KR100624490B1

KR100624490B1 - 화학변형 열안정성 ｄｎａ 중합효소

Info

Publication number: KR100624490B1
Application number: KR1020040037864A
Authority: KR
Inventors: 양영근; 김종열; 김성욱; 태건식; 권오협; 장혁준
Original assignee: 바이오퀘스트(주); 고마바이오텍(주)
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2006-09-20
Also published as: KR20050112686A

Abstract

본 발명은 화학변형 열안정성 DNA 중합효소에 있어서, 상기 열안정성 DNA 중합효소는 피리독살 포스페이트 (PLP) 또는 피리독살 (PL)에 의해 그의 라이신 잔기의 ε-아미노기가 화학변형되어 있고, 상기 PLP 또는 PL이 상기 열안정성 DNA 중합효소로부터 해리되면 그의 활성이 회복되는 것을 특징으로 하는 화학변형 열안정성 DNA 중합효소, 이를 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물 및 이를 이용한 핵산분자의 증폭방법에 관한 것이다.

중합효소, PCR, 열안정성 DNA 중합효소, PLP, PL, 화학변형

Description

화학변형 열안정성 ＤＮＡ 중합효소{Chemical-Modified Thermostable ＤＮＡ Polymerase}

도 1은 포스페이트 농도변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.

도 2는 피로포스페이트의 농도변화에 따른 흡광도 변화를 나타내는 그래프이다.

도 3은 다양한 농도의 PLP (피리독살 포스페이트) 또는 PLP와 NaBH₄로 처리한 Taq DNA 중합효소가 활성이 억제됨을 보여주는 M13 연장 반응 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 4는 다양한 농도의 PLP로 처리한 Taq DNA 중합효소가 활성이 억제됨을 보여주는 M13 연장 반응 결과를 나타내는 젤 사진이다.

도 5는 다양한 농도의 PLP로 처리한 Taq DNA 중합효소를 이용하고 람다 DNA를 주형으로 이용한 핫 스타트 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.

도 6은 다양한 농도의 PLP로 처리한 Taq DNA 중합효소를 이용한 TNF 유전자에 대한 핫 스타트 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.

도 7은 다양한 농도의 PL (피리독살)로 처리한 Taq DNA 중합효소를 이용한 HIV-1 유전자에 대한 핫 스타트 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.

도 8은 PL로 처리한 Pfu DNA 중합효소를 이용한 HIV-1 유전자에 대한 핫 스타트 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.

도 9는 PLP로 화학변형된 Taq DNA 중합효소를 이용하여 HIV-1 유전자의 카피 수에 따른 증폭 패턴의 변화를 보여주는 젤 사진이다.

도 10은 PLP로 화학변형된 본 발명의 Taq DNA 중합효소, Applied Biosystems사의 AmpliTaq Gold 및 Qiagen사의 HotStarTaq DNA 중합효소의 람다 DNA 주형에 대한 증폭 패턴을 보여주는 젤 사진이다.

도 11은 PLP로 화학변형된 본 발명의 Taq DNA 중합효소, Applied Biosystems사의 AmpliTaq Gold 및 Qiagen사의 HotStarTaq DNA 중합효소의 M13 프라이머 연장 반응 패턴을 보여주는 젤 사진이다.

본 발명은 화학변형 열안정성 DNA 중합효소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PLP (피리독살 포스페이트) 또는 PL (피리독살)로 화학변형된 열안정성 DNA 중합효소, 이를 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물 및 이를 이용한 핵산분자의 증폭방법에 관한 것이다.

PCR (Polymerase chain reaction)은 1980년대에 Mullis에 의해 개발 (1, 2)되었고, 이후 열에 안정한 Taq DNA 중합효소의 개발로 생명공학 분야에서 중요한 분야로 급속한 발전을 이루었다. 이 PCR 기술은 현재 인간 유전자 분석, 유전 질병 원인 규명, 유전 진단, 미생물학 (식품, 환경, 임상 등), 개인 식별과 친자 확인의 방법 등 다양한 분야에서 이용되고 있으며, 관련 시장은 계속적으로 증가하고 있다.

PCR의 기술적인 발전은 Taq DNA 중합효소에 비해 높은 충실도 (fidelity)를 갖는 DNA 중합 효소 (예컨대, Pfu DNA 중합효소)의 개발과 긴 길이 (long size or Long range) DNA를 증폭할 수 있는 기술의 개발 (3, 4), PCR을 이용한 클로닝, 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR, 원스템과 투스텝 방법), 정량적 PCR/RT-PCR (real time PCR), 분별 디스플레이 PCR, 핫 스타트 (hot start) PCR, 염기서열 분석 등 다양한 방법들로 개발되었고, 현재 생명공학 분야의 대부분의 연구 등에서 이 PCR 방법은 필수적인 실험법으로 여겨지고 있다.

이런 PCR의 핵심 요소는 내열성, 즉 열안정성 DNA 중합효소로서, 현재 다양한 고온성 미생물에서 정제되어 시판되고 있으나, 전 세계적으로 가장 널리 이용되고 있는 효소로는 1989년 처음으로 PCR법에 적용된 Taq DNA 중합효소 (Thermus aquaticus)(5) 와 충실도 가지고 있는 Pfu (Pyrococcus furiosus)가 있다 (6, 7).

근래에 PCR-관련 산업에서 중요한 부분으로 중요하게 여겨지고 있는 기술은 핫 스타트 PCR로, 현재 핫 스타트 PCR은 감염성 질환 (예, HIV), 순도가 높지 않은 DNA를 이용하는 경우, 실시간 PCR, 원스텝 RT-PCR 등 다양한 분야에서 이용되고 있 으며, 관련 효소에 대한 연구가 매우 다양한 방향으로 진행되고 있다.

일반적인 PCR에서는 PCR 성분들을 혼합하는 과정과 초기 온도 증가 때 비특이적인 프라이밍이 발생한다. 이 때 중합효소의 활성 작용에 의해 원하는 않는 PCR 산물을 얻게 되며, 이 PCR 산물은 계속적인 PCR 반응에서 원하는 PCR 산물과의 경쟁적인 반응을 하면서 원하는 PCR 산물의 검출을 방해한다. 핫 스타트 PCR은 이런 초기 PCR 과정상의 비특이적인 프라이밍에 의해 생성된 원하지 않는 PCR 산물을 제거하기 위한 방법으로 개발된 것으로서, 초기 온도 증가가 이루어진 상태에서 PCR 반응이 개시되게 하는 방법이다. 이와 같은 핫 스타트 PCR의 장점은 일반적인 PCR에 비해 약 50% 정도의 PCR 산물의 특이성을 증가시킬 수 있다는 것이다.

