CN101691593B - 在经修饰的随机寡核苷酸的存在下的核酸扩增 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在经修饰的随机寡核苷酸的存在下的核酸扩增。本发明涉及包含优选热稳定的DNA聚合酶、脱氧核苷酸、至少一种引物寡核苷酸或一对扩增引物和随机化的5-8聚体寡核苷酸的组合物,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。此种组合物对于执行热启动PCR特别有用。
Description
本发明涉及模板依赖性聚合酶催化的引物延伸反应领域。具体地,本发明提供了通过执行聚合酶链反应(PCR)用于核酸扩增的新方法。更确切地说,本发明提供了用于执行特征在于避免了非特异性引物二聚体扩增的热启动PCR的新方法。
现有技术
关于核酸扩增且更特别地关于PCR的主要问题是非特异性扩增产物的产生。在许多情况下,这是由于在实际热循环程序自身之前的非特异性寡核苷酸引发和后续引物延伸事件,因为热稳定的DNA聚合酶在环境温度下也是适度活跃的。例如,经常观察到由于最终偶然发生的引物二聚化和后续延伸的扩增产物。为了克服这个问题,本领域众所周知的是执行所谓的“热启动”PCR,其中使扩增反应所必需的一种组分与反应混合物分开,或保持无活性状态直至反应混合物的温度首次升高。因为聚合酶不能在这些条件下起作用,所以在引物可以非特异性结合的时间段期间不存在引物延伸。为了达到这种效果,已应用了几种方法:
a)DNA聚合酶的物理分离
物理分离可以例如通过固体蜡的屏障来获得,所述屏障使包含DNA聚合酶的区室与包含大多数其他试剂的区室分开。在第一个加热步骤期间,蜡随后自动熔化且使流体区室混合(Chou,Q.,等人,NucleicAcidsRes20(1992)1717-23,US5,411,876)。可替代地,在扩增反应之前将DNA聚合酶亲和固定在固体支持体上,且仅通过热介导的释放而释放到反应混合物内(Nilsson,J.,等人,Biotechniques22(1997)744-51)。然而,2种方法都是费时的且不便于执行。
b)DNA聚合酶的化学修饰
对于这种类型的热启动PCR,作为化学修饰的结果DNA聚合酶被可逆地灭活。更确切而言,将不耐热的封闭基团引入TaqDNA聚合酶内,这使得该酶在室温下无活性(US5,773,258)。这些封闭基团在高温下在PCR前步骤期间被去除,从而使得该酶变得活化。此种不耐热的修饰例如可以通过使柠康酐或乌头酸酐(AconitricAnhydride)与酶的赖氨酸残基偶联而获得(US5,677,152)。携带此种修饰的酶当时作为AmplitaqGold(Moretti,T.,等人,Biotechniques25(1998)716-22)或FastStartDNA聚合酶(RocheMolecularBiochemicals)商购可得。然而,封闭基团的引入是在酶的所有立体可用的赖氨酸残基上任意发生的化学反应。因此,化学修饰的酶制剂的再现性和质量可能改变且可能难以控制。
c)DNA聚合酶的重组修饰
Taq聚合酶的冷敏感突变体已通过基因工程进行制备。这些突变体不同于野生型酶之处在于它们缺乏N末端(US6,241,557)。与天然或野生型重组Taq聚合酶相反,这些突变体在35℃以下是完全无活性的且因此可以在一些情况下用于执行热启动PCR。然而,N末端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓冲条件,与野生型酶相比较具有较低的持续合成能力且因此仅可以用于扩增短靶核酸。此外,因为截短形式缺乏5′-3′外切核酸酶活性,所以它不能用于基于TaqMan检测形式的实时PCR实验。
d)经由核酸添加剂的DNA聚合酶抑制
非特异性退火的引物的延伸已显示通过添加短双链DNA片段得到抑制(Kainz,P.,等人,Biotechniques28(2000)278-82)。在这种情况下,引物延伸在低于短双链DNA片段的解链温度的温度下被抑制,而不依赖于竞争DNA(competitorDNA)自身的序列。然而,过量的竞争DNA影响核酸扩增反应的产量至何种程度未知。
可替代地,可以使用导致限定的二级结构的具有特定序列的寡核苷酸适体。此种适体已使用SELEX技术就对于DNA聚合酶的极高亲和力进行选择(US5,693,502,Lin,Y.和Jayasena,S.D.,JMolBiol271(1997)100-11)。在实际热循环过程自身之前在扩增混合物内此种适体的存在再次导致与DNA聚合酶的高亲和力结合,及因此其活性的不耐热抑制(US6,020,130)。然而,由于选择过程,所有迄今为止可用的适体仅可以与一个特定种类的DNA聚合酶组合使用。
e)TaqDNA抗体
达到TaqDNA聚合酶的不耐热抑制的可替代方法是添加针对纯化酶产生的单克隆抗体(Kellogg,D.E.,等人,Biotechniques16(1994)1134-7;Sharkey,D.J.,等人,Biotechnology(NY)12(1994)506-9)。如同寡核苷酸适体,抗体以抑制方式在环境温度下以高亲和力与TaqDNA聚合酶结合(US5,338,671)。复合物在热循环过程自身之前在预热步骤中分解。这导致总体上扩增的显著费时的延伸,特别是如果应用用于快速热循环的规程的话(WO97/46706)。
