DE19915141A1 - Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten - Google Patents

Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten

Info

Publication number
DE19915141A1
DE19915141A1 DE19915141A DE19915141A DE19915141A1 DE 19915141 A1 DE19915141 A1 DE 19915141A1 DE 19915141 A DE19915141 A DE 19915141A DE 19915141 A DE19915141 A DE 19915141A DE 19915141 A1 DE19915141 A1 DE 19915141A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
amplification
motif
probe
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19915141A
Other languages
English (en)
Other versions
DE19915141C2 (de
Inventor
Guido Krupp
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMPTEC GMBH, 22767 HAMBURG, DE
Original Assignee
ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG filed Critical ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG
Priority to DE19915141A priority Critical patent/DE19915141C2/de
Priority to EP99973802A priority patent/EP1165841A1/de
Priority to AU59817/99A priority patent/AU772693B2/en
Priority to PCT/EP1999/007127 priority patent/WO2000058505A1/de
Publication of DE19915141A1 publication Critical patent/DE19915141A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19915141C2 publication Critical patent/DE19915141C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Abstract

Die vorliegende Patentanmelsung betrifft insbesondere Verfahren zum Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.

Description

Die vorliegende Patentanmeldung betrifft insbesondere Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nu­ kleinsäuren sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.
Zur Vervielfältigung von Desoxyribonucleinsäuren (DNA) oder Ribonucleinsäuren (RNA) wurden bislang verschiedene Nukleinsäure- Amplifikationstechniken (NAT), wie zum Beispiel Polymerase- Kettenreaktion (PCR) oder Nucleic Acid Sequence-Based Amplifica­ tion (NASBA®), entwickelt. Auf diesen Amplifikationstechniken basierende Assays werden beispielsweise für den hochsensitiven Nachweis und/oder die Quantifizierung von Erregern im medizi­ nisch-diagnostischen Bereich eingesetzt.
DNA-Amplifikationstechniken wie PCR führen zur Erzeugung großer Mengen amplifizierter Target-DNA (oder über einen initialen Reverse Transkriptase-Schritt zu amplifizierter RNA). Üblicher­ weise werden die Amplifikationsprodukte nach einer definierten Zeit mit Hilfe von Post-Amplifikationsmethoden - im allgemeinen durch Hybridisierung - nachgewiesen (Endpunktanalyse).
Gemäß einem neuen Ansatz - "TaqMan®" - zur quantitativen PCR wird Fluorescence Resonance Transfer (FRET; vgl. Heid et al., Genome Res. 6 (1996) 986-994) mit doppelt fluoreszenzmarkierten DNA- Sonden zur Echtzeitdetektion der DNA-Amplifikation vorgeschla­ gen). Ein Nachteil dieser Methode ist, daß die Sonde am Target haften bleibt, bis sie durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq DNA-Polymerase entfernt wird. Die Stringenz ist aufgrund des Temperaturprofils der PCR nur sehr schwer kontrollierbar, und die Lösung dieses Problems durch entsprechende Sondenkonstruktion ist nur unter großem Aufwand denkbar. Ein weiterer Nachteil des TaqMan® ist die Erzeugung eines äquimolaren Signals, d. h., daß pro Amplifikationszyklus nur ein Sondenmolekül pro amplifiziertem DNA Target-Molekül gespalten wird, was ein vergleichsweise schwaches Signal zur Folge hat.
Bei NASBA® handelt es sich - im Gegensatz zur thermozyklischen PCR - um eine homogene, isotherme in vitro Amplifikation (vgl. z. B. T. Kievits et al. J. Vir. Meth. 35 (1991) 273-286), EP 0 329 822 sowie R. Sooknanan et al. in "Molecular Methods for Virus Detection", D. L. Wiedbrauk und D. H. Farkas (Ed.), Academic Press 1995, Kapitel 12, 261-285). Gegenüber anderen Amplifikations­ verfahren weisen die NASBA® und andere isotherme Reaktionen den Vorteil auf, daß sie ohne besonderen technischen Aufwand durchgeführt werden können, da die Amplifikation bei einem einzigen Temperaturwert erfolgt und diese Reaktionsbedingungen während des gesamten Prozesses beibehalten werden. Damit verkürzt nicht auch die Dauer jedes Amplifikationsschrittes. In Verbindung mit der z. B. im Vergleich zur PCR hohen Amplifikationseffizienz werden so mit Hilfe der NASBA® und anderer isothermer Amplifika­ tionstechniken hohe Amplifikat-Konzentrationen in kurzer Zeit erreicht. Ein weiterer Vorteil der NASBA® gegenüber der PCR ergibt sich aus der selektiven Nachweismöglichkeit von RNA. Dies spielt insbesondere im Zusammenhang mit der Amplifikation bzw. Quantifizierung von zellulärer mRNA eine Rolle, bei der mögliche zelluläre DNA-Kontaminationen vermieden werden können.
Ein Nachteil der NASBA® und anderer isothermer Amplifikations­ strategien ist jedoch, daß eine Echtzeitdeketion mit Hilfe von Fluoreszenz wie bei dem auf PCR basierenden TaqMan (Perkin Elmer) oder Light-Cycler (Roche Diagnostics) nicht möglich ist.
Die in diesem Zusammenhang vorgeschlagene Endpunktanalyse zur Quantifizierung ist mit Schwierigkeiten verbunden, da im Falle des Nachweises unterschiedlicher Target-RNA-Konzentrationen manche Proben bereits das Sättigungsniveau (Plateauphase) erreicht haben können, während sich andere Proben noch in der Phase steigender Amplifikat-Konzentrationen befinden (vgl. auch Heid et al., a.a.O.). Ferner ist diese Endpunktsanalyse aufgrund zusätzlicher Arbeitsschritte nach der erfolgten RNA-Amplifikation aufwendiger und zeitintensiver. Aufgrund des Erfordernisses, die Reaktionsgefäße für die Quantifizierungsschritte zu öffnen, besteht außerdem das Risiko einer Kreuzkontamination hoch­ amplifizierter RNA- und DNA-Targets.
Von Leone et al. (Nucleic Acids Research 26 (1998) 2150-2155) wurde ein Ansatz zur Echtzeitdetektion von NASBA®-amplifizierter RNA vorgeschlagen, bei dem man eine zweifach fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde verwendet. Im Gegensatz zum PCR-Verfahren (vgl. Heid et al., a.a.O.) haftet die Sonde am Target an und wird bei der Amplifikationsreaktion nicht entfernt. Dies führt zu potentiellen Komplikationen, da die DNA-Sonden während der frühen Amplifika­ tionsstufen mit der Bindung an die ersten Antisense-RNA-Am­ plifikate interferieren können, was zum RNase H-Abbau und damit zu Eliminierung von RNA-Substraten und in der Folge zu einer fehlerhaften Konzentrationsbestimmung führen kann. Die Genau­ igkeit der quantitativen Target-Bestimmung hängt ferner in entscheidendem Maß von der Menge der zugesetzten Sonde ab.
Das von Leone et al. vorgeschlagene System erlaubt allerdings nur eine sehr schlechte Quantifizierung, unabhängig davon, ob man die bevorzugte Auswertung auf Basis des Schwellenwerts (vgl. Leone et al., Fig. 7; Kurven für 100 fg und 1 pg überlappen zu Beginn) oder nach Erreichen des Plateaus (vgl. Leone et al., Fig. 7; Kurven für 1 pg und 10 pg überlappen am Ende) durchführt.
Ferner ist hur eine sehr geringe Stringenz möglich, da die Sonde am Target haften bleibt und die isotherme Reaktion bei relativ geringer Temperatur (41°C) erfolgt, was ein hohes Risiko falsch positiver Ergebnisse zur Folge hat. Offensichtlich könnte, abhängig von der Sonde, ein maximales Signal sogar bei geringeren Temperaturen erhalten werden (vgl. Leone et al., Fig. 7), aber aufgrund der gewählten Versuchsdurchführung hätte dies ein zusätzliches Risiko für falsch positive Resultate zur Folge. Wie im Rahmen weiterer Untersuchungen anhand des von Leone et al. vorgeschlagenen Protokolls festgestellt wurde, variiert die optimale Temperatur für die Hybridiserung des Fluoreszenzmarkers in Abhängigkeit von der Länge bzw. der Sequenz des hybridi­ sierenden Target-Abschnitts.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, insbesondere von RNA, zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Methoden, insbesondere des Verfahrens von Leone et al., vermeidet und für Routineanwendungen geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nukleinsäu­ ren, bei dem man