가장 초기에 사용되었던 핫 스타트 PCR 방법으로 매뉴얼 (Manual) 법이 있다. 이 방법은 초기에 PCR에 필요한 성분 중의 하나 (예컨대, MgCl₂, Taq DNA 중합효소, dNTP 등)를 온도가 올라간 상태에서 첨가해 주는 방법이다. 그러나, 이 방법은 다량의 시료를 처리하는 경우에 사용할 수 없는 등 많은 불편한 점을 가지고 있다.

이후에 개발된 방법으로 PCR의 중요 성분들을 왁스를 이용하여 분리한 후 이 분리된 성분들이 온도가 올라가면서 왁스의 용해에 의해 서로 혼합되면서 PCR이 진행되는 방법이다 (8). 이 방법은 왁스를 녹여서 첨가를 해 주어야 하는 문제, PCR 반응 후 PCR 산물을 얻는데 왁스가 방해를 할 수 있으며, 왁스의 첨가로 전체 반응액의 양이 증가되는 단점이 있다.

또 다른 방법으로서, 가장 상업적으로 성공을 거두었고, 현재 Invitrogen 등 몇몇 기업체에서 사용하고 있는 방법으로 Taq DNA 중합효소의 항체를 이용 방법이 있다 (9). 이 방법은 상온에서 항체가 중합효소와 반응을 하고 있으므로 효소의 활성을 억제하는 효과를 가질 수 있으며, 온도가 올라가면 항체가 효소에서 떨어져 나가므로, 효소의 활성이 작용하게 되어 PCR이 진행되게 된다. 그러나, 이 방법은 과량의 항체의 양을 필요로 하며, 또한 항체의 가격이 고가라는 문제점을 가지고 있다.

최근에 개발된 방법으로서, 화학적 변형 (chemical modification)된 DNA 중합효소를 이용하는 방법이 있으며, 이 기술은 Roche (10, 11)와 Qiagen (12)에서 각각 개발되었고, 핫 스타트 관련 미국 시장의 약 68%를 점유하고 있다. 이 방법에 따르면, 화학적 변형에 의해서 Taq DNA 중합효소의 활성이 억제되어 있다가, PCR 반응의 초기 재활성화 과정 (95℃에서 10분)을 통해서 효소의 활성이 재활성화되어 PCR를 진행하는 방법이다. 그러나, PCR 반응 초기에는 효소의 약 30%만이 재활성되고, 고온에 의한 재활성화로 주형 DNA에 탈퓨린화가 발생되어 긴 길이의 증폭은 불가능한 단점이 있으나, 사용이 편리하고 특이성이 매우 높은 장점을 가지고 있으므로, 매우 폭넓게 사용되고 있다.

그 외의 방법으로는 프라이머의 독특한 설계 방법 (프라이머 제작의 고가 문제점 가짐), 마그네슘 침전법 (13) (고농도의 Mg를 사용, 정확한 농도의 Mg 사용이 불가능), 피로포스파타아제와 피로포스페이트를 이용하는 방법 ((주)바이오니아, 대한민국)이 개발이 되어 있으나, 이들 방법들 모두 결정적인 문제점을 가지고 있 기 때문에, 제품화에는 성공하지 못하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 핵산 증폭에 적합한 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 개발하고자 노력한 결과, 피리독살 포스페이트 (PLP) 또는 피리독살 (PL)에 의해 화학변형된 열안정성 DNA 중합효소가 본 발명의 목적에 부합되는 특성을 나타냄을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 이용하는 핵산분자의 증폭방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도 면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 화학변형 열안정성 DNA 중합효소에 있어서, 상기 열안정성 DNA 중합효소는 피리독살 포스페이트 (PLP) 또는 피리독살 (PL)에 의해 그의 라이신 잔기의 ε-아미노기가 화학변형되어 있고, 상기 PLP 또는 PL이 상기 열안정성 DNA 중합효소로부터 해리되면 그의 활성이 회복되는 것을 특징으로 하는 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명자들은 핵산 증폭, 바람직하게는 PCR (polymerase chain reaction), 가장 바람직하게는 핫 스타트 PCR (hot start PCR)에 적합한 화학변형 열안정성 (내열성) DNA 중합효소를 개발하고자 노력한 결과, 피리독살 포스페이트 (PLP) 또는 피리독살 (PL)에 의해 화학변형된 열안정성 DNA 중합효소가 본 발명의 목적에 부합되는 특성을 나타냄을 발견하였다.

본 발명에 있어서, 화학변형 대상이 되는 효소는 열안정성 (내열성)을 나타내는 DNA 중합효소로서 고온의 최적 온도를 가지는 중합효소이다. 화학변형의 대상이 되는 효소는 당업계에 공지된 어떠한 열안정성 DNA 중합효소가 가능하다. 바람직하게는 상기 열안정성 DNA 중합효소는, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermis flavus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Thermotoga maritima, Pyrococcus profundus, Thermococcus stetteri, Thermococcus peptonophilus, Thermococus celer, Thermococcus fumicolans 및 Thermococcus litoralis로부터 분리된 DNA 중합효소이다. 보다 바람직하게는, Thermus aquaticus로부터 분리된 Taq DNA 중합효소, Pyrococcus furiosus로부터 분리된 Pfu DNA 중합효소, Pyrococcus woesei로부터 분리된 Pwo DNA 중합효소 및 Thermus thermophilus로부터 분리된 Tth DNA 중합효소이고, 보다 더 바람직하게는, Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소이고, 가장 바람직하게는 Taq DNA 중합효소이다.

본 발명에서 열안정성 DNA 중합효소를 화학변형 (chemical modification)하기 위하여 사용된 화학물질은, 피리독살 포스페이트 또는 피리독살이다. 상기 피리독살 포스페이트는 바람직하게는 피리독살 5'-포스페이트이다.

상기 두 화학변형제는 단백질의 라이신 잔기의 ε-아미노기에 결합하여 쉬프염기 (Schiff Base)를 형성하며, 이 쉬프염기 결합 형태가 가역적으로 분해되어 화학변형제가 해리되면, 원래의 단백질 형태가 얻어진다.

