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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Anordnung zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit auf einem festen Träger.
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In der Immunologie und der Molekularbiologie spielt die in-vitro Diagnostik eine wichtige Rolle. So können z.B. DNA-Analysen Aufschluss über Krankheitserreger geben, Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA das Grundverständnis über Prozesse im Körper verbessern, oder die Reaktion von Zellen auf Substanzen bei der Entwicklung von Arzneimitteln helfen.
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Ein wichtiges Arbeitsmittel in der in-vitro Diagnostik ist durch Biosensoren gegeben. Mit ihrer Hilfe sind biochemische Moleküle kostengünstig, schnell und einfach nachzuweisen. Häufig werden dabei Enzyme als Marker-Moleküle und zur Verstärkung von Messsignalen verwendet. So werden z.B. in heterogenen Assays, z.B. ELISA-Assays, Fänger-Moleküle auf einen festen Träger gebunden, an welche darauffolgend Target-Moleküle mit Enzym-Labeln spezifisch binden. Bei einem Waschschritt wird ungebundenes Enzym entfernt und darauffolgend die Enzym-Aktivität nach Zugabe von Enzym-Substrat gemessen. Das gebildete Reaktionsprodukt der Reaktion des Substrats mit dem Enzym dient dabei als Maß für die Enzym-Aktivität und kann optisch oder elektrisch detektiert werden.
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Um eine optimale Empfindlichkeit zu erreichen, wird das Reaktionsgefäß auf eine Temperatur thermostatisiert, bei welcher das Substrat optimal vom Enzym umgesetzt wird. Eine günstige Temperatur für eine solche Reaktion liegt bei bestimmten Enzymen und Substraten um die 40°C. Eine besonders günstige Reaktionsform zum Nachweis des gebundenen Enzyms ist im Redoxcycling gegeben. Dabei wird das Substrat am gebundenen Enzym oxidiert bzw. reduziert und räumlich benachbart an einer Elektrode wieder reduziert bzw. oxidiert. Die an der Elektrode umgesetzte Ladungsmenge wird gemessen. Durch die Reversibilität der Oxidation bzw. Reduktion und die kontinuierlich mit der Zeit ablaufenden Redoxreaktionen wird mit steigender Messzeit mehr Ladung an der Elektrode umgesetzt und das Messsignal verbessert.
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Für eine besonders effektive parallele Messung wird in der Regel nicht eine einzelne Elektrode verwendet, sondern ein Elektroden-Array. Eine besonders hohe Messempfindlichkeit erreicht man mit Elektroden-Arrays aufgebaut aus einzelnen Interdigital-Elektroden. Eine hohe Integrationsdichte und einen besonders kompakten Messaufbau erhält man bei Verwendung von Elektroden-Arrays auf Silizium-Chips bzw. in Lab-on-a-Chip Systemen, bei welchen der Silizium-Chip in einer Cartridge integriert ist. Dies ermöglicht auch die Integration der gesamten bzw. eines Teils der Messelektronik auf dem Chip. Die Messelektroden sind in Array-Form auf dem Chip angeordnet, z.B. als Mikroelektroden der Größe 200µm im Abstand von 50 pm voneinander. Der Chip kann in eine Durchflusszelle eingebaut werden, welche mit Enzym-Substrat befüllt wird. Anschließend wird der Substratumsatz elektrochemisch vermessen.
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Ein Problem des geschilderten Messaufbaus und Verfahrens ist, dass bereits während des Befüllens der Durchflusszelle mit Substrat chemische Reaktionen des Substrats mit dem Enzym-Label stattfinden. Das umgesetzte Substrat strömt während des Befüllens über das Array und eine ladungsmäßige Detektion des Reaktionsprodukts erfolgt an Elektroden entfernt vom Reaktionsort. Eine Zuordnung der umgesetzten Ladung zu einem räumlich bestimmten System Fänger/Target-Molekül mit Label ist nicht möglich. Den Vorgang nennt man in der Sensorik Übersprechen, d.h. Sensoren Messen Signale welche an benachbarten oder anderen Sensoren ihren Ursprung haben.