US5,985,619公开了使用热启动抗体用于执行PCR的具体实施方案,其中除Taq聚合酶外,例如来自大肠杆菌(E.coli)的外切核酸酶III作为对于扩增混合物的补充物添加,以消化非特异性引物二聚体中间体。如上文所公开的,外切核酸酶III识别双链DNA作为底物,如例如靶/引物或靶/引物延伸产物杂种。消化通过在3′末端脱氧核苷酸残基的5′末端处的磷酸二酯键的切割而发生。因为这种类型的外切核酸酶在环境温度下是有活性的,所以消化所有非特异性退火的引物和引物延伸产物。这在一些实施方案中导致扩增反应甚至增强的特异性。然而,依赖于预温育时间的持续时间的非特异性引物的消化可能导致引物浓度相当大量和不受控制的减少,这依次可能影响扩增反应自身。
f)经修饰的引物单独或与外切核酸酶组合的使用
EP0799888和GB2293238公开了给PCR反应添加3′封闭的寡核苷酸。由于3′封闭,这些寡核苷酸不能充当引物。封闭的寡核苷酸被设计为与PCR引物竞争/相互作用,这导致非特异性产物的减少。
另一种可替代方法是在PCR反应混合物中与外切核酸酶III组合的硫代硫酸寡核苷酸引物的使用(EP0744470)。在这种情况下,通常接受双链以及单链DNA底物的3′外切核酸酶降解双链体人为产物例如引物二聚体以及遗留(carryover)扩增子,同时使得单链扩增引物不降解。类似地,已建议了具有基本修饰的3′末端的引物的使用和经由大肠杆菌内切核酸酶IV的模板依赖性去除(US5,792,607)。
一般想法的具体实施方案在EP1275735中找到。它的说明书公开了用于执行核酸扩增反应的组合物,所述组合物包含(i)热稳定的DNA-聚合酶、(ii)热稳定的3′-5′外切核酸酶、和(iii)具有经修饰的3′末端残基的用于核酸扩增的至少一种引物,其不通过所述热稳定的DNA-聚合酶延伸,以及使用这种组合物用于执行PCR反应的方法。
然而,所公开的可替代方案的主要缺点是关于每次PCR反应需要经修饰的引物,这导致关于增加每个个别测定的成本增加的需要。
g)其他PCR添加剂
本领域已知的其他有机添加剂如DMSO、甜菜碱和甲酰胺(WO99/46400;Hengen,P.N.,TrendsBiochemSci22(1997)225-6;Chakrabarti,R.和Schutt,C.E.,NucleicAcidsRes29(2001)2377-81)导致富含GC序列的扩增的改善,而不是引物二聚体形成的预防。类似地,肝素推测可能通过蛋白质如组蛋白的去除以使得染色体DNA可接近来刺激体外连缀转录(Hildebrand,C.E.,等人,BiochimicaetBiophysicaActa477(1977)295-311)。
还已知单链结合蛋白(US5,449,603)或tRNA(Sturzenbaum,S.R.,Biotechniques27(1999)50-2)的添加导致这些添加剂与引物的非共价结合。在PCR期间加热时,这种结合被破坏。还发现DNA解旋酶的添加阻止引物的随机退火(Kaboev,O.K.,等人,BioorgKhim25(1999)398-400)。此外,在几种情况下可以使用聚谷氨酸(WO00/68411),以抑制在低温下的聚合酶活性。
此外,已知聚阴离子聚合酶抑制剂可以依赖于所应用的温育温度控制热稳定的DNA聚合酶的活性。US6,667,165公开了热启动实施方案,其特征在于无活性的聚合酶-抑制剂复合物在低于40℃的温度下形成。在40℃-55℃,抑制剂与模板DNA竞争结合Taq聚合酶,而在高于55℃的温度下,抑制剂离开聚合酶活性位点。然而,当使用具有较低的退火温度的引物时,抑制剂倾向于减少可获得的产物产量。
h)镁螯合
因为热稳定的聚合酶长时间来已知仅在Mg2+阳离子的存在下是有活性的,所以已尝试在热循环规程起始前镁的螯合,以避免错误引发和非特异性引物延伸。如US6,403,341中公开的,Mg2+可以以沉淀的形式存在且因此在扩增反应开始时是不可用的。温度在第一轮热循环形成期间增加后,沉淀溶解且Mg2+在前3个循环内变得完全可用。此种溶液已显示是完全可应用的且能够提供良好的热启动结果。另一方面,此种溶液不允许制备主混合物(mastermixes),其包含执行核酸扩增反应所需的除引物和靶核酸外的所有试剂。因而,测定间数据再现性和数据比较变得复杂。
考虑到概述的现有技术,本发明的目的是提供用于热启动PCR的改善的可替代组合物和方法,这允许抑制不仅在扩增过程自身之前而且在热循环过程期间的非特异性引发和引物延伸。更确切而言,本发明的目的是提供用于热启动PCR的可替代组合物和方法,其中不会发生非特异性退火的引物的延伸。
发明概述
因此,在第一个方面,本发明提供了包含下述的组合物
-DNA聚合酶
-脱氧核苷酸
-至少一种引物寡核苷酸,和
-随机化的5-8聚体寡核苷酸,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。
此种组合物对于PCR扩增反应的执行是特别有用的,因为避免了人工扩增产物例如引物二聚体的形成。
优选地,所述修饰位于所述随机化的寡核苷酸的5′末端处。还优选地,所述修饰的所述有机疏水部分是芘或茋。
在一个具体实施方案中,DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶,例如Taq聚合酶。如果是这种情况,那么组合物不仅可以包含一种引物而且还可以包含至少一对扩增引物。
此外,如果如上限定的任何一种组合物进一步包含靶核酸样品,那么这也在本发明的范围内。
在第二个方面,本发明涉及包含DNA聚合酶和随机化的5-8聚体寡核苷酸的试剂盒,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。优选地,所述修饰位于所述随机化的寡核苷酸的5′末端处(加帽的随机寡核苷酸(randomer))。还优选地,所述修饰的所述有机疏水部分是芘或茋。