  • a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure- Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel." nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, das aufgrund des über den Primer eingeführten bzw. an die Nukleinsäureamplifikate angehäng­ ten Sequenzmotivs A und des in der Sonde verwendeten Motivs B die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms ermöglicht, kommt es zur Spaltung der Sonde und damit zur Erzeugung eines Fluoreszenzsi­ gnals. Das erfindungsgemäße Prinzip ist schematisch in Fig. 1 (sowie Fig. 2 bis 16) dargestellt. Erfindungsgemäß ist es selbstverständlich möglich, Sequenzen auszunutzen, die anstelle des Hammerkopf-Ribozyms zur Ausbildung anderer, kleinerer Ribozyme (z. B. des "Hairpin-Ribozyms" oder des "Hepatitis Delta") geeignet sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Quantifizierung von RNA, DNA oder RNA/DNA-Chimären (d. h. Ribo- und Desoxyribonukleotiden enthaltenden Nukleinsäuren), die als "Target-Nukleinsäure" bezeichnet werden, wobei gegebenenfalls eine dem Verfahren vorgeschaltete Aufschmelzung doppelsträngiger Nukleinsäuren zum Erhalt von Einzelsträngen erforderlich ist.
Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Am­ plifikationsverfahren handelt es sich vorzugsweise um um isotherme Amplifikationsverfahren wie NASBA®, Transcription Mediated Amplification (TMA; vgl. z. B. M. Hirose et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 3122-6) oder Self-sustained Sequence Replication (3SR; vgl. E. Fahy et al. in PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1991, 25-33) oder um cyclische Amplifikationsverfahren wie z. B. PCR.
Soweit hierin nichts anderes angegeben ist kann es sich bei den Nukleotiden A, C und G jeweils um Ribonukleotide (rNTP) oder Desoxyribonukleotide (dNTP) handeln. "N" kann für ein beliebiges Ribo- oder Desoxyribonukleotid stehen. Im Falle von RNA/DNA- Chimären (d. h. Oligonukleotiden, die sowohl Ribo- als auch Desox­ yribonukleotide enthalten) sind die obligatorischen Ribonukleoti­ de mit dem Präfix "r" versehen (d. h. rA, rC, rG) bzw. U. Die Sequenzmotive A und B der Sonden können somit entweder aus­ schließlich aus Ribonukleotiden (RNA-Sonde) bestehen oder RNA/DNA-Chimäre sein. Beim Motiv A ist es jedoch erforderlich, daß am 3'-Ende in jedem Fall das Ribonukleotid Adenin (rA) eingesetzt wird (d. h. 5'-GAA(rA)-3'). Beim Motiv B (5'-CUGANGA- 5') ist es erforderlich, daß Guanin als Ribonukleotid vorliegt und Adenin am 3'-Ende ebenfalls ein Ribonukleotid (rA) ist (d. h. 5'-CU(rG)AN(rG)(rA)-3'). U kann gegebenenfalls durch T ausge­ tauscht sein.
Unter "Fluoreszenz-Schwellenwert" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenz-Wert verstanden, der um den Faktor 5-10 über der unter vergleichbaren Bedingungen (d. h. Reaktionsmischung ohne Target- oder Referenz-Nukleinsäure) gemessenen Hintergrund­ schwankung liegt.
Die Zeit tP entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der Amplifikationsreaktion vergeht, bis soviele Amplifikate der Target-Nukleinsäure gebildet sind, daß der Fluoreszent-Schwellen­ wert (Schwellenwert) erreicht ist.
Die Zeit tRef. entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der Amplifikationsreaktion vergeht, bis ausgehend von einer Referenz- Nukleinsäure bekannter Konzentration soviele Amplifikate gebildet sind, daß der Schwellenwert erreicht ist. Die Referenznukleinsäu­ re sollte in ihrer Nukleinsäuresequenz nur geringfügig von der Target-Nukleinsäuresequenz abweichen, damit eine möglichst genaue Quantifizierung erreicht wird.
Um die Konzentration der Target-Nukleinsäure möglichst exakt bestimmen zu können mißt man vorzugsweise mehrere tRef.-Werte für Referenz-Nukleinsäuren unterschiedlicher Konzentration, so daß der gemessene tP-Wert möglichst zwischen zwei tRef.-Meßpunkten liegt und somit eine bestimmte Konzentration zugeordnet werden kann. Vorzugsweise mißt man drei tRef.-Werte für eine Referenz- Nukleinsäure bei drei unterschiedlichen Konzentrationen und ermittelt die sich daraus ergebende Meßkurve (Eichkurve). Die Target-Nukleinsäure unbekannter Konzentration kann anschließend durch Bestimmung des tP-Wertes durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Target-Nukleinsäure in gleichzeitiger Anwesenheit einer oder mehrerer, vorzugsweise von. drei Referenz-Nukleinsäuren bekannter Konzentration durchführt, und zur Detektion verschiedene sequenzspezifische, fluoreszenz­ markierte Sonden verwendet, die ein unterschiedliches Fluo­ reszenzsignal erzeugen. Die Sequenzen der Referenz-Nukleinsäuren in einem Amplifikationsansatz unterscheiden sich nur geringfügig voneinander und sollten Varianten der Target-Nukleinsäure sein. Auf diese Weise können in einem Reaktionsansatz die tP- und tRef.- Werte gleichzeitig bestimmt und somit ohne zusätzlichen Arbeits­ aufwand die Konzentration (crel.) der Target-Nukleinsäure bestimmt werden (sogen. "Multiplexing"; vgl. auch US 5,837,501).
Anstelle der Verwendung eines das Sequenzmotiv A enthaltenen Primers und einer das Sequenzmotiv B enthaltenden Sonde ist auch die umgekehrte Kombination gleichermaßen geeignet, d. h. die Kombination aus einem das Motiv B enthaltenden Primer und einer das Motiv A enthaltenden Sonde.
Als Reporter kommen praktisch alle Fluoreszenz-Farbstoffe und insbesondere die in Tab. 17 angegebenen Farbstoffe (vor allem FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue (TIB MOLBIOL) in Frage. Vorzugsweise handelt es sich bei den Reporter-Farbstoffen um Substanzen mit hohem Fluoreszenzsignal (d. h. hoher "Lichtausbeute") bei geringem "Photobleaching".
Als Quencher können Farbstoffe eingesetzt werden, die bei Wellenlängen < ca. 500 nm absorbieren. Unter den in Frage kommenden Substanzen sind TAMRA, LCR, CY-5 oder DABCYL bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Reporter/Quencher- Kombinationen bevorzugt, die eine Anregung bei ca. 490 nm und eine Emission bei < ca. 650 nm (TaqMan® SDS 7700, Perkin Elmer) oder < 700 (Light Cycler, Boehringer) gestatten. Die Fluoreszenz kann praktisch mit jedem handelsüblichen Fluorimeter gemessen werden.
Beim Multiplexing bietet sich die Kombination des universellen Quenchers DABCYL mit Reporter-Farbstoffen wie Coumann (emit­ tierte Fluoreszenz bei 475 nm), FAM (emittierte Fluoreszenz bei 515 nm), BODIPY (emittierte Fluoreszenz bei 525 nm), TAMRA (emit­ tierte Fluores zenz bei 575 nm), Texas Red (emittierte Fluores zenz bei 615 nm), CY-5 (emittierte Fluoreszenz bei 674 nm) usw. an (vgl. z. B. S. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53).