본 발명에서의 화학변형은 당업계에 공지된 통상의 화학변형 방법을 통해 실시할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, Bicine 완충액 (pH 8.0), KCl, EDTA 및 열안정성 DNA 중합효소의 혼합물에 적당량의 PLP 또는 PL를 첨가하여 37℃에서 30분 내지 1시간 반응시켜 화학변형을 실시한다. PLP에 의한 변형에 있어서, 바람직한 PLP의 농도는 0.1-1 mM이고, 보다 바람직하게는 0.2-0.8 mM이며, 가장 바람직하게는 약 0.5 mM이다. PL에 의한 변형에 있어서, 바람직한 PL의 농도는 1-15 mM이고, 보다 바람직하게는 5-12 mM이며, 가장 바람직하게는 약 10 mM이 다.

화학변형이 완료된 반응물은 젤 여과방법 (gel filtration) 또는 투석을 거쳐 미반응 PLP 또는 PL을 제거한다. 화학변형된 열안정성 DNA 중합효소는 각 중합효소에 맞는 저장 완충액, 예컨대, Taq DNA 중합효소의 경우에는, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% NP-40 및 50%(w/v) 글리세롤을 포함하는 저장 완충액, Pfu DNA 중합효소의 경우에는 50 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Tween-20, 0.1% NP-40 및 50%(w/v) 글리세롤을 포함하는 저장 완충액에 보관한다.

PLP 또는 PL로 화학변형된 본 발명의 열안정성 DNA 중합효소는 변형전보다 감소된 활성을 가지며, 프라이머 연장 (primer extension)의 통상적인 온도 (예컨대, 60-75℃)에서 실질적으로 프라이머 연장 활성을 나타내지 않는다. 화학변형된 열안정성 DNA 중합효소는 간단한 열처리에 의해 재활성화 (reactivation) 된다. 상기 열처리에 의해 열안정성 DNA 중합효소에 공유결합되어 있던 PLP 또는 PL이 해리되어 변형전의 재활성화 열안정성 DNA 중합효소를 얻게 된다. 재활성화된 열안정성 DNA 중합효소는 상당한 프라이머 연장 활성을 나타낸다. 본 명세서에서 재활성화 과정과 관련하여 사용된 표현 "활성의 회복"은 원래의 활성, 즉 변형전의 활성을 30-100%, 바람직하게는 50-100%, 보다 바람직하게는 60-100%까지 회복한 것을 의미한다.

상기 열처리는 바람직하게는 50℃-100℃, 보다 바람직하게는 60℃-97℃, 보다 더 바람직하게는 70℃-96℃, 가장 바람직하게는 약 95℃에서 실시한다. 본 발 명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소는 다른 변형제 (예컨대, 시트라콘 무수화물 (citraconic anhydride) 및 포름알데히드)보다 마일드 (mild)한 조건 (예컨대, 보다 낮은 온도 및/또는 보다 짧은 재활성화 시간)에서 재활성화될 수 있는 장점을 갖는다. 이러한 장점은 열안정성 DNA 중합효소의 열에 의한 비활성화 (inactivation)를 감소시키며, 또한 주형 DNA의 열에 의한 탈퓨린화 (depurination)를 감소시킬 수 있다.

상술한 열처리에 의해 재활성화 과정은 핵산 증폭, 예컨대, PCR 사이클 전에 전항온처리 과정 (pre-incubation)에 의해 실시하거나 또는 PCR 사이클의 변성 단계에서 변성과 동시에 실시할 수 있다.

본 발명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소는 핵산 증폭, 바람직하게는 PCR, 보다 바람직하게는 핫 스타트 PCR에 매우 적합하다. 본 발명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소는 종전의 어떠한 화학변형 열안정성 DNA 중합효소보다도 우수한 민감성 (sensitivity) 및 특이성 (specificity)을 나타내며, 이러한 사실은 하기 실시예의 실험결과 Ⅲ-1 (HIV-1 유전자의 핫 스타트 PCR 응용예)에 예시되어 있으며, 도 9에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소; 그리고, (b) 효소 안정화제, 완충용액, MgCl₂, 4종의 dNTP 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 중합효소 반응시약을 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물 (premixture)을 제공한다.

본 발명의 전혼합물에서, 이용 가능한 효소 안정화제의 예는 글리세롤 (Gekko, K. et al., Biochemistry, 20:4677(1981)), 글루코스, 수크로스, 푸럭토스, 소르비톨 (Smith, M.B. et al., Proc. Aust. Biochem. Soc., 11:4(1978)), 네오트레할로스, 이소트레할로스, 라피노스 및 멜레지토스가 있다. 상기 효소 안정화제의 양은 효소 반응 전혼합물을 기준으로 하여 1-15 중량%가 바람직하다.

본 발명의 전혼합물에 포함되는 완충액은 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 완충액도 사용이 가능하다. 예컨대, Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, MOPS-KOH, HEPES-NaOH, Tris-Cl, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCl, 보레이트 및 글리신-NaOH을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 전항온처리하여 재활성화하는 단계; 및 (b) 핵산분자를 주형으로 이용하고 상기 재활성화된 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 상기 핵산분자를 증폭하는 단계를 포함하는 핵산분자의 증폭방법을 제공한다.

본 발명의 핵산분자의 증폭방법에 있어서, 바람직하게는 증폭을 실시하기 전에, 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 전항온처리 (pre-incubation)하여 열안정성 DNA 중합효소를 재활성화한다. 이러한 재활성화 과정에 의해, 화학변형된 중합효소와 비교하여 바람직하게는, 최소 2배, 보다 바람직하게는 최소 3배, 가장 바람직하게는 최소 4배 정도의 활성을 가지게 된다.

상기 재활성화 과정은 바람직하게는 열처리에 의해 실시된다. 상기 열처리는 바람직하게는 50℃-100℃, 보다 바람직하게는 60℃-97℃, 보다 더 바람직하게는 70℃-96℃, 가장 바람직하게는 약 95℃에서 실시한다.

화학변형 열안정성 DNA 중합효소의 재활성화 과정에 이어, 열안정성 DNA 중합효소를 이용한 증폭이 실시된다. 상기 증폭 과정은 당업계에 공지된 핵산분자의 증폭방법에 따라 실시된다.

