KR20210044744A - 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법 - Google Patents

생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료의 DNA 품질을 결정하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표적 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 정량적 PCR(polymerase chain reaction)을 수행함으로써 생물학적 시료의 DNA 품질을 결정하는 방법, 상기 방법에 이용되는 프라이머 제조방법 및 상기 결정된 DNA 품질을 적용하여 표적 유전자 돌연변이 검출량을 표준화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 유전자 분석에 이용되는 생물학적 시료의 DNA 품질을 객관적으로 평가할 수 있고 유전자 돌연변이의 발현 비율에 대한 객관적인 결과를 제시할 수 있어, 임상 연구 및 동반 진단 분야에서 신뢰성 있는 정보를 제공하는데 효과를 나타낼 수 있다.

Description

생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법{Method for determining the quality of nucleic acid of biological samples}
본 발명은 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 내부 품질 대조 부위 (Internal quality control region)를 증폭할 수 있는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행함으로써 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법, 상기 방법에 이용되는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트 제조방법 및 상기 결정된 핵산 품질을 적용하여 표적 유전자 돌연변이 비율을 표준화 하는 방법에 관한 것이다.
임상의가 특정 질병에 대한 가장 적절한 치료법을 선택하기 전에 질병의 분자적 특성을 분석하는 것이 점점 더 보편화되고 있다. 임상적으로 타당하고 정확한 동반진단(Companion diagnostics, CDx)과 함께 환자에게 최적의 치료를 제공하는 것이 질병의 치료 효과를 극대화하기 위한 방법이 되고 있다.
이에, 본 발명자들은 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 추출한 유전자의 상태를 객관적으로 평가함으로써, 유전자 분석 결과에 대한 신뢰성을 확보할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 정해진 조건을 만족하는 임의의 내부 품질 대조 부위 (internal quality control region)를 특이적으로 증폭할 수 있는 PCR용 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 생물학적 시료의 핵산 품질을 객관적으로 평가할 수 있는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계; (d) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표(internal quality control index, iQC index)를 산출하는 단계: 내부 대조군 품질 지표 = 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 PCR의 입력 DNA(input DNA) 카피수; 및 (e) 상기 내부 대조군 품질 지표가 정해진 역치값 이상인 경우 상기 시료의 핵산 품질이 적절한 것으로 판단하거나, 또는 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 상기 생물학적 시료의 핵산 품질이 우수한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법에 있어서, (a) 내부 품질 대조 부위의 핵산 단편을 증폭할 수 있는 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 단계; (b) 표준(reference standard) 물질에 포함된 핵산을 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및 (d) [상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 핵산 카피수]가 0.90 ~ 1.10인 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질 결정을 위한 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위을 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 제1의 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 제1의 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; (d) 상기 추출된 핵산을 표적 유전자 또는 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 iii) 프라이머; 또는 iv) 프라이머 및 프로브 세트;로 제2의 PCR을 수행하는 단계; (e) 상기 제2의 PCR 결과로부터 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및 (f) 하기 수식에 따라 %돌연변이 지수 (% mutation index)를 산출하는 단계: %돌연변이 지수 = 상기 표적유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수 / 상기 내부 품질 대조 부위 카피수 Х 100; 를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자의 %돌연변이 지수의 산출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 생물학적 시료에서 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율 (mutational frequency)를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 돌연변이 비율을 상기 시료의 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control)로 나누어 표준화된 돌연변이 비율을 산출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율(mutational frequency)의 표준화 (normalization) 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; (d) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표를 산출하는 단계: 내부 대조군 품질 지표 = 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 PCR의 입력 DNA 카피수; 및 (e) 상기 내부 대조군 품질 지표가 정해진 역치값 이상인 경우 상기 시료의 핵산 품질이 적절한 것으로 판단하거나, 또는 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 상기 생물학적 시료의 핵산 품질이 우수한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법에 있어서, (a) 내부 품질 대조 부위의 핵산 단편을 증폭할 수 있는 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 단계; (b) 표준 물질에 포함된 핵산을 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및 (d) [상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 핵산 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질 결정을 위한 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 제1의 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 제1의 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; (d) 상기 추출된 핵산을 표적 유전자 또는 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 iii) 프라이머; 또는 iv) 프라이머 및 프로브 세트;로 제2의 PCR을 수행하는 단계; (e) 상기 제2의 PCR 결과로부터 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및 (f) 하기 수식에 따라 %돌연변이 지수를 산출하는 단계: %돌연변이 지수 = 상기 표적유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수 / 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 Х 100; 를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자의 %돌연변이 지수의 산출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 생물학적 시료에서 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 돌연변이 비율을 상기 시료의 내부 대조군 품질 지표로 나누어 표준화된 돌연변이 비율을 산출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율의 표준화 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위 (internal quality control region)을 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; (d) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control index, iQC index)를 산출하는 단계: 내부 대조군 품질 지표 = 상기 표적 유전자의 카피수 / 상기 PCR의 입력 DNA(input DNA) 카피수; 및 (e) 상기 내부 대조군 품질 지표가 정해진 역치값 이상인 경우 상기 시료의 핵산 품질이 적절한 것으로 판단하거나, 또는 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 상기 생물학적 시료의 핵산 품질이 우수한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법을 제공한다.
현대의학에서 질병의 병리학적 기전을 연구하거나 동반진단을 통해 환자의 병리상태를 진단함에 있어서, 생물학적 시료에서 얻어지는 유전자는 매우 유용한 정보를 제공하는 자원이 되고 있다. 이러한 분석을 위한 유전자 증폭 기술에서 관심의 대상인 생물학적 시료의 유전자 품질은 유전자 증폭 후 성공적인 분자 검정에 매우 중요한 역할을 한다.
하지만, 유전자 증폭을 위해서 사용되는 생물학적 시료는 채집, 보관, 분석과 같은 일련의 처리 과정을 거치면서 본래의 상태를 유지하지 못하는 경우가 많다. 예를 들어, 혈중 순환 종양 세포와 같은 경우 시료 수득과정 중 사멸하는 경우가 매우 빈번하며, 카스파제를 매개로 세포가 사멸되는 동안에는 게놈 DNA가 작은 조각들로 분절화 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 임상연구 및 질병의 분자적 진단에서 가장 흔하게 사용되는 생물학적 시료의 보관 형태인 포르말린-고정 파라핀-포매 조직(formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, FFPE-T)의 경우 단백질간의 가교결합이 유도되어 면역조직학적 분석을 위한 최상의 상태로 조직을 유지할 수 있다는 장점이 있지만, 보관기간이 길어짐에 따라 유전자의 분절화, 화학적 변형, 가교결합, 메틸화, 산화적 스트레스 등과 같은 회복 불가능한 손상을 초래하기도 한다.
이와 같은 다양한 형태의 손상이 발생한 유전자를 이용하여 분석을 진행할 경우 정확한 연구 결과를 확보할 수 없음은 물론, 질병의 진단과 같은 중대한 사안에 있어서 생명과 직결되는 치명적인 오류가 발생할 수도 있다. 그럼에도 불구하고 임상 연구 및 진단 분야에서 아직까지 이러한 사실이 간과되는 경우가 많으며, 상업적으로 이용 가능한 다양한 형태의 분석 키트에 포함된 내부 컨트롤(internal control)은 생물학적 시료의 유전자 상태(status) 또는 품질(quality)을 평가하기 위함이 아닌 분석 프로세스 그 자체가 정상적으로 수행되었는지를 검증하기 위한 목적으로 이용되는 경우가 대부분이다.
본 발명의 상기 방법은 생물학적 시료에 포함된 유전자를 분석하는 과정을 포함하는 일체의 임상 연구 및 진단 분야에서 분석의 대상이 되는 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR), 유전자 시퀀싱(gemone sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 차세대 시퀀싱(next generation sequencing) 등과 같이 유전자를 직접적인 분석 대상으로 하는 분석기법을 적용함에 있어서 해당 생물학적 시료가 객관적인 또는 유의미한 실험 결과를 도출할 수 있을 정도의 핵산 품질을 유지하고 있는지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료의"핵산 품질"이란 생물학적 시료에 포함된 게놈 DNA의 함량, 오염원의 존재여부, 게놈 DNA의 크기, DNA의 분절화 여부, 염기 손상 여부, 가교결합 여부, 증폭 효율, 증폭 가능한 표적 유전자 절편의 함량 등을 의미하며, 바람직하게는 검출 또는 분석하고자 하는 표적 유전자(target gene) 또는 돌연변이를 포함하는 표적 유전자가 생물학적 시료 내에서 증폭 가능한 주형(template)으로서의 온전성(integrity)을 어느 정도의 수준으로 유지하고 있는지 여부를 의미하며, 가장 바람직하게는 표적 유전자 내에서 돌연변이가 발생하는 영역이 어느 정도의 수준으로 온전성을 유지하고 있는지를 의미한다.
수많은 분자스크리닝 및 분석 방법의 결과는 종종 게놈 DNA (genomic DNA, gDNA)의 전반적인 품질에 의존한다. 예를 들어, Array CGH (aCGH) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)은 결과를 보장하기 위해 손상되지 않은 고품질 gDNA를 요구할 수 있다. 이러한 워크 플로우 (workflow), 특히 NGS와 같은 고가의 방법에 대해 입력 자료 (샘플 등)의 품질 관리 (Quality control, QC)를 수행하는 것이 좋다. 그러면 낮은 품질의 샘플에 낭비되는 시간과 노력을 절약 할 수도 있다.
본 발명의 iQC index와 유사하게, DNA integrity number (DIN), RNA integrity number (RIN) 지수도 마찬가지로 핵산의 무결성을 수치화 하여 나타내는 값이다. 측정은 예를 들어 상용화된 측정기기 (Bioanalyzer, Agilent 2200 Tapestation, 4200 Tapestation 등)를 통하여 측정이 되며, 실제로는 Gel running based analysis 이다. 따라서 실험 방법 자체가 간편하지만, 실제 PCR 방식을 통한 증폭 가능한 핵산 측정과 비교하여 결과의 신뢰성은 보장할 수 없다. 또한, 돌연변이 검출을 위한 PCR 단계에서 핵산의 무결성을 함께 검증 하는 방법 대비, 추가적인 장비 및 소모품이 필요하다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자는 비소세포성폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자로부터 수득한 총 316개의 FFPE 시료에서 내피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor) 엑손 18번 내지 21번 내의 유전자 품질을 평가해 본 결과, 절반 이상인 166개의 생물학적 시료에서 입력 DNA(input DNA) 카피수 대비 EGFR 엑손 18번 내지 21번 내의 내부 품질 대조 부위(control region)카피수가 50% 미만인 것으로 확인이 되었다. NSCLC 환자에 대한 치료 약물을 결정하기 위해 중요한 지표가 되는 돌연변이들이 EGFR의 엑손 18번 내지 21번 영역에서 주로 발생한다는 것을 고려했을 때, EGFR 엑손 18번 내지 21번의 온전성이 유지되고 있지 않다고 판단할 수 있는 상기 166개의 생물학적 시료에서의 돌연변이 분석 결과는 신뢰성이 보장되지 않을 수 있음을 의미하며, 이는 곧 상기 생물학적 시료의"핵산 품질"이 EGFR 엑손 18번 내지 21번의 돌연변이를 검출하고자 하는 유전자 분석에는 적절하지 않은 것을 의미한다.
이하에서는 상기 핵산 품질 결정 방법의 각 단계에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
*
(a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 유전자 분석을 수행하기 위해 개체로부터 수득한 세포주, 조직학적 슬라이드, 생검체, 포르말린-고정된 파라핀-포매(formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 조직, 신체 유체 (body fluid), 대변, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 단리된 혈액 세포 및 혈액으로부터 단리된 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 세포주, 생검체, FFPE 조직, 단리된 혈액 세포 및 혈액으로부터 단리된 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더 바람직하게는 생검체, FFPE 조직 및 혈액으로부터 단리된 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 FFPE 조직일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 분석 가능한 핵산을 포함하고 있는 것일 수 있다.
생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 샘플 조직은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하여 FFPE 조직으로 제조한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.
본 발명에 있어서 용어 "파라핀"은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.
본 발명에서 상기 "개체"는 건강한 개체 또는 어느 질병에 걸린 것으로 의심되거나 연구의 대상이 되는 생물을 의미한다. 일반적으로 상기 개체는 인간일 수 있다. 그러나 상기 개체는 설치류(생쥐, 쥐, 햄스터 및 기니픽을 포함하는), 고양이, 개, 토끼, 소, 말, 산양, 양, 돼지 등을 포함하는 농경용 가축, 및 영장류(원숭이, 침판지, 오랑우탄 밀 고릴라를 포함하는)와 같은 포유류를 포함하는 동물일 수도 있다. 본 발명에서의 "개체"는 질병의 치료 또는 진단이 필요한 인간일 수 있다.
본 발명에서 상기 "핵산"이란, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하고, DNA에는, 예컨대 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 핵산은 분절화된 게놈 DNA일 수 있다.
본 발명에서 상기 핵산 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 페놀/클로로포름 추출법 또는 SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990) CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 핵산 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 FFPE 처리된 검체를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10㎛의 두께로 절단한 다음 FFPE 용 버퍼(FFPE buffer, VERSANT tissue preparation reagents, Box 1, siemens)를 혼합하고, 80℃에서 30분간 인큐베이션(incubation)하였다.
FFPE 시료의 양의 조절 및 시약과의 접촉의 용이성을 위하여 마이크로톱(microtome)을 사용하여 FFPE 시료를 절단할 수 있다. 절단 두께는 이에 한정되지는 않으나, 5 내지 15㎛가 바람직하다. 절단된 FFPE 시료는 DNA, 특히 게놈 DNA 추출용 tube에 넣고 단백질분해효소 (proteinase)를 처리하여 시료 내의 단백질을 분해하여 단편화시킨다. 바람직하게 본 발명에서 단백질분해효소는 단백질분해효소 K이며, 단백질분해효소 K의 처리는 바람직하게는 20 내지 40분, 45 내지 70℃, 더 바람직하게는 25 내지 35분, 60 내지 65℃, 가장 바람직하게는 30분, 65℃의 조건으로 처리한다. 상기 처리 조건의 하한값 미만의 처리는 단백질 분해 효율이 떨어져 궁극적으로 DNA 분리 효율이 감소되며, 상한값 초과의 처리는 분리 과정 중의 DNA의 분해로 DNA 분리 효율이 감소하고, 전체적인 분리 시간이 증가되어 생산성이 떨어지게 된다.
처리한 시료에서 단백질 또는 세포 잔해물 (debris)을 제거하고, 예를 들어, RNA를 제거하고 게놈 DNA를 분리하기 위하여 RNA 분해효소를 처리하고 게놈 DNA를 수득할 수 있다.
이와 같은 과정은 상용의 키트 및 장치, 예를 들어, 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)에 의해서 수행될 수 있다.