Sollte die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits die Sequenzmo­ tive 5'-GAAA-3' oder 5'-CUGANGA-3' ("Ribozym-Motive") enthalten, kann das Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echt­ zeitdetektion erfindungsgemäß ebenfalls durchgeführt werden, wobei - aufgrund des bereits in der Target-Nukleinsäure enthalte­ nen Ribozym-Motivs - unmarkierte Primer einsetzt werden, d. h. Primer, an die Motiv A oder Motiv B nicht angehängt sind. Die Detektion erfolgt schließlich, indem man die Nukleinsäure- Amplifikation - vorzugsweise NASBA®, TMA, 3SR oder PCR - in Gegenwart eines Überschusses einer Sonde durchführt, die das jeweils zum in der Target-Nukleinsäure enthaltenen Ribozym-Motiv "komplementäre" Motiv enthält. Unter "komplementäres Motiv" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Motiv verstanden, das - abhängig von dem in der Target-RNA enthaltenen Ribozym-Motivs (5'-GAAA-3' oder 5'-CUGANGA-3') zur Ausbildung einer Hammerkopf- Ribozym-Struktur (Hammerhead-Ribozym) erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion einer das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) oder einer das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' (Motiv B) enthaltenden Nukleinsäure, bei dem man
  • a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der für das Motiv A im Transkript kodiert, amplifiziert wird, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel" nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist somit erstmals eine quantitative Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren (d. h. RNA, DNA oder RNA-DNA-Chimären) im Rahmen einer isothermen Nukleinsäuream­ plifikation, z. B. mittels NASBA®, TMA oder 3SR, möglich. Im Falle der NASBA® werden insbesondere die dem System von Leone et al. (a. a. O.) anhaftenden Probleme umgangen. Ferner kommt es nicht zu einer möglichen Konkurrenz zwischen Detektion und Amplifikation, da die Sonde - eine RNA-Substratsonde - nicht am Target haften bleibt sondern abgespalten und freigesetzt wird, wodurch ein nachweisbares Signal erzeugt wird. Ferner ist von Vorteil, daß RNase H die Target-RNA im Hybrid aus RNA-Substratsonde und RNA- Target nicht abbauen kann. Ferner ist die Menge der RNA-Sub­ stratsonde nicht kritisch, und sie kann in einem sehr hohen Überschuß, wie z. B. 500 nM gegenüber 2 nM Ribozym-Target oder 0,066 nM Ribozym, eingesetzt werden.
Gegenüber den auf der PCR basierenden Echtzeitverfahren wie TaqMan® oder Light Cycler weist das erfindungsgemäße Verfahren unter isothermen wie unter cyclischen Temperaturbedingungen (PCR) ebenfalls Vorteile auf. Aufgrund der Möglichkeit, im Rahmen eines Amplifikationsschrittes mehrere Sonden zu spalten, kann ein vergleichsweise höheres Signal generiert werden. Dieses führt zu einer höheren Sensitivität der Reaktion und zu einer verkürzten Reaktionszeit. Zudem ist die Signalgenerierung aufgrund der enzymatischen Spaltung grundsätzlich steuerbar. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der hohen Spezifi­ tät der Reaktion, da nur eine exakte Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz zum Spaltungsprozeß und damit zum Entstehen eines signifikanten Signals führt. Ferner ist insbesondere im Vergleich zum TaqMan® keine aufwendige Sondenkonstruktion notwendig, da sich die Sonde nach jedem Spaltungsprozeß von der Zielsequenz löst. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht in der Möglichkeit des Multiplexing.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund der enzymatischen Spaltung der Sonde eine sehr gute und exakte lineare Quantifizie­ rung. Im erfindungsgemäßen Ribozym-System erzeugt die Hybridis­ ierung selbst nur ein sehr schwaches Signal, während jedes in der amplifizierten Nukleinsäure vorhandene Ribozym eine Vielzahl von Nukleinsäure-Substratsonden spaltet. Diese weitere Amplifikation ist sehr spezifisch und erfordert das Vorliegen einer vollständig hybridisierenden Sequenz (vgl. Singh et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 6 (1996) 165-168). Ohne das Risiko, falsch positive Resultate zu erhalten, können Temperatur und sonstige Reaktionsbedingungen optimiert werden, um zu einem maximalen Fluoreszenzsignal zu kommen. Beispielsweise können synthetische Peptide (vgl. Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429), CTAB (Nedbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-7) oder GAP-DH (Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789) zugesetzt werden, die die Effizienz, wie z. B. die Hybridisierungsgeschwin­ digkeit, und die Spezifität der Target-Erkennung erhöhen können.
Gegenüber den im Stand der Technik angewandten oder vorgeschlage­ nen Amplifikationsverfahren mit Target-Quantifizierung können durch die vorliegende Erfindung die Stabilität der RNA-Sonde erhöht und deren Kosten gleichzeitig reduziert werden. So ist es z. B. möglich, nahezu alle, bei der chemischen Synthese teuereren Ribonukleotide durch 2'-Desoxyribonukleotide zu ersetzen, die billiger und gegenüber Abbau (durch längerfristige Lagerung, Einwirkung von Nukleasen, Metallionen wie Magnesium, sowie Hitze usw.; vgl. Bratty et al., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 345- 359) stabiler sind.
Im Hinblick auf eine Verbesserung der allgemeinen Ribozym- Struktur und Effizienz des Verfahrens sind unter anderem folgende Modifikationen möglich:
Um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, d. h. um mehr Signale bezogen auf die Anzahl amplifizierter Nukleinsäure-Moleküle zu erzeugen, sollte auf den Spaltungsort des Ribozyms die Sequenz UA folgen (vgl. Clouet-d'Orval et al., Biochemistry 36 (1997) 9087-9092). Ferner sollte die Position X (vgl. Fig. 4B) die modifizierte Base Pyridin-4-on (vgl. Burgin et al., Biochemistry 35 (1996) 14090-14097) enthalten, was ebenfalls zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit der Detektionsstufe führt.
Durch das Ersetzen der meisten Ribonukleotide durch Desoxy­ ribonukleotide können die Kosten für eine RNA-Sonde um bis das 10fache gesenkt werden. An vier Positionen sind Ribonukleotide jedoch essentiell, die z. B. in Fig. 2B, 4B, 15 und 16 mit "r" gekennzeichnet sind (vgl. Byang et al., Biochemistry 31 (1992) 5005-5009). In den hierin vorhandenen Tabellen werden zur Unterscheidung von Desoxy- und Ribonukleotiden ferner Großbuch­ staben (für dNTPs) und Kleinbuchstaben (für rNTPs) verwendet.
Ferner hat sich gezeigt, daß chimäre DNA/RNA Hammerkopf-Ribozyme eine erhöhte katalytische Effizient und Stabilität aufweisen (N. R. Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 4559-4565). Dieses Prinzip kann man erfindungsgemäß insbesondere für Amplifikationsverfahren wie z. B. PCR ausnutzen, die bei höheren Temperaturen oder bei cyclischen Temperaturprofilen durchgeführt werden.
Zusätze wie z. B. das Protein GAP-DH (vgl. Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789), kurze synthetische Peptide, die vom Viral coat protein (vgl. Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429) abgeleitet sind oder die chemische Substanz CTAB (Netbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-13557) sind geeignet, die Effektivität des Verfahrens im Hinblick auf das Auffinden von in großen Nukleinsäure-Strukturen "versteckten" Targets, d. h. Ribozym-Motiven, zu erhöhen.
Auf Basis der vorliegenden Erfindung ist es erstmals möglich, mehrere verschiedene Targets simultan durch Verwendung ent­ sprechender Ribozym-Sonden mit unterschiedlichen Reporter- Farbstoffen nachzuweisen. Dabei sind Sequenz-spezifische Sonden . erforderlich, die selektiv an den jeweils nachzuweisenden Target- Nukleinsäuren anhaften und bei Ribozym-Spaltung Fluoreszenz- Signale unterschiedlicher Wellenlänge erzeugen. Beispielsweise ist es möglich, den Quencher DABCYL mit Reporter-Farbstoffen, wie z. B. Cumann (Fluoreszenzemission bei 475 nm), FAM (Fluoreszenz­ emission bei 515 nm), BODIPY (Fluoreszenzemission bei 525 nm), TAMRA (Fluoreszenzemission bei 575 nm), Texas red (615 nm), CY-5 (674 nm) usw., zu kombinieren (vgl. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53). Mit diesem sogenannten "Multiplexing" ist es somit möglich, innerhalb eines Reaktionsansatzes gleichzeitig eine Target-RNA sowie mehrere Referenzproben bekannter Konzen­ tration, deren Sequenzen sich im Primer-bindenden Abschnitt jeweils geringfügig voneinander unterscheiden, zu amplifizieren, wobei durch Sequenz-spezifische Sonden, die unterschiedliche Reporter/Quencher-Kombinationen tragen, eine Quantifizierung erfolgen kann, ohne daß getrennte Amplifikationen und Fluo­ reszenzmessungen mit den RNA-Referenzproben durchgeführt werden müssen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durch­ führung der oben genannten Verfahren, der entweder
