WO2000058505A1 - Detektion von nukleinsäure-amplifikaten - Google Patents

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WO2000058505A1
WO2000058505A1 PCT/EP1999/007127 EP9907127W WO0058505A1 WO 2000058505 A1 WO2000058505 A1 WO 2000058505A1 EP 9907127 W EP9907127 W EP 9907127W WO 0058505 A1 WO0058505 A1 WO 0058505A1
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nucleic acid
amplification
motif
probe
sequence
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PCT/EP1999/007127
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Inventor
Guido Krupp
Original Assignee
Artus Gesellschaft für molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung mbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present patent application relates in particular to methods for the amplification and quantitative real-time detection of nucleic acids and to kits for carrying out the methods.
  • NAT nucleic acid amplification techniques
  • PCR Chain reaction
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • DNA amplification techniques such as PCR lead to the generation of large amounts of amplified target DNA (or via an initial reverse transcriptase step to amplified RNA).
  • the amplification products are usually detected after a defined time using post-amplification methods - generally by hybridization (endpoint analysis).
  • thermocyclic NASBA ® is - in contrast to the thermocyclic
  • the NASBA ® and other isothermal reactions have the advantage that they can be carried out without any special technical effort, since the amplification takes place at a single temperature value and these reaction conditions are maintained throughout the process. This does not shorten the duration of each amplification step.
  • high amplicon concentrations can be reached in a short time with the help of NASBA ® and other isothermal amplification techniques.
  • Another advantage of NASBA ® over PCR results from the selective detection of RNA. This plays in particular in connection with the amplification or
  • Quantification of cellular mRNA plays a role in which possible cellular DNA contamination can be avoided.
  • DNA probe used In contrast to the PCR method (see Heid et al., Op. Cit.), The probe adheres to the target and is used in the
  • the Leone et al. The proposed system, however, only permits very poor quantification, regardless of whether the preferred evaluation is based on the threshold value (cf. Leone et al., FIG. 7; curves for 100 fg and 1 pg overlap at the beginning) or after reaching the plateau ( see Leone et al., Figure 7; curves for 1 pg and 10 pg overlap at the end).
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for real-time detection of nucleic acids, in particular RNA, which avoids the disadvantages of the methods known in the prior art, in particular the method by Leone et al., And is suitable for routine applications .
  • the present invention thus relates to a method for the amplification and quantitative real-time detection of nucleic acids, in which
  • a) uses a primer to which a nucleic acid sequence, preferably with a length of 1 to 40 nucleotides, is attached, which codes for the sequence motif 5'-GAAA-3 '(motif A) in the transcript, wherein
  • the initial concentration of the nucleic acid in the sample is determined by measuring the time-dependent -Change of fluorescence during the amplification, wherein one determines the relative concentration "c rel _" according to the following formula:
  • tp corresponds to the time measured for the sample from the beginning of the amplification until the fluorescence threshold is reached
  • Concentration corresponds to the time measured from the start of the amplification until the fluorescence threshold is reached.
  • the probe is cleaved and thus a fluorescence signal is generated .
  • the principle according to the invention is shown schematically in FIG. 1 (and also FIGS. 2 to 16). According to the invention it is of course possible to use sequences which are suitable for the formation of other, smaller ribozymes (e.g. the "hairpin ribozyme” or the "hepatitis delta") instead of the hammerhead ribozyme.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the quantification of RNA, DNA or RNA / DNA chimera (ie nucleic acids containing ribo- and deoxyribonucleotides), which are referred to as "target nucleic acid”, optionally with a pre-melting of double-stranded nucleic acids to obtain Single strands is required.
  • RNA, DNA or RNA / DNA chimera ie nucleic acids containing ribo- and deoxyribonucleotides
  • target nucleic acid optionally with a pre-melting of double-stranded nucleic acids to obtain Single strands is required.
  • the amplification methods suitable within the scope of the present invention are preferably isothermal amplification methods such as NASBA®, Transcription
  • TMA Mediated Amplification
  • nucleotides A, C and G can each be ribonucleotides (rNTP) or deoxyribonucleotides (dNTP).
  • N can represent any ribo- or deoxyribonucleotide.
  • RNA / DNA chimeras ie oligonucleotides which contain both ribo- and deoxyribonucleotides
  • the obligatory ribonucleotides are prefixed with "r” (ie rA, rC, rG) or U.
  • the sequence motifs A and B of the probes can thus consist exclusively of ribonucleotides (RNA probe) or can be RNA / DNA chimera.
  • ribonucleotide adenine (rA) is used at the 3 'end (i.e. 5' -GAA (rA) -3 ').
  • Motif B (5 '-CUGANGA-3') requires that guanine is present as a ribonucleotide and that adenine at the 3 'end is also a ribonucleotide (rA) (ie 5'-CU (rG) AN (rG) (rA ) -3 ').
  • U can optionally be replaced by T.
  • fluorescence threshold value is understood to mean a fluorescence value which is a factor of 5-10 above the background fluctuation measured under comparable conditions (i.e. reaction mixture without target or reference nucleic acid).
  • the time t P corresponds to the time which elapses after the start of the amplification reaction until enough amplicons of the target nucleic acid have been formed that the fluorescent threshold value (threshold value) has been reached.
  • the time t Ref corresponds to the time which elapses after the start of the amplification reaction until, based on a reference nucleic acid of known concentration, so many amplicons are formed that the threshold value is reached.
  • the reference nucleic acid should differ only slightly in its nucleic acid sequence from the target nucleic acid sequence so that the most accurate possible quantification is achieved.
  • t R ⁇ f values for reference nucleic acids of different concentrations, so that the measured t P value is as far as possible between two t Ref_ measuring points and thus a certain concentration can be assigned.
  • the target nucleic acid of unknown concentration can then be determined by determining the t P value by comparison with the calibration curve.
  • the method is carried out by carrying out the target nucleic acid in the simultaneous presence of one or more, preferably three, reference nucleic acids of known concentration and using different sequence-specific, fluorescence-labeled probes which generate a different fluorescence signal.
  • the sequences of the reference nucleic acids in an amplification batch differ only slightly from one another and should be variants of the target nucleic acid.
  • the t P - and t Re £ - values can be determined simultaneously in a reaction mixture and thus the concentration (c rel_ ) of the target nucleic acid can be determined without additional work (so-called "multiplexing"; cf. also US Pat. No. 5,837,501 ).
  • the reverse combination is equally suitable, ie the Combination of a primer containing motif B and a probe containing motif A.
  • the reporter dyes are substances with a high fluorescence signal (ie high "light yield") with little "photobleaching".
  • Dyes which absorb at wavelengths> approx. 500 n can be used as quencher.
  • TAMRA, LCR, CY-5 or DABCYL are preferred.
  • reporters / quenchers are
  • ® permit emission at ⁇ approx. 650 nm (TaqMan SDS 7700, Perkin Elmer) or ⁇ 700 (Light Cycler, Boehringer).
  • the fluorescence can be measured practically with any commercially available fluorimeter.
  • Multiplexing offers the combination of the universal quencher DABCYL with reporter dyes such as coumarin (emitted fluorescence at 475 n), FAM (emitted fluorescence at 515 nm), BODIPY (emitted fluorescence at 525 nm), TAMRA (emitted fluorescence at 575 nm), Texas Red (emitted fluorescence at 615 nm), CY-5 (emitted fluorescence at 674 nm) etc. (cf., for example, S. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53).
  • reporter dyes such as coumarin (emitted fluorescence at 475 n), FAM (emitted fluorescence at 515 nm), BODIPY (emitted fluorescence at 525 nm), TAMRA (emitted fluorescence at 575 nm), Texas Red (emitted fluorescence at 615 nm), CY-5 (emitted fluorescence at 674 nm) etc.
  • the method for amplification and quantitative real-time detection can also be carried out according to the invention, whereby - due to the already ribozyme motif contained in the target nucleic acid - unlabeled primers are used, ie Primer to which motif A or motif B are not attached.
  • complementary motif is understood to mean a motif which - depending on the ribozyme motif contained in the target RNA
  • Ribozy structure (hammerhead ribozyme) is required.
  • the present invention thus relates to a method for
  • Transcript is encoded, amplified using
  • the initial concentration of the nucleic acid in the sample is determined by measuring the time-dependent change in fluorescence during the amplification, wherein one determines the relative concentration "c rel _" according to the following formula:
  • t P corresponds to the time measured for the sample from the start of the amplification until the fluorescence threshold is reached
  • t ßef corresponds to the time measured for a reference nucleic acid from the beginning of the amplification until the fluorescence threshold is reached.
  • RNA-DNA chimeras quantitative real-time detection of nucleic acids (i.e. RNA, DNA or RNA-DNA chimeras) in the context of isothermal nucleic acid amplification, e.g. using NASBA ®, TMA or 3SR.
  • NASBA ® the system of Leone et al.
  • RNA substrate probe an RNA substrate probe - does not adhere to the target but is split off and released, which generates a detectable signal. It is also advantageous that RNase H cannot degrade the target RNA in the hybrid of the RNA substrate probe and the RNA target. Furthermore, the amount of the RNA substrate probe is not critical and it can be used in a very large excess, e.g. 500 nM versus 2 nM ribozyme target or 0.066 nM ribozyme.
  • the method according to the invention also has advantages under isothermal and under cyclic temperature conditions (PCR). Due to the possibility of splitting several probes in the course of an amplification step, a comparatively higher signal can be generated. This leads to a higher sensitivity of the reaction and to a shorter reaction time. In addition, the signal generation is basically controllable due to the enzymatic cleavage.
  • PCR cyclic temperature conditions
  • Another advantage of the described method lies in the high specific did the reaction, since only an exact hybridization of the probe with the target sequence leads to the cleavage process and thus to the emergence of a significant signal, furthermore, especially in comparison to the TaqMan ®, no complex probe construction is necessary, since the probe detaches from the target sequence after each cleavage process.
  • Another advantage of the described method is the possibility of multiplexing
  • the method according to the invention allows a very good and exact linear quantification.
  • the hybridization itself generates only a very weak signal, while each ribozyme present in the amplified nucleic acid cleaves a large number of nucleic acid substrate probes. This further amplification is very specific and requires the presence of a fully hybridizing sequence (see Singh et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 6 (1996) 165-168). Without the risk of getting false positive results, temperature and other reaction conditions can be optimized to get a maximum fluorescence signal. For example, synthetic peptides (see Müller et al., J. Mol. Biol.
  • CTAB Nedbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-7)
  • GAP-DH GAP-DH
  • the stability of the RNA probe can be increased by the present invention and its costs can be reduced at the same time.
  • it is possible to replace almost all ribonucleotides, which are more expensive in chemical synthesis, with 2 '-deoxyribonucleotides, which are cheaper and less degradative (due to long-term storage, exposure to nucleases, metal ions such as magnesium, and heat, etc. al., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 345-359) are more stable.
  • the following modifications are possible with a view to improving the general ribozyme structure and efficiency of the process:
  • the cleavage site of the ribozyme should be followed by the sequence UA (cf. Clouet-d'Orval et al., Biochemistry 36 (1997) 9087-9092).
  • Position X (cf. FIG. 4B) should also contain the modified base pyridin-4-one (cf. Burgin et al., Biochemistry 35 (1996) 14090-14097), which likewise leads to an increase in the reaction rate of the detection stage.
  • ribonucleotides are essential at four positions, e.g. 2B, 4B, 15 and 16 are marked with "r” (see Byang et al., Biochemistry 31 (1992) 5005-5009). Uppercase (for dNTPs) and lowercase (for rNTPs) are also used in the tables herein to distinguish deoxy and ribonucleotides.
  • chimeric DNA / RNA hammerhead ribozymes have been shown to have increased catalytic efficiency and stability (N.R. Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 4559-4565).
  • This principle can be used according to the invention in particular for amplification processes such as e.g. Take advantage of PCR carried out at higher temperatures or with cyclic temperature profiles.
  • Additives such as the protein GAP-DH (see Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789), short synthetic peptides derived from the viral coat protein (see Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429) or the chemical substance CTAB (Netbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-13557) are suitable, the effectiveness of the method with regard to the detection of large nucleic acid Structures "hidden” targets, ie Ribozyme motifs.
  • Sequence-specific probes are required which selectively adhere to the target nucleic acids to be detected in each case and which, in the case of ribozyme cleavage, generate fluorescence signals of different wavelengths.
  • the Quencher DABCYL with reporter dyes such as Coumarin (fluorescence emission at 475 nm), FAM (fluorescence emission at 515 nm), BODIPY (fluorescence emission at 525 nm), TAMRA (fluorescence emission at 575 nm), Texas red (615 nm), CY-5 (674 nm), etc.
  • the present invention further relates to a kit for performing the above methods, which either
  • an amplification primer to which a nucleic acid sequence, preferably with a length of 1 to 40
  • nucleic acid probe preferably with a length of 25 to 60 nucleotides (particularly preferably about 50 WO 00/58505 -, "PCT / EP99 / 07127
  • Nucleotides which contain the sequence motif 5 '-CUGANGA-3' (or 5'-GAAA-3 '), a reporter molecule and a quencher molecule being attached to each probe molecule, and optionally e) for carrying out the reaction required equipment and aids,
  • Reporter molecule and a quencher molecule are attached, and optionally d) equipment and aids required for carrying out the reaction
  • a method for the detection of nucleic acids and kits for carrying out the method are made available for the first time.
  • the invention relates to a method for the detection of nucleic acids which contain the sequence motif S'-GAAA-S '(motif A) or the sequence motif 5' -CUGANGA-3 '(motif B), in which a sample containing the nucleic acid is also included a probe, preferably with a length of 25 to 60 nucleotides (particularly preferably about 50 nucleotides), which contacts the sequence motif 5'-CUGANGA-3 '(motif B) or the sequence motif 5'-GAAA-3' (motif A ), with a reporter molecule and a quencher molecule attached to each probe molecule, the probe having to have a sequence suitable for hybridization with the nucleic acid to be detected and the nucleic acid Receiving a fluorescence signal corresponding to the choice of reporter and quencher molecules.
  • a kit according to the invention for carrying out this detection method comprises, in addition to the solvents and reagents required for carrying out the reaction, a probe, preferably with a length of 25 to 60 nucleotides (particularly preferably about 50 nucleotides), which contains the sequence motif 5 '-CUGANGA-3' ( Motif B) or the sequence motif 5'-GAAA-3 '(motif A), where a reporter molecule and a quencher molecule (see above) are attached to each probe molecule, the probe having a sequence suitable for hybridization with the nucleic acid to be detected having.
  • the nucleic acid can be detected by using one of the motifs e.g. by nucleic acid amplification using an above-mentioned primer.
  • a corresponding double fluorescence-labeled probe (see above) is required for detection, which contains a sequence motif suitable for ribozy formation.
  • the 16S rRNA of many pathogen species naturally already contains a 5'-GAAA-3 'ribozyme motif which can be used to form the hammerhead ribozyme. If the nucleic acids of the pathogens do not contain any sequence motifs suitable for the formation of ribozymes, these can, as stated above, be introduced or "added” as part of the amplification steps by using appropriate primers.
  • Tab. I GAAA in 16S rRNA
  • Fig. 1 General scheme of NASBA ® combined with ribozymes for real-time detection.
  • Ribozyme motif within one of the two primers. It is only one
  • RNA substrate probe is labeled with a fluorescent dye, the reporter (circle) and a quencher (triangle).
  • the efficient interaction of both labels leads to "FRET" or quenching, i.e. to no (or only very weak) reporter signal (empty circle).
  • the ribozyme cleaves many probe molecules. Both labels are separated in the split probe and a strong reporter signal is generated (filled circles).
  • Fig. 2 A: General structure of hammerhead ribozymes. Only conserved nucleotides are labeled with the appropriate letters, all non-conserved positions are indicated with N. The length of the hybridizing arms can be adapted to the respective requirements. Three locations of possible hairpin loops are shown by dotted lines. The polarity (5'-3 'direction) is only given for the split section.
  • B Corresponds to FIG. 2A, wherein the positions at which ribonucleotides are preferably used are prefixed with “r”, the remaining nucleotides can each be either ribo- or deoxyribonucleotides.
  • Fig. 3 One way to split a minimal ribozyme and a nucleic acid substrate probe.
  • the conserved ribozyme motif was shortened to GAAA.
  • Fig. 4 A: Based on the possibility shown in Fig. 3, an amplified nucleic acid (thick line) with the minimal ribozyme motif is shown.
  • the nucleic acid substrate probe contains reporters and quenchers (a few possibilities are given below) at both ends, but they can also be linked to other positions.
  • B Corresponds to FIG. 4A, where the positions at which ribonucleotides are preferably used are prefixed with “r”, the remaining nucleotides can each be either ribo- or deoxyribonucleotides.
  • Fig. 5 Another way to split a nucleic acid substrate probe. The conserved ribozyme motif is reduced to CUGA-N-GA.
  • Fig. 6 Based on the possibility shown in Fig. 5, an amplified nucleic acid (thick line) with the minimal ribozyme motif is shown.
  • the nucleic acid substrate probe contains reporters and quenchers at both ends, but they can also be linked to other positions (cf. FIG. 4).
  • Fig. 7 Based on the possibility shown in Fig. 3, the reverse primer contains the ribozyme motif.
  • the hybrid between primary target nucleic acid and primer is shown above.
  • the position within the target nucleic acid and the length of the base pair-forming stretch can vary.
  • the resulting amplified nucleic acid with the full ribozyme motif is shown below.
  • Fig. 8 Based on the possibility shown in Fig. 3, the reverse primer contains the ribozyme motif in a bulge.
  • the hybrid between primary target nucleic acid and primer is shown above. The position within the target nucleic acid and the length of both base pair-forming streches can vary.
  • the resulting amplified nucleic acid with the full ribozyme motif is shown below.
  • Fig. 9 Based on the possibility shown in Fig. 3, the reverse primer contains the ribozyme motif in a bulge, followed by a very short 3 'terminal base-paired section. As shown, this section can overlap with the ribozyme motif and the bulge can be so short that it comprises only one nucleotide.
  • the hybrid between primary target nucleic acid and primer is shown above. The position within the target nucleic acid and the length of both base pair-forming streches can vary.
  • the resulting amplified nucleic acid with the full ribozyme motif is shown below.
  • Fig. 10 Based on the possibility shown in Fig. 2B, the reverse primer contains the ribozyme motif in a bulge followed by a single rA-T base pairing with the target sequence.
  • the hybrid between primary target nucleic acid and primer is shown above.
  • the position within the target nucleic acid and the length of both base pair-forming streches can vary.
  • the resulting amplified nucleic acid with the full ribozyme motif is shown below.
  • Fig. 11 Corresponds to the possibility shown in Fig. 10. Here, however, the target sequence already contains a longer stretch of the ribozyme motif (or, as shown, the complete motif).
  • the substrate can either be completely RNA or there must be a minimum of rA.
  • Fig. 13 Exemplary structure of a further DNA enzyme.
  • the substrate can either be completely RNA or there must be a minimum of rRrY.
  • Fig. 14 Corresponds to Fig. 10, wherein the primer contains the major part of the NAzym motif (the catalytic nucleic acid motif) and only the last two nucleotides are missing.
  • prototype A the presence of longer motifs (eg TCGTTG instead of TCGT) enables a deleted motif to be used in the primer, the 3'-terminal ACGA in the elongated primer being supplied by the target sequence.
  • Fig. 15 Example of a universal ribozyme probe.
  • Fig. 16 Example of an HIV ribozyme probe.
  • primers and probes used in the context of the invention are obtainable in a manner familiar to the person skilled in the art, e.g. by oligonucleotide synthesis.
  • the amplification was started by adding 2 ⁇ l enzyme mixture (0.1 ⁇ g / ⁇ l BSA, 0.1 units RNase H, 40 units T7 RNA polymerase and 8 units AMV reverse transcriptase). The reaction was incubated at 41 ° C for 90 minutes. During the reaction, the fluorescence signals were measured in the ABI Prism 7700 Sequence Detector. The combination FAM / TAMRA was used as reporter / quencher.
  • Primer 1 5 '-AT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
  • Primer 2 5 '-GAA TCT CAT CAG TAG CGA GTG GGG GGA CAT CAA GCA GCC ATG CAA A-3'
  • Substrate A 5 '-TAMRA-Tga auc gaa acg cga aag cgu cua gcg u-
  • Primer 1 5 'AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC
  • Primer 2 5 '-ACG TAG TTT CGG CCT TTC GGC CTC ATC AGC GTG CAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CCA TGC AAA-3'
  • Substrate B 5 '-TAMRA-Tac gua guc cgu gcu-FAM-3' Quantification:
  • RNA QQil ccaa .. 1,000,000 molecules
  • the reverse primer contains the usual target-specific sequence (N) and additionally at its 5' end a sequence which codes for the general universal ribozyme motif: 5 '-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N ...
  • the transcript ends with the sequence 5 '- ... N NNN NNG GAA UCG AAA CGC
  • the ribozyme probe had the following sequence:
  • This example probe can be extended at one or both ends by more base-paired nucleotides.
  • proximal sequence is also highly conserved and includes the following section: aqcaqctatqGaaa (c,) gttaaaaga
  • the transcription product contains the GAAA ribozyme motif that is linked to the proximal HIV-specific sequence: GGGaqcaqctatqGaaa (c,) gttaaaaga ....
  • GAAA in rRNA sections for the specific detection of bacterial species.
  • the main food-borne pathogens are listed in the tables above.
  • sequence motifs contained in the 16S rRNA can be used for the methods according to the invention, so that within the scope of the present invention also methods for the detection of pathogens, in particular of sepsis pathogens and food germs, and kits provided therefor are made available.
  • Dyes suitable as reporters / quenchers Dyes suitable as reporters / quenchers
  • ROX ⁇ m ⁇ xN 568 nm ⁇ m ⁇ ⁇
  • 6-ROX ⁇ m ⁇ X / A: 575 nm ⁇ m ⁇ , E: 602 nm

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Abstract

Die vorliegende Patentanmeldung betrifft insbesondere Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.

Description

Detektion von Nukleinsäure-Amplif katen
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft insbesondere Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.
Zur Vervielfältigung von Desoxyribonucleinsäuren (DNA) oder Ribonucleinsäuren (RNA) wurden bislang verschiedene Nukleinsäure- Amplifikationstechniken (NAT), wie zum Beispiel Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) oder Nucleic Acid Sequence-Based Amplifica- tion (NASBA ®), entwickelt. Auf diesen Amplifikationstechniken basierende Assays werden beispielsweise für den hochsensitiven Nachweis und/oder die Quantifizierung von Erregern im medizinisch-diagnostischen Bereich eingesetzt.
DNA-Amplifikationstechniken wie PCR führen zur Erzeugung großer Mengen amplifizierter Target-DNA (oder über einen initialen Reverse Transkriptase-Schritt zu amplifizierter RNA) . Üblicherweise werden die Amplifikationsprodukte nach einer definierten Zeit mit Hilfe von Post-Amplifikationsmethoden - im allgemeinen durch Hybridisierung - nachgewiesen (Endpunktanalyse).
Gemäß einem neuen Ansatz - "TaqMan " - zur quantitativen PCR wird Fluorescence Resonance Transfer (FRET; vgl. Heid et al . , Genome Res . 6 (1996) 986-994) mit doppelt fluoreszenzmarkierten DNA- Sonden zur Echtzeitdetektion der DNA-Amplifikation vorgeschlagen). Ein Nachteil dieser Methode ist, daß die Sonde am Target haften bleibt, bis sie durch die 5 ' -Exonuklease-Aktivität der Taq DNA-Polymerase entfernt wird. Die Stringenz ist aufgrund des Temperaturprofils der PCR nur sehr schwer kontrollierbar, und die Lösung dieses Problems durch entsprechende Sondenkonstruktion ist nur unter großem Aufwand denkbar. Ein weiterer Nachteil des TaqMan ® ist die Erzeugung eines äquimolaren Signals, d.h., daß pro Amplifikationszyklus nur ein Sondenmolekül pro amplifiziertem DNA Target-Molekül gespalten wird, was ein vergleichsweise schwaches Signal zur Folge hat.
Bei NASBA ® handelt es sich - im Gegensatz zur thermozyklischen
PCR - um eine homogene, isotherme in vi tro Amplifikation (vgl. z.B. T. Kievits et al, J. Vir. Meth. 35 (1991) 273-286), EP 0 329
822 sowie R. Sooknanan et al . in "Molecular Methods for Virus
Detection", D.L. iedbrauk und D.H. Farkas (Ed.), Academic Press
1995, Kapitel 12, 261-285). Gegenüber anderen Amplifikations- verfahren weisen die NASBA ® und andere isotherme Reaktionen den Vorteil auf, daß sie ohne besonderen technischen Aufwand durchgeführt werden können, da die Amplifikation bei einem einzigen Temperaturwert erfolgt und diese Reaktionsbedingungen während des gesamten Prozesses beibehalten werden. Damit verkürzt nicht auch die Dauer jedes Amplifikationsschrittes . In Verbindung mit der z.B. im Vergleich zur PCR hohen Amplifikationseffizienz werden so mit Hilfe der NASBA ® und anderer isothermer Amplifika- tionstechniken hohe Amplifikat-Konzentrationen in kurzer Zeit erreicht. Ein weiterer Vorteil der NASBA ® gegenüber der PCR ergibt sich aus der selektiven Nachweismöglichkeit von RNA. Dies spielt insbesondere im Zusammenhang mit der -Amplifikation bzw.
Quantifizierung von zellulärer mRNA eine Rolle, bei der mögliche zelluläre DNA-Kontaminationen vermieden werden können.
Ein Nachteil der NASBA ® und anderer isothermer Amplifikations- Strategien ist jedoch, daß eine Echtzeitdeketion mit Hilfe von Fluoreszenz wie bei dem auf PCR basierenden TaqMan ® (Perkin
Eimer) oder Light-Cycler (Röche Diagnostics) nicht möglich ist. Die in diesem Zusammenhang vorgeschlagene Endpunktanalyse zur Quantifizierung ist mit Schwierigkeiten verbunden, da im Falle des Nachweises untreschiedlicher Target-RNA-Konzentrationen manche Proben bereits das Sättigungsniveau (Plateauphase) erreicht haben können, während sich andere Proben noch in der Phase steigender Amplifikat-Konzentrationen befinden (vgl. auch Heid et al., a.a.O.). Ferner ist diese Endpunktsanalyse aufgrund zusätzlicher -Arbeitsschritte nach der erfolgten RNA-Amplifikation aufwendiger und zeitintensiver. Aufgrund des Erfordernisses, die Reaktionsgefäße für die Quantifizierungsschritte zu öffnen, besteht außerdem das Risiko einer Kreuzkontamination hoch- amplifizierter RNA- und DNA-Targets.
Von Leone et al . (Nucleic Acids Research 26 (1998) 2150-2155) wurde ein Ansatz zur Echtzeitdetektion von NASBA ®-amplifizierter
RNA vorgeschlagen, bei dem man eine zweifach fluoreszenzmarkierte
DNA-Sonde verwendet. Im Gegensatz zum PCR-Verfahren (vgl. Heid et al., a.a.O.) haftet die Sonde am Target an und wird bei der
Amplifikationsreaktion nicht entfernt. Dies führt zu potentiellen Komplikationen, da die DNA-Sonden während der frühen Amplifika- tionsstufen mit der Bindung an die ersten Antisense-RNA-Am- plifikate interferieren können, was zum RNase H-Abbau und damit zu Eliminierung von RNA-Substraten und in der Folge zu einer fehlerhaften Konzentrationsbestimmung führen kann. Die Genau- igkeit der quantitativen Target-Bestimmung hängt ferner in entscheidendem Maß von der Menge der zugesetzten Sonde ab.
Das von Leone et al . vorgeschlagene System erlaubt allerdings nur eine sehr schlechte Quantifizierung, unabhängig davon, ob man die bevorzugte Auswertung auf Basis des Schwellenwerts (vgl. Leone et al., Figur 7; Kurven für 100 fg und 1 pg überlappen zu Beginn) oder nach Erreichen des Plateaus (vgl. Leone et al . , Figur 7; Kurven für 1 pg und 10 pg überlappen am Ende) durchführt.
Ferner ist nur eine sehr geringe Stringenz möglich, da die Sonde am Target haften bleibt und die isotherme Reaktion bei relativ geringer Temperatur (41° C) erfolgt, was ein hohes Risiko falsch positiver Ergebnisse zur Folge hat. Offensichtlich könnte, abhängig von der Sonde, ein maximales Signal sogar bei geringeren Temperaturen erhalten werden (vgl. Leone et al., Figur 7), aber aufgrund der gewählten Versuchsdurchführung hätte dies ein zusätzliches Risiko für falsch positive Resultate zur Folge. Wie im Rahmen weiterer Untersuchungen anhand des von Leone et al . vorgeschlagenen Protokolls festgestellt wurde, variiert die optimale Temperatur für die Hybridiserung des Fluoreszenzmarkers in -Abhängigkeit von der Länge bzw. der Sequenz des hybridi- sierenden Target-Abschnitts.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, insbesondere von RNA, zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Methoden, insbesondere des Verfahrens von Leone et al., vermeidet und für Routineanwendungen geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, bei dem man
a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure- Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man — D —
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen -Änderung der Fluoreszenz während der -Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »crel_« nach folgender Formel bestimmt:
C rel. ~ tp / tRef <
wobei
tp der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tRe£_ der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter
Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, das aufgrund des über den Primer eingeführten bzw. an die Nukleinsäureamplifikate angehängten Sequenzmotivs A und des in der Sonde verwendeten Motivs B die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms ermöglicht, kommt es zur Spaltung der Sonde und damit zur Erzeugung eines Fluoreszenzsi- gnals. Das erfindungsgemäße Prinzip ist schematisch in Fig. 1 (sowie Fig. 2 bis 16) dargestellt. Erfindungsgemäß ist es selbstverständlich möglich, Sequenzen auszunutzen, die anstelle des Hammerkopf-Ribozyms zur Ausbildung anderer, kleinerer Ribozyme (z.B. des "Hairpin-Ribozyms " oder des "Hepatitis Delta") geeignet sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Quantifizierung von RNA, DNA oder RNA/DNA-Chimären (d.h. Ribo- und Desoxyribonukleotiden enthaltenden Nukleinsäuren), die als "Target-Nukleinsäure" bezeichnet werden, wobei gegebenenfalls eine dem Verfahren vorgeschaltete AufSchmelzung doppelsträngiger Nukleinsäuren zum Erhalt von Einzelsträngen erforderlich ist. Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Amplifikationsverfahren handelt es sich vorzugsweise um um isotherme Amplifikationsverfahren wie NASBA ®, Transcription
Mediated Amplification (TMA; vgl. z.B. M. Hirose et al . , J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 3122-6) oder Self-sustained Sequence
Replication (3SR; vgl. E. Fahy et al . in PCR Methods and
Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1991, 25-33) oder um cyclische Amplifikationsverfahren wie z.B. PCR.
Soweit hierin nichts anderes angegeben ist kann es sich bei den Nukleotiden A, C und G jeweils um Ribonukleotide (rNTP) oder Desoxyribonukleotide (dNTP) handeln. "N" kann für ein beliebiges Ribo- oder Desoxyribonukleotid stehen. Im Falle von RNA/DNA- Chimären (d.h. Oligonukleotiden, die sowohl Ribo- als auch Desox- yribonukleotide enthalten) sind die obligatorischen Ribonukleotide mit dem Präfix "r" versehen (d.h. rA, rC, rG) bzw. U. Die Sequenzmotive A und B der Sonden können somit entweder ausschließlich aus Ribonukleotiden (RNA-Sonde) bestehen oder RNA/DNA-Chimäre sein. Beim Motiv A ist es jedoch erforderlich, daß am 3 '-Ende in jedem Fall das Ribonukleotid Adenin (rA) eingesetzt wird (d.h. 5 ' -GAA(rA)-3 ' ) . Beim Motiv B ( 5 ' -CUGANGA- 3') ist es erforderlich, daß Guanin als Ribonukleotid vorliegt und Adenin am 3 ' -Ende ebenfalls ein Ribonukleotid (rA) ist (d.h. 5'-CU(rG)AN(rG) (rA)-3' ) . U kann gegebenenfalls durch T ausge- tauscht sein.
Unter "Fluoreszenz-Schwellenwert" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenz-Wert verstanden, der um den Faktor 5-10 über der unter vergleichbaren Bedingungen (d.h. Reaktionsmischung ohne Target- oder Referenz-Nukleinsäure) gemessenen Hintergrundschwankung liegt.
Die Zeit tP entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der Amplifikationsreaktion vergeht, bis soviele Amplifikate der Target-Nukleinsäure gebildet sind, daß der Fluoreszent-Schwellen- wert (Schwellenwert) erreicht ist. Die Zeit tRef, entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der -Amplifikationsreaktion vergeht, bis ausgehend von einer Referenz- Nukleinsäure bekannter Konzentration soviele Amplifikate gebildet sind, daß der Schwellenwert erreicht ist. Die Referenznukleinsäu- re sollte in ihrer Nukleinsäuresequenz nur geringfügig von der Target-Nukleinsäuresequenz abweichen, damit eine möglichst genaue Quantifizierung erreicht wird.
Um die Konzentration der Target-Nukleinsäure möglichst exakt bestimmen zu können mißt man vorzugsweise mehrere tRβf.-Werte für Referenz-Nukleinsäuren unterschiedlicher Konzentration, so daß der gemessene tP-Wert möglichst zwischen zwei tRef_-Meßpunkten liegt und somit eine bestimmte Konzentration zugeordnet werden kann. Vorzugsweise mißt man drei tRef.-Werte für eine Referenz- Nukleinsäure bei drei unterschiedlichen Konzentrationen und ermittelt die sich daraus ergebende Meßkurve (Eichkurve). Die Target-Nukleinsäure unbekannter Konzentration kann anschließend durch Bestimmung des tP-Wertes durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt werden .
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Target-Nukleinsäure in gleichzeitiger Anwesenheit einer oder mehrerer, vorzugsweise von drei Referenz-Nukleinsäuren bekannter Konzentration durchführt, und zur Detektion verschiedene sequenzspezifische, fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet, die ein unterschiedliches Fluoreszenzsignal erzeugen. Die Sequenzen der Referenz-Nukleinsäuren in einem Amplifikationsansatz unterscheiden sich nur geringfügig voneinander und sollten Varianten der Target-Nukleinsäure sein. Auf diese Weise können in einem Reaktionsansatz die tP- und tRe£-- Werte gleichzeitig bestimmt und somit ohne zusätzlichen Arbeitsaufwand die Konzentration (crel_) der Target-Nukleinsäure bestimmt werden (sogen. "Multiplexing" ; vgl. auch US 5,837,501).
-Anstelle der Verwendung eines das Sequenzmotiv A enthaltenen Primers und einer das Sequenzmotiv B enthaltenden Sonde ist auch die umgekehrte Kombination gleichermaßen geeignet, d.h. die Kombination aus einem das Motiv B enthaltenden Primer und einer das Motiv A enthaltenden Sonde.
Als Reporter kommen praktisch alle Fluoreszenz-Farbstoffe und insbesondere die in Tab. III angegebenen Farbstoffe (vor allem FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue (TIB MOLBIOL) in Frage. Vorzugsweise handelt es sich bei den Reporter-Farbstofen um Substanzen mit hohem Fluoreszenzsignal (d.h. hoher "Lichtausbeute") bei geringem "Photobleaching" .
Als Quencher können Farbstoffe eingesetzt werden, die bei Wellenlängen > ca. 500 n absorbieren. Unter den in Frage kommenden Substanzen sind TAMRA, LCR, CY-5 oder DABCYL bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Reporter/Quencher-
Kombinationen bevorzugt, die eine Anregung bei ca. 490 nm und
® eine Emission bei < ca. 650 nm (TaqMan SDS 7700, Perkin Eimer) oder < 700 (Light Cycler, Boehringer) gestatten. Die Fluoreszenz kann praktisch mit jedem handelsüblichen Fluorimeter gemessen werden.
Beim Multiplexing bietet sich die Kombination des universellen Quenchers DABCYL mit Reporter-Farbstoffen wie Coumarin (emit- tierte Fluoreszenz bei 475 n ) , FAM (emittierte Fluoreszenz bei 515 nm) , BODIPY (emittierte Fluoreszenz bei 525 nm) , TAMRA (emittierte Fluoreszenz bei 575 nm) , Texas Red (emittierte Fluoreszenz bei 615 nm) , CY-5 (emittierte Fluoreszenz bei 674 nm) usw. an (vgl. z.B. S. Tyagi et al . , Nature Biotech. 16 (1998) 49-53).
Sollte die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits die Sequenzmotive 5 ' -GAAA-3 ' oder 5 ' -CUGANGA-3 ' ( "Ribozym-Motive " ) enthalten, kann das Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion erfindungsgemäß ebenfalls durchgeführt werden, wobei - aufgrund des bereits in der Target-Nukleinsäure enthaltenen Ribozym-Motivs - unmarkierte Primer einsetzt werden, d.h. Primer, an die Motiv A oder Motiv B nicht angehängt sind. Die
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) Detektion erfolgt schließlich, indem man die Nukleinsäure- Amplifikation - vorzugsweise NASBA ®, TMA, 3SR oder PCR - in
Gegenwart eines Überschusses einer Sonde durchführt, die das jeweils zum in der Target-Nukleinsäure enthaltenen Ribozym-Motiv "komlementäre" Motiv enthält. Unter "komplementäres Motiv" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Motiv verstanden, das - abhängig von dem in der Target-RNA enthaltenen Ribozym-Motivs
(5'-GAAA-3' oder 5 ' -CUGANGA-3 ' ) zur Ausbildung einer Hammerkopf-
Ribozy -Struktur (Hammerhead-Ribozym) erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur
Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion einer das
Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) oder einer das Sequenzmotiv 5'-
CUGANGA-3' (Motiv B) enthaltenden Nukleinsäure, bei dem man
a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der
Sequenzbereich der Nukleinsäure, der für das Motiv A im
Transkript kodiert, amplifiziert wird, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 hM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der -Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »crel_« nach folgender Formel bestimmt:
Figure imgf000011_0001
wobei
tP der für die Probe ab Beginn der -Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tßef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist somit erstmals eine quantitative Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren (d.h. RNA, DNA oder RNA-DNA-Chimären ) im Rahmen einer isothermen Nukleinsäuream- plifikation, z.B. mittels NASBA ®, TMA oder 3SR, möglich. Im Falle der NASBA ® werden insbesondere die dem System von Leone et al .
(a.a.O.) anhaftenden Probleme umgangen. Ferner kommt es nicht zu einer möglichen Konkurrenz zwischen Detektion und Amplifikation, da die Sonde - eine RNA-Substratsonde - nicht am Target haften bleibt sondern abgespalten und freigesetzt wird, wodurch ein nachweisbares Signal erzeugt wird. Ferner ist von Vorteil, daß RNase H die Target-RNA im Hybrid aus RNA-Substratsonde und RNA- Target nicht abbauen kann. Ferner ist die Menge der RNA-Substratsonde nicht kritisch, und sie kann in einem sehr hohen Überschuß, wie z.B. 500 nM gegenüber 2 nM Ribozym-Target oder 0,066 nM Ribozym, eingesetzt werden.
Gegenüber den auf der PCR-basierenden Echtzeitverfahren wie TaqMan oder Light Cycler weist das erfindungsgemäße Verfahren unter isothermen wie unter cyclischen Temperaturbedingungen (PCR) ebenfalls Vorteile auf. Aufgrund der Möglichkeit, im Rahmen eines Amplifikationsschrittes mehrere Sonden zu spalten, kann ein vergleichsweise höheres Signal generiert werden. Dieses führt zu einer höheren Sensitivität der Reaktion und zu einer verkürzten Reaktionszeit. Zudem ist die Signalgenerierung aufgrund der enzymatischen Spaltung grundsätzlich steuerbar. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der hohen Spezifi- tat der Reaktion, da nur eine exakte Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz zum Spaltungsprozeß und damit zum Entstehen eines signifikanten Signals führt, ferner ist insbesondere im Vergleich zum TaqMan ® keine aufwendige Sondenkonstruktion notwendig, da sich die Sonde nach jedem Spaltungsprozeß von der Zielsequenz löst. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht in der Möglichkeit des Multiplexing
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund der enzymatischen Spaltung der Sonde eine sehr gute und exakte lineare Quantifizierung. Im erfindungsgemäßen Ribozym-System erzeugt die Hybridisierung selbst nur ein sehr schwaches Signal, während jedes in der amplifizierten Nukleinsäure vorhandene Ribozym eine Vielzahl von Nukleinsäure-Substratsonden spaltet. Diese weitere Amplifikation ist sehr spezifisch und erfordert das Vorliegen einer vollständig hybridisierenden Sequenz (vgl. Singh et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 6 (1996) 165-168). Ohne das Risiko, falsch positive Resultate zu erhalten, können Temperatur und sonstige Reaktionsbedingungen optimiert werden, um zu einem maximalen Fluoreszenzsignal zu kommen. Beispielsweise können synthetische Peptide (vgl. Müller et al . , J. Mol. Biol . 242 (1994) 422-429), CTAB (Nedbal et al . , Biochemistry 36 (1997) 13552-7) oder GAP-DH (Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789) zugesetzt werden, die die Effizienz, wie z.B. die Hybridisierungsgeschwin- digkeit, und die Spezifität der Target-Erkennung erhöhen können.
Gegenüber den im Stand der Technik angewandten oder vorgeschlagenen -Amplifikationsverfahren mit Target-Quantifizierung können durch die vorliegende Erfindung die Stabilität der RNA-Sonde erhöht und deren Kosten gleichzeitig reduziert werden. So ist es z.B. möglich, nahezu alle, bei der chemischen Synthese teuereren Ribonukleotide durch 2 ' -Desoxyribonukleotide zu ersetzen, die billiger und gegenüber Abbau (durch längerfristige Lagerung, Einwirkung von Nukleasen, Metallionen wie Magnesium, sowie Hitze usw.; vgl. Bratty et al., Biochim. Biophys . Acta 1216 (1993) 345- 359) stabiler sind. Im Hinblick auf eine Verbesserung der allgemeinen Ribozym- Struktur und Effizienz des Verfahrens sind unter anderem folgende Modifikationen möglich:
Um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, d.h. um mehr Signale bezogen auf die Anzahl amplifizierter Nukleinsäure-Moleküle zu erzeugen, sollte auf den Spaltungsort des Ribozyms die Sequenz UA folgen (vgl. Clouet-d'Orval et al . , Biochemistry 36 (1997) 9087-9092). Ferner sollte die Position X (vgl. Figur 4B) die modifizierte Base Pyridin-4-on (vgl. Burgin et al . , Biochemistry 35 (1996) 14090-14097) enthalten, was ebenfalls zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit der Detektionsstufe führt.
Durch das Ersetzen der meisten Ribonukleotide durch Desoxy- ribonukleotide können die Kosten für eine RNA-Sonde um bis das lOfache gesenkt werden. An vier Positionen sind Ribonukleotide jedoch essentiell, die z.B. in Fig. 2B, 4B, 15 und 16 mit "r" gekennzeichnet sind (vgl. Byang et al . , Biochemistry 31 (1992) 5005-5009). In den hierin vorhandenen Tabellen werden zur Unterscheidung von Desoxy- und Ribonukleotiden ferner Großbuchstaben ( für dNTPs ) und Kleinbuchstaben ( für rNTPs ) verwendet .
Ferner hat sich gezeigt, daß chimäre DNA/RNA Hammerkopf-Ribozyme eine erhöhte katalytische Effizient und Stabilität aufweisen (N.R. Taylor et al . , Nucleic Acids Research 20 (1992) 4559-4565). Dieses Prinzip kann man erfindungsgemäß insbesondere für Amplifikationsverfahren wie z.B. PCR ausnutzen, die bei höheren Temperaturen oder bei cyclischen Temperaturprofilen durchgeführt werden .
Zusätze wie z.B. das Protein GAP-DH (vgl. Sioud et al . , J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789), kurze synthetische Peptide, die vom Viral coat protein (vgl. Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429) abgeleitet sind oder die chemische Substanz CTAB (Netbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-13557) sind geeignet, die Effektivität des Verfahrens im Hinblick auf das Auffinden von in großen Nukleinsäure-Strukturen "versteckten" Targets, d.h. Ribozym-Motiven, zu erhöhen.
Auf Basis der vorliegenden Erfindung ist es erstmals möglich, mehrere verschiedene Targets simultan durch Verwendung ent- sprechender Ribozym-Sonden mit unterschiedlichen Reporter- Farbstoffen nachzuweisen. Dabei sind Sequenz-spezifische Sonden erforderlich, die selektiv an den jeweils nachzuweisenden Target- Nukleinsäuren anhaften und bei Ribozym-Spaltung Fluoreszenz- Signale unterschiedlicher Wellenlänge erzeugen. Beispielsweise ist es möglich, den Quencher DABCYL mit Reporter-Farbstoffen, wie z.B. Cumarin (Fluoreszenzemission bei 475 nm) , FAM (Fluoreszenzemission bei 515 nm) , BODIPY (Fluoreszenzemission bei 525 nm) , TAMRA (Fluoreszenzemission bei 575 nm) , Texas red (615 nm) , CY-5 (674 nm) usw., zu kombinieren (vgl. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53). Mit diesem sogenannten "Multiplexing" ist es somit möglich, innerhalb eines Reaktionsansatzes gleichzeitig eine Target-RNA sowie mehrere Referenzproben bekannter Konzentration, deren Sequenzen sich im Primer-bindenden Abschnitt jeweils geringfügig voneinander unterscheiden, zu amplifizieren, wobei durch Sequenz-spezifische Sonden, die unterschiedliche Reporter/Quencher-Kombinationen tragen, eine Quantifizierung erfolgen kann, ohne daß getrennte Amplifikationen und Fluoreszenzmessungen mit den RNA-Referenzproben durchgeführt werden müssen .
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren, der entweder
a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40
Nukleotiden, angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5 ' -GAAA-3 ' ( oder 5 ' -CUGANGA-3 ' ) im Transkript kodiert , b) einen weiteren Amplifikationsprimer, c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Amplifika- tionsreaktion, d) eine Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 WO 00/58505 -, „ PCT/EP99/07127
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Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt,
oder
a) zwei Amplifikationsprimer, b) Enzyme zur Durchführung der -Amplifikation, c) eine Nukleinsäure-Sonde vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein
Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt,
Gemäß einem Teilaspekt der vorliegenden Erfindung werden erstmals ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung gestellt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmotiv S'-GAAA-S' (Motiv A) oder das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide) in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweisen muß und man die Nukleinsäure durch Erhalt eines der Wahl der Reporter- und Quencher-Moleküle entsprechendes Fluoreszenzsignals nachweist.
Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchführung dieses Nachweisver- fahrens umfaßt neben zur Durchführung der Reaktion erforderlichen Lösungsmittel und Reagenzien eine Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül (s.o.) angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist.
Für den Fall, daß die Target-Nukleinsäuren keines der Sequenzmo- tive A oder B enthalten, kann die Nukleinsäure nachgewiesen werden, indem eines der Motive z.B. durch Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung eines oben genannten Primers eingeführt wird. Zur Detektion ist eine entsprechende doppelt fluoreszenzmarkierte Sonde (s.o.) erforderlich, die ein zur Ribozy -Bildung geeignetes Sequenzmotiv enthält.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits wird - mit oder ohne Einsatz einer Nukleinsäure-Amplifikation - eine neue Methode zum Erreger-Nachweis zur Verfügung gestellt. Wie im folgenden angegeben enthält beispielsweise die 16S rRNA vieler Erreger- Spezies bereits natürlicherweise ein 5'-GAAA-3' Ribozym-Motiv, das zur Bildung des Hammerkopf-Ribozyms ausgenutzt werden kann. Falls die Nukleinsäuren der Erreger keine zur Ausbildung von Ribozymen geeignete Sequenzmotive enthalten können diese, wie oben angegeben, im Rahmen der Amplifikationsstufen durch Verwendung entsprechender Primer eingeführt bzw. "addiert" werden . Tab. I: GAAA in 16S rRNA
Figure imgf000018_0001
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BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) I
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- II
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Tab. II: GAAA in 16 S rRNA
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BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA / EP
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert .
Beschreibung der Figuren;
Fig. 1: Allgemeines Schema der NASBA ® kombiniert mit Ribozymen zur Echtzeitdetektion.
Ribozym-Motiv innerhalb eines der zwei Primer. Es ist nur eine
Möglichkeit gezeigt, bei der sich das Ribozym-Motiv am 3 ' -Ende der amplifizierten RNA befindet. Die RNA Substrat-Sonde ist mit einem Fluorezenzfarbstoffen markiert, dem Reporter (Kreis) und einem Quencher (Dreieck) . In der intakten Sonde führt die effiziente Wechselwirkung beider Labels zum "FRET" or Quenching, d.h. zu keinem (or nur sehr schwachem) Reporter-Signal (leerer Kreis). Das Ribozym spaltet viele Sonden-Moleküle. In der gespaltenen Sonde werden beide Labels getrennt, und es wird ein starkes Reporter-Signal erzeugt (gefüllte Kreise).
Fig. 2: A: Allgemeine Struktur von Hammerkopf-Ribozymen . Es sind nur konservierte Nukleotide mit entsprechenden Buchstaben bezeichnet, alle nicht-konservierten Positionen sind mit N angegeben. Die Länge der hybridisierenden Arme können den jeweiligen Erfordernissen angepaßt werden. Drei Orte möglicher Hairpin-Schleifen sind durch gepunktete Linien dargestellt. Die Polarität (5'-3' Richtung) ist nur für den gespaltenen Abschnitt angegeben. B: Entspricht Fig. 2A, wobei die Positionen, an denen vorzugsweise Ribonukleotide eingesetzt werden mit dem Präfix "r" versehen sind, die übrigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.
Fig. 3: Eine Möglichkeit zur Aufspaltung eines minimalen Ribozyms und einer Nukleinsäure-Substrat-Sonde . Das konservierte Ribozym- Motiv wurde auf GAAA verkürzt. Fig. 4: A: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat-Sonde enthält Reporter und Quencher (einige wenige Möglichkeiten sind unten angegeben) an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft werden. B: Entspricht Fig. 4A, wobei die Positionen, an denen vorzugsweise Ribonukleotide eingesetzt werden mit dem Präfix "r" versehen sind, die übrigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.
Fig. 5: Eine weitere Möglichkeit zur Aufspaltung einer Nu- kleinsäure-Substrat-Sonde. Das konservierte Ribozym-Motiv ist auf CUGA-N-GA reduziert.
Fig. 6: Basierend auf der in Fig. 5 dargestellten Möglichkeit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat-Sonde enthält Reporter und Quencher an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft werden (vgl. Fig. 4).
Fig. 7: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge des Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 8: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target- Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt. Fig. 9: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung, gefolgt von einem sehr kurzen 3 ' -terminalen basengepaarten Abschnitt. Wie gezeigt ist, kann dieser Abschnitt mit dem Ribozym-Motiv überlappen, und die Ausbuchtung kann so kurz sein, daß sie nur ein Nukleotid umfaßt. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar- bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifi- zierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt .
Fig. 10: Basierend auf der in Fig. 2B dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung gefolgt von einer einzigen rA-T Basenpaarung mit der Target- Sequenz . Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target- Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 11: Entspricht der in Fig. 10 dargestellten Möglichkeit. Hier enthält die Target-Sequenz jedoch bereits einen längeren Stretch des Ribozym-Motivs (oder, wie gezeigt, des vollständigen Motivs) .
Fig. 12: Beispielhafte Struktur enes DNAzyms (= katalytische DNA) . Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rA vorhanden sein .
Fig. 13: Beispielhafte Struktur eines weiteren DNAzyms. Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rRrY vorhanden sein. Fig. 14: Entspricht Fig. 10, wobei der Primer den überwiegenden Teil des NAzym-Motivs (des katalytischen Nukleinsäure-Motivs ) enthält und nur die zwei letzten Nukleotide fehlen. Gezeigt ist hier eine Möglichkeit basierend auf "Prototyp A" . Für "Prototyp B" ermöglicht das Vorliegen längerer Motive (z.B. TCGTTG statt TCGT) ein deletierteres Motiv im Primer einzusetzen, wobei das 3'-terminale ACGA im elongierten Primer durch die Target-Sequenz geliefert wird.
Fig. 15: Beispiel für eine universelle Ribozym-Sonde.
Fig. 16: Beispiel für eine HIV Ribozym-Sonde.
BEISPIELE
Material:
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Primer und Sonden sind auf dem Fachmann geläufigem Wege erhältlich, wie z.B. durch Oligonukleotidsynthese .
Beispiel 1
NASBA -Reaktion in Kombination mit Ribozym-abhängiger Detektion:
Alle Enzyme waren komerziell von Pharmacia erhältlich, ausgenommen AMV-Reverse Transkriptase, die von Seikagaku bezogen wurde.
23μl NASBA ® Reaktionsmischung, davon 5 μl aus der Aufreinigung nach Boom et al . (J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503) (finale
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) Konzentration in 25 μl Reaktionsmischung: 40 M Tris, pH 8 , 5 , 12 mM MgCl2, 42 mM KC1, 15 % v/v DMSO, 1 M jedes dNTP, 2 mM jedes NTP, 0,2 μM Primer 1, 0,2 μM Primer 2 und 0,1-0,5 μM Substrat- Sonde) wurden bei 65 °C für 5 Minuten inkubiert um eine Destabi- lisation der Sekundärstrukturen in der RNA zu ermöglichen. Anschließend wurde für das Primer-Annealing auf 41 °C abgekühlt. Die Amplifikation wurde durch Zugabe von 2 μl Enzym-Mischung (0,1 μg/μl BSA, 0,1 Einheiten RNase H, 40 Einheiten T7 RNA Polymerase und 8 Einheiten AMV Reverse Transkriptase) gestartet. Die Reaktion wurde bei 41 °C für 90 Minuten inkubiert. Während der Reaktion wurden die Fluoreszenzsignale im ABI Prism 7700 Sequence Detector gemessen. Als Reporter/Quencher wurde die Kombination FAM/TAMRA eingesetzt.
Experiment A:
(dNTP = Großbuchstaben; rNTP = Kleinbuchstaben)
Primer 1: 5 ' -AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2 : 5 ' -GAA TCT CAT CAG TAG CGA GTG GGG GGA CAT CAA GCA GCC ATG CAA A-3'
Substrat A: 5 ' -TAMRA-Tga auc gaa acg cga aag cgu cua gcg u-
FAM-3'
Experiment B:
Primer 1: 5 ' -AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC
TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2: 5 ' -ACG TAG TTT CGG CCT TTC GGC CTC ATC AGC GTG CAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CCA TGC AAA-3'
Substrat B: 5 ' -TAMRA-Tac gua guc cgu gcu-FAM-3' Quantifizierung:
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrollen, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mittels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzentration der Standards betrug:
QQil ccaa.. 1 000 000 Moleküle (RNA)
Q2 ca . 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca . 10 000 Moleküle (RNA)
Q4 ca . 1 000 Moleküle (RNA)
Die Experimente A und B führten zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 15 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 x Std.dev. des Backgrounds ) . Die weiteren Standards erreichten nach t = 20, 24 und 26 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 200 000 (t = 18) bzw. 15 000 (t = 23). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist.
Beispiel 2
Universelle Erkennung beliebiger (full-size) amplifizierter RNA- Targets (ribozyme motive in reverse primer). Die entsprechende "Universelle Ribozym-Sonde" wurde dem NASBA ®-Amplifikationskit zugesetzt.
An seinem 3 ' -Ende enthält der reverse Primer die übliche Target- specifische Sequenz (N) und zusätzlich an seinem 5 '-Ende eine Se- quenz , die für das allgemeine universelle Ribozym-Motiv codiert: 5 ' -GCG TTT CGA TTC CNN NNN N...
Das Transcript endet mit der Sequenz 5 ' - ...N NNN NNG GAA UCG AAA CGC
Die Ribozym-Sonde wies folgende Sequenz auf :
5' -GCG UC - U AGC GGA AAC GCU ACU GAX GAG AUU CC (32-mer) - Spaltungsort
Zwei Farbstoffe, 5 ' -Q and 3 ' -R (oder 3 ' -Q und 5'-R) waren mit den Enden verknüpft .
