, U., Hutcheon, T., y van de Sande, J.H. (1988), J. Biol. Chem., 263, 7776). Una mezcla maestra esta disponible en el mercado en Applied Biosystems, Foster City, CA (TaqMan® Universal Master Mix, nO de catalogo 4304437, 4318157 y 4326708). El uso de UNG se limita generalmente al ensayo de PCR digital y no se emplea en el ensayo de preamplificaci6n.

Para aplicaciones en forma multiplex se emplean diferentes tintes indicadores fluorescentes para marcar cebadores

o sondas distintos para la cuantificaci6n de genes diferentes. Para los estudios de expresi6n relativa utilizando PCR en forma multiplex, la cantidad de cebador para el gen de referencia (por ejemplo, β-actina o GAPDH) debe limitarse para evitar la competici6n entre la amplificaci6n del gen de referencia y del gen de muestra. En general, la concentraci6n final del cebador del gen de referencia debe estar entre 25 y 100 nM. Una titulaci6n del cebador puede resultar util para la optimizaci6n.

Ejemplo

En un ejemplo de una realizaci6n de la presente invenci6n, el numero de copias de CYP2D6 se determin6 con y sin preamplificaci6n. Utilizando una preamplificaci6n segun la presente invenci6n, se descubri6 que el CYP2D6 en una muestra tenfa una duplicaci6n (el numero de copias es 3), mientras que con el metodo de la tecnica anterior sin preamplificaci6n, la misma muestra mostr6 un numero de copias de 2.

La mezcla maestra de PCR util para realizar ensayos de PCR con muestras preparadas mediante el metodo de la invenci6n puede prepararse con la siguiente composici6n: Tris 20 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, glicerol al 1%, Tween™ al 0,04%, MgCl2 5 mM, dNTP 400 mM, enzima AmpliTaq® Gold 0,08 U/μl (Applied Biosystems, Foster City, CA). La AmpliTaq ADN polimerasa es la forma recombinante de la Taq ADN polimerasa. Se obtiene mediante la expresi6n de la Taq ADN polimerasa en un hospedante E. coli. Al igual que la Taq ADN polimerasa nativa, carece de actividad endonucleasa y 3'-5' exonucleasa, pero tiene actividad 5'-3' exonucleasa.

En un ejemplo, la preamplificaci6n se realiz6 en el sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, CA) en una reacci6n de 5 μl que contenfa 1 x mezcla maestra PreAmp (Applied Biosystems, CA), cebadores 225 nM (ARNasa P como polinucle6tido de referencia, y la secuencia diana de interes), y 1 μl de muestra de ADN. Las condiciones de termociclado fueron 95 OC, 10 minutos de inicio en caliente, y 100 ciclos de 95 OC durante 15 segundos y 60 OC durante 1 minuto. Se afaden 20 μl de agua a cada reacci6n despues de la preamplificaci6n, y las muestras se analizaron en la matriz digital.

Se analizaron cinco muestras de ADN de Coriell en los chips digitales. Se cont6 el numero de moleculas de CYP2D6 y ARNasa P en el mismo volumen (4,59 μl) de cada muestra utilizando el programa informatico de analisis de PCR digital BioMark empleando la correcci6n de Poisson, asf como el algoritmo de Simant (vease Dube et al., supra). Un mapa termico representativo se muestra en la ilustraci6n simplificada en blanco y negro en la figura 5. Aunque se muestra como acontecimientos en blanco, negro y gris como ilustraci6n, los acontecimientos pueden registrarse y mostrarse de manera grafica en forma de colores, tales como amarillo, verde o rojo, que corresponden con un gen ARNasa P (VIC, amarillo), un gen CYP2D6 (FAM, rojo), y sin gen, respectivamente. Se ensayaron controles sin molde ("no template control", NTC) en los paneles 1 y 12.

Las proporciones del numero de moleculas del gen CYP2D6 al gen ARNasa P se obtuvieron para las cinco muestras. Dos de las proporciones fueron de aproximadamente 0,5, lo cual significa que existe s6lo una copia del gen CYP2D6 en cada celula de estas dos muestras (el gen ARNasa P es un gen de una sola copia y siempre hay dos copias del gen en cada celula). Por tanto, los individuos de los que se recogen las muestras de ADN deben tener una deleci6n del gen CYP2D6 sobre un cromosoma. Las otras tres muestras mostraban una proporci6n de aproximadamente 1, pero esto no excluye la posibilidad de una duplicaci6n, puesto que dos copias estrechamente vinculadas podrfan estar sobre una molecula y no se pueden separar. Se realiz6 una reacci6n de preamplificaci6n sobre estas cinco muestras y los productos preamplificados se analizaron en el chip digital (tabla 2).