  • a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleotiden, angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (oder 5'-CUGANGA-3') im Transkript kodiert,
  • b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
  • c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Amplifika­ tionsreaktion,
  • d) eine Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt,
oder
  • a) zwei Amplifikationsprimer,
  • b) Enzyme zur Durchführung der Amplifikation,
  • c) eine Nukleinsäure-Sonde vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel
umfaßt.
Gemäß einem Teilaspekt der vorliegenden Erfindung werden erstmals ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung gestellt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) oder das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide) in Kontakt bringt, die das Sequenz­ motiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweisen muß und man die Nukleinsäure durch Erhalt eines der Wahl der Reporter- und Quencher-Moleküle entsprechendes Fluoreszenzsignals nachweist.
Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchführung dieses Nachweisver­ fahrens umfaßt neben zur Durchführung der Reaktion erforderlichen Lösungsmittel und Reagenzien eine Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül (s. o.) angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist.
Für den Fall, daß die Target-Nukleinsäuren keines der Sequenzmo­ tive A oder B enthalten, kann die Nukleinsäure nachgewiesen werden, indem eines der Motive z. B. durch Nukleinsäureamplifika­ tion unter Verwendung eines oben genannten Primers eingeführt wird. Zur Detektion ist eine entsprechende doppelt fluoreszenz­ markierte Sonde (s.o.) erforderlich, die ein zur Ribozym-Bildung geeignetes Sequenzmotiv enthält.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits wird - mit oder ohne Einsatz einer Nukleinsäure-Amplifikation - eine neue Methode zum Erreger-Nachweis zur Verfügung gestellt. Wie im folgenden angegeben enthält beispielsweise die 16S rRNA vieler Erreger- Spezies bereits natürlicherweise ein 5'-GAAA-3' Ribozym-Motiv, das zur Bildung des Hammerkopf-Ribozyms ausgenutzt werden kann. Falls die Nukleinsäuren der Erreger keine zur Ausbildung von Ribozymen geeignete Sequenzmotive enthalten können diese, wie oben angegeben, im Rahmen der Amplifikationsstufen durch Verwendung entsprechender Primer eingeführt bzw. "addiert" werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1: Allgemeines Schema der NASBA® kombiniert mit Ribozymen zur Echtzeitdetektion.
Ribozym-Motiv innerhalb eines der zwei Primer. Es ist nur eine Möglichkeit gezeigt, bei der sich das Ribozym-Motiv am 3'-Ende der amplifizierten RNA befindet. Die RNA Substrat-Sonde ist mit einem Fluorezenzfarbstoffen markiert, dem Reporter (Kreis) und einem Quencher (Dreieck). In der intakten Sonde führt die effiziente Wechselwirkung beider Labels zum "FRET" or Quen­ ching, d. h. zu keinem (or nur sehr schwachem) Reporter-Signal (leerer Kreis). Das Ribozym spaltet viele Sonden-Moleküle. In der gespaltenen Sonde werden beide Labels getrennt, und es wird ein starkes Reporter-Signal erzeugt (gefüllte Kreise).
Fig. 2A: Allgemeine Struktur von Hammerkopf-Ribozymen. Es sind nur konservierte Nukleotide mit entsprechenden Buchstaben bezeichnet, alle nicht-konservierten Positionen sind mit N angegeben. Die Länge der hybridisierenden Arme können den jeweiligen Erfordernissen angepaßt werden. Drei Orte möglicher Hairpin-Schleifen sind durch gepunktete Linien dargestellt. Die Polarität (5'-3' Richtung) ist nur für den gespaltenen Ab­ schnitt angegeben. B: Entspricht Fig. 2A, wobei die Positio­ nen, an denen vorzugsweise Ribonukleotide eingesetzt werden mit dem Präfix "r" versehen sind, die übrigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.
Fig. 3: Eine Möglichkeit zur Aufspaltung eines minimalen Ribozyms und einer Nukleinsäure-Substrat-Sonde. Das konser­ vierte Ribozym-Motiv wurde auf GAAA verkürzt.
Fig. 4: A: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglich­ keit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat- Sonde enthält Reporter und Quencher (einige wenige Möglichkei­ ten sind unten angegeben) an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft werden. B: Entspricht Fig. 4A, wobei die Positionen, an denen vorzugsweise Ribonu­ kleotide eingesetzt werden mit dem Präfix "r" versehen sind, die übrigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.
Fig. 5: Eine weitere Möglichkeit zur Aufspaltung einer Nu­ kleinsäure-Substrat-Sonde. Das konservierte Ribozym-Motiv ist auf CUGA-N-GA reduziert.
Fig. 6: Basierend auf der in Fig. 5 dargestellten Möglichkeit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat- Sonde enthält Reporter und Quencher an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft werden (vgl. Fig. 4).
Fig. 7: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer ge­ zeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge des Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 8: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Aus­ buchtung. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nu­ kleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 9: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Aus­ buchtung, gefolgt von einem sehr kurzen 3'-terminalen basenge­ paarten Abschnitt. Wie gezeigt ist, kann dieser Abschnitt mit dem Ribozym-Motiv überlappen, und die Ausbuchtung kann so kurz sein, daß sie nur ein Nukleotid umfaßt. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resul­ tierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 10: Basierend auf der in Fig. 2B dargestellten Möglich­ keit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung gefolgt von einer einzigen rA-T Basenpaarung mit der Target-Sequenz. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bilden­ den Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.
Fig. 11: Entspricht der in Fig. 10 dargestellten Möglichkeit. Hier enthält die Target-Sequenz jedoch bereits einen längeren Stretch des Ribozym-Motivs (oder, wie gezeigt, des vollständi­ gen Motivs).
Fig. 12: Beispielhafte Struktur eines DNAzyms ( = katalytische DNA). Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rA vorhanden sein.
Fig. 13: Beispielhafte Struktur eines weiteren DNAzyms. Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rKrY vorhanden sein.
Fig. 14: Entspricht Fig. 10, wobei der Primer den überwiegen­ den Teil des NAzym-Motivs (des katalytischen Nukleinsäure- Motivs) enthält und nur die zwei letzten Nukleotide fehlen. Gezeigt ist hier eine Möglichkeit basierend auf "Prototyp A". Für "Prototyp B" ermöglicht das Vorliegen längerer Motive (z. B. TCGTTG statt TCGT) ein deletierteres Motiv im Primer einzusetzen, wobei das 3'-terminale ACGA im elongierten Primer durch die Target-Sequenz geliefert wird.
Fig. 15: Beispiel für eine universelle Ribozym-Sonde.