(b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 PCR을 수행하는 단계;
본 발명에서 상기 "내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)"란 추출한 핵산에서
i) 분석의 대상이 되는 표적 유전자 내의 일정 영역 또는 돌연변이 부위를 포함하고 있는 유전자 내의 일정 영역; 또는
ii) 분석의 대상이 되는 표적유전자 또는 돌연변이 부위에 인접한 부위를 의미한다.
상기 내부 품질 대조 부위는 검출하고자 하는 표적 유전자 내 (인트론, 엑손 또는 이들을 모두 포함하는 부위)에 존재하거나, 또는 돌연변이 부위를 포함하고 있는 유전자 내 (인트론, 엑손 또는 이들을 모두 포함하는 부위)에 위치할 수 있다.
또한, 상기 내부 품질 대조 부위는 표적유전자 또는 돌연변이 부위에 인접한 부위에 위치할 수 있으며, 바람직하게는 검출하고자 하는 표적 유전자 또는 돌연변이 부위 (핫스폿 (hotspot)이라고도 함)로부터 5'방향 또는 3'방향으로 "인접한 부위", 바람직하게는 20 kb (kilobase) 이내, 19 kb 이내, 18 kb 이내, 17 kb 이내, 16 kb 이내, 15 kb 이내, 14 kb 이내, 13 kb 이내, 12 kb 이내, 11 kb 이내, 10 kb 이내, 9 kb 이내, 8 kb 이내, 7 kb 이내, 6 kb 이내, 5 kb 이내, 4 kb 이내, 3 kb 이내, 2 kb 이내, 1 kb 이내, 900 염기 (base) 이내, 800 염기 이내, 700 염기 이내, 600 염기 이내, 500 염기 이내, 400 염기 이내, 300 염기 이내, 200 염기 이내, 100 염기 이내의 부위일 수 있다. 본 발명에서 상기 거리는 야생형의 게놈 유전정보를 기준으로 하여 측정된다. 본 발명에서 상기 거리는 1 kb 이상 20 kb 이하에 대해서는 소수점 1자리에서 반올림하는 것으로, 1 kb 미만에 대해서는 십의 자리에서 반올림하는 것으로 이해될 수 있다.
상기에서 "인접한 부위"는 i) 암세포의 특성인 카피수 변이 (copy number validation)에 의한 영향을 줄이기 위해 검출하고자 하는 표적 유전자와 대조부위와의 거리를 최대한 근접하게 설정하는 것이 바람직하며, ii) 돌연변이 발생가능성 높은 핫스폿과 근접하게 설정함으로써, FFPE 등에서 추출한 작은 단편의 핵산에서의 검출정확성을 높일 수 있다. 바람직하게는 상기 "유전자 내의 일정 영역" 및 "인접한 부위"는 SNP (single nucleotide polymorphism)가 빈번하지 않은, 즉, 5% 이내, 바람직하게는 1% 이내, 더 바람직하게는 0.5%이내로 존재하는 것일 수 있다.
또한 돌연변이가 발생하는 부위가 둘 이상 존재하는 경우 이들 돌연변이 부위의 가운데 (양 끝단의 돌연변이 부위의 가운데)에 존재하는 부위일 수 있다.
돌연변이 부위의 상호간의 거리가 충분히 멀리 떨어져 있는 경우 (예를 들어, 20 kb 초과) 또는 하나의 돌연변이 부위에 대해서 둘 이상의 내부 품질 대조 부위를 설정하려는 경우 둘 이상의 내부 품질 대조 부위를 적용하여 PCR을 수행할 수도 있다. 둘 이상의 내부 품질 대조 부위에 대한 하기 iQC index는 각각의 결과를 평균하여 산출하거나, 또는 독립적으로 iQC index를 평가하여 핵산 품질을 결정할 수도 있다. 이 때, 상기 평균은 산술 평균 (Arithmetic mean), 기하 평균 (Geometric mean), 조화 평균 (Harmonic mean), 멱 평균 (power mean), 가중 산술 평균 또는 이들의 조합에 의해서 산출될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 내부 품질 대조 부위를 EGFR(Epidermal growth factor receptor) 엑손 18번 내지 21번 내에서 선정하였다.
상기 내부 품질 대조 부위를 부적절하게 결정하는 경우, 핵산의 빈번한 분절화(fragmentation)로 인한 야생형 및 돌연변이 서열 population 변화로 부정확한 카피수 및 빈도수가 도출이 될 수 있으며, 상기 내부 품질 대조 부위를 검출하고자 하는 표적 핵산 영역 또는 돌연변이가 발생하는 부위와 다른 염색체에서 선정할 경우, 암 세포와 같이 카피수 변이가 빈번하게 발생하는 생물학적 시료에서 부정확한 카피수가 도출이 될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서의 내부 품질 대조 부위는 EGFR 유전자의 엑손 18번 내지 21번의 부위 내에 존재하며, 엑손 18번 말단에서의 거리는 약 7.5kb이며, 엑손 21번 말단에서의 거리는 약 11kb이다. 한편, 본 발명의 일 실시예에서의 내부 품질 대조 부위는 엑손 28번의 위치와 약 25kb 떨어져 있으며, 이러한 거리의 경우 본 발명의 내부 품질 대조 부위로는 부적절하다.
본 발명에서 상기 분석의 대상이 되는 "표적 유전자"란, 예를 들어 유전자 감식이나 개체 식별에 사용되는 마커 유전자, 질환의 진단에 사용되는 마커 유전자, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 마커 유전자, STR (short tandem repeat)을 갖는 유전자 및 단일염기다형성(single nucleotide polymorphysm)을 갖는 마커 유전자 등을 의미할 수 있다. "표적 유전자"는 돌연변이를 포함하고 있거나 또는 야생형일 수 있으나, 바람직하게는 유전학적 의미 또는 진단에 의미가 있는 돌연변이를 갖는 마커 유전자일 수 있으며, 더 바람직하게는 진단에 의미가 있는 돌연변이를 갖는 마커 유전자일 수 있다.
본 발명에서 "표적 유전자"는 다음 표 1에 기재된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 (Transcription ID는 Genbank Accession No.를 나타낸다):
Gene Name Transcript ID Gene Name Transcript ID
ABL1 NM_005157 LMO1 NM_002315
ACVR1 NM_001111067 LYN NM_002350
AGO2 NM_012154 MALT1 NM_006785
AKT1 NM_001014431 MAP2K1 NM_002755
AKT2 NM_001626 MAP2K2 NM_030662
AKT3 NM_005465 MAP2K4 NM_003010
ALK NM_004304 MAP3K1 NM_005921
ALOX12B NM_001139 MAP3K13 NM_004721
AMER1 NM_152424 MAP3K14 NM_003954
ANKRD11 NM_013275 MAPK1 NM_002745
APC NM_000038 MAPK3 NM_002746
AR NM_000044 MAPKAP1 NM_001006617
ARAF NM_001654 MAX NM_002382
ARID1A NM_006015 MCL1 NM_021960
ARID1B NM_020732 MDC1 NM_014641
ARID2 NM_152641 MDM2 NM_002392
ARID5B NM_032199 MDM4 NM_002393
ASXL1 NM_015338 MED12 NM_005120
ASXL2 NM_018263 MEF2B NM_001145785
ATM NM_000051 MEN1 NM_000244
ATR NM_001184 MET NM_000245
ATRX NM_000489 MGA NM_001164273
AURKA NM_003600 MITF NM_198159
AURKB NM_004217 MLH1 NM_000249
AXIN1 NM_003502 MPL NM_005373
AXIN2 NM_004655 MRE11A NM_005591
AXL NM_021913 MSH2 NM_000251
B2M NM_004048 MSH3 NM_002439
BABAM1 NM_001033549 MSH6 NM_000179
BAP1 NM_004656 MSI1 NM_002442
BARD1 NM_000465 MSI2 NM_138962
BBC3 NM_001127240 MST1 NM_020998
BCL10 NM_003921 MST1R NM_002447
BCL2 NM_000633 MTOR NM_004958
BCL2L1 NM_138578 MUTYH NM_001128425
BCL2L11 NM_138621 MYC NM_002467
BCL6 NM_001706 MYCL1 NM_001033082
BCOR NM_001123385 MYCN NM_005378
BIRC3 NM_182962 MYD88 NM_002468
BLM NM_000057 MYOD1 NM_002478
BMPR1A NM_004329 NBN NM_002485
BRAF NM_004333 NCOA3 NM_181659
BRCA1 NM_007294 NCOR1 NM_006311
BRCA2 NM_000059 NEGR1 NM_173808
BRD4 NM_058243 NF1 NM_001042492
BRIP1 NM_032043 NF2 NM_000268
BTK NM_000061 NFE2L2 NM_006164
CALR NM_004343 NFKBIA NM_020529
CARD11 NM_032415 NKX2-1 NM_001079668
CARM1 NM_199141 NKX3-1 NM_006167
CASP8 NM_001080125 NOTCH1 NM_017617
CBFB NM_022845 NOTCH2 NM_024408
CBL NM_005188 NOTCH3 NM_000435
CCND1 NM_053056 NOTCH4 NM_004557
CCND2 NM_001759 NPM1 NM_002520
CCND3 NM_001760 NRAS NM_002524
CCNE1 NM_001238 NSD1 NM_022455
CD274 NM_014143 NTHL1 NM_002528
CD276 NM_001024736 NTRK1 NM_002529
CD79A NM_001783 NTRK2 NM_006180
CD79B NM_001039933 NTRK3 NM_001012338
CDC42 NM_001791 NUF2 NM_031423
CDC73 NM_024529 NUP93 NM_014669
CDH1 NM_004360 PAK1 NM_002576
CDK12 NM_016507 PAK7 NM_177990
CDK4 NM_000075 PALB2 NM_024675
CDK6 NM_001145306 PARK2 NM_004562
CDK8 NM_001260 PARP1 NM_001618
CDKN1A NM_078467 PAX5 NM_016734
CDKN1B NM_004064 PBRM1 NM_018313
CDKN2Ap14ARF NM_058195 PDCD1 NM_005018
CDKN2Ap16INK4A NM_000077 PDCD1LG2 NM_025239
CDKN2B NM_004936 PDGFRA NM_006206
CDKN2C NM_078626 PDGFRB NM_002609
CEBPA NM_004364 PDPK1 NM_002613
CENPA NM_001809 PGR NM_000926
CHEK1 NM_001274 PHOX2B NM_003924
CHEK2 NM_007194 PIK3C2G NM_004570
CIC NM_015125 PIK3C3 NM_002647
CREBBP NM_004380 PIK3CA NM_006218
CRKL NM_005207 PIK3CB NM_006219
CRLF2 NM_022148 PIK3CD NM_005026
CSDE1 NM_001242891 PIK3CG NM_002649
CSF1R NM_005211 PIK3R1 NM_181523
CSF3R NM_000760 PIK3R2 NM_005027
CTCF NM_006565 PIK3R3 NM_003629
CTLA4 NM_005214 PIM1 NM_002648
CTNNB1 NM_001904 PLCG2 NM_002661
CUL3 NM_003590 PLK2 NM_006622
CXCR4 NM_003467 PMAIP1 NM_021127
CYLD NM_001042355 PMS1 NM_000534
CYSLTR2 NM_020377 PMS2 NM_000535
DAXX NM_001141970 PNRC1 NM_006813
DCUN1D1 NM_020640 POLD1 NM_002691
DDR2 NM_006182 POLE NM_006231
DICER1 NM_030621 PPARG NM_015869
DIS3 NM_014953 PPM1D NM_003620
DNAJB1 NM_006145 PPP2R1A NM_014225
DNMT1 NM_001379 PPP4R2 NM_174907
DNMT3A NM_022552 PPP6C NM_002721
DNMT3B NM_006892 PRDM1 NM_001198
DOT1L NM_032482 PRDM14 NM_024504
DROSHA NM_013235 PREX2 NM_024870
DUSP4 NM_001394 PRKAR1A NM_212471
E2F3 NM_001949 PRKCI NM_002740
EED NM_003797 PRKD1 NM_002742
EGFL7 NM_201446 PTCH1 NM_000264
EGFR NM_005228 PTEN NM_000314
EIF1AX NM_001412 PTP4A1 NM_003463
EIF4A2 NM_001967 PTPN11 NM_002834
EIF4E NM_001130678 PTPRD NM_002839
ELF3 NM_004433 PTPRS NM_002850
EP300 NM_001429 PTPRT NM_133170
EPAS1 NM_001430 RAB35 NM_006861
EPCAM NM_002354 RAC1 NM_018890
EPHA3 NM_005233 RAC2 NM_002872
EPHA5 NM_004439 RAD21 NM_006265
EPHA7 NM_004440 RAD50 NM_005732
EPHB1 NM_004441 RAD51 NM_002875
ERBB2 NM_004448 RAD51B NM_133509
ERBB3 NM_001982 RAD51C NM_058216
ERBB4 NM_005235 RAD51D NM_133629
ERCC2 NM_000400 RAD52 NM_134424
ERCC3 NM_000122 RAD54L NM_001142548
ERCC4 NM_005236 RAF1 NM_002880
ERCC5 NM_000123 RARA NM_000964
ERF NM_006494 RASA1 NM_002890
ERG NM_182918 RB1 NM_000321
ERRFI1 NM_018948 RBM10 NM_001204468
ESR1 NM_001122740 RECQL NM_032941
ETV1 NM_001163147 RECQL4 NM_004260
ETV6 NM_001987 REL NM_002908
EZH1 NM_001991 RET NM_020975
EZH2 NM_004456 RFWD2 NM_022457
FAM175A NM_139076 RHEB NM_005614
FAM46C NM_017709 RHOA NM_001664
FAM58A NM_152274 RICTOR NM_152756
FANCA NM_000135 RIT1 NM_006912
FANCC NM_000136 RNF43 NM_017763
FAT1 NM_005245 ROS1 NM_002944
FBXW7 NM_033632 RPS6KA4 NM_003942
FGF19 NM_005117 RPS6KB2 NM_003952
FGF3 NM_005247 RPTOR NM_020761
FGF4 NM_002007 RRAGC NM_022157
FGFR1 NM_001174067 RRAS NM_006270
FGFR2 NM_000141 RRAS2 NM_012250
FGFR3 NM_000142 RTEL1 NM_032957
FGFR4 NM_213647 RUNX1 NM_001754
FH NM_000143 RXRA NM_002957
FLCN NM_144997 RYBP NM_012234
FLT1 NM_002019 SDHA NM_004168
FLT3 NM_004119 SDHAF2 NM_017841
FLT4 NM_182925 SDHB NM_003000
FOXA1 NM_004496 SDHC NM_003001
FOXL2 NM_023067 SDHD NM_003002
FOXO1 NM_002015 SESN1 NM_014454
FOXP1 NM_001244814 SESN2 NM_031459
FUBP1 NM_003902 SESN3 NM_144665
FYN NM_153047 SETD2 NM_014159
GATA1 NM_002049 SETD8 NM_020382
GATA2 NM_032638 SF3B1 NM_012433
GATA3 NM_002051 SH2B3 NM_005475
GLI1 NM_005269 SH2D1A NM_002351
GNA11 NM_002067 SHOC2 NM_007373
GNAQ NM_002072 SHQ1 NM_018130
GNAS NM_000516 SLX4 NM_032444
GPS2 NM_004489 SMAD2 NM_001003652
GREM1 NM_013372 SMAD3 NM_005902
GRIN2A NM_001134407 SMAD4 NM_005359
GSK3B NM_002093 SMARCA4 NM_003072
H3F3A NM_002107 SMARCB1 NM_003073
H3F3B NM_005324 SMARCD1 NM_003076
H3F3C NM_001013699 SMO NM_005631
HGF NM_000601 SMYD3 NM_001167740
HIST1H1C NM_005319 SOCS1 NM_003745
HIST1H2BD NM_021063 SOS1 NM_005633
HIST1H3A NM_003529 SOX17 NM_022454
HIST1H3B NM_003537 SOX2 NM_003106
HIST1H3C NM_003531 SOX9 NM_000346
HIST1H3D NM_003530 SPEN NM_015001
HIST1H3E NM_003532 SPOP NM_001007228
HIST1H3F NM_021018 SPRED1 NM_152594
HIST1H3G NM_003534 SRC NM_198291
HIST1H3H NM_003536 SRSF2 NM_003016
HIST1H3I NM_003533 STAG2 NM_001042749
HIST1H3J NM_003535 STAT3 NM_139276
HIST2H3C NM_021059 STAT5A NM_003152
HIST2H3D NM_001123375 STAT5B NM_012448