예를 들어, 상기 증폭과정은 PCR (미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호), Davey, C. 등의 방법 (EP 329,822), 리가아제 연쇄 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 연쇄 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 교정 연쇄 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (미국 특허 제5,130,238호)에 따라 실시될 수 있으며, 보다 바람직하게는 PCR 방법, 가장 바람직하게는 핫 스타트 PCR 방법에 따라 실시된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

실험 재료

인간 지놈 DNA와 Taq DNA 중합효소는 Promega사 제품, M13 mp18 단일쇄 DNA (7,249 bases)은 Takara사 제품, GeneAmplimer HIV-1 대조군 시약, AmpliTaq DNA 중합효소, AmpliTaq Gold DNA 중합효소는 Applied Biosystems사 제품, HotStarTaq DNA 중합효소는 Qiagen사 제품, Pfu DNA 중합효소는 Stratagene사 제품을 구입하였다. 프라이머의 합성은 Takara, Bioneer, Genotech사에서 하였다. 말라키트 그린 (Malachite Green (oxalate))은 Merck사 제품을 무기 피로포스파타아제, 피리독살-5-포스페이트 (PLP), 피리독살 (PL), 소듐 포스페이트 (모노베이직), 암모늄 몰리브데이트(4수화물), 소듐 피로포스페이트 (탈수화물)의 제품은 Sigma사의 제품을 구입하였다. 사용한 PCR 사이클러는 MJ research 사의 PTC200과 MWG사의 Primus96을 사용하였다.

실험 방법

I. DNA 중합효소의 활성 측정

I-1: 내열성 DNA 중합효소의 일반적인 활성 측정법 (14)

DNA 중합효소의 활성 측정은 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, dNTP 각각 0.2 mM, 0.1 mCi[α-³²P]dCTP 및 12.5 ㎍ 활성화 소 흉선 DNA로 이루어진 50 ㎕의 반응 혼합물에 효소용액을 첨가한 후 72℃에서 30분간 반응시 킨 다음, 트리클로로아세트산으로 침전되며 삽입되는 dNTP의 양으로 결정하였다. 1 unit은 75℃에서 30분 동안에 침전된 DNA에 삽입되는 전체 dNTP의 양이 10 nmol이다.

I-2: 피로포스파타아제를 이용한 DNA 중합효소의 활성 측정

가. 포스페이트의 측정

소듐 피로포스페이트를 이용하여 만든 다양한 농도의 포스페이트 표준액과 암모늄 몰리브데이트를 이용한 방법(15)을 사용하였다. 다양한 농도의 포스페이트 100 ㎕ (0-100 μM)에 80 mM 암모늄 몰리브데이트 400 ㎕와 5 N H₂SO₄ 400 ㎕를 넣어 잘 혼합한 다음, 1 mM 말라키트 그린(16) 100 ㎕를 넣어 650nm에서 흡광도를 측정하였다.

나. 피로포스페이트의 측정

피로포스페이트의 측정은 다음과 같이 실시하였다: 소듐 피로포스페이트를 이용하여 만든 다양한 농도의 피로포스페이트와 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂에 0.1 unit의 무기 피로포스파아제 (pyrophosphatase)를 넣어 최종 부피가 100 ㎕가 되게 하였다. 이 용액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 포스페이트의 측정을 통해서 분해된 무기 포스페이트를 측정하였다. 피로포스페이트는 피로포스파아제에 의해 분해되면 2배의 포스페이트가 생성되므로 포스페이트의 측정값의 절반이 사용된 피로포스페이트의 양이 된다.

다. DNA 중합효소의 활성 측정

중합효소의 활성 측정은 방사성 동위원소를 이용한 측정 방법의 조건을 이용하여 실시하였다. 즉, 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, dNTP 각각 0.2 mM 및 12.5 ㎍ 활성화 소 흉선 DNA로 이루어진 50 ㎕의 반응 혼합물에 효소 용액을 넣은 후 72℃에서 30분간 반응시켰다. 이어, 일정 양을 취한 후 중합효소의 작용에 의해 생성된 피로포스페이트를 위의 피로포스퍼타아제를 이용한 피로포스페이트의 측정 방법에 따라 측정을 하였다. 화학 변형된 DNA 중합효소는 80℃에서 3시간 항온처리한 후에 측정을 하였다.

Ⅱ. 중합효소 연쇄반응

Ⅱ-１: 람다 DNA를 주형으로 이용한 PCR

DNA 중합효소의 PCR 반응성을 확인하기 위해, 본 연구자들은 람다 (Lambda) DNA와 PC01-PC04의 프라이머 (표 1)를 사용하여 300 bp (PC03과 PC04)와 500 bp (PC01과 PC02)의 산물을 얻을 수 있음을 확인하였고, 이들 4종류의 프라이머를 모두 다 이용할 경우 300과 500 bp 두 개의 산물을 확인할 수 있는 간단한 멀티플렉스 PCR 시스템이 구축됨을 확인하였다.

PCR 반응은 10 x 반응 용액 (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl) 5 ㎕, 최종농도가 1.5 mM이 되게 MgCl₂를 넣고, 2.5 ng 람다 DNA, 프라이머의 최종농도는 0.2 μM, dNTP 혼합액은 최종 농도는 0.2 mM이 되게 넣어 준 후 여기에 다양한 양의 DNA 중합효소를 넣었다. 최종 부피 50 ㎕가 되게 증류수를 넣어 준 다음 PCR을 진행하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분 또는 화학 변형 DNA 중합효소의 경우에는 95℃에서 10분 진행한 후, 94℃에서 15초와 68℃에서 1분을 30회 반복한 다음, 72℃에서 7분간 반응을 더 진행하고서 4℃로 낮추었다. 결과물은 2% 아가로스 젤 전기영동을 통해서 확인하였다.

람다 DNA 증폭을 위한 프라이머

올리고뉴클레오타이드 표시 (방향성)	서열 (5'-3')	위치^a
PC01(+)	GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CTG G	7131-7355
PC02(-)	GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CGC C	7630-7606
PC03(+)	TTC AGG CGG CGC ATT TTT ATT	30537-30557
PC04(-)	ACG TCG ATG ACA TTT GCC GTA	30836-30816
^a GenBank 접근번호 J02459 참조

Ⅱ-2: 종양괴사인사 (TNF)를 주형으로 이용한 PCR

TNF를 이용한 PCR에서, 일반적인 PCR은 원하는 크기의 산물 (131 bp) 외에 다른 원하지 않는 산물이 같이 생성시킨다. 그러나 핫 스타트 PCR을 진행하면 원하는 산물인 131 bp를 얻을 수 있게 된다. 따라서 활성억제 및 재활성화에 따른 핫 스타트 PCR의 진행이 적절히 이루어졌는지를 확인할 수 있는 방법으로 TNF에 대한 증폭을 실시하였다.

