CN110283801A - 一种dna聚合酶的化学修饰方法 - Google Patents

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Abstract

本方案公开了生物检测技术领域的一种DNA聚合酶的化学修饰方法，包括以下步骤：步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；步骤二、化学修饰剂的制备：取EDC、NHS和‑COOH溶液，按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于30～37℃温度下中反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：向步骤二制备的修饰剂中加入3～6体积的Taq DNA聚合酶充分混合，然后放置于30～37℃温度下反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成后加入同等体积的1％BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于‑20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。本发明的Taq DNA聚合酶的修饰方式简单。

Description

一种DNA聚合酶的化学修饰方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种DNA聚合酶的化学修饰方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国科学家Kary BanksMulls在1985年发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项获得过诺贝尔奖的技术其主要原理是以双链DNA为模板，以人工合成的一段核苷酸序列为引物，以dNTPs为底物，通过DNA聚合酶的催化从而获得大量基因拷贝,DNA聚合酶又称DNA依赖的DNA聚合酶,其主要起到聚合作用：即在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。
最早应用于PCR的DNA聚合酶是Klenow片段(Klenow fragment，又称克列诺片段)，是最早应用于PCR的DNA聚合酶，但Klenow片段不耐高温，通常在60℃就会失去活性，导致在PCR过程中需要多次补加，从而影响PCR的简便性，随着时代的发展这种酶逐渐被Taq DNA聚合酶所取代。目前应用最广泛的Taq DNA聚合酶由美国黄石公园的温泉中一种水生嗜热菌(Thermusaquaticus)YT-1中分离得到。该酶相比最初的Klenow片段，主要特点在于其在热变性反应中不会钝化，避免重复添加以补全PCR反应中所需的DNA聚合酶；该酶虽然在70℃中加热2h后活性相对最初加入时相差很小，在95℃的环境中加热2h后活性相对最初加入时亦拥有接近一半的活性，但是容易使得PCR反应出现假阴性结果，即非目的基因片段与引物二聚体的产生。
为了减少甚至避免这些问题，热启动PCR应运而生，为了实现这一难题，人们开发出多种方案增强Taq DNA聚合酶的热稳定性及特异性，以达到良好的热启动效果，得到准确可靠的PCR结果。
目前热启动DNA聚合酶的制备方式主要是通过利用Taq DNA聚合酶功能区域的定位对Taq DNA聚合酶的改造及修饰，主要的修饰方式有核酸适配体修饰，利用寡核苷酸配体与TaqDNA聚合酶结合，从而封闭酶在室温下的活性，这种修饰方式涉及基因技术，其原理相对复杂，并且所需核酸适配体需要非常长的周期筛选，并且目前并未有相关报导发现一种高亲和性的核酸适配体；特异性抗体修饰，涉及免疫学的基本原理及技术，以所修饰的TaqDNA聚合酶为抗原免疫实验动物产生相对应的抗体，经过一系列的筛选后，通过单克隆抗体技术大规模制备该抗体，并利用抗体的蛋白生物活性使其在PCR反应高温条件90℃下失活脱落从而达到PCR热启动的效果，该项修饰技术原理较之核酸适配体修饰要简单易懂，但特定抗体的产生需要非常长的筛选周期，同时容易对免疫动物产生较大的痛苦，不能很好的符合国际实验动物福利。酸酐修饰，主要是利用马来酸酐与柠康酸酐对特定的活性氨基酸基团可逆性结合以在常温下封闭其活性，高温下结合脱落从而达到热启动效果，这种修饰方式目前较为被人们推广认同，其实验周期相对以上两类方式较短，但是其经费成本仍然较高，并且修饰方式繁琐。
发明内容
本发明意在提供一种成本低且方式简便的热启动DNA聚合酶化学修饰方法，从而增强PCR反应的灵敏性、准确性及高效性。
本方案中的一种DNA聚合酶的化学修饰方法，包括以下步骤：
步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；
步骤二、化学修饰剂的制备：取EDC、NHS和-COOH溶液，按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于30～37℃温度下中反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：步骤二制备的修饰剂中加入3～6体积的Taq DNA聚合酶充分混合，然后放置于30～37℃温度下反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成后加入同等体积的1％BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于-20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。
有益效果:1、通过本发明的化学修饰方法所制备的热启动Taq DNA聚合酶，在PCR反应中对比未经本发明所述方法修饰的Taq酶及市售的Taq酶其特异性、灵敏性均有显著性的增强，并且可以减少引物二聚体的产生，能很好的达到热启动PCR的效果。
2、本发明所述的化学修饰方法中所使用的NHS与EDC有非常多的研究报导，主要是固定化凝胶等应用，并无相关报导应用于热启动DNA聚合酶的制备中，本发明所述的化学修饰方法是一种全新的热启动PCR的实现手段，为制备热启动DNA聚合酶奠定了一种新颖的基础，并且技术步骤较为简便快捷，可使用于普通技术人员生产；耗费成本较低，可在非常大的程度上减少经费预算。
进一步，所述-COOH溶液为乙酸或一水合柠檬酸。此两种为弱酸或中强酸，能够有效作为羧基供体，同时又不会因为酸性太强而破坏酶的活性结构。
进一步，所述步骤二和步骤三的温度为37℃。此温度下能够使EDC、NHS和-COOH溶液充分的混合。
进一步，还包括步骤五对Taq DNA聚合酶进行活性测定。通过活性测定，掌握TaqDNA聚合酶的活性，利于后期对PCR反应。
进一步，在步骤三中修饰完后放在冰面上冷却。冷却的目的是终止修饰反应继续进行，并且低温能够保证酶的稳定性。
附图说明
图1是经过NHS/EDC修饰前后，酶的扩增能力的对比；
