HU221750B1 - Nukleinsav amplifikációs módszer - Google Patents
Nukleinsav amplifikációs módszer Download PDFInfo
- Publication number
- HU221750B1 HU221750B1 HU9602289A HUP9602289A HU221750B1 HU 221750 B1 HU221750 B1 HU 221750B1 HU 9602289 A HU9602289 A HU 9602289A HU P9602289 A HUP9602289 A HU P9602289A HU 221750 B1 HU221750 B1 HU 221750B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- enzyme
- reaction
- activity
- dna polymerase
- amplification
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 65
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 153
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 152
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 152
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 124
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 106
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 47
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 71
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- WQNHWIYLCRZRLR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxy-2,5-dioxooxolan-3-yl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1(O)CC(=O)OC1=O WQNHWIYLCRZRLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CCOC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 14
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 11
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical group O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dimethylmaleic anhydride Chemical compound CC1=C(C)C(=O)OC1=O MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1CCCC2=C1C(=O)OC2=O HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 6
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 4
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 125
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 56
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 44
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 18
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 18
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 9
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 5
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 5
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 4
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- CSJDCSCTVDEHRN-UHFFFAOYSA-N methane;molecular oxygen Chemical compound C.O=O CSJDCSCTVDEHRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNUWDURNWORUHQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-hydroxy-4,4-bis(hydroxymethyl)pentane-2-sulfonic acid Chemical compound OCC(CC(S(=O)(=O)O)(N)C)(CO)CO HNUWDURNWORUHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 241001427367 Gardena Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000531165 Pyrodictium abyssi Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 241000204315 Thermosipho <sea snail> Species 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940023019 aconite Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940059720 apra Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N cis-aconitic acid Chemical compound OC(=O)C\C(C(O)=O)=C\C(O)=O GTZCVFVGUGFEME-IWQZZHSRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N methane;sulfane Chemical compound C.S YQCIWBXEVYWRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Furan Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya DNS-polimeráz-aktivitással vagy ligázaktivitássalrendelkező, kémiai módosítással reverzíbilisen inaktivált, hővelszemben stabil enzim, amelyet valamely hővel szemben stabil enzim ésvalamely módosítóreagens elegyének reakciójával állítanak elő;mimellett a reakciót lúgos pH-értéken, kb. 25 °C-nál alacsonyabbhőmérsékleten végzik el; reagensként valamely (I) általános képletű(mely képletben R1 és R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetbenösszekapcsolódó szerves csoportok) vagy valamely (II) általánosképletű (mely képletben R1 és R2 jelentése előnyösen összekapcsolódószerves csoportok és a hidrogénatomok cisz-állásúak)dikarbonsavanhidridet alkalmaznak; és a reakciót az enzimaktivitáslényegében teljes inaktiválódásáig végzik el. A kémiailag módosított,hővel szemben stabil enzim nukleinsavak amplifikációjára alkalmazható.Az inaktivált enzim aktivitását a reakcióelegy magasabb hőmérsékleten,az amplifikációs reakció előtt vagy annak részeként elvégzett in-kubálásával nyerik vissza. ŕ
Description
A találmány tárgya DNS-polimeráz-aktivitással vagy ligázaktivitással rendelkező, kémiai módosítással reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzim, amelyet valamely hővel szemben stabil enzim és valamely módosítóreagens elegyének reakciójával állítanak elő; mimellett a reakciót lúgos pH-értéken, kb. 25 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végzik el; reagensként valamely (I) általános képletű (mely képletben R1 és R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben összekapcsolódó szerves csoportok) vagy valamely (II) általános képletű (mely képletben Rt és R2 jelentése előnyösen összekapcsolódó szerves csoportok és a hidrogénatomok cisz-állásúak) dikarbonsavanhidridet alkalmaznak; és a reakciót az enzimaktivitás lényegében teljes inaktiválódásáig végzik el.
A kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim nukleinsavak amplifíkációjára alkalmazható. Az inaktivált enzim aktivitását a reakcióelegy magasabb hőmérsékleten, az amplifikációs reakció előtt vagy annak részeként elvégzett inkubálásával nyerik vissza.
HU 221 750 B1
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 6 lap ábra)
HU 221 750 Bl
Találmányunk általánosan a nukleinsavkémia területére vonatkozik. Találmányunk tárgya közelebbről eljárás nukleinsavszekvenciák amplifikálására és eljárás nemspecifikus amplifikáció csökkentésére.
A nukleinsavszekvenciák amplifikálására szolgáló 5 polimeráz láncreakciók (PCR) az irodalomból jól ismertek (lásd 4 683 202,4 683 195 és 4 965 188 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A PCRreagensek forgalmazását és PCR-jegyzőkönyvek közrebocsájtását kereskedelmi cégek (például Perkin 10 Elmer, Norwalk, CT) végzik.
Minden PCR-amplifikációs ciklusban egy kettős szálú target (cél)-szekvenciát denaturálnak, a denaturált célszekvencia minden egyes szálához primereket kapcsolnak és a primereket DNS-polimeráz segítségé- 15 vei kiterjesztik. Az amplifikáció specifikussága a primer hibridizáció specifikusságától függ. A primereket oly módon választják meg, hogy a célnukleinsav minden szála 3’-végződésén levő szekvenciához komplementerek vagy lényegében komplementerek legyenek. 20 A tipikus PCR-reakcióknál alkalmazott magasabb hőmérsékleten a primerek csak a kivánt célszekvenciához hibridizálódnak. Az amplifikációs reakcióelegyeket azonban általában szobahőmérsékleten, tehát a primer hibridizáció specifikusságához szükségesnél alacso- 25 nyabb hőmérsékleten készítik el. Kevésbé szigorú körülmények között a primerek nemspecifikusan más, csupán részlegesen komplementer nukleinsavszekvenciákhoz (vagy akár más primerekhez) kapcsolódhatnak és nemkívánatos kiterjesztett (extenziós) termékek szín- 30 tézisét indíthatják be, amelyek a célszekvenciával együtt amplifikálhatók. A nemspecifikus primer kiterjesztett termékek amplifikációja a célszekvenciák amplifikációjával versenyezhet és a kivánt szekvencia amplifikációját lényegesen csökkentheti. A nemspecifikus 35 amplifikáció által okozott problémákkal Chou és társai foglalkoztak [Nucleic Acids Research 20 (7), 1717-1723 (1992)].
A nemspecifikus amplifikáció oly módon csökkenthető, hogy a nem célszekvenciákhoz kötött primerek- 40 bői származó kiterjesztett termékek képződését a reakció megkezdése előtt visszaszorítják. A „forró indrtásos” jegyzőkönyv nevű egyik módszer szerint a hibridizációs specifikussághoz szükséges hőmérséklet elérése előtt egy vagy több döntő jelentőségű reagenst nem ad- 45 nak a reakcióelegyhez. Ezáltal a specifikus primer hibridizációt biztosító reakciókörülmények kialakulása előtt a reakcióelegy a primer kiterjesztésnek nem kedvez.
A „forró inditásos” módszereket kézi úton végzik el oly módon, hogy a beindításhoz szükséges magas hő- 50 mérsékleten elvégzett inkubációs lépés után a reakciócsövet felnyitják és a hiányzó reagenseket hozzáadják. A kézi „forró inditásos” módszerek azonban munkaigényesek, és a reakcióelegy fertőződésének veszélye megnő. A reakciókomponensek elválasztása és elkü- 55 lönrtése céljából hővel szemben érzékeny anyagokat (például viasz) alkalmazó „forró inditásos” módszerek az 5 411 876 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és Chou és társai fent idézett közleményében kerültek ismertetésre. Ezeknél a módszerek- 60 nél a reakció előtt magas hőmérsékleten elvégzett inkubálás során a hővel szemben érzékeny anyag megolvad és ezáltal a reagensek elegyednek.
A reakció megkezdése előtt a nem célszekvenciákhoz kötött primerekből keletkező kiterjesztett termékek képződésének csökkentését célzó másik módszer szerint a DNS-polimerázt gátolják, éspedig a DNS-polimerázhoz hőre reverzibilis módon nem kovalens kötéssel kapcsolódó vegyület felhasználásával. Az 5 338 671 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban DNS-polimeráz-aktivitás gátlása céljából hővel szemben stabil DNS-polimerázra specifikus antitestek felhasználását írják le. Az antitest-DNS-polimeráz komplex kialakítása céljából az antitesteket valamely pufferben szobahőmérsékleten a reakcióelegy összeállítása előtt a DNS-polimerázzal inkubálják. A DNS-polimeráz-aktivitás antitest által előidézett gátlását magas hőmérsékleten végzett reakció előtti inkubálással inaktiválják. E módszer hátránya, hogy a DNS-polimerázzal szemben specifikus antitestek termelése költséges és időigényes művelet, különösen nagyobb mennyiségek esetében. További hátrány, hogy az antitesteknek a reakcióelegyhez történő hozzáadása az amplifikációs reakció áttervezését teheti szükségessé.
A kiterjesztett termékek képződése oly módon is gátolható, hogy a primerekhez kovalens kötéssel hőre reverzibilis módon kapcsolódó vegyületet adnak a reak-. cióelegyhez, és ezáltal megakadályozzák a primereknek bármely szekvenciához vagy célhoz történő hibridí* zációját. így például a reakcióelegyhez adott egyszálü megkötő fehérje a primerekhez kötődik és ezáltal meg* gátolja a primer hibridizációt és a primer kiterjesztést..
A PCR-termékek kitermelésének javítására szolgálói gén 32 fehérjét alkalmazó módszer Schwarz és társaid közleményében került ismertetésre [Nucleic Acids Research 18 (4), 10 (1990)].
A nemspecifikus amplifikáció továbbá oly módon, csökkenthető, hogy a nem célszekvenciákhoz kötődő primerekből képződő kiterjesztett termékeket a reakció beindítása előtt lebontják (lásd az 5 418 149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és a WO 92/01814 számú nemzetközi közrebocsátási iratban leírt módszereket). Az újonnan szintetizált kiterjesztett termékeket úgy bontják le, hogy a reakcióelegybe dUTP-t és UNG-t építenek be és a reakcióelegyet az amplifikációs reakció elvégzése előtt 45-60 °C-on inkubálják. A módszer hátránya, hogy a kiterjesztett termék lebontása a kiterjesztett termék képződésével versenyez és a nemspecifikus primer kiterjesztett termék nem küszöbölhető teljesen ki.
A molekuláris biológia, fehérjekémia és nukleinsavkémia szokásos módszerei a szakember által jól ismertek és az irodalomban széleskörűen ismertetésre kerültek; lásd például az alábbi irodalmi helyeket: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Sambrook és társai, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J.
Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D.
Hames és S. J. Higgins. eds., 1984); Chemical Reá- r gents fór Protein Modification (CRC Press); és egy so2
HU 221 750 Bl rozat, Methods in Enzimology (Academic Press, Inc.).
A fent említett valamennyi szabadalom, szabadalmi bejelentés és közlemény, supra és infra egyaránt, hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
Találmányunk tárgya eljárások és reagensek nuk- 5 leinsavamplifikációjára, az igénypontokban meghatározott primeralapú amplifikációs reakció felhasználásával. A nemspecifikus amplifíkáció problémái ezekkel a módszerekkel és reagensekkel egyszerűen és gazdaságosan megoldhatók. A találmányunk szerinti módsze- 10 rek során az amplifikációs reakcióelegyben magasabb hőmérsékleten végzett inkubálással újra aktiválható, reverzibilisen maktivált hővel szemben stabil enzimet alkalmazunk. A nemspecifikus amplifíkáció nagymértékben csökken, minthogy a reakcióelegy a primer hibridi- 15 záció specifikusságának biztosításához szükséges magasabb hőmérséklet elérése előtt a primer kiteijesztésnek nem kedvez.
Találmányunk tárgya egyrészről valamely primer kiteijesztési reakciót katalizáló hővel szemben stabil en- 20 zim és valamely módosítóreagens közötti reakció által termelt, reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil enzimek. A reakció eredményeként az enzimaktivitás jelentős mértékben - előnyösen lényegében teljesen csökken. A módosított enzimnek vizes pufferben, lúgos 25 pH-értéken kb. 25 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten történő inkubálásakor az enzimaktivitás kb. 20 percnél rövidebb idő alatt lényegében nem emelkedik. A módosított enzimnek pH 8-9 értéken, 25 °C-on elkészített vizes pufferben kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten 30 végzett inkubálásának hatására a primer kiteijesztő aktivitás kb. 20 percnél rövidebb idő alatt legalább kétszeresére nő. A találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil enzimek aktív állapotban a primer kiteqesztést katalizálják vagy a primer extenzió 35 lejátszódásához szükségesek. Enzimként előnyösen hővel szemben stabil DNS-polimerázokat és ligázokat alkalmazhatunk.
Módosító reagensként előnyösen (I) általános képletű (mely képletben Rj és R2 jelentése hidrogénatom 40 vagy adott esetben egymáshoz kapcsolódó szerves maradékok) vagy (II) általános képletű dikarbonsavanhidrideket (mely képletben Rt és R2 jelentése adott esetben összekapcsolódó szerves maradékok és a hidrogénatomok cisz-állásúak) alkalmazhatunk. A szerves 45 maradék a gyűrűhöz közvetlenül szén-szén kötésen vagy szén-heteroatom kötésen (például szén-oxigén, szén-nitrogén, vagy szén-kén kötés) keresztül kapcsolódhat. A szerves maradékok gyűrűs szerkezetet képezve össze is kapcsolódhatnak (például 3,4,5,6-tetrahid- 50 roftálsavanhidrid).
Előnyösek az alábbi reagensek: maleinsavanhidrid; helyettesített maleinsavanhidridek, például citrakonsavanhidrid, cisz-akonitsavanhidrid vagy 2,3-dimetil-maleinsavanhidrid; exo-cisz-3,6-endoxo-A4-tetrahidroftál- 55 savanhidrid; és 3,4,5,6-tetrahidroftálsavanhidrid.
A PCR-amplifikációknál felhasználható reverzibilisen inaktivált DNS-polimerázok előállításánál különösen előnyösen citrakonsavanhidrid és cisz-akonitsavanhidrid alkalmazható. 60
Találmányunk tárgya továbbá eljárás nukleinsavamplifikációs reakciók végrehajtására a találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil enzim felhasználásával. A találmányunk tárgyát képező, valamely mintában levő célnukleinsav amplifikációjára szolgáló eljárás az alábbi lépéseket foglalja magában:
a) a mintát a célnukleinsavval komplementer valamely prímért és valamely módosított hővel szemben stabil enzimet tartalmazó amplifikációs reakcióeleggvel hozzuk érintkezésbe; mi mellett a módosított hővel szemben stabil enzimet valamely primer kiterjesztési reakciót katalizáló hővel szemben stabil enzim és valamely módosítóreagens reakciójával termeljük; a reakciót lúgos pH-értéken, kb.
°C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végezzük el; a reakció eredményeként az enzimaktivitás lényegében teljes inaktiválását előidéző kémiai módosítást hajtunk végre; és a módosított enzimnek 25 °C-on pH 8-9 értéken kialakított vizes pufferben kb.
°C-nál magasabb hőmérsékleten végzett inkubálásakor az enzimaktivitás kevesebb mint kb. 20 perc t alatt legalább kétszeresére emelkedik; és
b) az a) lépésnél keletkező elegyet kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten az enzim újraaktiválásához és a primer kiteijesztett termékek képződéséhez elegen- » dő ideig inkubáljuk.