여기서 사용된 주형은 인간의 지놈 DNA를 사용하였고, 사용된 프라이머는 센 스 프라이머가 5'-GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG-3'(TNF_131F)이고, 안티센스 프라이머는 5'-CCT GCC CCA ATC CCT TTA TT-3'(TNF_131R)이다. PCR 반응은 10 x 반응 용액 5 ㎕, MgCl₂(최종 농도 2.5 mM), 50 ng 인간 지놈 DNA, 프라이머 (최종농도 0.2 μM) 및 dNTP 혼합액 (최종 농도 0.2 mM)를 넣어 주고 DNA 중합효소를 다양한 양을 넣은 후 최종부피 50 ㎕가 되게 증류수를 넣어 주었다. PCR 반응은 94℃에서 2분 또는 화학 변형 DNA 중합효소의 경우에는 95℃에서 10분 진행한 후, 94℃에서 1초, 55℃에서 1초와 72℃에서 30초를 35회 반복한 다음, 72℃에서 7분간 반응을 더 진행하고서 4℃로 낮추었다. 결과물은 2% 아가로스 젤 전기영동을 통해서 확인하였다.

Ⅱ-3: M13 프라이머 연장 반응

반응은 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl 및 1.5 mM MgCl₂ 용액에 50 ng M13mp18 DNA, 0.1 μM 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (5'-TTT CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG-3') 및 50 μM의 dNTP 혼합물을 혼합한 다음, 여기에 일정 양의 DNA 중합효소 (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 1 ㎍/㎖ BSA 용액으로 희석)를 첨가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되게 하였다. 위 반응액을 94℃에서 1초, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분을 순서대로 진행을 한 후, 4℃로 온도를 낮추었다. 여기에 적절한 양의 로딩 다이를 넣어 1% 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 결과를 확인하였다. 결과를 통해 DNA 중합효소의 활성을 알 수 있을 뿐만 아니라, DNA 중합효소의 활성 억제를 확인할 수 있었다. 화학 변형된 DNA 중합효소의 경우는 반응 조건은 초기에 95℃에서 15분, 55℃에서 30초, 72℃에서 3분을 순서대로 진행을 하였다.

Ⅱ-4: 낮은 카피수의 HIV-1 DNA 확인(17)

10 x 반응용액 ((주)Koma Biotech, Inc., 대한민국) 5 ㎕, 25 mM MgCl₂ 5 ㎕, 100 ng 인간 지놈 DNA (Promega)에 다양한 카피수의 HIV 양성대조군 DNA (GeneAmplimer HIV-1 대조군 시약)를 넣고, 여기에 프라이머 (표 2)의 최종 농도는 0.5 μM, dNTP 혼합액은 최종 농도 0.2 mM이 되게 넣어 준 후 여기에 다양한 양의 DNA 중합효소를 양을 넣었다. 최종 부피 50 ㎕가 되게 증류수를 넣어 준 다음 PCR을 진행하였다. PCR 반응의 구체적인 조건은 아래의 표 3과 같고, 그 결과물은 2% 아가로스 젤 전기영동을 통해서 확인하였다.

HIV-1의 증폭용 프라이머

올리고뉴클레오타이드 표시 (방향성)	서열 (5'-3')	위치^a
SK38(+)	ATA ATC CAC CTA TCC CAG TAG GAG AAA T	1551-1578
SK39(-)	TTT GGT CCT TGT CTT ATG TCC AGA ATG C	1665-1638
SK145(+)	AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT	1366-1395
SK431(-)	TGC TAT GTC AGT TCC CCT TGG TTC TCT	1507-1481
^a GenBank 접근번호 K02007 참조

HIV-1의 증폭시 조건

SK38 & SK39 (115 bp)
사이클	단계	온도	시간
1	1	95℃	10분
40	2	95℃	1분
	3	55℃	1분
	4	72℃	1분
1	5	72℃	10분

HIV-1의 증폭시 조건

SK145 & SK431 (142 bp)
사이클	단계	온도	시간
1	1	95℃	10분
43	2	94℃	1분
43	3	60℃	1분
1	5	60℃	10분

HIV-1의 증폭시 조건

SK145 & SK39 (300 bp)
사이클	단계	온도	시간
1	1	95℃	10분
45	2	94℃	1분
45	3	60℃	1분
1	5	60℃	10분

Ⅲ. PLP 및 PL을 이용한 화학 변형 처리

반응액은 200 mM Bicine pH 8.0, 1 M KCl 및 10 mM EDTA 용액 100 ㎕와 Taq DNA 중합효소 (50 unit/㎕) 200 ㎕ 또는 100 ㎕ Pfu DNA 중합효소 (25 unit/㎕)를 혼합한 다음, dH₂O로 최종부피를 1 ㎖로 만들었다 (최종 Taq DNA 중합효소는 10 unit/㎕, Pfu DNA 중합효소는 5 unit/㎕). 여기에 50 mM PLP (pH 8.0) 혹은 100 mM PL (pH8.0)를 다양한 양으로 첨가한 후, 37℃에서 30분과 1시간 반응 후, 4℃로 냉각을 하였다. 이렇게 얻어진 용액을 젤 여과방법이나 투석을 통해 과량의 미반 응 PLP와 PL을 제거한 후 위의 각 중합효소에 맞는 저장 완충액으로 교체한 후 M13 프라이머 연장반응과 람다 DNA를 이용한 PCR, TNF 유전자에 대한 PCR 등 다양한 방법으로 활성을 확인하였다. 상기 젤 여과방법은 Sepadex G 50 컬럼을 이용하여 실시하였고, 젤 여과방법 또는 투석은 하기의 저장용액에서 글리세롤을 제외한 용액을 이용하여 실시하였다. Taq DNA 중합효소의 저장 완충액은 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% NP-40 및 50%(w/v) 글리세롤을 포함하며, Pfu DNA 중합효소는 50 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Tween-20, 0.1% NP-40 및 50%(w/v) 글리세롤을 포함한다.