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Nach vollständigem Befüllen der Durchflusszelle wird der Fluss der Flüssigkeit mit Substrat-Molekülen gestoppt. Ein Nachströmen von an anderen Orten umgesetztem Substrat erfolgt nicht mehr. Umgesetztes Substrat diffundiert von der Chip-Oberfläche weg und damit nimmt an den Sensoren der Ladungsumsatz ab. Das an den Sensoren gemessene Signal nimmt ab. Dieser Effekt wird als Artefakt bezeichnet.
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In gebräuchlichen ELISA-Assays tritt der Effekt des Übersprechens nicht auf, da die Reaktionsräume durch Wände voneinander getrennt sind, z.B. durch Wells bei Mikrotiterplatten. Bei Lab-on-a-Chip Systemen können Artefakte verhindert werden, durch Einführung von Mikro-Reaktionskavitäten. So können z.B. durch das Pressen einer porösen Folie auf das Sensor-Array kleine abgeschlossene Reaktionsräume über den einzelnen Sensoren erzeugt werden, welche ein Übersprechen verhindern. Reaktionsprodukt kann nicht von einem zum anderen Sensor gelangen, da es nur innerhalb eines Reaktionsraumes diffundieren oder strömen kann. Nur während des Befüllens tritt der Effekt des Übersprechens weiterhin auf.
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Die
WO 2007/090674 A1 offenbart eine Sensorvorrichtung für ein elektrochemisches Messgerät. Die Sensorvorrichtung weist ein Elektrodenarray bestehend aus einer Vielzahl von direkt heizbaren Elektroden auf. Die Reaktionsflächen werden mit einem Enzym modifiziert und in eine elektrochemische Zelle gebracht. Die Kinetik des Enzyms wird amperometrisch durch Oxidation des gebildeten Wasserstoffperoxids auf den einzelnen Elektroden des Elektrodenarrays ermittelt.
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Die
DE 10 2004 017 750 A1 offenbart ein Analysearray mit heizbaren Elektroden, wobei zusätzlich ein Peltier-Element zur Kühlung der Elektroden vorgesehen ist. Die Reaktionsflächen der entsprechenden Elektroden werden mit einem Enzym modifiziert und in eine elektrochemische Zelle gebracht. Mithilfe des Peltier-Elements wird die Ausgangstemperatur des Arrays auf 0° verringert. Durch selektives Aufheizen werden die einzelnen Reaktionsflächen auf die gewünschten Temperaturen zwischen 0° und 60° gebracht. Die Aktivität des Enzyms kann nach Zusatz des Substrats amperometrisch auf den einzelnen Arrayelementen verfolgt werden.
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Die
US 5, 773, 258 A offenbart ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren mittels eines temperaturstabilen Enzyms. Das Enzym ist das Resultat einer chemischen Modifizierung eines Proteins, das zur Inaktivierung des Enzyms ausgebildet ist. Die Aktivierung des Enzyms wird dabei durch eine Inkubation einer Reaktionsmischung bei steigender Temperatur durchgeführt.
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Die
US 2007/0189921 A1 offenbart ein Verfahren zur Detektion von Target-Molekülen mittels eines Biochiparrays. Die Probe mit den nachzuweisenden Target-Molekülen werden über einen Einlass in eine Reaktionskammer einer Karte eingeleitet. Die nachzuweisenden Substanzen werden über entsprechende Elektroden detektiert.
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Die
US 2002/0119481 A1 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung biomolekularer Moleküle mittels elektrochemischer Detektion. Dabei sind die entsprechenden Elektroden von einer Reaktionsmatrix abgedeckt, die ein entsprechendes Reagenz aufweist.