Fig. 16: Beispiel für eine HIV Ribozym-Sonde.
Fig. 17A-C: Für die erfindungsgemäße Echtzeitdetektion als Reporter/Quencher geeignete Farbstoffe.
BEISPIELE Material
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Primer und Sonden sind auf dem Fachmann geläufigem Wege erhältlich, wie z. B. durch Oligonukleotidsynthese.
Beispiel 1 NASBA®-Reaktion in Kombination mit Ribozym-abhängiger Detek­ tion
Alle Enzyme waren kommerziell von Pharmacia erhältlich, ausge­ nommen AMV-Reverse Transkriptase, die von Seikagaku bezogen wurde.
23 µl NASBA® Reaktionsmischung, davon 5 µl aus der Aufreinigung nach Boom et al. (J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503) (finale Konzentration in 25 µl Reaktionsmischung: 40 mM Tris, pH 8,5, 12 mM MgCl2, 42 mM KCl, 15% v/v DMSO, 1 mM jedes dNTP, 2 mM jedes NTP, 0,2 µM Primer 1, 0,2 µM Primer 2 und 0,1-0,5 µM Substrat-Sonde) wurden bei 65°C für 5 Minuten inkubiert um eine Destabilisation der Sekundärstrukturen in der RNA zu ermöglichen. Anschließend wurde für das Primer-Annealing auf 41°C abgekühlt. Die Amplifikation wurde durch Zugabe von 2 µl Enzym-Mischung (0,1 µg/µl BSA, 0,1 Einheiten RNase H, 40 Einheiten T7 RNA Polymerase und 8 Einheiten AMV Reverse Trans­ kriptase) gestartet. Die Reaktion wurde bei 41°C für 90 Minuten inkubiert. Während der Reaktion wurden die Fluores­ zenzsignale im ABI Prism 7700 Sequence Detector gemessen. Als Reporter/Quencher wurde die Kombination FAM/TAMRA eingesetzt.
Experiment A
Primer 1: 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2: 5'-GAA TCT CAT CAG TAG CGA GTG GGG GGA CAT CAA GCA GCC ATG CAA A-3'
Substrat A: 5'-TAMRA-Tga auc gaa acg cga aag cgu cua gcg u- FAM-3'
Experiment B
Primer 1: 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2: 5'-ACG TAG TTT CGG CCT TTC GGC CTC ATC AGC GTG CAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CCA TGC AAA-3'
Substrat B: 5'-TAMRA-Tac gua guc cgu gcu-FAM-3'
Quantifizierung
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrol­ len, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mit­ tels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzen­ tration der Standards betrug:
Q1 ca. 1 000 000 Moleküle (RNA)
Q2 ca. 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca. 10 000 Moleküle (RNA)
Q4 ca. 1000 Moleküle (RNA)
Die Experimente A und B führten zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Mole­ kül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 15 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 × Std.dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 20, 24 und 26 Minuten den entsprechenden Schwellen­ wert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 200 000 (t = 18) bzw. 15 000 (t = 23). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekü­ len durch die hier beschriebene Technik möglich ist.
Beispiel 2
Universelle Erkennung beliebiger (full-size) amplifizierter RNA-Targets (ribozyme motive in reverse primer). Die entspre­ chende "Universelle Ribozym-Sonde" wurde dem NASBA®-Amplifika­ tionskit zugesetzt.
An seinem 3'-Ende enthält der reverse Primer die übliche Tar­ get-specifische Sequenz (N) und zusätzlich an seinem 5'-Ende eine Sequenz, die für das allgemeine universelle Ribozym-Motiv codiert:
5'-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N . . .
Das Transcript endet mit der Seguenz
5'. . .N NNN NNG GAA UCG AAA CGC
Die Ribozym-Sonde wies folgende Sequenz auf:
5'-GCG UC - U AGC GGA AAC GCU ACU GAX GAG AUU CC (32-mer) - Spaltungsort
Zwei Farbstoffe, 5'-Q and 3'-R (oder 3'-Q und 5'-R) waren mit den Enden verknüpft.
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrol­ len, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mit­ tels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzen­ tration der Standards betrug:
Q1 ca. 1 000 000 Moleküle (RNA)
Q2 ca. 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca. 10 000 Moleküle (RNA)
Q4 ca. 1 000 Moleküle (RNA)
Das Experiment in Beispiel 2 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Mole­ kül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 12 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 × Std.dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 18, 22 und 25 Minuten den entsprechenden Schwellen­ wert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 100 000 (t = 18) bzw. 8000 (t = 23). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekü­ len durch die hier beschriebene Technik möglich ist.
Diese Beispiel-Sonde kann an einem oder beiden Enden durch mehr Basen-gepaarte Nukleotide verlängert sein.
Beispiel 3
Spezifische Erkennung einer amplifizierten Target Sequenz: proximal zu einem der Primer.
Das vorliegende spezifische Beispiele anhand einer NASBA®- gestützten Detektion von HIV (entspr. USP 5,837,501) durch­ geführt.
Amplifiziertes Segment der HIV-RNA:
(es ist nur ein Strang gezeigt, die Primer-Sequenzen sind unterstrichen). Die proximale Sequenz ist ebenfalls hoch konserviert und schließt den folgenden Abschnitt ein:
Der Vorwärtsprimer zur Einführung der T7 Promotor-Sequenz (Großbuchstaben) and 1 Punktmutation (fettgedruckter Großbuch­ stabe):
Das Transkriptionsprodukt enthält das GAAA Ribozym-Motiv, das mit der proximalen HIV-spezifischen Sequenz verknüpft ist:
Es kann insbesondere mit der komplementären Ribozym-Sonde, entsprechend dem allgemeinen Versuchsprotokoll durchgefährt werden.
Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrol­ len, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mit­ tels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzen­ tration der Standards betrug:
Q1 ca. 1 000 000 Moleküle (RNA)
Q2 ca. 100 000 Moleküle (RNA)
Q3 ca. 10 000 Moleküle (RNA)
Q4 ca. 1 000 Moleküle (RNA)
Das Experiment in Beispiel 3 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Mole­ kül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 22 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Signal erreicht wurde (5 × Std.dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 24, 28 und 33 Minuten den entsprechenden Schwellen­ wert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Molekülmenge von ca. 400 000 (t = 23) bzw. 10 000 (t = 28). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekü­ len durch die hier beschriebene Technik möglich ist.
Beispiel 4 A. GAAA in rRNA-Abschnitten zur spezifischen Detektion von Bakterien-Spezies
In den obigen Tabellen sind die wichtigsten, durch Lebens­ mittel übertragene Pathogene aufgeführt.
Einzigartige Sequenzmotive (schattiert) liegen zwischen den Positionen 110 and 700 (gemäß E. coli Numerierungssystem) vor.
Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: 110f and 700r [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systema­ tics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. (New York: Willey), pp. 115-175].
B. Spezifischen Detektion von Sepsis-Erregern
In den obigen Tabellen sind ferner die wichtigsten Sepsis-Erreger aufgeführt.
Einzigartige Sequenzmotive (schattiert), die erfindungsgemäß ausgenutzt werden können liegen zwischen den Positionen 110 and 530 (gemäß E. coli Numerierungssystem) vor. Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. (New York: Willey), pp. 115-175].
Die in der 16S rRNA enthaltenen Sequenzmotive können für die erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt werden, so daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verfahren zum Nachweis von Erregern, insbesondere von Sepsis-Erregern und Lebensmittel­ keimen, und dafür vorgesehene Kits zur Verfügung gestellt werden.

