KR20100058566A

KR20100058566A - 카피수 변이 측정, 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20100058566A
Application number: KR1020107005860A
Authority: KR
Inventors: 라메쉬 라마크리쉬난
Original assignee: 플루이다임 코포레이션
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2008-09-08
Publication date: 2010-06-03
Also published as: JP5707132B2; BRPI0816393A2; EA018555B1; EP2198293B1; AU2008295992B2; CN101821619A; WO2009033178A1; EP2198293A4; US8148078B2; US20120282604A1; CN101821619B; IL204288A; EA201070349A1; MX2010002556A; AU2008295992A1; KR101518085B1; JP2010538614A; CA2698545A1; ATE541946T1; US8450065B2

Abstract

본 발명은, 증폭 기반 기법을 포함하는, 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수 변이를 측정하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 이 방법은 시료를 사전 증폭시키는 단계, 시료를 복수의 반응 용량으로 분배하는 단계, 표적 폴리뉴클레오티드와 참조 폴리뉴클레오티드의 정량적 검출 단계 및 피험체 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정하기 위한 분석 단계를 포함할 수 있다.

Description

카피수 변이 측정, 방법 및 시스템{COPY NUMBER VARIATION DETERMINATION, METHODS AND SYSTEMS}

[관련 출원에 대한 상호 참조]

본 출원은, 35 U.S.C. §119(e) 하에서, 2007년 9월 7일자 출원된 미국 가명세서 특허 출원 제60/967,897호(전체 내용은 본원에 참고용으로 인용됨)의 우선권의 이익을 주장하는 출원이다.

[발명의 분야]

본 발명은 소집단 또는 개체 유래의 게놈에 있어서의 카피수 변이를 측정하는 방법에 관한 것이며, 생물학 및 의학 분야에서 적용될 수 있다.

"디지털 PCR(digital PCR)"이란, 시료 중에 존재하는 각각의 핵산 분자를 복수의 개별 반응 용량(예를 들어, 챔버 또는 분액)으로 분배한 후, 하나 이상의 표적 서열을 PCR 증폭시키는 방법을 의미한다. 분배 후 시료 중 각 분자의 농도를 맞추면, 각각의 반응 용량은 하나 이하의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자(또는 결합된 폴리뉴클레오티드 분자의 응집체)를 함유하게 되고, 대부분의 챔버는 하나의 분자를 함유하거나 또는 전혀 함유하지 않게 된다. 표적 서열을 증폭시키면 2진 디지털 출력 결과가 나오는데, 이 경우, 각각의 챔버는 상응하는 표적 서열의 존재에 대한 지표가 되는 PCR 생성물을 함유하거나 또는 함유하지 않는 것으로 확인된다. PCR 최종 생성물을 검출 가능한 수준으로 함유하는 반응 용량을 측정하는 것은 핵산의 절대량을 직접 측정하는 것과 같다. 디지털 PCR 중 하나의 버젼에 있어서는, 폴리뉴클레오티드 분자를 개별 반응 용량으로 분할(partitioning) 함으로써 상기 분자를 분배한다. 하나의 분할 방법에서는 바이오마크(BioMark)™ 12.765 디지털 어레이(Digital Array)(Fluidigm Corp., South San Francisco, CA)를 사용한다. 이 칩은 시료와 시약의 혼합물을 765 나노리터 용량의 반응 챔버에 분할하는 통합형 채널 및 밸브를 이용한다. 각각의 혼합물 중 DNA 분자는 각 패널의 765개 챔버에 무작위로 분할된다. 그 후, 상기 칩은 열 사이클링(thermocycling)되고, 플루이다임(Fluidigm)의 바이오마크(BioMark) 실시간 PCR 시스템 상에는 이미지가 형성되며, 원래 하나 이상의 분자를 함유하고 있던 포지티브 챔버(positive chamber)가 디지털 어레이 분석 소프트웨어에 의해 계수될 수 있다. 디지털 PCR에 관하여는, 예를 들어 문헌[Vogelstein and Kinzler, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-41; McBride외 다수, 미국 특허 출원 공보 20050252773(특히, 실시예 5)]을 참조할 수 있다.

카피수 변이(Copy Number Variation; CNV)는 크기가 500 염기 이상인(종종 5천∼5백만 염기) 게놈 부위의 증가 또는 감소를 의미한다. 전체 게놈을 대상으로 연구한 결과, 인간의 경우 CNV 부위가 다수 존재하고, 전체 집단 중 유전적 특성이 매우 다양하다는 것이 규명되었다. CNV는 인간의 유전 질환에 이것이 미치는 영향력으로 말미암아, 최근 행하여지고 있는 다수의 연구에서 주요 연구 대상이 되고 있다. 예를 들어 각각 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Iafrate외 다수, 2004, Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet 36: 949-951; Sebat외 다수, 2004, Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science 305: 525-528; Redon외 다수, 2006, Global variation in copy number in the human genome. Nature 444: 444∼454; Wong외 다수, 2007, A comprehensive analysis of common copy-number variations in the human genome. Am J Hum Genet 80: 91-104; Ropers, 2007, New perspectives for the elucidation of genetic disorders. Am J Hum Genet 81 : 199-207; Lupski, 2007, Genomic rearrangements and sporadic disease. Nat Genet 39: S43-S47]을 참조할 수 있다. 이수성, 예를 들어 3 염색체성 또는 전체적인 염색체 결실은, 인간의 다양한 질병과 관련된 카피수 변이의 제한적인 유형에 해당한다.

본 발명은 소집단 또는 개체로부터 유래하는 게놈 내 카피수 변이를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시료 중의 관심있는 유전자를 사전에 증폭시킨 후, 디지털 PCR에 의해 분석하는 것을 제공한다. 본 발명의 사전 증폭 단계를 통해서 개별 PCR 반응 시료에 분배될 유전자의 각 카피를 분배함으로써, 사전 증폭 과정이 없는 디지털 PCR로 측정하는 경우보다 실제 카피수가 더욱 정확하게 측정되는 방식으로 검출될 수 있다.

본 발명의 디지털 PCR 기반 방법은 유전자 카피수가 2배 미만으로 차이가 날 경우에도 매우 정확하게 구별하는 능력을 갖는다. 예를 들어 상이한 시료 중에서는 유전자 카피수가 1∼4개 정도 차이가 있을 수 있다. 실제로 상이한 시료 중 유전자 카피수가 분명하게 차이가 나며, 시료의 양이 차이가 날 때에도 결과가 왜곡되지 않도록 만들기 위하여, 본 발명의 발명자들은 상대 카피수(relative copy number)라는 용어를 사용한다. (인간 게놈당) 유전자의 상대 카피수는 DNA 시료 중 표적 유전자의 카피수 대 단일 카피 참조 유전자의 카피수의 비로서 표현될 수 있는데, 이는 일반적으로 1이다. 예를 들어 RN아제 P(RNase P) 유전자는 RN아제 P 효소에 대한 RNA 부분을 코딩하는 단일 카피 유전자로서, 카피수 분석법에서 참조 유전자로 사용될 수 있다.

시판중인 디지털 PCR 수행용 디지털 어레이 칩, 예를 들어 도 3에 도시한 칩은 시료 중 DNA를 정량하는 데 사용되어 왔다. 상기 칩은 시료 혼합물 도입용인 시료 주입구를 12개 가지고 있다. 각각의 시료 혼합물은 12개의 패널 각각에 존재하는 765개의 반응 챔버에 분할된다. 문헌[예를 들어, McBride외 다수, 미국 특허 출원 공보 제20050252773호]에 기술되어 있는 바와 같이, 시료 중의 DNA를 정량하는 능력은, 적당량의 DNA가 도입될 때, 하나의 DNA 분자가 챔버 내에 무작위로 분배된다는 원리를 기본으로 한다.

하나의 칩 상에 2개의 형광 염료를 보유하는 2개의 유전자(예를 들어, RN아제 P 및 관심있는 다른 유전자)에 대해 2개의 분석법을 사용함으로써, 동일 DNA 시료 중 RN아제 P 및 다른 유전자 둘 다를 동시에 정량할 수 있으며, 그 결과, 상기 2개의 유전자 간 비와 관심 있는 유전자의 카피수를 정확하게 산정할 수 있게 된다.

그러나, 복제될 때, 하나의 유전자에 대한 복수의 카피는 동일한 염색체 상에서 밀접하게 연관되어 있을 수 있으므로, 디지털 어레이 상에서조차 각각 분할될 수 없다. 결과적으로, 복수의 카피들은 하나의 분자처럼 행동을 하게 될 것이고, 유전자 카피의 총 수는 매우 적게 산정될 것이다.

본 발명은 그 과정 중 사전 증폭 단계를 포함함으로써, 이와 같은 문제를 해결하였다. 사전 증폭은 관심있는 유전자와 참조 유전자(예를 들어, RN아제 P 유전자) 둘 다에 대한 프라이머를 사용하는 PCR 반응이다. 통상적으로, 이 단계는 제한된 횟수(예를 들어, 10 사이클)의 열 사이클링을 수행함으로써 수행되는데; 이 경우, PCR 효율이 동일하다고 가정할 때, 상기 두 유전자의 카피수는 사전 증폭 단계에서 비례적으로 증가하게 된다. 이 과정을 통하여, 복수의 유전자 카피가 게놈 상에 함께 연관되어 있을 때조차도, 사전 증폭 단계를 거친 후에는 관심있는 유전자의 각 카피는 별도로 증폭될 것이며, 디지털 어레이 내 상이한 챔버에 별도로 분할될 것이다. 새로이 생성된 상기 두 유전자의 분자들은 원래의 비를 반영하고, 이 분자들은 더 이상 연관되지 않기 때문에, 디지털 칩 분석법은 2개의 유전자 분자들을 정량하여, 2개의 유전자의 비(즉, 관심있는 유전자의 카피수)를 정확하게 측정할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 유전자 기반 분석을 수행하는 시스템 및 이와 관련된 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 방법 및 시스템은 일반적으로, 피험체로부터 얻은 시료 중의 관심있는 폴리뉴클레오티드의 카피수의 변이를 측정하는 것에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:

(a) 피험체의 게놈 DNA를 함유하는 시료 중의 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 사전 증폭시킴으로써 증폭된 시료를 생성하는 것인 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 생성물을 복수의 분리된 반응 용량으로 분배하고, 각각의 반응 용량에 대해 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열을 증폭시킨 후, 증폭된 시료 중의 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열의 상대량을 측정함으로써 디지털 PCR을 수행하는 단계로서, 증폭된 시료 중의 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열의 상대량은 게놈 내 표적 유전자 서열과 참조 유전자 서열의 상대량에 해당하는 것인 단계.

관련 측면에 있어서, 본 발명은 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정하는 방법으로서 다음과 같은 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:

피험체의 게놈 DNA를 함유하는 시료 중의 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 사전 증폭시키는 단계;

사전 증폭된 시료의 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 디지털 PCR에 의해 분석하는 단계;

표적 유전자 서열을 포함하는 증폭된 폴리뉴클레오티드 분자의 수(a) 및 참조 유전자 서열을 포함하는 증폭된 폴리뉴클레오티드 분자의 수(b)를 측정하여 (a):(b)의 비를 결정하는 단계.

관련된 측면에 있어서, 본 발명은 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 카피수를 측정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:

피험체로부터 얻은 DNA 시료에 대해 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계로서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 소정의 게놈 카피수 N을 갖는 참조 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다가 증폭되어 증폭된 시료를 생성하는 것인 단계;

증폭된 시료 전부 또는 그 일부를 복수의 분리된 반응 용량으로 분배하는 단계;

각각의 반응 용량에 대해 제2 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계로서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재할 경우 이것이 증폭되고, 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재할 경우 이것이 증폭되는 것인 단계;

표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(A)를 측정하고, 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(B)를 측정하는 단계로서; 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수는 약 (A)/(B)×N인 단계.

몇몇 구체예에서, 시료는 인간 유래의 것이다. 특정 구체예에서, (a):(b)의 비가 약 0.5이고, 한 염색체 상에 (a)의 결실이 존재하거나, 또는 (a):(b)의 비가 약 1.5이고, 한 염색체 상에 (a)의 중복이 존재한다. 몇몇 구체예에서, 실질적으로 1의 값으로부터 벗어난 표적 유전자 서열:참조 유전자 서열의 비는 환자의 게놈에 있어서의 비정상적인 표적 유전자 서열의 카피수를 나타내는 것이다.

몇몇 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계는, 생체 시료를, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 조성물과 혼합하고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석을 수행하여 표적 폴리뉴클레오티드와 참조 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 동일한 비율로 개별적으로 증폭시키는 것을 포함한다.

몇몇 구체예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭은 4∼15회의 열 사이클링을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 반응 용량을 미세유체 디바이스(microfluidic device)에 배치하고, 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 미세유체 디바이스로부터 분리된 반응 용량에서 수행한다.

몇몇 구체예에서, 분배 단계의 수행 전에, 증폭된 시료 전부 또는 일부를 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열의 증폭을 위해 선택된 시약과 혼합한다. 일반적으로, 일부가 사용되며, 증폭된 시료를 희석한 후 그 일부를 반응 용량으로 분배한다. 몇몇 구체예에서, 증폭은 PCR 증폭이다.

몇몇 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용된 참조 유전자 서열 증폭 프라이머는 제2 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용된 프라이머와 동일하다. 몇몇 구체예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용된 표적 유전자 서열 증폭용 프라이머는 제2 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용된 프라이머와 동일하다. 몇몇 구체예에서, 시약은 표적 유전자 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 제1 프로브와, 폴리뉴클레오티드 증폭에 적합한 조건 하에서 참조 유전자 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 제2 프로브를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 제1 프로브와 제2 프로브는 검출 가능한 상이한 표지를 포함하며, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기반 중합시, 상기 제1 프로브 또는 제2 프로브의 결합 또는 상기 제1 프로브 또는 제2 프로브의 분해로 인하여 각각의 검출 가능한 표지의 형광에 검출 가능한 변화가 발생한다.

몇몇 구체예에서, 참조 유전자 서열은 적어도 부분적으로 RN아제 P 효소, β-액틴 또는 GAPDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 표적 유전자 서열의 상대 카피수를 측정하는 것은 피험체의 게놈에서 이형접합성 소실을 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 실질적으로 1보다 크거나 작은 표적 유전자 서열 대 참조 유전자 서열의 비는 환자의 게놈에 있어서의 이형접합성 소실을 나타내는 것이다.

본 발명의 특징과 이점에 대해 더욱 자세히 이해하기 위해서는, 첨부 도면들과 함께 이하에 기술된 발명의 상세한 설명을 참고로 해야 할 것이다. 첨부된 도면들은 예를 들어서 본 발명의 구체예를 나타내는 것이다. 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 다양한 측면에서 본 발명을 변형시킬 수 있다. 그러므로, 도면/도면들과 구체예에 관한 설명은 본질적으로 예시적인 것이지, 제한적인 것은 아니다.

도 1은 본원에 개시된 본 발명의 방법을 이루는 일반적인 단계들을 도시한 흐름도이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 구체예에 따른 미세유체 디바이스의 대표적인 채널 디자인을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 구체예에 의한 미세유체 디바이스를 간단히 나타낸 도면이다.
도 4a∼4c는, 예를 들어 도 1에 도시된 미세유체 디바이스의 일부를 나타내는 것이다.
도 5는 미세유체 디바이스를 이용하여 수행된, 카피수 변이 결과를 예를 들어 나타낸 것이다.
도 6은 미세유체 디바이스를 이용하여 수행된, 이형접합성 소실 결과를 예를 들어 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 구체예에 따라서 수행된 이형접합성 소실의 검출 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 가상 실험의 부분적인 결과를 나타내는 개략도로서, 여기서는 표적 서열의 카피수(T)가 측정된다. 반응 용량이 64×64인 매트릭스가 도시되어 있는데, 여기서, 표적 서열은 VIC 표지화된(황색) 프로브를 사용하여 증폭 및 검출되었고, 단일 카피인 참조 서열은 FAM 표지화된 (녹색) 프로브를 사용하여 증폭 및 검출되었다. 황색 표지를 포함하는 19개의 반응 용량과 녹색 표지를 포함하는 12개의 반응 용량이 검출되는데, 이는 곧, 비가 약 1.5이고[19/12 = 1.58로서, 약 1.5], 또한 이수체 게놈당 표적 서열 카피수가 3임을 말해주는 것이다.

본 발명은 환자의 게놈 내에 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 카피수(예를 들어, 유전병과 관련된 카피수 변이 포함)를 측정하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 환자로부터 유래한 시료 내에 존재하는 게놈 물질을 이용하여 환자의 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수 변이를 측정하는 데 사용될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 기법은 시료 중 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정하기 위한 폴리뉴클레오티드 증폭 기반 분석법을 이용할 것이다. 참조 서열에 대한 게놈의 카피수는 알고 있다. 그러므로, 표적 폴리뉴클레오티드 카피수는 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 상대적으로 분석되며, 그 결과, 표적 폴리뉴클레오티드의 상대 카피수가 측정될 수 있다. 표적 및/또는 참조 폴리뉴클레오티드 서열을 때때로 "유전자"라고도 한다. 그러나, "유전자"라는 용어는 반드시 단백질(또는 RNA)을 코딩하는 서열(즉, RNA)을 의미하는 것은 아님을 이해해야 할 것이다.