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Die
DE 10 2004 025 580 A1 offenbart eine Sensoranordnung zum Erfassen von in einem Analyten möglicherweise enthaltenen Partikeln. Die Sensoranordnung weist mindestens eine Sensorelektrode auf, auf der Fängermoleküle immobilisierbar sind. Die Fängermoleküle sind derart eingerichtet, dass sie mit einem Analyten hybridisierbar sind, wobei bei einem Hybridisierungsereignis generierte elektrische geladene Teilchen an den Sensorelektrode erfassbar sind.
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Die
EP 0 058 428 A2 betrifft ein Verfahren zur Messung von Substanzen mittels eines antikörperbasierten Nachweisverfahrens (ELISA). Hierzu werden entsprechende Schalen mit nachzuweisenden Substanzen in entsprechende Öffnungen einer Aluminiumplatte eingeführt. Die Aluminiumplatte ist dabei auf einem Eiswürfel angeordnet, so dass die chemische Reaktion inhibiert ist. Anschließend wird die Aluminiumplatte in ein warmes Wasser getaucht, so dass die enzymatisch gekoppelte Nachweisreaktion erfolgen kann. Anschließend wird die Messung über ein Messsystem durchgeführt, wobei die zu messende Substanz auf Basis einer Messung der optischen Dichte unter Verwendung entsprechender Kalibrierkurven bzw. Eigkurven ermittelt wird.
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Die
WO 2004/088315 A1 offenbart ein Verfahren zur effizienten Ausführung von ELISA-Messungen, wobei eine Aktivierung einer PCR-Platte zur Durchführung des entsprechenden Verfahrens zur Anpassung der entsprechenden Inkubationstemperatur erfolgt.
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Die
WO 95/14962 A1 offenbart einen potentiometrischen Biosensor mit einer Kühl- und Heizeinrichtung in Form eines Peltier-Elements, wobei ein Sensor die Umgebungstemperatur des Elements misst, und wobei eine Regelungseinrichtung vorgesehen ist, die zur Regelung der Kühl- und Heizeinrichtung des Peltier-Elements ausgebildet ist, sodass die Umgebungstemperatur des Elements auf einem vorbestimmten Wert beibehalten wird.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens anzugeben, welche ein Übersprechen zwischen Sensoren verhindern beim Befüllen eines Reaktionsraums über einem Sensor-Array. Dabei sollen chemische Reaktionen des Substrats mit Enzym-Label beim Befüllen verhindert bzw. verringert werden, und so der Transport von Reaktionsprodukt durch Strömung beim Befüllen vermindert oder vollständig unterbunden werden.
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Die angegebene Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 1, und bezüglich der Anordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 6 gelöst.
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Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Anordnung zur Durchführung des Verfahrens gehen aus den jeweils zugeordneten abhängigen Unteransprüchen hervor. Dabei können die Merkmale der nebengeordneten Ansprüche mit Merkmalen eines jeweils zugeordneten Unteranspruchs oder vorzugsweise auch mit Merkmalen mehrerer zugeordneter Unteransprüche kombiniert werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit vor einer Messung der Reaktionsprodukte auf einem festen Träger wobei der feste Träger Teil einer Durchflusszelle ist und als Silizium Chip mit einem Sensor Array verwendet wird, mit den Schritten: a) Kühlen des festen Trägers auf eine erste Temperatur, bei welcher die chemische Reaktion nicht oder nur in geringem Umfang erfolgt, b) Strömen der Flüssigkeit mit den Substanzen durch die Durchflusszelle über den festen Träger und Stoppen des Flüssigkeitsstroms, c) Erwärmen des festen Trägers und der darüber befindlichen Flüssigkeit auf eine zweite Temperatur, bei welcher die chemische Reaktion stattfindet oder beschleunigt stattfindet, und d) Nachweisen der Reaktionsprodukte über eine Nachweisreaktion mit am festen Träger gebundenen Nachweissubstanzen durch eine Messung, wobei die Nachweissubstanzen auf dem festen Träger über Fänger- Moleküle als Target-Moleküle mit Enzym-Labeln gebunden und wobei Substrat-Moleküle an den Enzym-Labeln zu den Reaktions- produkten umgesetzt und elektrochemisch über die Sensoren des Sensor Arrays nachgewiesen werden.