A találmányunk szerinti eljárás előnyös kiviteli alak- * ja szerint valamely mintában levő célnukleinsav amplifikációját oly módon végezzük el, hogy
a) a mintát a célnukleinsavval komplementer prímát és valamely módosított hővel szemben stabil enzi- > met tartalmazó reakcióeleggyel hozzuk érintkezés- i be; mi mellett a módosított hővel szemben stabil enzimet oly módon állítjuk elő, hogy a hővel szemben <
stabil enzimet és valamely (I) általános képletű (mely képletben R, és R2 jelentése hidrogénatom * vagy adott esetben összekapcsolódó szerves maradékok) vagy valamely (II) általános képletű (mely képletben Rj és R2 jelentése adott esetben összekapcsolódó szerves maradékok és a hidrogénatomok ciszállásúak) tartalmazó elegyet az enzimaktivitás lényegében teljesen inaktiválását eredményező reakciónak vetünk alá; és
b) az a) lépésnél keletkező elegyet kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten az enzim újraaktiválásához és primer kiteijesztett termékek képződéséhez szükséges ideig inkubáljuk.
A találmányunk szerinti eljárás előnyös kiviteli alakjai szerint előnyös módosítóreagensek felhasználásával reverzibilisen módosított enzimeket alkalmazunk. A találmányunk szerinti eljárás egyes kiviteli alakjai szerint az inkubációs b) lépést az amplifikációs reakció megkezdése előtt végezzük el. A találmányunk szerinti eljárás más kiviteli alakjai szerint az enzim újraaktiválását eredményező inkubálást az amplifikációs eljárásba integrált lépésként hajtjuk végre. így például a minden PCR-ciklusban elvégzett denaturáló lépés egyidejűleg a módosított DNS-polimeráz újraaktiválására szolgálhat.
...........
HU 221 750 Bl
A találmányunk szerinti eljárás előnyös kiviteli alakja szerint amplifikációs reakcióként valamely polimeráz láncreakciót (PCR) végzünk el és valamely reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil DNS-polimerázt alkalmazunk. A reakcióelegyet az amplifikációs reakció elvégzése előtt az amplifikációs reakció kapcsolási (gyűrőzárási) hőmérsékleténél magasabb hőmérsékleten inkubáljuk. Ezáltal a DNS-polimeráz mindaddig inaktiválódik, míg a hőmérséklet az amplifikációs reakció specifikussá tételéhez szükséges hőmérséklet feletti érték, és ily módon a nemspecifikus amplifikáció csökken.
Találmányunk tárgya továbbá valamely találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil enzimet és az amplifikációs reakció elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmazó reakcióelegyet Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint az amplifikációs reakcióelegy valamely PCR elvégzésére szolgáló oligonukleotid printereket tartalmaz.
Találmánymik tárgya továbbá valamely találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált hővel szemben stabil enzimet és egy vagy több amplifikációs reagenst tartalmazó kit
Az 1. ábrán a citrakonsavanhidrid, cisz-akonitsavanhidrid és 2,3-dimetil-maleinsavanhidrid szerkezetét, valamint a citrakonsavanhidrid és lizin között lejátszódó reakciót tüntetjük fel.
A 2. ábrán citrakonilezett Taq DNS-polimeráz felhasználásával elvégzett amplifikációk eredményeit tüntetjük fel (4. példa).
A 3. ábrán citrakonilezett DNS-polimerázok felhasználásával elvégzett amplifikációk eredményeit tüntetjük fel (6. példa).
A 4. ábrán a citrakonilezett és cisz-akonitelezett DNS-polimerázok felhasználásával elvégzett amplifikációknál a reakció előtt végrehajtott inkubáció időtartamának változtatásakor nyert eredményeit tüntetjük fel (9. példa).
Az 5. ábrán citrakonilezett és cisz-akonitelezett DNS-polimerázok felhasználásával elvégzett amplifikációknál az amplifikációs ciklusszám változtatásakor kapott eredményeit tüntetjük fel (10. példa).
A találmány jobb megértése céljából néhány kifejezés értelmezését az alábbiakban közöljük.
A „nukleinsav” és „oligonukleotid” kifejezés a kimutatandó primerekre, mintákra és oligomer fragmensekre vonatkozik, és ezeken a kifejezéseken polideoxiribonukleotidok (2-deoxi-D-ribózt tartalmaznak), poliribonukleotidok (D-ribózt tartalmaznak) és purin- vagy pirimidinbázis, vagy módosított purin- vagy pirimidinbázis valamely N-glikozidját képező bármely más típusú polinukleotidok általánosan értendők. Ennek megfelelően a „nukleinsav” és „oligonukleotid” kifejezések között a hosszúság tekintetében nem teszünk különbséget; ezek a kifejezések egymással felcserélhetően alkalmazhatók. A fenti kifejezések azonban csak a molekula primer szerkezetére vonatkoznak. így ezek a kifejezések a kétszálú és egyszálú DNS-t, valamint a kétszálú és egyszálú RNS-t egyaránt felölelik. Az oligonukleotid bármely megfelelő módszerrel előállítható. A szintézismódszerek összefoglalása az alábbi irodalmi helyen került ismertetésre: Goodchild, Bioconjugate Chemistry 1 (3), 165-187 (1990).
A „hibridizáció” kifejezés két egyszálú nukleinsav által, komplementer bázispárosítás eredményeként képezett duplex szerkezet kialakítására vonatkozik. A hibridizáció teljesen komplementer nukleinsavszálak vagy kis hibás összeillesztésű tartományokat tartalmazó „lényegében komplementer” nukleinsavszálak között játszódhat le. Azokat a körülményeket, amelyek mellett csak a teljesen komplementer nukleinsavszálak hibridizálódnak „szigorú hibridizációs körülményeknek” vagy „szekvenciaspecifikus hibridizációs körülményeknek” nevezzük. Lényegében komplementer szekvenciák stabil duplexei kevésbé szigorú hibridizációs körülmények között alakíthatók ki. A nukleinsavtechnológiában járatos szakember a duplex stabilitást empirikus úton határozhatja meg, a változó tényezők (például az oligonukleotidok hossza és bázispár koncentrációja, ionerősség és a hibás illesztésű bázispárok gyakorisága) figyelembevételével, az irodalomban közölt útmutatások alapján (lásd például Sambrook és társai, 1989, supra).
A szigorú hibridizációs körülményeket általában * oly módon választjuk meg, hogy meghatározott ionerősség és pH mellett a specifikus szekvencia termális olva- *' í· dáspontjánál (Tm) kb. 5 °C-kal alacsonyabbak legye- ·. t nek. Tm az a hőmérséklet (meghatározott ionerősségés t pH mellett), amelynél a bázispárok 50%-a disszociál. V F
A hibridizációs körülmények szigorúságának enyhítése- í f kor hibás illesztésű szekvenciák alakulhatnak ki; a> hi- £ bás illesztésű szekvenciák megengedett mértékét a hib- L ridizációs körülmények megfelelő beállításával szabá- | lyozzuk. I
A „primer” kifejezés olyan természetes vagy szintetikus oligonukleotidokra vonatkozik, amelyek valamely nukleinsavszálhoz komplementer primer kiterjesztett termék indukálását eredményező szintézis körülményei között DNS-szintézis beindító pontjaként működni képesek; ez a reakció 4 különböző nukleozid trifoszfát és valamely polimerizációs ágens (például DNS-polimeráz vagy fordított transzkriptáz) jelenlétében, megfelelő pufferben, megfelelő hőmérsékleten indul be. Oligonukleotid analógok (például „peptid nukleinsavak”) printerként képesek működni és a jelen szabadalmi leírásnál használt „primer” definícióba beletartoznak. A primer előnyösen valamely egyszálú oligodeoxiribonukleotid lehet. A primer hossza a kivánt felhasználástól függ, és általában 6-50 nukleotid. Rövidebb primer molekulák a templáttal általában alacsonyabb hőmérsékleten képeznek stabil hibrid komplexeket.
A primemek nem kell a templát nukleinsav pontos szekvenciáját tükröznie, azonban a templáttal történő hibridizációhoz szükséges mértékben komplementernek kell lennie. g
A szabadalmi leírásban használt „primer kiteijesztés” kifejezés az alábbi műveletekre vonatkozik: egye- Γ di nukleotid trifoszfátok polimerizációjából származó,
HU 221 750 Bl beindító pontként valamely prímért felhasználó DNSszintézis; és a primer kiterjesztése céljából további oligonukleotidoknak a primerhez történő kapcsolása.
A „primer kiterjesztés” kifejezésen két oligonukleotidnak az elkövetkező amplifikációs ciklusokban target- 5 ként szolgáló hosszabb tennék képződéséhez vezető ligációját is magában foglalja. A „primer” kifejezés a ligálás által közvetített amplifikációs eljárásokban felhasznált, valamely szomszédos helyzetben hibridizáló második oligonukleotid ligálása által kiterjesztett oligo- 10 nukleotidokra is vonatkozik.
A primerekbe további jellemzők is beépíthetők, amelyek a primer kimutatását vagy immobilizálását lehetővé teszik, ugyanakkor azonban a primer alapvető tulajdonságát - a DNS-szintézis beindító pontjaként 15 működik - nem változtatják meg. így például a primerek az 5’-végződésen további nukleinsavszekvenciát tartalmazhatnak, amely a célnukleinsavhoz nem hibridizálódik, azonban az amplifikált tennék klónozását megkönnyíti. A hibridizálandó templáttal elegendő mérték- 20 ben komplementer primer tartományt „hibridizáló tartománynak” nevezzük.
A „céltartomány” és „célnukleinsav” kifejezés az amplifikálandó nukleinsav tartományára vagy alszekvenciájára vonatkozik. A primer hibridizációs helyre, 25 mint a primer hibridizáció céltartományára hivatkozhatunk.
A jelen szabadalmi leírás szerint valamely oligonukleotid primer egy célszekvencia szempontjából „specifikus”, ha az oligonukleotid és a célszekvencia között 30 levő hibás illeszkedések száma kisebb, mint az oligonukleotid és a mintában levő nem célszekvenciák közötti hibás illeszkedések száma. Olyan hibridizációs körülményeket választhatunk meg, amelyek mellett stabil duplexek csak abban az esetben képződnek, ha a jelen 35 levő hibás illeszkedések száma nem nagyobb az oligonukleotid és a célszekvencia között levő hibás illeszkedések számánál. Ilyen körülmények között az oligonukleotid csak a célszekvenciával képezhet stabil duplexet.
A targetspecifikus primerek megfelelő szigorú amplifi- 40 kációs körülmények mellett történő alkalmazása a target primer kötődési helyeket tartalmazó célszekvenciák specifikus amplifikációjához vezet. Szekvenciaspecifikus amplifikációs körülmények alkalmazása a pontosan komplementer primer kötődési helyeket tártál- 45 mazó célszekvenciák specifikus amplifikációját teszi lehetővé.
A „nemspecifikus amplifikáció” kifejezés a célszekvenciától eltérő nukleinsavszekvenciák ampliftkációjára vonatkozik, amelyek a célszekvenciától eltérő szék- 50 venciákhoz hibridizálódó primerekből származnak és a primer kiteijesztés szubsztrátumaként szolgálnak. A printernek valamely nem célszekvenciához történő hibridizációját „nemspecifikus hibridizációnak” nevezzük, amely alacsonyabb hőmérsékleten kevésbé szigorú reak- 55 ció előtti körülmények között játszódhat le.
A „hővel szemben stabil enzim” kifejezés hővel szemben viszonylag stabil enzimekre vonatkozik A hővel szemben stabil enzimek a módosítócsoportok eltávolítására szolgáló magasabb - előnyösen 50 °C fölötti 60
- hőmérsékletnek az aktivitás irreverzíbilis elvesztése nélkül ellenállnak. A találmányunk szerinti eljárásnál módosított hővel szemben stabil enzimként hővel szemben stabil DNS-polimerázok és hővel szemben stabil ligázok alkalmazhatók.
A „hővel szemben stabil DNS-polimeráz” kifejezés olyan enzimekre vonatkozik, amelyek melegítéssel szemben viszonylag stabilak és nukleozid trifoszfátoknak a célszekvencia egyik nukleinsavszálával komplementer primer kiterjesztett termékek képződéséhez vezető polimerizációját katalizálják. Az enzim a szintézist a primer 3’-végződésén indítja be és a folyamat a templát 5’-végződése irányában a szintézis befejeződéséig folytatódik Tisztított hővel szemben stabil DNSpolimerázok az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: 4 889 818, 5 352 600 és 5 079 352 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás;
WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200 és WO 92/06202 számú nemzetközi közrebocsátási irat;
491 086 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 92/09689 számú nemzetközi közrebocsátási irat, és 5 210 036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás.
A valamely szervezetből „szánnazó” enzim kifejezés a szervezetből tisztított enzimre vagy annak rekombináns változatára vonatkozik. Ez a kifejezés molekuláris biológiai módszerekkel módosított aminosavszekvenciát tartalmazó enzimekre is kiterjed.
A szabadalmi leírásban használt „reverzíbiliseniriraktivált” kifejezés valamely vegyülettel lejátszódó reakcióval maktivált enzimekre vonatkozik. E retófció eredményeként az enzim kovalens módosítása következik be („kémiai módosításnak” is nevezzük), majd a módosítóvegyület megfelelő körülmények között eltávolítható. A módosítóvegyület eltávolítását eredményezd reakció a módosítóreakcióval nem szűk- | ségszerűen ellentétes irányú. Az enzimet reverzíbi- F lisen inaktiváltnak tekintjük minden olyan esetben, amikor a módosítóvegyület eltávolítását és az enzimfunkció felszabadítását eredményező reakció elvégezhető.
A „reakcióelegy” kifejezésen az adott reakció elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmazó oldatok értendők. Az „amplifikációs reakcióelegy” kifejezés az amplifikációs reakció végrehajtásához szükséges reagenseket tartalmazó oldatokra vonatkozik, amelyek általában oligonukleotid primereket és DNS-polimerázt vagy ligázt tartalmaznak, megfelelő pufferben. A „PCR reakcióelegy” kifejezés általában oligonukleotid primereket, hővel szemben stabil DNS-polimerázt, dNTP-eket és két vegyértékű fémkationt tartalmaz, megfelelő pufferben. A reakcióelegyet akkor nevezzük teljesnek, ha a reakció lejátszódásához szükséges valamennyi reagenst tartalmazza. A nem teljes reakcióelegyek csupán a szükséges reagensek egy részét tartalmazzák. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a reakciókomponenseket az ' egyszerű kezelhetőség, tárolási stabilitás és a kompo- g nensek koncentrációjának a felhasználástól függő külön beállítása céljából az összes komponensek közül csu- r pán néhányat tartalmazó különálló oldatok formájában
HU 221 750 BI rutinszerűen tároljuk. Ugyanakkor közismert és általános gyakorlat, hogy a teljes reakcióelegyet a reakciókomponensek elegyítésével a reakció elvégzése előtt alakítjuk ki.
A találmányunk tárgyát képező eljárás során hővel 5 aktivált, hőre stabil enzim felhasználásával amplifikációs reakciót végzünk el; a primer kiteijesztéshez aktív enzim szükséges. Az enzimet aktiváló magasabb hőmérsékleten végzett inkubálás előtt az amplifikációs reakcióelegy a primer kiterjesztésnek nem kedvez és ki- 10 terjesztett termékek - nemspecifikus vagy más termékek - nem képződnek. A magasabb hőmérsékleten végzett, az enzimet újraaktiváló inkubálás után az amplifikációs reakcióelegyet a reakció specifikusságának biztosítása céljából magasabb hőmérsékleten tartjuk. En- 15 nek következtében primer kiterjesztett termékek csak az amplifikáció specifikusságát biztosító körülmények között képződnek.
A találmányunk tárgyát képező eljárás során a hővel aktivált enzim aktív állapotban a primer kiterjesztő- 20 ses reakciót katalizálja. Egy tipikus amplifikációs reakcióban történő felhasználásnál (például PCR) a hővel aktivált, hőre stabil enzim aktív állapotban DNS-polimeráz-aktivitással rendelkezik. Ligáz által közvetített amplifikációs rendszerekben a hővel aktivált, hőre sta- 25 bil enzim aktív állapotban DNS-ligáz-aktivitással rendelkezik.