Claims (31)

1. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitde­ tektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se­ quenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukl­ eotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vor­ zugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, ei­ ner Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel." nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon­ zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei­ chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
2. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitde­ tektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se­ quenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nu­ kleotiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' (Motiv B) im Transkript kodiert, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vor­ zugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, ei­ ner Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der F­ luoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel." nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon­ zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei­ chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
3. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetek­ tion einer das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthalten­ den Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv A enthält, amplifiziert wird, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Son­ denmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Mole­ kül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel." nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon­ zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei­ chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
4. Verfahren zur Amplifikation und zum quantitativen Nachweis einer das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthaltenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv B enthält, amplifiziert wird, wobei man
  • b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, durchführt, wobei an jedes Son­ denmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Mole­ kül angehängt sind, und man
  • c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "crel." nach folgender Formel bestimmt:
    crel. = tP / tRef.,
    wobei
    tP der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
    tRef. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon­ zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei­ chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA- Chimär ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure- Sequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Nukleinsäure-Sonde in einer Konzen­ tration von 50 bis 500 nM einsetzt.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cyclisches Amplifikationsverfahren ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA®, TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeich­ net, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe be­ stehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.
12. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmo­ tiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Repor­ ter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist.
13. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmo­ tiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure ge­ eignete Sequenz aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure- Sequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.
18. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er
  • a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' im Transkript kodiert,
  • b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
  • c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Amplifika­ tion
  • d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-CU- GANGA-3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt.
19. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er
  • a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-CU- GANGA-3' im Transkript kodiert,
  • b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
  • c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Ainplifika­ tion
  • d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA- 3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt.
20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er
  • a) zwei Amplifikationsprimer,
  • b) Enzyme zur Durchführung der Amplifikation,
  • c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-CU- GANGA-3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt.
21. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er
  • a) zwei Amplifikationsprimer,
  • b) Enzyme zur Durchführung der Amplifikation,
  • c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA- 3' enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter- Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
  • d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt.
22. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.
23. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure-Sequenz eine Länge von 1 bis 40 Nukleotiden aufweist.
24. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nukleinsäure-Sonde in einer Konzentration von 50 bis 500 nM einsetzt.
25. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleo­ tiden, vorzugsweise etwa 50 Nukleotide, hat.
26. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cycli­ sches Amplifikationsverfahren ist.
27. Kit nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA®, TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Kit zur Durchführung einer NASBA® ist, wobei die Enzyme die Aktivität von Reverse Transkriptase, T7 RNA Polymerase und RNase H aufweisen.
29. Kit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme zur Durchführung der NASBA® Reverse Transkriptase, T7 RNA Polymerase und RNase H sind.
30. Kit zur Durchführung des Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Sonde mit einer zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäu­ re geeignete Sequenz, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls weitere zur Durch­ führung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt.
31. Kit nach den Ansprüchen 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, der Reporter ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und der Quencher ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist.
DE19915141A 1999-03-26 1999-03-26 Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten Expired - Fee Related DE19915141C2 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19915141A DE19915141C2 (de) 1999-03-26 1999-03-26 Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten
EP99973802A EP1165841A1 (de) 1999-03-26 1999-09-27 Detektion von nukleinsäure-amplifikaten
AU59817/99A AU772693B2 (en) 1999-03-26 1999-09-27 Detection of nucleic acid amplified products
PCT/EP1999/007127 WO2000058505A1 (de) 1999-03-26 1999-09-27 Detektion von nukleinsäure-amplifikaten