在具体实施方案中,所述试剂盒的特征在于所述DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶,例如TaqDNA聚合酶。如果是这种情况,那么试剂盒不仅可以包含一种引物而且还可以包含至少一对扩增引物。
在第三个方面,本发明提供了用于对于特定靶核酸的引物延伸的方法,其包括下述步骤
-提供怀疑包含所述靶核酸的样品
-添加如上文公开的任何一种组合物,和
-执行至少第一次引物延伸反应。
具体地,本发明提供了用于扩增特定靶核酸的方法,其包括下述步骤
-提供怀疑包含所述靶核酸的样品
-添加包含热稳定的DNA聚合酶和一对扩增引物的如上文公开的组合物,和
-执行核酸扩增反应。
优选地,所述核酸扩增反应是实时监控的聚合酶链反应。在具体实施方案中,随后对通过所述扩增产生的扩增产物实施解链曲线分析。
发明详述
本发明提供了用于执行具有增加的特异性的引物延伸反应的新的和改善的方案。具体地,本发明提供了用于执行具有增加的特异性的核酸扩增反应的新的和改善的方案。所谓的热启动效应导致不希望有的引物延伸的有效抑制。不希望有的引物延伸起因于偶发的杂交事件,其中引物与核酸样品中的任何序列至少部分杂交,所述序列不同于核酸靶的实际引物结合侧。
本发明因此提供了包含下述的组合物
-DNA聚合酶
-脱氧核苷酸
-至少一种引物寡核苷酸,和
-随机化的5-8聚体寡核苷酸,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。
DNA聚合酶一般而言可以是能够执行模板依赖性引物延伸反应的任何酶。此种模板依赖性引物延伸反应可以在所有部分双链核酸杂种上发生,其特征在于具有游离3′羟基的引物核酸与具有单链5′突出端的模板核酸杂交。模板依赖性聚合酶随后通过掺入始终与模板链内相对位置处的核苷酸互补的核苷酸残基催化引物的3′末端的延伸。该反应使用dNTPs作为底物且导致焦磷酸的释放。
在一个实施方案中,所述DNA聚合酶是RNA模板依赖性聚合酶或其任何修饰。此种酶通常称为逆转录酶。例子是AMV逆转录酶或MMLV逆转录酶。具体地,Transcriptor逆转录酶(RocheAppliedScience目录号:03531317001)是在本发明的背景中可应用的酶。包含此种依赖于RNA的DNA聚合酶的发明组合物特别用于制备和分析cDNA合成的所有种类和应用,且特别是2步RT-PCR。
在另一个实施方案中,DNA聚合酶是DNA模板依赖性DNA聚合酶或其任何突变体或修饰。一个显著的例子是克列诺(Klenow)聚合酶(RocheAppliedScience目录号11008404001)。优选地,DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶或其任何突变体或修饰。一般的例子是来自水生栖热菌(Thermusaquaticus)的TaqDNA聚合酶(RocheAppliedScience目录号:11647679001)。依赖DNA的DNA聚合酶可以具有或不具有3′-5′校正活性,例如Pwo聚合酶(RocheAppliedScience目录号:11644947001)。此外,本发明的DNA聚合酶组分可以是具有和不具有校正活性的酶的混合物,例如扩展高保真性系统(ExpandHighFidelitysystem)(RocheAppliedScience目录号:11732641001)。包含任何种类的热稳定的聚合酶的发明组合物特别用于执行聚合酶链反应(PCR)的各种制备或分析实施方案。
在进一步的实施方案中,本发明的DNA聚合酶组分是具有另外的RNA模板依赖性逆转录酶活性的热稳定的依赖DNA的DNA聚合酶,如来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的聚合酶(RocheAppliedScience目录号:11480014001),或依赖于RNA的DNA聚合酶(即,逆转录酶)和热稳定的依赖DNA的DNA聚合酶的混合物。包含此种组分的发明组合物特别用于一步RT-PCR的分析执行。
脱氧核苷酸(Deocxynucleotide)三磷酸(dNTPs)通常是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物,然而,在一些特定情况下,可以使用仅3个或更少不同种类的dNTP。此外,此种dNTP可以以任何方式进行化学修饰,只要所述构件块仍能够通过聚合酶掺入新生多核苷酸链内。例如,所述经修饰的核苷酸化合物可以在各自的碱基部分处携带生物素或荧光化合物修饰。
至少一种引物寡核苷酸通常是与靶核酸的特定区域完全或几乎完全互补的脱氧寡核苷酸。此外,所述引物部分必须具有游离3′羟基,从而使得它可通过DNA聚合酶进行延伸。对于特定目的,此种引物可以例如在其3′末端处进行化学修饰。关于常用修饰的例子是生物素标记、洋地黄毒苷(Digoxygenin)标记和荧光标记。
如果热稳定的依赖DNA的DNA聚合酶被设计用于PCR反应,那么根据本发明的组合物通常包含2种引物寡核苷酸,其以相反方向和与应变得扩增的靶序列相邻的靶核酸的相反链杂交。还可能本发明的组合物包含多对寡核苷酸PCR引物用于多重PCR扩增。