HIST3H3 NM_003493 STK11 NM_000455
HLA-A NM_001242758 STK19 NM_004197
HLA-B NM_005514 STK40 NM_032017
HNF1A NM_000545 SUFU NM_016169
HOXB13 NM_006361 SUZ12 NM_015355
HRAS NM_001130442 SYK NM_003177
ICOSLG NM_015259 TAP1 NM_000593
ID3 NM_002167 TAP2 NM_018833
IDH1 NM_005896 TBX3 NM_016569
IDH2 NM_002168 TCEB1 NM_005648
IFNGR1 NM_000416 TCF3 NM_001136139
IGF1 NM_001111285 TCF7L2 NM_001146274
IGF1R NM_000875 TEK NM_000459
IGF2 NM_001127598 TERT NM_198253
IKBKE NM_014002 TET1 NM_030625
IKZF1 NM_006060 TET2 NM_001127208
IL10 NM_000572 TGFBR1 NM_004612
IL7R NM_002185 TGFBR2 NM_001024847
INHA NM_002191 TMEM127 NM_001193304
INHBA NM_002192 TMPRSS2 NM_001135099
INPP4A NM_001134224 TNFAIP3 NM_006290
INPP4B NM_001101669 TNFRSF14 NM_003820
INPPL1 NM_001567 TOP1 NM_003286
INSR NM_000208 TP53 NM_000546
IRF4 NM_002460 TP53BP1 NM_001141980
IRS1 NM_005544 TP63 NM_003722
IRS2 NM_003749 TRAF2 NM_021138
JAK1 NM_002227 TRAF7 NM_032271
JAK2 NM_004972 TSC1 NM_000368
JAK3 NM_000215 TSC2 NM_000548
JUN NM_002228 TSHR NM_000369
KDM5A NM_001042603 U2AF1 NM_006758
KDM5C NM_004187 UPF1 NM_002911
KDM6A NM_021140 VEGFA NM_001171623
KDR NM_002253 VHL NM_000551
KEAP1 NM_203500 VTCN1 NM_024626
KIT NM_000222 WHSC1 NM_001042424
KLF4 NM_004235 WHSC1L1 NM_023034
KMT2A NM_001197104 WT1 NM_024426
KMT2B NM_014727 WWTR1 NM_001168280
KMT2C NM_170606 XIAP NM_001167
KMT2D NM_003482 XPO1 NM_003400
KNSTRN NM_033286 XRCC2 NM_005431
KRAS NM_033360 YAP1 NM_001130145
LATS1 NM_004690 YES1 NM_005433
LATS2 NM_014572 ZFHX3 NM_006885
본 발명에서 상기 "돌연변이 부위"는 예를 들어 유전자 감식이나 개체 식별에 사용되는 마커 유전자의 돌연변이 부위, 특정 질환의 진단에 사용되는 마커 유전자의 돌연변이 부위, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 유전자의 돌연변이 부위일 수 있으며, 바람직하게는 상기 돌연변이 부위는 유전자 감식, 개체 식별, 특정 질환의 진단, 유전학적인 의미 등 각각의 목적에 대해서 유의미한 것을 나타낸다.본 발명에서 상기 분석의 대상이 되는 "돌연변이"는 상기 표적유전자에 있는 돌연변이이거나 하기 표 2에 기재된 유전자 및 해당 코돈에 위치한 돌연변이일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다:
Gene Codons
ABL1 G250,Q252,Y253,E255,T315,F317,M351,F359,H396R
AKT1 E17,Q124,G171,E170
AKT2 V140
ALK K1062,D1091,C1156,M1166,I1171,F1174,L1196,A1234,F1245,I1250,R1275,Y1278
APC S1234,I1307,E1309,E1317,P1319,G1339,S1341,P1361,P1372,P1373,R1399,S1400,S1407,S1411,V1414,S1415,S1421,T1438,P1439,P1440,T1445,P1453,N1455,E1464,S1465,T1487,L1488,F1491,T1493,E1494,T1537,K1555,T1556,I1557,C1578
AR T878,T8782,Q581
ARAF S214
ARID1A D1850,G2087
ARID2 R314,S297,R285,A1773
ASXL1 Y591,E635,G645,G646,E1102D
ASXL2 R591
ATM D1853,R3008,R3376,E2164
ATRX K1936,E625
BARD1 P24
BCL6 R594,R618
BCOR N1425,N14591
BRAF G464,G466,G469,Y472,N581,D594,F595,G596,L597,A598_T599,V600,V600_K601,K601,V60010,K6010,G4694,N5810,G4660
CARD11 R170
CBL Y371,L380,C384,C404,R420Q
CDH1 T263
CDK4 R24
CDKN2A S43,P48,A57,A68,D74,L78,P81,H83,D84,L97,D108,P114,H831,D1081,P1140
CEBPA P23,H24,Q83,K304_Q305,E309_T310,Q312_K313,K313_V314,K313_V314,K313,E316_L317,E316_L317insQ
CHEK2 K373,K3732
CIC R215
CREBBP R1446,S1680,R14460
CRLF2 F232C
CSF1R Y969C
CTCF R377
CTNNB1 D32,S33,G34,I35,H36,S37,T40,T41,T42,A43,P44,S45,G48,K49,E53,K335,S376,S334,D324,T412,G349,S455,C619
DICER1 E1813
DIS3 R382,D488
DNMT1 E432
DNMT3A G543,R635,S714,F731,R882,R8820
DOT1L G1386
EGFR R108,A289,G598,R677,E709,G719,K745_E749,K745_E746,E746_A750,E746_S752,E746_T751,E746_E749,E746_T751,L747_P753,L747_A750,L747_T751,L747_S752,L747_T751,L747_E749,L747,T751,S752_I759,D761,S768,V769_D770,D770_N771,H773_V774,R776,T790,L833,H835,T847,P848,T854,L858,L861,G863,L8587,A2898,R252,R222
EP300 D1399,D13990,C1164
EPHB1 R170
ERBB2 G309, S310, L755, L755_T759del, D769H, D769Y, G776, V777, V842, R869, R678
ERBB3 V1043,D297,M91
ERBB4 R711
ERCC2 D312
ESR1 D538, Y537, L536, E380, S463, V533
ETV1 R187
ETV6 R369
EZH2 Y646,R690
FBXW7 G423,R465,R479,R505,S582,R689,R4652,R5054,R4792
FGFR2 S252,P253,C382,N549,N550,K659
FGFR3 R248,S249,G370,S371,Y373,G380,A391,K650,G697,S2492,Y3730
FGFR4 V550
FLT3 D835,I836,D8358
FOXL2 C134W
FUBP1 R430
GATA1 M1,S30,V74I
GATA2 G320,L321,L359,R362Q
GNA11 R183,Q209,R256
GNAQ R183,Q209
GNAS R201,Q227,R8448
GRIN2A R1067
HIST1H3B E74
HNF1A W206,P291,G292
HRAS G12,G13,Q61,E62,Q614,G136,G122
IDH1 G70,V71,R132,V178,R13239,P33
IDH2 R140,R172,V294,R1402,R1721
IL7R K395
IRS2 G1057
JAK1 R873
JAK2 F537_K539,H538_K539,K539,I540_E543,R541_E543,N542_E543,E543_D544,V617,R683
JAK3 A572,A573,R657Q
KDR S1100,E759
KEAP1 R470
KIT D52,D419,Y503_F504,K509,M541,K550_K558,P551_V555,P551_E554,P551_M552,Y553_K558,E554_K558,Q556_V560,W557_K558,W557,W557_V559,W557_E561,W557_V559,K558_E562,K558,K558_V560,V559,V559_V560,V559_E561,V560,E561,Y570_L576,D572,L576,D579,K642,V654,T670,S715,D816,K818,D820,N822,Y823,V825,D8160
KMT2C V656
KRAS G10_A11,G12,G13,V14,L19,Q22,T58,A59,Q61,K117,A146,G1242,G133,Q619,A1467
LATS2 A3243,G3630
MAP2K1 Q56,K57,D67,P124,P1240,F53,E203
MAP2K4 R134
MAP3K1 S1330,S939
MAPK1 E322
MAX R600
MED12 L36,Q43,G44,L1224,L12240
MEF2B D83V
MET T1010,Y1248,Y1253,M1268,K1360
MLL3 K2797
MPL S505,W515,W515R
MSH6 F1088,T1219I
MTOR S22152,F1888
MYC T58
MYCN P44
MYD88 S219,S243,L265P
NF1 L844
NFE2L2 D29,L30,G31,R34,E79,T80,G81,E82,E794,D294,R342
NOTCH1 L1574,L1575,V1578,L1585,L1586,F1592,L1593,L1594,R1598,R1599,L1600,L1601,L1678,L1679,Q2460,P2514,A1944
NOTCH2 E385,N463
NPM1 W288,W290
NRAS G12,G13,A18,G60,Q61,Q6193,G128,G138
NTRK1 T264
PAK7 E144
PARP1 I562
PAX5 P80R
PDGFRA V561,S566_E571,N659,D842,I843_D846,D1071N
PIK3C2G S670
PIK3CA R38,E81,R88,R93,G106,R108,K111,G118,V344,N345,C378,E418,C420,E453,P539,E542,E545,Q546,E547,S553,K567,H701,E726,C901,G1007,Y1021,T1025,M1043,N1044,D1045,A1046,H1047,G1049,T1052,A1066,N1068,E54534,H104715,E54217,Q5467,R887,N3453,C4209,G1187,E7265,E4535,K1113,R932,R382,R1080,E39
PIK3R1 G376,D560,N564,K567
POLE P2864,V4111
PPP2R1A P179,R182,R183,S256,W257,R258,R1832
PREX2 G233C
PTCH1 P1315
PTEN K6,P38,L42,H61,Y68,Y76,Y88,H93,I101,C105,L112,H123,A126,G129,R130,C136,A151,Y155,R159,K164,G165,S170,R173,N184,E242,P246,P248,C250,K267,V290,L318,T319,T321,N323,F347,R1309,R1730,K128
PTPN11 G60,D61,E69,A72,T73,E76,S502,G503,Q510
PTPRD S431,P666
RAC1 P295
RAF1 S2570
RET E632_T636,E632_L633,C634,M918T
RHOA E40,Y42
RICTOR S1101
RIT1 M90
RUNX1 L56,R107,D198,R201,R204,R162,R205
SDHA S4560,A466,R465
SF3B1 E622,R625,H662,K666,K700,K7002
SMAD4 A118,D351,R361,G386,R3619,D537,P356
SMARCA4 T910,G1232
SMARCB1 R377,A382,P383
SMO W535L
SPOP F133,F1338,W131,F102
SRSF2 P95,P95_R102,P107H
STAG2 R370
STK11 D194,P281,F354L
TET2 C25,C262,Q764,F868,R1261,H1380,V1718L
TNFAIP3 L324
TP53 E11,D49,P82,T102,G105,Y107,R110,L111,F113,K120,T125,Y126,Y126_K132,S127,P128,L130,N131,K132,M133,F134,C135,A138,K139,T140,C141,P142,V143,Q144,L145,V147,S149,P151,P152,P153,G154,T155,R156,V157,R158,A159,M160,A161,I162,Y163,K164,S166,H168,M169,T170,E171,V172,V173,R174,R175,C176,P177,P177_C182,H178,H179,E180,R181,C182,D184,D186,G187,P190,P191,Q192,H193,L194,I195,R196,V197,E198,G199,N200,R202,V203,Y205,D208,R209,T211,F212,R213,,S215,V216,V217,V218,Y220,E224,G226,S227,D228,C229,T230,I232,Y234,N235,Y236,M237,C238,N239,S240,S241,C242,M243,G244,G245,M246,N247,R248,R249,P250,I251,L252,T253,I254,I255,L257,E258,D259,G262,L265,G266,R267,F270,E271,V272,R273,V274,C275,A276,C277,P278,G279,R280,D281,R282,R283,T284,E285,E286,E287,N288,R290,K291,K292,E294,P300,P301,S303,K320,G334,R337,R27328,R24892,R17538,R2820,G2451,Y2202,H1938,H1797,R1583,C1763,P2783,Y1633,R2800,G2660,I1950,S2419,R2499,V1577,C2386,E2856,R3375,G2445,V1733,P1512,C2752,K1321,Y2050,V2720,C1359,D2818,E2718,V2168,M2378,Y2347,E2867,L1946,A1596,R2675,S1275,C2425,Y2364,C1414,F2704,A1613,V2743,S2153,R2132,H2142,R1101,N2390,T1550,P1520,P2500,G1050,L1300,Q136,F109
TP63 R379
TSC2 N1515
TSHR M453,I486,L512,I568,D619,A623,L629,I630,T632,D633,D633E
U2AF1 S34,Q157,S347
VHL V62,S65,S72,V74,F76,N78,S80,P81,L85,P86,L89,N90,S111,G114,H115,L118,D121,L128,V130,G144,F148,I151,L153,V155,L158,E160,C162,V166,R167,L169,L184
WT1 V303,R312,A314,R394,D396,R462
XPO1 E571,R749
본 발명에서 상기 "프라이머(primer)"는 적합한 온도 및 적합한 완충 용액에 담긴 적합한 조건들(즉, 4 종류의 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA 중합효소 또는 RNA 중합효소 또는 역전사 효소와 같은 중합(polymerizaiton) 작용제의 존재) 하에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 핵산을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 의존적이나 일반적으로 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이며, 보다 일반적으로는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 다른 프라이머들은 30 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된 길이와 같이 길이가 다소 더 길 수 있다. PCR 프라이머는 통상적으로 약 15-30개의 염기쌍으로 구성되는 길이이며 표적 서열의 상류에 위치한(즉, 5'에서 3' 방향) 한쪽 가닥 및 그 서열의 하류에 위치한(즉, 3'에서 5' 방향) 그 반대쪽 가닥에 상보적이게 선택된다. 프라이머의 5' 말단들은 증폭된 PCR 생성물의 말단들을 정의한다. 프라이머는 AT 함량과 거의 동일한 GC 함량을 포함할 수 있고 하나의 염기로 구성된 긴 부위(stretch)는 포함할 수 없다. 또한, 프라이머들은 상호 간에 실질적으로 상보적인 구조들을 포함하지 않아야 하며, 이는 "프라이머 이량체(primer dimer)" 또는 다른 이차 구조가 형성되지 않는 것을 보장한다. 짧은 프라이머 분자들은 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도가 요구된다. 프라이머가 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없으나 주형과 혼성화되기에 충분한 정도로 상보적이어야 한다. "프라이머 부위(primer site)" 또는 "프라이머 결합 부위(primer binding site)"라는 용어는 프라이머가 혼성화되는 상기 내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)의 세그먼트를 의미한다. "프라이머 쌍(primer pair)"이라는 용어는 증폭되는 DNA 서열의 5' 말단의 상보체(complement)와 혼성화하는 5' 상류 프라이머(Forward primer) 및 증폭되는 서열의 3' 말단과 혼성화하는 3' 하류 프라이머(Reverses primer)을 포함하는 일 세트의 프라이머를 의미한다.