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19915141A DE19915141C2 (de) 1999-03-26 1999-03-26 Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19915141A1 true DE19915141A1 (de) 2000-09-28
DE19915141C2 DE19915141C2 (de) 2002-11-21

Family

ID=7903431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19915141A Expired - Fee Related DE19915141C2 (de) 1999-03-26 1999-03-26 Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1165841A1 (de)
AU (1) AU772693B2 (de)
DE (1) DE19915141C2 (de)
WO (1) WO2000058505A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046464A2 (en) * 2000-12-05 2002-06-13 Norchip A/S Ligand detection method
WO2003095648A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Board Of Trustees Of The University Of Illinois New fluorescence based biosensor
WO2003100076A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Applera Corporation Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria
EP1464710A3 (de) * 2003-04-02 2004-12-22 Canon Kabushiki Kaisha Eine Detektionsprobe und eine Reihe von Detektionsproben für Infektionserreger, ein Träger und eine genetische Uberprüfungsmethode
WO2009158119A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6706474B1 (en) 2000-06-27 2004-03-16 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid enzyme biosensors for ions
US7534560B2 (en) 2002-05-10 2009-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Simple catalytic DNA biosensors for ions based on color changes
DE60331587D1 (de) 2002-11-15 2010-04-15 Gen Probe Inc Test und zusammensetzungen zum nachweis von bacillus-anthracis-nukleinsäure
CN1316036C (zh) * 2003-01-06 2007-05-16 徐定邦 一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法
US7612185B2 (en) 2003-03-07 2009-11-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid biosensors
DE20315159U1 (de) 2003-04-30 2004-01-22 Artus Gesellschaft für molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung mbH Kit zum Nachweis eines neuen Coronavirus, das mit dem Schweren Akuten Atemwegssyndrom (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS) assoziiert ist
US7485419B2 (en) 2004-01-13 2009-02-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Biosensors based on directed assembly of particles
WO2006086499A2 (en) * 2005-02-08 2006-08-17 Applera Corporation Nucleozymes and methods of use
US7892734B2 (en) 2005-08-11 2011-02-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer based colorimetric sensor systems
AT516369T (de) 2005-10-07 2011-07-15 Johnson & Johnson Res Pty Ltd Nukleinsäure-enzyme mit mehreren bestandteilen und verfahren zu deren verwendung
WO2007109500A1 (en) 2006-03-16 2007-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Lateral flow devices
BRPI0718137B1 (pt) 2006-10-06 2016-05-10 Johnson & Johnson Res Pty Ltd comutadores moleculares e métodos para seu uso
WO2008089248A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Amphiphilic substances and triggered liberation from lipid vesicles
CA2682612C (en) 2007-04-05 2018-08-21 Johnson & Johnson Research Pty Limited Detection cascades using multi-component nucleic acid complex (mna complex)
US8058415B2 (en) 2007-04-24 2011-11-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer- and nucleic acid enzyme-based systems for simultaneous detection of multiple analytes
WO2009012309A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for divalent copper ion detection
US8568690B2 (en) 2007-07-31 2013-10-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MRI contrast agents and high-throughput screening by MRI
WO2009045632A2 (en) 2007-08-10 2009-04-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for mercury detection
US8062893B2 (en) 2008-10-10 2011-11-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fluorescent sensor for mercury
US9175353B2 (en) 2008-11-14 2015-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and methods for detection of campylobacter nucleic acid
CA3140839A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Carlos Roberto CAMOZZI Vibration generator
WO2022136532A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Perseus Biomics Bv Genomic analysis method