使根据本发明的组合物与本领域目前使用的组合物区别的重要化合物是随机化的5-8聚体寡核苷酸的添加,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。更确切地说,术语“随机化的寡核苷酸”指其序列表示4种不同核苷酸残基或多或少相等地所有可能组合的寡核苷酸库。尽管5聚体的添加以及8聚体的添加已证明具有所需热启动效应,但若使用随机化的六聚体寡核苷酸,已证明是特别有利的。所述随机化的寡核苷酸可以以10μM-1mM的浓度范围加入引物延伸反应或PCR反应中,优选25μM-400μM,且最优选约100μM的浓度。若随机化的寡核苷酸具有不可延伸的3′末端,也已证明是特别有利的,其例如可以通过磷酸部分进行封闭。这避免了在样品核酸的任何区域处的任何寡核苷酸偶然杂交的情况下经由聚合酶的不希望有的延伸。
随机化的寡核苷酸用有机疏水部分进行化学修饰。所述部分通常不干扰任何类型的引物延伸反应。例如,此种有机疏水部分可以选自由缩聚的(polycondensend)芳族环和杂芳族环组成的部分组,如萘(naphthalin)、蒽(anthracen)、菲(phenantren)、芘、蒽醌、咔唑菲咯啉(carbazolphenantrolines)、喹啉(quonolines)等,或选自茋(stilbens),或选自自类固醇如胆固醇。此种疏水部分可以由不大的取代基进行取代,如氰基、甲氧基、甲基、硝基和卤素,且部分已知充当所谓的“帽”用于稳定末端碱基对。Narayanan,S.,等人,NucleicAcidsResearch32(9)(2004)2901-2911;Dogan,Z.,等人,JournaloftheAmericanChemicalSociety126(15)(2004)4762-4763。
最优选地,此种有机疏水部分是任选取代的芘或任选取代的茋(Stilben),其具有下述化学结构:
最优选地,此种芘或茋与随机化的寡核苷酸的5’末端附着,而此种寡核苷酸的5′末端具有下述结构:
有机疏水部分可以位于随机化的寡核苷酸的任何部分处。然而,优选地,将所述修饰引入随机化的寡核苷酸的5′末端处。原因是此种5′修饰可以根据本领域众所周知的标准方法使用具有合适的末端亚磷酰胺的亚磷酰胺化学引入寡核苷酸内,并且芘和茋亚磷酰胺是商购可得的。
随机化的寡核苷酸可以包含核碱基(nucleobase)类似物,其具有经修饰的碱基,如7脱氮类似物,如7脱氮dG,7脱氮8氮杂类似物,如7溴7脱氮8氮杂2氨基dA,或取代的碱基如丙炔基U、丙炔基C,或具有经修饰的糖的类似物,如2′甲氧基核糖或锁定糖如在LNA中,或具有核糖类似物如己糖醇和阿卓糖醇。代替随机化使用通用碱基如硝基吲哚或N8核糖基化-7脱氮8氮杂dA,而优选仅在随机寡核苷酸的一个位置处使用通用碱基代替随机寡核苷酸。核苷间磷酸可以由磷酸模拟物(mimetikum)取代,如硫代磷酸酯(phosphorthioate)或甲基膦酸酯或氨基磷酸酯。随机化的寡核苷酸优选具有一个疏水部分但可以由其他疏水部分另外取代,而疏水部分独立地选自彼此。
包含用有机疏水部分进行化学修饰的随机化的寡核苷酸与依赖DNA的热稳定的DNA聚合酶和至少一对扩增引物一道的那些组合物特别用于执行PCR扩增反应。原因是所述随机化的和经修饰的寡核苷酸的存在有效抑制在低于各自的扩增引物的退火温度的温度下人工扩增产物例如引物二聚体的形成,从而产生热启动效应。
如果如上限定的任何组合物进一步包含靶核酸样品,那么它也在本发明的范围内。样品通常可以例如包含与依赖DNA的DNA聚合酶一道的基因组DNA或断裂的基因组DNA,或者与依赖于RNA的DNA聚合酶一道的总细胞或聚腺苷酸+RNA。
在一个具体方面,本发明还提供了试剂盒用于制备如上文详细公开的组合物。因此,本发明还涉及包含至少DNA聚合酶和随机化的5-8聚体寡核苷酸的试剂盒,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。优选地,所述修饰是如上文公开的任何例子且位于所述随机化的寡核苷酸的5′末端处。此外,试剂盒可以包含进一步的组分,例如脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和合适的缓冲液以及其他试剂添加剂,其用于执行各自的引物延伸反应。此外,参数特异性试剂盒可以包含至少一种靶特异性引物寡核苷酸。
在第一个具体实施方案中,试剂盒被设计用于cDNA合成且包含如上文公开的逆转录酶。作为引物组分,试剂盒可以包含任一参数特异性引物用于扩增特定cDNAs。
在第二个具体实施方案中,试剂盒被设计用于执行PCR,且包含DNA依赖性热稳定的聚合酶或DNA依赖性热稳定的聚合酶的混合物。试剂盒随后可以另外包含例如dNTPs和/或缓冲溶液和/或至少一对或多对扩增引物。更具体而言,如果试剂盒被设计用于一步RT-PCR,那么酶组分可以是依赖DNA的热稳定的DNA聚合酶,其另外包含逆转录酶活性。
在第三个具体实施方案中,试剂盒被设计用于2步RT-PCR,且可以包含选自如上文公开的第一个和第二个实施方案的组分的各种组分组合。
此外,根据第二个和第三个具体实施方案的试剂盒可以包含用于检测PCR扩增产物的组分。例如,如果试剂盒被设计用于实时PCR(=qPCR),那么此种试剂盒可以另外包含双链DNA结合染料组分,例如SybrGreen(RocheAppliedScience目录号:04707516001)或LC480ResoLight染料(RocheAppliedScience目录号:04909640001)。可替代地,此种试剂盒可以另外包含荧光标记的杂交探针,例如TaqMan探针(US5,804,375)、分子信标(MolecularBeacons)(US5,118,801)、FRET杂交探针(US6,174,670)或简单探针(SimpleProbes)(WO02/14555)。
本发明不仅涉及组合物和试剂盒,而且还涉及执行一般而言的引物延伸反应和特别地PCR或逆转录反应的方法。因此,以其最广泛的含义,根据本发明的方法包括下述步骤