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Dabei liegt der besondere Vorteil des Verfahrens darin, dass kein chemisches Übersprechen und keine Artefakt-Signale auftreten. Die Kühlung des festen Trägers beim Befüllen und damit der über den festen Träger strömenden Flüssigkeit mit Substanzen verringert oder verhindert eine chemische Reaktion der Substanzen in der Flüssigkeit mit am Träger gebundenen Nachweissubstanzen. Sensoren messen dann nur den Substratumsatz, welcher in unmittelbarer nähe zu ihnen erfolgt. Eine Zuordnung des Signals zu Sensorpositionen wird so vollständig möglich.
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Besonders vorteilhaft ist das Verfahren durchzuführen, wenn die Schritte a) bis d) in der angegebenen Reihenfolge zeitlich aufeinanderfolgend durchgeführt werden, und wenn folgend auf den Schritt b) der Flüssigkeitsstrom gestoppt wird, bevor Schritt c) gestartet wird. Durch eine Ausführung der Schritte in der angegebenen Reihenfolge können Messfehler ausgeschlossen werden, welche durch eine zu frühe Erwärmung und ein Starten der chemischen Reaktionen zu einem Zeitpunkt vor dem Verhindern der Effekte Übersprechen und Artefakt entstehen würden. Die zuvor angegebenen Vorteile kommen in vollem Umfang durch Einhaltung der angegebenen zeitlichen Reihenfolge zum tragen.
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Bevorzugt liegen bei dem angegebenen Verfahren die erste Temperatur im Bereich von 0°C bis 15°C, insbesondere bei etwa 10°C, und die zweite Temperatur im Bereich von 30°C bis 60°C, insbesondere bei etwa 40°C. Bei einer ersten Temperatur von etwa 10°C wird eine bevorzugte Reaktion, wie z.B. die PCR (Polymerase-Chain-Reaktion) fast vollständig unterbunden und bei einer zweiten Temperatur von etwa 40°C findet diese Reaktion optimal statt, wobei die genauen Temperaturen von der bevorzugten Reaktion und den verwendeten Lösungen (z.B. Konzentrationen in den Flüssigkeiten) bestimmt sind.
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Bei dem Verfahren kann folgend auf die Schritte a) bis d) ein Schritt e) mit Stopp der Messung erfolgen und darauffolgend ein Schritt f) mit Entfernen der Flüssigkeit. Darauffolgende Schritte wie z.B. Waschschritte können die Vorrichtung, mit welcher das Verfahren durchgeführt wird, auf eine erneute Verwendung vorbereiten.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden auf dem festen Träger als Nachweissubstanzen über Fänger-Moleküle gebundene Target-Moleküle mit Enzym-Label gebunden. Die Flüssigkeit kann mit den Substanzen als Substratlösung über den Träger in Schritt b) geleitet werden. Die als Reaktionsprodukte in Schritt d) erhaltenen Produkte der chemischen Reaktion des Enzym-Labels mit dem Substrat der Flüssigkeit werden bei der Messung elektrochemisch nachgewiesen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als fester Träger ein Chip, insbesondere ein Silizium-Chip, mit Sensor-Array verwendet. Dies ermöglicht eine besonders hohe Integrationsdichte und die Anwendung der in der Halbleitertechnologie entwickelten, kostengünstigen Herstellungsverfahren zur Herstellung des Trägers. Steuer- bzw. Regel- sowie Auswerteelektronik sind auf einem Silizium-Chip einfach und kostengünstig zu integrieren. So lassen sich beispielsweise ein Temperatur-Sensor und eine Temperatur-Regelung oder -Steuerung auf dem Chip integrieren. Diese können eine Temperatur des festen Trägers regeln oder steuern, insbesondere im Temperaturbereich von 0°C bis 60°C, besonders bevorzugt von 10°C bis 40°C.