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780273A (en) * 1993-04-09 1998-07-14 Amoco Corporation Insertion elements and amplifiable nucleic acids

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3276955B2 (ja) * 1988-09-30 2002-04-22 ジーン−トラック・システムス Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
ES2214472T3 (es) * 1991-08-02 2004-09-16 Biomerieux B.V. Cuantificacion de acidos nucleicos.
DE69331911T2 (de) * 1992-12-04 2002-11-21 Univ Yale New Haven Diagnose mittels signalverstärkung durch ein ribozym
US5807718A (en) * 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
JPH08205897A (ja) * 1995-02-07 1996-08-13 Nikon Corp 特異結合検査法およびそれに用いる検査用試薬
WO1996027026A1 (en) * 1995-02-27 1996-09-06 Intelligene Ltd. Detection of biomolecules
DE19811618C1 (de) * 1998-03-17 2000-08-31 Andreas Jenne Ribozym codierende DNA und ein Oligonucleotidsubstrat enthaltende Zusammensetzung und Verfahren zur Messung von Transkriptionsraten

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780273A (en) * 1993-04-09 1998-07-14 Amoco Corporation Insertion elements and amplifiable nucleic acids

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046464A3 (en) * 2000-12-05 2003-09-12 Norchip As Ligand detection method
WO2002046464A2 (en) * 2000-12-05 2002-06-13 Norchip A/S Ligand detection method
US6890719B2 (en) 2002-05-10 2005-05-10 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Fluorescence based biosensor
WO2003095648A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-20 Board Of Trustees Of The University Of Illinois New fluorescence based biosensor
WO2003100076A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Applera Corporation Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria
WO2003100076A3 (en) * 2002-05-17 2005-04-28 Applera Corp Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria
EP1464710A3 (de) * 2003-04-02 2004-12-22 Canon Kabushiki Kaisha Eine Detektionsprobe und eine Reihe von Detektionsproben für Infektionserreger, ein Träger und eine genetische Uberprüfungsmethode
EP1717323A3 (de) * 2003-04-02 2006-12-20 Canon Kabushiki Kaisha Eine Detektionsprobe und eine Reihe von Detektionsproben für Infektionserreger, ein Träger und eine genetische Uberprüfungsmethode
US8080381B2 (en) 2003-04-02 2011-12-20 Canon Kabushiki Kaisha Infectious etiologic agent detection probe and probe set, carrier, and genetic screening method
CN101768638B (zh) * 2003-04-02 2014-04-30 佳能株式会社 传染性病原体检测用探针和探针组以及载体和基因检查方法
WO2009158119A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella
WO2009158119A3 (en) * 2008-05-30 2010-04-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella
US8703421B2 (en) 2008-05-30 2014-04-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Salmonella
US10240185B2 (en) 2008-05-30 2019-03-26 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Salmonella
US10711295B2 (en) 2008-05-30 2020-07-14 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella

Also Published As

Publication number Publication date
AU5981799A (en) 2000-10-16
WO2000058505A1 (de) 2000-10-05
DE19915141C2 (de) 2002-11-21
AU772693B2 (en) 2004-05-06
EP1165841A1 (de) 2002-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19915141C2 (de) Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten
DE10150121B4 (de) Echtzeitdetektion von DNA-Amplifikationsprodukten
DE69133389T2 (de) Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nukleinsäuren
DE69838210T2 (de) Markierter Primer, geeignet für die Detektion von Nukleinsäuren
DE69432919T2 (de) Verfahren für den Nachweis spezifischer Polynukleotiden
DE69915932T2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Ziel-Nukleinsäuren
DE69531133T2 (de) Verfahren zur Dämpfung der Fluoreszene in Lösung von Fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidsonden
DE69816488T2 (de) Pcr-primerkonstruktionen für ein integriertes signalsystem
DE4441626A1 (de) Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
DE60209617T2 (de) Quantitative Multiplex-PCR mit grossem Dynamikbereich
EP1029084A2 (de) Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren
EP2467498A1 (de) Verfahren zum nachweis von zielnukleinsäuren
DE60122043T2 (de) Oligonukleotide zur Detektion von &#39;Vibrio parahaemolyticus&#39; und Detektionsverfahren für &#39;Vibrio parahaemolyticus&#39; unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide
DE102005000021A1 (de) Verfahren und Testkit zur Detektion von Ziel-Nukleinsäuren
DE112020000525T5 (de) Verfahren zum nachweis mehrerer ziele basierend auf einer einzigennachweissonde unter verwendung eines markierungs-sequenz-snp
EP1493822A1 (de) Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
WO1997021832A1 (de) Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuremolekülen in niedriger konzentration
DE69919875T2 (de) Methoden für exogene, interne kontrollen während der amplifizierung von nukleinsäuren
DE102004034343B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Spuren genomischer Varianten mittels Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen
EP3530755B1 (de) Verfahren zum anzeigen des fortschrittes der amplifikation von nukleinsäuren und kit zu dessen durchführung
DE19614852A1 (de) Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure
DE69914942T2 (de) Kennzeichnung einer substanz mittels eines reportergens und sequenzen, die für die in vitro expression des reportergens notwendig sind
DE19835856A1 (de) Verfahren zum Nachweis von HBV
WO2001055159A1 (de) Verfahren, kit und dna-sonden zum nachweis einer pilz-spezies in klinischem material
WO2000075369A1 (de) Verfahren zur detektion von nukleinsäureamplifikationsprodukten unter verwendung von primern mit &#39;primer-integrierten reporter-sequenzen&#39; (pirs)

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: AMPTEC GMBH, 22767 HAMBURG, DE

8339 Ceased/non-payment of the annual fee