-提供怀疑包含所述靶核酸的样品
-添加如上文公开的任何一种组合物,和
-执行至少第一次引物延伸反应。
更确切而言,根据本发明的方法包含下述步骤
-提供怀疑包含所述靶核酸的样品
-添加
-DNA聚合酶
-脱氧核苷酸
-至少一种引物寡核苷酸,和
-随机化的5-8聚体寡核苷酸,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰,
-执行至少第一次引物延伸反应。
在第一个实施方案中,样品是总的或聚腺苷酸+RNA,DNA聚合酶是逆转录酶,且引物寡核苷酸是与特定类型的cDNA互补的特定引物。
在第二个实施方案中,样品衍生自基因组DNA,DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶或热稳定的DNA聚合酶的混合物,并且至少一对或多对扩增引物在PCR扩增反应之前加入。优选地,所述核酸扩增反应是根据本领域已知的标准方法实时监控的聚合酶链反应(参见,例如US5,210,015、US5,338,848、US5,487,972、WO97/46707、WO97/46712、WO97/46714)。
在具体实施方案中,通过随着时间过去对扩增产物实施热梯度而对产生的扩增产物实施解链曲线分析(US6,174,670、US6,569,627)。在这种类型的实验中,监控由于分别标记的杂交探针的结合或由于源自DNA结合染料的荧光的荧光强度。随后,分别由于杂交探针或扩增子的两条链解链的荧光强度中减少的一阶导数针对温度梯度进行绘图。如实施例中将显示的,在扩增过程期间随机化的5-8聚体寡核苷酸的存在随后提供优质的解链曲线结果,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。
概括地说,可以阐述本发明的方法包含超过本领域已公开的方法的几个优点。在引物延伸反应例如逆转录或PCR或RT-PCR期间随机化的5-8聚体寡核苷酸的存在显然导致各自反应的特异性中的增加,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。
迄今为止,本发明人未完全了解关于这种积极效应的一种或多种原因。一种可能的机械学解释可能是在低温下,寡核苷酸分子的随机化群体的部分可以与引物相互作用至引物不能延伸的程度,即使它已与更长的、基本上互补的核酸分子退火。
本发明的一个主要优点是易于使用和短激活时间,以消除在低温下聚合酶的抑制。简单地,随机化的5-8聚体寡核苷酸需被加入至PCR反应设置中,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰。在PCR热循环期间,使双链DNA模板分离成单链通常所需的第一个循环之前的变性时间足以消除缀合的随机寡核苷酸和PCR引物之间的相互作用。
此外,随机六聚体可以根据本领域充分确立的标准氨基磷酸酯化学法进行合成。此外,同样5′修饰可以根据标准方法非常容易地使用具有分别修饰的末端氨基磷酸酯的氨基磷酸酯化学引入寡核苷酸内。因此,与其他热启动解决方案相比较,关于本发明PCR添加剂的生产成本相当低。
此外,本发明方法、组合物和试剂盒一般可以用于任何种类的引物延伸、逆转录或PCR扩增,而不管应制备、扩增、检测或分析何种特定靶核酸序列。
附图简述
图1根据实施例1在芘加帽的六聚体存在下的基因组DNA的扩增
泳道1:不含添加剂的PCR,50ngDNA
泳道2:不含添加剂的PCR,25ngDNA
泳道3:不含添加剂的PCR,10ngDNA
泳道4:不含添加剂的PCR,5ngDNA
泳道5:不含添加剂的PCR,1ngDNA
泳道6:不含添加剂的PCR,无模板对照
泳道7:含添加剂的PCR,50ngDNA
泳道8:含添加剂的PCR,25ngDNA
泳道9:含添加剂的PCR,10ngDNA
泳道10:含添加剂的PCR,5ngDNA
泳道11:含添加剂的PCR,1ngDNA
泳道12:含添加剂的PCR,无模板对照
图2根据实施例2在芘加帽的六聚体存在下的基因组DNA的扩增
泳道1:Taq聚合酶,30ngDNA
泳道2:Taq聚合酶,3ngDNA
泳道3:Taq聚合酶,0.3ngDNA
泳道4:Taq聚合酶,芘加帽的六聚体,30ngDNA
泳道5:Taq聚合酶,芘加帽的六聚体,3ngDNA
泳道6:Taq聚合酶,芘加帽的六聚体,0.3ngDNA
图3根据实施例4在芘或茋加帽的八聚体存在下的扩增
泳道1-6:在不存在添加剂的情况下分别用50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人DNA形成的PCR产物。
泳道7-12:在100M芘加帽的八聚体的存在下分别用50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人DNA形成的PCR产物。
泳道13-18:在100M茋加帽的八聚体的存在下分别用50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人DNA形成的PCR产物。
图4根据实施例7的实时PCR解链曲线分析
图4a关于各种量的基因组DNA的PCR和不含芘加帽的六聚体的解链曲线分析
图4b关于各种量的基因组DNA的PCR和含芘加帽的六聚体的解链曲线分析
图5根据实施例9的实时RTPCR
5a:在加帽六聚体的存在下的第一链cDNA合成,和在不存在加帽六聚体的情况下的后续PCR,
5b:在加帽六聚体的存在下的第一链cDNA合成,和在加帽六聚体的存在下的后续PCR,
5c:在不存在加帽六聚体的情况下的第一链cDNA合成,和在不存在加帽六聚体的情况下的后续PCR,