실험 결과

Ⅰ. DNA 중합효소의 활성 측정

Ⅰ-1: 포스페이트의 농도 측정

현재 무기 포스페이트 발색을 통한 정량 방법은, 암모늄 몰리브데이트와 포스페이트가 결합한 후 환원제를 처리하면 색깔이 포스페이트의 양에 따라 정량적으로 나온다는 Fiske-SubbaRow 방법이 소개된 이후, 새롭고 안정한 환원제를 이용하는 방법으로 변형된 방법들이 개발되었고 (예, 아스코르브산을 이용한 방법), 이외에도 효소학적인 화학 발광법이나 자외선 측정법 등이 알려져 있다. 본 발명자들은 다양한 환원제를 통한 포스페이트의 정량을 시도하였으나, 그 중에서 말라키트 그린을 이용한 방법이 가장 감소가 높은 것으로 확인이 되어 포스페이트 정량에 사 용하였다.

도 1의 작은 그래프를 보면, 무기 포스페이트와 몰리브드산이 결합하면 포스포몰리브드산 (phosphomolybdic acid) 복합체 (- - -)가 형성되는데, 이 물질은 색깔을 나타내지 않는다. 여기에 환원제로 말라키트 그린이 첨가되면 450 nm와 650 nm에서 최대 흡광 파장을 보인다 (직선). 650 nm에서 포스페이트의 농도 (2-100 μM의 포스페이트)에 따른 흡광도 측정은 아주 뛰어난 직선성을 나타내었다.

Ⅰ-2: 피로포스페이트 농도 측정 및 DNA 중합효소의 활성 측정

피로포스페이트에 암모늄 몰리브데이트와 말라키트 그린을 처리한 경우 발색을 하지 않는데, 이것은 피로포스페이트가 포스페이트와 같이 포스포몰리브드산을 형성하지 않기 때문이다. 피로포스페이트에 무기 피로포스파타아제를 처리하면 1 mol의 피로포스페이트가 2 mol의 포스페이트로 분해가 된다. 이 포스페이트를 암모늄 몰리브데이트와 말라키트 그린으로 측정하면, 피로포스페이트의 양을 알 수 있다.

도 2의 피로포스페이트의 정량선은 DNA 중합효소의 활성 측정과 동일한 조건에서 수행하여 얻은 것이다. 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, dNTP 각각 0.2 mM 및 12.5 ㎍ 활성화 소 흉선 DNA에 알고 있는 농도의 피로포스페이트를 넣거나, DNA 중합효소를 넣은 후 최종 부피를 50 ㎕로 하였다. 이 반응액을 72℃에서 30분간 반응시킨 후, 25 ㎕를 취해서 0.1 unit의 피로포스파타아 제 반응과, 말라키트 그린을 이용한 포스페이트 정량 과정을 실시하였다. 여기서 나온 값을 도 1과 비교를 하면, 흡광도가 약 88% 정도로 조금 낮게 나온다. 이렇게 낮게 나오는 이유는 초기에 피로포스페이트를 DNA 중합효소의 활성 측정 반응 조건으로 만들었기 때문인 것으로 판단된다.

DNA 중합 효소에 대한 효소 활성도를 측정하는 종래의 방법은 방사성 동위 원소를 이용한 방법으로 이 방법은 사용상 안정성의 문제와 사용 시설을 갖추어야 하는 문제가 있기 때문에, 간편한 효소 활성 측정 방법의 개발이 필요하다. 또한, 종래의 비방사성 물질을 사용하여 DNA 중합효소의 활성을 측정하는 방법은(19), 바이오틴이 붙은 DNA와 디곡시게닌이 붙은 dNTP를 이용하여 중합효소 반응을 진행을 한 후 항체를 이용하여 측정하는 방법이 있으나, 고가의 제품을 이용하여야 하는 문제가 있다.

따라서, 본 발명에서 제시한 DNA 중합효소의 활성 측정방법은, 방사성 동위 원소를 이용하지 않고도 손쉽게 저가로 효소 활성을 측정하는 시스템을 제공한다.

Ⅱ. DNA 중합효소의 변형 및 재활성화

Ⅱ-１: PLP와 PL에 의한 Taq DNA 중합효소의 활성 억제 및 재활성화

일반적인 화학 변형은 재활성화가 이루어지지 않거나 또는 재활성화의 조건이 매우 복잡하다. 핫 스타트 PCR을 진행하기 위해서는, 화학 변형된 DNA 중합효소가 온도 상승에 의해 재활성화가 유도되어야 하는 단점이 있다. 라이신에 대한 화학 변형 물질 중 온도에 의해 재활성화가 되는 물질로는 시트라콘 무수화물 (citraconic anhydride; Applied Biosystems사의 AmpliTaq Gold DNA 중합효소)(11)와 포름알데히드 (Qiagen사의 HotStarTaq DNA 중합효소)(12)가 현재 개발되어 판매가 되고 있다.

본 연구자들은 먼저 다양한 화학 변형 시약을 통해 Taq DNA 중합효소의 화학 변형을 유도한 후 온도 증가에 따른 재활성화의 정도를 조사하였다(20). 이중에서 재활성화가 쉽게 일어나는 물질인 피리독살 5-포스페이트 (PLP)(21-23)와 PLP의 유사물질인 피리독살 (PL)에 대한 실험을 통해 활성억제, 재활성화 그리고 핫 스타트 PCR에 적용 여부를 조사하였다.

PLP와 PL은 라이신의 ε-아미노기와 반응하면 쉬프염기를 형성하고, 이 쉬프염기는 쉽게 해리가 되어 라이신으로 되돌아가지만, 대표적인 환원제인 NaBH₄에 의해 환원이 되면 다른 화학 구조를 갖는 물질이 되어 더 이상 라이신으로 전환되지 않는다.

화학 변형을 위한 반응액은 아미노기를 가지고 있지 않는 완충액 중에 Bicine을 이용하였고, 농축된 DNA 중합효소 용액을 넣은 후 PLP나 PL의 농도를 변화시키면서 실험을 진행하였다. PLP의 처리 농도는 0-3.0 mM의 농도를 처리하였고, PL은 0-50 mM까지 처리하였다. PLP 처리 군에서는 환원제인 과량의 NaBH₄(최종 농도 100 mM)를 처리하여 라이신 잔기의 확실한 변형을 확인할 수 있었다.