카피수의 측정 및 분석 기법은 소위 "디지털 분석" 또는 "디지털 PCR"에 적합한 임의의 고용량 디바이스, 예를 들어 미세유체 디바이스를 이용할 수 있는데, 여기서, 상기 미세유체 디바이스는 다수 또는 고밀도의 저용량 반응 위치(예를 들어, 나노 용량 반응 부위 또는 반응 용량)를 포함한다. 그러므로, 본 발명의 카피수 변이 검출 및 분석 기법은, 반응/분석용 플랫폼 또는 미세유체 디바이스, 예를 들어 본원에 개시된 예시적인 디바이스에 배분되어 있는, 수백 내지 수천 개의 반응 용량에 시료를 분배 또는 분할하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 기타 정량 증폭 기법을 이용하여 생체 시료로부터 얻어진 DNA(예를 들어, 게놈 DNA)를 증폭시키는 사전 증폭 단계를 포함한다. 대표적인 생체 시료로서는 세포(예를 들어, 용해된 세포 및 세포 균질물), 혈청 및 생물학적 유체를 포함한다. 일반적으로, (예를 들어, 인간인 환자의 게놈 내 카피수 변이를 측정하기 위한) 본원의 방법은 인간 DNA와 관련하여 기술되어 있는데, 여기서, 상기 방법은 유전 물질의 양에 변화가 있는 임의의 시료에 대해서 변형/응용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법은 동물, 식물, 박테리아 및 진균의 유전 분석 및 인간인 피험체의 유전 분석에 사용될 수 있다. DNA를 함유하는 생체 시료를 수집 및 가공하는 방법에 관하여는 널리 공지되어 있으므로, 본원에서 별도로 논의할 필요는 없겠다. 본 발명의 분석을 수행하기 위하여, 세포 또는 생물학적 유체로부터 DNA를 분리할 수 있거나, 또는, 예를 들어 DNA를 함유하는 세포 용해물을 사용함으로써 분석을 수행할 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 "DNA 시료"란 용어는, 정제된 형태, 반 정제된 형태 또는 정제되지 않은 형태를 가지는 DNA 특히, 게놈 DNA를 의미할 수 있다. 본원에 사용된 "피험체로부터 DNA 시료를 얻는 단계"란, 간단히 말해서, 후속 분석 단계들(예를 들어, 사전 증폭 단계)에 사용될 DNA 시료가 출발 물질이라는 의미이다. "DNA 시료를 얻다"는 의미는, 예를 들어 피험체로부터 세포를 수집하거나, DNA를 분리하는 것을 함축하는 것은 아니지만, 단순히 사전 수집된 DNA를 함유하는 튜브를 얻는 것일 수 있다.

도 1은 본원에 개시된 방법을 수행하는 일반적인 단계들을 도시한 것이다. 예시적인 한 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계들로서는, 분석용 프라이머, 적당한 완충 시스템, 뉴클레오티드 및 DNA 폴리머라제 효소(예를 들어, "핫 스타트(hot start)" 조건에 맞춘 폴리머라제 효소)를 포함하는 사전 증폭 마스터 혼합물을 제공하는 단계, 게놈 DNA를 사전 증폭 마스터 혼합물에 첨가하는 단계, 관심있는 서열(들)과 참조 서열을 사전 증폭시키는 단계; 및 (종말점 분석법 또는 실시간 분석법에서) 디지털 PCR 분석법을 통해 사전 증폭된 서열들을 분석하는 단계 및 참조 서열의 출현 빈도에 대한 표적 서열(들)의 출현 빈도를 비교하는 단계를 포함한다. 도 1은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것으로서, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1의 첫 번째 단계에서는, 피험체로부터 얻은 DNA 시료의 제1 폴리뉴클레오티드 증폭 단계, 즉 사전 증폭 단계가 수행된다. 사전 증폭 단계에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 참조 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다가 증폭된다. PCR 증폭 방법에 관하여는 널리 공지되어 있으며, 본원에도 기술할 필요가 있다.

몇몇 구체예에서, 표적 서열은 결실 또는 중복 여부가, 관심 있는 표현형과 관련되어 있는 서열이다. 몇몇 구체예에서, 표적 서열은 결실 또는 중복 여부가, 관심 있는 표현형과 관련되어 있지 않되, 특정 집단에 있어서 변이의 분배 또는 상관성에 관한 정보가 필요한 서열이다.

참조 서열은 알고 있는(또는 가정의) 게놈 카피수를 갖는 서열이다. 그러므로, 참조 서열은 게놈 내에서 증폭 또는 결실될 가능성이 없는 서열이다. 각각의 분석법에서 참조 서열의 카피수를 실험에 의해 측정할 필요는 없다. 오히려, 카피수는 관심있는 유기체 내 정상적인 카피수를 기준으로 하여 가정할 수 있다. 예를 들어 인간 게놈 내 하나의 유용한 참조 서열은 RN아제 P 유전자와, 이수체 게놈당 2개의 카피수만큼 존재하는(존재하고, 또한 반수체 게놈당 카피수가 1인) 단일 카피 유전자이다. 예시로서, 기타 유용한 참조 서열로서는 β-액틴 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 포함하지만; 본 발명은 특정 참조 서열에 한정되는 것은 아니라는 사실을 이해해야 할 것이다.

사전 증폭 단계는 RN아제 P(참조 유전자) 및 관심있는 표적 유전자 둘 다에 대한 프라이머를 사용하는 PCR 반응으로서 수행된다. 통상적으로, 이 반응은 제한된 횟수(예를 들어, 5 사이클 또는 10 사이클)의 열 사이클링으로 수행된다. 몇몇 구체예에서, 상기 사이클의 최적 횟수는 참조 유전자 및 표적 유전자에 대한 PCR 효율에 따라 달라질 것이다. 임의의 구체예에서, 사전 증폭 분석법에 있어서 열 사이클링 횟수는, 약 4∼15 사이클, 또는 약 4∼10 사이클일 수 있다. 임의의 구체예에서, 열 사이클링 횟수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회, 또는 15회 이상일 수 있다.

사전 증폭 반응은 정량적이거나 비례적인 것이 바람직하다. 즉, 표적 서열과 참조 서열의 앰플리콘의 상대 수(비)는 증폭되고 있는 게놈(또는 기타) DNA 내 표적 서열과 참조 서열의 상대 수(비)를 반영할 것이다. 정량적 증폭 방법에 관하여는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Arya외 다수, 2005, Basic principles of real-time quantitative PCR, Expert Rev Mol Diagn. 5(2):209-19]을 참조할 수 있다. 복제된 유전자의 경우, 프라이머는 관심있는 표적 유전자의 복제된 각 카피가 개별적으로 증폭되는 것으로서 선택되어야 한다. 그러므로, 시료를 선택적으로 사전 증폭하고 이를 개별 반응 용량으로 분배한 후, 앰플리콘은 각각의 서열에 상응하는 비례 수만큼 반응 용량으로 분배될 것이다. 상기 두 개의 유전자의 새로이 생성된 분자들은 원래의 비를 반영하므로, 이후의 카피수 분석은 표적 유전자와 참조 유전자의 분자 수를 정량할 수 있다. 결과적으로, 2개의 유전자의 비는 정확하게 결정될 수 있는 것이다. 참조 서열의 카피수는 알고 있기 때문에, 관심있는 서열의 카피수가 측정될 수 있다.

2개의 유전자 카피수의 비가 어떠한 형태로라도 편차를 보이지 않도록 표적 서열과 참조 서열의 증폭 효율이 유사하거나 거의 동일한 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 프라이머 쌍과 증폭 조건은 그와 같은 결과를 얻어내도록 선별되어야 할 것이다. 프라이머의 임의의 쌍의 증폭 효율은 통상의 기법에 의해 용이하게 측정될 수 있다[예를 들어, Furtado외 다수, "Application of real-time quantitative PCR in the analysis of gene expression." DNA amplification: Current Technologies and Applications. Wymondham, Norfolk, UK: Horizon Bioscience p. 131-145 (2004)].

비록 표적 서열 및 참조 서열의 증폭 효율이 거의 동일한 것이 바람직하다고 하지만, 제한된 횟수의(통상적으로, 15회 미만, 일반적으로 10회 또는 10회 미만, 가장 일반적으로는 약 5회) 사전 증폭 열 사이클링 단계를 통하여는 효율의 차이를 어느 정도 감소시킬 수 있으므로, 일반적인 차이로 인해서는 본 발명의 효과에 거의 영향을 미치지 않을 것이다.

전술한 바와 같이, 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 사전 증폭 방법에 사용된 반응 혼합물(사전 증폭 조성물 또는 혼합물)은 통상적으로 적당한 완충액, 마그네슘 이온(Mg² ⁺)의 공급원(약 1∼약 10 mM, 바람직하게는 약 2∼약 8 mM)과, 뉴클레오티드를 함유하며, 임의로는 계면활성제와 안정화제도 함유한다. 하나의 적당한 완충액의 예로서는 TRIS 완충액(농도 = 약 5∼약 85 mM로서, 10∼30 mM이 바람직함)이 있다. 일 구체예에서, TRIS 완충액 농도는 세기가 2배인(2×) 반응 혼합물 중 20 mM이다. 반응 혼합물의 pH는 약 7.5∼약 9.0일 수 있고, 통상적으로는 약 8.0∼약 8.5이다. 뉴클레오티드의 농도는 약 25∼약 1000 mM일 수 있으며, 통상적으로는 약 100∼약 800 mM일 수 있다. dNTP의 농도는, 예를 들어 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 및 800 mM이다. 계면활성제, 예를 들어 Tween™ 20, Triton® X 100 및 Nonidet™ P40도 반응의 혼합물 중에 포함될 수 있다. 안정화 제제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT, 클레란트 시약(Cleland's reagent)) 또는 머캅토에탄올도 포함될 수 있다. 사전 증폭 반응 혼합물은 사전 증폭 반응용 프라이머를 함유할 것이다. 상기 프라이머는 일반적으로, 시료가 낮은 농도로 생성되는 후속 PCR 분석법에서 사용될 프라이머의 서열과 동일한 서열을 갖는다. 프라이머 농도는 PCR 분석법에 사용된 프라이머 농도보다 크거나, 동일하거나 또는 그 미만일 수 있다. 구체예로서는 PCR 분석법에서의 프라이머 농도보다, 약 50, 25, 20, 10 또는 5 배 크거나 동일한 농도의 프라이머를 사용하거나, 또는 그보다 10, 20, 35, 50, 65, 75, 100, 125, 150, 175 및 200 배 미만인 농도의 프라이머를 사용한다. 사전 증폭 단계에서 사용된 프라이머로서는 랜덤 프라이머, 폴리 A 테일, 및 PCR 분석법용으로 디자인된, 관심있는 특이 프라이머를 포함할 수 있다.

반응 혼합물은 후속 실 시간 정량 PCR 분석 결과를 정규화하기 위한 참조 염료를 함유할 수도 있다. 일반적으로 시판되고 있는 참조 염료의 예로서는 ROX가 있다. 시판되고 있는 ROX 염료 함유 반응 혼합물로서는 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)으로부터 시판되고 있는 셀스다이렉트 2X 반응 혼합물(CellsDirect 2X Reaction Mix; Cat. Nos. 11754-100 및 11754-500)이 있다.

DNA 폴리머라제 효소(예를 들어, Taq 폴리머라제)도 또한 반응 혼합물에 첨가된다. 일 구체예에서, Taq 폴리머라제, 예를 들어 플래티늄(Platinum)® Taq DNA는, 상온에서 폴리머라제 활성을 억제하는 항체와 복합체를 형성한 재조합 Taq DNA 폴리머라제이다. 폴리머라제의 전체 활성은, "핫 스타트"를 제공하는 PCR 중 변성 단계 이후 회복된다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 사전 증폭 시료는 특히 디지털 PCR 분석용으로 적합하며, 또한 유전자의 염색체 중복을 구별하기 위한 것으로서도 적합하다. 특히, 사전 증폭된 시료는 다수의 저용량 PCR 실험에서 분석된다. 디지털 PCR에 있어서, 게놈 DNA 시료에 대해 동일한(또는 실질적으로 유사한) 분석법이 진행된다. 소정의 게놈 시료에 대한 각 반응의 수행 횟수는 약 2∼1,000,000회 이상으로 다양할 수 있다. 바람직하게, 시료를 대상으로 한 분석법의 수행 횟수는 100회 이상, 더욱 바람직하게는 200회 이상, 더욱 바람직하게는 300회 이상이다. 보다 큰 규모의 디지털 PCR도 또한 수행될 수 있는데, 여기서, 시료를 대상으로 한 분석법의 수행 횟수는 500회 이상, 700회 이상, 765회 이상, 1000회 이상, 2500회 이상, 5000회 이상, 7,500회 이상 또는 10,000회 이상이다. 분석법의 수행 횟수는 게놈 시료당 약 2,5000회 이하, 약 50,000회 이하, 약 75,000회 이하, 약 100,000회 이하, 약 250,000회 이하, 약 500,000회 이하, 약 750,000회 이하, 약 1,000,000회 이하, 또는 1,000,000회 이상일 수도 있다. 디지털 PCR 분석법에서 사용된 DNA의 양은 일반적으로, 하나 이하의 핵산 단편이 각 디지털 PCR 반응에 존재하도록 선택된다.

도 1에 도시된 바와 같이, 사전 증폭 단계 수행 후, 비례적으로 증폭된 유전 물질(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 앰플리콘)을 가지는 사전 증폭 생성물을 포함하는 시료(또는 이의 일부)는 개별 위치 또는 반응 용량에 분배되므로, 각각의 반응 웰은, 예를 들어 용량당 평균 약 하나 이하의 앰플리콘을 포함한다. 그러므로, 대부분의 반응 용량은 앰플리콘을 함유하지 않을 것이며, 또한 하나의 표적 서열 앰플리콘 또는 하나의 참조 서열 앰플리콘을 함유할 것이다. 일반적으로, 사전 증폭된 시료를 희석(통상적으로, 1:10∼1:20)시키고/시키거나 증폭된 시료 중 소량의 시료를 사용하여 앰플리콘의 농도를 맞추어, 반응 용량당 앰플리콘을 함유하지 않거나 또는 하나의 앰플리콘을 함유하도록 만드는 것이 유용하다. 몇몇 경우, 추가의 증폭 시약(예를 들어, 폴리머라제)을 첨가하지 않고 사전 증폭 단계의 생성물을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 새로운 증폭용 시약, 예를 들어 상이한 프라이머를 첨가하는 것이 유용하다. 그러므로, 생체 시료는, 분배 이전 또는 이후에 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 참조 폴리뉴클레오티드 둘 다를 정량 증폭시키거나 또는 정량 증폭시키지 않기 위하여 선택된 시약들과 혼합할 수 있다(12; 제2 단계).

뿐만 아니라, 사전 증폭 단계는 일반적으로 PCR형 증폭 단계이지만, 제2 증폭 단계(즉, 사전 증폭 단계에서 생산된 앰플리콘 서열의 증폭 단계)는, 임의의 증폭 방법, 예를 들어 나스다(Nasba)(Compton, 1991. Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature 350: 91-91, 1991) 및 에버와인 프로토콜(Eberwine protocol)(Van Gelder외 다수, Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990)을 이용하여 수행될 수 있다.

전술한 바와 같이, DNA 주형 및 앰플리콘의 양(출발 게놈 DNA의 양, 증폭 사이클 횟수, 증폭 효율 및 반응 용량의 크기에 관한 함수)은 분배를 바람직하게 만들도록 맞추어질 것이다. 당업자는 사전 증폭 생성물 중 앰플리콘의 농도를 측정할 수 있으며, 적당한 주입량도 계산할 수 있다. 더욱 편리하게는, 사전 증폭 생성물의 연속 희석 세트가 테스트될 수 있다. 예를 들어 도 3에 도시된 디바이스[플루이다임 코포레이션(Fluidigm Corp.)에서 시판중인 바이오마크(BioMark) 12.765 디지털 어레이]는 12가지의 희석물을 동시에 테스트할 수 있다. 임의로는, 선형 회귀 플롯을 작성하여 최적 희석률을 결정할 수 있다. 최적 희석률을 구하기 위해서는, 선을 똑바로 그어서 시작점을 통과하도록 해야 한다. 그 후, 이 플롯으로부터 원 시료의 농도를 계산할 수 있다.

분배 후, 다수의 반응 챔버 내에 포함된 게놈 물질은 추후 시료 분석을 수행하도록 증폭될 수 있으며, 그 결과, 표적 서열 또는 참조 서열에 상응하는 앰플리콘이 분리된 반응 용량의 수를 측정할 수 있다(도 1의 14). 제2 증폭 단계는 사전 증폭 단계에서 사용된 것과 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머(예를 들어, 네스티드 세트(nested set))를 사용하여 수행될 수 있다.

시료의 차등적 검출 및 분석을 수행함으로써, 참조 폴리뉴클레오티드와 비교될 표적 폴리뉴클레오티드로부터 유래하는 신호를 구별할 수 있다(도 1의 16). 예를 들어 개별 반응 위치를 분석한 결과를 사용하여, 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 반응 용량의 수와 참조 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 반응 용량의 수의 비를 계산할 수 있다. 이 방법은 또한 피험체의 게놈 내에 존재하는 표적 서열에 관한 유전자 관련 정보를 검출 및 분석하는 단계들, 예를 들어 유전자 결실 또는 중복, 이형접합성 소실 등, 예를 들어 이수성(예를 들어, 3 염색체성)과 다수의 기타 유전적 이상성을 검출 및 분석하는 단계들을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 차등적 검출 기법과 분석 기법을 포함하는 방법의 단계들에 관한 추가의 설명을 이하에 제시하였다.

전술한 바와 같이, 사전 증폭 생성물 또는 증폭되지 않은 유전 물질을 함유하는 시료는 검출 및 분석 플랫폼의 별도 위치 또는 반응 용량에 분배될 수 있다. 시료의 분배, 예를 들어 다수의 소용량 반응 위치/챔버를 포함하는 미세유체 디바이스 내 유동 기반 분배는 다양한 기법과 디바이스들을 이용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 방법의 분배 단계를 수행함으로써, 관심있는 시료 물질, 예를 들어 표적 및 참고 서열을 개별 반응 위치에 분리하여, 추후 검출 및 분석에 이용하게 된다.

다수의 반응 위치 또는 용량 각각의 내부에서는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 선택된 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 다단계 반응 검출 정량 분석/증폭 단계를 포함하는 하나 이상의 증폭 분석을 수행할 수 있다. 시료 중 검출된 서열의 비는, 검출 기법, 예를 들어 디지털 PCR 분석법, 실시간 PCR 곡선의 모니터 및/또는 하나의 분석법 대 다른 분석법 간 포지티브 반응 챔버의 종말점 이미지들을 비교함으로써 계산될 수 있다. 대안적으로, DNA 시료 중 임의의 서열의 농도(카피수/㎕)는 그 서열의 하나 이상의 카피를 함유하는 디바이스 내 포지티브 반응 챔버의 수를 이용하여 계산할 수 있으며, 표적 서열과 참조 서열의 농도 비는 카피수를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 본 출원과 공동 계류중인 미국 특허 출원 제12/170414호(발명의 명칭: Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR)(본 출원은 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있음)를 참조할 수 있다. 또한, 모든 목적을 위하여 본원에 인용되어 있는 문헌[Dube외 다수, 2008, "Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device" PLoS ONE 3(8): e2876. doi:10.1371/journal.pone.0002876]을 참조할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은, 예를 들어 환자의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수 변이를 측정하기 위한 방법 및 증폭 기반 기법을 포함하며, 몇몇 경우에 있어서, 사전 증폭 단계를 수행한 후, 추후 정량 증폭 및 분석을 위해서 미세유체 디바이스 내에 시료를 분배할 수 있다. 예를 들어 하나의 표적 유전자의 다수 개의 카피가 동일한 염색체 상에 조밀하게 배치되어 있어서, 정량 분석시 표적 서열이 서로 최적으로 분할될 수 없을 경우에, 사전 증폭법이 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 표적 유전자의 다수의 카피는 2개의 분자보다는 하나의 분자로서 정량될 수 있거나 또는 실제보다 적게 측정될 수 있다. 그러므로, 유전자 카피의 총 수는 적게 계측될 수 있다.

본 발명에 따르면, CNV 계산은 통상적으로, 상이한 시료 중 유전자 카피수의 명확한 차이와, 왜곡 또는 분석 노이즈/오차, 예를 들어 시료의 양에 차이가 남으로써 발생하는 왜곡을 유리하게 구별하기 위해서, "상대 카피수"를 결정하는 것을 포함할 것이다. (게놈당) 유전자의 상대 카피수는, 환자의 게놈 내 농도(카피수)를 알고 있는 DNA 시료 중 단일 카피 참조 유전자의 카피수에 대한 표적 유전자의 카피수의 비(통상적으로 1)로서 표시될 수 있다. 동일한 디지털 어레이 상에 존재하는 2개의 상이한 표지(예를 들어, 형광 염료)를 사용하여 2개의 유전자(표적 폴리뉴클레오티드 및 참조 폴리뉴클레오티드)에 대한 2가지 분석법을 실시함으로써, 본원에 개시된 방법은 동일한 DNA 시료 중 두 개의 유전자를 동시에 정량하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 그리고 편리함은 떨어지지만, (사전 증폭 단계에서 유래한) 표적 앰플리콘은 반응 용량 세트를 구성하는 하나의 칩 상에서 증폭될 수 있으며, (사전 증폭 단계에서 유래한) 테스트 앰플리콘은 상이한 앰플리콘 세트 내에서 분석될 수 있고, 그 결과, 데이터가 비교될 수 있다. 이와 같은 2개의 유전자들의 비는 DNA 시료 중 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 관심있는 유전자의 상대 카피수이다. 한 접근법에서, 이 방법은, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(A)를 측정하는 것과, 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(B)를 측정하는 것, 및 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수가 약 (A)/(B)×N [여기서, N은 참조 서열의 소정의 게놈 카피수임]인지를 확인하는 것으로 요약될 수 있다. 상기 (A)/(B)×N은 약 카피수와 관련되어 있는데, 그 이유는, 대부분의 유기체 내 배수성이 낮고(예를 들어, 인간은 보통 체세포 염색체의 카피가 2개 존재함), 본 발명에서 검출된 앰플리콘의 수는 본질적으로 실험 오차에 영향을 받기 때문이다. 예를 들어 (A)는 실험에 의해 936으로 측정될 수 있고, (B)는 실험에 의해 596으로 측정될 수 있으며, N은 반수체 게놈당 1일 수 있다. (A)/(B)×N은 1.57(약 1.5)이며, 이는 반수체 게놈당 A의 카피수가 약 1.5임을 말해주는 것이다(즉, A의 3 염색체성). 도 8과 이하 실시예를 참조할 수 있다.

본 발명을 수행하는데 있어서는 다수의 검출 플랫폼 또는 미세유체 디바이스와 방법이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 디바이스는 다양한 재료, 예를 들어 유리, 플라스틱, 실리콘, 엘라스토머 중합체(예를 들어, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄 또는 기타 중합체)를 이용하여 구성될 수 있다. 본 발명의 임의의 구체예에서, 본 발명의 측면들을 수행하는 데 사용된 미세유체 디바이스들은 통상적으로, 최소한 일부는 엘라스토머 재료로 제작되며, 단층 및 다층 연식 석판술(MSL) 및/또는 희생 층(sacrificial layer) 캡슐화 방법에 의해서도 제작된다[예를 들어, Unger외 다수, 2000, Science 288:113-116, 및 PCT 특허 공보 WO 01/01025; 이 두 문헌은 모든 목적을 위하여 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용됨]. 이와 같은 방법을 이용함에 있어서, 엘라스토머 막 또는 분절에 의해 유동 채널(flow channel)과 분리된 하나 이상의 제어 채널(control channel)을 통하여, 상기 디바이스의 유동 채널을 통한 용액의 흐름을 적어도 부분적으로 제어하는 미세유체 디바이스가 디자인될 수 있다. 이러한 막 또는 분절은 제어 채널을 발동력(actuation force)을 걸어줌으로써 제어 채널을 결합하는, 유동 채널로 편향될 수 있거나 또는 이 유동 채널로부터 수축될 수 있다. 상기 막이 유동 채널로 편향되거나 또는 이로부터 수축되어 외부로 돌출되는 정도를 제어함으로써, 용액의 흐름은 느려지거나 또는 유동 채널을 완전히 차단할 수 있다. 이와 같은 유형의 유동 채널과 제어 채널을 통합함으로써, 문헌[Unger외 다수, 상동, PCT 특허 공보 WO 02/43615 및 WO 01/01025]에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 용액의 흐름을 조절하기 위한 상이한 유형의 밸브와 펌프를 다수 개 제조할 수 있다.

본원에 개시된 미세유체 디바이스에 시료를 분배하는 단계는, 부분적으로는 당업계에 일반적으로 인식되고 있는 엘라스토머 재료의 임의의 특성으로 인해 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌[Allcock외 다수, Contemporary Polymer Chemistry, 2nd Ed.]에는, 일반적으로 "엘라스토머" 또는 "엘라스토머 재료"란, 이것들의 유리 전이 온도와 액화 온도 사이의 온도에서 중합체로서 존재하는 것으로 정의되어 있다. 엘라스토머 재료는, 중합체 사슬이, 외력이 존재하지 않을 경우에 주쇄가 이전의 형태를 가지도록 다시 코일을 형성함과 아울러, 외력이 존재하면 주쇄 코일을 풀 수 있는 왜곡 작용을 용이하게 수행하므로, 탄성을 나타내게 되는 것이다. 일반적으로, 외력이 가하여지면 엘라스토머는 변형되지만, 이후 외력이 제거되면 다시 원래의 형태로 복구된다. 엘라스토머 재료에 의해 나타나는 탄성은 영률(Young modulus)로서 특징 지워질 수 있다. 본원에 개시된 미세유체 디바이스에 사용된 엘라스토머 재료는 통상적으로 영률이 약 1 Pa∼1 TPa이고, 다른 경우에는 약 10 Pa∼100 GPa, 또 다른 경우에는 약 20 Pa∼1 GPa, 또 다른 경우에는 약 50 Pa∼10 MPa이며, 임의의 경우에는 약 100 Pa∼1 MPa이다. 특정 용도에 따라서는 영률이 상기 범위 밖인 엘라스토머 재료도 사용될 수 있다.

중합체 화학, 전구체, 합성 방법, 반응 조건 및 잠재적인 첨가물은 상당히 다양할 수 있기 때문에, 임의의 용도와 분야에 대해서 광범위한 특성들이 선택될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 있어서, 모놀리식 엘라스토머 미량 밸브 및 펌프를 제조하는 데 사용될 수 있는 엘라스토머 시스템이 다수 존재한다. 본원에 개시된 미세유체 디바이스 중 일부는 엘라스토머 중합체, 예를 들어 GE RTV 615(제형), 비닐-실란 가교(유형) 실리콘 엘라스토머(군)로 제작된다. 그러나, 본 발명의 미세유체 시스템은 이와 같은 한 가지 제형, 유형 또는 이와 같은 중합체 군에 국한되지 않으며; 오히려, 임의의 엘라스토머 중합체가 적당하다. 재료 선택은 통상적으로 수행될 작업에 필요한 특정 재료의 특성(예를 들어, 용매 내성, 강성(stiffness), 가스 투과성 및/또는 온도 안정성)에 따라서 달라진다. 본원에 개시된 미세유체 디바이스의 구성 부분을 제조하는 데 사용될 수 있는 엘라스토머 재료들의 종류에 관한 부가 설명은, 본원에 모든 목적으로 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Unger외 다수 (2000) Science 288:113-116, 및 PCT 특허 공보 WO 02/43615 및 WO 01/01025]에 개시되어 있다.

디바이스의 제조 및 열 사이클링

전술한 바와 같이, 본 발명의 기법은 다양한 검출 플랫폼, 예를 들어 디지털 분석 또는 디지털 PCR에 적합한 고 처리량 미세유체 디바이스를 포함하는 검출 플랫폼을 이용하는 단계를 포함할 수 있다. 디바이스의 제조, 시스템 구성 부분 및 열 사이클링에 관한 양상을 이하에 더욱 상세히 기술하였다.

일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 적당한 미세유체 디바이스는 단층 및 다층 연식 리소그래피(MSL) 기법 및/또는 희생 층 캡슐화 방법을 이용하여 제작될 수 있다. 하나의 기본적인 MSL 연구법은, 기계가공 몰드(micromachined mold) 상에 일련의 엘라스토머 층들을 주조하는 단계, 이 몰드로부터 층들을 분리하는 단계 및 상기 층들을 함께 융합하는 단계를 포함한다. 희생 층 캡슐화 연구법에 있어서는, 채널이 필요한 곳마다 포토 레지스트 패턴이 침착된다. 이와 같은 기법들 및 미세유체 디바이스를 생산하는데 있어서의 용도에 관하여는 문헌[예를 들어, Unger외 다수 (2000) Science 288:113-116, 및 Chou,외 다수 (2000) "Integrated Elastomer Fluidic Lab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagnostics," Proceedings of the Solid State Actuator and Sensor Workshop, Hilton Head, S.C.; 및 PCT 특허 공보 WO 01/01025; 상기 문헌들은 각각 모든 목적을 위하여 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 더욱 상세히 기술되어 있다.

요약하면, 전술한 예시적인 조립 방법은, 처음에 상층(예를 들어, 제어 채널을 가지는 엘라스토머 층)과 하층(예를 들어, 유동 채널을 가지는 엘라스토머 층)에 대한 머더 몰드(mother mold)를 포토 레지스트(Shipley SJR 5740)를 이용하는 포토리소그래피에 의해 실리콘 웨이퍼 상에 조립하는 단계를 포함한다. 채널의 높이는 스핀 코팅률(spin coating rate)에 의해 정밀하게 조절될 수 있다. 포토레지스트 채널은 포토레지스트를 UV 광선에 노출시킨 후 현상함으로써 형성된다. 열 재역류 과정(heat reflow process) 및 보호 처리는 통상적으로 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용되어 있는 문헌[M. A. Unger, H.-P. Chou, T. Throsen, A. Scherer and S. R. Quake, Science (2000) 288:113]에 개시된 바와 같이 수행된다. 그 후, 혼합 2부 실리콘 엘라스토머(GE RTV 615)는 각각 회전되어 하부 몰드에 들어가게 되고, 상부 몰드에도 들어가게 된다. 스핀 코팅은 하부 중합 유체층의 두께를 조절하도록 이용될 수 있다. 부분적으로 경화된 상층은 80℃의 오븐에서 25분 동안 베이킹(baking)된 후 몰드로부터 벗겨져, 하층과 정렬 및 조립된다. 80℃에서 1시간 30분 동안 최종적으로 베이킹하여, 이와 같은 2개의 층들을 비가역적으로 결합시킨다. 일단 하부 실리콘 머더 몰드로부터 벗겨지면, 이 RTV 디바이스는 통상적으로 HCL(0.1N, 30분, 80℃)로 처리된다. 이와 같은 처리는 Si-O-Si 결합의 일부를 절단하여, 채널을 보다 친수성으로 만드는 하이드록시 기를 노출시키는 작용을 한다.

그 후, 상기 디바이스는 임의로는 지지체에 외부의 영향을 받지 않도록 밀봉될 수 있다. 밀봉은 주로 접착력에 의해 이루어지는 것인 만큼, 밀봉이 잘 되도록 하기 위해서는 상기 지지체의 표면이 편평해야 하겠지만, 이 지지체는 근본적으로 임의의 재료로 만들어질 수 있다. 적당한 지지체의 예로서는 유리 및 플라스틱 등을 포함한다.

전술한 방법에 의해 형성된 디바이스들은 유동 채널의 벽 중 하나를 형성하는 기판(예를 들어, 유리 슬라이드)을 생성하게 된다. 대안적으로, 일단 머더 몰드로부터 분리된 디바이스가 엘라스토머 박막에 밀봉되면, 유동 채널은 엘라스토머 재료로 완전히 밀봉되는 것이다. 이와 같이 형성된 엘라스토머 디바이스는 이후, 기판 지지체에 임의로 결합할 수도 있다.

층 형성

일 구체예에서, 미세유체 디바이스, 예를 들어 이 디바이스가 제조되는 동안 시약이 반응 위치에 침착되는 디바이스는 3개의 층으로 이루어져 있다. 하층은 시약이 침착되는 층이다. 이 하층은 상기 MSL 방법이 언급되어 있는 참고 문헌에 기술된 바와 같이 다양한 엘라스토머 재료로 제조될 수 있다. 통상적으로, 이 재료는 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머이다. 특정 디바이스용으로 바람직한 반응 위치의 배열과 그 위치를 바탕으로 하였을 때, 적당한 시약이 스팟팅(spotting)되어야 하는 하층 상의 위치를 결정할 수 있다. PDMS가 소수성이므로, 침착된 수성의 얼룩 스팟(spot)은 수축되어 매우 작은 스팟을 형성하게 된다. 전술한 바와 같이, 일단 상기 시약이 반응 위치에 도입됨에 따라서 시료 용액 중에 용해되는 성질이 있으므로, 임의로 침착된 시약은 공유 결합이 시약과 엘라스토머 표면 사이에 형성되지 않도록 침착된다.

상기 디바이스의 기타 2개의 층으로서는, 유동 채널이 형성되어 있는 층과, 제어 층과 임의로는 가드 채널(guard channel)이 형성되어 있는 층이 있다. 이와 같은 2개의 층은 본 섹션의 초반부에 제시되어 있는 일반적인 방법에 따라서 제조된다. 그 후, 결과로 형성된 2개의 층 구조는 시약들이 침착된 제1 층의 상부에 형성된다. 3층으로 구성된 복합 구조물의 구체예는 다음과 같이 구성되어 있다[성분 A 대 성분 B의 비]: 제1층(시료 층) = 30:1(중량 부); 제2층(유동 채널 층) = 30:1; 및 제3층(제어 층) = 4:1. 그러나, 기타 복합 구조물과 엘라스토머 성분들의 비도 활용될 수 있을 것이라 예상된다. 이러한 과정에 있어서, 반응 위치는 침착된 시약과 함께 배열되므로 상기 시약은 적당한 반응 위치 내에 들어간다.

본 발명에 따르면, 열 사이클링 관정은 미세유체 디바이스 상에서 수행될 수 있다. 특히, 열 사이클링 과정은 반응 챔버 내에 분배된 시료의 분석을 촉진하는 증폭 반응을 진행하는 데 이용될 수 있다.

미세유체 디바이스의 선택된 부위 내에서 또는 전체 디바이스에서 온도를 제어하기 위해서, 각양 각색의 정교화에 관한 상이한 사양들을 다수 이용할 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 온도 제어 디바이스란 용어는, 광범위하게는, 전체 미세유체 디바이스 또는 이 미세유체 디바이스의 일부의 내부(예를 들어, 특정 온도 부위 내 또는 블라인드 채널 유형의 미세유체 디바이스 매트릭스 내 하나 이상의 접합부)의 온도를 조절할 수 있는 디바이스 또는 구성 부분을 의미한다.

일반적으로, 상기 디바이스는 이 디바이스를 열 사이클링하는 열 사이클링 플레이트 상에 배치된다. 이와 같은 다수의 플레이트들은 상업적 공급처, 예를 들어 서모하이베이드(ThermoHybraid) P×2(Franklin, MA), MJ 리서치 PTC-200(South San Francisco, CA), 에펜도르프 파트# E5331(Westbury, NY), 테크니 파트# 205330(Princeton, NJ)로부터 용이하게 입수할 수 있다.

열 사이클링 단계의 정확성을 보장하기 위해서는, 이 디바이스의 다양한 부위의 온도를 감지하는 센서가 임의의 디바이스 내에 통합되어 있는 것이 유용하다. 온도를 감지하기 위한 하나의 구조물로서는 열 전대(thermocouple)가 있다. 이와 같은 열 전대는 내재 기재상에 패턴이 형성된 박막 와이어의 형태로서, 또는 미세 조립 엘라스토머 재료 자체에 직접 통합된 와이어의 형태로서 제조될 수 있었다.

다양한 온도 측정/모니터 수단이 본 발명의 시스템/디바이스에 포함될 수 있다. 예를 들어 온도는 전기 저항의 변화를 통하여 감지될 수도 있다. 열 감지 변색 재료(thermo-chromatic material)는 증폭 디바이스의 부위들 상에서 온도를 감지할 수 있는 또 다른 유형의 구조물이다. 온도를 감지하는 다른 수단으로서는 적외선 카메라를 사용하는 것이 있다. 온도 감지를 위한 또 다른 수단으로서는 초 전기 센서를 사용하는 것이 있다. 기타 전기 현상, 예를 들어 전기 용량 및 유도 계수를 활용하여 본 발명의 구체예에 따라 온도를 감지할 수 있다. 열 확산성에 관하여 알려진 등식과, 이 디바이스에 사용된 엘라스토머 및 유리에 대한 적당한 수치를 이용하여, 반응 위치 내 온도를 제어기가 유지하고자 하는 온도에 도달하도록 만드는 데 필요한 시간을 계산할 수 있다.

잠재적으로 적당한 물질의 다양한 조성 및 특성 이외에, 본 발명에 사용될 적당한 미세유체 디바이스는 다수의 특징, 디자인 및 채널 구조 등을 포함할 수 있다. 디바이스는 통상적으로 용액이 흐를 수 있는 유동 통로(flow path)라 칭하여지는 "유동 채널"을 복수개 포함할 것이다. 뿐만 아니라, 상기 디바이스는 "제어 채널(control channel)", 즉 유동 채널과 경계를 형성하도록 디자인된 채널을 포함할 수 있으며, 이를 통하여, 이것들이 상기 유동 채널 내 흐름을 추진하는 데 사용될 수 있다. 디바이스는 또한 유속을 추가로 조절하는 구조물, 예를 들어 "밸브"를 포함할 수도 있는데, 여기서, 상기 밸브는 유동 채널과 제어 채널이 교차하고, 구동력에 반응하여 유동 채널로 편향되어 들어가거나 또는 이 유동 채널에서 수축될 수 있는 엘라스토머 막에 의해 분리되는 형태를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 구체예는 상기 디바이스의 외부 입구와 하나 이상의 유동 채널 사이에서 유체가 출입할 수 있도록, 엘라스토머 디바이스 내에 형성된 채널을 의미하는 "바이어(via)"를 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 바이어는, 예를 들어 시료의 입력 또는 출력 수단으로서 사용될 수 있다.

본 발명에서는 여러 가지 종류의 채널 구조 또는 디자인이 이용될 수 있다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 본 발명의 디바이스에 포함될 수 있는, 채널 디자인의 하나의 유형은 개방 채널 디자인(open channel design)을 포함한다. "개방 채널(open channel)" 또는 "개방 말단부 채널(open-end channel)"이란, 분리된 바이어 사이에 배치되어, 출구(예를 들어, 배출구)와 분리된 입구(예를 들어, 입수구)를 가지는 유동 채널을 의미한다. 일반적으로, 개방 채널 네트워크 디자인은 2개 이상의 반향(opposing) 유동 채널 바이어 또는 입수구를 포함하는데, 이것은 하나 또는 다수의 분지 유동 채널을 연결시켜 개방 채널 네트워크를 형성할 수 있다. 인접/중첩 제어 채널에 의해 형성된 하나 이상의 밸브는 분지 채널의 개별 부위들을 분리하여, 반응 위치들을 형성하도록 구동될 수 있다. 이와 같은 밸브는 다수의 반응 위치들을 교환 가능하도록 분리하는 기작을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 디바이스들은 하나 이상의 채널로부터 분지된 하나 이상의 개방 유동 채널을 포함할 수 있다. 하나 이상의 반응 부위 또는 반응 위치는 유동 채널의 길이를 따라서 존재하는 임의의 위치에 배치될 수 있다. 중첩 유동 채널에 의해 형성된 밸브는 상기 채널을 따라서 배치되어 있는 반응 위치(들)를 분리하도록 구동될 수 있으며, 이로써, 반응 위치들을 교환 가능하도록 분리하는 메커니즘들이 제공된다. 그러므로, 각각의 디바이스는 다수의(예를 들어, 10,000개 이상의) 반응 위치들을 포함할 수 있으며, 반응 위치 밀도도 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 디바이스는 통상의 미세유체 디바이스에 비하여 그 크기가 상당 수준 감소할 수 있다. 예를 들어 개방 채널 디자인은 하나 이상의 위치/바이어로부터 어드레스(address)될 수 있는 분지형 유동 채널을 가질 수 있다. 이와 같은 디자인 양상은, 예를 들어 특정 채널/분지형 유동 채널이 (예를 들어, 제조시 변형 및 결점으로 인해) 폐색되거나 차단될 경우 특히 유리할 수 있는데, 그 이유는, 상기 유체가 상이한 방향에서 들어와서, 구체적으로 차단 또는 폐색이 일어난 반대 방향 면에 이르기까지 채널을 채울 수 있기 때문이다. 이와는 반대로, 차단이 발생한 오직 하나의 말단부와 접근 가능한 채널은 차단 또는 폐색이 일어난 지점까지 채워질 수 있으며, 만일 반응 위치가 상기 차단이 발생한 부위 위일 경우 상기 위치는 쓸모없이 될 수 있다.

도 2b에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라서 사용하기 적당한 미세유체 디바이스는 "블라인드 채널(blind channel)" 또는 "블라인드 필(blind fill)" 디자인을 이용할 수 있다. 이와 같은 디바이스는 부분적으로 하나 이상의 블라인드 채널, 또는 막다른 말단부 또는 분리된 말단부를 가져서, 용액이 한쪽 말단에 있는 블라인드 채널로만 도입 및 배출될 수 있는 것을 특징으로 한다[즉, 블라인드 채널에 대한 별도의 입수구 및 배출구는 존재하지 않음]. 이와 같은 디바이스는 분리된 반응 위치를 형성하기 위해서 블라인드 채널 부위를 분리시키는 각각의 블라인드 채널에 대한 하나의 밸브만을 필요로 한다. 이와 같은 유형의 디바이스를 제조함에 있어서, 하나 이상의 분석용 시약은 반응 위치에 침착될 수도 있으며, 이로써, 주입 및 배출 횟수를 상당 수준 감소시킬 수 있다. 그러므로, 블라인드 채널과 소통하는 유동 채널 네트워크는, 다수의 반응 위치가 하나 또는 제한된 수의 입수구(예를 들어, 5개 미만 또는 10개 미만)로 채워질 수 있도록 형태를 갖출 수 있다. 상기 디바이스는 충분히 다공성이어서, 용액이 상기 채널로 도입됨에 따라서 유동 채널 및 블라인드 채널 내 공기가 이 공극을 빠져나갈 수 있으므로, 블라인드 유동 채널을 충전하는 능력을 가질 수 있다. 기타 미세유체 디바이스 내에 사용된 재료가 다공성이 아니면, 블라인드 채널 디자인을 사용하지 않아도 되는데, 그 이유는, 용액이 주입될 때 블라인드 채널 내 공기가 빠져나갈 길이 없기 때문이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 미세유체 디바이스는 유동 채널 및 밸브 또는 제어 채널 이외에도 가드 채널(guard channel)을 추가로 포함할 수도 있다. 본원에 제공된 엘라스토머 미세유체 디바이스로부터 시료와 시약이 증발하는 것을 감소시키기 위해서는, 상기 디바이스에 다수의 가드 채널을 만드는 것도 가능하다. 가드 채널은, 통상적으로 유동 채널 및/또는 반응 위치를 중첩시키는 엘라스토머 층 속에 형성된다는 점에서 제어 채널과 유사하다. 그러므로, 제어 채널과 같이, 가드 채널은 엘라스토머 재료로 만들어진 막 또는 분절에 의해 내재 유동 채널 및/또는 반응 위치로부터 분리된다. 그러나, 제어 채널과는 달리, 상기 가드 채널은 횡단면적이 상당히 작다. 일반적으로, 표면적이 작은 막은, 동일한 압력이 가해지는 경우, 표면적이 큰 막에 비하여 편향 정도가 작을 것이다. 가드 채널은 압력이 가해질 때 용액(통상적으로 물)이 가드 채널로 흘러갈 수 있도록 디자인된다. 가드 채널로부터 유래하는 수증기는 유동 채널 또는 반응 위치에 인접하여 존재하는 엘라스토머 공극으로 확산될 수 있으므로, 유동 채널 또는 반응 위치와 인접한 곳에서의 수증기 농도가 증가하게 되며, 이로부터 용액이 증발하는 것을 감소시킨다. 미세유체 디바이스에 배치되어 있고 본 발명에 따라 사용하기 적당한 가드 채널에 관한 보다 상세한 설명은, 본원에 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[McBride외 다수, 미국 특허 출원 공보 20050252773]을 참조할 수 있다.

본 발명의 디바이스는 시약이 반응할 수 있는 다수의 반응 위치 또는 반응 용량을 추가로 포함하며, 이 디바이스는 반응 위치들을 선택적으로 분리시키기 위한 여러 가지 수단들(예를 들어, 펌프 및 밸브)이 통합되어 있을 수 있다. 반응 위치는 디바이스 내 다수의 상이한 위치 중 어느 하나의 위치에 존재할 수 있다.

본 발명의 디바이스는 광학적으로 비교적 투명한 엘라스토머 재료를 포함할 수 있기 때문에, 본질적으로 미세유체 디바이스 상 임의의 위치에서 다수의 상이한 검출 시스템을 사용함으로써 반응을 용이하게 모니터할 수 있다. MSL형 디바이스를 사용할 때에는, 가장 통상적으로 반응 위치 자체에서 검출이 진행될 수 있다. 이러한 디바이스가 실질적으로 투명한 재료로 제조된다는 사실은 또한, 임의의 검출 시스템이, 통상의 실리콘 기반 미세유체 디바이스와는 함께 사용될 수 없는 본 발명의 디바이스와 함께 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 디바이스에 통합되어 있거나, 이 디바이스로부터 분리되어 있되 검출될 디바이스의 특정 부위와 함께 정렬되어 있는 검출기를 사용하여 검출을 진행할 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에서, 반응 용량 내 반응은, 처음에 칩과 다른 시스템 구성 부분들로부터 분리된 용액 중에서 (예를 들어, 시료와) 혼합된 후, 용액에 도입되는 시약 또는 혼합물을 사용하여 진행된다.

디바이스는 통상적으로 온도 제어 반응, 예를 들어 열 사이클링 증폭 반응을 수행하도록 디자인 및 배열될 것이다. 그러므로, 이 디바이스는 반응 용량 내 온도 제어 반응(예를 들어, 열 사이클링 반응)에 사용하도록 배열/디자인될 수 있다. 디바이스, 예를 들어 엘라스토머 디바이스 또는 이의 일부는 지지체(예를 들어, 유리 슬라이드)에 고정될 수 있다. 결과로 생성된 구조물은 이후, 예를 들어 다수의 반응 위치에서 그곳의 온도를 제어하도록 온도 제어 플레이트 상에 배치될 수 있다. 열 사이클링 반응의 경우, 이 디바이스는 다수의 열 사이클링 플레이트 중 임의의 것에 배치될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법을 수행하기 위해서는 다양한 디바이스의 특징과 디자인을 활용하여 미세유체 디바이스를 사용할 수도 있다. 이하, 다수의 분석법, 예를 들어 온도 제어가 필요한 분석법(예를 들어, 핵산 증폭 반응)을 수행하기 위해 이용될 수 있는 대표적인 배열에 관하여 더욱 상세히 기술하였다. 그러나, 이러한 배열은 예시적인 것이며, 이 시스템의 변형 예는 당업자에게 명백할 것임을 이해해야 할 것이다.

도 3은 본 발명의 대표적인 구체예에 의한 미세유체 디바이스의 개략도이다. 도 3에 도시한 바와 같이, 디지털 어레이라고도 칭하여지는 미세유체 디바이스는 캐리어(carrier, 20)를 포함할 수 있는데, 이 캐리어는 본 발명의 미세유체 디바이스의 다양한 구성 부분에 대한 지지체로서 적당한 재료로 만들어질 수 있다. 예를 들어 본 디바이스는 엘라스토머 중합체를 사용하여 제조된다. 이 디바이스의 외부 부분은 표준 384웰 마이크로플레이트와 동일한 홈(footprint)을 가지므로, 자립형 밸브 작동이 가능하다. 이하에 기술한 바와 같이, 이 부분에는 본 디바이스에 대한 12개의 개별 시료 주입물에 상응하여 12개의 주입구가 존재한다. 상기 디바이스는 12개의 패널(22)을 가질 수 있는데, 이 12개의 패널은 각각 패널당 총 용량이 4.59 ㎕인 765.6 nL들이 반응 챔버를 포함할 수 있다. 이하 더욱 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 미세유체 채널(24)은 패널 상 다수의 반응 챔버들을 유체 공급원에 연결해줄 수 있다.

반응 챔버들을 유체 공급원에 연결시키는 밸브를 개방 및 폐쇄하기 위하여, 압력을 축열기(accumulator; 26)에 가할 수 있다. 도 3에 도시한 바와 같이, 12개의 입수구(28)는 시료 시약 혼합물을 로딩하기 위해 제공될 수 있다. 48개의 입수구(28)는, 압력이 축열기(26)에 가하여질 때 바이오칩에 공급되는 시약의 공급원을 제공하는 몇몇 경우에 사용된다. 시약을 사용하지 않는 경우, 입수구(28) 및 시약 측면 축열기(26)는 사용할 수 없다. 뿐만 아니라, 도 3에 도시된 대표적인 구체예(바이오칩에 수분을 공급하는 디바이스)에는 입수구(30)가 2개 존재한다. 수분 공급 입수구(30)는 반응 챔버와 결합된 디바이스와 소통하는 유체 중에 잠겨 있어서, 습기를 용이하게 제어한다. 당업자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 디바이스의 조립에 사용된 몇몇 엘라스토머 재료는 기체가 투과할 수 있어서, 반응 챔버로부터 증발된 기체 또는 증기가 엘라스토머 재료를 통과하여 주변 대기로 빠져나갈 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 디바이스의 주변 부분에 위치하는 유체 라인은 수화액, 예를 들어 완충액 또는 마스터 혼합물의 차폐 막을, 반응 챔버들의 패널을 감싸고 있는 바이오칩의 주변부에 제공하므로, 반응 챔버에 존재하는 액체의 증발을 감소 또는 방지한다. 그러므로, 상기 디바이스의 주변부 습기는, 휘발성 액체, 예를 들어 수분을 수분 공급 입수구(30)에 첨가함으로써 증가할 수 있다. 특정 구체예에서, 첫 번째 입수구는 바이오칩의 첫 번째 면에 있는 패널 주위의 수분 공급 유체 라인과 소통하는 유체 속에 잠겨있으며, 두 번째 입수구는 바이오칩의 다른 쪽 면에 있는 패널 주위의 수분 공급 유체 라인과 소통하는 유체 속에 잠겨있다.