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Bevorzugt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Messung als elektroche- 5 mische und/oder optische Messung durchgeführt. Gerade elektrochemische Sensoren, z.B. mit Biomolekülen beschichtete Goldoberflächen, lassen sich einfach, in hoher Dichte und kostengünstig auf Trägern integrieren und elektrisch steuern sowie auslesen.
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Besonders einfach und kostengünstig lässt sich die Kühlung in Schritt a) des Verfahrens und/oder die Erwärmung in Schritt c) des Verfahrnes mit Hilfe eines Fluids, insbesondere eines Gases Luft, Stickstoff oder Helium, oder einer Flüssigkeit Wasser oder Öl, durchführen. Eine elektrische Kühlung oder Erwärmung ist ebenfalls einfach und kostengünstig auf einem Chip zu integrieren, z.B. in Form von Peltier-Elementen, CMOS-Transistoren und -Widerständen.
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Bei der erfindungsgemäßen Anordnung zum Ausführen des zuvor beschriebenen Verfahrens ist auf einer Oberfläche eines festen Trägers ein Sensor-Array angeordnet, wobei auf oder in unmittelbarer Nähe zu den Sensoren Fänger-Moleküle mit über Target-Molekülen gebundenen Enzym-Labeln angeordnet sind. Der feste Träger umfasst eine Kühl- und Heizeinrichtung, welche ausgebildet ist abhängig von einem Substratfluss über der Sensor-Oberfläche zu kühlen bzw. zu heizen.
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Für die erfindungsgemäße Anordnung ergeben sich die vorstehend erwähnten, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verbundenen Vorteile.
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Der feste Träger ist erfindungsgemäß ein Silizium-Chip. Bevorzugt ist in oder auf dem festen Träger wenigstens ein Temperatur-Sensor und/oder eine Temperatur-Regel- oder Steuer-Einrichtung integriert. Zum Kühlen oder Heizen sind auf oder in dem festen Träger Kühl- bzw. Heizelemente integriert, insbesondere Peltier-Elemente, CMOS-Transistoren und -Widerstände.
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Der feste Träger ist erfindungsgemäß Teil einer Durchflusszelle. Bei einer Durchflusszelle ist ein Befüllen und Entleeren der Messzelle besonders einfach möglich. Mit Hilfe einer Einrichtung zum Regeln oder Steuern eines Flüssigkeitsstroms, welche die Anordnung aufweisen kann, lassen sich die Flüssigkeiten geregelt bzw. gesteuert der Messeinrichtung zuführen. Messfehler durch eine schlechte Befüllung oder durch ungeregelte Strömungen lassen sich so reduzieren bzw. verhindern.
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Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung mit vorteilhaften Weiterbildungen gemäß den Merkmalen der abhängigen Ansprüche werden nachfolgend anhand der folgenden Figuren näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
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Es zeigen:
- 1 schematisch eine Schnittdarstellung einer Durchflusszelle mit einem Sensor-Array auf einem Sensor-Chip ohne Kühl- und Heizeinrichtung nach dem Stand der Technik, und
- 2 schematisch eine Schnittdarstellung einer Durchflusszelle mit einem Sensor-Array auf einem Sensor-Chip beim Befüllen mit Flüssigkeit unter Kühlung durch eine Kühleinrichtung bei einer erniedrigten Temperatur, und
- 3 schematisch eine Schnittdarstellung der Durchflusszelle aus 2 bei ausgeschalteter Kühlung und bei einer Messung bei einer erhöhten Temperatur nach bzw. während einer Beheizung.
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1 zeigt eine Durchflusszelle 1 nach dem Stand der Technik mit einem Sensor-Array auf einem Sensor-Chip 2. Die Durchflusszelle, und insbesondere der Sensor-Chip mit Sensor-Array 2 sind weder gekühlt noch beheizt. Es ist keine Kühl- und/oder Heizeinrichtung vorhanden.