Tabla 2. Uso de la preamplificaci6n para distinguir la duplicaci6n cromos6mica de genes

MUESTRAS

PCR DIGITAL CYP2D6/ARNasa P PREAMPLIFICACION-PCR DIGITAL CYP2D6/ARNasa P Copias de CYP2D6

NA12155

0,49 0,52 1

NA12872

0,97 0,87 2

NA07357

0,85 0,98 2

NA12873

0,49 0,52 1

NA11994

1,06* 1,49* 3

*La muestra NA11994 tiene una duplicaci6n del gen CYP2D6 sobre un cromosoma.

Tal como se ilustra en la tabla 2, dos muestras con una proporci6n de CYP2D6 a ARNasa P de aproximadamente 0,5 cuando se utiliza ADN gen6mico segufan mostrando una proporci6n de aproximadamente 0,5 cuando se emple6 el proceso de preamplificaci6n de la invenci6n. Una proporci6n de 0,5 indica una deleci6n. Dos muestras con una proporci6n de aproximadamente 1 cuando se utiliza ADN gen6mico tambien tenfan una proporci6n de aproximadamente 1 con los productos de la preamplificaci6n, lo cual indica un estado alelico normal. Pero una muestra con una proporci6n de aproximadamente 1 cuando se analiza ADN gen6mico mostraba una proporci6n de 1,5 cuando se emple6 el proceso de preamplificaci6n. Esto indica que la muestra tiene una duplicaci6n del gen CYP2D2.

Detecci6n de la perdida de heterocigosidad

Una aplicaci6n util de los metodos descritos para determinar la variaci6n en el numero de copias de un gen de interes concreto incluye detectar la perdida de heterocigosidad ("loss of heterozygosity", LOH). Las tecnicas descritas en la presente pueden ofrecer un nuevo nivel de sensibilidad y flexibilidad para detectar la perdida de heterocigosidad. Los ejemplos de aplicaciones incluyen la detecci6n y/o el estudio de un numero an6malo de copias del cromosoma X, o aneuploidfa. La perdida de heterocigosidad (LOH) se refiere a un cambio desde un estado heterocig6tico en un genoma normal a un estado homocig6tico en un genoma tumoral apareado. Las investigaciones demuestran que la perdida de un cromosoma X completo esta implicada en numerosos canceres (Moertel, C.A. et al., Cancer Genet. Cytogenet., 67:21-27 (1993)). Por ejemplo, 40% de los canceres de ovario estan asociados con LOH en regiones del cromosoma X (Osbourne, R.J. y Leech, V., Br. J. Cancer, 69:429-438 (1994)). Ademas, se ha demostrado que la ganancia de un cromosoma X es relativamente comun en leucemias y linfomas (Sandberg, A.A., "The X chromosome in human neoplasia, including sex chromatin and congenital conditions with Xchromosome anomalies", en Sandberg, A.A., editor, Cytogenetics of the mammalian X chromosome, parte B: X chromosome anomalies and their clinical manifestations, Nueva York, Alan R. Liss, 459-498 (1983)).

Para realizaron los experimentos de LOH, pueden proporcionarse dispositivos de microfluidos segun se describen en la presente. La figura 3 muestra la arquitectura de un ejemplo de un dispositivo que se emple6 para determinar la perdidad de heterocigosidad en un ejemplo (vease, por ejemplo, el anterior analisis para mas detalles del dispositivo). Brevemente, el dispositivo incluye un circuito de microfluidos integrado (IFC) que tiene 12 paneles, cada uno con una entrada de flujo para una muestra o mezcla de ensayo. En un ejemplo, la muestra se traslada al chip para su carga, y se carga colocando la matriz digital sobre el controlador de IFC y empleando la interfase del programa informatico para cargar con presi6n los componentes del ensayo hacia los diferentes paneles de 765 reacciones. Cada una de las doce muestras, que se premezclaron con la mezcla maestra y conjuntos de cebadorsonda, se distribuy6 en entradas separadas en el marco del chip. Dentro de cada panel, una unica muestra se reparti6 en 765 reacciones inviduales de PCR a tiempo real de 6 nl. Se realiz6 una PCR con la muestra. La matriz digital se coloc6 en un sistema de PCR a tiempo real para el termociclado y la detecci6n de fluorescencia. Los resultados del experimento se visualizaron y se analizaron utilizando la aplicaci6n del programa informatico BioMark®. Se registraron las curvas de la PCR a tiempo real o las imagenes de consumaci6n de las camaras positivas para comparar un ensayo frente a otro ensayo, por ejemplo, se calcul6 la proporci6n de dos secuencias cualesquiera en una muestra de ADN. Para el analisis, las matrices digitales muestran una mejor linealidad, sensibilidad, y facilidad de uso.