Egy ligáz által közvetített amplifikációs rendszerben valamely „kiterjesztett tennék” oly módon képződik, hogy valamely első oligonukleotidot (a „primer” kifeje- 30 zés körébe tartozik) annak 3'-végződéséhez szomszédos helyhez hibridizáló második oligonukleotiddal ligálunk.
A második oligonukleotid közvetlenül a primerrel szomszédos helyhez hibridizálódhat (ez esetben csak ligálásra van szükség), vagy a primertől egy vagy több bázis 35 távolságra hibridizálódhat, amikor is a primer ligálás előtti kiterjesztéséhez polimerázaktivitásra van szükség. Mindkét esetben a cél-DNS szomszédos tartományaihoz hibridizálódó két oligonukleotid kapcsolása a „primer kiterjesztés” kifejezés körébe tartozik. 40
A találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzimek valamely módosítóreagens és az enzim között lejátszódó reakció eredményeként képződnek. A reakció során az enzim reverzibilis kémiai módosítása játszódik le és ennek következtében 45 az enzim aktivitását teljes egészében vagy közel teljesen elveszti. A módosítás lényege, hogy a fehérjéhez a módositócsoport kovalens kötéssel kapcsolódik.
A módosítóvegyületet oly módon választjuk meg, hogy az amplifikációs reakciópufferben magasabb hőmérsék- 50 létén végzett inkubáció során a módosítással ellentétes irányú folyamat játszódjék le. A megfelelő enzimeket és módosítócsoportokat az alábbiakban ismertetjük.
Aktív állapotban DNS-polimeráz-aktivitással rendelkező, reverzibilisen inaktivált enzimeket hővel szemben 55 stabil DNS-polimerázokból készítünk. Az amplifikációs reakciókban felhasználható, hővel szemben stabil DNSpolimerázok az irodalomból jól ismertek és számos forrásból származtathatók le. Ide tartoznak például a Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyridictium, 60
Pyrococcus és Thermosipho genushoz tartozó speciesek termőül eubaktériumai vagy archae-baktériumai. PCRamplifikációkban felhasználható hővel szemben stabil DNS-polimerázok előnyösen az alábbi speciesekből származtathatók le: Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi és Thermosipho africanus. Hővel szemben stabil DNS-polimerázok az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: 4 889 818, 5 352 600 és 5 079 352 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200 és WO 92/06202 számú nemzetközi közrebocsátási irat; 5 491 086 számú amerikai egyesült államokbeü szabadalmi leírás; WO 92/09689 számú nemzetközi közrebocsátási irat és 5 210 036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Hővel szemben stabil DNS-polimerázokat a Perion Elmer cég (Norwalk, CT) hoz kereskedelmi forgalomba.
Más amplifikációs eljárásoknál (például ligáz által közvetített amplifikációk) felhasználható, reverzibilisen maktivált, hővel szemben stabil enzimek a különböző amplifikációs módszereket ismertető alábbi irodalmi helyeken leírt, hővel szemben stabil enzimekből készíthetők.
A találmányunk szerinti eljárást nem korlátozzuk a példákban bemutatott enzimek felhasználására. így például az irodalomban amplifikációs reakciókban történő felhasználására leirt bármely hővel szemben stabil DNS-polimeráz a fent ismertetett módon módosítható,' a találmányunk szerinti eljárásnál felhasználható rever» zíbilis inaktivált enzimek előállítása céljából. A találmá» nyunk szerinti eljárásnál általában bármely olyan enzim felhasználható, amely primer kiterjesztést katalizál vagy primer kiteijesztés lejátszódásához szükséges, magas hőmérsékleten elvégzett újraaktiválási inkubációval szemben irreverzibilis inaktiválódás nélkül megfelelő termikus stabilitással rendelkezik, és a leírt módon reverzibilisen inaktivált enzim képződése közben módosítható. A szakember a jelen szabadalmi leírásban megadott útmutatás alapján bármely enzim esetében képes a módosítási reakció és amplifikációs reakciókörülmények optimalizálására.
Találmányunk előnyös kiviteli alakjai szerint a hővel szemben stabil enzim reverzibilis inaktiválását oly módon végezhetjük el, hogy a lizinmaradékok ε-aminocsoportjának kémiai módosításával a lizinmaradékokat reverzibilisen blokkoljuk A fehéije aktív tartományában levő lizinek módosítása a fehéije inaktiválódását eredményezi. Ezenkívül, az aktív tartományon kívül levő lizinek módosítása térbeli kölcsönhatások vagy konformációs változások révrá a fehéije inaktiválásához hozzájárulhat. Az irodalomban az aminocsoporttal reverzibilisen reagáló számos vegyületet Írtak le. így például az aminocsoportok reverzibilisen trifluor-acetilezéssel [lásd Goldberger és Anfinsen: Biochemistry 1: 410 (1962)], amidinálással [lásd Hunter és Ludwig: J. Amer. Chem. Soc. 84, 3491 (1962)], maleilezéssel [lásd Butler és társai: Biochem. J. 103, 78 (1967)] aceto-acetilezéssel [lásd Marzotto és társai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 26, 517 (1967), valamint Marzotto és társai: Bio6
HU 221 750 Bl chem. Biophys. Acta 154, 450 (1968)], tetrafluor-szukcinilezéssel [lásd: Braunitzer és társai : Hoppé- Seyler:
Z. Physiol. Chem. 349, 265 (1968)] és citrakonilezéssel [lásd Dixon és Perham: Biochem. J. 109 312-314 (1968), valamint Habeeb és Atassi: Biochemistry 9, 5 (25), 4939-4944 (1970)] módosíthatók.
A lizinmaradékok ε-aminocsoportjának kémiai módosításához reagensként előnyösen (I) általános képletű (mely képletben Rj és R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben összekapcsolódó szerves csoportok) vagy 10 (Π) általános képletű (mely képletben Rj és R2 jelentése adott esetben összekapcsolódó szerves csoportok és a hidrogénatomok cisz-állásúak) dikarbonsavanhidridek alkalmazhatók. A szerves csoportok a gyűrűhöz közvetlenül szén-szén kötésen vagy szén-heteroatom 15 kötésen (például szén-oxigén, szén-nitrogén vagy szénkén kötés) keresztül kapcsolódhatnak. A szerves csoportok gyűrűs szerkezet kialakítása közben egymáshoz is kapcsolódhatnak (például a 3,4,5,6-tetrahidroftálsavanhidrid esetében). 20
A dikarbonsavanhidridek a fehéijék aminocsoportjaival megfelelő acilezett termékek képződése közben reagálnak; a reakciót citrakonsavanhidrid esetében az 1. ábrán tüntetjük fel. A fenti dikarbonsavanhidridek reverzibilitását feltételezésünk szerint cisz-szén-szén két- 25 tős kötés vagy cisz-hidrogénatomok jelenléte elősegíti, amely az acilezett csoportok végállású karboxilcsoportját az amidcsoporttal lejátszódó kölcsönhatás, majd az azt követő deacilezés szempontjából megfelelő térbeli elrendezésben tartja [lásd Palacian és társai: Mól. 30 Cell. Biochem. 97, 101-111 (1990), ahol is az acilezési és deacilezési reakció feltételezett mechanizmusát ismertetik]. Más szubsztituensek hasonlóképpen az acilezett termékben levő acilrész 2,3-kötése körüli rotációt korlátozhatják és az ilyen vegyületek a találmá- 35 nyunk szerinti eljárásnál várhatóan alkalmazhatók.
Az előnyös reagensek példájaként az alábbi vegyületeket soroljuk fel: maleinsavanhidrid; helyettesített maleinsavanhidridek, például citrakonsavanhidrid, ciszakonitsavanhidrid és 2,3-dimetil-maleinsavanhidrid; 40 exo-cisz-3,6-endoxo-A4-tetrahidroftálsavanhidrid; és 3,4,5,6-tetrahidroftálsavanhidrid. A reagensek például az Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), vagy Spectrum Chemical Mfg. Coip. (Gardena, CA) cégtől szerezhetők be. Hő- 45 vei szemben stabil DNS-polimerázoknak citrakonsavanhidrid és cisz-akonitsavanhidrid (helyettesített maleinsavanhidridreagensek) felhasználásával történő módosítását a példákban ismertetjük
A fenti reagensek felhasználásával acilezett amino- 50 csoportok relatív stabilitása az alábbi sorrendben csökken: maleinsavanhidrid; exo-cisz-3,6-endoxo-A4-tetrahidroftálsavanhidrid; citrakonsavanhidrid; 3,4,5,6-tetrahidroftálsavanhidrid; cisz-akonitsavanhidrid és 2,3-dimetil-maleinsavanhidrid (lásd Palacian és társai, supra). 55 Az egyes reagensekkel módosított enzimek optimális aktiválási inkubációs körülményeit empirikus úton a példákban leírt módon határozhatjuk meg.
Az 5 262 525 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban fehérjék dikarbonsavanhid- 60 ridekkel történő kémiai módosítását ismertetik; a dikarbonsavanhidrideket maleinsavanhidrid és valamely dién Diels-Alder-reakciójával állítják elő. A fenti ’525 számú szabadalomban leírt, meghatározott stabilitással rendelkező vegyületek a jelen találmány esetében alkalmazhatók.
A találmányunk szerinti eljárást nem korlátozzuk a példákban bemutatott módosítóvegyületek alkalmazására vagy fehéijéknek a lizinmaradékok kémiai módosítása útján történő módosítására. Reverzibilisen inaktiválható enzimek előállítására az irodalomban leírt bármely olyan vegyület felhasználható, amely fehérjékkel az enzimaktivitás teljes vagy csaknem teljes elvesztése közben reagál, és a módosítás az amplifikációs reakciópufferben magasabb hőmérséklettel elvégzett inkubálással visszafordítható. Fehéijéket reveizibilisen módosító, a jövőben előállításra kerülő vegyületek is alkalmazhatók lesznek a találmányunk szerinti eljárásban. A találmányunk szerinti módositott hővel szemben stabil enzimek előállításánál az alábbi követelményeket kielégítő vegyületek alkalmazhatók:
(1) A vegyület primer kiterjesztést katalizáló hővel szemben stabil enzimekkel az enzim szignifikáns inaktiválódását eredményező reakcióban reagál.
(2) A kapott módosított enzimnek kb. 8-9 pH-értékű vizes pufferben kb. szobahőmérsékleten (25 °G)· vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten történő inka* hálásakor az enzimaktivitás kb. 20 percnél rövidebb, idő alatt szignifikáns mértékben nem emelkedik (3) A kapott módosított hővel szemben stabil enzimnek, kb. pH 8-9 értéken szobahőmérsékleten kialakított ’ reakciópufferben ld). 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten történő inkubálásakor az enzimaktivitás kb.* 20 percnél rövidebb idő alatt legalább kétszeresére emelkedik.
Az egyes módosított vegyületek találmányunk szerinti alkalmassága a megadott útmutatás alapján empirikus úton rutinszerűen meghatározható. A fenti tulajdonságok, az enzimaktivitásnak a fehérje módosításából eredő csökkenése és az enzimaktivitásnak az amplifikációs reakcióelegyben magasabb hőmérsékleten végzett inkubálás után bekövetkező visszanyerése a példákban ismertetett kísérleti módszerekkel mérhető. Reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzimek előállítása
A fehérjében levő lizinmaradékok kémiai módosítása azon alapul, hogy a lizinmaradékban levő ε-aminocsoport nukleofilként való reagálásra képes. A protonálatlan aminocsoport a reakcióképes forma, amelynek lúgos pH-érték kedvez. A módosítási reakciót 8,0-9,0 pH-értéken, vizes pufferben, szobahőmérsékleten (25 °C) vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten végezzük el. A reakció 12-24 órás inkubálás után lényegében teljes. Az alkalmas reakciókörülmények az irodalomból ismertek és a példákban szintén ismertetésre kerülnek.
Dikarbonsavanhidridek vízzel a megfelelő savak képződése közben könnyen reagálnak. Ezért a reagens nagy része a fehérjékben levő aminocsoportok módosítása közben hidrolizál. A hidrolízis mértéke a pH növe7
HU 221 750 Bl lésével emelkedik. így 9 fölötti pH-értéken a hidrolízis növekedése a fehéije szuboptimális acilezését eredményezheti.
Az acilezési reakcióban a módosítóreagenst a fehérjéhez viszonyítva általában moláris fölöslegben alkal- 5 mázzuk. A módosítóreagens és az enzim optimális mólaránya a felhasznált reagenstől függ és általában empirikusan határozzuk meg. így például Taq DNS-polimeráz citrakonsavanhidrid 20-szoros vagy nagyobb moláris fölöslegével történő reagáltatás hatására lényegében 10 teljesen inaktiválódik (az eredeti aktivitás 5%-a alá csökken). Az enzim lényegében teljes inaktiválását eredményező minimális módosítóreagens-mólarányt oly módon határozhatjuk meg, hogy a módosítóreagens hígítássorozatával inaktiválási reakciókat hajtunk vég- 15 re; a módszert a példákban újuk le.
A találmányunk szerinti eljárásnál nincs szükség az enzim teljes inaktiválására; az enzim szignifikáns inaktiválása elegendő. A jelen szabadalmi leírás értelmében az enzim szignifikáns inaktiválása azt jelenti, hogy az 20 enzim aktivitása a módosítóreagenssel lejátszódó reakció után az eredeti érték kb. 50%-a alá csökken. A nemspecifikus amplifikáció szignifikánsan inaktivált enzim alkalmazásával csökkenthető. Az enzim lényegében teljes vagy szignifikáns inaktiválását eredményező módo- 25 sítószer: enzim mólarányt a jelen szabadalmi leírásban megadott útmutatás alapján empirikusan választhatjuk meg. Megfelelő mólarányokat a példákban ismertetünk. A példákban be nem mutatott enziminaktiválási reakció körülményeit a jelen szabadalmi leírásban kö- 30 zölt útmutatás alapján rutinkísérletekkel határozhatjuk meg.
A találmányunk szerinti hővel inaktivált enzimek fontos előnye a tárolásnál mutatott stabilitás. A jelen szabadalmi leírásban ismertetett vegyületek hosszabb 35 időtartamon át stabilak, és ezért azokat nem kell közvetlenül felhasználás előtt előállítani. így például a citrakonilezett Taq DNS-polimeráz 25 °C-on történő tároláskor legalább 4 héten át inaktivált marad. Az ajánlott tárolási körülmények a felhasznált módosítóreagenstől 40 függően változnak; általánosan azonban megállapítható, hogy az inaktivált enzimkészítményeket szobahőmérsékleten (25 °C) vagy ennél alacsonyabb hőfokon - előnyösen hűtés közben - kell tárolni. A kevésbé stabil módosított enzimek (például a 2,3-dimetil-malein- 45 savanhidriddel módosított enzimek) hűtés közben tárolandók.
A találmányunk szerinti eljárás során reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzimet tartalmazó reakcióelegyet alkalmazunk, amelyet inkubálás előtt 50 vagy az amplifíkációs reakció szerves részeként vetünk alá a magas hőmérsékleten végzett inkubálásnak. A magas hőmérsékleten végrehajtott inkubálás során az aminocsoportok deacileződnek és az enzimaktivitás visszaalakul. 55
A módosított aminocsoportok deacilezése a hőmérséklet-növelés és az azzal együtt járó pH-csökkenés hatására következik be. Az amplifíkációs reakciókat általában pH 8,0-9,0 értékre beállított trisz-HCl-pufferben szobahőmérsékleten végezzük el. A lúgos reakciópuf- 60 fer-körülmények szobahőmérsékleten az aminocsoport acilezett formájának kedveznek. Bár a reakciópuffer pH-ját szobahőmérsékleten 8,0-9,0 értékre állítjuk be, a trisz-HCl-reakciópuffer pH-ja a hőmérséklet növekedésével csökken. A reakciópuffer pH-értéke az amplifikáció elvégzésekor alkalmazott magasabb hőmérsékleten csökken; ez a csökkenés különösen az aktiváló inkubálásnál alkalmazott hőmérséklet mellett jelentős. A reakciópuffer pH-értékének csökkenése az aminocsoportok deacilezésének kedvez.