5d:在不存在加帽六聚体的情况下的第一链cDNA合成,和在加帽六聚体的存在下的后续PCR。
提供下述实施例、序列表和图以帮助理解本发明,其真实范围在附加权利要求中阐述。应当理解在不背离本发明的精神的情况下可以在阐述的程序中进行修饰。
实施例
通过标准方法在ABI394合成仪上以10μmol规模以三苯甲基关闭(trityloff)模式合成随机化的寡核苷酸,其中使用商购可得的磷酸CPG(2-[2-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧(trityoxy))乙磺酰基]乙基-2-琥珀酰(succinoyl))-长链烷基氨基-CPG)作为固体支持体和标准dA(bz)dT,dG(iBu)dC(Bz)亚磷酰胺的等摩尔(∑0.1mol)混合物,在标准条件下用氨或NaOH进行脱保护并且经由透析给产物脱盐。
实施例1
5’芘加帽的六聚体在DNA扩增中进行分析。在100μM芘加帽的六聚体的存在或不存在下的PCR反应以50μl反应进行,所述50μl反应包含50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人基因组DNA,30mMTris-HCl,pH8.6,1.5mMMgCl2,50mMKCl,0.2mM每种dNTP′s,0.4μM引物(SEQIDNO:1ATTAGAGAACCATGTTAACACTACCG和SEQIDNO:2GAGGTGAATGACCACTGTTTATTTTC)和2.5单位TaqDNA聚合酶。使用下述循环条件:于94℃4分钟的起始变性,和于94℃20秒变性、于62℃30秒退火、于72℃60秒延伸的35个循环以及于72℃7分钟的最终延伸步骤。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且通过溴化乙锭染色进行显现。
在图1中描述的结果显示在芘加帽的六聚体的存在下在扩增特异性中的明确改善。
实施例2
5’芘加帽的六聚体在实时PCR中进行分析。在芘加帽的六聚体的存在或不存在下的PCR反应以20μl反应进行,所述20μl反应包含30ng、3ng或0.3ng人基因组DNA,50mMTris-HCl,pH8.6,0.2mMCHAPS,1mMBigChap,20mMKCl,3mMMgCl2,0.4μM引物(SEQIDNO:3GGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGC和SEQIDNO:4GAATCTCCATTCATTCTCAAAAGGACT),0.2mM脱氧核苷酸和2.5单位TaqDNA聚合酶。PCR在480仪器中用下述循环条件进行:于95℃2分钟的起始变性,以及于95℃1秒变性、于65℃10秒退火和于72℃10秒延伸的45个循环。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且通过溴化乙锭染色进行显现(图2)。结果显示通过芘加帽的六聚体在扩增特异性中的明确改善。
实施例3
5’芘加帽的五聚体在与实施例2中描述相同的实验设置中进行分析。测试的最终浓度是50μM、100μM、150μM和200μM。在对照反应(不存在添加剂)中形成多种PCR产物,而在渐增量的芘加帽的五聚体的存在下,所需产物以增加的产量形成。特异性和灵敏性显著高于不含添加剂的对照实验(未显示)。
实施例4
5’芘加帽的八聚体和茋加帽的八聚体以100μM终浓度在人胶原基因片段的扩增中进行测试,其中使用50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人DNA,使用与实施例1中描述相同的PCR缓冲液。PCR引物(SEQIDNO:5TAAAGGGTCACCGTGGCTTC和SEQIDNO:6CGAACCACATTGGCATCATC)以0.4μM浓度使用。总反应体积是50μl。PCR循环在块循环仪(blockcycler)进行,其使用于94℃4分钟的起始变性,和于94℃20秒、于62℃30秒、于72℃4分钟的35个循环以及于72℃7分钟的最终延伸步骤。
结果在图3中描述。在不存在添加剂的情况下,形成约550bp的非特异性产物。在加帽的寡核苷酸的存在下未观察到非特异性产物。茋加帽的八聚体导致在凝胶的底部处的强荧光。
实施例5
5’芘加帽的单体在实时PCR中进行分析。在芘加帽的单体(最高达400μM)或芘加帽的六聚体(最高达400μM)的存在或不存在下的PCR反应以20μl反应进行,所述20μl反应包含30ng、3ng、0.3ng、0.03ng、0.01ng和0ng人基因组DNA,50mMTris-HCl,pH8.6,0.2mMCHAPS,1mMBigChap,20mMKCl,3mMMgCl2,0.4μM引物(SEQIDNO:7CACCCCGTGCTGCTGACCGA和SEQIDNO:8AGGGAGGCGGCCACCAGAAG),0.2mM脱氧核苷酸和2.5单位TaqDNA聚合酶。PCR在480仪器中用下述循环条件进行:于95℃2分钟的起始变性,以及于95℃1秒变性、于65℃15秒退火和于72℃5秒延伸的45个循环。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且通过溴化乙锭染色进行显现。结果显示与对照反应(未显示)相比较,通过芘加帽的六聚体在扩增特异性中的明确改善,但用芘加帽的单体在特异性中无增加。
实施例6