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Die Durchflusszelle 1 umfasst ein Gehäuse, welches in der Schnittdarstellung der 1 durch ein unteres 3 und oberes 4 Gehäuseteil angedeutet ist. In der Durchflusszelle 1 bzw. integriert in dem Gehäuse ist der Sensor-Chip 2 angeordnet, welcher z.B. aus einem Silizium-Material besteht. Das Sensor-Array auf dem Sensor-Chip 2 ist in Richtung eines Reaktionsraumes 16 innerhalb der Durchflusszelle 1 gerichtet. Es umfasst Sensoren, welche in Form eines Arrays 5 auf der Oberfläche des Sensor-Chips 2 angeordnet sind. Die Sensoren 5 können z.B. aus Goldoberflächen in Form von Interdigitalelektroden aufgebaut sein. Die Interdigitalelektroden können kammartig ausgebildet sein, mit einem Abstand von z.B. 1 µm zwischen benachbarten Stegen zweier Elektroden und einer Breite der Stege von jeweils z.B. 1µm. Ein Sensor 5 kann aus zwei ineinander greifenden kammartigen Interdigitalelektroden bestehen, wobei der Sensor 5 von einer kreisförmigen Erhöhung aus der Chip-Oberfläche umschlossen ist, und einen Durchmesser von z.B. 150µm aufweist.
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Auf den einzelnen Sensoren des Arrays 5, welche der Einfachheit halber durch drei Sensoren A, B, C angedeutet sind in den Figuren, bzw. auf deren Elektroden sind Fänger-Moleküle 6 aufgebracht. Fänger-Moleküle 6 können z.B. Antikörper umfassen, welche über Thiol-Gruppen an die Goldoberflächen der Sensoren gebunden sind. Target-Moleküle 7 in einer zu analysierenden Flüssigkeit können spezifisch an die Fänger-Moleküle 6 binden. Die zu analysierende Flüssigkeit strömt über einen Zufluss 11 in die Durchflusszelle 1 bzw. in deren Reaktionsraum 16 und überstreicht die Elektroden des Sensor-Arrays 5 A, B, C. Mit einer, der Einfachheit halber in den Figuren nicht dargestellten Einrichtung, kann der Flüssigkeitsstrom reguliert und/oder eingestellt werden. Über einen Abfluss 12 kann die Flüssigkeit aus der Durchflusszelle 1 entfernt werden bzw. diese verlassen.
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Wird die zu analysierende Flüssigkeit in die Durchflusszelle 1 gefüllt bzw. diese von der Flüssigkeit durchströmt, so können in der Flüssigkeit gelöste Target-Moleküle 7 spezifisch an die Fänger-Moleküle 6 binden. Die Bindung kann z.B. durch Coulomb-Wechselwirkung erfolgen oder durch chemische Reaktionen, welche insbesondere kovalente Bindungen ausbilden. Sind verschiedene Sensoren 5 A, B, C mit unterschiedlichen Fänger-Molekülen 6 a, b, c beschichtet (vgl. 2), so binden spezifisch an den verschiedenen Sensoren 5 A, B, C unterschiedliche Target-Moleküle 7 *, **, ***, welche jeweils spezifisch für die auf den einzelnen Sensoren 5 A, B, C gebundenen Fänger-Moleküle 6 a, b, c sind.
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Die Target-Moleküle
7 können mit Labeln
8 (vgl.