A magasabb hőmérséklet hatására bekövetkező pHváltozás a felhasznált puffertől függ. A különböző biológiai reakciókban felhasznált pufferek pH-értékének hőmérsékletfüggését Good és társai ismertették [Biochemistry 5 (2), 467-477 (1966)]. Trisz-pufferek esetében a pKa-értéknek (azaz a puffertartomány középső pontja pH-jának) a hőmérséklethez viszonyított változása az alábbi egyenlettel fejezhető ki: ApRa/ °C=-0,031. így például a 25 °C-on elkészített trisz-HCl-puffer pKaértéke 2,17-dal csökken, ha az aktiválási inkubálás során a hőmérsékletet 95 °C-ra emeljük.
Bár az amplifíkációs reakciókat általában triszHCl-pufferben hajtjuk végre, az amplifíkációs reakció-1 kát a hőmérséklet-változás hatására kisebb vagy nagyobb pH-változást mutató pufferekben is elvégezhetjük. A felhasznált puffertől függően többé vagy kevésbé stabil módosított enzimek alkalmazása lehet kívánatos. így például kevésbé stabil módosított enzimet eredményező módosítóreagens felhasználása esetén at megfelelő enzimaktivitás a puffer pH-értékének kisebb' változtatása mellett alakítható vissza. A különböző reagensekkel módosított enzimek relatív stabilitásának empirikus összehasonlítása - a fentiek értelmében - meghatározott pufferekben felhasználható módosított enzimek kiválasztásához ad útmutatást.
A találmányunk szerinti eljárásnál a módosított enzim aktiválását eredményező inkubálást olyan hőmérsékleten végezzük el, amely az amplifikációs reakció specifikusságának kialakításához felhasznált primer hibridizációs (gyűrűzáró) hőmérséklettel azonos vagy annál magasabb. Az enzimaktivitás visszanyerésében szükséges inkubálási idő a hőmérséklettől, a reakcióelegy pH-értékétől és az enzim acilezett aminocsoportjának stabilitásától függ; utóbbi a módosított enzim előállításánál felhasznált módosítóreagenstől függ. Az inkubációs körülmények széles tartományban változtathatók; az optimális körülményeket minden reakcióhoz empirikusan határozzuk meg. Az inkubálást általában az amplifikációs reakciópufferben, kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten, kb. 10 másodperc és kb. 20 perc közötti időtartamon át végezzük. A példákban be nem mutatott enzimek újraaktíválásánál vagy a példákban nem szereplő reakcióelegyeknél alkalmazott inkubációs körülmények optimalizálását a szabadalmi leírásban közölt útmutatás alapján rutínkisérletekkel határozhatjuk meg.
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint valamely reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil DNS-polimeráz felhasználásával PCR-amplifikációt hajtunk végre. A PCR-amplifikációnál használt kapcso8
HU 221 750 Bl lási (gyűrűzárási) hőmérséklet általában 55-75 °C, és a reakció előtti inkubálást a kapcsolási (gyűrűzárási) hőmérséklettel azonos vagy annál magasabb hőmérsékleten - előnyösen 90 °C feletti hőmérsékleten - végezzük el. Az amplifikációs reakcióelegyet a DNS-polime- 5 ráznak a hőmérséklet ciklus előtt történő újraaktiválása céljából kb. 12 percen át kb. 90-100 °C-on inkubáljuk.
A PCR-amplifikációknál használható előnyös reakció előtti inkubációs körülményeket a példákban újuk le, ahol is a reakció előtti inkubációs körülmények változ- 10 tatásának az amplifikációra kifejtett hatását is bemutatjuk.
Egy tipikus PCR-amplifikáció első lépése a kettős szálú célnukleinsav hővel történő denaturálásából áll.
A nukleinsavminta denaturálásához szükséges pontos 15 körülmények a mintanukleinsav hosszától és összetételétől függnek Általában 90-100 °C-on, kb. 10 másodperc és 4 perc közötti időn át végzett inkubálás a mintanukleinsav teljes denaturálásához elegendő. A kezdeti denaturálási lépés reakció előtti inkubálásként a 20 DNS-polimeráz újraaktiválására szolgálhat. A kezdeti denaturálási lépés hosszától és hőmérsékletétől, valamint a DNS-polimeráz inaktiválásához használt módosítóreagenstől függően azonban a DNS-polimeráz-aktivitás visszanyerése tökéletlen is lehet. Amennyi- 25 ben az enzimaktivitás maximális visszanyerése kívánatos, a reakció előtti inkubáció meghosszabbítható vagy - alternatív módon - az amplifikációs ciklusok száma növelhető.
Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint a mó- 30 dositott enzimet és a kezdeti denaturálási körülményeket oly módon választjuk meg, hogy a kezdeti inkubációs lépés alatt a visszaalakítható enzimaktivitásnak csupán egy részét nyerjük vissza. A magas hőmérsékleten végzett denaturálási lépést magában foglaló további 35 PCR-ciklusok alatt további enzimaktivitást nyerünk vissza. Ezáltal az enzimaktivitás visszanyerését az amplifikáció kezdeti ciklusain keresztül elnyújtjuk. A DNSpolimeráz-aktivitás „időben történő késleltetése” megfigyeléseink szerint a nemspecifikus amplifikációt to- 40 vább csökkenti. Ismeretes, hogy a DNS-polimeráz fölöslege a nemspecifikus amplifikációnak kedvez. A jelen módszereknél a DNS-polimeráz-aktivitás az amplifikáció kezdeti szakaszaiban, kisszámú célszekvencia mellett alacsony és ez a képződő nemspecifikus kiterjesz- 45 tett termékek mennyiségét csökkenti. Maximális DNSpolimeráz-aktivitás az amplifikáció későbbi szakaszaiban, nagyszámú célszekvencia mellett van jelen és ez magas amplifikációs kitermelést tesz lehetővé. Az amplifikációs ciklusok száma szükség esetén a kezdeti ciklu- 50 sokban levő alacsony DNS-polimeráz-aktivitás pótlása céljából növelhető. Az amplifikációs ciklusszám változtatásának az amplifikációra kifejtett hatását a példákban mutatjuk be.
A találmányunk szerinti eljárás előnye, hogy a reak- 55 cióelegyet a kezdeti elkészítés után nem kell manipulálni. A találmányunk szerinti módszerek automatizált amplifikációs rendszerek és in situ amplifikációs módszerek esetében ideális megoldást képeznek, mikor is a reagenseknek a kezdeti denaturálási lépés után történő 60 hozzáadása vagy viaszgátak alkalmazása kényelmetlen és gyakorlati szempontból kedvezőtlen lenne.
A találmányunk szerinti eljárás különösen PCR esetében alkalmas a nemspecifikus amplifikáció csökkentésére. Találmányunkat azonban semmiképpen sem korlátozzuk bizonyos meghatározott amplifikációs rendszerekre. A találmányunk szerinti reverzibilisen inaktivált enzimeket bármely olyan primeralapú amplifikációs rendszerben alkalmazhatjuk, amelynél hővel szemben stabil enzimeket használnunk fel és az amplifikáció specifikusságának biztosítása a reakció-hőmérsékleten alapul. A találmányunk szerinti módszerek hővel szemben stabil enzimeket felhasználó izoterm amplifikációs rendszerek esetében alkalmazhatók. Az enzimaktivitás visszanyeréséhez csupán magasabb hőmérsékleten végzett átmeneti inkubálásra van szükség. Miután a reakcióelegyet az enzimaktivitás visszanyerése céljából magasabb hőmérsékleten végzett inkubálásnak vetettük alá, a reakciót megfelelő reakció-hőmérsékleten folytatjuk.
A PCR (4 683 195, 4 683 202 és 4 965 188 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) mellett alkalmazható más amplifikációs módszerek az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: Ligásé Chain Reaction (LCR, Wu és Wallace, Genomics 4: 560-569 (1989) és Bárány, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
189-193 (1991); Polymerase Ligásé Chain Reaction (Bárány, PCR Methods és Applic. 1, 5-16 (1991);
Gap-LCR (PCT közrebocsátási irat WO 90/01069);
Repair Chain Reaction 439,182 A2 számú európai közrebocsátási irat); 3SR (Kwoh és társai, Proc. Nad. Acad.1 Sci. USA 86, 1173-1177 (1989); Guatelli és társai?
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990);
PCT közrebocsátási hat WO 92/08800), és NASBA 5,130,238 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Találmányunkat nem korlátozzuk meghatározott amplifikációs rendszerekre. További kifejlesztésre kerülő módszerek is alkalmazhatók. Az amplifikációs rendszerek összefoglalását nemrégen Abramson és Myers hozta nyilvánosságra: Current Opinion in Biotechnology 4, 41-47 (1993).
Az irodalomban mindegyik amplifikációs reakció számára alkalmas mintakészítési módszereket utak le (lásd például Sambrook és társai, supra, és az amplifikációs módszereket leíró fenti irodalmi helyek). Célszekvenciák PCR-amplifikációja számára egyszerű és gyors mintakészítési módszereket az alábbi irodalmi helyeken ismertettek: Higuchi, 1989, PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York), és PCRjegyzőkönyvek 18-20 fejezet. (Innis és társai, ed.,
Academic Press, 1990). A megfelelő protokoll kiválasztása és empirikus optimalizálása a szakember kötelező tudásához tartozik.
Amplifikált termékek kimutatására szolgáló módszereket az irodalomban széleskörűen leírtak. A standard módszerek közé tartozik a gélelektroforézissel történő elemzés vagy az oligonukleotid mintákkal végrehajtott hibridizáció. A minták és az amplifikált nukleinsav kö- g zött képződő hibridek kimutatását többféleképpen végezhetjük el, például dot-blot teszt és fordított dot-blot teszt ' segítségével [Saiki és társai, Natúré 324, 163-166
.......
HU 221 750 Bl (1986); Saiki és társai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230 (1989); WO 89/11548 számú nemzetközi közrebocsátási irat; 5 008 182 és 5 176 775 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; PCR-jegyzőkönyv: A Guide to Methods and Applications (ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA), 337-347], Mikromélyedéses lemezeket felhasználó fordított dot-blot módszereket az alábbi irodalmi helyeken írtak le: függő 141 355 számú USA szabadalmi bejelentés, amely az EP-A-420260 számú európai közrebocsátási iratnak felel meg; 5 232 829 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás; Loeffelholz és társai,
J. Clin. Microbiol. 30 (11), 2847-2851 (1992); Mulder és társai, J. Clin. Microbiol. 32 (2), 292-300 (1994); és Jackson és társai, AIDS 5,1463-1467 (1991).
További megfelelő tesztmódszert - 5’-nukleázteszt néven ismert - az 5 210 015 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, valamint Holland és társai közleményében [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276-7280 (1991)] írtak le. Az 5’-nukleázteszt során jelzett mintákat DNS-polimeráz (például Taq DNS-polimeráz) 5’-3’-exonukleáz-aktivitás által végzett primer kiterjesztésével együtt lebontanak. A minták lebontott termékeinek kimutatása egyrészről azt jelzi, hogy a minta- és a cél-DNS közötti hibridizáció lejátszódott, másrészről az amplifikációs reakció bekövetkeztére utal. Az 5 491 063 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a 699 768 számú európai közrebocsátási iratnak felel meg) és a 713 921 számú európai közrebocsátási iratban a mintának az amplifikációval együtt lejátszódó lebontását kimutató javított módszerek kerültek ismertetésre.
Alternatív módon a nukleinsavamplifikáció oly módon mutatható ki, hogy a kettős szálú DNS teljes mennyiségének növekedését a reakcióelegyben nyomon követjük. Ezek a módszerek az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: Bio/Technology 10, 413-417 (1992); Higuchi és társai, Bio/Technology 11, 1026-1030 (1993), valamint a 487 218 és 512 334 számú európai közrebocsátási irat. A kettős szálú DNS kimutatása ethidium-bromid (EtBr) és a DNS-hez kötődő más jelzett anyagok által a kettős szálú DNS-hez való kötődéskor kibocsátott megnövekedett fluoreszcencián alapul. A célszekvencia-szintéziséből származó kettős szálú DNS-növekedés a fluoreszcencia kimutatható növekedését idézi elő. E rendszer azzal a hátránnyal jár, hogy a nem célszekvencia (azaz a nemspecifikus amplifikáció) fluoreszcencianövekedést okoz, amely a célszekvencia-szintézisből származó fluoreszcencianövekedés mérését zavarja. Ennek megfelelően a találmányunk szerinti módszer különösen előnyös és eredményesen alkalmazható, mivel a nemspecifikus amplifikációt csökkenti és ezáltal a nem célszekvenciák amplifikációjából származó fluoreszcencianövekedést minimális értékre csökkenti.
Találmányunk továbbá a találmány szerinti módszer kivitelezésére alkalmas kitre, multikonténerre és komponensekre vonatkozik. A kit előnyös kiviteli alakja valamely reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzimet, az amplifikációs reakció végrehajtására szolgáló egy vagy több reagenst (például oligonukleotid primerek, szubsztrátum nukleozid trifoszfátok, kofaktorok) és megfelelő puffért tartalmaz.
Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Találmányunknak az igénypontok oltalmi körén belül eső, a példák kitanítását követő számos kiviteli alakja a szakember számára a jelen szabadalmi leirás és a példák alapján nyilvánvaló, és ezek a megoldások is találmányunk tárgyát képezik.
1. példa
Polimerázaktivitás meghatározása
A példákban leírt valamennyi DNS-polimerázaktivitás-mérést az alábbi DNS-polimeráz-aktivitásteszt segítségével végezzük el. A tesztet lényegében a Lawyer és társai [J. Bioi. Chem. 264 6427-6437 (1989)] által leírt módon, valamint az AmpliTaq® DNSpolimeráz tennék inzert (Perkin Elmer, Norwalk, CT) figyelembevételével hajtjuk végre. Mindkét citátum hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
A definíció szerint 1 enzimaktivitás-egység az a mennyiség, amely 10 nmol dNTP-t savban oldhatatlan* anyagba 30 perc alatt 74 °C-on végzett 10 perces inkubálás alatt beépít. A módosított enzimek labilitása miatt... az aktivitásokat 50 °C-on méijük, és a 74 °C-on is meghatározott standard Taq DNS-polimeráz-oldathoz normalizáljuk. A reakciókat az alábbi reagenseket tar- j talmazó 50 μΐ térfogatban végezzük el. ' i mM TAPS [trisz(hidroxi-metil)-metil-amino-pro- f pánszulfonsav-nátriumsó] pH 9,3 (szobahőmérséklet); N- t mM kálium-klorid; J mM magnézium-klorid;
mM beta-merkapto-etanol;
200-200 μΜ dATP, dGTP és dTTP;
100 μΜ [a-32P]-dCTP (0,05-0,1 Ci/nmol);
aktivált lazacsperma-DNS. f
2. példa
Taq DNS-polimeráz citrakonilezése
Ebben a példában Taq DNS-polimeráz citrakonsavanhidrid felhasználásával történő módosítását újuk le.
A citrakonilezett Taq DNS-polimeráz-aktivitást a 3. példában leirt módon méijük; ez az aktivitás az inaktiválási reakcióban a DNS-polimeráz-aktivitás teljes inaktiválásához szükséges módosítóreagens:enzim mólarányt jelzi.
A Taq DNS-polimerázt (AmpliTaq®, Peikin Elmer,
Norwalk CT) 1,3 mg/ml kiinduló koncentrációban al- r kalmazzuk. A kiinduló kísérletekben a Taq DNS-polimerázt először 1000-szeres fölöslegben alkalmazott
0,1 M nátrium-boráttal (pH 8,63) szemben dializáljuk.