在5′末端处不含有机分子的3′磷酸化的六聚体以最高达200μM终浓度在人胶原基因片段的扩增中进行测试,其中使用50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人基因组DNA,使用与实施例1中描述相同的PCR缓冲液。PCR引物(SEQIDNO:5TAAAGGGTCACCGTGGCTTC和SEQIDNO:6CGAACCACATTGGCATCATC)以0.4μM浓度使用。总反应体积是50μl。PCR循环在块循环仪进行,使用于94℃4分钟的起始变性,于94℃20秒、于58℃30秒、于72℃4分钟的35个循环以及于72℃7分钟的最终延伸步骤。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且通过溴化乙锭染色进行显现。结果显示在PCR产物组合物中无差异,无论六聚体存在与否(未显示)。
实施例7
5’芘加帽的六聚体在实时PCR中进行分析。在芘加帽的六聚体的存在或不存在下的PCR反应以20μl反应进行,所述20μl反应包含30ng、3ng或0.3ng、0.03ng、0.01ng和0ng人基因组DNA,50mMTris-HCl,pH8.6,0.2mMCHAPS,1mMBigChap,20mMKCl,3mMMgCl2,0.4μM引物(SEQIDNO:3GGAAGTACAGCTCAGAGTTCTGC和SEQIDNO:4GAATCTCCATTCATTCTCAAAAGGACT),0.2mM脱氧核苷酸以及2.5单位TaqDNA聚合酶和SYBRGreen(1∶40000)。PCR在480仪器中用下述循环条件进行:于95℃2分钟的起始变性,以及于95℃1秒变性、于65℃10秒退火和于72℃10秒延伸的45个循环。对于特异性和非特异性产物的相对定量,解链曲线根据对于LightCycler480推荐的规程进行。结果显示于图4中。在不存在添加剂的情况下(图4A),形成大量非特异性产物,在添加剂的存在下(图4B),非特异性产物显著减少。
实施例8
为了测试5’芘加帽的六聚体是否也可以用于使用另一种DNA聚合酶的RT-PCR中,并且添加剂是否影响PCR反应的cp值。因此我们使用基于Tth聚合酶的480RNA主水解探针(MasterHydrolysisProbes)(RocheAppliedScience,目录号04991885001)进行RT-PCR反应。20μl的反应混合物分别包含100pg、10pg、1pg、0.1pg和0pg来自人肝细胞的总RNA,7.4μlRNAMaster,3.25mM乙酸锰,0.5μM每种引物(SEQIDNO:9TGCAGCCTCCATAACCATGAG和SEQIDNO:10GATGCCTGCCATTGGACCTA)和0.25μM水解探针(SEQIDNO:11FAM-GATGCCTGCCATTGGACCTA-TAMRA)。在不存在芘加帽的六聚体情况下或者用50μM、100μM或200μM芘加帽的六聚体进行反应。在480仪器中根据由制造商推荐的规程进行RT-PCR。cp值显示于表1中。芘加帽的六聚体对于交叉点(crossingpoint)没有影响。不存在扩增信号中的延迟或灵敏性的丧失。
表1:
实施例9
为了评估灵敏性的增加是否也可以在cDNA合成中观察到,我们在接近于一步RT-PCR的条件的反应设置中进行两步RT-PCR实验。平行进行4个反应:
(a)不含加帽的随机六聚体的第一链cDNA合成,和在加帽的随机六聚体的存在下的后续PCR,
(b)不含5′加帽的随机六聚体的第一链cDNA合成,和在不存在加帽的随机六聚体的情况下的后续PCR,
(c)在5′加帽的随机六聚体的存在下的第一链cDNA合成,和在不存在加帽的随机六聚体的情况下的后续PCR,
(d)在5′加帽的随机六聚体的存在下的第一链cDNA合成,和在加帽的随机六聚体的存在下的后续PCR。
选择当少量RNA存在于RT-PCR反应中时引起非特异性产物形成的引物对:G6PDHforw(SEQIDNO:12GCAAACAGAGTGAGCCCTTC)和G6PDHrev(SEQIDNO:13GGGCAAAGAAGTCCTCCAG)引物。cDNA在20μl反应中进行合成,所述20μl反应包含0.5μM引物、0.6单位Transcriptor(RocheAppliedSciences,目录号:03531317001),30mMTris.HCl,pH8.6;3mMMgCl2,200μMdATP,200μMdGTP,200μMdCTP,600μMdUTP,20mMKCl,0.2mMCHAPSO,1mMBigChap,125ng/mlT4gene32蛋白质,1∶20000的最终稀度的SYBRGreen和10pg来自HeLa细胞的总RNA。制备用于cDNA合成的2种样品,一种含100μM芘加帽的六聚体,另一种不含芘加帽的六聚体。反应于50℃温育10分钟,于95℃温育2分钟并且在冰上冷却。PCR以20μl反应体积进行,使用2μlcDNA反应混合物、0.5μM引物、1.2单位Taq聚合酶,在对于cDNA反应混合物描述相同的缓冲液中,在100μM终浓度的另外芘加帽的六聚体的存在或不存在下。反应在LightCycler480仪器中温育,于95℃2分钟,以及95℃/10秒、60℃/10秒、72℃/13秒的45个循环。扩增产物的解链概况显示于图5a-d中。在其中芘加帽的六聚体在cDNA合成期间存在的反应中(5a和5b),形成具有预期解链温度的一种单一产物。当cDNA合成在不存在芘加帽的六聚体的情况下进行时(5c和5d),产生了具有不同于特异性产物的那种的解链温度的几种产物。这个结果显示芘加帽的六聚体能够抑制在RNA的逆转录期间的非特异性产物形成。
实施例10