En el ejemplo descrito, se obtuvo ADN de lfneas celulares que contenfan 1, 2, 3, 4 o 5 copias del cromosoma X (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). Se emplearon matrices digitales para ensayar cada muestra frente a tres conjuntos distintos de cebador-sonda TaqMan® de cromosoma X (123B, SMS e YY2 marcados con FAM [BioSearch Technologies, Novato, CAD) que se coamplificaron en presencia de una secuencia "de referencia" marcada con VIC dirigida a una sola copia.

La figura 6 muestra un diagrama en blanco y negro que ilustra los resultados a color que estudian la perdida de heterocigosidad segun se describe, y tambien ilustra cada ejecuci6n del ensayo en paneles duplicados dentro de las

matrices digitales. La figura 6 tambien muestra una vista aumentada del panel 4 del dispositivo. En cada panel, se cont6 el numero de camaras positivas a la diana (gris claro, que se corresponde con un color, por ejemplo, amarillo) y positivas a la referencia (gris mas oscuro, que se correponde con un segundo color, por ejemplo, rojo) y se corrigi6 para multiples tintes por camara. A partir de estos resultados, se determin6 la proporci6n bruta de diana a referencia. Se emplearon controles sin molde (NTC) en los paneles 1 y 12. Se apreciara que, en experimentos practicos, se pueden registrar diferentes colores y los resultados ilustrarse a color, tales como rojo y amarillo, que se indican en la figura 6 como grises en la ilustraci6n en blanco y negro.

Se emple6 un ajuste lineal simple para determinar el numero de copias. La figura 7 muestra la media de las proporciones de tres ensayos diferentes (eje de ordenadas) representada graficamente frente al numero de copias conocido del cromosoma X (eje de abscisas), incluyendo barras de error que muestran el error estandar de la media. Las proporciones producen pendientes para muestras de ADN que se sabe que contienen 1, 2, 3, 4 o 5 copias del cromosoma X. Las mediciones brutas de las proporciones individuales se multiplicaron por 2 y se promediaron para obtener el numero de copias por genoma diploide. La respuesta media para todos los ensayos, de 1 a 5 variantes de numero de copias, es un valor r2 de 0,994, lo cual indica una actuaci6n del ensayo muy lineal.

La tabla 3 lista las proporciones brutas de los conjuntos de sondas-cebadores de TaqMan® para ensayos del cromosoma X individuales ejecutados en los dispositivos de microfluidos. Se determin6 la media de copias del cromosoma X por genoma multiplicando la proporci6n media por 2. La ultima columna de la derecha muestra el error estandar de la media (EEM). Tal como se muestra en la tabla 3, la media de copias por genoma se corresponde bien con el numero de copias conocido del cromosoma X de una muestra.

Tabla 3. Proporciones brutas para ensayos del cromosoma X individuales

NO de copias

Proporci6n de Proporci6n de Proporci6n de Media de copias por EEM

conocido del crom. X

FAM123 bruta SMS bruta YY2 bruta genoma

1x crom.

0,51 0,49 0,61 1,0 0,07

2x crom.

0,77 1,15 0,96 1,9 0,22

3x crom.

1,10 1,19 1,86 2,8 0,48

4x crom.

1,63 2,05 1,79 3,6 0,24

5x crom.

2,03 2,34 2,90 4,8 0,51

Estos resultados indican que los metodos y los dispositivos descritos en la presente permiten la detecci6n y la distinci6n de diferencias pequefas, aunque biol6gicamente importantes, en el numero de copias de genes dentro de muestras de ADN gen6mico muy complejas. Las muestras seleccionadas para estos ensayos son similares o identicas a las estudiadas en ensayos de CGH y en estudios de micromatrices basados en MIP, segun se describe en Visakorpi et al., 1994, Am. J. Pathol., 145:624-630, y Pinkel et al., 1998, Nat. Genet., 20:207-211. Los presentes resultados utilizando los metodos descritos en la presente con matrices digitales pueden producir unos calculos de numero de copias al menos tan discriminantes como los metodos de CGH y MIP conocidos, mientras que reducen la manipulaci6n manual de los tecnicos y, por tanto, requieren menos mano de obra y tienen una mayor eficacia. Ademas, la capacidad para ejecutar multiples ensayos TaqMan® en un formato de PCR digital proporciona robustez biol6gica y redundancia del ensayo, compensando las diferencias en la amplificaci6n entre ensayos. Si se fijan como objetivo multiples loci simultaneamente, los resultados globales de los ensayos son validos incluso si existen mutaciones o deleciones individuales en sitios de uni6n al cebador-sonda localizados. Ademas, la eficacia puede potenciarse utilizando una etapa de preamplificaci6n antes de trasladar la muestra a los dispositivos de microfluidos para el analisis.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un metodo para determinar el numero de copias relativo de una secuencia polinucleotfdica diana en el genoma de un sujeto, que comprende:

   preamplificar una secuencia polinucleotfdica diana y una secuencia polinucleotfdica de referencia en una muestra que contiene ADN gen6mico del sujeto;

   ensayar la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia de la muestra preamplificada mediante una PCR digital;

   determinar (a) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica diana, y (b) el numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica de referencia, y determinar la proporci6n de (a) a (b).
2. 2.-El metodo de la reivindicaci6n 1, en el que la muestra procede de un ser humano.
3. 3.-El metodo de la reivindicaci6n 1, en el que: (i) la proporci6n de (a) a (b) es de aproximadamente 0,5, y existe una deleci6n de la secuencia polinucleotfdica diana sobre un cromosoma; o (ii) la proporci6n de (a) a (b) es de aproximadamente 1,5, y existe una duplicaci6n de la secuencia polinucleotfdica diana sobre un cromosoma.
4. 4.-El metodo de la reivindicaci6n 1, en el que:

   la secuencia polinucleotfdica de referencia tiene un numero de copias gen6micas predeterminado N;

   la determinaci6n del numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica diana comprende determinar el numero de volumenes de reacci6n en los que esta presente la secuencia polinucleotfdica diana o una subsecuencia de esta (A);

   la determinaci6n del numero de moleculas polinucleotfdicas amplificadas que contienen la secuencia polinucleotfdica de referencia comprende determinar el numero de volumenes de reacci6n en los que esta presente la secuencia polinucleotfdica de referencia o una subsecuencia de esta (B); y

   el numero de copias relativo del polinucle6tido diana en el genoma es aproximadamente igual a (A)/(B) x N.
5. 5.-El metodo de la reivindicaci6n 4, en el que la realizaci6n de la preamplificaci6n comprende combinar la muestra con una composici6n que comprende cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica diana y cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica de referencia, y realizar una reacci6n en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar de forma separada el polinucle6tido diana y el polinucle6tido de referencia en una proporci6n sustancialmente identica.
6. 6.-El metodo de la reivindicaci6n 4, en el que los volumenes de reacci6n se disponen en un dispositivo de microfluidos, y la preamplificaci6n se realiza en un volumen de reacci6n separado del dispositivo de microfluidos.
7. 7.-El metodo de la reivindicaci6n 4, en el que, antes de ensayar la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia de la muestra preamplificada mediante una PCR digital, toda o una porci6n de la muestra preamplificada se combina con reactivos seleccionados para la amplificaci6n cuantitativa de la secuencia polinucleotfdica diana y la secuencia polinucleotfdica de referencia.
8. 8.-El metodo de la reivindicaci6n 5, en el que los cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica de referencia utilizados en la etapa de preamplificaci6n tambien se utilizan en el ensayo de la secuencia polinucleotfdica de referencia de la muestra preamplificada mediante PCR digital.
9. 9.-El metodo de la reivindicaci6n 8, en el que los cebadores especfficos para la secuencia polinucleotfdica diana utilizados en la etapa de preamplificaci6n tambien se utilizan en el ensayo de la secuencia polinucleotfdica diana de la muestra preamplificada mediante PCR digital.
10. 10.-El metodo de la reivindicaci6n 7, en el que los reactivos comprenden una primera sonda que se hibrida selectivamente con una secuencia polinucleotfdica diana, y una segunda sonda que se hibrida selectivamente con una secuencia polinucleotfdica de referencia bajo condiciones adecuadas para la amplificaci6n de polinucle6tidos.
11. 11.-El metodo de la reivindicaci6n 10, en el que la primera y la segunda sonda comprenden diferentes marcadores detectables, y en el que la uni6n de la primera o de la segunda sonda o la degradaci6n de la primera o de la segunda sonda tras una polimerizaci6n basada en la reacci6n en cadena de polimerasa (PCR) produce un cambio en la fluorescencia detectable del respectivo marcador detectable.
12. 12.-El metodo de la reivindicaci6n 1, en el que la secuencia polinucleotfdica de referencia comprende una secuencia polinucleotfdica que codifica al menos parcialmente una enzima ARNasa P, beta-actina o GAPDH.
13. 13.-El metodo de la reivindicaci6n 1 o de la reivindicaci6n 2, en el que una proporci6n de secuencia polinucleotfdica diana a secuencia polinucleotfdica de referencia que se desvfe sustancialmente de un valor de 1 indica un numero de copias an6malo de la secuencia polinucleotfdica diana en el genoma del paciente.