Azt találtuk, hogy ez a lépés a későbbi kísérletekben nem döntő jelentőségű. A Taq DNS-polimerázt triszpufferben (50 mM trisz-HCl, 1 mM EDTA, 65 mM
KCI, pH 7,5) közvetlenül, nátrium-boráttal szemben történő dialízis nélkül alkalmazzuk. g
A citrakonsavanhidridet (11,06 M) kereskedelmi forgalomban szereztük be (Aldrich, Milwaukee, WI). r
A citrakonsavanhidrid kiinduló oldatát oly módon ké10
HU 221 750 BI szítjük el, hogy 11,06 M citrakonsavanhidridet N,Ndimetil-formamiddal 100-szorosra hígítunk.
A módosító reakciók egyik csoportjában citrakonsavanhidridoldatot készítünk, dimetil-formamidos kétszeres hígítások megismétlése útján. A sorozat minden 5 oldata esetében 4 μΐ hígított citrakonsavanhidridet 400 μΐ Taq DNS-polimeráz-oldathoz adunk (nátriumborátos dialízissel); az ily módon kapott oldatokban a citrakonsavanhidrid: Taq DNS-polimeráz mólarány kb.
80:1, 40:1, 20:1 és 10:1. Az oldatokat egy éjjelen át 10 4 °C-on a Taq DNS-polimeráz inaktiválása céljából inkubáljuk. A módosítóreagens N-szeres moláris fölöslegével végzett reakcióval módosított enzimet a továbbiakban „NX enzim”-nek nevezzük. Ennek megfelelően a kapott citrakonilezett Taq DNS-polimerázok jelö- 15 lése a továbbiakban a következő: 80X, 40X, 20X és 10X Taq DNS-polimeráz.
További módosító reakciókat végzünk citrakonsavanhidridzTaq DNS-polimeráz (nátrium-borátos dialízis nélkül)=kb. 80X, 160X és 240X mólarány mellett. 20 A 160X és 240X mólarányt a 11,06 M citrakonsavanhidrid Ν,Ν-dimetil-fonnamidos kiinduló hígítás megfelelő beállításával alakítjuk ki. így például a 160X végső mólarány esetében 11,06 M citrakonsavanhidridet dimetil-formamidban 1:50 arányban hígítunk és a ka- 25 pott kiinduló citrakonsavanhidridoldat 4 μΐ térfogatát 400 μΐ Taq DNS-polimeráz-oldathoz adjuk. A kapott citrakonilezett Taq DNS-polimerázok jelölése a továbbiakban a következő: 240X, 160X és 80X Taq DNS-polimeráz. 30
3. példa
DNS-polimeráz-aktivitás inaktiválása és hővel történő visszanyerése citrakonsavanhidridfelhasználásával 35
Ebben a példában a 2. példa szerinti citrakonilezett
Taq DNS-polimerázok aktivitásának mérését újuk le, a citrakonilezett Taq DNS-polimeráz hővel végzett inkubálással történő újraaktiválása előtt és után. A pH-nak a citrakonilezett Taq DNS-polimeráz hővel történő újra- 40 aktiválása után visszanyert aktivitására kifejtett hatását mérjük.
Citrakonilezett Taq DNS-polimeráz-mintákat az alábbi komponensekből álló pufferben 1:200 arányban hígítunk: 10 mM trisz-HCl, 100 mM kálium-klorid, 45 2 mM magnézium-klorid, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40,16% glicerin. A puffer pH-értéke szobahőmérsékleten 8,25. A citrakonilezett Taq DNS-polimeráz hígított mintáit 90 °C-on 20 percen át inkubáljuk vagy kontrollként szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A keze- 50 lés után a mintákat enzim hígítás pufferben (25 mM trisz-HCl, 50 mM kálium-klorid, 1 mM beta-merkaptoetanol, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40, 0,1% zselatin)
1:5 arányban hígítjuk, és az aktivitást az 1. példában leírt módon mérjük. A kezelés után meghatározott DNS- 55 polimeráz-aktivitásokat az alábbiakban tüntetjük fel.
A mólarány a módosító reakcióban felhasznált citrakonsavanhidrid: Taq DNS-polimeráz mólarányra utal. Minden megadott aktivitás két mintán mért aktivitási érték átlaga. 60
Aktivitás (kontroll %-a)
| Mólarány | Melegítés nélkül | 90 °C-on végzett inkubálás |
| Kontroll | 100 | |
| 80X | 0 | 16 |
| 40X | 0 | 28 |
| 20X | 3,7 | 38 |
| 10X | 38 | 63 |
A Taq DNS-polimeráz teljes inaktiválása 20-szorosnál nagyobb citrakonsavanhidridfölösleg felhasználásával érhető el. A teljesen inaktivált Taq DNS-polimeráz 90 °C-on 20 percen át történő inkubálásakor az aktivitás legalább 16%-át nyerjük vissza.
Bár 40X citrakonilezett DNS-polimeráz felhasználásakor több enzimaktivitást nyerünk vissza, mint 80X citrakonilezett Taq DNS-polimeráz esetében, a kereskedelmi kitben a nagyobb gyártási tűrés miatt előnyösen 80X (vagy magasabb) citrakonilezett Taq DNS-polimerázt használhatunk.
Hasonló kísérleteket végzünk el szobahőmérsékleten pH 7,75 értékre beállított puffer felhasználásával» Az eredményeket az alábbiakban ismertetjük.
Aktivitás (kontroll %-a)
| Mólarány | Melegítés nélkül | 90 °C-on végzett ; inkubálás |
| Kontroll | 100 | * |
| 80X | 0 | 61 s s |
| 40X | 0 | 67 |
| 20X | 3,5 | 70 |
| 10X | 35 | 77 |
Alacsonyabb pH-értéken nagyobb mennyiségű DNS-polimeráz-aktivitás nyerhető vissza.
A 80X és 160X Taq DNS-polimerázok (nátriumborátos dialízis nélkül) aktivitását hővel történő inkubálással végzett újraaktiválás előtt és után lényegében a korábbiakban leüt módon méljük. Az inkubálásokhoz felhasznált puffer pH-értéke szobahőmérsékleten 8,0. A kapott eredményeket az alábbiakban ismertetjük. Minden megadott aktivitás két mintán mért aktivitási érték átlaga.
Aktivitás (kontroll %-a)
| Mólarány | Melegítés nélkül | 90 °C-on végzett inkubálás |
| Kontroll | 100 | |
| 160X | 0 | 19 |
| 80X | 0 | 29 |
A pH-nak az újraaktiválásra gyakorolt hatását oly módon is megvizsgálhatjuk, hogy három különböző
HU 221 750 Bl pH-értéken újraaktivált 80X Taq DNS-polimeráz visszanyert aktivitását összehasonlítjuk. A fenti adatok azt mutatják, hogy az enzimaktivitás még abban az esetben is visszanyerhető, ha a módosítási reakcióban a módosítóreagenst nagy moláris feleslegben alkal- 5 mázzuk.
4. példa
PCR-amplifikáciő citrakonilezett Taq DNS-polimerázokfelhasználásával 10
Ebben a példában a 2. példában leírt citrakonilezett
Taq hőre stabil DNS-polimeráznak PCR-amplifikációkban történő felhasználását ismertetjük. PCR-jegyzőkönyv
Az amplifikációkat 240X módosított Taq DNS-poli- 15 meráz 1:20, 1:40 és 1:80 hígításainak (2. példa) felhasználásával végezzük el. A hígításokat az alábbi komponensekből álló pufferben végezzük el: 20 mM triszHC1, pH 8,0 (szobahőmérsékleten) 100 mM KC1,
0,1 mM EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), 1 mM 20 DTT (ditiotreit), 50% glicerin, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40 (AmpliTaq® tárolópuffer, Perkin Elmer, Norwalk, CT). Összehasonlítás céljából amplifikációkat módosítatlan Taq DNS-polimeráz 1:10, 1:20,
1:40 és 1:80 hígításaival is elvégzünk. 25
Egy klónozott HTLV-I genom szekvenciát az SK 432 és SK 111 primerek felhasználásával amplifikálunk. A primer szekvenciák az 5 418 149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kerültek ismertetésre; ez a szabadalmi leírás hivatkozásként a je- 30 len szabadalmi leírás részét képezi. A pCR-t 100 μΐ reakció-térfogatban az alábbi reakciókörülmények között végezzük el.
Reakcióelegy
HTLV -1 DNS templát kópia 35 mM trisz. pH 8,3 50 mM kálium-klorid 0,5-0,5 μΜ mindegyik primerből
200 μΜ dATP, dCTP és dGTP
400 μΜ dUTP 40
0,5 μΐ citrakonilezett Taq DNS-polimeráz-oldat 2,5 mM magnézium-klorid ng hpDNS egység UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
Termikus ciklusprofil
| Reakció előtti inkubálás | (90 °C, 10 percen át) | |
| 2 ciklus | denaturálás | 98 °C, 1 percen át |
| gyűrübezárás/ki- terjesztés | 60 °C, 2 percen át | |
| 38 ciklus | denaturálás | 94 °C, 1 percen át |
| gyűrőbezárás/ki- teijesztés | 60 °C, 1 percen át | |
| Végső inkubálás | 60 °C, 7 percen át. |
Az amplifikált termékeket 4% agaróz gélelektroforézissel elemezzük; mozgó pufferként IX TBE-t (0,089 M Trisz, 0,089 M bórsav, 0,0025 M dinátrium- 60
EDTA) alkalmazunk Az elektroforézist 100 volt mellett kb. 2 órán át végezzük. A jelen levő DNS megfestése céljából elektroforézis után ethidium-bromidot (0,5 pg/ml) adunk hozzá. A gélről a színezéket IX TBE-ben eltávolítjuk és az ethidium-bromid által megfestett DNS-sávokat UV-besugárzás segítségével vizuálisan értékeljük.
Eredmények
Az eredményeket a 2. ábrán tüntetjük fel. Az amplifikált célszekvenciának megfelelő sávot megjelöltük. A gélen jelentkező, az amplifikált célszekvenciától eltérő sávok a nem célszekvenciák nemspecifikus amplifikációja által képezett termékeknek felelnek meg. A citrakonilezett Taq DNS-polimeráz (jelzett Taq HS) felhasználásával végzett amplifikáció hatása oly módon állapítható meg, hogy a sávokat és az intenzitást minden mezőn belül összehasonlítjuk. Minthogy a nemspecifikus termékek amplifikációja a célszekvencia amplifikációjával versenyez, a célszekvencia amplifikációjának növekedése a nemspecifikus amplifikáció csökkenésének mértékét jelzi. Ennek megfelelően a termékek relatív mennyiségének változása minden egyes mezőn belül a legjobban jelzi a reakció előtti kezeléseknek a nemspecifikus amplifikációra kifejtett hatását
Módosítatlan Taq DNS-polimeráz felhasználásával végzett amplifikációk túlnyomórészt nemspecifikus amplifikációs termékhez vezetnek. Citrakonilezett TAq DNS-polimeráz felhasználása esetén az amplifikált ; célszekvenciának megfelelő sáv intenzitása szignifikánsan növekedik, és a nemspecifikus amplifikációs termé-keknek megfelelő sávok intenzitása szignifikánsan^ csökken. A kapott adatok azt mutatják, hogy reverzibili-sen inaktivált DNS-polimeráz felhasználásával végzett; PCR-amplifikáció esetén a nemspecifikus amplifikáció szignifikáns mértékben csökken és a kívánt amplifikált célszekvencia mennyisége szignifikáns mértékben emelkedik.
5. példa
Más citrakonilezett, hővel szemben stabil DNS-polimerázok
Ebben a példában a fentiekben leírt Taq DNS-polimeráztól eltérő számos más, hővel szemben stabil DNS-polimeráz citrakonilezését újuk le. Az alábbi hővel szemben stabil DNS-polimerázokat módosítjuk:
1) Thermus thermophilusból (rTth, Perkin Elmer,
Norwalk, CT) származó hővel szemben stabil DNSpolimeráz; a WO 91/09950 számú nemzetközi közrebocsátási iratban írták le; ez az irodalmi hely hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
2) Thermatoga maritimaból (UITmaR, Perkin Elmer,
Norwalk, CT) származó hővel szemben stabil DNSpolimeráz mutáns; a WO 92/03556, számú nemzetközi közrebocsátási iratban írták le; ez az irodalmi hely hivatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi.
3) Thermus aquaticusból származó, 3’-5’ exonukleáz hiányos, hővel szemben stabil DNS-polimeráz mutáns formája; a WO 92/06200 számú nemzetközi közrebocsátási iratban írták le; ez az irodalmi hely hi12
HU 221 750 Bl vatkozásként a jelen szabadalmi leírás részét képezi. Ezen enzim jelölése: Taq CS vagy AmpliTaq* CS. Mindhárom fenti DNS-polimeráz esetében a kiindulási oldat hozzávetőleges koncentrációja kb. 200 egység μΐ. Összehasonlítás céljából: 1,3 mg/ml Taq DNSpolimeráz, az előző példákban leirt felhasználás szerint, kb. 260 egység/μΐ értékkel egyenértékű. Minden DNS-polimerázt lényegében a 2. példában leírt módon módosítunk. 10 μΐ citrakonsavanhidridet 500 μΐ dimetil-formamidban hígítunk. Ezután 10 μΐ hígított citrakonsavanhidridet az egyes enzimoldatok 1000-1000 μΐ részletével elegyítünk. A kapott oldatokat 4 °C-on órán át inkubáljuk.
6. példa
PCR-amplifikáció citrakonilezett DNS-polimerázok felhasználásával
Ebben a példában a 2. és 5. példában leirt citrakonilezett, hővel szemben stabil DNS-polimerázoknak PCRamplifikációkban történő felhasználását újuk le. PCR-jegyzőkönyv
Az amplifikációkat módosított DNS-polimerázok hígításainak felhasználásával végezzük el. A hígításokat az alábbi komponensekből álló pufferben hajtjuk végre: 20 mM Trisz-HCl, pH 8,0 (szobahőmérsékleten) 100 mM kálium-klorid, 0,1 mM EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav), 1 mM DTT (ditiotreit), 50% glicerin, 0,5% TweenR20,0,5% Nonidet P40 (AmpliTaq® tárolópuffer, Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Egy HIV-1 genomszekvenciát az SK 145 és SK 431 primer felhasználásával amplifikálunk (Perkin Elmer Norwalk, CT). Az SK 145 és SK 431 primer az 5 481 149 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az alábbi tudományos közleményekben került ismertetésre: SK 145: Kwok és társai, Nucleic Acids Rés. 18, 9991005 (1990); SK 431: Jackson és társai, AIDS 5, 1463-1467 (1991). A PCR-t 100 μΐ reakció-térfogatban az alábbi reakciókörülmények mellett végezzük el.
Reakcióelegy
100 HIV-1 DNS templát kópia 10 mM Trisz, pH 8,3 50 mM kálium-klorid 0,5-0,5 μΜ mindegyik primerből
200 μΜ dATP, dCTP és dGTP 400pMdUTP
0,5 μΐ DNS-polimeráz-oldat 2,5 mM magnézium-klorid 1 μg hpDNS egység UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
Termikus ciklusprofil
| Reakció előtti inkubálás | (95 °C, 12 percen át) | |
| 38 ciklus | denaturálás | 94 °C, 1 percen át |
| gyűrűbezárás/ki- terjesztés | 60 °C, 1 percen át | |
| Végső inkubálás | 60 °C, 7 percen át. |
A reakció előtti inkubációs lépés kezdeti denaturálási lépésként is szolgál. A kezdeti denaturálási lépést rutinszerűen alkalmazzuk tipikus amplifikációs reakciókban, a kettős szálú céltarget teljes denaturálásának biztosítása céljából. Minden PCR-ciklus egy 94 °C-on végzett 1 perces denaturálási lépéssel kezdődik. így azonnal a kezdeti 95 °C-on 12 percen át végzett kezdeti reakció előtti inkubálás után a reakcióelegyet az első ciklus denaturálási lépése alatt 94 °C 1 percen át inkubáljuk.