具有与引物之一的3′末端的6碱基对重叠的100μM5’芘加帽的六聚体(芘-CGGTAG-3′磷酸)和与引物不互补的100μM5’芘加帽的六聚体(芘-CTTTTA-3′磷酸)在DNA扩增中进行平行分析。在50μl反应中,其包含50ng、25ng、10ng、5ng、1ng和0ng人基因组DNA,30mMTris-HCl,pH8.6,1.5mMMgCl2,50mMKCl,0.2mM每种dNTP′s,0.4μM引物(SEQIDNO:1ATTAGAGAACCATGTTAACACTACCG和SEQIDNO:2GAGGTGAATGACCACTGTTTATTTTC)和2.5单位TaqDNA聚合酶。PCR在块循环仪用下述循环条件进行:于94℃4分钟的起始变性,和于94℃20秒变性、于62℃30秒退火、于72℃60秒延伸的35个循环以及于72℃7分钟的最终延伸步骤。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分离并且通过溴化乙锭染色进行显现。在不存在添加剂的情况下的对照反应平行进行。在芘-CGGTAG-3′磷酸的存在下无法检测出PCR产物。在包含非互补芘-CTTTTA-磷酸的样品中,达到与对照反应中相似的产物产量和灵敏性(在不存在任何添加剂的情况下)。
序列表
<110>F.Hoffmann-LaRocheAG
<120>在经修饰的随机寡核苷酸的存在下的核酸扩增
<130>24836
<150>EP08005100
<151>2008-03-19
<160>13
<170>PatentInversion3.2
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>1
attagagaaccatgttaacactaccg26
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>2
gaggtgaatgaccactgtttattttc26
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
ggaagtacagctcagagttctgc23
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
gaatctccattcattctcaaaaggact27
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
taaagggtcaccgtggcttc20
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
cgaaccacattggcatca18
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
caccccgtgctgctgaccga20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>8
agggaggcggccaccagaag20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>9
tgcagcctccataaccatgag21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
gatgcctgccattggaccta20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>11
gatgcctgccattggaccta20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>12
gcaaacagagtgagcccttc20
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>13
gggcaaagaagtcctccag19
Claims (9)
1.一种组合物,其包含
-DNA聚合酶
-脱氧核苷酸
-至少一种引物寡核苷酸
-随机化的5-8聚体寡核苷酸,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰,其中所述修饰位于所述随机化的寡核苷酸的5′末端处,
且其中所述随机化的寡核苷酸具有不可延伸的3′末端,且其中所述部分是芘或茋。
2.根据权利要求1的组合物,其特征在于
-所述DNA聚合酶是热稳定的,且
-所述组合物包含一对扩增引物。
3.根据权利要求1的组合物,其进一步包含靶核酸样品。
4.一种试剂盒,其包含
-DNA聚合酶,和
-随机化的5-8聚体寡核苷酸,其特征在于所述寡核苷酸包含用有机疏水部分进行的修饰,其中所述修饰位于所述随机化的寡核苷酸的5′末端处,且其中所述随机化的寡核苷酸具有不可延伸的3′末端,且其中所述部分是芘或茋。
5.根据权利要求4的试剂盒,其特征在于所述DNA聚合酶是热稳定的,其进一步包含一对扩增引物。
6.用于扩增特定靶核酸的方法,其包括下述步骤
-提供怀疑包含所述靶核酸的样品
-添加根据权利要求1-2的组合物
-执行至少第一次引物延伸反应。
7.根据权利要求6的方法,其中所述组合物是根据权利要求2的组合物,其进一步包括执行核酸扩增反应的步骤。
8.根据权利要求7的方法,其特征在于所述核酸扩增反应是实时监控的聚合酶链反应。
9.根据权利要求5-6的方法,其特征在于对通过所述扩增产生的所述扩增产物实施解链曲线分析。
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