PLP와 PL에 의한 활성 억제 효과를 확인하기 위해, M13 연장, TNF 유전자에 대한 PCR, HIV-1 유전자의 증폭 등을 실시하였다. 또한 NaBH₄를 처리한 경우의 변 화도 확인하였다. M13을 이용한 연장실험에서, PLP 약 0.5 mM까지의 처리에서 단일쇄 DNA를 이중쇄 DNA로 연장시키지만, 과량의 NaBH₄를 처리하면 0.3-0.5 mM의 PLP 농도에서 활성이 억제됨을 알 수가 있었다 (도 3). 도 3에서, L은 100 bp DNA 래더 레인을 나타내며, 숫자는 처리된 PLP 농도 (μM)를 나타낸다. 상기 실험결과는 PLP 0.3-0.5 mM 농도만으로도 Taq DNA 중합효소의 활성을 모두 억제할 수 있음을 보여 주는 것이다.

도 4를 보면, M13 연장 반응에서 PLP의 농도를 3 mM까지 높이면 NaBH₄를 처리하지 않은 상태에서도 이중쇄 DNA가 만들어지지 않는다는 것을 알 수 있었다. 도 4에서, 가장 왼쪽 및 오른쪽 레인은 DNA 레더를 로딩한 것이고, 숫자는 처리된 PLP 농도 (mM)를 나타낸다. 람다 DNA를 증폭한 결과 (500 bp)도 M13 연장과 유사하게 약 1.0 mM PLP 농도에서 밴드가 2-3 mM PLP에서는 PCR 산물이 나오지 않았다 (도 5). 도 5에서, 가장 오른쪽 레인은 100 bp DNA 레더를 로딩한 것이고, 숫자는 처리된 PLP 농도 (mM)를 나타낸다.

이 결과를 토대로 TNF 유전자의 증폭은 PLP의 농도를 약 3 mM까지 증가를 시켜 확인을 하였다. TNF 유전자의 증폭 조건은 일반적인 PCR로는 131 bp의 산물 외에 약 400 bp의 다른 산물이 나온다. 그러나 핫 스타트 PCR을 이용하면 원하는 131 bp의 산물만을 얻을 수가 있다. 도 6의 결과를 보면, PLP의 농도가 증가되면서 비특이적인 밴드들이 사라지고 원하는 131 bp의 증폭산물만이 나오는 것을 확인할 수 있었다. 도 6에서, 가장 오른쪽 레인은 100 bp DNA 레더 레인이고, Taq 레 인은 통상적인 Taq 중합효소를 이용한 증폭산물을 로딩한 레인이며, 숫자는 처리된 PLP 농도 (mM)를 나타낸다.

한편, 0.1-50 mM까지 PL을 처리한 경우 10 mM PL에서 낮은 카피수의 HIV-1의 주형에서 PCR 증폭되는 현상을 관찰할 수 있었다. 즉 10 카피 수의 HIV-1 유전자가 들어 있는 경우 핫 스타트 PCR을 이용하지 않으면 다량의 인간 지놈 DNA에 의해 비특이적인 PCR 산물이 다량 증폭이 되고, 원하는 HIV-1의 산물을 얻을 수가 없다 (도 7). 즉 PL 약 10 mM 농도의 경우, 핫 스타트 PCR에 적용될 수 있다는 것을 알 수 있다. 도 7에서, 레인 L은 100 bp DNA 레더이고, 레인 1은 통상적인 Taq 중합효소 산물이며, 레인 2는 효소 첨가가 없는 대조군 레인이고, 레인 3-9는 PL을 각각 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM 및 50 mM로 처리한 본 발명의 Taq 중합효소 산물을 로딩한 레인이다.

Ⅱ-2: PL에 의한 Pfu DNA 중합효소의 핫 스타트 PCR

Pfu DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소와 달리 3'-5' 엑소뉴클레아제의 활성을 가지고 있어서 교정 (proofreading) 기능을 가지며, 이에 중합효소 반응에서 발생할 수 있는 에러를 줄이는 기능을 가지고 있다. 이 외에도 Taq DNA 중합효소와의 차이점은 보다 높은 열에 대한 안정성을 보인다는 것이고, Taq DNA 중합효소와 혼합되어 있으면 Taq DNA 중합효소의 작용을 도와서 긴 길이의 증폭을 가능하게 한다.

활성도에서 Taq DNA 중합효소와의 차이점은, Taq DNA 중합효소의 경우는 효 소 양을 많이 사용을 해도 PCR 산물이 생성되지만, Pfu DNA 중합효소의 경우는 효소 양을 많이 사용하면 PCR 산물이 생성되지 않는다. 이 이유는 Pfu DNA 중합효소가 가지고 있는 3'-5' 엑소뉴클레아제의 활성에 의한 영향으로 판단된다.

이처럼 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소의 효소 특이성의 차이에 의해 피리독살에 의한 Pfu DNA 중합효소의 활성 억제는 초기 반응에 사용하는 Pfu DNA 중합효소의 양이 Taq DNA 중합효소의 양보다 작게 하였다. 그러나, 나머지 과정은 Taq DNA 중합효소에 대한 처리와 동일한 진행을 하였고, 그 결과물은 HIV-1 (SK145 & SK39, 300 bp)의 특정 부위의 증폭을 통해서 확인을 할 수가 있었다 (도 8). 도 8에서, 레인 1은 피리독살로 화학변형된 Pfu DNA 중합효소의 증폭산물, 레인 2는 피리독살로 화학변형된 Taq DNA 중합효소의 증폭산물, 레인 3은 Applied Biosystems의 AmpliTaq Gold DNA 중합효소의 증폭산물, 레인 4는 Qiagen사의 HotStarTaq DNA 중합효소의 증폭산물, 레인 5는 주형 없이 증폭한 경우, 레인 6은 효소 첨가가 없는 대조군 레인, 그리고 레인 L은 100 bp DNA 레더 레인이다.

본 실험결과에서 확인할 수 있듯이, 피리독살을 이용하여 변형된 본 발명의 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 모두 핫 스타트 PCR에 이용이 가능한 형태를 갖는다는 것을 알 수 있다.