Az amplifíkált termékeket agaróz gélelektroforézissel (100 ml 3% NuSieve® és 0,5% SeaChem*) elemezzük, mozgó pufferként IX TBE (0,089 M Trisz,
0,089 M bórsav, 0,0025 dinátrium-EDTA) felhasználásával. Az elektroforézist 100 volt mellett kb. 1 órán át végezzük. Elektroforézis után a jelen levő DNS megfestése céljából ethidium-bromidot (0,5 pg/ml) adunk hozzá. A gélből a festéket TBE-ben eltávolítjuk és az ethidium-bromiddal megfestett DNS-sávokat UV-besugárzás felhasználásával vizuálisan értékeljük.
Citrakonilezett DNS-polimerázok felhasználásával végzett amplifikációk
HIV-1 nukleínsavamplifikációjánál citrakonilezett DNS-polimerázok 1:10, 1:20, 1:40 és 1:80 hígításait (5. példa) és 240X citrakonilezett Taq DNS-polimerázt i (2. példa) alkalmazunk és az amplifíkált termékeket» agaróz gélelektroforézissel elemezzük, összehasonlítás <
céljából amplifikációkat módosítatlan Taq DNS-poli- i meráz felhasználásával is végrehajtunk. +Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Az ampli- i fikáit célszekvenciának megfelelő sávot megjelöltüké t
A gélen az amplifíkált célszekvenciának megfelelő sáv-* j tói eltérő sávok a nem célszekvenciák nemspecifikus + amplifikációja által képezett termékeknek felelnek' meg. A citrakonilezett DNS-polimeráz felhasználásával végzett amplifikáció hatása oly módon állapítható meg, hogy a sávokat és az intenzitást minden mezőn be- r lül összehasonlítjuk. Minthogy a nemspecifikus termékek amplifikációja a célszekvencia amplifikációjával versenyez, a célszekvencia amplifikációjának növekedése a nemspecifikus amplifikáció mértékének csökkenését jelzi. Ennek megfelelően a termékek relatív mennyisége minden sávon belül a legjobban jelzi a reakció előtt végzett kezeléseknek a nemspecifikus amplifikációra kifejtett hatását
Módositadan Taq DNS-polimerázzal végzett amplifikációk az enzim hígítást szintjein túlnyomórészt nemspecifikus amplifikációs terméket eredményeznek.
Citrakonilezett Taq DNS-polimeráz alkalmazása esetén - az 1:80 hígítás kivételével valamennyi hígításban az amplifíkált célszekvenciának megfelelő intenzív sáv jelentkezik, és a nemspecifikus amplifikációs termékeknek megfelelő sáv intenzitása szignifikánsan csökken.
Az adatok szerint reverzibilisen inaktivált DNS-polimeráz felhasználásával végzett PCR-amplifikáció a nemspecifikus amplifikációt szignifikáns mértékben csők- 1 kenti és a kívánt amplifíkált célszekvencia mennyiségét g szignifikáns mértékben növeli.
Citrakonilezett UITma, Taq CS, és rTth DNS-poli- r~ merázok alkalmazása esetén nagyobb mennyiségű spe13
HU 221 750 Bl cifikus amplifikációs termék keletkezik, mint a nem módosított Taq DNS-polimerázzal végrehajtott amplifikációk során, és ezzel egyidejűleg a nemspecifikus amplifikációs termék mennyisége is csökken. Az eredmények bizonyiják, hogy a találmányunk szerinti eljá- 5 rás hővel szemben stabil DNS-polimerázok esetében általánosan alkalmazható.
Megjegyezzük, hogy bár az eredmények a jelen találmány funkcionalitását bizonyítják, a citrakonilezett Taq, UITma, Taq CS, és rTth DNS-polimerázok fel- 10 használásakor kapott eredmények közvetlenül nem hasonlíthatók össze, minthogy a módosítási körülményeket összehasonlító módon nem optimalizáltuk minden egyes DNS-polimeráz esetében. Különösen arra hívjuk fel a figyelmet, hogy bár minden kezdeti DNS-polime- 15 ráz-oldat egység/ml értéke azonos, az oldatok molaritását nem határoztuk meg, és ezért a citrakonsavanhidrid moláris fölöslegét nem állapítottuk meg minden módosítási reakciónál. Az optimális módosítási körülményeknek a megadott jegyzőkönyvek felhasználásával történő empirikus meghatározása a szakember kötelező tudásához tartozik.
Aktivitás (kontroll %-a)
| Mólarány | Melegítés nélkül | 90 °C-on végzett inkubálás |
| Kontroll | 100 | |
| 180X | 0 | 50 |
| 90X | 3 | 118 |
A fenti eredményeket a 3. példa során nyert adatokkal összehasonlítva megállapítható, hogy a ciszakonitelezés könnyebben visszafordítható, mint a citrakonilezés. A DNS-polimeráz teljes inaktiváláshoz a cisz-akonitsavanhidrid nagyobb moláris fölöslegére van szükség, és a magas hőmérsékleten végzett inkubálás során több aktivitást nyerünk vissza. A 90-szeres moláris fölöslegben alkalmazott cisz-akonitsavanhidriddel történő módosítás esetén a hővel végzett újraaktiválás után azt találtuk, hogy az aktivitás 100%-nál na20 gyobb; ennek okát nem isméjük, azonban feltehetően az aktivitásmérés pontatlansága okozza vagy a DNS-polimeráz tényleges módosítását tükrözi vissza.
7. példa
Cisz-akonitelezett DNS-polimeráz 25
Ebben a példában Taq DNS-polimeráznak ciszakonitsavanhidriddel történő módosítását újuk le.
A módosítást cisz-akonitsavanhidrid felhasználásával, lényegében a 2. példában leírtak szerint végezzük el, azzal a változtatással, hogy a cisz-akonitsavanhidrid 30 nem folyadék, hanem por alakjában kerül forgalomba.
Taq DNS-polimerázt (AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk CT) trisz-pufferben (50 mM trisz-HCl, 1 mM EDTA, 68 mM HCI, pH 7,5) 1,3 mg/ml kiindulási koncentrációban alkalmazunk. A cisz-akonitsavanhidrid ki- 35 indulási oldatát (Aldrich, Milwaukee, WI) oly módon készítjük el, hogy 20 mg cisz-akonitsavanhidridet 1 ml 100%-os etanolban oldunk.
1000 μΐ Taq DNS-polimeráz-oldathoz 10 vagy 20 μΐ cisz-akonitsavanhidrid-oldatot adunk; a kapott ol- 40 datokban a cisz-akonitsavanhidrid:Taq DNS-polimeráz mólarány kb. 90:1 és 180:1. Az oldatokat a Taq DNS-polimeráz inaktiválása céljából egy éjjelen át 4 °C-on inkubáljuk.
A cisz-akonitelezett Taq DNS-polimeráz és citrakonilezett Taq DNS-polimeráz felhasználásával végzett amplifikációkat az alábbiakban hasonlítjuk össze:
8. példa
DNS-polimeráz-aktivitás inaktiválása és hővel történő visszanyerése, cisz-akonitsavanhidrid felhasználásával
A 7. példa szerint készített 90X és 180X ciszakonitelezett Taq DNS-polimerázok aktivitását, hővel történő inkubálással végzett újraaktiválás előtt és után, lényegében a 3. példában leüt módon méjük. A puffer pH-értéke inkubálás alatt 8,0. Az eredményeket az alábbiakban ismertetjük. Minden megadott aktivitás két mintán mért aktivitásérték átlagának felel meg.
9. példa
Reakció előtt végzett inkubáció időtartamának hatása
Ebben a példában a reakció előtt végzett inkubáció időtartamának a kapott termék mennyiségére kifejtett; hatását mutatjuk be. ·
Az amplifikációkat a fentiekben leírt módon előállt-» tott citrakonilezett és cisz-akonitelezett Taq DNS-poli-! merázok felhasználásával végezzük el. Minden amplifikációs kísérletnél a Taq DNS-polimerázok módosítására a citrakonsavanhidridet 80-szoros és 160-szoros moláris fölöslegben, mig a cisz-akonitsavanhidridet 90szeres és 180-szoros moláris fölöslegben alkalmazzuk. A amplifikációkat a 6. példában leüt HIV-1 modellrendszer felhasználásával végezzük el, azzal a változtatással, hogy a kezdeti reakció előtti inkubálást változtattuk. Minden egyes enzimkészítmény esetében az amplifikációknál 12,6,3 és 0 perces reakció előtti inkubációt hajtunk végre.
A reakció előtti inkubációs lépés - mint már említettük - kezdeti denaturáló lépésként is szolgál. Min45 den PCR-ciklus egy denaturáló lépéssel kezdődik. A 95 °C-on 12, 6, 3 vagy 0 percen át végzett kezdeti reakció előtti inkubálás után azonnal minden reakcióelegyet az első ciklus denaturáló lépése alatt 94 °C-on 1 percen át inkubálunk. így φζ enzimaktivitást a kezdeti 50 ciklusok denaturáló lépése alatt akkor is visszanyejük, ha a reakció előtti inkubálást nem alkalmazzuk.
Az amplifikációs termékeket agaróz gélelektroforézissel elemezzük. Az eredményeket a 4. ábrán tüntetjük fel. Az amplifikált célszekvenciának megfelelő sávot 55 megjelöltük. A gélben megjelenő, az amplifikált célszekvenciának megfelelő sávtól eltérő sávok a nem célszekvenciák nemspecifikus amplifikációja által képezett termékeknek felelnek meg.
Az eredmények azt mutatják, hogy cisz-akonite60 lezett DNS-polimeráz felhasználása esetén valamennyi
HU 221 750 Bl időtartamon át végzett reakció előtti inkubálás az amplifikált terméknek megfelelő erős sávot eredményez. A reakció előtti inkubálás nélkül végrehajtott amplifikációk közel annyi terméket eredményeznek, mint a hosszabb reakció előtti inkubálások felhasználásával végzett amplifikációk.
Ezzel szemben a kapott eredmények szerint citrakonilezett DNS-polimeráz felhasználása esetén az amplifikált tennék maximális mennyiségének kinyeréséhez legalább 3 perc reakció előtti inkubálásra van szükség. A reakció előtti inkubálás nélkül végzett amplifikáció esetén lényegesen kevesebb amplifikált terméket kapunk. Az eredmények azt mutatják, hogy a cisz-akonitelezett DNS-polimerázok aktivitása gyorsabban nyerhető vissza, mint a citrakonilezett DNS-polimerázoké.
10. példa
A ciklusszám hatása
Ebben a példában a rövid reakció előtti inkubációs idő kiegyenlítése céljából végzett amplifikációs ciklusszámemelés hatását mutatjuk be.
Az amplifikációknál felhasznált Taq DNS-polimerázokat 80-szoros és 160-szoros moláris fölöslegben alkalmazott citrakonsavanhidriddel, valamint 90-szeres és 180-szoros moláris fölöslegben alkalmazott cisz-akonitsavanhidriddel módosítjuk. Az amplifikációkat lényegében a 6. példában leírt HIV-1 modellrendszer alkalmazásával végezzük el, azzal a változtatással, hogy a reakció előtti kezdeti inkubációt és a ciklusszámot változtatjuk. Az amplifikációkat minden enzimkészítmény esetében az alábbi körülmények között végezzük el.
Reakció előtti inkubálás Amplifikációs ciklusok perc, 80 °C 60
60
48
43
39
Az amplifikációs termékeket agaróz gélelektroforézissel elemezzük. Az eredményeket az 5. ábrán tüntetjük fel. Az eredmények azt mutatják, hogy az amplifikációs ciklusszám növelése kiegyenlítheti azt az amplifikációs hatékonyságveszteséget, amely a reakció előtti inkubálás elhagyása esetén a DNS-polimeráz-aktivitás nem teljes újraaktiválásából keletkezett.
Minden DNS-polimeráz esetében az amplifikációs ciklusszám emelése az amplifikált termék mennyiségének növekedését eredményezi. Ez a hatás ciszakonitelezett Taq DNS-polimeráz felhasználása esetén a legkisebb 0ásd 9. példa); ilyenkor reakció előtti inkubálásra nem, vagy csak kismértékben van szükség.
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. DNS-polimeráz-aktivitással vagy ligázaktivitással rendelkező, kémiai módosítással reverzibilisen inaktivált, hővel szemben stabil enzim, amelyet valamely hővel szemben stabil enzim és valamely módosítóreagens elegyének reakciójával állítunk elő; mi mellett a reakciót lúgos pH-értéken, kb. 25 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végezzük el; reagensként valamely (I) általános képletű (mely képletben Rj és R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben összekapcsolódó szerves csoportok) vagy valamely (Π) általános képletű (mely képletben Rt és R2 jelentése előnyösen összekapcsolódó szerves csoportok és a hidrogénatomok ciszállásúak) dikarbonsavanhidridet alkalmazunk; és a reakciót az enzimaktivitás lényegében teljes inaktiválódásáig végezzük el.
- 2. Az 1. igénypont szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek vizes pufferben, lúgos pH-értéken, kb. 25 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten végzett inkubálása eredményeként az enzimaktivitás kb. 20 percnél rövidebb idő alatt szignifikánsan nem növekedik, és amelynek a kb. 8-9 pH értékű, 25 °C hőmérsékleten elkészített vizes pufferben kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten végzett inkubálása eredményeként az enzimaktivitás kb. 20 percnél rövidebb idő alatt legalább a kétszeresére nő.
- 3. Az 1. igénypont szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek az enzimaktivitása hővel szemben stabil DNS-polimeráz-aktivitás, mimellett a hővel szemben stabil DNS-polimeráz valamely, a Thermus aquaticus, Thermus thermophilus vagy Thermotoga maritima genushoz tartozó speciesből leszármaztatott, reverzibilisen inaktivált forma.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek · az előállításánál módosító ágensként maleinsavanhidri** det, exo-cisz-3,6-endoxo-A4-tetrahidroftálsavanhidri- < det, citrakonsavanhidridet, 3,4,5,6-tetrahidroftálsavanhidridet, cisz-akonitsavanhidridet vagy 2,3-dimetil-maleinsavanhidridet alkalmazunk.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek az előállításánál a módosítóreagenst a hővel szemben stabil enzimhez viszonyítva több mint 20-szoros moláris fölöslegben alkalmazzuk.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek az előállításánál hővel szemben stabil enzimként Thermus aquaticusból leszármaztatható hővel szemben stabil DNS-polimerázt és módosítóreagensként citrakonsavanhidridet alkalmazunk.
- 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim, amelynek az előállításánál hővel szemben stabil enzimként Thermus thermophilusból leszármaztatható hővel szemben stabil DNS-polimerázt és módosítóreagensként cisz-akonitsavanhidridet alkalmazunk.
- 8. Eljárás módosítatlan állapotban DNS-polimerázaktivitással vagy ligázaktivitással rendelkező, kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim előállítására, az enzimaktivitás kémiai módosítással végzett reverzibilis inaktiválása útján, azzal jellemezve, hogy valamely hővel szemben stabil enzim és valamely módosítóreagens elegyét lúgos pH-értéken kb. 25 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten reagáltatjuk; és reagensként . ¢.HU 221 750 Bl valamely (I) általános képletű (mely képletben Rt és R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben összekapcsolódó szerves csoportok) vagy valamely (II) általános képletű (mely képletben Rt és R2 jelentése előnyösen összekapcsolódó szerves csoportok, és a hidrogén- 5 atomok cisz-állásúak) dikarbonsavanhidridet alkalmazunk; és a reakciót az enzimaktivitás lényegében teljes inaktiválódásáig végezzük el.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárással előállított kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim.
- 10. Eljárás valamely mintában levő targetnukleinsav amplifikációjára, azzal jellemezve, hogy a) a mintát a targetnukleinsawal komplementer prímért és az 1-7. vagy 9. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil 15 enzimet tartalmazó amplifikációs reakcióeleggyel hozzuk érintkezésbe; ésb) az a) lépés szerint kapott elegyet kb. 50 °C-nál magasabb hőmérsékleten a kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzim újraaktiválásához és primer kiterjesztett termékek képződéséhez szükséges időn át inkubáljuk.