2 und
3) versehen sein, z.B. mit an die Target-Moleküle
7 gebundenen Enzym-Labeln
8. Die Bindung der Target-Moleküle
7 an die Fänger-Moleküle
6 kann mit Hilfe der Label
8 für jeden Sensor einzeln nachgewiesen werden. Optische oder bevorzugt elektrochemische Nachweis-Methoden sind bekannt. Bei einem elektrochemischen Nachweis werden z.B. an den Enzym-Labeln
8 Substrat-Moleküle
13 umgesetzt, insbesondere von einem Edukt
13 zu einem Produkt
14. An der Sensor-Oberfläche
5, welche eine Elektrode darstellt, werden die umgesetzten Substrat-Moleküle (Produkte
14) Oxidiert bzw. Reduziert, wobei ein Ladungstransfer über die Elektrode gemessen werden kann oder eine Änderung der Ladung nahe der Elektrode (insbesondere ein Strom oder eine Änderung der Spannung). Wird ein Sensor aus wenigstens zwei Elektroden entgegen gesetzter Polung (positiv + / negativ -) aufgebaut, so kann an der einen Elektrode (+) das Produkt
14 oxidiert werden zu einem oxidiertem Produkt
Ox, und an der anderen Elektrode (-) das oxidierte Produkt wieder reduziert werden zu Red. Die Methode wird als Redoxcycling bezeichnet.
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Die an den Elektroden umgesetzte Ladungsmenge kann zeitabhängig gemessen werden und ist ein Maß für den Umsatz von Edukt 13 zu Produkt 14 am Enzym-Label 8 und somit für das spezifische Binden von Target-Molekülen 7 an Fänger-Moleküle 6. Nur bei Vorhandensein des für das Fänger-Molekül 6 spezifischen Target-Moleküls 7 in der zu analysierenden Flüssigkeit erfolgt an dem zugeordneten Sensor ein Ladungsumsatz, welcher gemessen wird.
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In einem Ausführungsbeispiel werden als Fänger-Moleküle
6 Antikörper verwendet. Das Enzym-Label
8 ist alkalische Phosphatase, mit einer Konzentration von 17U/ml in 0.1M PhosphatPuffer. Das Substrat (Edukt
13) ist 2 mM p-Aminophenylphosphat in Puffer mit pH 9. Durch das Enzym
8 wird das p-Aminophenylphosphat (Edukt
13) in p-Aminophenol (Produkt
14) und Phosphat gespalten.
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Die Durchflusszelle wird z.B. mit 5µl befüllt, wobei je Sensor eine Nachweisgrenze von 10-20 mol für Enzym-Label 8 erreicht werden kann. In die Durchflusszelle 1 kann ein Gel oder eine Zellulose (poröses Material) über den Sensoren 5 eingebracht sein, oder diese kann mit einem Gel oder einer Zellulose (z.B. Nitrozellulose) befüllt sein. Kapillarkräfte können die Flüssigkeit über die Sensoren 5 transportieren.
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Das Messsignal kann durch eine Elektronik 9 auf dem Chip 2 verarbeitet und/oder ausgewertet werden, und dann kann z.B. an eine in 1 nicht gezeigte Ausgabeeinheit das Messergebnis weitergeleitet werden. Alternativ kann das Messergebnis aber auch direkt an eine Ausgabeeinheit weitergeleitet werden. Eine weitere Aufarbeitung des Messsignals kann in der Ausgabeeinheit erfolgen. Ein Computer mit Display stellt z.B. eine solche Ausgabeeinheit dar.
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In der in 1 dargestellten Durchflusszelle 1 mit Sensor-Chip erfolgt keine Kühlung oder Heizung der Flüssigkeit. Beim Befüllen bzw. Durchströmen der Zelle 1 mit Flüssigkeit binden die Target-Moleküle 7 an die Fänger-Moleküle 6 und gleichzeitig kann an den Labeln 8 der Target-Moleküle 7 ein Substratumsatz erfolgen. Durch die Strömung der Flüssigkeit werden die umgesetzten Substrat-Moleküle 14 zu benachbarten oder weiter entfernt befindlichen Sensor-Oberflächen 5, insbesondere Elektroden transportiert, und dort registriert bzw. gemessen. Ein Übersprechen erfolgt und die gemessenen Ergebnisse können nicht mehr den spezifischen Target-Molekülen 7 *, **, *** auf den zugehörigen Sensoren 5 A, B, C zugeordnet werden. Die Messergebnisse sind verfälscht.
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In 2 ist schematisch eine Schnittdarstellung einer Durchflusszelle 1 mit einem Sensor-Array auf einem Sensor-Chip 2 dargestellt, welche eine Kühleinrichtung 15 umfasst. Beim Befüllen der Durchflusszelle 1 mit zu analysierender Flüssigkeit wird über die Kühleinrichtung eine erniedrigte Temperatur T1 über dem Sensor-Chip 2 eingestellt bzw. aufrechterhalten. Die Temperatur kann über einen auf dem Sensor-Chip befindlichen Temperatur-Sensor 10 gemessen werden. Über eine nicht dargestellte Regeleinrichtung, welche z.B. in der Elektronik auf dem Chip 9 integriert ist, wird die Kühleinrichtung gesteuert. Die Temperatur T1 liegt bevorzugt im Bereich von 0 bis 20°C, besonders bevorzugt im Bereich von 10°C.
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Durch die Kühlung des Sensor-Chips 2 während des Befüllens der Durchflusszelle 1 werden die Label 8 auf einer Temperatur gehalten, bei welcher diese inaktiv sind, d.h. kein SubstratUmsatz stattfinden kann oder zumindest eingeschränkt stattfindet. Edukt-Moleküle 13 werden nicht bzw. nur eingeschränkt zu Produkt-Molekülen 14 umgesetzt. Ein Verschleppen durch die Strömung der Flüssigkeit und ein Messen von Produkt-Molekülen 14 an Elektroden 5, an welchen diese nicht gebildet worden sind, wird so verhindert bzw. stark eingeschränkt. Ein Übersprechen erfolgt nicht oder nur in geringem Ausmaß.
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In 3 ist schematisch eine Schnittdarstellung der Durchflusszelle 1 aus 2 dargestellt, nachdem das Befüllen der Durchflusszelle 1 abgeschlossen ist. Es findet kein Strömen von Flüssigkeit über das Sensor-Array 2 statt. Die Kühleinrichtung 15 ist abgeschaltet und über dem Sensor-Chip mit Sensor-Array 2 bildet sich eine erhöhte Temperatur aus. Um diese erhöhte Temperatur auszubilden kann die Kühleinrichtung 15 als Heizeinrichtung 15 verwendet werden, z.B. indem erwärmte Flüssigkeit durch die Kühl/Heizeinrichtung 15 geströmt wird. Alternativ kann die Heizeinrichtung in Form von Peltier-Elementen, CMOS-Transistoren und/oder -Widerständen ausgebildet sein. Diese können in dem Chip 2 integriert oder an, in oder auf dessen Rückseite, welche der Seite mit dem Sensor-Array gegenüber liegt, oder auf dessen Vorderseite, der Seite mit dem Sensor-Array, angeordnet sein. Eine bevorzugte Temperatur zum Heizen liegt bei T2 im Bereich von 20 bis 50°C, besonders bevorzugt im Bereich von 40°C (+/- 5°C).
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Bei dieser Temperatur sind die Label 8 aktiv und Substrat wird von einem Edukt 13 zu einem Produkt 14 umgesetzt bzw. verstärkt umgesetzt, im Vergleich zu der in 2 dargestellten Situation. Das Fehlen von Strömung in der Flüssigkeit führt zu einer Bewegung der Moleküle nur durch Diffusion. Die Diffusion führt im Vergleich zu einer strömenden Flüssigkeit beim Befüllen der Durchflusszelle 1 zu einer geringen Bewegung und einem beschränkten Bewegungsradius um die Elektroden 5 herum. Substrat, welches an einer Elektrode 5 A von einem Edukt 13 zu einem Produkt 14 umgesetzt wird, wird fast ausschließlich an derselben Elektrode A wieder zu Edukt 13 umgesetzt. Die geringe Bewegung der Moleküle in der Flüssigkeit verglichen mit einer strömenden Flüssigkeit führt zu einem lokalen Stoffumsatz spezifisch an den Elektroden, ohne Übersprechen bzw. mit stark eingeschränktem Übersprechen. Dadurch werden Messfehler verhindert bzw. stark reduziert.