본 발명에서 상기 "상보적(complementary)"이라는 용어는 하나의 핵산이 또 다른 핵산 분자와 일치(identical)하거나 또는 그에 선택적으로 혼성화 된다는 것을 의미한다. 혼성화의 선택성은 특이성(specificity)의 완전한 부재보다 더 선택적인 혼성화가 일어나는 경우 존재한다. 통상적으로, 선택적인 혼성화는 14-25개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 부위에 대해 약 55% 이상의 일치성(identity), 대안적으로 65% 이상, 75% 이상, 또는 90% 이상의 일치성이 있는 경우 일어날 것이다. 대안적인 일 구체예에서, 하나의 핵산은 다른 핵산에 특이적으로 혼성화된다. M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)를 참조한다.
본 발명에서 상기 "프로브(probe)"는 하나 이상의 종류의 화학 결합, 통상적으로는 상보적 염기 쌍 형성을 통해, 통상적으로는 수소 결합 형성을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 결합하고, 이에 의해 이중가닥 구조(duplex structure)를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 부위(probe binding site)"에 결합하거나 또는 혼성화된다. 프로브는 특히 일단 프로브가 그의 상보적인 표적에 혼성화된 후, 프로브의 용이한 검출을 허용하기 위해 검출가능한 표지(label)로 표지로 표지될 수 있다. 프로브에 부착된 표지는 예를 들면, 화학 또는 물리적 수단에 의해 검출될 수 있는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다양한 표지들을 포함할 수 있다. 프로브에 부착될 수 있는 표지들은 방사성 동위원소, 형광발광단(fluorophores), 발색단(chromophores), 금 입자들, 양자점(quantum dots), 질량 표지(mass labels), 전자 밀집 입자(electron dense particles), 자성 입자(magnetic particles), 스핀 표지, 화학발광을 방출하는 분자, 전기화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조인자(cofactor) 및 효소 기질들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일부 프로브는 비교적 짧다. 일반적으로, 프로브는 7개 내지 15개 이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 다른 프로브들은 20개, 30개, 또는 40개이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 또 다른 프로브들은 길이가 더 길고, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 이상의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 그러나, 다른 프로브들은 길이가 보다 더 길고, 100개, 150개, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어 질 수 있다. 프로브들은 전술된 범위들 내에 속하는 임의의 특정 길이일 수 있다.
본 발명에서 상기 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 증폭하고자 하는 핵산 추출물과 상기 프라이머, 프로브 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
프라이머에 의해 증폭된 핵산은 아가로스젤에서 전기영동한 후 밴드를 확인하는 방법을 통해 증폭 산물의 존재 및 상대적인 양을 확인할 수 있으며, 또는 프라이머 및 프로브를 통한 형광신호를 검출함으로써 증폭 산물을 정량화할 수 있다.
본 발명에서 상기 "PCR(polymerase chain reaction)"이란 당업계에 널리 알려져 있는 것으로, 주형, 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 폴리머라제, dNTP를 포함하는 반응용액을 변성, 어닐링, 중합에 해당하는 온도로 반복하여 순환시킴으로써, 핵산을 증폭하는 방법을 의미하는 것으로, 예를 들어 PCR, RT-PCR, 실시간 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 등의 방법이 있다. 본 발명에서 상기 PCR은 바람직하게는 실시간 PCR(real-time PCR) 또는 디지털 PCR(digital PCR)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 디지털 PCR일 수 있다.
상기 "실시간 PCR (Real-time PCR)"은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCRMethods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점에서 CT 값이 산출된다. 실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다.
한편, 상기 "디지털 PCR(digital PCR)"이란, 시료 중에 존재하는 각각의 핵산 분자를 복수의 개별 반응 용량(예를 들어, 챔버 또는 분액)으로 분배한 후, 하나 이상의 표적 서열을 PCR 증폭시키는 방법을 의미한다. 상기 실시간 PCR의 결과 분석 방식은 bulk type으로 광대한 시그날을 방출하는 것 대비 디지털 PCR은 개별 분획된 챔버 또는 분액에서 방출되는 시그날을 캡쳐함에 따라 소량의 시료에서의 신호 민감성과 특이도가 매우 높다.
디지털 PCR에 관하여는, 예를 들어 문헌[Vogelstein and Kinzler, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-41; McBride외 다수, 미국 특허 출원 공보 20050252773(특히, 실시예 5)]을 참조할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 내부 품질 대조 부위는 하나의 표적 유전자 내에서 복수로 선택이 될 수 있으며, 이 경우에는 상기 PCR은 각각의 내부 품질 대조 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브를 혼합하여 수행이 될 수 있다.
(c) 상기 정량적 PCR 결과로부터 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계;
상기 PCR이 실시간 PCR 또는 디지털 PCR인 경우에 표적 유전자의 카피수는 당업계에서 통상적으로 수행되는 실시간 PCR의 방법에 따라 산출이 될 수 있으며, 예를 들어 하기 단계들을 포함하는 방법에 따라 산출이 될 수 있다:
예를 들어, 일반적인 실시간 PCR의 경우 카피수를 알고 있는 유전자 시료인 참고 표준(reference standard) 물질을 순차 희석 (serial dilution)한 샘플을 대상으로 표준 곡선을 도출하고, 시료를 대상으로 실시간(real-time) PCR로 증폭하여 도출한 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)을 상기 표준 곡선에 대응시켜 시료 내의 카피수를 측정할 수 있다.
한편 상기 PCR이 디지털 PCR 인 경우에, 디지털 PCR은 하나의 웰에 많은 수의 액적이 분포되어 있고, 분포된 액적(droplet) 내에 핵산 시료, 증폭 프라이머, 형광 프로브 및 DNA 증폭 polymerase가 포함되어 있다. 디지털 PCR의 경우 상기 실시간 PCR 방법과 달리 표적 핵산의 정량을 위해서 별도의 표준물질에 대한 표준곡선으로 표적 핵산 수치를 산출하지 않고 표적 핵산시료에 대한 단일 계수법을 적용한 절대정량 방식이다. 즉 하나의 웰에 분포된 개별 액적 내 표적 핵산이 존재하면 PCR 반응에 의해 형광신호가 증폭하게 되고 형광검출장치를 통해 독립된 신호로 감지된다. 이후 감지된 신호의 강도 및 액적을 계수하여 프아송 분포(poisson distribution) 산출식에 의해서 표적 핵산의 정확한 카피수를 정량할 수 있다.
(d) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control index, iQC index)를 산출하는 단계:
내부 대조군 품질 지표 = 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 PCR의 입력 DNA(input DNA) 카피수;
상기 "내부 품질 대조 부위의 카피수"는 상기 (c) 단계에서 산출한 시료 내 내부 품질 대조 부위의 카피수를 의미하며, 상기 "PCR의 입력 DNA 카피수"는 증폭하고자 하는 내부 품질 대조 부위가 포함된 시료의 전체 핵산 또는 검출 대상이 되는 부위의 카피수를 의미하는 것으로서, 통상적인 방법에 따라 정량된 핵산 값으로부터 산출될 수 있다. 예를 들어 human genomic DNA인 경우 3.3ng의 DNA의 경우 1000 카피의 입력 DNA 카피 수를 가지는 것으로 산출된다.
보다 상세하게는, 핵산 값의 수치는 통상적으로 사용되는 mole 계수법을 통해 일반적으로 산출한다. 즉, 핵산 분자 1bp 를 약 650 달톤(Dalton, Da)으로 가정할 경우, 그람 당 분자 수 (mol/g)는 아보가드로의 수 (6.022 x 1023 molecules/mole)와 핵산의 길이(bp) 및 핵산의 정량값 (ng)을 하기 식에 적용하여 계수할 수 있다.
식) number of copies = (amount * 6.022x1023) / (length * 1x109 * 650)
(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html를 참고)
(e) 상기 내부 대조군 품질 지표가 정해진 역치값 이상인 경우 상기 시료의 핵산 품질이 적절한 것으로 판단하거나, 또는 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 상기 생물학적 시료의 핵산 품질이 우수한 것으로 판단하는 단계
전술한 바와 같이 본 발명에서 상기 생물학적 시료의"핵산 품질"이란 바람직하게는 검출 또는 분석하고자 하는 핵산 영역이 생물학적 시료 내에서 증폭 가능한 상태로서의 온전성을 어느 정도의 수준으로 유지하고 있는지 여부를 의미한다.
이를 위해, 본 발명에서는 전술한 기준에 따라 선정된 "내부 품질 대조 부위"의 핵산을 증폭하고 그 카피수를 분석함으로써, 특정 생물학적 시료에 분석하고자 하는 핵산 영역이 상기 내부 품질 대조 부위와 동등한 수준의 카피수로 포함이 되어 있다고 판단한다.
본 발명에서 상기 "정해진 역치값"이란 분석 대상이 되는 핵산 영역의 종류 및 분석의 목적에 따라 통상의 기술자가 예비 실험을 통해 설정할 수 있는 값으로서, 상기 생물학적 시료의 채취, 보관 및 처리 방법 등 핵산의 품질에 영향을 줄 수 있는 환경적인 영향을 고려하여 결정할 수 있으며, 또는 DIN(DNA integrity number) 측정, 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 등과 같은 보조 실험 결과를 반영하여 결정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 316개의 모든 시료를 저장기간, DIN 값 및 iQC 카피수에 따라 네 그룹으로 분류했다. 또한, 316개 검체에 대해서 보관 기간에 따라 DIN값과 iQC index 값에 대한 분포를 보았다. 보관기간 6년을 기준으로 6년이 초과되어 보관된 검체는 DIN값과 iQC index값이 현저하게 감소하는 것을 관찰 하였다(도 5, 도 6). 6년 이상 저장된 블록에서 선택한 169개의 시료 중에서 57개의 불일치성 시료에 대한 DIN 값을 분석했다. 불일치성 시료 대부분의 DIN 값은 2.5 미만이었다(도 7). 블록 저장기간이 6년 미만인 147개 시료 중 26개 시료가 DIN 기준을 충족하지 못했고 그룹 1에 포함되었다. iQC index 기준을 설정하기 위해, 그룹 1에서 60개의 불일치성 시료를 재분석했으며, 거의 모든 시료(58/60)의 iQC index가 0.5 미만이었다(도 8).
이 결과를 바탕으로, 시료 선택 기준을 [블록 저장 기간 = 6 년, DIN> 2.5, iQC index = 0.5]로 설정했다. 또한 ddEGFR iQC index와 DIN 값 사이에 강한 상관관계가 있음을 확인했으며 (표 10), iQC index의 임상적 유용성을 검증하기 위하여 iQC index만을 적용하여 일치도를 평가 한 결과 iQC index와 DIN값을 동시 적용한 일치도와 유사하게 도출되었다 (표 11). 따라서 iQC index가 핵산의 품질을 나타내고 있음을 뒷받침해 주는 것이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자는 316개의 NSCLC FFPE 조직을 상온에서의 저장 기간에 따라 두 그룹으로 분류한 후 이들 그룹간에 EGFR 엑손 18번 내지 21번의 내부 대조군 품질 지표 차이를 확인해 보았다. 그 결과, 저장기간이 6년을 초과하는 169개의 시료에서는 내부 대조군 품질 지표가 평균 0.31로 나타난 반면에 저장기간이 2년~6년인 147개의 시료에서는 내부 대조군 품질 지표가 평균 1.07로 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 저장기간이 6년을 초과한 NSCLC FFPE 시료의 경우에는 1000 카피수의 입력 DNA(input DNA)를 이용하여 증폭 반응을 진행한다고 하더라도 실제로는 평균 310 카피수의 EGFR 엑손 18번 내지 21번만이 증폭 가능한 주형(template)으로 기능할 수 있는 반면에, 저장기간이 2년~6년인 NSCLC FFPE 시료의 경우에는 입력 DNA와 거의 동일한 카피수의 EGFR 엑손 18번 내지 21번이 증폭 가능한 주형으로서 기능할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서 사용된 FFPE 조직들 중에서 저장기간이 6년을 초과한 FFPE 조직과 6년 이하인 FFPE 조직에서 검출된 EGFR 엑손 18번 내지 21번의 돌연변이 카피수가 동일하다고 하더라도 이를 근거로 환자의 치료 전략을 세우는 것은 문제가 될 수 있다.
상기 실시예와 같은 경우, 실험자는 생물학적 시료의 저장기간이라는 환경적인 영향을 고려하여 내부 대조군 품질 지표로서 역치값을 설정해 볼 수 있을 것이다.
본 발명에서 정해진 상기 "역치값"은 이에 한정되지는 않으나, 0.3 내지 0.9 사이의 임의의 소수로 한자리의 유효숫자를 가지는 소수일 수 있거나, 0.30 내지 0.90 사이의 임의의 소수로 두자리의 유효숫자를 가지는 소수일 수 있거나 0.300 내지 0.900 사이의 임의의 소수로 세자리의 유효숫자를 가지는 소수일 수 있다. 바람직하게는 역치값은 이에 한정되지는 않으나, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 0.50, 0.51, 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.89, 0.90 일 수 있다. 한편 역치값의 설정은 유효숫자에 맞추기 위하여 반올림, 올림 또는 내림하여 정할 수 있다. 또한 역치값은 둘 이상의 표적 유전자 또는 돌연변이에 대해서 서로 동일하게 설정하거나 또는 다르게 설정할 수도 있으며, 둘 이상의 내부 대조군 품질 지표에 대해서 서로 동일하게 설정하거나 또는 다르게 설정할 수도 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명자는 내부 대조군 품질 지표에 따라 시료를 분류하지 않은 채 316개의 NSCLC FFPE 조직에서 추출한 핵산을 이용하여 EGFR 엑손 18번 내지 21번에 존재하는 돌연변이를 검출해 본 결과, 상업적으로 이용 가능한 EGFR 돌연변이 검출 키트(cobas® EGFR Mutation test, Roche 이하 Cobas EGFR), ddPCR-based EGFR (GenesWell?? ddEGFR mutation test 이하 ddEGFR) 키트 및 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 결과 사이에 매우 낮은 일치성이 나타나는 것을 확인하였다. 이는 곧, 분석에 이용된 316개의 NSCLC FFPE 조직 중 다수는 EGFR 유전자 엑손 18번 내지 21번 영역의 온전성이 훼손되어 있어 신뢰성 있는 유전자 돌연변이 검출 결과가 나타나지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명자는 상기 316개의 NSCLC FFPE 조직 중에서 내부 대조군 품질 지표가 0.5 이상인 시료를 선별한 후 이들 시료에서 추출한 DNA를 이용하여 EGFR 엑손 18번 내지 21번에 존재하는 돌연변이를 검출해 본 결과, 상업적으로 이용 가능한 EGFR 돌연변이 검출 키트(cobas EGFR) 및 ddEGFR test 키트를 이용한 결과 사이에 매우 높은 일치율이 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 상기 실시예에서 저장기간이라는 환경적인 영향을 고려하여 설정된 내부 대조군 품질 지표의 역치값(0.5) 이상을 나타내는 생물학적 시료들은 EGFR 엑손 18번 내지 21번의 돌연변이 분석이라는 목적을 위해 적절한 핵산 품질을 나타내고 있는 것으로 판단할 수 있는 것이다.
한편, 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하기 위한 또 다른 방법으로, 상기 (d) 단계에서 산출한 내부 대조군 품질 지표(internal quality control index)가, 예를 들어 1이라면, 생물학적 시료 내에 포함된 내부 품질 대조 부위의 카피수는 입력 DNA의 카피수와 동일하다는 것을 의미하며, 이는 곧 분석하고자 하는 표적 핵산 영역이 생물학적 시료 내에서 손상되지 않고 증폭 가능한 주형(template)의 형태로서 온전성을 유지하고 있다고 판단할 수 있다.
즉, 임상 연구 또는 동반 진단의 목적으로, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 대한 유전자 분석을 수행하기에 앞서 해당 생물학적 시료내에 분석하고자 하는 표적 유전자가 온전한 형태를 유지하고 있는지 여부를 본 발명의 상기 방법에 따라 판단해 볼 수 있으며, 그 결과 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 해당 생물학적 시료 내에 표적 유전자의 온전성이 유지되고 있어 유전자 분석에 적합한 우수한 핵산 품질을 나타내고 있다고 판단할 수 있다.
이에 반해, 본 발명의 상기 방법에 따라 특정 생물학적 시료의 내부 대조군 품질 지표를 산출한 결과, 예를 들어 그 값이 0에 가깝다면, 해당 생물학적 시료에 포함된 표적 핵산 영역 대부분이 온전성을 상실하여(예를 들면, 분절화, 가교결합, 메틸화, 산화적 손상 등) 증폭 가능하지 않은 형태로 존재하고 있으며, 상기 생물학적 시료의 핵산 품질은 우수하지 않은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 (b) 단계에서의 프라이머는 내부 품질 대조 부위의 카피수를 알고 있는 표준(reference standard) 물질에 대한 정량적 PCR을 수행했을 때, [검출된 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
이와 관련된 자세한 사항은 후술하기로 한다.
본 발명은 또한 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법에 있어서, (a) 내부 품질 대조 부위의 핵산 단편을 증폭할 수 있는 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 단계; (b) 표준(reference standard) 물질에 포함된 핵산을 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계; 및 (d) [상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 핵산 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질 결정을 위한 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법을 제공한다.
(a) 내부 품질 대조 부위의 핵산 단편을 증폭할 수 있는 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 단계;
PCR로 유전자의 특정영역을 증폭하려면 프라이머가 되는 2종의 합성된 한가닥(single strand) DNA가 필요하다. 프라이머 및/또는 프로브의 설계와 그에 대응하는 재조건 설정이 PCR의 성패를 결정한다고 볼 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 및/또는 프로브는 상기 내부 품질 대조 부위의 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및/또는 프로브 제조방법과 관련된 당업계에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기"프라이머(primer)" 및 "프로브(probe)"는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계에서 프라이머 설계 디자인시 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 1) 길이, 2) primer 간의 상보성, 3) GC 함량, 4) primer 내의 2차 구조, 5) Tm 값, 6) 사용농도 등이 있으나, 현재는 프라이머 설계용 컴퓨터 프로그램도 시판하고 있어 통상의 기술자라면 검출하고자 하는 내부 품질 대조 부위에 특이적인 프라이머를 디자인 하는 것은 큰 어려움이 없을 것이다. 프라이머 디자인시 고려해야 할 일반적인 사항들은 다음과 같다:
(1) 프라이머의 길이
프라이머의 길이는 15~30 염기가 적당하고, 17~25 염기가 바람직하다. 이 크기의 프라이머는 주형 DNA와 특이적으로 어닐링(annealing)하는데 충분할 수 있다. 단지 LA PCR (long and accurate PCR)의 경우는 30 염기 이상의 primer가 보다 효과적일 수 있다.
(2) 프라이머간의 상보성
2개의 프라이머끼리 어닐링(annealing)하지 않도록 서열을 디자인 하는 것이 바람직하다. 특히 3'말단이 상보적인 프라이머가 되지 않도록 하면 프라이머의 이합체 형성에 따른 증폭 효율 저하의 위험성을 줄일 수 있다.
(3) GC 함량
GC 함량이 50% 전후 (40 내지 60%, 바람직하게는 45 내지 55%)로 설계하는 것이 바람직하며 부분적으로 GC 혹은 AT-rich가 되지 않도록 한다. 또 프라이머의 3'말단과 주형 DNA와 안정한 결합이 되도록 프라이머의 3'부근이 AT-rich가 되지 않도록 한다.
(4) 프라이머 내의 2차구조
프라이머 자신의 2차구조의 형성을 피하기 위하여 자기 상보서열을 갖지 않도록 한다.
(5) Tm 값
이중 가닥 DNA가 단일 가닥 DNA로 되는 온도변화에 있어서 그 중간값을 Tm (melting temperature)이라고 하며 이 값은 DNA의 길이, 염기 조성에 따라 다르게 나타나며 이 값이 높을수록 강하게 결합된다는 것을 의미한다. 프라이머-주형 DNA 혼성체의 안정성은 Tm 값에 의해 결정되는데, 이 값은 실험치를 바탕으로 한 하기 계산식을 통해 구할 수도 있다.
Tm = 4℃ x (G+C의 수) + 2℃ x (A+T의 수)
이 공식은 G+C 염기쌍이 A+T 염기쌍보다 안정하다는 것에 기초를 두고 있다. 주로 이 공식을 이용하여 Tm 값이 비슷한 프라이머를 설계하는데, 실제 어닐링(annealing)하는 온도는 Tm 값보다 2~3℃ 정도 낮아야 프라이머가 표적 유전자의 원하는 위치에 정확히 결합할 수 있다.
그러나 상기 식은 N(염기의 수)이 14이하일 때 적합한 식이며 N>14일 때는 Tm = 64.9 + 41 x (G+C의 수 - 16.4)/N의 식으로 구한다. 또 이러한 Tm 값은 주변의 염(salt) 농도에 의해 변할 수 있기 때문에 이러한 변수를 보정한 식으로 Tm = 81.5 + 16.6 x {log10([Na+] + [K+])} + 0.41 x (% GC) - 675/N 을 이용하기도 한다. 하지만 이러한 계산식은 이미 프로그램으로 나와 있고 염기서열만 알면 쉽게 Tm을 구할 수도 있다.
(6) 기타 고려사항
검출하고자 하는 표적 유전자의 돌연변이 부위를 피하여 선정(야생형 부위를 선정)한 후, SNP 가 빈번하게 발생하는 (5% 이상, 바람직하게는 1%이상, 더 바람직하게는 0.5%이상) 위치인지 파악한 후, 프라이머를 디자인하고, 디자인된 프라이머 서열의 게놈 상의 다른 서열과의 Homology를 비교하여 비특이결합 가능성을 배제하는 단계를 거쳐 디자인되며, 상기 고려사항에 해당되는 경우 배제하는 것이 바람직하다.
또한, 프라이머 및/또는 프로브가 결합되는 부위가 표적 유전자 (또는 표적 유전자 내의 돌연변이) 또는 돌연변이 부위와 "인접한 부위"가 아닌 경우도 배제하는 것이 바람직하다. 상기 "인접한 부위"에 대해서는 전술한 바와 같다.
전술한 바와 같은 일반적인 사항들을 고려하여 검출하고자 하는 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 다양한 서열의 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트를 디자인 한 후, 이하의 단계들을 통해 최적의 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트를 선별할 수 있다.
(b) 표준(reference standard) 물질에 포함된 핵산을 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계
상기 (a) 단계에서 디자인된 다양한 서열의 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행하고, 상기 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계로서 PCR을 수행하는 방법 및 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 방법에 대한 자세한 사항은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 표준(reference standard) 물질은 표적 유전자의 카피수가 기 설정된 물질로서, 예를 들어, 야생형 EGFR 유전자를 가진 세포주에 유전자 가위 기법 (CRISPR/Cas9)을 사용하여 EGFR 주요 돌연변이를 인위적으로 도입하여 EGFR 돌연변이를 갖는 세포를 만든 후, 돌연변이 세포와 야생형 세포를 일정한 비율로 혼합한 후에 이를 파라핀으로 고정하여 FFPE 블록을 제작한 것으로 일정한 비율의 돌연변이율을 가지는 표준 물질로 기능을 할 수 있다. 표준 물질은 horizon 사 등에서 표 3과 같은 상업적으로 구매 가능한 상품들을 이용할 수도 있다.
Gene Amino Acid Change Chromosome Exon Transcript ID(GRCh37) COSMIC ID dbSNP ID
ABL1 T315I chr9 Exon6133748247_133748424 ENST00000318560 COSM12560 rs121913459
ABL2 P986fs chr1 Exon12179078576_179068462 ENST00000344730 COSM2095020 N/A
AKT1 E17K chr14 Exon4105246553_105246425 ENST00000349310 COSM33765 rs121434592
ALK F1174L chr2 Exon2329443689_29443560 ENST00000389048 COSM28055 N/A
ALK P1543S chr2 Exon229415640_29416788 ENST00000389048 COSM2941442 N/A
APC R2714C chr5 Exon5112173250_112181936 ENST00000257430 COSM2991126 N/A
ARID1A P1562fs chr1 Intron ENST00000324856 N/A N/A
BRAF V600E chr7 Exon7140453075_140453193 ENST00000288602 COSM476 rs113488022
BRAF V600G chr7 Exon7140453075_140453193 ENST00000288602 COSM6137 rs113488022
BRAF V600K chr7 Exon7140453075_140453193 ENST00000288602 COSM473 rs121913227
BRAF V600M chr7 Exon7140453075_140453193 ENST00000288602 COSM1130 rs121913378
BRAF V600R chr7 Exon7140453075_140453193 ENST00000288602 COSM474 rs121913227
BRCA2 A1689fs chr13 Downstream ENST00000380152 N/A N/A
CCND2 N/A chr12 N/A ENST00000261254 N/A rs3217808
CDH1 N/A chr16 3'UTR ENST00000261769 N/A N/A
CDX2 V306fs chr13 Exon328537506_28536274 ENST00000381020 N/A N/A
CTNNB1 S33Y chr3 Exon341266017_41266202 ENST00000349496 COSM5673 rs121913400
CTNNB1 S45del chr3 Intron ENST00000426215 COSM12628 N/A
EGFR G719S chr7 Exon1855241614_55241736 ENST00000275493 COSM6252 rs28929495
EGFR L858R chr7 Exon2155191719_55191874 ENST00000275493 COSM6224 rs121434568
EGFR L861Q chr7 Exon2155191719_55191874 ENST00000275493 COSM6213 rs121913444
EGFR T790M chr7 Exon2055248986_55249171 ENST00000275493 COSM6240 rs121434569
EGFR ΔE746-A750 chr7 Exon2055248986_55249171 ENST00000275493 COSM6223 rs121913421
EGFR S768I chr7 Exon1955174772_55174870 ENST00000275493 COSM6241 rs121913465
EGFR G719A chr7 Exon2055248986_55249171 ENST00000275493 COSM6239 rs121913428
EGFR S492R chr7 Exon1855241614_55241736 ENST00000275493 COSM236670 N/A
EGFR V769_D770insASV chr7 Exon1225398208_25398329 ENST00000275493 COSM12376 N/A
EP300 K291fs chr22 Intron ENST00000263253 N/A N/A
FANCA E345fs chr16 Downstream ENST00000389301 N/A N/A
FBXW7 G667fs chr4 Intron ENST00000263981 N/A N/A
FGFR1 P124L chr8 Exon838285439_38285611 ENST00000335922 N/A N/A
FGFR2 S252W chr10 Exon7123279683_123279493 ENST00000358487 COSM36903 rs79184941
FLT3 D835Y chr13 Exon2028592726_28592604 ENST00000241453 COSM783 rs121913488
FLT3 S985fs chr13 Intron ENST00000241453 N/A N/A
FLT3 V197A chr13 Exon1328626682_28626811 ENST00000241453 COSM2070177 N/A
FLT3 ΔI836 chr10 Exon2028592726_28592604 ENST00000241453 COSM797 rs121913490
GNA11 Q209L chr19 Exon53118922_3119051 ENST00000078429 COSM52969 N/A
GNAQ Q209L chr9 Exon580409524_80409653 ENST00000286548 COSM28757 rs121913492
GNAS R201C ch20 Exon857484405_57484478 ENST00000371085 COSM27887 rs11554273
IDH1 R132C chr2 Exon4209113384_209113093 ENST00000345146 COSM28747 rs121913499
IDH1 R132H chr2 Exon4209113384_209113093 ENST00000345146 COSM28746 rs121913500
IDH1 S261L chr2 Exon2209106718_209106869 ENST00000345146 COSM1669701 N/A
IDH2 R140Q chr15 Exon490631979_90631819 ENST00000330062 COSM41590 rs121913502
IDH2 R172K chr15 Exon490631979_90631819 ENST00000330062 COSM33733 rs121913503
JAK2 V617F chr9 Exon145073698_5073785 ENST00000381652 COSM12600 rs77375493
KIT D816V chr4 Exon1755599236_55599358 ENST00000288135 COSM1314 rs121913507
KRAS A146T chr12 Exon425378707_25378548 ENST00000256078 COSM19404 rs121913527
KRAS A59T chr12 Exon325380346_25380168 ENST00000311936 COSM546 rs121913528
KRAS G12A chr12 Exon22539869_2539748 ENST00000256078 COSM522 rs121913529
(d) [검출된 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머 세트를 선택하는 단계;
본 발명의 상기 프라이머 및 프로브 제조방법에 따라 제조된 프라이머 및 프로브는, 생물학적 시료에 포함된 표적 유전자의 온전성을 판단하기 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 따라서, 표적 유전자의 염기서열 중에서 선택된 내부 품질 대조 부위에 대한 민감도가 매우 높은 프라이머를 선별하는 것이 중요하며, 이를 위해 상기 (d) 단계의 선별 방법이 적용이 될 수 있다.
상기 표준(reference standard) 물질의 입력 DNA(input DNA) 카피수는 정량을 통해 수치화 할 수 있으며, 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수는 상기 (c) 단계에서 산출된 수치를 대입할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 디자인한 다양한 염기 서열의 프라이머; 또는 프라이머및 프로브 세트들은 여러가지 요인들에 의해 서로 다른 민감도와 특이도를 나타낼 수 있으며, 표준 물질의 입력 DNA 카피수와 특정 염기 서열의 프라이머를 이용하여 검출된 내부 품질 대조 부위의 카피수의 비율이 1에 가까울수록 내부 품질 대조 부위에 대한 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 높다고 판단할 수 있다.
따라서, 검출된 상기 내부 품질 대조 부위 카피수가 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수에 대응되는 것, 다시 말하면, 실험에 사용된 표준 물질의 핵산 카피수만큼 내부 품질 대조 부위 카피수가 도출되는지를 선택의 기준으로 한다. 보다 상세하게는 본 발명에서는 상기 [검출된 상기 내부 품질 대조 부위 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]값이 0.90~1.10, 바람직하게는 0.91~1.09, 0.92~1.08, 0.93~1.07, 0.94~1.06, 0.95~1.05, 0.96~1.04, 0.97~1.03, 가장 바람직하게는 0.98~1.03인 프라이머를 선별할 수 있다. 또한, 대조부위의 증폭 정도 (amplitude)값이 낮은 경우 추후의 실험이 곤란하므로 상기 범위를 만족하는 여러 개의 프라이머 중 가장 높은 증폭값을 가지는 프라이머 또는 프라이머와 프로브 세트를 선택하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (프라이머 단독 또는 프라이머 및 프로브 세트에 포함되는 프라이머를 모두 나타냄)는 프라이머 디자인에 있어서 추가로"인접한 부위"와 [검출된 상기 내부 품질 대조 부위 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]값이 0.90~1.10을 충족하는 것일 수 있다.
이상의 방법에 따라 제조된 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트는 표적 핵산 영역의 염기서열 내 내부 품질 대조 부위에 대한 민감도가 매우 높기 때문에, 생물학적 시료 내에서 표적 핵산 영역이 증폭 가능한 형태의 온전성을 유지하고 있는지 여부를 확인하는데 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 제1의 PCR을 수행하는 단계; (c) 상기 제1의 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 단계; (d) 상기 추출된 핵산을 표적 유전자 또는 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 iii) 프라이머; 또는 iv) 프라이머 및 프로브 세트;로 제2의 PCR을 수행하는 단계; (e) 상기 제2의 PCR 결과로부터 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및 (f) 하기 수식에 따라 %돌연변이 지수 (% mutation index)를 산출하는 단계: %돌연변이 지수 = 상기 표적유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수 / 상기 대조부위의 카피수 Х 100; 를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자의 %돌연변이 지수의 산출 방법을 제공한다.
유전자의 돌연변이 분석은 인간 유전질환 진단, 약물 유전학, 약물 개발 그리고 미생물학 등 다양한 임상 분석 및 진단 분야에서 그 중요성이 강조되면서 빠르게 성장하고 있다. 유전학 분야에서 돌연변이는 DNA를 구성하는 염기서열의 변화를 말하며 전좌, 역위를 비롯하여 특정 유전자의 인프레임 내 삽입/결실, 염기 치환 및 단일염기다형성(SNP)이 포함된다. 유전자의 돌연변이를 분석하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 방법은 PCR 방법이다. 다른 돌연변이 분석법과 비교해 PCR은 빠르고, 민감도와 특이도가 높으며 분석 비용이 저렴하고 또한 쉽게 자동화가 가능하다는 장점이 있다.
한편, 종래 PCR을 이용한 유전자 돌연변이 검출 방법에서는 입력 DNA(input DNA) 대비 돌연변이의 비를 계산함으로써 돌연변이 비율(mutational frequency)을 산출하는 것이 일반적인 방법이었다. 하지만, 전술한 바와 같이 돌연변이를 검출하고자 하는 생물학적 시료는 시료의 수집, 보관 및 전처리 과정과 같은 일련의 처리과정을 거치며 핵산에 다양한 형태의 변형이 나타날 수 있고, 이러한 변형으로 인해 검출되어야 할 돌연변이가 포함된 핵산이 PCR에 의해 증폭이 가능한 주형(template)의 형태로 보존이 되어 있지 않다면, 산출된 돌연변이 비율은 실제 생물학적 시료의 핵산에 발현된 돌연변이의 비율과 많은 차이를 나타낼 수 있다는 문제가 있다.
이에, 본 발명자는 생물학적 시료의 핵산 품질을 평가하는 상기 내부 대조군 품질 지표(internal quality control index, iQC index)의 개념을 돌연변이율 산출 방법에 적용하여, 실제로 증폭이 가능한 주형(template)의 카피수 대비 돌연변이 카피수의 비율을 나타낸 새로운 개념의 %돌연변이 지수(%mutation index, MI)를 고안함으로써, 생물학적 시료의 핵산에 포함된 특정 돌연변이의 발현율을 표준화하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 %돌연변이 지수는 하기 식에 따라 산출이 될 수 있다:
%돌연변이 지수 = [상기 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수 / 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 Х 100] (단위 : %)
본 발명의 상기 방법에서 "표적 유전자"와 "내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)"는 전술한 바와 같다.
상기 내부 품질 대조 부위가 PCR 증폭이 가능하다는 것은, 검출하고자 하는 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 핵산 영역(야생형 및 돌연변이형 모두 포함)도 증폭이 가능한 형태의 주형(template)인 것으로 판단할 수 있으며, 상기 기준을 만족하는 내부 품질 대조 부위가 PCR 증폭이 불가능하다는 것은, 검출하고자 하는 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 핵산 영역(야생형 및 돌연변이형 모두 포함)도 다양한 형태의 변형이 나타나 증폭이 불가능한 형태인 것으로 판단할 수 있다.
따라서, 상기 식에서 "상기 내부 품질 대조 부위의 카피수" 값은 검출하고자 하는 돌연변이가 발생하는 부위를 포함하는 핵산 영역(야생형 및 돌연변이형 모두 포함)의 증폭 가능한 카피수와 동일한 것으로 간주할 수 있고, 이를 근거로 검출된 돌연변이 카피수를 표준화 할 수 있다.
상기 산출식을 참고하면, 본 발명의 상기 %돌연변이 지수는 입력 DNA 대비 돌연변이 비율을 산출했던 종래 돌연변이 비율과 달리, 실제로 증폭이 가능한 주형(template) 대비 돌연변이의 비율을 나타냄으로써, 분석 대상인 생물학적 시료의 핵산에 포함된 돌연변이의 실제 발현 비율과 가장 근접한 객관적인 수치를 제공할 수 있다는 점에서 매우 의미가 크다.
예를 들어, 정량적 PCR을 수행하기 위해 입력한 DNA의 카피수가 1000이고 정량적 PCR에 의해 검출된 돌연변이 부위의 카피수가 200이라면 종래 방법에 따라 산출된 돌연변이 비율은 20%가 된다. 하지만, 상기 입력한 DNA 1000 카피 중에서 여러가지 형태의 핵산 변형에 의해 실제로 증폭이 가능했던 주형(template)이 500 카피에 불과했다면(즉, 내부 품질 대조 부위의 카피수가 500 이었다면) 상기 20%의 돌연변이 비율은 객관적인 수치가 될 수 없다. 반면에, 본 발명에서 제시하는 상기 %돌연변이 지수에 따르면, [돌연변이 유전자 200 카피 / 증폭이 가능했던 주형 500 카피 × 100] = 40%가 되고, 상기 40% 라는 수치가 분석 대상인 생물학적 시료의 핵산에서 발현된 돌연변이 비율을 표준화하여 객관적으로 나타내는 수치라고 할 수 있다.
본 발명에서 상기 %돌연변이 지수 산출 방법에 포함된 각 단계들에는 상기 핵산 품질을 결정하는 방법의 각 단계들에 적용된 방법들이 동일하게 적용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 (b) 내지 (e) 단계는 내부 품질 대조 부위를 증폭할 수 있는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트와 표적 유전자 또는 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트를 혼합하여 다중(multiplex) PCR 반응으로 하나의 절차에서 수행될 수 있으며, 이 때 상기 각 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트는 상호간에 간섭반응이 일어나지 않고 각각 독립적으로 상보적인 서열을 높은 특이도와 민감도로 증폭할 수 있도록 각 프라이머; 또는 각 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 것이 바람직하다.
또한, (b) 및 (c) 단계의 제1의 PCR 수행을 통한 내부 품질 대조 부위의 카피수를 산출하는 것과 (d) 및 (e) 단계의 제2의 PCR 수행을 통한 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수를 산출하는 것은 서로 동시에, 순차적으로 또는 순서를 바꾸어 진행될 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명은 또한 상기 표적 유전자는 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR) 엑손 18번 내지 21번이며, 상기 돌연변이는 표피성장인자 수용체 엑손 18번 내지 21번에서 나타나는 염기의 인프레임 결손, 인프레임 삽입 및 치환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 EGFR은 폐암 치료의 표적으로 인식되고 있는 타겟으로 EGFR을 표적으로 하는 암 치료법의 대표적인 예로, EGFR 타이로신 키나아제 저해제(EGFR tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI)의 개발을 들 수 있다. 현재 폐암, 특히 비소세포폐암 치료에 유용한 타이로신 키나아제 억제제로서 제피티닙(gefitinib, Iressa) 과 엘로티닙(erlotinib, Tarceva)이 개발되어 있다. 그런데, 상기 EGFR 타이로신 키나아제 저해제들은 임상에 적용시 많은 환자들에게서 내성을 나타내거나 처음부터 반응을 나타내지 않으며, 진행된 폐암 환자들 중 단지 10 내지 15% 만이 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 것으로 알려져 있다. 이에 대한 종래의 연구 결과, EGFR의 키나아제 도메인에서의 체세포 돌연변이의 존재가 EGFR 키나아제 저해제 약물의 민감성을 현저하게 증가시킨다는 것이 발견되었다. 상기 EGFR 돌연변이는 여성, 아시아인, 비흡연자, 및 선암(adenocarcinoma)성 폐암 환자에서 주로 관찰되며, 이러한 돌연변이의 존재는 약물 반응성 및 환자의 예후와 관계가 있다. EGFR의 돌연변이는 주로 엑손 18 내지 엑손 21번에서 대부분 관찰되며, 그 중에서도 엑손 19 내의 인프레임 결실이나 엑손 21 내의 L858R 점돌연변이가 가장 흔한 돌연변이형이고, 특히 T790M 점돌연변이가 EGFR 키나아제 저해제 약물에 대한 저항성에 크게 기여하고 있음이 보고된 바 있다. EGFR 돌연변이가 있는 비소세포폐암 환자는 EGFR 돌연변이가 없는 비소세포 폐암 환자에 비하여 EGFR 키나아제 저해제 약제에 대한 반응성이 현저하게 우수하여 유의한 생존률의 증가가 보고되었다. 이와 같이, EGFR 돌연변이의 존재는 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 본 발명의 상기 방법에 따라 EGFR 돌연변이를 객관적이고 신뢰성 있게 검출하는 것이 중요하다.
바람직하게, 본 발명에서 상기 EGFR 엑손 18번 내지 21번에서 나타나는 돌연변이는 하기 표 4에 나열한 돌연변이들 중 1종 이상일 수 있다.
No. Target exon COSMIC No. Target mutant A.a Target mutant site
1 Exon19 6223 p.E746_A750del c.2235_2249 del 15
2 13551 p.E746_T751>I c.2235_2252 > AAT
3 12728 p.E746_T751del c.2236_2253 del 18
4 12678 p.E746_T751>A c.2237_2251 del 15
5 12367 p.E746_S752>A c.2237_2254 del 18
6 12384 p.E746_S752>V c.2237_2255>T
7 6225 p.E746_A750del c.2236_2250 del 15
8 6220 p.E746_S752>D c.2238_2255 del 18
9 13550 p.E746_A750>IP c.2235_2248>AATTC
10 12403 p.L747_S752>Q c.2239_2256>CAA
11 12422 p.L747_A750>P c.2238_2248 >GC
12 12419 p.L747_T751>Q c.2238_2252 >GCA
13 6218 p.L747_E749del c.2239_2247 del 9
14 12382 p.L747_ A750>P c.2239_2248 TTAAGAGAAG>C
15 6210 p.L747_T751>S c.2240_2251 del 12
16 12383 p.L747_T751>P c.2239_2251>C
17 13552 p.E746_T751>IP c.2235_2251>AATTC
18 6254 p.L747_T751del c.2239_2253 del 15
19 6255 p.L747_S752del c.2239_2256 del 18
20 12387 p.L747_P753>Q c.2239_2258 >CA
21 12370 p.L747_P753>S c.2240_2257 del 18
22 12416 p.E746_T751>VA c.2237_2253>TTGCT
23 - - c.2239_2257>GT
24 26038 p.K745_E749del c.2233_2247del15
25 13556 p.S752_I759del c.2253_2276del24
26 12386 p.E746_T751>V c.2237_2252>T
27 12385 p.E746_S752>I c.2235_2255>AAT
28 18427 p.E746_P753>VS c.2237_2257>TCT
29 12369 p.L747_T751del c.2240_2254 del 15
30 23571 p.L747_T751delLREAT c.2238_2252 del 15
31 Exon20 6240 p.T790M c.2369C>T
32 Exon21 6224 p.L858R c.2573T>G
33 12429 p.L858R c.2573_2574TG>GT
34 Exon18 6239 p.G719A c.2156G>C
35 6252 p.G719S c.2155G>A
36 6253 p.G719C c.2155G>T
37 Exon20 6493937 p.C797S c.2389T>A
38 5945664 p.C797S c.2390G>C
39 - p.C797S c.2388, 89 CT>AA
40 Exon20 6241 p.S768I c.2303G>T
41 Exon20 12376 p.V769_D770insASV c.2307_2308 insGCCAGCGTG
42 12377 p.H773_V774insH c.2319_2320 insCAC
43 12378 p.D770_N771insG c.2310_2311 insGGT
44 13428 p.D770_N771insSVD c.2311_2312insGCGTGGACA
45 13558 p.V769_D770insASV c.2309_2310AC>CCAGCGTGGAT
46 Exon21 6213 p.L861Q c.2582T>A
본 발명은 또한 (a) 생물학적 시료에서 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율(mutational frequency)를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 돌연변이 비율을 상기 시료의 내부 대조군 품질 지표(internal quality control index, iQC index)로 나누어 표준화된 돌연변이 비율을 산출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율(mutational frequency)의 표준화 (normalization) 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 "돌연변이 비율(mutational frequency)"는 [PCR에 의해 검출된 돌연변이 부위의 카피수 / 입력 DNA(input DNA)의 카피수]의 값을 의미하는 통상적으로 지칭되는 돌연변이 비율이며, 본 발명에서의 MI (mutation index)는 이와 상이한 것이다. 아울러, 상기 "내부 대조군 품질 지표"는 전술한 바와 같다.
상기 [PCR에 의해 검출된 돌연변이 부위의 카피수 / 입력 DNA(input DNA)의 카피수]에서 "돌연변이 부위의 카피수"는 전술한 바와 같이, 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머; 또는 프라이머 및 프로브 세트로 PCR을 수행함으로써 산출될 수 있다.
본 발명의 상기 돌연변이 비율 표준화 방법에 따르면, 각 생물학적 시료간 돌연변이의 발현비를 객관적으로 비교할 수 있어 임상 연구 및 동반 진단 분야에서 신뢰성 있는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 유전자 분석에 이용되는 생물학적 시료의 핵산 품질을 객관적으로 평가할 수 있고 유전자 돌연변이의 발현 비율에 대한 객관적인 결과를 제시할 수 있어, 임상 연구 및 동반 진단 분야에서 신뢰성 있는 정보를 제공하는데 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명에서 생물학적 시료(FFPET)를 선별하는 기준 및 이에 따라 선별된 시료의 개수를 나타내는 모식도이다(A: 시료 선정 기준을 확립하기 위한 전임상 시험 work flow, B: 후향적 비교 시험을 위한 시료의 선별 기준 work flow, D/O: Drop Out).
도 2는 정상 FFPE 블록을 사용하여 거짓-양성 분석(false-positive analysis)을 기반으로 하는 적절한 컷-오프(cut-off) 결정 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 ddEGFR 실험의 내부 품질 컨트롤의 검증 결과를 나타낸 것으로, EGFR 돌연변이에 대한 각 FFPE 참고 표준 DNA 추출물을 ddEGFR 테스트에 사용하기 위해 검증된 1.5% 돌연변이 수준을 표적으로 한 고정된 양의 야생형 gDNA(3.3 ng, 1,000GE)와 혼합하였다. 값은 9회 실험의 평균±SD(mean±SD)로 표시하였다.
도 4는 ddEGFR 실험의 내부 품질 컨트롤의 검증 결과를 나타낸 것으로, 각 FFPE 참고 표준 DNA 추출물을 4단계의 연속적인 희석액으로 제조하였고, ddEGFR 실험을 실시하였다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 값은 3회 실험의 평균±SD(mean±SD)로 표시하였다.
도 5는 시료 선택 기준을 확립하기 위한 실험 결과를 나타낸 것으로, 시료의 저장기간에 따른 ddEGFR iQC index의 분포를 나타낸 도면이다(검정 실선은 결과값의 평균을 나타냄).
도 6은 시료 선택 기준을 확립하기 위한 실험 결과를 나타낸 것으로, 시료의 저장기간에 따른 DIN 값의 분포를 나타낸 도면이다(검정 실선은 결과값의 평균을 나타냄).
도 7은 시료 선택 기준을 확립하기 위한 실험 결과를 나타낸 것으로, 결과가 일치하지 않았던 시료들의 저장기간과 DIN 값과의 상관관계를 나타낸 도면이다(검정 실선은 결과값의 평균을 나타냄).
도 8은 시료 선택 기준을 확립하기 위한 실험 결과를 나타낸 것으로, 결과가 일치하지 않았던 시료들의 저장기간과 iQC index와의 상관관계를 나타낸 도면이다(검정 실선은 결과값의 평균을 나타냄).
도 9는 불일치 시료들의 재분석 실험 진행 과정을 나타낸 모식도이다.
도 10은 그룹 3에서 불일치 결과를 나타냈던 11개의 시료들 중 8개의 시료를 재분석한 결과를 나타낸 표이다(MD: mutation detected, MND: mutation not detected, N/A: FFPE blocks not available). 11개의 시료들 중 8개는 생어 시퀀싱에 의해 검증되었다.
도 11은 후향적 비교 시험군에서 시료의 저장기간에 따른 iQC index(A)와 DIN(B)의 분포를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명에 따른 iQC index의 개념을 요약하여 설명한 도면이다.
도 13은 본 발명에 따른 돌연변이 지수(mutation index, MI)의 개념을 요약하여 설명한 도면이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 연구 설계
시료 기준을 확립하기 위해, 비소세포성폐암(NSCLC) 환자로부터 얻은 총 316개의 시료로 EGFR 돌연변이에 대한 실험을 실시하였다. ddEGFR 및 cobas EGFR 테스트 결과 모두에 대해 이러한 전-임상적 데이터의 post-hoc 분석이 수행되었다. 확립된 시료 기준을 기반으로, ddEGFR과 cobas EGFR 검사간의 일치도를 평가하기 위해 독립적인 후향적 비교 연구가 수행되었다; 이를 위해 NSCLC 환자에서 채취한 228개의 FFPET-DNA 시료를 두 가지 검사로 분석 하였다. 두 가지 EGFR 돌연변이 검사는 독립적인 실험(Abion Inc., Seoul, Korea)에 의해 더블-블라인드(double-blind)방식으로 수행되었다. 연구 설계(workflow)에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.
주요 연구 목적은 1) PCR을 이용한 유전자 분석에 적합한 최소한의 생물학적 시료의 DNA 품질을 결정하기 위한 기준을 수립하고, 2) ddEGFR 및 cobas EGFR 검사의 결과를 비교를 통해 본 발명의 기술을 검증하는 것이었다.
2. FFPET 수집, DNA 추출, DNA 양 및 품질의 결정
2005년부터 2014년까지 수집된 NSCLC 환자 (n=316)의 절제 또는 생검 시료의 FFPET(Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue) 블록을 삼성 병원(n=200)(SMC, 서울), 아산 병원 (n=66) (AMC; 서울) 및 세브란스 병원(n=50)(서울)의 병리과로부터 수득하였다. 이 연구는 SMC와 서울 대학교의 Institutional Review Board(IRB)(연구 ID : SMC-2014-05-084-002)의 승인을 받았다. 후향적 비교 연구를 위해, 2010년과 2016년 사이에 수집된 NSCLC 환자의 228개의 보관된 FFPET 블록을 SMC 병리과에서 획득했다. 이 연구는 SMC의 한국 식품 의약품 안전부의 IRB(Study ID : SMC-2016-07-104-002)의 승인을 받았다.
환자 정보는 분석 전에 익명 처리하였다. 각 FFPET에서, 10㎛ 단면을 잘라내어 DNA 추출을 실시했다. 병리학자(S.W.C.)에 의해 표시된 종양 병변을 포함하는 H&E로 염색된 절편을 스캔하였고, Pannoramic Viewer Software v.1.15.4 (3DHISTECH, Budapest, Hungary)를 사용하여 암/정상(cancer/normal; C/N) 비율을 계산하였다. VERSANT® Tissue Preparation Reagents를 포함하는 자동화된 Tissue Preparation System(TPS, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)을 사용하여 FFPET에서 DNA 추출을 수행했다. 전체 핵산은 100μL elution buffer로 용출시켰다. 모든 시료에 대해 Qubit?? 3.0 형광 측정기(ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 DNA 농도를 측정했다. Genomic DNA Screen Tape(Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하는 2200 TapeStation 시스템에서 게놈 DNA (gDNA)의 DNA 단편화 수준을 반영한 DNA integrity number(DIN)를 분석했다.
3. ddEGFR 검사의 내부 품질 컨트롤(Internal quality control, IQC) 검증
ddEGFR 검사(Gencurix Inc., Seoul, Korea)는 4가지 반응을 사용하여 EGFR 유전자의 엑손 18-21 영역 내 45개 돌연변이 부위를 검출하는 고감도 ddPCR-기반 진단 검사로 설계되었다. Fluorophores FAM?? 또는 HEX??를 포함하는 증폭된 단편은 도트(droplet)로 표시되고, 푸아송 분포(Poisson distribution)에 따라 농도(copies/20 μL)를 계산하는 데 사용할 수 있다.
분석에 의해 검출된 EGFR 돌연변이의 세부 사항을 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00001
비-임상 연구는 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)와 Korea-MFDS에서 승인 받은 지침을 따랐다. ddEGFR의 내부 품질 컨트롤을 검증하기 위해, EGFR 돌연변이를 포함하는 FFPE 참고 표준 DNA 추출물(HDx?? Reference Standard, Horizon Discovery, Cambridge, UK)을 야생형 gDNA의 고정된 양(3.3 ng, 1,000 GE; Promega, Fitchburg, WI, USA) 및 1.5%의 표적 돌연변이 지수(mutation index, MI)를 갖는 각 시료에 혼합하였다. 또한, 각 시료의 4개의 연속적인 희석액(9.9ng, 6.6ng, 3.3ng 및 1.65ng)을 준비하였고, ddEGFR 검사를 사용하여 분석했다. 각 시료의 iQC 카피수(copies) 및 표적 MI는 입력 DNA 농도 및 표적 MI(1.5 %)를 기준으로 확인하였다(본 발명에서 iQC 카피수는 본 실험에서 사용된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 특정 FFPET 시료에서 검출된 EGFR 유전자의 카피수를 의미한다).
3. 바이오마커 분석
ddEGFR 검사는 Droplet Digital?? PCR(ddPCR) 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 주형 DNA 3.3ng(1,000 GE)/반응을 포함하는 20μL 부피에서 수행되었다. ddPCR 분석은 종래 보고된 방법에 따라 수행되었다. 검출 임계값은 비-주형 대조군 웰 및 야생형 gDNA(Promega)를 함유한 음성 대조군 웰로부터의 결과를 기반으로 하여 수동으로 설정하였다. cobas EGFR 검사(Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA)에 대한 PCR 증폭을 cobas® z480 분석기에서 수행하였다. cobas EGFR 검사에는 150ng의 전체 입력 DNA(total input DNA)가 필요하다. 상기 두 종류의 돌연변이 검사방법은 double-blind 방식으로 분석하였고, 그 결과를 분석 후에 비교하였다.
2x 양방향 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)에 의한 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 스크리닝을 위해, 표적 유전자를 PCR로 증폭시키고 증폭된 시료를 검증된 프로토콜을 사용하여 독립적인 실험실(Macrogen, Seoul, Korea)에서 처리 하였다. 생어 시퀀싱 결과는 병리학자 (Y.L.C.)가 교차 점검하고 해석하였다.
4. 방법 상호관계 및 통계 분석
모든 방법에 대한 일치 분석(Agreement analysis)은 상기 표 5의 돌연변이 리포트 콜(call)에 기반하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism??(GraphPad Software Inc., San Diego, USA) 및 R 1.6.12 패키지 'psych'(http://CRAN.R-project.org/package=psych)를 사용하여 수행했다. 일치 분석을 위해 PPA(Positive Percent Agreement), NPA(negative percent agreement) 및 OPA (Overall Percentage Agreement)에 상응하는 95% 신뢰 구간(CI)으로 계산하였다.
<실험결과>
1. ddEGFR 검사에서 내부 품질 컨트롤(iQC) 검증
ddPCR-기반 검사는 본질적으로 매우 고감도이고, FFPET의 특성으로 인해 거짓-양성(false-positive) 결과를 초래할 수 있기 때문에, ddEGFR 검사의 컷-오프는 정상적인 포르말린-고정된, 파라핀 포매 조직(formalin-fixed, paraffin-embedded FFPET)을 사용한 거짓-양성(false-positive) 분석을 기반으로 결정하였다.
돌연변이 콜(calls)은 분석 성능 연구(표 5)로부터 확립된 블랭크 한계(limit of blank, LoB) 및 검출 한계(limit of detection, LoD) 돌연변이 지수 (Mutation index, MI) 보다 높은 참-양성(true-positive) 돌연변이 값에 기초하여 확인하였다. MI는 하기 식 (1)에 따라 계산된 돌연변이와 내부 품질 컨트롤(iQC) 카피수(copies)의 비율을 나타내는 수치이다.
Figure pat00002
ddEGFR 검사에서, 상기 iQC 카피수는 FFPE 참고 표준(FFPE reference standard)을 사용하여 입력 DNA(input DNA)의 농도로 변환될 수 있기 때문에, iQC index(2)가 증폭 가능한 DNA를 나타내는 지수임을 알 수 있다. iQC 카피수는 반응 웰 당 3.3 ng (1,000 게놈 당량[GE])의 입력 DNA를 사용하여 분석하였기 때문에, iQC index를 하기 식 (2)에 따라 계산하였다.
Figure pat00003
40개의 야생형 FFPET 시료를 사용하여, 8개 표적의 돌연변이 calling에 대해 거짓-양성 비율을 결정하였다. 최대 카피수는 반응 1회당 5.4이고, 거짓-양성 비율은 MI의 0.5% 미만이었다(도 2). 본 발명자는 참고 표준을 사용하여 iQC를 평가했다. EGFR 돌연변이가 있는 FFPET-DNA 참고 표준을 1.5% 돌연변이 수준을 목표로 고정된 양의 야생형 gDNA(3.3 ng, 1,000GE)와 혼합했다. 예상되는 iQC index 및 MI는 측정된 입력 DNA의 양으로부터 계산하였는데, 측정된 MI(%)와 iQC index는 예측된 수치(iQC index = 1, MI = 1.5%)와 거의 일치하는 것으로 나타났다(도 3). 또한, iQC는 4개의 농도의 참고 표준FFPET-DNA를 순차적으로 희석하여 검증하였으며, 이는 측정된 값이 예측된 수치와 거의 일치하고(도 4), iQC 카피수가 입력 DNA의 양을 나타내는 것으로 확인되었다.
2. 시료 선택 기준 없이 진행한 ddEGFR 및 cobas EGFR 검사의 비교
316개의 비소세포성 폐암(NSCLC) FFPET 시료에서 EGFR 돌연변이를 ddEGFR 및 cobas 검사를 사용하여 분석하였다. 두 가지 방법 모두 시료 중 하나를 제외하고는 모두 유효한 결과를 산출했다. 놀랍게도 ddEGFR 및 cobas EGFR 검사는 낮은 일치성을 보였다(positive percent agreement (PPA) = 94.04%, negative percent agreement(NPA) = 63.41%, overall percent agreement(OPA) = 78.10%, 카파 계수 값 (κ) = 0.6650)(표 6 및 표 7).
Figure pat00004
Figure pat00005
cobas EGFR 검사는 또한 299개 시료의 생어 시퀀싱(Sanger sequencing) 결과와 매우 낮은 일치성을 보였다(PPA = 59.30%, NPA = 75.00%, OPA = 65.63%, κ = 0.4526)(표 8 및 표 9).
Figure pat00006
Figure pat00007
3. ddPCR 방법을 사용하여 PCR에 적합한 최소 DNA 품질 결정을 위한 개념증명(Proof-of-concept)
ddEGFR과 cobas EGFR 테스트의 일치성을 높이기 위해, iQC 카피수 및 iQC index를 제공하는 ddEGFR 데이터를 재분석하여 PCR 분석에 적합한 최소 DNA 품질을 조사했다(도 3 및 도 4).
FFPET 블록의 저장기간은 증폭 가능한 DNA의 양에 반영되었는데, 7-11년 된 시료에서 증폭 가능한 DNA의 양은 1,000GE의 50%미만으로 감소하였다(iQC index의 평균 = 0.31, 표준 편차, SD = 0.57). 대조적으로 2-6년 된 시료에서 증폭 가능한 DNA의 양은 약 100%였다(iQC index = 1.07, SD = 0.69 평균)(도 5).
따라서 FFPET를 실온에서 보관할 경우 저장기간에 따라 iQC index가 감소했다. 함께 측정된 315개의 FFPET-DNA 시료의 DIN값 패턴은 상기 시료들의 iQC 카피수 및 지수와 유사했다(도 6).
4. FFPET 시료를 이용한 ddEGFR의 iQC index 확립
도 1에 나타난 것처럼 316개의 모든 시료를 저장기간, DIN 값 및 iQC 카피수에 따라 네 그룹으로 분류했다. 먼저, 6년 이상 저장된 블록에서 선택한 169개의 시료 중에서 57개의 불일치성 시료에 대한 DIN 값을 분석했다. 불일치성 시료 대부분의 DIN 값은 2.5 미만이었다(도 7). 블록 저장기간이 6년 미만인 147개 시료 중 26개 시료가 DIN 기준을 충족하지 못했고 그룹 1에 포함되었다. iQC index 기준을 설정하기 위해, 그룹 1에서 60개의 불일치성 시료를 재분석했으며, 거의 모든 시료(58/60)의 iQC index가 0.5 미만이었다(도 8).
이 결과를 바탕으로, 시료 선택 기준을 [블록 저장 기간 ≤ 6 년, DIN> 2.5, iQC index ≥ 0.5]로 설정했다. 또한 ddEGFR iQC index와 DIN 값 사이에 강한 상관관계가 있음을 확인했으며, 이는 iQC index가 FFPET-DNA의 품질을 나타내고 있음을 뒷받침해 주는 것이다(표 10).
Figure pat00008
5. IQC 지수 기준 만족 여부에 따른 ddEGFR 및 cobas EGFR 검사 결과 비교
iQC index 컷-오프가 121개 시료(블록 저장 기간 ≤ 6 년, DIN> 2.5)에 적용되었을 때, 113개 시료가 남아 있었다(도 1, 그룹 2). 그룹 2 시료는 ddEGFR과 cobas EGFR 검사 사이에 매우 높은 일치율을 보였다(PPA = 100.00%, NPA = 76.00%, OPA = 94.69%, κ = 0.9197) (표 11 및 표 12).
Figure pat00009
Figure pat00010
iQC index의 임상적 영향을 확인하기 위해, 본 발명자는 이 기준을 316개의 FFPET에 적용하여, 150 개의 시료를 그룹 3(도 1)으로 분류하였고, ddEGFR과 cobas EGFR 결과 사이의 일치율을 다시 분석했다.
그룹 3 시료는 그룹 2의 결과(모든 기준 적용)와 유사하게 매우 높은 일치율을 나타냈다(PPA = 100.00%, NPA = 75.00%, OPA = 92.67%, κ = 0.8923) (표 11 및 표 13).
Figure pat00011
대조적으로, iQC index 기준이 만족되지 않은 그룹 4 시료는 매우 낮은 일치율을 나타냈다(PPA = 78.57%, NPA = 58.20%, OPA = 63.41%, κ = 0.3862)(표 14).
따라서, iQC index는 DNA가 ddEGFR 테스트에 적합한 충분한 품질을 갖고 있는지 여부를 결정하는 핵심 요소라고 판단할 수 있었다.
Figure pat00012
6. 전임상 시험에서 불일치 시료 분석
iQC index 기준을 적용하여 그룹 3의 나머지 11개의 불일치성 시료를 재분석했다. 불일치 시료에 대한 재분석 workflow의 도식적 표현은 도 9에 나타냈다. 세 가지 시료에서, ddEGFR 검사는 이중 돌연변이(19del/T790M)를 나타냈으나, cobas EGFR 검사와 Sanger는 오로지 단일 돌연변이 (19del)만 나타냈다(표 11, 그룹 3). 이것은 Sanger(~15%) 및 cobas EGFR 검사의 낮은 검출 감도의 결과일 수 있다(T790M의 LoD = ~3%, cobas EGFR v2). 이러한 세 가지 시료의 ddEGFR 결과를 기반으로, T790M의 MI는 ~1%(1.11 %, 1.16 % 및 1.03%)였다. 또한 8개의 불일치성 시료를 Sanger로 분석하였으나 돌연변이는 발견되지 않았다(도 10). 게다가 종양 비율의 영향을 확인하기 위해, macrodissection을 시행하여 종양 조직을 풍부하게 한 다음, cobas EGFR 검사에서는 음성 결과를 얻었으나 ddEGFR 검사에서 양성 결과를 얻은 8개의 시료에서 EGFR 돌연변이를 재분석하였다. Macrodissection 후, cobas EGFR 검사는 8개의 시료 중 4개에 대해 ddEGFR 검사와 동일한 결과를 나타냈다(도 10). 따라서, 이상의 결과는 ddEGFR 검사가 종양비(tumor ratio)와 무관하게 EGFR 돌연변이 검출에 더 민감하다는 것을 나타낸다. 비정상적으로, 하나의 불일치한 케이스는 macrodissection 후 ddEGFR 검사에 의해 무효로 판정된 예비 분석에서 돌연변이(T790M/G719X)가 검출된 경우였다. iQC index가 매우 낮기 때문에(0.37, 데이터 미표시), macrodissection 과정에서 DNA 분해가 진행되었을 가능성이 있다.
7. EGFR 검사의 후향적(retrospective) 비교 임상 시험
다음으로, ddEGFR과 cobas EGFR 검사를 사용하여 228개 시료의 EGFR 돌연변이 상태를 분석했다; iQC index를 기준으로 57개 시료가 제외되었다. 연구 설계는 도 3에 나타내었다. iQC 지수 ≥ 0.5인 남아있는 171개 시료는 ddEGFR 및 cobas EGFR 검사 사이에 PPA가 98.23%, NPA가 82.76% 및 OPA가 92.98%였다 (κ = 0.9029, 표 15 및 표 16).
Figure pat00013
Figure pat00014
12개의 불일치성 시료 중 6개는 ddEGFR 검사에 따라 이중 돌연변이가 검출되었으나, cobas EGFR 검사에 따르면 단일 돌연변이만 검출되었다. 예상한대로, 추가 검출된 돌연변이의 MI는 매우 낮았다. 하나의 불일치 케이스는 cobas EGFR 검사로 발견되지 않은 돌연변이였으나, ddEGFR 검사와 Sanger에서 모두 검출되었다(L861Q). 반대로, 다른 불일치 케이스는 ddEGFR 검사에서 발견되지 않았으나, cobal EGFR 검사와 Sanger에 의해 발견된 돌연변이(19del)였다. 이것은 cobas EGFR 검사에서 고안된 것이 아닌 비-특이적 반응으로 인한 19del subtype(c.2239_2264del_insGCGAA)의 일반적이지 않은 돌연변이였고, 이는 잠재적으로 잘못된 검출 및 상업적 진단 키트의 유익한 교차-반응을 식별하기 위해 사용될 수 없는 것이다.
또한, 228개의 FFPET-DNA 시료로부터 DIN 값을 측정하여 iQC 지수와 유사한 패턴을 관찰했다. 게다가, 대부분의 가장 최근 시료들은(1년 이내) DIN> 2.5이고 iQC 지수=0.5 이었다(도 11). 이러한 데이터는 iQC 지수가 FFPET-DNA의 품질을 나타내는 매우 강력한 지표임을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 ddEGFR 검사가 임상 현장에서 EGFR 돌연변이의 정확한 검출을 위한 견고한 진단 도구임을 설명해준다고 할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, FFPET-DNA의 낮은 품질로 인하여 돌연변이 상태가 변하면 진단이 잘못될 수 있다. 그러므로 PCR에 적합한 FFPET-DNA의 품질을 결정하기 위한 시료 기준을 최적화하기 위해서는 많은 노력이 요구된다. 본 발명에서는 FFPET-DNA의 최소 품질을 결정하기 위해 iQC index 기준을 확립하였고, 실제 임상 적용에서 이러한 기준을 적용하는 것의 이점(장점)을 확인했다.
본 발명의 상기 실시예에서 본 발명자는 취급 오류를 최소화하고 포름알데히드-유도된 DNA-DNA 및 DNA-단백질 가교결합의 효과를 감소시킬 수 있는 자동 조직 준비 시스템 (TPS, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)과 우라실-DNA 글리코실레이즈(uracil-DNA glycosylase, UDG) 처리가 모두 서열 인공물(sequence artifacts)에 의한 거짓-양성을 줄이기 위한 강력한 전략임을 확인하였다. 그러나, DNA 단편화(fragmentation)로 인한 서열 인공물은 여전히 문제가 될 수 있다는 것 또한 확인이 되었다. DNA의 단편화 정도에 따라, 서로 다른 FFPET 시료에서 얻은 동일한 양의 DNA는 상당히 다른 양의 증폭 가능한 DNA 템플릿을 포함할 수 있다. 이러한 이유로 qPCR, ddPCR 및 차세대 시퀀싱(NGS)과 같은 PCR-기반 방법들은 FFPET-DNA에서 증폭 가능한 주형의 양을 정량화하는 데 적합할 수 있다.
또한, 본 발명자는 iQC 카피수(copies)가 입력 DNA(input DNA)의 농도를 나타내는 지표로 사용될 수 있으며, 돌연변이 지수(mutation index, MI)라고 정의된 돌연변이에 대한 새로운 개념이 DNA 품질을 반영하는 돌연변이 레벨의 지표로 사용될 수 있음을 확인하였다. MI는 단순히 입력 DNA 농도를 기반으로 간략하게 계산된 돌연변이 빈도보다 더 정확한 돌연변이 수준에 대한 정보를 제공할 수 있다.
이상 설명한 본 발명에 따른 iQC index에 대한 개념을 도 12에 요약하여 나타냈으며, MI에 대한 개념을 도 13에 요약하여 나타냈다.
본 발명의 방법에 따르면, 유전자 분석에 이용되는 생물학적 시료의 DNA 품질을 객관적으로 평가할 수 있고 유전자 돌연변이의 발현 비율에 대한 객관적인 결과를 제시할 수 있어, 임상 연구 및 동반 진단 분야에서 신뢰성 있는 정보를 제공하는데 효과를 나타낼 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (11)

  1. (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트;로 디지털 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 상기 디지털 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계;
    (d) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control index, iQC index)를 산출하는 단계:
    내부 대조군 품질 지표 = 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 디지털 PCR의 입력 DNA(input DNA) 카피수; 및
    (e) 상기 내부 대조군 품질 지표가 정해진 역치값 이상인 경우 상기 시료의 핵산 품질이 적절한 것으로 판단하거나, 또는 상기 내부 대조군 품질 지표가 1에 가까울수록 상기 생물학적 시료의 핵산 품질이 우수한 것으로 판단하는 단계를 포함하며,
    상기 내부 품질 대조 부위는 표적 유전자 또는 돌연변이 부위에 인접한 부위에 위치하고,
    상기 프라이머는 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수를 알고 있는 표준(reference standard) 물질에 대한 정량적 디지털 PCR을 수행했을 때, [검출된 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포주, 조직학적 슬라이드, 생검체, 포르말린-고정된 파라핀-포매(FFPE) 조직, 신체 유체, 대변, 소변, 혈장, 혈청, 전혈, 단리된 혈액 세포 및 혈액으로부터 단리된 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 내부 품질 대조 부위는 표적 유전자 또는 돌연변이 부위에 인접한 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인접한 부위는 20kb (kilobase) 이내에 위치하는 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 내부 품질 대조 부위는 하나 또는 둘이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 역치값은 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.40, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 0.50, 0.51, 0.52, 0.53, 0.54, 0.55, 0.56, 0.57, 0.58, 0.59, 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.89, 0.90로 이루어지는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 품질이 적절한 것은 핵산 품질이 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR), 유전자 시퀀싱(gemone sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 및 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 분석에 적절한 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법에 있어서,
    (a) 내부 품질 대조 부위(internal quality control region)의 핵산 단편을 증폭할 수 있는 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하는 단계;
    (b) 표준(reference standard) 물질에 포함된 핵산을 상기 프라이머 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트로 디지털 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 상기 디지털 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계; 및
    (d) [상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 핵산 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머를 선택하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료의 핵산 품질 결정을 위한 i) 프라이머 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (d) 단계의 선택은 [상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 핵산 카피수]가 0.95~1.05인 프라이머를 선택하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위 (internal quality control region)을 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii)프라이머 및 프로브 세트;로 제1의 디지털 PCR을 수행하는 단계;
    (c) 상기 제1의 디지털 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계;
    (d) 상기 추출된 핵산을 표적 유전자 또는 돌연변이 부위를 증폭할 수 있는 iii) 프라이머; 또는 iv) 프라이머 및 프로브 세트;로 제2의 디지털 PCR을 수행하는 단계;
    (e) 상기 제2의 디지털 PCR 결과로부터 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수를 산출하는 단계; 및
    (f) 하기 수식에 따라 %돌연변이 지수 (% mutation index)를 산출하는 단계:
    %돌연변이 지수 = 상기 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 카피수 / 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 × 100;
    를 포함하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자의 %돌연변이 지수의 산출 방법.
  11. (a) 생물학적 시료에서 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율 (mutational frequency)을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 돌연변이 비율을 상기 시료의 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control index)로 나누어 표준화된 돌연변이 비율을 산출하는 단계를 포함하며, 상기 내부 대조군 품질 지표는
    (ⅰ) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단계;
    (ⅱ) 상기 추출된 핵산을 내부 품질 대조 부위(Internal quality control region)를 증폭할 수 있는 i) 프라이머; 또는 ii) 프라이머 및 프로브 세트;로 디지털 PCR을 수행하는 단계;
    (ⅲ) 상기 디지털 PCR 결과로부터 내부 품질 대조 부위의 카피수(copy number)를 산출하는 단계; 및
    (ⅳ) 하기 수식에 따라 내부 대조군 품질 지표 (internal quality control index, iQC index)를 산출하는 단계:
    내부 대조군 품질 지표 = 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 디지털 PCR의 입력 DNA(input DNA) 카피수;
    를 포함하는 방법에 의해 산출되며,
    상기 내부 품질 대조 부위는 표적 유전자 또는 돌연변이 부위에 인접한 부위에 위치하고,
    상기 프라이머는 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수를 알고 있는 표준(reference standard) 물질에 대한 정량적 디지털 PCR을 수행했을 때, [검출된 상기 내부 품질 대조 부위의 카피수 / 상기 표준 물질의 입력 DNA 카피수]가 0.90~1.10인 프라이머인 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료 내 표적 유전자 또는 돌연변이 부위의 돌연변이 비율(mutational frequency)의 표준화 (normalization) 방법.
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