전술한 디바이스 및 시료 분배에 관한 사항들은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 하나의 예시적인 시스템에 불과하지만, 당업자는 본원에 개시된 미세유체 디바이스 디자인에 대한 다수의 대안, 변형 및 변이를 줄 수 있음을 알 것이다. 예를 들어 도 3에 도시된 미세유체 디바이스는 12개의 패널[이것들은 각각 반응 챔버당 용량이 6 nL인 반응 챔버를 765개 가짐]을 포함하지만, 이는 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 디지털 어레이의 구체적인 형태는 구체적인 용도에 따라서 달라질 것이다. 그러므로, 예를 들어 본 발명의 범위는 765개의 반응 챔버를 가지는 12개의 패널이 존재하는 디지털 어레이에 한정되는 것은 아니며, 기타 구성 부분들의 조합도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 구체예에 사용하기 적당한 디지털 어레이와 관련된 추가 설명은, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 출원 공보 2005/0252773에 개시되어 있다.

다수의 동일한 시료(replicate sample)들을 대상으로 분석을 수행함에 있어서는 다량의 시약을 필요로 할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 디지털 PCR은 미세 용량으로 수행된다. 저용량 PCR을 진행하기 위한 반응 챔버는 약 2∼약 500 nL일 수 있다. 반응 챔버의 용량이 작아질수록, 진행될 수 있는 각각의 분석법의 횟수는 증가하게 된다[상이한 프로브 및 프라이머 세트를 사용하거나, 동일한 프로브 및 프라이머 세트를 여러 가지로 사용하거나, 또는 반복 수행 횟수와 상이한 분석법들의 수행 횟수를 임의로 바꿔줌]. 일 구체예에서, 본 발명의 반응 챔버의 용량은 약 2∼약 50 nL, 바람직하게는 2∼약 25 nL, 더욱 바람직하게는 약 4∼약 15 nL이다. 몇몇 구체예에서, 반응 챔버의 용량은 약 4 nL, 약 5 nL, 약 6 nL, 약 7 nL, 약 8 nL, 약 9 nL, 약 10 nL, 약 11 nL, 또는 약 12 nL이다. 시료 챔버는 유리, 플라스틱, 실리콘, 엘라스토머 중합체, 예를 들어 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄, 또는 기타 중합체로 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 처리된 시료는 바이오마크(BioMark)™ 시스템[Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA]을 사용하는 다양한 카피수 분석에 사용하기 적당하다. 상기 바이오마크™ 시스템은 다수의 시료들을 대상으로 분석법을 다수 회 수행할 수 있는 폴리디메틸실록산 미세유체 디바이스를 이용한다.

플루이다임 미세유체 디바이스(디지털 어레이)는 플루이다임 코포레이션(South San Francisco, CA)에 의해 제조된다. 칩은 다층 연식 리소그래피(Multilayer Soft Lithography; MSL) 방법[Unger MA, Chou HP, Thorsen T, Scherer A, Quake SR, Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography, Science 2000; 288:113-116]에 따라서 조립된다. 상기 칩은 평균 반 타원 반 단축(semi-elliptical depth)이 10 ㎛이고, 장축(width)이 70 ㎛이며, 중앙으로부터 200 ㎛ 간격으로 평행을 이루고 있는 시료 채널들을 가진다. 시료 유체 역학에 의해서, 각각의 시료 채널을 따라 배열되어 있는, 265 ㎛(깊이)×150 ㎛×150 ㎛인 분할 챔버를 2층 몰드 가공을 통해 제작한다. 분리된 실리콘층 상에, 칩의 제어 채널은 시료 채널에 수직으로 뻗어있다. 채널의 교차부는 전달 유체(routing fluid)에 대한 편향 밸브(deflective valve)를 형성한다. 제어 채널에 압력을 가함에 따라서, 층간 박막은 시료 채널을 차단하여, 개별 분할 챔버들을 분리시킨다. 제어 채널의 깊이는 15 ㎛이고, 폭은 50 ㎛이며, 중앙에서 300 ㎛의 간격으로 평행하게 나열되어 있다.

반응 혼합물, 예를 들어 PCR 혼합물, 시료 혼합물, 사전 증폭 생성 시료 혼합물을 각각의 패널에 로딩한 다음, 단일 DNA 분자들을 다양한 반응 챔버에 무작위로 분할하여 넣는다. 패널과 반응 챔버에 로딩한 후, 디지털 어레이를 열 사이클링한 다음, 적당한 판독기, 예를 들어 바이오마크™ 기기(본 발명의 양수인에 의해 시판)상에 이미지를 형성할 수 있다. 본 발명의 양수인이 시판하고 있는 디지털 PCR 분석 소프트웨어 또는 기타 적당한 분석 소프트웨어를 사용하여 얻어진 데이터를 분석한다. 본 발명의 구체예에 사용하기 적당한 분석 기법 및/또는 대표적인 검출 기법에 관한 부가 설명은, 본원과 공동 계류중이고 전체가 양도된 미국 특허 출원 공보, 즉 미국 특허 출원 제12/170,414호(발명의 명칭: "Copy Number Variation Determination by Digital PCR")(모든 목적을 위하여 본원에 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있다.

도 4a∼4c는 도 3에 도시된 디바이스/바이오칩의 일부를 간략하게 나타낸 도면이다. 도 4a에는 12개의 패널(22)이 도시되어 있는데, 이들 패널은 각각 다수의 반응 챔버들을 포함한다. 도 4b는 패널에 포함된 다수의 반응 챔버들(40)에 관한 기하학적 형태를 나타내는 것이다. 반응 챔버(40)는 도면에 도시된 바와 같이 중앙에서 200㎛의 간격으로 배치되어 있다. 도 4c에는 패널 일부의 형광 이미지가 도시되어 있다. 도 4c의 좌측은 제어 구획으로서, 반응 챔버를 전부 어둡게 나타냈다. 도 4c의 우측은 통상의 실험에서 반응 챔버 중 얼마나 많은 수의 챔버가 어두운 색(42)을 띠는지를 나타내는 것으로서, 여기서, 형광은 거의 발광되지 않는다. 그러나, 반응 챔버의 일부는 형광을 발광하며, 이를 "포지티브" 반응 챔버(44)라 칭한다. 도 2b에 관하여 전술한 바와 같이, 시료 채널은 좌→우로 뻗어 있어서, 각각의 반응 챔버를 연결시키며, 제어 채널은 하층의 상부에서 하부로 뻗어있다. 제어 채널에 압력이 가하여지면, 층간 박막은 시료 채널을 차단하여 각각의 반응 챔버를 분리시킨다. 밸브는 PCR 실험 중 계속 차단된 상태를 유지하는 각각의 챔버들을 분할한다.

본 발명의 명세서를 통하여 더욱 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 칩은 열 사이클링되어 바이오마크™ 실시간 PCR 시스템(본 발명의 양수인이 시판) 상에 이미지를 형성하였으며, 디지털 PCR 분석 소프트웨어, 예를 들어 바이오마크™ 디지털 PCR 분석 소프트웨어(본 발명의 양수인이 시판)가 각각의 패널에 존재하는 포지티브 챔버의 수를 계수하는 데 사용되었다. 2개의 형광 염료를 사용하는 2가지 분석법이 다중 디지털 PCR 반응에서 실시될 때, 2개의 유전자는 독립적으로 정량될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 디지털 어레이를 사용하는 카피수 변이에 대해 연구하기 위해서, 유전자를 독립적으로 정량하는 능력을 이용한다. 단일 PCR 반응에서 독립적으로 정량될 수 있는 유전자의 수는 형광 염료의 수와 사용 가능한 필터에 따라서 달라진다.

상기 일반적인 방법에 관하여 기술한 바와 같이, 시료 분배 후에 행하여지는 부가의 단계들로서는, 증폭 단계와, 이 증폭 결과의 검출 및 분석 단계를 포함한다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 2개의 단계들을 통합한 방법, 예를 들어 정량 PCR을 이용하여 증폭 및 검출/분석 단계를 수행할 수 있다. 일반적으로, 각각의 반응 위치에서 분리된 폴리뉴클레오티드는 일정 범위의 수행 가능한 기법들을 이용하여 증폭, 검출 및 분석될 수 있다. 하나의 대표적인 기법은, 표적 및 참조 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜, 증폭된 생성물을 표적 폴리뉴클레오티드의 농도와 참조 폴리뉴클레오티드의 농도를 측정하는 데 사용할 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 증폭을 수행하기 위하여 증폭에 필요한 시약들을 시료와 혼합하는데, 이 경우, 이 시약들은 폴리뉴클레오티드 증폭에 적합한 조건 하에서, 표적 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화하는 제1 프로브와, 참조 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화하는 제2 프로브를 포함할 수 있다. 제1 프로브 및 제2 프로브는 검출 가능한 상이한 표지들을 포함할 수 있으며, 그 결과, 표적과 참조 폴리뉴클레오티드 증폭 생성물 간 구별이 가능해진다. 뿐만 아니라, 표적 폴리뉴클레오티드 및 참조 폴리뉴클레오티드를 구별하여, 참조 뉴클레오티드 분자의 비로서 표적 뉴클레오티드 분자의 농도를 계산하고, 그 결과, 피험체의 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정할 수 있다.

증폭 후 검출 및 분석 단계에 관한 일반적인 단계들은 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 명세서를 통하여 개시된 방법 및 시스템에 관한 이해를 돕기 위해, 이하에서는 당업계에서 일반적으로 사용되는 용어를 사용한다. "시약(reagent)"이란 용어는, 광범위하게는 반응에 사용되는 임의의 제제를 의미한다. 시약은 그 자체가 모니터될 수 있는 하나의 제제(예를 들어, 가열됨에 따라서 모니터되는 물질) 또는 2개 이상의 제제들의 혼합물을 포함할 수 있다. 시약은 생물(예를 들어, 세포) 또는 무생물일 수 있다. 핵산 증폭 반응에 사용되는 대표적인 시약으로서는 완충액, 금속 이온, 폴리머라제, 프라이머, 주형 핵산, 뉴클레오티드, 표지, 염료 및 핵산 분해 효소 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효소 반응에 사용되는 시약으로서는, 예를 들어 기질, 보조 인자, 커플링 효소, 완충액, 금속 이온, 억제 인자 및 활성화 인자를 포함한다. 세포 기반 반응에 사용되는 시약으로서는 세포, 세포 특이 염료 및 세포 수용체에 결합하는 리간드(예를 들어, 작동제 및 길항제)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 시약은 시료 용액에 포함될 수 있거나, 또는 다양한 수단으로(예를 들어, 공유 결합, 비공유 결합 또는 적당한 링커 분자를 통해) 고정될 수도 있다. 칩 상 핵산 증폭 반응에 있어서, 예를 들어 연장 반응을 수행하는 데 사용된 하나 이상의 시약은, 디바이스 제조시 (예를 들어, 스팟팅)을 통해 각각의 반응 위치에 침착될 수 있다.

"표지"란 용어는, 물리적, 화학적, 전자기적 기법 및 기타 관련된 분석 기법에 의해 검출될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 사용될 수 있는 검출 가능한 표지의 예로서는 방사성 동위 원소, 형광단, 발색단, 단체 표지(mass label), 전자 고밀도 입자, 자성 입자, 스핀 표지, 화학 발광하는 분자, 전기 화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조 인자, 핵산 프로브 및 효소 기질과 결합된 효소를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. "검출 가능하도록 표지화된"이란 용어는, 제제가 표지와 접합되어 있는 경우, 또는 제제가 별도의 표지에 접합하지 않아도 검출될 수 있도록 만드는 고유의 특성(예를 들어, 크기, 모양 또는 색)을 일부 가지는 경우를 의미한다.

본원에서 사용된 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"란 용어는, 임의의 길이를 가지는 뉴클레오티드의 중합체 형, 예를 들어 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 용어들 간에 길이에 따른 의도적인 구별은 없다. 뿐만 아니라, 이와 같은 용어들은 분자의 1차 구조만을 의미하는 것이다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 이와 같은 용어들은 3중, 2중 및 단일 사슬 DNA 뿐만 아니라, 3중, 2중 및 단일 사슬 RNA를 포함할 수도 있다. 상기 용어들은 또한 메틸화 및/또는 캡핑에 의해 변형된 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드의 변형되지 않은 형태의 것도 포함한다. 더욱 구체적으로, "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어에는, (2-데옥시-D-리보스를 함유하는) 폴리데옥시리보뉴클레오티드, (D-리보스를 함유하는) 폴리리보뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드 또는 C-글리코시드인 임의의 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 비뉴클레오티드 주쇄, 예를 들어 폴리아미드[예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)]를 함유하는 기타 중합체와, 폴리모폴리노(Anti-Virals, Inc. 시판, Corvallis, Oregon, Neugene) 중합체, 및 기타 합성 서열 특이 핵산 중합체를 포함하되, 단, 상기 중합체는 염기 쌍 형성 및 염기 스택킹(base stacking)이 가능한 형태로 배열된 핵산 염기, 예를 들어 DNA와 RNA에서 발견되는 핵산 염기를 함유한다.

"프로브"는 일반적으로 수소 결합 형성에 의한, 일반적으로 상보성 염기 쌍 형성을 통해, 한 가지 이상의 화학 결합을 형성함으로써, 상보성 서열의 표적 핵산에 결합해서, 이중체 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 위치"에 결합 또는 하이브리드화한다. 프로브는 특히, 프로브가 그것의 상보성 표적과 하이브리드화하면, 검출 가능한 표지로 표지화될 수 있으며, 이로써 상기 프로브의 검출을 촉진할 수 있다. 프로브에 부착된 표지는 당업계에 공지된 다수의 상이한 표지들(예를 들어, 화학적 수단이나 물리적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지들) 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 프로브에 부착될 수 있는 적당한 표지로서는 방사성 동위 원소, 형광단, 발색단, 단체 표지, 전자 고밀도 입자, 자성 입자. 스핀 표지, 화학 발광하는 분자, 전기 화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조 인자 및 효소 기질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로브는 크기가 매우 다양할 수 있다. 몇몇 프로브는 그 길이가 비교적 짧다. 일반적으로, 프로브는 길이가 7∼15 뉴클레오티드이다. 기타 프로브는 길이가 20, 30 또는 40 뉴클레오티드 이상이다. 또 다른 프로브는 어느 정도 길이가 긴데, 50, 60, 70, 80 및 90 뉴클레오티드 이상이다. 또 다른 프로브는 그 길이가 상기의 경우보다 더욱 긴데, 100, 150 및 200 뉴클레오티드 이상이다. 프로브는 구체적으로 그 길이가 상기 범위 내에 포함되는 임의의 것일 수 있다.

"프라이머"는 적당한 완충액 및 적당한 온도에서, 적절한 조건[즉, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트와 중합 제제, 예를 들어 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 역 전사 효소의 존재] 하에 주형 유도 DNA 합성의 개시 점으로서 작용할 수 있는 단일 사슬 폴리뉴클레오티드이다. 프라이머의 적당한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 따라서 달라지지만, 통상적으로는 7 뉴클레오티드 이상, 더욱 통상적으로는 10∼30 뉴클레오티드이다. 기타 프라이머는 그 길이가 약간 길 수 있는데, 예를 들어 30∼50 뉴클레오티드 정도로 길 수 있다. 길이가 짧은 프라이머 분자가 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해서는 온도가 더욱 낮아야 한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확히 상응할 필요는 없으나, 주형과 하이브리드화하기에 충분히 상보성이어야 한다. "프라이머 위치" 또는 "프라이머 결합 위치"란 용어는, 프라이머가 하이브리드화하는 표적 DNA의 분절을 의미한다. "프라이머 쌍"이라는 용어는, 프라이머 세트, 예를 들어 증폭될 DNA 서열의 5' 말단의 상보체와 하이브리드화하는 5' "상류 프라이머"와, 증폭될 서열의 3' 말단과 하이브리드화하는 3' "하류 프라이머"를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.

"완전히 상보성인" 프라이머란, 프라이머 전체가 완전히 상보성인 서열로서, 미스매치 부위가 존재하지 않는 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 통상적으로 표적 서열의 일부(부분 서열)와 완전히 상보성이다. "미스 매치"란, 어느 위치가 프라이머 내 뉴클레오티드 및 그것과 함께 배열되어 있는 표적 핵산 내 뉴클레오티드가 상보성이 아닌 경우를 의미한다. 프라이머와 관련하여 사용될 때, "실질적으로 상보성인"이란 용어는, 프라이머가 그것의 표적 서열에 완전히 상보성이지 않은 대신에, 이 프라이머가, 원하는 프라이머 결합 위치에서 그것의 각 사슬에 선택적으로 하이브리드화하기에 충분히 상보성인 경우를 말한다.

"상보성"이란 용어는, 하나의 핵산이 다른 핵산 분자와 동일하거나 또는 다른 핵산 분자에 선택적으로 하이브리드화하는 경우를 의미한다. 하이브리드화의 선택성은 전체적으로 특이성이 존재하지 않는 경우보다 더욱 선택적인 하이브리드화가 일어나는 경우에 존재한다. 통상적으로, 선택적 하이브리드화는, 길이가 약 14∼25 뉴클레오티드 이상인 확장부(stretch)에 비하여 동일성이 약 55% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상인 경우에 일어난다. 바람직하게, 하나의 핵산은 다른 핵산과 특이적으로 하이브리드화한다. 문헌[M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)]을 참조할 수 있다.

검출은 "검출 구획(detection section)" 또는 "검출 부위(detection region)"에서 진행된다. 이와 같은 용어와 기타 관련 용어들은 검출이 진행되는 미세유체 디바이스의 일부분에 해당한다. 전술한 바와 같이, 임의의 디자인(예를 들어, 개방 채널 디자인, 블라인드 채널 디자인 등)을 이용하는 디바이스에 있어서, 검출 구획은 일반적으로 각각의 반응 위치들과 결합하고 있는 밸브에 의해 분리된 반응 위치이다. 매트릭스 기반 디바이스의 검출 구획은 일반적으로, 교차부에 인접하여 존재하는 유동 채널의 특정 부위, 교차부 그 자체 또는 교차부와 주변 부위를 포함하는 부위 내에 존재한다.

전술한 바와 같이, 대표적인 카피수 변이 분석은 칩 상에서 행하여지는 정량 PCR법을 이용하여 수행될 수 있다. 특히, 정량 PCR은 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계와, 증폭된 생성물을 검출/분석하는 단계를 둘 다 포함할 수 있다. qPCR에 더하여, 소위 "실시간 증폭법" 또는 "실시간 정량 PCR법"이라 칭하여지는 다수의 방법도, 증폭 과정 진행 중 또는 진행 후에 형성된 증폭 생성물의 양을 측정함으로써, 시료 중에 존재하는 표적 핵산의 양을 측정하는 데 이용될 수 있다. 형광 발생 핵산 분해 효소 분석법은 본원에 개시된 디바이스를 사용하여 성공적으로 활용될 수 있는 실시간 정량법에 관한 일 구체예이다. 증폭 생성물의 형성 여부를 모니터하는 방법은, 이중 표지화 형광 발생 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 PCR 생성물 축적량을 연속적으로 측정하는 단계를 포함한다[이러한 방법을 문헌에서는 종종 "TaqMan" 방법이라 칭하기도 함].

이와 같은 분석법에 사용된 프로브는 통상적으로, 2개의 상이한 형광 염료로 표지화된 짧은(예를 들어, 길이가 약 20∼25 염기인) 폴리뉴클레오티드이다. 이 프로브의 5'-말단은 통상적으로 리포터 염료에 부착되며, 3'-말단은 소광 염료에 부착되는데, 여기서, 상기 염료들은 프로브의 다른 위치에 부착될 수도 있다. 이 프로브는 표적 핵산 상의 프로브 결합 위치와 적어도 실질적 서열 상보성을 가지도록 디자인된다. 프로브 결합 위치에 측접하는 부위와 결합하는 상류 및 하류 PCR 프라이머는 또한 본 발명의 반응 혼합물에 포함된다.

프로브가 변형되지 않은 상태인 경우, 2개의 형광단 사이에 에너지 전이가 일어나며, 이때, 소광 인자는 리포터의 발광을 소광시킨다. PCR의 연장 단계가 진행되는 동안, 프로브는 핵산 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제의 5' 핵산 분해 활성에 의해 절단되므로, 폴리뉴클레오티드-소광 인자로부터 리포터가 방출되고, 그 결과, 적당한 검출기에 의해 측정될 수 있는 리포터 발광 강도가 증가하게 된다.

형광의 발광, 예를 들어 형광 발생 분석법에서 발생하는 형광을 측정하기 위해 특히 고안된 하나의 검출기로서는, 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이션(Applied Biosystems Inc.; Foster City, CA)에 의해 제조된 ABI 7700이 있다. 이 디바이스에 제공된 컴퓨터 소프트웨어는 증폭 과정에 걸쳐 발생하는 리포터와 소광 인자의 형광 강도를 기록할 수 있다. 그 후, 이와 같이 기록된 수치들은 정규화된 리포터 발광 강도의 증가량을 연속적으로 계산하고, 궁극적으로는 증폭되는 mRNA의 양을 정량하는 데 사용될 수 있다.

증폭 생성물의 농도를 실시간으로 측정하는 형광 발생 방법에 관한 이론과 이의 실행에 관한 부연 설명을, 예를 들어 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[미국 특허 제5,210,015호(Gelfand), 동 제5,538,848호(Livak외 다수), 그리고 동 제5,863,736호(Haaland)와, Heid, C.A.외 다수, Genome Research, 6:986-994 (1996); Gibson, U.E.M,외 다수, Genome Research 6:995-1001 (1996); Holland, P. M.,외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, (1991); 및 Livak, K.J.,외 다수, PCR Methods and Applications 357-362 (1995)]에 기술하였다. 그러므로, 증폭 반응이 진행됨에 따라서, 점점 다량의 염료가 결합하게 되고, 그에 따라서 신호가 증가한다.

칩 상에서 증폭 분석을 수행할 경우, 열 사이클링 과정 동안, 예를 들어 다수의 프라이머(각각 관심 있는 특정 표적 핵산에 특이적임)(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 참조 폴리뉴클레오티드 서열)를 사용하여, 하나의 반응 위치 내에서 다수의 증폭법들을 수행할 수 있다. 증폭된 상이한 생성물의 존재 여부는, 정량 RT-PCR 반응을 수행하기 위해 차등적으로 표지화된 프로브를 사용하여 확인할 수 있거나, 또는 차등적으로 표지화된 분자 비콘(beacon)을 사용함으로써 확인할 수 있다[상기 문헌 참조]. 이와 같은 연구법에서, 각각 차등적으로 표지화된 프로브는 증폭된 특정 표적에만 하이브리드화하도록 디자인된다. 이용되는 상이한 표지들을 신중히 선택함으로써, 상이한 표지가 하나의 반응 중 상이한 파장에서 여기 및/또는 검출되는 분석법이 수행될 수 있다. 이와 같은 연구법에서 사용하기 적당한 형광 표지의 선택에 관한 추가의 지침으로서는 문헌[Fluorescence Spectroscopy (Pesce외 다수, Eds.) Marcel Dekker, New York, (1971); White외 다수, Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Press, New York, (1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976); Indicators (Bishop, Ed.). Pergamon Press, Oxford, 19723; 및 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992)]을 포함한다.

미세유체 디바이스, 예를 들어 개방 채널 또는 블라인드 채널 디자인 디바이스는 핵산 증폭 반응을 수행하는 데 사용되며, 반응 위치에 침착될 수 있는 시약은 목적으로 하는 유형의 증폭 반응을 수행하는데 필요한 시약들이다. 일반적으로, 이는 곧, 예를 들어 프라이머, 폴리머라제, 뉴클레오티드, 금속 이온, 완충액 및 보조 인자와 같은 성분들 중 일부 또는 전부가 침착된다는 것을 의미한다. 이와 같은 경우 반응 위치에 도입된 시료는 핵산 주형이다. 그러나, 대안적으로, 주형은 침착될 수 있으며, 증폭 시약은 반응 위치로 유입될 수 있다. 매트릭스 디바이스가 증폭 반응을 수행하는 데 사용될 때, 핵산 주형을 함유하는 시료는 수직 유동 채널을 통해, 그리고 증폭 시약은 수평 유동 채널을 통해 유입될 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.

일반적으로, 각각의 반응 위치에서 유전자형 분석 및 발현 분석을 복수회 수행할 수 있다. 표적 DNA를 함유하는 시료는 미세유체 디바이스 상 반응 위치에 도입될 수 있다. 정량 PCR 방법, 예를 들어 TaqMan®에 있어서, 관심있는 표적 DNA의 상이한 부위들을 증폭하기 위한 프라이머를 단일 반응 위치 내에 포함시킨다. 각각의 부위에 대해 차등적으로 표지화한 프로브를, 형성된 생성물, 예를 들어 표적 및 참조 폴리뉴클레오티드를 구별하는 데 사용한다. 만일 프로브와 상보성인 대립 유전자가 표적 DNA에 존재하면 증폭이 진행되고, 그 결과, 검출 가능한 신호가 발생한다. 차등 신호 중 어느 것이 얻어지느냐에 따라서, 다형성 위치에 있는 뉴클레오티드의 동일성을 확인할 수 있다. 만일 두 개의 신호가 검출되면, 두 개의 대립 유전자가 존재하는 것이다. 상기 온도 제어 섹션에 기술한 바와 같이, 반응 중에 열 사이클링 과정이 진행된다.

본 발명의 몇몇 구체예에서, 각각의 대립 유전자 형에 상보성이며, 차등적으로 표지화된 프로브는 프라이머, 뉴클레오티드 및 폴리머라제와 함께, 시약으로서 포함될 수 있다. 하나의 프로브만을 사용하면, 신호가 발생하지 않는 이유가 특정 대립 유전자가 존재하지 않기 때문인지, 아니면 단순히 반응이 실패하였기 때문인지 여부를 명확히 알 수 없지만, 반응은 단 하나의 프로브만을 사용하여 진행될 수 있다. 2개의 대립 인자들이 다형성 위치가 될 수 있는 통상의 쌍 대립 인자의 경우, 차등적으로 표지화된 2개의 프로브(각각의 프로브는 대립 인자 중 어느 하나와 완전히 상보성임)는 일반적으로, 증폭 프라이머, 뉴클레오티드 및 폴리머라제와 함께 시약 혼합물에 포함된다.

도 4c에 도시한 바와 같이, 각각의 반응 위치로부터 신호가 검출되며 이 신호를 추가로 분석하면 이 시료에 대한 정보를 얻어낼 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 처리된 시료는 바이오마크™ 시스템(Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA)과, 바이오마크™ 형광 이미지 형성 열 사이클링 시스템을 이용하는 다양한 카피수 분석법에 적합하다. 상기 바이오마크™ 시스템은 다수의 시료를 대상으로 하는 분석법을 복수회 수행할 수 있는 폴리디메틸실록산 미세유체 디바이스를 이용한다.

본 발명의 명세서에 보다 자세히 기술되어 있는 바와 같이, 몇몇 구체예에서 칩은 열 사이클링될 수 있고, 또한 본 발명의 양수인이 시판하고 있는 바이오마크™ 실시간 PCR 시스템 상에 이미지를 형성할 수 있으며, 디지털 PCR 분석 소프트웨어, 예를 들어 바이오마크™ 디지털 PCR 분석 소프트웨어(본 발명의 양수인에 의해 시판중)를 사용하여 각 패널 내에 존재하는 포지티브 챔버의 수를 계수하였다. 2개의 형광 염료를 이용하는 2가지 분석법이 다중 디지털 PCR 반응에 사용될 때, 2개의 유전자는 독립적으로 정량될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 이와 같이 유전자를 독립적으로 정량할 수 있는 능력을 이용하여, 디지털 어레이를 사용하는 카피수 변이에 대해 연구할 수 있다.

일반적으로 전술한 바와 같이, 반응 혼합물, 예를 들어 PCR 혼합물을 각각의 패널에 로딩할 수 있으며, 단일 DNA 분자들을 다양한 반응 챔버에 무작위로 분할할 수 있다. 패널과 반응 챔버에 로딩한 후, 디지털 어레이를 열 사이클링한 다음, 적당한 판독기, 예를 들어 바이오마크™ 디바이스(본 발명의 양수인에 의해 시판) 상에 이미지를 형성시킨다. 디지털 PCR 분석 소프트웨어(본 발명의 양수인에 의해 시판) 또는 기타 적당한 분석 소프트웨어를 사용하여, 얻어진 데이터를 분석한다.

전술한 바와 같이, 칩 상 정량 PCR을 통해서 본 발명의 임의의 구체예를 수행할 수 있다. 그러나, 전술한 미세유체 디바이스를 이용하여 다수의 상이한 검출 기법들을 수행할 수 있다. 시스템은 부분적으로, 디바이스, 검출되는 현상 및/또는 제제의 종류에 따라 적당한 것으로 선택되는 것으로 알려져 있다. 검출기는 다수의 상이한 유형의 신호, 예를 들어 방사성 동위 원소, 형광단, 발색단, 전자 고밀도 입자, 자성 입자, 스핀 표지, 화학 발광하는 분자, 전기 화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조 인자, 핵산 프로브 및 효소 기질과 결합된 효소로부터 얻어지는 신호를 검출하도록 디자인될 수 있다.

예시적인 검출 방법으로서는 광 산란법, 다중 채널 형광 검출법, UV 및 가시 파장 흡수법, 발광법, 차등 반사율 검출법 및 공 초점 레이저 스캐닝을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 임의의 분야에 사용될 수 있는 부가의 검출 방법으로서는 섬광 근접 측정 기법, 방사 화학 검출법, 형광 편광법, 형광 상관 분광학(FCS), 경시 해상 에너지 전이법(time-resolved energy transfer; TRET), 형광 공명 에너지 전이법(FRET) 및 이의 변법, 예를 들어 생물 발광 공명 에너지 전이법(BRET)을 포함한다. 부가의 검출 사양으로서는, 전기 저항, 저항률, 임피던스 및 전압 감지를 포함한다.

검출 섹션은 하나 이상의 현미경, 다이오드, 광 자극 디바이스(예를 들어, 레이저), 광전자 배증관, 프로세서를 함께 사용하거나, 이 디바이스들을 조합하여 사용함으로써[이 경우, 특정 현상 및/또는 제제와 관련된 신호를 검출할 수 있도록 함께 작동함] 진행될 수 있다. 종종 검출되는 신호는 광학 검출기에 의해 검출 섹션에서 검출되는 광학 신호이다. 광학 검출기는 하나 이상의 광 다이오드(예를 들어, 애벌랜치 광 다이오드(avalanche photodiode), 예를 들어 광전자 배증관과 연결된 광섬유 광선 가이드, 현미경 및/또는 비디오 카메라(예를 들어, CCD 카메라)를 포함할 수 있다.

검출기는 미세유체 디바이스 내에 미세 제조(microfabricate)될 수 있거나, 또는 별도의 구성 부분일 수 있다. 만일 검출기가 별도 구성 부분으로서 존재하면, 미세유체 디바이스는 다수의 검출 섹션을 포함할 것이며, 임의의 순간에 단일 검출 섹션 내에서 검출이 진행될 수 있다. 대안적으로, 스캐닝 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어 임의의 자동화된 시스템은 미세유체 디바이스와 관련하여 광 공급원을 스캔하며; 다른 시스템은 검출기에 대해 발광된 광선을 스캔하거나 또는 다중 채널 검출기를 포함한다. 특정 구체예의 일례로서, 미세유체 디바이스는 변형 가능한 단에 부착되어 현미경의 대물 렌즈 하에서 스캔될 수 있다. 그 후, 이렇게 해서 얻어진 신호는 프로세서로 전송되고, 여기서 신호 분석 및 처리가 진행된다. 광전자 배증관 어레이도 사용할 수 있다. 부가적으로, 상이한 검출 섹션 전부로부터 신호를 수집함과 동시에, 각 섹션에서 얻어진 신호를 측정하는 능력을 가지는 광학 시스템을 사용할 수 있다.

제공된 디바이스는 완전히 또는 거의, 모니터하는 파장에서 광학적으로 투명한 재료로 만들어졌기 때문에 외부 검출기를 사용할 수도 있다. 이와 같은 특징으로 인하여, 본원에 개시된 디바이스를 통상의 실리콘 기반 미세유체 디바이스와 사용할 수 없는 다수의 광학 검출 시스템에서 사용할 수 있게 된다.

일 구체예에서, 검출기는 CCD 카메라와 광학 경로[각각의 반응 챔버로부터 수집된 광선의 양을 최대화하기 위해 광 시야와 다수의 공극을 제공함]를 이용한다. 이러한 관점에서, 상기 CCD는 광 검출기 어레이로서 사용되는데, 이 경우, 각각의 픽셀 또는 픽셀 군은 어레이의 이미지를 형성하기 위해 사용되는 것이라기보다는 반응 챔버와 상응하는 것이다. 그러므로, 이미지 품질이 떨어지거나 초점이 흐려지게 되어, 각각의 반응 챔버로부터 더욱 많은 양의 광선을 수집하도록 광학 시스템 장의 깊이가 증가하도록, 광학 특성을 변경할 수 있다.

검출기는 검출 가능한 신호를 발생시키는 리포터를 자극하기 위한 광 공급원을 포함할 수 있다. 이용된 광 공급원의 유형은 활성화되는 리포터의 특성에 따라서 부분적으로 달라진다. 적당한 광 공급원으로서는 레이저, 레이저 다이오드 및 고 강도 램프를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 만일 레이저가 사용되면, 이 레이저는 검출 섹션 세트 또는 단일 검출 섹션을 통과하여 스캔하는 데 사용될 수 있다. 레이저 다이오드는 미세유체 디바이스 자체로 미세 조립될 수 있다. 대안적으로, 레이저 다이오드는 열 사이클링 반응을 수행하는 데 사용되는 미세유체 디바이스에 인접하여 위치하는 다른 디바이스에 조립되어 들어갈 수 있으며, 그 결과, 이 다이오드로부터 나오는 레이저 광선은 검출 섹션으로 향하게 된다.

검출 방법은 또한 다수의 비 광학적 방법들을 포함할 수 있다. 예를 들어 검출기는 또한 온도 센서, 전도율 센서, 전위차 측정 센서(예를 들어, pH 전극) 및/또는 전류 측정 센서(예를 들어, 산화 및 환원 반응 모니터용)를 포함할 수도 있다.

시판중인 다수의 외부 검출기가 사용될 수 있다. 형광 표지화된 시약을 제조하는 것이 용이하므로, 이 검출기 중 다수는 형광 검출기이다. 사용 가능한 검출기의 구체예로서는 어플라이드 프레시젼 어레이 WoRx(Applied Precision ArrayWoRx)(Applied Precision, Issaquah, WA)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 구체예에서, FRET 기반 검출 방법이 사용된다. 이러한 유형의 검출 방법은, 공여체/수여체 형광단 쌍 중에서 공여체(리포터) 및/또는 수여체(소광 인자) 형광단으로부터 유래하는 형광의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 공여체 및 수여체 형광단 쌍은, 공여체의 발광 스펙트럼이 수여체의 여기 스펙트럼과 중첩하는 것으로 선택된다. 그러므로, 형광단 쌍이 서로 충분히 가까이 있도록 배치될 때, 공여체로부터 수여체로 에너지가 전이될 수 있다. 이와 같은 에너지 전이는 검출될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,945,283호 및 PCT 특허 출원 공보 WO 97/22719를 참조할 수 있다.

분자 비콘(Molecular Beacon)을 이용하여 특히 유용한 연구를 수행할 수 있다. 분자 비콘을 이용할 경우, 이것이 증폭된 생성물의 상보성 부위에 하이브리드화됨에 따라서 검출 가능한 신호가 발생하게 될 때, 프로브의 형태가 변하게 된다. 프로브 그 자체는 2개의 섹션[즉, 5'-말단에 존재하는 하나의 섹션과 3'-말단에 존재하는 다른 섹션]을 포함한다. 이와 같은 섹션들은 프로브 결합 위치에 어닐링되는 프로브의 섹션에 측접하며, 또한 서로 상보성이다. 하나의 말단 구획은 통상적으로 리포터 염료에 부착되고, 다른 말단 구획은 일반적으로 소광 인자 염료에 부착된다.

용액 중, 상기 2개의 말단 구획은 서로 하이브리드화되어, 헤어핀 루프를 형성한다. 이와 같은 배열로서, 리포터 및 소광 인자 염료는 충분히 가까이 근접하게 되는데, 이로써, 리포터 염료로부터 유래하는 형광은 소광 인자 염료에 의해 효과적으로 소광된다. 이와는 반대로, 하이브리드화된 프로브는 선형화된 형태를 띠게 되며, 그 결과, 소광 정도가 감소하게 된다. 그러므로, 2가지 염료의 발광도 변화를 모니터함으로써 증폭 생성물의 형성 여부를 간접적으로 모니터할 수 있다. 이와 같은 유형의 프로브와 이 프로브를 사용하는 방법에 관하여는 모든 목적을 위하여 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[Piatek, A. S.,외 다수, Nat. Biotechnol. 16:359-63 (1998); Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nature Biotechnology 14:303-308 (1996); 및 Tyagi, S.외 다수, Nat. Biotechnol. 16:49-53 (1998)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.

기타 널리 공지된 증폭/검출 방법(본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아님)으로서는 인베이더(Invader; Neri, B.P.,외 다수, Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826:117-125, 2000); 나스바(Nasba;, 예를 들어 Compton, J. Nucleic Acid Sequence-based Amplification, Nature 350: 91-91, 1991); 스콜피온(Scorpion; Thelwell N.,외 다수 Nucleic Acids Research, 28:3752-3761, 2000); 및 전기 용량 DNA 검출법(Capacitive DNA Detection;, 예를 들어 Sohn,외 다수, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:10687-10690)을 포함한다. 이들 참고 문헌들은 각각 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 다양한 시약, 조성물, 완충액 및 첨가물 등을 필요로 하는 다양한 반응/증폭 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 반응 혼합물은 적어도 부분적으로 분석 플랫폼 또는 미세유체 칩/디바이스와는 분리되거나, 또는 디바이스 그 자체의 반응 위치 내에서 제조될 수 있다(예를 들어, 스팟팅). 임의의 반응 혼합물 또는 조성물은 제조되어, 키트 또는 시스템의 일부로서 포함될 수 있다. 예를 들어 시스템은 사전 증폭 혼합물/조성물, 증폭 분석 조성물과, 증폭 및 카피수 검출 분석을 수행하기 위한 미세유체 디바이스를 포함할 수 있다. 상기 시스템 중 2개 이상의 구성 부분들은 키트 또는 시스템의 일부로서 조립되어 제공될 수 있다.

본원에 개시된 미세유체 디바이스를 사용하여 수행하는 반응에서는 다양한 시약들, 완충액, 조성물, 첨가물 등도 사용할 수 있는데, 이 물질들을 본 발명의 반응(예를 들어, 사전 증폭, 정량 증폭 등)을 수행하기 위해 제제화할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 시약이 침착된 디바이스의 경우, 시약은, 예를 들어 반응 위치에서 하나 이상의 반응물과 함께 스팟팅될 수 있다. 다른 구체예에서, 예를 들어 칩 상 스팟팅이 일어나지 않을 때, 시약은 칩이나 기타 시스템의 구성 부분으로부터 분리된 혼합물이나 시약 용량에 제공될 수 있다. 첨가물의 하나의 세트로서는 엘라스토머 기질 상 단백질 결합 위치를 차단하는 차단 시약이 있다. 이와 같이 다양한 화합물, 예를 들어 다수의 상이한 단백질(예를 들어, 젤라틴 및 다양한 알부민 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민)과 글리세롤을 사용할 수 있다. 계면활성제 첨가물도 유용할 수 있다. 다수의 상이한 계면활성제 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 그 예로서는, SDS 및 다양한 Triton 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

핵산 증폭 반응에 관한 구체예에서, 상이한 유형의 다수 시약 및/또는 첨가물이 포함될 수 있다. 상기 유형 중 하나의 유형으로서는 증폭 반응을 촉진하는 인핸서가 있다. 이러한 첨가물로서는 핵산의 2차 구조를 환원시키는 시약(예를 들어, 베타인)과, 미스프라이밍(mispriming) 현상을 감소시키는 제제(예를 들어, 염화테트라메틸암모늄)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일반적으로, CNV 계산은 "상대 카피수"를 바탕으로 할 수 있으므로, 상이한 시료 중 유전자 카피수의 표면상 차이는 시료의 양에서 나타나는 차이에 의해 왜곡되지 않는다. (게놈당) 유전자의 상대 카피수는, DNA 시료 중 표적 유전자의 카피수 대 단일 카피 참조 유전자의 카피수 비(통상적으로 1)로서 나타낼 수 있다. 동일한 디바이스 상에서 2개의 상이한 형광 염료와 2개의 유전자(표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 참조 폴리뉴클레오티드 서열)를 사용하는 2가지 분석을 수행함으로써, 동일한 DNA 시료 중 2개의 유전자를 동시에 정량할 수 있다. 그러므로, 2개의 유전자의 비는 DNA 시료 중 표적 뉴클레오티드 서열의 상대 카피수이다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 사전 증폭 과정은 참조 유전자, 예를 들어 RN아제 P를 사용하여 수행될 수 있는데, 여기서, 상기 유전자는 RN아제 P 효소, 즉 리보핵산 단백질의 RNA 부분을 코딩하는 단일 카피 유전자이다.

다수의 동일한 시료들을 대상으로 실험을 수행함에 있어서는 상당량의 시약이 필요할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 디지털 PCR은 미세 용량 규모로 수행된다. 저용량 PCR을 진행하기 위한 반응 챔버들은 약 2∼약 500 nL일 수 있다. 반응 챔버의 용량이 작을수록, 수행될 수 있는 각각의 분석법[상이한 프로브와 프라이머 세트를 이용하거나, 또는 동일한 프로브 및 프라이머 세트의 복제본, 또는 다수의 복제본과 다수의 상이한 분석법을 임의로 조합하여 수행]의 횟수가 증가하게 된다. 일 구체예에서, 반응 챔버의 용량은 약 2∼약 50 nL, 바람직하게는 2∼약 25 nL, 더욱 바람직하게는 약 4∼약 15 nL이다. 몇몇 구체예에서, 상기 반응 챔버의 용량은 약 4 nL, 약 5 nL, 약 6 nL, 약 7 nL, 약 8 nL, 약 9 nL, 약 10 nL, 약 11 nL 또는 약 12 nL이다. 시료 챔버는 유리, 플라스틱, 실리콘, 엘라스토머 중합체 예를들어, 폴리디메틸실록산, 폴리우레탄 또는 기타 중합체로 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 처리된 시료들은 바이오마크™ 시스템(Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA)을 이용하는 다양한 카피수 분석법에서 사용하기 적당하다. 상기 바이오마크 시스템에서는 다수의 시료를 대상으로 분석법을 복수회 실시하는 데 사용되는 폴리디메틸실록산 미세유체 디바이스를 사용한다.

플루이다임 디바이스/나노유체 칩(디지털 어레이)과 바이오마크 형광 이미지 형성 열 사이클링 시스템은 플루이다임 코포레이션(South San Francisco, CA)에 의해 제조된다. 도 5에 예시한 바와 같은 칩은 12개의 패널을 가지며, 이 12개의 패널들은 각각 패널당 총 용량이 4.59 ㎕인 챔버들(765.6nL)을 보유한다. 칩은 다층 연식 리소그래피(MSL) 방법에 따라서 조립된다[Unger MA, Chou HP, Thorsen T, Scherer A, Quake SR. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 2000; 288:113-116]. 상기 칩은 반 타원의 반 단축이 평균 10 ㎛이고, 장축이 70 ㎛이며, 중심에서 200 ㎛ 간격으로 평행으로 배열된 시료 채널들을 갖는다. 시료 유체 공학에 의해서, 각 시료 채널을 따라 배열되어 있는 분할 챔버들[265 ㎛(깊이)×150 ㎛×150 ㎛]을 제조하도록 2층 몰드 공정을 구성한다. 별도의 실리콘층 상에 있어서, 칩의 제어 채널은 시료 채널에 수직 방향으로 뻗어있다. 상기 채널들의 교차부는 전달 유체에 대한 편향 밸브를 형성한다. 제어 채널에 압력을 가할 때, 층간 박막은 시료 채널을 차단하여 각각의 분할 챔버들을 분리시킨다. 제어 채널의 깊이는 15 ㎛이고, 폭은 50 ㎛이며, 중심에서부터 300 ㎛ 간격으로 평행하게 배열되어 있다. 외부에는 표준 384웰 미세 플레이트와 동일한 홈이 존재하고, 이로써 밸브가 자립하여 작동할 수 있게 된다. 12개의 별도 시료 주입물(칩으로의 주입물)에 상응하여 12개의 주입구가 존재한다. 사용된 칩은 시료 주입물당 765.6 nL의 분할 챔버를 포함하는데, 여기서, 칩당 챔버의 수는 총 14,400개 이하이다. 이와 같은 특정 구체예에서, 시료 채널은 좌→우 방향으로 뻗어있어 각각의 반응 챔버들을 연결시키고, 제어 채널은 하층 내 상부→하부의 방향으로 뻗어있다. 제어 채널에 압력이 가하여지면, 층간 박막은 시료 채널을 차단하며, 그 결과, 각각의 반응 챔버들이 분리된다. 상기 밸브는 PCR 실험이 진행되는 동안 폐쇄된 상태를 유지하는 각각의 챔버들을 분할한다.

실시간 PCR 반응을 진행시킴에 있어서, 마스터 증폭 혼합물(예를 들어, "마스터 혼합물")을, 사전 증폭 분석법의 생성물을 포함하는 시료와 혼합한다. 마스터 혼합물은 적당한 완충액, 미그네슘 이온(Mg2+)의 공급원[약 1∼약 10 mM, 바람직하게는 약 2∼약 8 mM] 및 뉴클레오티드를 함유하며, 임의로는 계면활성제 및 안정화제를 함유한다. 하나의 적당한 완충액의 예로서는 TRIS 완충액이 있으며, 이것의 농도는 약 5∼약 85 mM이고, 바람직하게는 10∼30 mM이다. 일 구체예에서, TRIS 완충액의 반응 혼합물(세기가 2배(2×)인 형태) 중 농도는 20 mM이다. 반응 혼합물의 pH 범위는 약 7.5∼약 9.0일 수 있으며, 통상적인 pH 범위는 약 8.0∼약 8.5이다. 뉴클레오티드의 농도는 약 25∼약 1000 mM의 범위에 있을 수 있으며, 통상적으로는 약 100∼약 800 mM의 범위에 있을 수 있다. dNTP 농도는, 예를 들어 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 및 800 mM이다. 계면활성제, 예를 들어 Tween™ 20, Triton® X 100 및 Nonidet™ P40도 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 안정화제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT, 클레란트(Cleland) 시약) 또는 머캅토에탄올도 포함될 수 있다.

뿐만 아니라, 마스터 혼합물은 임의로는 dUTP와 우라실 DNA 글리코실라제(우라실-N-글리코실라제, UNG)를 함유할 수도 있다. UNO는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) ung 유전자의 생성물로서, 이. 콜라이 내에서 클로닝, 서열 결정 및 발현되었다. 우라실-DNA-N-글리코실라제(UNG)는 DNA 당-포스포디에스테르 주쇄를 파괴하지 않고, DNA(단일 사슬 및 이중 사슬)로부터 우라실을 제거하므로; 하이브리드화 표적 또는 DNA 폴리머라제에 대한 주형으로서 사용될 수 없다. 결과로 형성된 무 염기 위치(abasic site)는 고온에서 진행되는 가수 분해에 의해 영향을 받기 쉽다. 그러므로, 우라실 염기를 제거하면, 일반적으로 DNA가 단편화되어 버린다[Duncan, B. K., and Chambers, J. A. (1984) GENE 28, 211, Varshney, U., Hutcheon, T., and van de Sande, J. H. (1988) 1. Biol. Chem. 263, 7776]. 마스터 혼합물은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(Foster City, CA)로부터 시판되고 있다[TaqMan® Universal Master Mix, cat. nos. 4304437, 4318157 및 4326708]. UNG는 통상적으로 디지털 PCR 분석법에서만 사용되고, 사전 증폭 분석법에서는 사용되지 않을 것이다.

다양한 분야에서, 상이한 유전자를 정량하기 위해서 별도의 프라이머 또는 프로브를 표지화하는데에는 상이한 형광 리포터 염료가 사용된다. PCR을 복수회 실시하는 상대 발현 연구를 위해서, 참조 유전자(예를 들어, β-액틴 또는 GAPDH)에 대한 프라이머의 양은, 참조 유전자와 시료 유전자 증폭시 서로 경쟁이 일어나는 것을 막도록 제한하여야 한다. 일반적으로, 참조 유전자 프라이머의 최종 농도는 25∼100 nM이다. 최적화를 위해서 프라이머를 적정하는 것이 유용할 수 있다.

[실시예]

본 발명의 대표적인 일 구체예에서, CYP2D6의 카피수는 사전 증폭 단계를 거치거나 또는 거치지 않고 측정하였다. 사전 증폭 단계를 수행하였을 경우, 하나의 시료 중 CYP2D6은 중복되는 것을 알 수 있었고(카피수 = 3), 반면에, 사전 증폭 단계를 수행하지 않았을 경우에는 상기 시료와 동일한 시료의 카피수는 2이었다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 시료를 이용하여 PCR 분석을 수행하는데 유용한 PCR 마스터 혼합물은 다음과 같은 조성을 가지도록 제조될 수 있다: 2O mM Tris, pH 8.0, 10O mM KCl, 1% 글리세롤, 0.04% Tween™, 5 mM MgCl₂, 40O mM dNTPs, 0.08 U/㎕ 앰플리택(AmpliTaq)® 골드 효소(Applied Biosystems, Foster City, CA). 앰플리택 DNA 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제를 재조합한 것이다. 이것은 이. 콜라이 숙주 내에서 Taq DNA 폴리머라제 유전자를 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 천연 TaqDNA 폴리머라제와 같이, 이는 엔도뉴클레아제와 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지는 않지만, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 갖는다.

일 실시예에서 사전 증폭 단계는 1× PreAmp 마스터 혼합물(Applied Biosystems, CA), 225 nM 프라이머(RN아제 P, 참조 폴리뉴클레오티드) 및 관심 있는 표적 서열과, 1 ㎕의 DNA 시료를 함유하는 5 ㎕ 반응물 중 진앰프(GeneAmp) PCR 시스템 9700(Applied Biosystems, CA) 상에서 수행되었다. 열 사이클링 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분(핫 스타트) → 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분(10 사이클). 사전 증폭 단계를 수행한 후 각각의 반응물에 20 ㎕의 물을 첨가하고, 이 시료를 디지털 어레이 상에서 분석하였다.

5개의 코리엘(Coriell) DNA 시료를 디지털 칩 상에서 분석하였다. 바이오마크 디지털 PCR 분석 소프트웨어[푸아송 상관 관계(Poisson correction)와 시만트 알고리즘(Simant algorithm)을 이용하는 소프트웨어]를 사용하여, 각 시료의 동일한 용량(4.59 ㎕) 중 CYP2D6 및 RN아제 P 분자의 수를 계수하였다[Dube외 다수, 상동]. 각각의 열 지도를 도 5에 간단히 흑백으로 도시하였다. 예시의 목적으로 백색, 흑색 및 회색으로 나타내긴 하였지만, RN아제 P 유전자(VIC, 황색), CYP2D6 유전자(FAM, 적색) 및 유전자가 존재하지 않는 경우에 상응하는 현상들을 기록하고, 이를 각각 황색, 녹색 또는 적색과 같은 색상을 사용하여 그래프로 나타낼 수 있다. 패널1과 패널 12에서는 주형 대조군(NTC)이 전개되지 않았다.

5개의 시료들에 대해서 CYP2D6 유전자의 분자수 대 RN아제 P 유전자의 분자 수에 대한 비를 구하였다. 상기 비 중 2개는 약 0.5였는데, 이는, 이들 2개의 시료를 구성하는 각각의 세포 내에 CYP2D6 유전자 중 카피가 하나만 존재함을 의미하는 것이다[RN아제 P는 단일 카피 유전자로서, 각 세포 내에는 항상 유전자 카피가 2개씩 존재함]. 그러므로, DNA 시료를 수집한 개체들은 한 염색체 상에 CYP2D6 유전자가 결실되어 있어야 한다. 기타 3개의 시료들의 비는 약 1이지만, 밀접하게 연관된 2개의 카피들은 하나의 분자에 존재할 것이며 또한 분리될 수 없기 때문에, 상기와 같은 결과는 중복의 가능성을 배제한 것이 아니다. 이러한 5개의 시료들을 대상으로 하여 사전 증폭 반응을 수행하였으며, 사전 증폭 생성물을 디지털 칩 상에서 분석하였다(표 2).

유전자의 염색체 중복을 구별하기 위한 사전 증폭의 이용
시료	디지털 PCR CYP2D6/RN아제 P	사전 증폭-디지털 PCR CYP2D6/RN아제 P	CYP2D6의 카피수
NA12155	0.49	0.52	1
NA12872	0.97	0.87	2
NA07357	0.85	0.98	2
NA12873	0.49	0.52	1
NA11994	1.06*	1.49*	3
* 시료 NA11994는 한 염색체 상에 CYP2D6 유전자의 중복을 가짐

상기 표 2에 기재된 바와 같이, 게놈 DNA가 사용되었을 때 CYP2D6 대 RN아제 P의 비가 약 0.5인 2개의 시료들의 비는, 본 발명의 사전 증폭 방법이 사용되었을 경우에도 여전히 약 0.5였다. 비가 0.5임은 곧, 결실이 발생하였음을 말해주는 것이다. 게놈 DNA를 사용하였을 때 비가 약 1인 2개의 시료들도, 사전 증폭 생성물을 사용하여 실험하였을 때 그 비가 약 1이었는데, 이는 곧, 대립 유전자의 상태가 정상임을 말해주는 것이다. 그러나, 게놈 DNA를 분석하였을 때 비가 약 1인 하나의 시료는, 사전 증폭법을 이용하였을 때에는 그 비가 1.5였다. 이는 곧, 시료가 CYP2D6 유전자의 중복체를 가진다는 사실을 말해주는 것이다.

이형접합성 소실 검출

본원에 개시된, 관심 있는 특정 유전자의 카피수 변이를 측정하는 방법에 대한 하나의 유용한 용도로서는 이형접합성 소실 여부(LOH)를 확인하는 것을 포함한다. 본원에 개시된 기법은, 이형접합성 소실 여부를 확인함에 있어서 새로운 수준의 감수성 및 융통성을 제공할 수 있다. 대표적인 용도로서는 비정상 X 염색체 카피수 또는 이수성을 확인 및/또는 연구하는 것을 포함한다. 이형접합성 소실(LOH)이란, 정상 게놈 내 이형접합 상태가 쌍을 형성한 종양 게놈 내 동형접합 상태로 변화함을 의미한다. 연구 결과, 다수의 암에서는 전체 X 염색체가 소실됨을 알 수 있다[Moertel, CA.외 다수, Cancer Genet. Cytogenet. 67:21-27 (1993)]. 예를 들어 난소암의 40%는 X 염색체의 임의의 부위에 있어서 LOH가 일어났다고 한다[Osbourne, R.J. and Leech, V., Br. J. Cancer 69:429-438 (1994)]. 또한, 백혈병과 림프종의 경우에는 비교적 X 염색체가 증가하는 것이 일반적이라고 한다[Sandberg AA. "The X chromosome in human neoplasia, including sex chromatin and congenital conditions with X-chromosome anomalies. In: Sandberg AA, editor. Cytogenetics of the mammalian X chromosome, part B: X chromosome anomalies and their clinical manifestations. New York: Alan R. Liss, 459-98 (1983)].

LOH 실험을 수행하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이 미세유체 디바이스가 제공될 수 있다. 도 3은 하나의 예에서 이형접합성 소실 여부를 측정하는 데 사용되었던 디바이스의 예시적인 구조를 나타내는 것이다[예를 들어, 디바이스에 관한 보다 상세한 설명은 전술한 바를 참조할 수 있다]. 간단히 말해서, 본 디바이스는 12개의 패널을 가지는 집적 유체 회로(IFC)를 포함하는데, 여기서, 이 패널들은 각각 시료 또는 분석 혼합물에 대한 유동 주입구를 보유한다. 하나의 예에서, 시료를 로딩하기 위해 칩으로 운반하고, IFC 제어기 상에 디지털 어레이를 배치한 다음, 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 분석 성분들을 각각의 패널(765개 반응물로 이루어짐)에 압력 하중을 가함으로써, 이 시료를 로딩하는 것이다. 마스터 혼합물 및 프라이머-프로브 세트와 사전 혼합한 12개의 시료들을 각각 칩의 프레임 상에 존재하는 별도의 입수구에 분배하여 넣었다. 각각의 패널 내에서는, 하나의 시료를 765개의 실시간 PCR 반응물(6 nL)에 분할하였다. 이 시료를 사용하여 PCR을 수행하였다. 열 사이클링 및 형광 검출을 위해 디지털 어레이를 실시간 PCR 시스템 상에 배치하였다. 이 실험으로부터 얻어진 결과들을 검토하고 바이오마크® 어플리케이션 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 하나의 분석법과 다른 분석법을 비교하기 위해 포지티브 챔버에 대한 실시간 PCR 곡선 또는 종말점 이미지를 기록하였는데, 예를 들어 DNA 시료 중 2개의 임의 서열의 비를 계산하였다. 분석용 디지털 어레이는 직선성(linearity), 감수성과 사용상 편의를 제공한다.

개시된 실시예에서, X 염색체를 1, 2, 3, 4 또는 5 카피수만큼 함유하는 세포주로부터 유래하는 DNA[Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ]를 얻었다. 디지털 어레이를 사용하여, 단일 카피 표적화, VIC-표지화 "참조" 서열의 존재 하에서 함께 증폭된, 3개의 별도 X 염색체 TaqMan® 프라이머-프로브 세트[FAM-표지화된 123B, SMS 및 YY2(BioSearch Technologies, Novato, CA)]에 대한 각각의 시료를 테스트하였다.

도 6은 전술한 바와 같이, 이형접합성 소실 여부를 색상을 바탕으로 관찰한 결과들을 도시하는 흑백 그래프를 나타내는 것으로서, 이 도면은 디지털 어레이 내 2중 패널 내에서 진행중인 각 테스트에 대해서 더욱 상세히 설명해주고 있다. 도 6은 또한 디바이스의 패널 4를 확대하여 보여주는 것이기도 하다. 각 패널에서 표적 포지티브(밝은 회색, 제1 색상, 예를 들어 황색에 해당함) 및 참조 포지티브(어두운 회색, 제2 색상, 예를 들어 적색에 해당함) 챔버의 수를 계측하여, 이를 챔버당 다수의 염료에 대해 보정하였다. 이와 같은 결과들로부터, 표적 대 참조 물질에 대한 비(비보정)를 측정하였다. 패널 1과 12에서는 무 주형 대조군(No template controls; NTC)을 사용하였다. 실험 실습에서는 상이한 색상들을 기록할 수 있고, 그 결과들을 색(예를 들어, 적색 및 황색; 도 6에서는 흑백 패턴을 이용하여 회색으로 도시함)으로 나타낸다는 사실을 이해할 것이다.

간단한 선형 근사법(linear fitting)을 이용하여 카피수를 측정하였다. 도 7은 알고 있는 X 염색체 카피수(X축)에 대하여 작성된, 3개의 별도 분석비의 평균(Y축)을 나타내는 것으로서, 평균의 표준 오차를 보여주는 오차 바(error bar)를 포함한다. 이 비로써, X 염색체를 1, 2, 3, 4 또는 5 카피수만큼 함유하는 것으로 알고 있는 DNA 시료에 대한 기울기를 얻었다. 각각의 비보정 비의 측정값을 2로 곱한 다음 평균을 내어, 이수체 게놈당 카피수를 구하였다. 1-대-5 카피수의 변수에 대한 모든 분석법에 있어서의 평균 응답 수치(r²)는 0.994였는데, 이는 곧, 선형 분석법의 효율이 높음을 의미한다.

표 3에는 미세유체 디바이스 상에서 수행한 각 X 염색체 테스트용인 택맨® 프라이머 프로브 세트로부터 얻어진 비보정 비가 기재되어 있다. 평균비에 2를 곱하여 게놈당 X 염색체의 평균 카피수를 측정하였다. 오른쪽 마지막 컬럼은 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 게놈당 평균 카피수는 알고 있는 시료 중 X 염색체 카피수와 거의 흡사하였다.

각각의 X 염색체 테스트에 대한 비보정 비
알고 있는 X 염색체 카피수	비보정 FAM123 비	비보정 SMS 비	비보정 YY2 비	게놈당 평균 카피수	SEM
1X 염색체	0.51	0.49	0.61	1.0	0.07
2X 염색체	0.77	1.15	0.96	1.9	0.22
3X 염색체	1.10	1.19	1.86	2.8	0.48
4X 염색체	1.63	2.05	1.79	3.6	0.24
5X 염색체	2.03	2.34	2.90	4.8	0.51

상기 결과들은, 본원에 개시된 방법과 디바이스들이 소량이면서 생물학적으로 관련되지 않은 물질들의 매우 복잡한 게놈 DNA 시료 내 유전자 카피수 간 차이를 확인 및 구별할 수 있음을 알려주는 것이다. 이와 같은 테스트를 위해 선택된 시료들은 CGH 분석법과 MIP 기반 마이크로어레이 연구에서 관찰되는 시료들과 유사하거나 또는 동일하다[Visakorpi외 다수, 1994, Am. J. Pathol, 145:624-630 및 Pinkel외 다수, 1998, Nat. Genet. 20:207-211]. 디지털 어레이를 사용하는 본 발명의 방법을 이용하여 얻어진 결과들을 통해서, 알고 있는 CGH 및 MIP 방법의 경우와 적어도 식별력이 있는 카피수 예측치를 얻을 수 있었는데, 이 경우, 조작에는 그다지 고도의 기법은 필요로 하지 않았으므로, 필요 노동력은 줄일 수 있었으며 효율은 증가하였다. 뿐만 아니라, 디지털 PCR 포맷으로 택맨® 분석법을 복수회 수행할 수 있었기 때문에, 분석-대-분석 증폭 차(assay-to-assay amplification differences)를 보상해주는, 생물학적 견고성(biological robustness)과 분석 중복성 둘 다를 제공한다. 만일 다수의 위치들이 동시에 표적화되면, 국소화된 프라이머-프로브 결합 위치에서 하나의 돌연 변이 또는 결실이 일어나는 경우조차도 전체적인 분석 결과들은 유효하다. 뿐만 아니라, 효능은 시료를 분석용 미세유체 디바이스 상에 운반하기 전, 사전 증폭 단계를 활용하여 증가시킬 수 있다.

비록 본 발명이 상기 예들을 참고로 하여 기술되었지만, 이것에 대한 변형 예 및 변경 예는 본 발명의 사상과 범위 내에 포함된다는 사실을 이해해야 할 것이다. 그러므로, 본 발명은 이하 청구항과 이 청구항의 균등 범위 전체에 의해서만 한정된다.

Claims

피험체의 게놈 DNA를 함유하는 시료 중의 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 사전 증폭시키는 단계;
사전 증폭된 시료의 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열을 디지털 PCR에 의해 분석하는 단계;
표적 유전자 서열을 포함하는 증폭된 폴리뉴클레오티드 분자의 수(a) 및 참조 유전자 서열을 포함하는 증폭된 폴리뉴클레오티드 분자의 수(b)를 측정하여, (a):(b)의 비를 결정하는 단계
를 포함하는, 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 상대 카피수를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료가 인간 유래의 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a):(b)의 비가 약 0.5이고, 한 염색체 상에 (a)의 결실이 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a):(b)의 비가 약 1.5이고, 한 염색체 상에 (a)의 중복이 존재하는 것인 방법.
피험체로부터 얻은 DNA 시료에 대해 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계로서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 및 소정의 게놈 카피수 N을 갖는 참조 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다가 증폭되어 증폭된 시료를 생성하는 것인 단계;
증폭된 시료 전부 또는 그 일부를 복수의 분리된 반응 용량으로 분배하는 단계;
각각의 반응 용량에 대해 제2 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계로서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재할 경우 이것이 증폭되고, 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재할 경우 이것이 증폭되는 것인 단계;
표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(A)를 측정하고, 참조 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그 부분 서열이 존재하는 반응 용량의 수(B)를 측정하는 단계로서, 게놈 내 표적 폴리뉴클레오티드의 카피수는 약 (A)/(B)×N인 단계
를 포함하는, 피험체의 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 카피수를 측정하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 수행하는 단계가, 생체 시료를, 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머와 참조 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 조성물과 혼합하고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석을 수행하여 표적 폴리뉴클레오티드와 참조 폴리뉴클레오티드를 실질적으로 동일한 비율로 개별적으로 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭이 4∼15 사이클을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 반응 용량을 미세유체 디바이스에 배치하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭을 상기 미세유체 디바이스로부터 분리된 반응 용량에서 수행하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 분배 단계 수행 전에, 증폭된 시료의 전부 또는 일부를, 표적 유전자 서열 및 참조 유전자 서열의 정량적 증폭을 위해 선택된 시약과 혼합하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용되는 참조 유전자 서열 증폭용 프라이머가 상기 제2 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용되는 프라이머와 동일한 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용되는 표적 유전자 서열 증폭용 프라이머가 상기 제2 폴리뉴클레오티드 증폭 단계에서 사용되는 프라이머와 동일한 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 시약이, 폴리뉴클레오티드 증폭에 적합한 조건 하에 표적 유전자 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 제1 프로브 및 참조 유전자 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 제2 프로브를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 제1 프로브와 제2 프로브는 검출 가능한 상이한 표지를 포함하고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기반 중합시, 상기 제1 프로브 또는 제2 프로브의 결합, 또는 상기 제1 프로브 또는 제2 프로브의 분해로 인하여 각각의 검출 가능한 표지의 검출 가능한 형광에 변화가 발생하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 참조 유전자 서열이 RN아제 P(RNase P) 효소, β-액틴 또는 GAPDH를 적어도 부분적으로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 실질적으로 1의 값으로부터 벗어난 표적 유전자 서열 대 참조 유전자 서열의 비가 환자의 게놈에 있어서의 비정상적인 표적 유전자 서열 카피수를 나타내는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 유전자 서열의 상대 카피수를 측정하는 것이 피험체 게놈에 있어서의 이형접합성 소실을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 실질적으로 1보다 크거나 작은 값의 표적 유전자 서열 대 참조 유전자 서열의 비가 환자의 게놈에 있어서의 이형접합성 소실을 나타내는 것인 방법.