Ⅲ. 핫 스타트 PCR에로의 응용

Ⅲ-1: HIV-1 유전자의 핫 스타트 PCR

핫 스타트 PCR법만으로 확인이 가능한 여러 가지 예들 중에서 가장 대표적인 방법이 인간 혈액에 소량으로 존재하는 HIV 바이러스를 확인하는 방법(17)이라 할 수 있다. HIV에 감염된 인간의 혈액에서 DNA를 추출하면 대부분의 DNA가 그 환자의 DNA이고 감염된 바이러스의 DNA는 소량으로 존재하는 경우가 많다. 이렇게 소량으로 존재하는 감염 바이러스의 DNA를 증폭하여 확인하는 경우, 일반적인 PCR법으로는 환자의 DNA에 의한 방해로 인해 확인이 안 되는 경우가 많다. 따라서 많은 연구자들이 소량의 감염 바이러스의 DNA를 증폭하는 방법을 통해 핫 스타트 PCR의 진행 여부를 확인하는 것이 일반적이다. 본 연구자들도 인간 지놈 DNA가 다량 존재하는 시료에 소량의 HIV DNA가 첨가된 경우 이 HIV DNA가 적절히 증폭이 되는 지를 확인하였다.

적은 카피 수의 주형을 증폭하는 실험으로 HIV-1 유전자의 카피 수를 0-100까지 변화를 시킨 후 300 bp (SK145와 SK39)의 PCR 산물을 Taq DNA 중합효소와 화학 변형된 Taq DNA 중합효소를 이용하여 비교하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 화학 변형된 Taq DNA 중합효소는 다량의 인간 지놈 DNA가 있어도 5 카피 수의 HIV-1 주형 DNA가 존재를 해도 원하는 DNA를 증폭해 낼 수 있음을 알 수 있으나, 변형이 되지 않은 Taq DNA 중합효소의 경우는 희미하게 PCR 산물이 생성되었다. 도 9에서, 왼쪽 패널의 젤은 화학변형 Taq DNA 중합효소에 대한 것이고, 오른쪽 패널의 젤은 화학변형되지 않은 통상의 Taq DNA 중합효소에 대한 것이다. 레인 L은 100 bp DNA 레더 레인이고, 레인 1-6은 HIV-1 유전자의 카피 수가 각각 0, 5, 10, 20, 50 및 100인 주형을 이용한 경우이다.

이 결과에서 파악할 수 있듯이, 본 발명의 핫 스타트용 Taq DNA 중합효소를 이용한 핫 스타트 PCR은 소량의 주형 DNA가 다른 다량의 DNA와 혼합되어 있어도, 민감성 및 특이성 두 측면에서 모두, 매우 탁월한 증폭 결과를 보임을 알 수 있다.

Ⅲ-2: 외국의 제품과 비교

현재 전 세계적으로 가장 널리 이용되고 있는 핫 스타트 PCR용 효소는 Applied Biosystems의 AmpliTaq Gold와 Qiagen사의 HotStarTaq DNA 중합효소이다. 따라서 본 연구자들은 본 기술을 통해 개발된 화학변형 Taq DNA 중합효소와 상기 두 제품을 비교하였다.

우선, 람다 DNA를 주형으로 사용한 방법을 통해 효소를 희석시키면서 그 산물의 양상을 비교하였다. 결과를 보면 본 발명의 핫 스타트용 Taq DNA 중합효소는 AmpliTaq Gold DNA 중합효소보다 활성이 높고, HotStarTaq DNA 중합효소와 유사한 결과를 보였다 (도 10). 도 10에서, 왼쪽 패널의 젤은 HotStarTaq DNA 중합효소에 대한 것이고, 가운데 패널의 젤은 본 발명의 Taq DNA 중합효소에 대한 것이며, 오른쪽 패널의 젤은 AmpliTaq Gold DNA 중합효소에 대한 것이다. 레인 1-5는 각각 효소 2.5, 1.25, 0.6, 0.3 및 0.15 unit를 사용한 경우이고, 레인 C는 효소의 첨가가 없는 경우이며, 레인 Taq는 1 unit의 통상의 Taq DNA 중합효소에 대한 것이다.

95℃에서 15분간 재활성화 과정을 거친 후 M13 연장 실험을 하였다 (도 11). 도 11에서, 왼쪽 패널의 젤은 HotStarTaq DNA 중합효소에 대한 것이고, 가운데 패널의 젤은 본 발명의 Taq DNA 중합효소에 대한 것이며, 오른쪽 패널의 젤은 AmpliTaq Gold DNA 중합효소에 대한 것이다. 레인 1-5는 각각 효소 0.25, 0.15, 0.05, 0.03 및 0.01 unit를 사용한 경우이다. 도 11에서 볼 수 있듯이, AmpliTaq Gold DNA 중합효소의 경우는 0.25 unit에서도 다른 중합효소에 비해 이중쇄 DNA로 변환이 약하다. 즉, 95℃에서 15분간 재활성화 처리에 의해, AmpliTaq Gold DNA 중합효소는 HotStarTaq DNA 중합효소와 본 발명의 화학변형 Taq DNA 중합효소에 비해 재활성도가 떨어짐을 확인할 수 있고, HotStarTaq DNA 중합효소와 본 발명의 화학변형 Taq DNA 중합효소의 재활성도는 유사하다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 화학변형 열안정성 DNA 중합효소, 이를 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물, 그리고 상기 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 이용하는 핵산분자의 증폭방법을 제공한다. 본 발명의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소는 핵산 증폭, 특히 핫 스타트 PCR 과정에 매우 적합하며, 개선된 민감성 및 특이성으로 핵산을 증폭할 수 있게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

화학변형 열안정성 DNA 중합효소에 있어서, 상기 열안정성 DNA 중합효소는 피리독살 포스페이트 (PLP) 또는 피리독살 (PL)에 의해 그의 라이신 잔기의 ε-아미노기가 화학변형되어 있고, 상기 PLP 또는 PL이 50℃-100℃에서의 열처리에 의해 상기 열안정성 DNA 중합효소로부터 해리되면 그의 활성이 회복되는 것을 특징으로 하는 화학변형 열안정성 DNA 중합효소.
제 1 항에 있어서, 상기 열안정성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소 또는 Pwo DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 화학변형 열안정성 DNA 중합효소.
삭제
(a) 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소; 그리고, (b) 효소 안정화제, 완충용액, MgCl₂, 4종의 dNTP 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 중합효소 반응시약을 포함하는 DNA 중합효소 반응 전혼합물.
(a) 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 화학변형 열안정성 DNA 중합효소를 전항온처리하여 재활성화하는 단계; 및 (b) 핵산분자를 주형으로 이용하고 상기 재활성화된 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 상기 핵산분자를 증폭하는 단계를 포함하는 핵산분자의 증폭방법.