- 11. Polimeráz láncreakció amplifikációs reakcióelegy, amely egy primer párt és az 1-7. vagy 9.10 igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzimet tartalmaz.
- 12. Polimeráz láncreakció elvégzésére szolgáló kit, amely az 1-7. vagy 9. igénypontok bármelyike szerinti kémiailag módosított, hővel szemben stabil enzimet tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US267395P | 1995-08-25 | 1995-08-25 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602289D0 HU9602289D0 (en) | 1996-10-28 |
| HUP9602289A2 HUP9602289A2 (en) | 1997-05-28 |
| HUP9602289A3 HUP9602289A3 (en) | 2000-07-28 |
| HU221750B1 true HU221750B1 (hu) | 2002-12-28 |
Family
ID=21701916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602289A HU221750B1 (hu) | 1995-08-25 | 1996-08-21 | Nukleinsav amplifikációs módszer |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5773258A (hu) |
| EP (1) | EP0771870B1 (hu) |
| JP (1) | JP3026554B2 (hu) |
| KR (1) | KR100221097B1 (hu) |
| CN (1) | CN1282741C (hu) |
| AT (1) | ATE176499T1 (hu) |
| AU (1) | AU689047B2 (hu) |
| BR (1) | BR9603563A (hu) |
| CA (1) | CA2184105C (hu) |
| CZ (1) | CZ289237B6 (hu) |
| DE (2) | DE69601488T2 (hu) |
| DK (1) | DK0771870T3 (hu) |
| ES (1) | ES2101668T3 (hu) |
| HU (1) | HU221750B1 (hu) |
| IL (1) | IL119088A (hu) |
| MX (1) | MX9603608A (hu) |
| NO (1) | NO323552B1 (hu) |
| PL (1) | PL185711B1 (hu) |
| RU (1) | RU2174556C2 (hu) |
Families Citing this family (280)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096499A (en) * | 1996-03-22 | 2000-08-01 | Geron Corporation | Mammalian DNA primase screen and activity modulating agents |
| US6828094B2 (en) * | 1996-12-20 | 2004-12-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application |
| US6605428B2 (en) * | 1996-12-20 | 2003-08-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| US20030215857A1 (en) * | 1996-12-20 | 2003-11-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US6399304B1 (en) * | 1996-12-20 | 2002-06-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules |
| JPH10276776A (ja) * | 1997-04-07 | 1998-10-20 | Toyobo Co Ltd | 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ |
| US6183998B1 (en) * | 1998-05-29 | 2001-02-06 | Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 | Method for reversible modification of thermostable enzymes |
| US6132416A (en) * | 1998-09-01 | 2000-10-17 | Broselow; James B. | Universal medication dosing system |
| US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
| GB9920194D0 (en) * | 1999-08-27 | 1999-10-27 | Advanced Biotech Ltd | A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification |
| AU2001253129A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| WO2002016605A1 (fr) * | 2000-08-25 | 2002-02-28 | Fujirebio Inc. | Procede de protection d'informations personnelles |
| IL155450A0 (en) * | 2000-10-20 | 2003-11-23 | Expression Diagnostics Inc | Leukocyte expression profiling |
| JP2002199877A (ja) * | 2000-11-30 | 2002-07-16 | Advanced Biotechnologies Ltd | 酵素の可逆的な不活性化およびその酵素を含むキット |
| GB0110501D0 (en) * | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) * | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| EP1275735A1 (en) * | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
| US7384739B2 (en) * | 2001-11-14 | 2008-06-10 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Compositions for enhancing DNA synthesis, DNA polymerase-related factors and utilization thereof |
| CA2409775C (en) * | 2001-12-03 | 2010-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro |
| CN100429307C (zh) * | 2002-01-09 | 2008-10-29 | 希森美康株式会社 | 核酸检测方法及其系统 |
| US20050221349A1 (en) * | 2002-05-30 | 2005-10-06 | Stuart Wilson | Methods of detecting target molecules and molecular interactions |
| US6896727B2 (en) * | 2002-06-28 | 2005-05-24 | Seh America, Inc. | Method of determining nitrogen concentration within a wafer |
| EP1403379A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-03-31 | QIAGEN GmbH | Enhanced coamplification of nucleic acids |
| CA2519309A1 (en) | 2003-03-25 | 2004-10-14 | Stratagene California | Dna polymerase fusions and uses thereof |
| DE10315640A1 (de) * | 2003-04-04 | 2004-10-14 | Ignatov, Konstantin | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
| US7892745B2 (en) * | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| AU2004203649B2 (en) | 2003-08-12 | 2006-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable Taq polymerase fragment |
| EP2208797A3 (en) | 2004-03-01 | 2010-11-24 | Applied Biosystems, LLC | Methods, compositions and kits for use in polynucleotide amplification |
| KR100624490B1 (ko) | 2004-05-27 | 2006-09-20 | 바이오퀘스트(주) | 화학변형 열안정성 ｄｎａ 중합효소 |
| EP1758981A4 (en) * | 2004-05-28 | 2013-01-16 | Wafergen Inc | APPARATUS AND METHODS FOR PERFORMING MULTIPLEX ANALYZES |
| CN101426908B (zh) * | 2004-06-09 | 2014-06-11 | 纽星实验室 | 可逆性修饰的热稳定酶组合物及其制备方法和使用方法 |
| US7700281B2 (en) * | 2004-06-30 | 2010-04-20 | Usb Corporation | Hot start nucleic acid amplification |
| EP1761637A2 (en) * | 2004-06-30 | 2007-03-14 | Applera Corporation | Methods reaction mixtures and kits for ligating polynucleotides |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| EP1634965B1 (en) | 2004-09-09 | 2010-01-20 | Roche Diagnostics GmbH | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| US20060051796A1 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Inga Boell | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| US7642055B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-01-05 | Applied Biosystems, Llc | Two-color real-time/end-point quantitation of microRNAs (miRNAs) |
| NZ554701A (en) * | 2004-10-18 | 2010-03-26 | Univ Brandeis | Reagents and methods for improving reproducibility and reducing mispriming in PCR amplification |
| EP1836319B1 (en) | 2005-01-06 | 2012-09-19 | Life Technologies Corporation | Polypeptides having nucleic acid binding activity and methods for nucleic acid amplification |
| US20070212695A1 (en) * | 2005-01-12 | 2007-09-13 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for selective amplification of nucleic acids |
| WO2006122295A2 (en) * | 2005-05-11 | 2006-11-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels |
| WO2007011903A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Applera Corporation | Analyzing messenger rna and micro rna in the same reaction mixture |
| WO2007011901A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Applera Corporation | Hot start reverse transcription by primer design |
| US20070059713A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| US20070212704A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-09-13 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids |
| DE102005047617A1 (de) * | 2005-10-05 | 2007-04-19 | Qiagen Gmbh | Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft |
| GB0600228D0 (en) | 2006-01-06 | 2006-02-15 | Fermentas Uab | Inactivation method |
| JP5022383B2 (ja) * | 2006-02-27 | 2012-09-12 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | マグネシウム封鎖によるｐｃｒホットスタート |
| DE102006015960A1 (de) * | 2006-04-04 | 2007-10-11 | Qiagen Gmbh | Gemisch reversibel inhibierter Enzyme |
| EP2007909A4 (en) * | 2006-04-07 | 2011-01-26 | Xdx Inc | EXPRESSION OF NUCLEIC ACID IN RESPONSE TO STEROIDS AND PREDICTION OF DISEASE ACTIVITY |
| US8232091B2 (en) | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
| ES2360738T3 (es) * | 2006-06-01 | 2011-06-08 | Trilink Biotechnologies | Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico. |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| US8435774B2 (en) * | 2006-06-28 | 2013-05-07 | Qiagen Gmbh | Enhancing reactivation of thermostable reversibly inactivated enzymes |
| AU2007275762B2 (en) * | 2006-07-17 | 2012-02-23 | Brandeis University | Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection |
| US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| WO2008016562A2 (en) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) * | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US8148067B2 (en) * | 2006-11-09 | 2012-04-03 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| KR100825279B1 (ko) * | 2006-11-30 | 2008-04-25 | 한국해양연구원 | Ｄｎα 중합효소 활성 증가 단백질 및 이를 암호화 하는유전자 |
| US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
| WO2008091626A1 (en) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Wafergen, Inc. | Apparatus for high throughput chemical reactions |
| US20090036325A1 (en) * | 2007-05-25 | 2009-02-05 | Applera Corporation | Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers |
| GB0711683D0 (en) * | 2007-06-16 | 2007-07-25 | Enigma Diagnostics Ltd | Compositions |
| WO2008155529A1 (en) * | 2007-06-16 | 2008-12-24 | Enigma Diagnostics Limited | Compositions |
| US20090263869A1 (en) * | 2007-08-27 | 2009-10-22 | Lei Xi | Methods and Compositions for PCR |
| EP2195452B1 (en) | 2007-08-29 | 2012-03-14 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction |
| US20110020877A1 (en) * | 2008-01-11 | 2011-01-27 | Genesys Limited | Cren7 chimeric protein |
| GB0803628D0 (en) * | 2008-02-28 | 2008-04-02 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804721D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804722D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| CA2658520C (en) | 2008-03-19 | 2016-11-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers |
| EP2113574A1 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-04 | Biotype AG | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| US10227641B2 (en) | 2008-04-30 | 2019-03-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US20090325169A1 (en) * | 2008-04-30 | 2009-12-31 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| AU2009257815B2 (en) | 2008-05-27 | 2014-05-29 | Trilink Biotechnologies | Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated amplification of nucleic acid |
| EP2300613A4 (en) * | 2008-06-18 | 2011-11-09 | Life Technologies Corp | THERMALLY STABLE CHEMICALLY MODIFIED POLYMERIAS DNA MUTANTS |
| EP2905344B1 (en) | 2008-06-30 | 2016-11-09 | Life Technologies Corporation | Method for direct amplification from crude nucleic acid samples |
| EP2307558A4 (en) * | 2008-07-03 | 2012-08-08 | Allelogic Biosciences Corp | COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR THE PROTECTION OF NUCLEOPHILER GROUPS |
| US8583380B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US7910720B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-03-22 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Polyanion for improved nucleic acid amplification |
| US8206929B2 (en) | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| CA2749093C (en) | 2009-01-08 | 2019-03-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Exonuclease deficient hybrid polymerase and uses thereof in amplification reactions |
| US9347092B2 (en) * | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
| JP5457222B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
| DE102009010639B4 (de) * | 2009-02-26 | 2020-07-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit vor einer Messung |
| US8039215B2 (en) | 2009-03-10 | 2011-10-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay |
| CN102421918B (zh) | 2009-03-12 | 2016-01-20 | 布兰代斯大学 | 用于pcr的试剂和方法 |
| US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
| JP5766178B2 (ja) | 2009-03-24 | 2015-08-19 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ | ＳｌｉｐＣｈｉｐ装置および方法 |
| US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
| US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
| US9834815B2 (en) | 2009-03-25 | 2017-12-05 | Life Technologies Corporation | Discriminatory positive/extraction control DNA |
| WO2010115160A2 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Helixis, Inc. | Devices and methods for heating biological samples |
| EP2301666B1 (en) * | 2009-09-09 | 2021-06-30 | Cole-Parmer Ltd. | Optical system for multiple reactions |
| WO2011044444A2 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Life Technologies Corporation | cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE |
| WO2011060014A1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Small rna detection assays |
| IN2012DN05145A (hu) | 2009-11-19 | 2015-10-23 | Solis Biodyne | |
| CN102712614B (zh) * | 2009-12-04 | 2015-12-02 | 拜奥蒂乌姆股份有限公司 | 杂环取代的呫吨染料 |
| US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| ES2633111T3 (es) | 2010-03-26 | 2017-09-19 | Hongzhi Zou | Métodos y materiales para detectar neoplasia colorrectal |
| US9068017B2 (en) | 2010-04-08 | 2015-06-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for inhibiting terminal transferase activity |
| US20110250598A1 (en) | 2010-04-12 | 2011-10-13 | Ulrike Fischer | Detergent free polymerases |
| WO2011143611A2 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Life Technologies Corporation | Karyotyping assay |
| US8618253B2 (en) * | 2010-05-25 | 2013-12-31 | Samsung Techwin Co., Ltd. | Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification |
| EP2576577B1 (en) | 2010-05-28 | 2015-03-18 | Life Technologies Corporation | Synthesis of 2', 3'-dideoxynucleosides for automated dna synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization |
| WO2011157435A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| EP2582801B1 (en) | 2010-06-18 | 2015-04-22 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| AU2011267421B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-04-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| CN103025869B (zh) | 2010-06-18 | 2015-07-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶 |
| WO2011157436A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| WO2011157438A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increasesed 3'-mismatch discrimination |
| CN103025870B (zh) | 2010-06-18 | 2015-07-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶 |
| CA2802302C (en) | 2010-06-18 | 2016-04-26 | F. Hoffman-La Roche Ag | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| EP3502272A1 (en) | 2010-06-21 | 2019-06-26 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| IN2013MN00522A (hu) | 2010-09-24 | 2015-05-29 | Univ Leland Stanford Junior | |
| EP2625286B1 (en) | 2010-10-04 | 2020-04-15 | Roche Diagniostics GmbH | Method for cell lysis in a pcr reaction buffer |
| WO2012045668A1 (en) | 2010-10-04 | 2012-04-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for cell lysis in a rt-pcr reaction buffer |
| EP2625285B1 (en) | 2010-10-04 | 2020-04-29 | Roche Diagniostics GmbH | Method for cell lysis and pcr within the same reaction vessel |
| WO2012054730A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and kits for detection of 5-hydroxymethylcytosine |
| EP3564392B1 (en) * | 2010-12-17 | 2021-11-24 | Life Technologies Corporation | Methods for nucleic acid amplification |
| WO2012125220A2 (en) | 2011-01-14 | 2012-09-20 | Life Technologies Corporation | Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas |
| WO2012099896A2 (en) | 2011-01-17 | 2012-07-26 | Life Technologies Corporation | Workflow for detection of ligands using nucleic acids |
| AU2012212127B2 (en) | 2011-02-02 | 2016-06-02 | Exact Sciences Corporation | Digital sequence analysis of DNA methylation |
| EP2675897B1 (en) | 2011-02-15 | 2016-05-11 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| JP2014508528A (ja) | 2011-03-10 | 2014-04-10 | オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフ | 消化管癌の検出方法および検出マーカー |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| JP6023173B2 (ja) | 2011-04-11 | 2016-11-09 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 改良された活性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| US8993341B2 (en) | 2011-05-12 | 2015-03-31 | Exact Sciences Corporation | Removal of PCR inhibitors |
| US8808990B2 (en) | 2011-05-12 | 2014-08-19 | Exact Sciences Corporation | Serial isolation of multiple DNA targets from stool |
| CN104450680A (zh) | 2011-05-12 | 2015-03-25 | 精密科学公司 | 核酸的分离 |
| CN103796987B (zh) | 2011-06-08 | 2016-09-21 | 生命技术公司 | 用于pcr系统的新型去污剂的设计和开发 |
| WO2012170907A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
| WO2013066438A2 (en) | 2011-07-22 | 2013-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| ES2553400T3 (es) | 2011-07-28 | 2015-12-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas con actividad mejorada |
| US9758837B2 (en) | 2011-08-02 | 2017-09-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Sensitive and rapid method for Candidatus Liberibacter species detection |
| CN103930111A (zh) | 2011-09-19 | 2014-07-16 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗 |
| CA2847943C (en) | 2011-09-23 | 2017-08-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Use of g-clamp for improved allele-specific pcr |
| JP2014533100A (ja) | 2011-11-04 | 2014-12-11 | オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフＯｓｌｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｓｙｋｅｈｕｓ Ｈｆ | 結腸直腸癌の分析のための方法およびバイオマーカー |
| US9260714B2 (en) * | 2011-12-02 | 2016-02-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides |
| JP6140182B2 (ja) | 2011-12-08 | 2017-05-31 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| EP2788480B1 (en) | 2011-12-08 | 2019-01-16 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with improved activity |
| ES2668448T3 (es) | 2011-12-08 | 2018-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas con actividad mejorada |