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrollen, in die oben beschriebene -Amplifikation eingesetzt. Mittels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzentration der Standards betrug:
Ql ca . 1 000 000 Moleküle (RNA) Q Q22 ccaa.. 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca . 10 000 Moleküle (RNA)
Q4 ca . 1 000 Moleküle (RNA)
Das Experiment in Beispiel 2 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 12 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 x Std.dev. des Backgrounds ) . Die weiteren Standards erreichten nach t = 18, 22 und 25 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekann- ten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 100 000 (t = 18) bzw. 8000 (t = 23). Die Negativkon- trollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist.
Diese Beispiel-Sonde kann an einem oder beiden Enden durch mehr Basen-gepaarte Nukleotide verlängert sein.
Beispiel 3
Spezifische Erkennung einer amplifizierten Target Sequenz: proximal zu einem der Primer.
Das vorliegende spezifische Beispiele anhand einer NASBA ®- gestützten Detektion von HIV (entspr. USP 5,837,501) durch- geführt.
Amplifiziertes Segment der HIV-RNA:
aqtqqqqqqacatcaaqcagctatqcaaa( c,t)gttaaaagatactatcaatgaggaagc- tgcagaatgggacagggtacatccagtacatgcagggcctattccaccaggccagatgaga-. qaaccaaqqqqaaqtqacataqca
(es ist nur ein Strang gezeigt, die Primer-Sequenzen sind unterstrichen) . Die proximale Sequenz ist ebenfalls hoch konserviert und schließt den folgenden Abschnitt ein: aqcaqctatqGaaa( c, )gttaaaaga
Der Vorwärtsprimer zur Einführung der T7 Promotor-Sequenz (Großbuchstaben) and 1 Punktmutation (fettgedruckter Großbuch- stabe):
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGaqtqqqqqqacatcaaqcaqctatqGaaa Das Transkriptionsprodukt enthält das GAAA Ribozym-Motiv, das mit der proximalen HIV-spezifischen Sequenz verknüpft ist: GGGaqcaqctatqGaaa(c , ) gttaaaaga....
Es kann insbesondere mit der komplementären Ribozym-Sonde, entsprechend dem allgemeinen Versuchsprotokoll durchgefährt werden .
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrollen, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mittels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzentration der Standards betrug:
Q Qll ccaa.. 1 000 000 Moleküle (RNA)
Q2 ca . 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca . 10 000 Moleküle (RNA)
04 ca . 1 000 Moleküle (RNA)
Das Experiment in Beispiel 3 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 22 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 x Std.dev. des Backgrounds ) . Die weiteren Standards erreichten nach t = 24, 28 und 33 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. -Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 400 000 (t = 23) bzw. 10 000 (t = 28). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist. Beispiel 4
A. GAAA in rRNA-Abschnitten zur spezifischen Detektion von Bakterien-Spezies .
In den obigen Tabellen sind die wichtigsten, durch Lebensmittel übertragene Pathogene aufgeführt.
Einzigartige Sequenzmotive (schattiert) liegen zwischen den Positionen 110 and 700 (gemäß E. coli NumerierungsSystem) vor. Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: HOf and 700r [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds . (New York: Willey) , pp. 115-175].
B. Spezifischen Detektion von Sepsis-Erregern.
In den obigen Tabellen sind ferner die wichtigsten Sepsis-Erreger aufgeführt.
Einzigartige Sequenzmotive (schattiert), die erfindungsgemäß ausgenutzt werden können liegen zwischen den Positionen 110 and 530 (gemäß E. coli NumerierungsSystem) vor. Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. (New York: Willey), pp. 115-175].
Die in der 16S rRNA enthaltenen Sequenzmotive können für die erfidungsgemäßen Verfahren ausgenutzt werden, so daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verfahren zum Nachweis von Erregern, insbesondere von Sepsis-Erregern und Lebensmittelkeimen, und dafür vorgesehene Kits zur Verfügung gestellt werden. Tab. III: Als Reporter/Quencher geeignete Farbstoffe
Figure imgf000036_0001
CY5 Texas Red λmαxN 651 nm λmαχ,E: 674 nm λmaX/A: 583 nm λ ax,E: 603 nm
Figure imgf000036_0002
[ Cl6 ] : HEX λmaχ,A: 535 nm λmax^: 556 nm
JOE [Cl4] : TET λmaχA:52i nmλmaχ,E: 536nm λmax,A: 527 nm λmaχ,E: 548 nm
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0001
ROX (6-ROX) TAMRA
ROX: λmαxN 568 nm λmαχ,E: 595 nm λmαxN 555 nm λmαχ,E: 580 nm
6-ROX: λmαX/A: 575 nm λmαχ,E: 602 nm
Figure imgf000037_0002
Fluoresceiπ 6 - FAM λmαx,A: 494 nm λmαx,E: 525 nm λmαx.A: 492 nm λmαx.E: 515 nm
Figure imgf000037_0003
rhodαmine 6G CY3 λmαx.A: 51 8 nm λmαχ,E: 543 nm λmαx,A: 552 nm λmDχ,E: 565 nm Tab. III (2. Fortsetzung;
Figure imgf000038_0001
A = Absorption E = Emission

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur -Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se- quenz , vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »creI « nach folgender Formel bestimmt:
Crel.= tp / tRef. ,
wobei
tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tRef- der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der -Amplifikation bis zum Errei- chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht .
2. Verfahren zur -Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se- quenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' (Motiv B) im Transkript kodiert, wobei man
b) die -Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der F- luoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »crel_« nach folgender Formel bestimmt:
Figure imgf000040_0001
wobei
tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tRef_ der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der -Amplifikation bis zum Errei- chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht .
3. Verfahren zur -Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion einer das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthaltenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv A enthält, amplifiziert wird, wobei man
b) die Amplifikationin Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde , die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »crel « nach folgender Formel bestimmt:
Figure imgf000041_0001
wobei
tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tRef- der für eine Referenz-RNA bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht. Verfahren zur -Amplifikation und zum quantitativen Nachweis einer das Sequenzmotiv 5 ' -CUG-ANGA-3 ' (Motiv B) enthaltenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv B enthält, amplifiziert wird, wobei man
b) die -Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration »crel « nach folgender Formel bestimmt:
Tel. / t Ref. I
wobei
tP der für die Probe ab Beginn der -Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
tRef- der für eine Referenz-RNA bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA- Chimär ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäuresequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Nukleinsäure-Sonde in einer Konzentration von 50 bis 500 nM einsetzt.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cyclisches Amplifikationsverfahren ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das
® -Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA ,
TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7 , IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.
12. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist.
13. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmotiv 5 ' -CUGANGA-3 ' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5 '-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäuresequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.
18. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne , daß er
a) einen Amplifikationsprimer , an den eine Nukleinsäuresequenz angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' im Transkript kodiert, b) einen weiteren Amplifikationsprimer , c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der -Amplifikation, # d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt .
19. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß er
a) einen Amplifikationsprimer , an den eine Nukleinsäuresequenz angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' im Transkript kodiert, b) einen weiteren Amplifikationsprimer, c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Amplifikation, d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5 ' -GAAA- 3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenf lls e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt .
20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er
a) zwei Amplifikationsprimer , b) Enzyme zur Durchführung der -Amplifikation, c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'- CUGA GA-3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt .
21. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er
a) zwei Amplifikationsprimer , b) Enzyme zur Durchführung der Amplifikation, c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5 ' -GAAA- 3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt .
22. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.
23. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure-Sequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
24. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nukleinsäure-Sonde in einer Konzentration von 50 bis 500 nM einsetzt.
25. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
26. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cycli- sches -Amplifikationsverfahren ist.
27. Kit nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA , TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Kit zur Durchführung einer NASBA ® ist, wobei die Enzyme die
Aktivität von Reverse Transkriptase, T7 RNA Polymerase und
RNase H aufweisen.
29. Kit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme
(R) zur Durchführung der NASBA Reverse Transkriptase, T7 RNA Polymerase und RNase H sind.
30. Kit zur Durchführung des Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Sonde mit einer zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz, die das Sequenzmotiv 5 ' -CUG-ANGA-3 ' (Motiv B) oder 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls weitere zur Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt .
31. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, der Reporter ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAN, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und der Quencher ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist.
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