图2是经过修饰前后的Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
实施例：一种DNA聚合酶的化学修饰方法，包括以下步骤：
步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；
步骤二、化学修饰剂的制备：根据所使用羧基供体的不同，分为两个修饰组：第一组，取EDC、NHS、乙酸溶液按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于37℃温度下反应25min，期间不时轻柔混匀；第二组，取EDC、NHS、一水合柠檬酸溶液按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于37℃温度下反应25min，期间不时轻柔混匀；
步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：将第一组按体积均分为A组和B组，第二组按体积均分为C组和D组，向A组和B组内加入3倍体积的Taq DNA聚合酶，C组和D组加入6倍体积的TaqDNA聚合酶；
步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成的A组、B组、C组和D组放置于冰面上冷却，然后加入同等体积的BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于-20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。
将实施例经化学修饰后得到的热启动Taq DNA聚合酶应用于PCR反应，以PCR扩增能力检测分离纯化后的Taq酶的活性，取经本实验方法修饰后热启动Taq DNA聚合酶与修饰前的Taq DNA聚合酶同时进行PCR，PCR所用引物为PPAR引物组，分别为：
PPAR-R：5’-CGTTGTGTGACATCCCGACAG-3’
PPAR-F：5’-CCAGTATTTAGGAAGCTGTCCTG-3’
扩增模板为HepG2细胞系cDNA；PCR反应体系如下：
试剂 体积
PPAR-R 0.5μL
PPAR-F 0.5μL
cDNA 0.5μL
Taq 0.5μL
2xPCR mix 12.5μL
ddH<sub>2</sub>O 10.5μL
所有组分加入后，使用小型低速离心机混匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃复性与延伸20s，35个循环；25℃保存。
PCR结果使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
实验结果如图1所示，由图1可知加入修饰后Taq DNA聚合酶组有明显的目的条带反应，而加入分离提取后Taq DNA聚合酶组则无目的条带反应，说明修饰后Taq DNA聚合酶有活性，且特异性良好，而分离提取后未经修饰Taq DNA聚合酶特异性不强。
对比实验1
本发明所述化学修饰方法处理后的Taq DNA聚合酶与未经修饰后Taq DNA聚合酶应用于PCR检测比对
以乙醛脱氢酶2的第12个外显子的部分序列(GenBank:EU373812.1)作为目的基因序列设计一对引物并命名为ALEX-R与ALEX-F，并在ALEX-R引物后加入一个单碱基A，以验证乙醛脱氢酶2是否突变，引物序列分别为
ALEX-R：5,—CTGCCAGGGATTTAGGGTA—3,
ALEX-F：5,—GAGCAGAGGCTGGGTCTT—3,
使用提取的某临床血液样品A和B的基因组DNA，取经本实验方法修饰后Taq酶与分离纯化后的Taq酶同时进行PCR扩增，以检测乙醛脱氢酶基因是否存在突变，PCR反应体系如下：
试剂 体积
ALEX-R 1μL
ALEX-F 1μL
C-DNA 0.5μL
Taq 0.5μL
dNTPs 0.5μL
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 1.5μL
10xPCR Buffer 2.5μL
ddH<sub>2</sub>O 17.5μL
所有组分加入后，使用小型低速离心机混匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸1min，40个循环；72℃复延伸10min；12℃保存。
PCR结果使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
实验结果如图2所示，由图2可知使用分离提取后的Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果并不理想，而使用乙酸作为修饰成分所修饰后Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果要相对较好，并出现了较明显的目的条带；使用一水合柠檬酸作为修饰成分所修饰后Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果与使用分离纯化后的Taq DNA聚合酶相比无异。即只有使用修饰后酶液作为PCR体系中Taq DNA聚合酶才具有目的基因片段，其余均无目的基因片段；说明经本发明所述的化学修饰方法处理后的TaqDNA聚合酶具有较强的特异性，可以增强PCR反应的灵敏性及准确性。

Claims (5)

1.一种DNA聚合酶的化学修饰方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；
步骤二、化学修饰剂的制备：取EDC、NHS和-COOH溶液，按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于30～37℃温度下中反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：向步骤二制备的修饰剂中加入3～6体积的Taq DNA聚合酶充分混合，然后放置于30～37℃温度下反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成后加入同等体积的1％BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于-20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶的化学修饰方法，其特征在于：所述-COOH溶液为乙酸或一水合柠檬酸。
3.根据权利要求2所述的DNA聚合酶的化学修饰方法，其特征在于：所述步骤二和步骤三的温度为37℃。
4.根据权利要求3所述的DNA聚合酶的化学修饰方法，其特征在于：还包括步骤五对TaqDNA聚合酶进行活性测定。
5.根据权利要求4所述的DNA聚合酶的化学修饰方法，其特征在于：在步骤三中修饰完后放在冰面上冷却。
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