| ES2872073T3 (es) | 2011-12-13 | 2021-11-02 | Univ Oslo Hf | Procedimientos y kits de detección de estado de metilación |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| EP2802673B1 (en) | 2012-01-09 | 2019-07-03 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| GB201201547D0 (en) | 2012-01-30 | 2012-03-14 | Olink Ab | Method and product |
| WO2013116353A1 (en) | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Hernandez Caleb | System for delivering medication |
| US11617835B2 (en) | 2012-02-01 | 2023-04-04 | Cd Acquisitions, Llc | Apparatuses, methods, and systems for delivering measured doses of medication |
| EP3544015B1 (en) | 2012-02-03 | 2024-10-23 | California Institute of Technology | Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays |
| CN104220876A (zh) | 2012-02-21 | 2014-12-17 | 奥斯陆大学医院 | 用于宫颈癌的检测和预后的方法和生物标志物 |
| US9085761B1 (en) | 2012-06-14 | 2015-07-21 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplification of nucleic acids |
| US9951378B2 (en) | 2012-06-14 | 2018-04-24 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods and kits for real time polymerase chain reaction (PCR) |
| EP3901243A1 (en) | 2012-08-03 | 2021-10-27 | California Institute of Technology | Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements |
| US9212392B2 (en) | 2012-09-25 | 2015-12-15 | Exact Sciences Corporation | Normalization of polymerase activity |
| GB201217405D0 (en) * | 2012-09-28 | 2012-11-14 | Fermentas Uab | Protein removal agent |
| DK2914743T3 (da) | 2012-11-02 | 2019-10-14 | Life Technologies Corp | Udvinding, detektering og kvantificering af lille rna |
| US9710596B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-18 | Exact Sciences Corporation | Methods for quantifying nucleic acid variations |
| WO2014095951A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Characterization of thermostable dna polymerase |
| GB201301457D0 (en) | 2013-01-28 | 2013-03-13 | Fluorogenics Ltd | Freeze-dried composition |
| WO2014165210A2 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Life Technologies Corporation | Universal reporter-based genotyping methods and materials |
| EP3543360B1 (en) | 2013-03-14 | 2021-02-17 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | Detecting neoplasm |
| ES2732012T3 (es) | 2013-03-14 | 2019-11-20 | Abbott Molecular Inc | Minimización de errores utilizando uracil-ADN-N-glicosilasa |
| WO2014184684A2 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection of hematological cancers |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| WO2015042446A2 (en) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for the analysis of radiosensitivity |
| EP3063129B1 (en) | 2013-10-25 | 2019-04-17 | Life Technologies Corporation | Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof |
| US10253358B2 (en) | 2013-11-04 | 2019-04-09 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiple-control calibrators for DNA quantitation |
| KR101488110B1 (ko) | 2013-11-29 | 2015-01-29 | 성균관대학교산학협력단 | 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용 |
| CN105452451B (zh) | 2013-12-06 | 2020-06-05 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 融合聚合酶 |
| EP3084004A4 (en) | 2013-12-19 | 2017-08-16 | Exact Sciences Corporation | Synthetic nucleic acid control molecules |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| US9663770B2 (en) | 2014-01-22 | 2017-05-30 | Life Technologies Corporation | Reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis |
| US10301680B2 (en) | 2014-03-31 | 2019-05-28 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting colorectal neoplasm |
| WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| EP3207156A1 (en) | 2014-10-13 | 2017-08-23 | Life Technologies Corporation | Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers |
| EP3230744B1 (en) | 2014-12-12 | 2021-05-12 | Exact Sciences Development Company, LLC | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| EP3230476B1 (en) | 2014-12-12 | 2020-02-05 | Exact Sciences Development Company, LLC | Zdhhc1 for normalizing methylation detection assays |
| CN113403293B (zh) | 2014-12-16 | 2024-08-16 | 生命技术公司 | 聚合酶组合物和制造与使用其的方法 |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US10641772B2 (en) | 2015-02-20 | 2020-05-05 | Takara Bio Usa, Inc. | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells |
| EP3967768A1 (en) | 2015-03-13 | 2022-03-16 | Life Technologies Corporation | Compositions for small rna capture, detection and quantification |
| EP3274440A4 (en) | 2015-03-27 | 2019-03-06 | Exact Sciences Corporation | PROOF OF DISEASES OF THE DISHES |
| CN104845967B (zh) | 2015-04-15 | 2020-12-11 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用 |
| JP6966681B2 (ja) | 2015-04-24 | 2021-11-17 | アティラ バイオシステムズ インコーポレイテッドAtila Biosystems Incorporated | 限られたヌクレオチド組成を有するプライマーを用いた増幅 |
| WO2016193070A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Roche Diagnostics Gmbh | A method of inactivating microbes by citraconic anhydride |
| USD938023S1 (en) | 2015-09-02 | 2021-12-07 | Certa Dose, Inc. | Drug delivery syringe |
| GB201518655D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Olink Ab | Method for generating proximity probes |
| IL294014B2 (en) | 2015-10-23 | 2024-07-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
| CN108350485A (zh) | 2015-10-30 | 2018-07-31 | 精密科学发展有限责任公司 | 血浆dna的多重扩增检测测定以及分离和检测 |
| CN116144626A (zh) | 2016-01-13 | 2023-05-23 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
| US10626383B2 (en) | 2016-01-15 | 2020-04-21 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic DNA polymerase mutants |
| PL3408408T3 (pl) | 2016-01-27 | 2019-09-30 | Devyser Holding Ab | Selektywna amplifikacja pożądanych regionów kwasów nukleinowych w sekwencji stanowiącej cel |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| CN109072291A (zh) | 2016-04-06 | 2018-12-21 | 生命技术公司 | 用于合成和检测核酸的组合物、方法和试剂盒 |
| WO2017192221A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Exact Sciences Corporation | Detection of lung neoplasia by analysis of methylated dna |
| US20170321286A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Exact Sciences Corporation | Detection of lung neoplasia by amplification of rna sequences |
| JP2019516529A (ja) | 2016-05-11 | 2019-06-20 | セルタ ドース，インコーポレイティド | 放射線投与システム及び方法 |
| AU2017277304B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-07-20 | Cepheid | Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods |
| WO2017218938A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
| WO2017218777A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| WO2017222056A1 (ja) * | 2016-06-23 | 2017-12-28 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム |
| FR3053968A1 (fr) | 2016-07-13 | 2018-01-19 | Biomerieux | Reactifs pour la protection reversible de molecules biologiques |
| CN109642227B (zh) | 2016-07-19 | 2023-02-28 | 精密科学发展有限责任公司 | 来自非人类生物体的核酸对照分子 |
| EP3978624A1 (en) | 2016-07-19 | 2022-04-06 | Exact Sciences Corporation | Methylated control dna |
| JP7075394B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-05-25 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注 |
| CA3032699A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| EP3504342A1 (en) | 2016-08-26 | 2019-07-03 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
| WO2018044831A1 (en) | 2016-08-30 | 2018-03-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Cleavable hairpin primers |
| KR20240038151A (ko) | 2016-09-02 | 2024-03-22 | 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 | 간세포 암종 검출 |
| WO2018071868A1 (en) | 2016-10-14 | 2018-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| WO2018127786A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| WO2018140781A1 (en) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | Exact Sciences Development Company, Llc | Detection of colon neoplasia by analysis of methylated dna |
| EP3580337A4 (en) | 2017-02-10 | 2020-12-02 | Zymergen, Inc. | MODULAR UNIVERSAL PLASMID DESIGN STRATEGY FOR COMPILING AND PROCESSING SEVERAL DNA CONSTRUCTS FOR SEVERAL HOST |
| US11248261B2 (en) | 2017-03-08 | 2022-02-15 | Etablissement Francais Du Sang | RhD gene allele associated with a weak D phenotype and its uses |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| IL269458B2 (en) | 2017-03-23 | 2024-02-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| CN107312762B (zh) * | 2017-06-23 | 2020-08-11 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 |
| WO2019002178A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES |
| JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
| USD846383S1 (en) | 2017-08-10 | 2019-04-23 | Certa Dose, Inc. | Carton |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| KR20200081476A (ko) | 2017-11-13 | 2020-07-07 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 요로 미생물 검출을 위한 조성물, 방법 및 키트 |
| JP7277460B2 (ja) | 2017-11-30 | 2023-05-19 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 乳癌の検出 |
| US10648025B2 (en) | 2017-12-13 | 2020-05-12 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiplex amplification detection assay II |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US11712522B2 (en) | 2018-05-01 | 2023-08-01 | CD Acquistions, LLC | System and method for sequential delivery of measured doses of medication |
| WO2019222625A1 (en) | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Certa Dose, Inc. | Syringe holder for medication dosing |
| EP3821020A4 (en) | 2018-08-15 | 2022-05-04 | Zymergen Inc. | APPLICATIONS OF CRISPRI IN HIGH-THROUGHPUT METABOLIC ENGINEERING |
| US11408030B2 (en) | 2018-09-10 | 2022-08-09 | Andy Madrid | Test for detecting Alzheimer's disease |
| WO2020053327A1 (en) | 2018-09-13 | 2020-03-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mutant dna polymerase(s) with improved strand displacement ability |
| EP3880847A2 (en) | 2018-11-16 | 2021-09-22 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and compositions for characterizing bladder cancer |
| USD943737S1 (en) | 2019-01-22 | 2022-02-15 | Certa Dose, Inc. | Overdose resistant drug delivery syringe |
| JP2022525322A (ja) | 2019-03-14 | 2022-05-12 | インシリクサ， インコーポレイテッド | 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム |
| DE112020001342T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-13 | President and Fellows of Harvard College | Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen |
| CN110283801A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-27 | 遵义医科大学珠海校区 | 一种dna聚合酶的化学修饰方法 |
| KR20220092561A (ko) | 2019-10-31 | 2022-07-01 | 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 | 난소암 검출 |
| WO2021089643A1 (en) | 2019-11-04 | 2021-05-14 | Mirnax Biosens, S.L. | Bivalent reverse primer |
| EP3901286A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-27 | Mirnax Biosens, S.L. | Bivalent reverse primer |
| AU2021224298A1 (en) | 2020-02-18 | 2022-09-22 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral sequences |
| DE112021002672T5 (de) | 2020-05-08 | 2023-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz |
| WO2021242740A2 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | Qiagen Beverly Llc | Polymerase enzyme |
| JP2023539128A (ja) | 2020-08-19 | 2023-09-13 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 非ホジキンリンパ腫の検出 |
| JP2023543803A (ja) | 2020-09-24 | 2023-10-18 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | プライム編集ガイドｒｎａ、その組成物、及びその使用方法 |
| CN112359031A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-02-12 | 北京丹大生物技术有限公司 | 一种热启动dna聚合酶及其制备方法和应用 |
| WO2022150790A2 (en) | 2021-01-11 | 2022-07-14 | The Broad Institute, Inc. | Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision |
| WO2022155588A2 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples |
| WO2022159874A1 (en) | 2021-01-25 | 2022-07-28 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| CN114958797A (zh) * | 2021-02-20 | 2022-08-30 | 郑州思昆生物工程有限公司 | 突变型dna聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用 |
| EP4314350A1 (en) | 2021-03-23 | 2024-02-07 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences |
| CN118339310A (zh) | 2021-08-02 | 2024-07-12 | 生命科技股份有限公司 | 用于检测核酸序列负荷的组合物、试剂盒和方法 |
| WO2023021330A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | University Of Oslo | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| WO2023069604A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard |
| WO2023076898A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase |
| CN116410951A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法和经该方法处理的Taq酶 |
| KR20240141247A (ko) | 2022-01-26 | 2024-09-26 | 주식회사 씨젠 | 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법 |
| WO2024006927A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting nucleic acids using intra-channel multiplexing |
| WO2024006924A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays |
| CN116024320A (zh) * | 2022-07-13 | 2023-04-28 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法 |
| WO2024054925A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| WO2024102839A1 (en) | 2022-11-10 | 2024-05-16 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of viral sequences |
| WO2024108092A1 (en) | 2022-11-17 | 2024-05-23 | The Broad Institute, Inc. | Prime editor delivery by aav |
| WO2024148013A1 (en) | 2023-01-02 | 2024-07-11 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral sequences |
| WO2024158993A1 (en) | 2023-01-27 | 2024-08-02 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting sti pathogen sequences |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5374553A (en) * | 1986-08-22 | 1994-12-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima |
| WO1989002916A1 (en) * | 1987-09-28 | 1989-04-06 | Novo-Nordisk A/S | Method for immobilizing lipase |
| US5108892A (en) * | 1989-08-03 | 1992-04-28 | Promega Corporation | Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity |
| SG46627A1 (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-20 | Hoffmann La Roche | Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus dna polymerase |
| DE69131321T2 (de) * | 1990-09-28 | 1999-12-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag, Basel | Mutationen in der 5'-3'-exonukleaseaktivität thermostabiler dna-polymerasen |
| FR2674248B1 (fr) * | 1991-03-19 | 1993-06-11 | Elf Aquitaine | Procede de modification chimique des proteines. |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| DE655506T1 (de) * | 1994-10-17 | 1995-09-28 | President And Fellows Of Harvard College, Cambridge, Mass. | DNS Polymerase mit Veränderten Nukleotiden Bindungstelle. |
-
1996
- 1996-07-11 US US08/680,283 patent/US5773258A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-19 US US08/684,108 patent/US5677152A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE69601488T patent/DE69601488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 AT AT96113222T patent/ATE176499T1/de active
- 1996-08-17 EP EP96113222A patent/EP0771870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE0771870T patent/DE771870T1/de active Pending
- 1996-08-17 DK DK96113222T patent/DK0771870T3/da active
- 1996-08-17 ES ES96113222T patent/ES2101668T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-19 IL IL11908896A patent/IL119088A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-21 HU HU9602289A patent/HU221750B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-21 AU AU62179/96A patent/AU689047B2/en not_active Expired
- 1996-08-23 CA CA002184105A patent/CA2184105C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 NO NO19963541A patent/NO323552B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 CZ CZ19962495A patent/CZ289237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 RU RU96116815/13A patent/RU2174556C2/ru active
- 1996-08-23 PL PL96315803A patent/PL185711B1/pl unknown
- 1996-08-23 MX MX9603608A patent/MX9603608A/es unknown
- 1996-08-24 KR KR1019960035291A patent/KR100221097B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-25 CN CNB961132191A patent/CN1282741C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 JP JP08240996A patent/JP3026554B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 BR BR9603563A patent/BR9603563A/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU221750B1 (hu) | Nukleinsav amplifikációs módszer | |
| CA2409775C (en) | Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro | |
| US5646019A (en) | Method for producing primed nucleic acid templates | |
| EP1091002A2 (en) | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules | |
| JP5022383B2 (ja) | マグネシウム封鎖によるｐｃｒホットスタート | |
| CA2249717A1 (en) | Target nucleic acid sequence amplification | |
| CA2127188C (en) | Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reactions | |
| US20160264950A1 (en) | Reversibly inactivated thermostable reverse transcriptases, compositions and methods for use | |
| US5605824A (en) | Composition for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| WO1991006679A1 (en) | An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein | |
| US6399304B1 (en) | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules | |
| US20170044506A1 (en) | cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE | |
| US8129150B2 (en) | Mixture of reversibly inhibited enzymes | |
| JP2002528121A5 (ja) | 高忠実度の熱安定性リガーゼおよびその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |