ES2360738T3 - Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico. - Google Patents
Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2360738T3 ES2360738T3 ES07777161T ES07777161T ES2360738T3 ES 2360738 T3 ES2360738 T3 ES 2360738T3 ES 07777161 T ES07777161 T ES 07777161T ES 07777161 T ES07777161 T ES 07777161T ES 2360738 T3 ES2360738 T3 ES 2360738T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- group
- carbon atoms
- oxo
- linear
- aryl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 92
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 88
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 84
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title description 85
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 191
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 117
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 117
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 58
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 56
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 48
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 41
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims abstract description 38
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 37
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims abstract description 28
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 26
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 claims abstract 18
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 79
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 77
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 71
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 69
- -1 aryl hydrogen Chemical class 0.000 claims description 55
- 125000000743 hydrocarbylene group Chemical group 0.000 claims description 37
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 33
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 31
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 28
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 27
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 27
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 21
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 10
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 8
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 8
- 125000005346 substituted cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 6
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108091008777 probable nuclear hormone receptor HR3 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 226
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 43
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 34
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 34
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 15
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 14
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 13
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 13
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 13
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 13
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 12
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 10
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 10
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 10
- JSHPTIGHEWEXRW-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxypentan-2-one Chemical compound CC(=O)CCCO JSHPTIGHEWEXRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 8
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 6
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 6
- 125000004656 alkyl sulfonylamino group Chemical group 0.000 description 6
- 125000004657 aryl sulfonyl amino group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000004475 heteroaralkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Chemical class 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 5
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 5
- 125000004644 alkyl sulfinyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N (e)-3-(2,3,4,5-tetrabromophenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC(Br)=C(Br)C(Br)=C1Br SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 4
- 101000835622 Homo sapiens Tubulin-specific chaperone A Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 102100026477 Tubulin-specific chaperone A Human genes 0.000 description 4
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003806 alkyl carbonyl amino group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 description 4
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000001316 cycloalkyl alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 4
- 125000005224 heteroarylcarbonylamino group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005553 heteroaryloxy group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005419 heteroarylsulfonylamino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- SQSPRWMERUQXNE-UHFFFAOYSA-N Guanylurea Chemical group NC(=N)NC(N)=O SQSPRWMERUQXNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 125000004658 aryl carbonyl amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 3
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 3
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 1-propanol Substances CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940044613 1-propanol Drugs 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 2-methylbut-2-ene Chemical group CC=C(C)C BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000005024 alkenyl aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005025 alkynylaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 125000005110 aryl thio group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- DKVNPHBNOWQYFE-UHFFFAOYSA-N carbamodithioic acid Chemical group NC(S)=S DKVNPHBNOWQYFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000005223 heteroarylcarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000004415 heterocyclylalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 125000006296 sulfonyl amino group Chemical group [H]N(*)S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical compound N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- AWMMPVVQZKSFQW-UHFFFAOYSA-N 2-n-(2-hydroxyethyl)benzene-1,2-dicarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)NCCO AWMMPVVQZKSFQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000006201 3-phenylpropyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- JNTVUHZXIJFHAU-UHFFFAOYSA-N 4-(Methylthio)-1-butanol Chemical compound CSCCCCO JNTVUHZXIJFHAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZJGCEGNCSGRBI-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-ethyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CCC1=CNC(=O)N=C1N CZJGCEGNCSGRBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQVOKWMIRXXDM-UHFFFAOYSA-N 6-fluoro-7h-purine Chemical compound FC1=NC=NC2=C1NC=N2 LGQVOKWMIRXXDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical group NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 150000001204 N-oxides Chemical class 0.000 description 1
- WPPONCHFOIIFIJ-UHFFFAOYSA-N N1N=NN=[C-]1 Chemical compound N1N=NN=[C-]1 WPPONCHFOIIFIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;triethylazanium;acetate Chemical compound CC#N.CC(O)=O.CCN(CC)CC CIHUOJZDKZENCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000004397 aminosulfonyl group Chemical group NS(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 125000005018 aryl alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006270 aryl alkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005418 aryl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005116 aryl carbamoyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005129 aryl carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005605 benzo group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000480 butynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003739 carbamimidoyl group Chemical group C(N)(=N)* 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000012986 chain transfer agent Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- HNEGQIOMVPPMNR-IHWYPQMZSA-N citraconic acid Chemical group OC(=O)C(/C)=C\C(O)=O HNEGQIOMVPPMNR-IHWYPQMZSA-N 0.000 description 1
- 229940018557 citraconic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 125000005724 cycloalkenylene group Chemical group 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005117 dialkylcarbamoyl group Chemical group 0.000 description 1
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012990 dithiocarbamate Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000555 isopropenyl group Chemical group [H]\C([H])=C(\*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011344 liquid material Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960003194 meglumine Drugs 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- FEHUTHGOLLQBNW-UHFFFAOYSA-N n-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)N(C(C)C)C(C)C FEHUTHGOLLQBNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSVFENCKYURWTI-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-7h-purin-6-amine Chemical class CCNC1=NC=NC2=C1NC=N2 GSVFENCKYURWTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000004316 oxathiadiazolyl group Chemical group O1SNN=C1* 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 125000005543 phthalimide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical group 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002294 quinazolinyl group Chemical group N1=C(N=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000001567 quinoxalinyl group Chemical group N1=C(C=NC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K selenophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=[Se] JRPHGDYSKGJTKZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004426 substituted alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005717 substituted cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho procedimiento: amplificar el ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado, en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado comprende un grupo de modificación en uno o más enlaces internucleotídicos; en el que dicho grupo de modificación puede disociarse térmicamente de forma no reversible; y en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado tiene la estructura I siguiente en la que: Nuc es un nucleósido dentro de la secuencia del cebador; U y Z son, de forma independiente, O, S, Se, NR 9 , o CR 9 R 10 ; R 9 y R 10 son cada uno de forma independiente hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, en el que cada uno puede incluir independientemente al menos un sustituyente seleccionado de halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido o un marcador detectable; Y es O, S o Se; W es O, S, S(O), S(O)2, Se, C(O), C(S), C(O)NH, NH o NR 9 ; y Q es un grupo de modificación que comprende uno o más grupos térmicamente escindibles.
Description
La presente invención se refiere a procedimientos para amplificar ácidos nucleicos. En aspectos concretos, la invención proporciona procedimientos para amplificación de ácido nucleico de inicio en caliente.
Se proporciona la descripción siguiente para ayudar a los conocimientos del lector. Ninguna información proporcionada
o referencias citadas se admite que sea técnica anterior en la presente invención.
Es probable que la PCR sea el procedimiento más usado en la biología molecular y la biotecnología moderna y se está aplicando rápidamente a las pruebas genéticas, diagnósticas, forenses y de biodefensa. Kolmodin, L.A., y col., Nucleic Acid Protocols, 569-580 (2000); Budowle, B., y col., 301 Science, 1852-53 (2003); Y. Sato, y col., 5 (Suppl. 1) Legal Medicine, S191-5193 (2003); Saldanha, J., y col., 43 J. Medical Virol., 72-76 (1994); Dahiya, R., y col., 44 Biochemistry and Molecular Biology International, 407-15 (1998); y Elnifro, E.M., y col., 13 Clin. Microbiol. Rev., 559-70 (2000). La PCR se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202. En cada ciclo del procedimiento de amplificación por PCR hay varias etapas típicas. En primer lugar, la secuencia diana de ADN bicatenario se desnaturaliza térmicamente a temperaturas elevadas (∼95ºC). La primera aparición de desnaturalización se denomina en el presente documento “etapa de desnaturalización inicial.” A esto le sigue la hibridación de un cebador oligonucleotídico sintético a cada hebra a temperaturas menores (∼ 60ºC). A continuación, cada uno de estos cebadores de oligonucleótidos orientados directos e inversos se extiende desde su extremo 3’ a una temperatura elevada (∼70ºC) mediante una ADN polimerasa térmicamente estable dependiente de iones de magnesio que incorpora 5’-desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y genera pirofosfato (PPi), como se representa en la porción superior de la Figura 1 para el cebador oligonucleotídico directo.
La utilidad del PCR se debe a su capacidad para proporcionar rápidamente amplificaciones diana de ∼106 veces, así como una especificidad elevada, que depende, en parte, de la especificidad de la hibridación del cebador oligonucleotídico. Por tanto, las secuencias de cebadores oligonucleotídicos y su longitud se diseñan para hibridar con únicamente la secuencia diana prevista, a las temperaturas usadas para la hibridación. No obstante, las reacciones de amplificación por PCR normalmente se preparan durante un periodo de minutos u horas a temperaturas ambientales que están muy por debajo del intervalo de temperatura necesario para asegurar la especificidad de la hibridación del cebador oligonucleotídico. En estas condiciones de preparación de muestras menos rigurosas, los cebadores oligonucleotídicos pueden unirse de forma inespecífica a otras secuencias sustancialmente no complementarias e inician potencialmente la síntesis de productos de extensión no deseados, Que se pueden amplificar junto con la secuencia diana. Como ha sido tratado por Chou, Q., y col., la amplificación de secuencias inespecíficas mediante este “cebado incorrecto” puede competir con la amplificación de las secuencias diana deseadas y, por tanto, pueden disminuir significativamente la eficiencia de la amplificación de la secuencia deseada, especialmente para dianas con un número bajo de copias. Chou, Q., y col., 20 Nucleic Acids Res., 1717-23 (1992).
La formación de un “dímero cebador” es otra forma problemática de hibridación inespecífica que, de acuerdo con Chou, Q., y col., es el resultado de la extensión amplificada de dos cebadores de oligonucleótidos a lo largo de otra secuencia sin una secuencia de interferencia significativa. Estos investigadores además han indicado que los dímeros cebadores pueden sufrir una oligomerización amplificada durante la PCR para crear una compleja mezcla de artefactos del cebador oligonucleotídico, cuya calidad a menudo varía de forma inversa con el rendimiento del producto específico de la PCR en amplificaciones con un número bajo de copias.
Aunque los problemas mencionados anteriormente por cebado incorrecto y formación de dímeros cebadores pueden encontrarse en todas las aplicaciones de PCR, estos problemas pueden suponer un reto concreto en los esquemas de PCR analítica de alta sensibilidad, tales como los usados para la detección de agentes infecciosos de transmisión por sangre (Saldanha, J., y col. and Elnifro, E.M., y col.), microbios biopeligrosos (Budowle, B., et al.), genes defectivos o cancerosos ((Dahiya, R., y col.) y ciencias forenses (Budowle, B., y col. And Y. Sato, y col.). Además, hay muchas más probabilidades de que se formen productos de amplificación falsos en la PCR multiplex. Markoulatos, P., y col., 16 J. of Clin. Laboratory Analysis, 47-51 (2002). En la PCR-transcriptasa inversa (RT-PCR), el medio más sensible para la detección de una secuencia de ARN diana es usar un cebador oligonucleotídico específico del gen en la etapa de RT. Zhang, J., y col., 337 Biochem. J., 231-41 (1999); Lekanne Deprez, R.H., y col., 307 Analytical Biochem., 63-69 (2002); y Bustin, SA, y col., J. of Biomolecular Techniques, 155-66 (2004). A la luz de la importancia de estas aplicaciones de alta sensibilidad que requieren una elevada especificidad para evitar consecuencias adversas graves de “falsos negativos” y “falsos positivos”, es crucial disponer de reactivos y protocolos que proporcionen ensayos que estén funcionalmente libres de artefactos debido a cebado incorrecto y formación de dímeros de cebadores.
Se ha investigador una serie de estrategias generales para reducir la amplificación inespecífica por PCR basada en el procedimiento denominado "inicio en caliente” cuyo objetivo es alterar la amplificación indeseada debido al cebado incorrecto y a la formación de dímeros de cebadores oligonucleotídicos en condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente durante la preparación de la muestra. Posteriormente, la amplificación por PCR comienza cuando la mezcla para la reacción de amplificación alcanza una alta rigurosidad, temperaturas “calientes” para “iniciar” la extensión mediada por la polimerasas de los cebadores oligonucleotídicos hibridados únicamente a secuencias diana. Por tanto, la temperatura se usa para desencadenar la extensión enzimática de los cebadores oligonucleotídicos únicamente a temperaturas elevadas cuando la rigurosidad de las condiciones de hibridación del cebador/diana es óptima para especificidad.
Estas estrategias generales para el “inicio en caliente” incluyen el uso de (1) materiales sensibles a la temperatura, tales como ceras como barreras o secuestrantes para controlar la mezcla de los reactivos (Q. Chou, y col. y Tanzer, L.R., y col., 273 Anal. Biochem., 307-310 (1999)); (2) aptámeros oligonucleotídicos (Dang, C., y co., 264 J. Mol. BioI., 268-78 (1996)) o anticuerpos (Eastlund, E., y coI., 2 LifeScience Quarterly, 2-5 (2001) y Mizuguchi, H., y coI., 126 J. Biochem (Tokyo), 762-68 (1999)) que inhiben la función de las ADN polimerasas; (3) el uso de una segunda enzima termoestable, tal como pirofosfatasa (Clark, D.R., y col.., Solicitud de Patente Internacional nº WO 2002088387) para eliminar la supresión mediante adición de pirofosfato (PPi); (4) polimerasas químicamente modificadas con reactivos hidrolíticamente reversibles tales como lisina modificada con ácido citracónico (Birch, D.E., y col., patente de EE.UU. nº 5.773.258) en AmpliTaq Gold (Moretti, T., y coI., BioTechniques, 716-722 (1998) y Saldanha, J., y col.) y (5) constructos de secuencias del cebador oligonucleotídico que no favorecen el cebado incorrecto a temperatura baja, tal como secuencias competidoras (Puskas, L.G., y col., Genome Research, 309-311 (1995) o "cebadores oligonucleotídicos de tipo touch-up and loop-incorporated" (TULlPS-PCR) (Ailenberg, M., y coI., 29(5) BioTechniques, 1018-23 (2000)).
La presente invención proporciona procedimientos para amplificar ácidos nucleicos. Estos procedimientos implican el uso de cebadores oligonucleotídicos y nucleósidos en reacciones de amplificación de ácido nucleico dependientes de la temperatura. En ciertos aspectos, los procedimientos se consiguen mediante el uso de ciertos cebadores oligonucleotídicos modificados que proporcionan utilidad en la amplificación de ácido nucleico. En formas de realización preferidas, los cebadores oligonucleotídicos se modifican con ciertos grupos químicos tales como ésteres.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, en el que el procedimiento incluye amplificar ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado, en el que el cebador oligonucleotídico modificado incluye uno o más grupos de modificación. El grupo de modificación se disocia durante la etapa de desnaturalización inicial de la amplificación. En una forma de realización, el grupo de modificación incluye uno
o más de los siguientes grupos químicos de fórmula I, Fórmula la, Fórmula Ib, Fórmula Ie, Fórmula Id, Fórmula II, Fórmula III y/o Fórmula IV como se describe más adelante en el presente documento.
En formas de realización concretas, el grupo de modificación está unido creando un enlace internucleotídico fosfotriéster (PTE). La modificación altera la extensión del cebador oligonucleotídico mediada por la ADN polimerasa antes del periodo de incubación inicial a una temperatura elevada de amplificación, como en la PCR. Los cebadores oligonucleotídicos hechos de nucleótidos y nucleósidos de la presente invención tienen dos estados. Primero, el cebador oligonucleotídico está en estado inactivo debido a la presencia de un grupo de modificación hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización inicial, a menudo 95ºC. Después de alcanzar la temperatura de desnaturalización inicial, el cebador oligonucleotídico se activa mediante fragmentación intramolecular inducida térmicamente que convierte el oligonucleótido al segundo estado. Este segundo estado del cebador oligonucleotídico es el correspondiente cebador oligonucleotídico no modificado que tiene un enlace fosfodiéster en estado activo y se puede extender con la acción de la polimerasa. La disociación parcial o completa del grupo de modificación se produce, preferentemente, después de incubar a aproximadamente 95ºC durante aproximadamente 2-10 minutos. En ciertas formas de realización, la disociación del grupo de modificación del cebador oligonucleotídico se produce con respecto a la temperatura y no requiere enzimas, agentes químicos o condiciones de reacción de amplificación, como el pH. Los enlaces fosfotriéster se describen en Miller, y coI., 93(24) J. Am. Chemical Society, 6657-65 (1971); Zon, y col., 6(2) Protein J., 131-45 (1987); y Koziolkiewicz, M. y Wilk, A., Protocols for Oligonucleotides and Analogs (1993).
En una forma de realización preferida, al menos un cebador de cada par de cebadores en la reacción de amplificación está marcado con un marcador detectable. Por tanto, tras la amplificación, el segmento diana se puede identificar por tamaño, captura de afinidad o color. El marcador detectable es, preferentemente, un pigmento fluorescente. En algunas formas de realización, diferentes pares de cebadores en una PCR multiplex se pueden marcar con diferentes marcadores detectables distinguibles. En otras formas de realización, el cebador directo estará marcado con un marcador detectable, mientras que el cebador inverso estará marcado con un marcador detectable diferente. El uso de diferentes marcadores detectables es útil para discriminar entre productos amplificados que son de la misma longitud o tienen una longitud muy similar. Por tanto, en una forma de realización preferida, se usan al menos dos pigmentos fluorescentes para marcar diferentes cebadores usados en una única amplificación.
En una forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención incluyen compuestos de Fórmula
I:
-L-X-R1
en la que:
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene entre
5 1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono:
X es 0, S, S(O), S(O)2, C(O), C(S) o C(O)NH; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, más preferentemente 1-6 átomos de carbono; preferentemente, el
10 hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo.
En una forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula Ia:
15
en la que:
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene entre
1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de 20 carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono; y
R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, más preferentemente 1-6 átomos de carbono; preferentemente, el hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y
25 heteroarilo.
Formas de realización preferidas del grupo de modificación de Fórmula Ia son las siguientes:
4-oxo-1-pentilo,
5-oxo-1-hexilo, 6-oxo-1-heptilo,
- 4-oxo-1-hexilo,
- 5
- 5-metil-4-oxo-1-hexilo,
- 10
- 2-metil-5-oxo-1-hexilo,
- 15
- 1-etil-4-oxo-1-pentilo,
1-metil-4-oxo-pentilo,
1,1-dimetil-4-oxo-pentilo,
4-oxo-1-octilo,
4-oxo-1-tetradecilo, y
10
4-oxo-1-eicosamilo.
En una forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula Ib:
-L-S(O)kR1
15 en la que:
k es un número entero de 0-2;
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene entre
1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono; y
20 R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, más preferentemente 1-6 átomos de carbono; preferentemente, el hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo.
25 En una forma de realización preferida, el grupo de modificación de Fórmula Ib es 4-metiltio-1-butilo, que se muestra a continuación:
En una forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula IC:
5
10
15
20
25
30
35
en la que:
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene entre
1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono; y
R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, más preferentemente 1-6 átomos de carbono; preferentemente, el hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo.
En una forma de realización preferida, el grupo de modificación de Fórmula Ic es -(N-terc-butilcarboxamido)-1-propilo, que se muestra a continuación:
En una forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula Id:
en la que:
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono; y
cada R1 es de forma independiente hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, más preferentemente 1-6 átomos de carbono. Preferentemente, el grupo hidrocarbilo es un alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo.
Formas de realización preferidas del grupo de modificación de Fórmula Id incluyen 2-(N-formil-N-metil)aminoetilo o 2(N-acetil-N-metil)aminoetilo (que se muestra a continuación):
En otra forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula II:
-L-R2
en la que:
L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1-10 átomos de carbono, preferentemente de 2-5 átomos de carbono, más preferentemente de 3-4 átomos de carbono, incluso más preferentemente 4 átomos de carbono; y
R2 es hidrógeno, ciano o un carbociclo, heterociclo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que tiene entre 5 y 10 átomos.
En una forma de realización preferida, el grupo de modificación de Fórmula II es N-(2-hIdroxIetil)-ftalimido, que se muestra a continuación:
5
N-(2-hidroxietil)-ftalimido.
En otra forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula III:
-La-A-Lb-B
10 en la que:
La y Lb se seleccionan cada uno forma independiente de un enlace o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene entre 1-8 átomos de carbono, preferentemente 2-5 átomos de carbono, más preferentemente 3-4 átomos de carbono;
A es 0, s, S(O), S(O)2, Se, CR3R4, NR3, C(O), C(S) o CNR3;
15 B es C(O)R3, C(S)R3, C(O)NR3R4, OR3 o SR3; y
R3 y R4 son cada uno de forma independiente de hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-10 átomos de carbono, preferentemente 1-6 átomos de carbono; preferentemente, el hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo que puede incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo,
20 hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo.
En otra forma de realización, los grupos de modificación de acuerdo con la invención proporcionan compuestos de Fórmula IV:
L3-D-Lb-E-Lc-F
La y Lb y Lc se seleccionan cada uno forma independiente de un enlace o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado
25 opcionalmente sustituido que tiene entre 1-8 átomos de carbono, preferentemente 2-5 átomos de carbono, más preferentemente 3-4 átomos de carbono;
D es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, o NR-5-;
E es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, o NR-6-;
F es hidrógeno, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NR7R8, OR7 o SR7;
30 R5 y R6 pueden ser, cada uno de forma independiente, hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi
o amino, o R5 y R6 pueden cooperar para formar un anillo mono o bicíclico que consiste en 5-10 átomos de carbono e incluye D, R5, R6, E y Lb, a condición de que cuando R5 y R6 cooperan para formar un anillo, n es de 0-2; y R7 y R8 se seleccionan cada uno de forma independiente, de arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo
35 opcionalmente sustituido, ariloxi opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.
En una forma de realización de un compuesto de Fórmula IV en la que R5 y R6 colaboran para formar un anillo en el que el grupo de modificación es metoximetil-ciclohex-1,3-il-etilo, que se muestra a continuación:
5
10
15
20
25
30
35
40
metoximetil-ciclohex-1,3-il-etilo.
En una forma de realización, el cebador oligonucleotídico tiene un armazón modificado de Estructura I:
en la que:
Nuc es un nucleósido dentro de la secuencia del cebador
U y Z son, de forma independiente, O, S, Se, NR9, o CR9R10;
R9 y R10 son cada uno de forma independiente de hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-10 átomos de carbono, preferentemente el hidrocarbilo es alquilo, alquenilo o alquinilo, en el que cada uno puede incluir independientemente al menos un sustituyente seleccionado de halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido o un marcador detectable;
Y es O, S o Se;
W es cualquier resto químico que permite que Q se escinda térmicamente, por ejemplo O, S, S(O), S(O)2, Se, C(O), C(S), C(O)NH, C(N)H, NH, -C(=NR11)-o NR9;
R11 es hidrógeno o hidrocarbilo opcionalmente sustituido que tiene 1-10 átomos de carbono, preferentemente 16 átomos de carbono; preferentemente R11 es H, alquilo o alquilo inferior; y
Q es un grupo de modificación que comprende uno o más grupos térmicamente escindibles.
En una forma de realización, el grupo de modificación Q incluye uno o más grupos térmicamente escindibles seleccionados de las Fórmulas I, la, Ib, Ic, Id, II, III o IV como se ha definido en el presente documento.
También se divulga un cebador oligonucleotídico para amplificación de ácido nucleico que incluye una secuencia de ácido nucleico en el que la secuencia de ácido nucleico tiene uno o más grupos de modificación. El grupo de modificación incluye uno o más de los siguientes grupos químicos de fórmula I, Fórmula la, Fórmula Ib, Fórmula Ic, Fórmula Id, Fórmula II, Fórmula III y/o Fórmula IV como se describe más adelante en el presente documento.
También se divulga un procedimiento de fabricar cebadores oligonucleotídicos modificados y nucleótidos modificados para ácido nucleico que incluye realizar la síntesis de oligonucleótidos con fosforoamiditas modificadas en el que las fosforoamiditas modificadas comprenden uno o más de los siguientes grupos de modificación de Fórmula I, Fórmula la, Fórmula Ib, Fórmula Ic, Fórmula Id, Fórmula II, Fórmula III y/o Fórmula IV como se describe más adelante en el presente documento.
Los kit que comprenden oligonucleótidos modificados para realizar amplificaciones también se describen en el presente documento. El kit puede incluir un recipiente marcado para amplificación de ácido nucleico, instrucciones para realizar la amplificación de ácido nucleico y/o uno o más reactivos seleccionados del grupo que consiste en dNTP, polimerasa de ácido nucleico, magnesio y tampón de reacción.
Los procedimientos de la presente invención para amplificación de ácido nucleico son útiles en aplicaciones que emplean cebadores oligonucleotídicos sintéticos y extensión mediante polimerasa del ácido nucleico. Los cebadores oligonucleotídicos pueden tener un único sitio de modificación o múltiples sitios de modificación.
De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que los oligonucleótidos modificados tal como se divulgan en el presente documento tienen ventajas significativas. Por ejemplo, el usuario final puede usar los mismos protocolos y procedimientos de amplificación ya en uso con cebadores oligonucleotídicos sin modificar. Los cebadores oligonucleotídicos modificados tal como se divulgan en el presente documento son compatibles con los sistemas y reactivos de amplificación existentes (incluida la PCR de inicio en caliente), no se necesitan enzimas o reactivos adicionales y se pueden usar los procedimientos de síntesis de cebadores oligonucleotídicos para sintetizar los cebadores oligonucleotídicos modificados divulgados en el presente documento. Otros aspectos incluyen productos comerciales para esta tecnología, que incluyen fosforoamiditas modificadas por PTE, soportes sólidos modificados por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
PTE para la síntesis de oligonucleótidos, conjuntos de cebadores oligonucleotídicos para dianas habitualmente amplificadas y secuencias de cebadores oligonucleotídicos sintetizados habituales. Las aplicaciones en amplificación basada en la polimerasas que emplean cebadores oligonucleotídicos que requieren fidelidad se pueden usar con los cebadores oligonucleotídicos modificados divulgados en el presente documento. Las aplicaciones en amplificación incluyen, entre otras, reacción en cadena de la polimerasa, PCR de inicio en caliente, PCR con transcripción inversa (RT-PCR), PCR multiplex, PCR cuantitativa (Q-PCR), secuenciación u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica.
En ciertas formas de realización de los procedimientos proporcionados en el presente documento, la amplificación se realiza mediante transcriptasa inversa (RT). Un experto habitual en la técnica está familiarizado con las condiciones necesarias para realizar la RT. Las temperaturas de desnaturalización y extensión pueden variar y depender de la enzima transcriptasa inversa que se esté usando. Por ejemplo, la desnaturalización y la extensión mediante la transcriptasa inversa se produce a aproximadamente 37-70ºC. Los grupos de modificación proporcionados en el presente documento se pueden seleccionar para usar de acuerdo con una condición de disociación deseada, tal como una temperatura concreta, o una temperatura concreta junto con un marco de tiempo concreto. Por ejemplo, se pueden usar para la RT grupos de modificación de modo que el grupo se disocia a 37-70ºC, preferentemente 37-60ºC; preferentemente a aproximadamente 50ºC; preferentemente a aproximadamente 42ºC y, preferentemente, a aproximadamente 37ºC. En otras formas de realización, el grupo de modificación se disocia en 0,1-60 minutos; preferentemente 1-30 minutos; preferentemente 1-15 minutos; preferentemente 1-10 minutos; preferentemente 0,1-5 minutos a la temperatura deseada.
En otras formas de realización de los procedimientos proporcionados en el presente documento, la amplificación puede ser una o más de una reacción de amplificación en una única mezcla de reacción, tal como reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) u otros ejemplos, tales como los descritos en la patente de EE.UU. nº
6.399.304. En ciertas formas de realización, se pueden añadir reactivos necesarios para más de una reacción enzimática y llevarse a cabo en un único vaso de reacción. En dichas reacciones, se pueden usar varias combinaciones de oligonucleótidos modificados y/o sin modificar. Por ejemplo, se podrían usar oligonucleótidos modificados para una, una o más, dos o más, tres o más, cinco o más, diez o más de las reacciones. En un caso, un oligonucleótido con un grupo de modificación podría usarse para la transcriptasa inversa que se disocie a temperaturas ideales para RT, de modo que se puedan usar 42ºC y otro oligonucleótido con un grupo de modificación diferente para la PCR que se disocie a temperaturas ideales para la PCR, tal como 95ºC. Proporcionando dicha combinación, los cebadores para la PCR no interfieren o no interfieren sustancialmente con la reacción RT. Como alternativa, los cebadores para RT pueden ser cebadores no modificados y los cebadores para RT pueden estar modificados con un grupo que se disocie a temperaturas ideales para la PCR, tal como 95ºC. En otras formas de realización más, la posterior PCR incluye PCR multiplex, PCR en tiempo real o PCR cuantitativa.
En otras formas de realización determinadas de los procedimientos proporcionados en el presente documento, la amplificación comprende una o más de una reacción de amplificación en una única mezcla de reacción, tal como PCR multiplex. Los cebadores usados para amplificar diferentes regiones diana pueden estar incluidos en la misma reacción. En dichas reacciones, se pueden usar diferentes combinaciones de cebadores modificados y/o no modificados para cada región diana. Al usar diferentes combinaciones de cebadores no modificados y/o modificados se pueden controlar las eficiencias relativas de la amplificación mediante el uso de diferentes grupos de modificación. Por ejemplo, un cebador para una primera región de ácido nucleico diana puede no tener un grupo de modificación, mientras que un cebador para una segunda región diana tiene un grupo de modificación, en el que la primera región diana se amplifica con menor eficiencia que la segunda región diana en las mismas condiciones. Como alternativa, un cebador para una primera región diana podría tener un grupo de modificación y un cebador para una segunda región diana podría tener un grupo de modificación diferente, en el que los grupos de modificación tienen diferentes tasas de disociación. En otra alternativa, con el fin de controlar la eficiencia de la amplificación se puede usar una población mixta de un cebador modificado y su equivalente sin modificar. En otras formas de realización todavía más preferidas, la reacción de PCR multiplex amplifica dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, diez o más o veinte o más regiones diana diferentes. Cualquier combinación de cebadores no modificados y modificados se puede usar para cada región diana, preferentemente una, dos, dos o más, tres o más, cinco o más, diez o más o veinte o más regiones diana diferentes. Por ejemplo, cuando se amplifican tres regiones diana, una región diana puede usar cebadores no modificados y la segunda y la tercera región diana pueden usar cebadores modificados, en las que los cebadores para la segunda y la tercera regiones diana pueden usar los mismos o diferentes grupos de modificación y en las que un cebador de una secuencia de nucleótidos (es decir, el cebador directo para una primera región diana), también puede ser una mezcla de cebadores modificados y su equivalente a cebador no modificado. Un experto en la técnica sería capaz de determinar qué combinación de cebadores y grupos de modificación será adecuada dependiendo de factores tales como las eficiencias de disociación de un grupo de modificación, la eficiencia de amplificación y el número de regiones diana.
Como se usa en el presente documento, el término “amplificación” o “amplificar” se refiere a uno o más procedimientos conocidos en la técnica para copiar un ácido nucleico diana, de modo que se incrementa el número de copias de una secuencia de ácido nucleico selecciona. La amplificación de la presente invención emplea cebadores oligonucleotídicos sintéticos con extensión por la ácido nucleico polimerasa, incluida la transcriptasa inversa (RT). La amplificación puede ser exponencial o lineal. Un ácido nucleico diana puede ser ADN, ARN, ADNc o un molde de ácido nucleico modificado. Aunque los procedimientos de ejemplo descritos en lo sucesivo en el presente documento se refieren a la amplificación usando la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), en la técnica se conocen otros numerosos procedimientos para amplificar ácidos nucleicos. Por ejemplo, los procedimientos incluyen procedimientos isotérmicos, procedimientos en círculo rodante, PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, PCR multiplex, secuenciación de ADN y otras reacciones de extensión de ácido nucleico. El experto en la técnica entenderá que se pueden usar otros procedimientos en lugar de, o junto con, los procedimientos de PCR. Véase, por ejemplo, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis y col., eds., Academic Press, San Diego, CA, 13-20 (1990); Wharam, y coI., 29(11) Nucleic Acids Res, 20 E54-E54 (2001); Hafner, y coI., 30(4) Biotechniques, 852-6, 858, 860 passim (2001); and Zhong, y coI., 30(4) Biotechniques, 852-56, 858, 860 passim (2001).
Como se usa en el presente documento, “ácido nucleico”, "secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácido nucleico” se refieren a nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos o cualquier fragmento de los mismos, o a moléculas naturales o sintéticas. Estas frases también se refieren a ADN o ARN de origen genómico o sintético que pueden ser monocatenarios o bicatenarios o pueden representar la hebra sentido o antisentido, o a cualquier material de tipo ADN
o de tipo ARN. Un “equivalente de ARN” en referencia a una secuencia de ADN está compuesto por la misma secuencia lineal de nucleótidos que la secuencia de ADN de referencia, con la excepción de que todas las bases nitrogenadas que sean timina están sustituidas por uracilo y el armazón de azúcar está compuesto por ribosa en lugar de por desoxirribosa, Armazones de ácido nucleico alternativos adicionales adecuados para la invención incluyen, entre otros, fosforotioato, fosforoselenoato, fosfonato de alquilo, fosfonato de arilo, ácidos nucleicos bloqueados (ANB) y ácidos peptidonucleicos (APN) y boronato. En los procedimientos descritos en el presente documento se puede usar ARN y/o se puede convertir en ADNc mediante transcripción inversa para usar en los procedimientos descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido modificado” se refiere a un cebador oligonucleotídico que tiene al menos un grupo de modificación. Los oligonucleótidos modificados incluyen, por ejemplo, un oligonucleótido que contiene un nucleósido modificado, un oligonucleótido que contiene un enlace internucleotídico modificado, o un oligonucleótido que tiene cualquier combinación de nucleósidos modificados y enlaces internucleotídicos (incluso cuando hay presente un nucleósido natural en la cadena de oligonucleótidos). Oligonucleótidos cuyos nucleósidos están conectados a través de enlaces internucleotídicos modificados se pueden encontrar en, por ejemplo, Waldner y coI., 6 Bioorg. Med. Chem. Letters, 2363-66 (1996), que describen la síntesis de oligonucleótidos que contienen varios enlaces internucleotídicos amida.
Como se usa en el presente documento, los términos “oligonucleótido” “cebador” o “cebador oligonucleotídico” se refiere a un polinucleótido, normalmente monocatenario, que puede ser natural o sintético, compuesto normalmente por una secuencia entre aproximadamente 5 a 50 nucleótidos, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos o más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos. Los oligonucleótidos incluyen ADN o ARN. El experto en la técnica es capaz de diseñar y preparar cebadores que son adecuados para amplificar una secuencia diana. La longitud de la secuencia de hibridación del cebador de los cebadores de amplificación para usar en la presente invención depende de varios factores, incluidos la identidad de secuencia de nucleótidos, la complementariedad y la temperatura a la cual estos ácidos nucleicos hibridan o se usan durante la amplificación de ácido nucleico un vitro. Las consideraciones necesarias para determinar una longitud preferida para la secuencia de hibridación del cebador de un cebador de amplificación de una identidad de secuencia concreta son bien conocidas para el experto en la técnica. Por ejemplo, la longitud de un ácido nucleico u oligonucleótido corto puede estar relacionada con su especificidad o selectividad de hibridación.
Como se usa en el presente documento, “grupo de modificación” se refiere a un resto químico unido a un cebador oligonucleotídico. En ciertas formas de realización, el resto químico es un éster. Un cebador oligonucleotídico que comprende uno o más grupos de modificación de la presente invención tiene una eficacia reducida para la extensión de ácidos nucleicos. Preferentemente, la extensión está alterada cuando el estado inactivo de un cebador oligonucleotídico modificado es al menos un 50% menos eficaz en el cebado de una reacción de amplificación que su correspondiente oligonucleótido en el estado activo, preferentemente al menos un 60% menos eficaz, preferentemente un 70% menos eficaz, más preferentemente al menos un 80% menos eficaz, más preferentemente un 90% menos eficaz e incluso más preferentemente un 95% menos eficaz en el cebado de una reacción de amplificación que su correspondiente cebador oligonucleotídico en el estado activo. Un experto habitual en la técnica es capaz de determinar con facilidad el nivel de actividad y eficacia. Un experto habitual en la técnica conoce muchos modos de investigar la capacidad de cebado. Un procedimiento de determinar la eficacia del cebado se ilustra en el Ejemplo 4 Randall, S.K. y col., 262 J. Biological Chemistry, 6864-70 (1987).
Preferentemente, los grupos de modificación son termolábiles y se disocian de un oligonucleótido modificado a una tasa creciente a medida que se eleva la temperatura del medio de la reacción de amplificación. El grupo de modificación puede estar entre dos nucleótidos adyacentes.
Como se usa en el presente documento, el término “terminal” con respecto al oligonucleótido se refiere a los nucleótidos en o cerca del extremo 3’ o 5’ de un oligonucleótido. Preferentemente, el terminal de un oligonucleótido incluye los últimos 6 nucleótidos, más preferentemente los últimos 5 nucleótidos, más preferentemente los últimos 4 nucleótidos, más preferentemente los últimos 3 nucleótidos, más preferentemente los últimos 2 nucleótidos o más preferentemente el último nucleótido.
Como se usa en el presente documento, el término “disociar” o “disociación” se refiere a la separación de un grupo de modificación de un oligonucleótido. La disociación puede ser parcial o completa.
Como se usa en el presente documento, la expresión “enlace internucleotídico” se refiere al enlace entre dos nucleótidos de un cebador oligonucleotídico.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “secuencia de ácido nucleico diana” o “ácido nucleico diana” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se va a identificar.
Como se usa en el presente documento, “marcadores” o “marcadores detectables” se refiere a cualquier molécula (o combinaciones de moléculas) que se pueden unir a o asociar con una molécula de modo que la molécula se pueda detectar de forma indirecta a través de la detección del marcador detectable. Un marcador detectable puede ser u radioisótopo (p. ej., yodo, indio, azufre, hidrógeno etc.), un pigmento o fluoróforo (p. ej., cianina, fluoresceína, rodamina), proteína (p. ej., avidina, anticuerpo), enzima (peroxidasa, fosfatasa, y similares), haptenos (p. ej., biotina) o cualquier otro agente que se pueda detectar directa o indirectamente. Una enzima es un ejemplo de un marcador detectable detectado por medios indirectos. En este caso, la enzima está unida al ácido nucleico diana y la presencia de la enzima se detecta mediante la adición de un sustrato adecuado que cuando actúa sobre él la enzima hace que el sustrato cambie de color o libere un producto de escisión que proporcione un color diferente del que tiene el sustrato original.
Como se usa en el presente documento, “inducción térmica” se refiere a un proceso por el cual la modificación del cebador oligonucleotídico se elimina del cebador oligonucleotídico generando un cebado oligonucleotídico en estado activo aplicando calor, convirtiéndolo de este modo en extensible por las polimerasas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “inicio en caliente” se refiere a una reacción de amplificación de ácido nucleico en la que la amplificación del ácido nucleico inducida por la polimerasa está alterada hasta que la reacción alcanza una temperatura inicial por encima de la temperatura de extensión de la enzima. En las aplicaciones de la PCR de inicio en caliente, las temperaturas iniciales alcanzan valores entre aproximadamente 80 y 105ºC o hasta que la reacción de amplificación alcanza una temperatura inicial de al menos aproximadamente 80ºC o hasta que la reacción de amplificación alcanza una temperatura inicial de al menos aproximadamente 85ºC o hasta que la reacción de amplificación alcanza una temperatura inicial de al menos aproximadamente 90ºC o hasta que la reacción de amplificación alcanza una temperatura inicial de al menos aproximadamente 95ºC. La expresión “inicio en caliente” es bien conocida en la técnica y se conoce una serie de procedimientos que alteran la amplificación tales como polimerasas modificadas, oligonucleótidos con estructuras secundarias que afectan a la hibridación y reactivos contenidos en barreras sensibles a la temperatura tales como ceras. En una forma de realización preferida, la amplificación de inicio en caliente está producida por la eliminación inducida por calor de un grupo de modificación de oligonucleótido.
Como se usa en el presente documento, la expresión “fragmentación intramolecular” se refiere al procedimiento en el que el grupo de modificación se disocia de un cebador oligonucleotídico modificado. Preferentemente, el oligonucleótido resultante está en un estado activo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “cebado incorrecto” se refiere a la unión de un cebador oligonucleotídico inespecífico. En particular, las secuencias que tienen una falta de complementariedad sustancial y que potencialmente inician síntesis de productos de extensión no deseados que se pueden amplificar junto con la secuencia diana.
Como se usa en el presente documento, la expresión “estado inactivo” o “inactivo” en el contexto de un cebador oligonucleotídico se refiere a un cebador oligonucleotídico con un grupo de modificación. En una forma de realización, el grupo de modificación altera la hibridación del cebador oligonucleotídico a una secuencia diana. En otra forma de realización, el grupo de modificación altera la extensión de la polimerasa cuando el cebador oligonucleotídico hibrida con otra secuencia.
Como se usa en el presente documento, la expresión “estado activo” o “activo” en el contexto de un cebador oligonucleotídico se refiere a un cebador oligonucleotídico sin un grupo de modificación. Preferentemente, un cebador oligonucleotídico activo tiene 1) un enlace fosfodiéster no modificado y 2) un resto de base no modificada y es capaz de extender la cadena para usar en reacciones de amplificación. Un cebador oligonucleotídico activo puede ser un cebador oligonucleotídico que nunca ha tenido un grupo de modificación o un cebador oligonucleotídico del que se ha eliminado un grupo de modificación.
Como se usa en el presente documento, la expresión “dímero cebador” se refiere a la hibridación inespecífica del cebador oligonucleotídico que es el resultado de la extensión amplificada de dos cebadores oligonucleotídicos a lo largo de la secuencia de ambos sin una secuencia de interferencia significativa.
Como se usa en el presente documento, el término “hibridar” o la expresión “hibridar de forma específica” se refiere a un procedimiento en el que dos hebras complementarias de ácido nucleico hibridan entre sí en condiciones rigurosas adecuadas. Normalmente se prefieren hibridaciones a ácidos nucleicos diana y preferentemente se realizan con moléculas de ácido nucleico de longitud de sonda, preferentemente de 20-100 nucleótidos de longitud. En la técnica se conocen bien las técnicas de hibridación de ácido nucleico. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. (1989); Ausubel, F.M. y coI., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. (1994).
Como se usa en el presente documento, la expresión “condición rigurosa de hibridación” se refiere a las condiciones de hibridación que no permiten la hibridación de dos ácidos nucleicos que no sean completamente complementarios.
Como se usa en el presente documento, el término “muestra” o la expresión “muestra problema” se refiere cualquier material líquido o sólido que se cree que está compuesto por los ácidos nucleicos de interés. Una muestra problema se puede obtener de cualquier fuente biológica (es decir, una muestra biológica), tal como células en cultivo o una muestra de tejido o producida sintéticamente, incluida un molde sintetizado químicamente.
Como se usa en el presente documento, los términos “complemento”, “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos tal como un oligonucleótido o un ácido nucleico diana) de acuerdo con las normas estándar de apareamiento de Watson/Crick. Una secuencia complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN o su secuencia complemento, y también puede ser un ADNc. Por ejemplo, para la secuencia 5'-A-G-T-3'" es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A5'." Ciertos nucleótidos que no se encuentran habitualmente en los ácidos nucleicos naturales pueden incluirse en los ácidos nucleicos descritos en el presente documento; estos incluyen nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados, tales como inosina, 7-deazaguanina, ácidos nucleicos bloqueados (ANB) y ácidos peptidonucleicos (APN). La complementariedad no tiene que ser perfecta, dúplex estables pueden contener pares de bases apareadas incorrectamente, degeneradas o bases sin aparear. Los expertos en la técnica de la tecnología de los ácidos nucleicos pueden determinar la estabilidad del dúplex empíricamente considerando una serie de variables incluidas, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición en bases y la secuencia del oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases apareadas incorrectamente.
La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases nucleotídicas de dos hebras de ácido nucleico están apareadas de acuerdo con las normas de apareamiento de bases. La complementariedad puede ser “completa” o "total”, en la que todas las bases nucleotídicas de dos hebras de ácido nucleico están apareadas de acuerdo con las normas de apareamiento de bases. La complementariedad puede estar ausente, en la que ninguna de las bases nucleotídicas de dos hebras de ácido nucleico están apareadas de acuerdo con las normas de apareamiento de bases. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos. Cualquier término se puede usar en referencia a nucleótidos individuales, especialmente dentro del contexto de polinucleótidos. Por ejemplo, un nucleótido concreto dentro de un oligonucleótido puede observarse por su complementariedad, o ausencia de la misma, con un nucleótido dentro de otra hebra de ácido nucleico, en contraste o comparación con la complementariedad entre el resto del oligonucleótido y la hebra de ácido nucleico.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “sustancialmente complementarios” se refiere a dos secuencias que hibridan en condiciones rigurosas de hibridación. El experto en la técnica entenderá que las secuencias sustancialmente complementarias no tienen que hibridan en toda su longitud. En particular, las secuencias sustancialmente complementarias comprenden una secuencia contigua de bases que no hibridan con una secuencia diana, en posición 3’ o 5’, con una secuencia contigua de bases que hibridan en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia diana.
Como se usa en el presente documento, la expresión “cebador directo” se refiere a un cebador oligonucleotídico que hibrida con la hebra antisentido de ARN monocatenario, ADN monocatenario o ADN bicatenario. Un “cebador inverso” hibrida con una hebra sentido de ARN monocatenario, ADN monocatenario o ADN bicatenario.
Como se usa en el presente documento, un cebador oligonucleotídico es “específico" de un ácido nucleico si la secuencia de hibridación de cebador oligonucleotídico del cebador oligonucleotídico tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con una porción del ácido nucleico cuando el cebador oligonucleotídico y el ácido nucleico están alineados. Un cebador oligonucleotídico que es específico de un ácido nucleico es uno que, en las condiciones adecuadas de hibridación o lavado, es capaz de hibridar con la diana de interés y no hibridar sustancialmente con ácidos nucleicos que no son de interés. Se prefieren niveles más elevados de identidad de secuencia e incluyen al menos 75%, al menos 80%, al menos 90% y al menos 95% y más preferentemente al menos 98% de identidad de secuencia.
Como se usa en el presente documento, el término “nucleósido” incluye todos los nucleósidos modificados y naturales, incluidas todas las formas de furanósidos encontradas en los ácidos nucleicos. Nucleósidos naturales incluyen, por ejemplo, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “análogos de nucleósido”, “nucleósidos modificados” o “derivados de nucleósidos” incluyen nucleósidos sintéticos como se describe en el presente documento. Derivados de nucleósidos también incluyen nucleósidos que tienen restos de base modificada, con o sin grupos protectores. Dichos análogos incluyen, por ejemplo, desoxinosina, 2,6-diaminopurina-2’-desoxiribosa, 5-metil-2’-desoxicitidina y similares. Los anillos de bases más frecuentes en los nucleósidos naturales son anillos de purina y de pirimidina. Entre los anillos de purina naturales se incluyen adenina, guanina y N6-metiladenina. Entre los anillos de purina naturales se incluyen citosina timina y 5-metilcitosina. Los compuestos y procedimientos de la presente invención incluyen anillos de base y análogos sintéticos de los mismos, así como azúcares de bases no naturales sustituidos con heterociclo e incluso azúcares de base sustituidos acíclicos. Además, derivados nucleosídicos incluyen otros derivados de purina y pirimidina, por ejemplo purinas sustituidas con halógeno (p. ej., 6-fluoropurina), pirimidinas sustituidas con halógeno, N6-etiladenina, N6-(alquil)-citosinas, 5-etilcitosina y similares. Derivados de nucleósidos y análogos abarcan una gran variedad de modificaciones, tales como las descritas en la patente de EE.UU. 6.762.298.
Como se usa en el presente documento, el término “acilo” indica grupos –C(O)Ra, en los que Ra es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituidos y similares como se define en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión “acilo sustituido” indica el grupo –C(O)Ra’, en el que Ra’ es alquilo inferior sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “aciloxi” indica el grupo -OC(O)Rb, en el que Rb’ es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “alquenilo” significa un hidrocarbilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene uno o más dobles enlaces y que, a menos que se indique lo contrario, contiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 átomos de carbono, más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 átomos de carbono y más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquenilo incluyen vinilo, alilo, 1,4-butadienilo, isopropenilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “alquenilarilo” se refiere a grupos arilo sustituidos con alquenilo u “alquenilarilo sustituido” se refiere a grupos alquenilarilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “alquenileno” se refiere a grupos hidrocarbilo divalentes de cadena lineal o ramificada que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono y que normalmente contienen 2-20 átomos de carbono, preferentemente 2-12 átomos de carbono, preferentemente 2-8 átomos de carbono, y “alquenileno sustituido" se refiere a grupos alquenileno que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilo” se refiere a una cadena de carbonos unidos por enlace sencillos, que normalmente varía de 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-8 átomos de carbono, ejemplos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo y similares. Ejemplos de tales radicales alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, iso-amilo, hexilo, octilo, dodecanilo y similares.
Como se usa en el presente documento, la expresión “alquilo inferior” se refiere a una cadena lineal o una cadena ramificada de carbonos que normalmente varía de 1-6 átomos de carbono, preferentemente 2-5 átomos de carbono. Ejemplos incluyen etilo, propilo, isopropilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “alquileno” se refiere a un hidrocarbilo divalente que contiene 1-20, preferentemente 1-15 átomos de carbono, de cadena lineal o ramificada, de la que se toman dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de diferentes átomos de carbono. Ejemplos de alquileno incluyen, entre otros, metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “alquinilo” significa un hidrocarbilo de cadena lineal o de cadena ramificada que tiene uno o más triples enlaces y que contiene aproximadamente 2-20 átomos de carbono, preferentemente aproximadamente 2-10 átomos de carbono, más preferentemente aproximadamente 2-8 átomos de carbono y más preferentemente aproximadamente 2-6 átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquinilo incluyen etinilo, propinilo (propargilo), butinilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “alquinilarilo” se refiere a grupos arilo sustituidos con alquinilo y “alquinilarilo sustituido” se refiere a grupos alquinilarilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “alcoxi” indica el grupo –ORc, en el que Rc es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, heteroalquilo, heteroarilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido tal como se ha definido.
Como se usa en el presente documento, el término “alcoxi inferior” indica el grupo ORd, en el que Rd es alquilo inferior.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilarilo” se refiere a grupos arilo sustituidos con alquilo y “alquilarilo sustituido” se refiere a grupos alquilarilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión “alquilcarbonilamino” indica el grupo –NReC(O)Rf, en el que Re es alquilo opcionalmente sustituido y Rf es hidrógeno o alquilo inferior.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilsulfinilo” indica el grupo –S(O)Rg, en el que Rg es alquilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilsulfonilo” indica el grupo –S(O)2Rg, en el que Rg es alquilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “alquilsulfonilamino” indica el grupo –NR’S(O)2Rf, en el que Re es alquilo opcionalmente sustituido y Rf es hidrógeno o alquilo inferior.
Como se usa en el presente documento, el término “alquiltio” se refiere al grupo –S-Rh, en el que Rh es alquilo inferior o alcoxi.
Como se usa en el presente documento, el término “alquiltio sustituido” se refiere al grupo –S-Ri, en el que Ri es alquilo inferior sustituido o alcoxi.
Como se usa en el presente documento, el término “alquinileno” se refiere a grupos hidrocarbilo divalentes de cadena lineal o ramificada que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono y que normalmente tienen en el intervalo de aproximadamente 2-12 átomos de carbono, preferentemente 2-8 átomos de carbono, y “alquinileno sustituido” se refiere a grupos alquinileno que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “amido” indica el grupo -C(O)NRjRj', en el que Rj y Rj’ pueden ser de forma independiente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido como se define en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión “amido sustituido” indica el grupo -C(O)NRkRk, en el que Rky Rk` son de forma independiente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido, no obstante, con la condición de que al menos uno de Rky Rk` no sea hidrógeno. RkRk' en combinación con el nitrógeno pueden formar un anillo heterocíclico o heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “amidino” indica el grupo -C(=NRm)NRm'Rm",en el que Rm, Rm' y Rm" son de forma independiente hidrógeno o alquilo inferior opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “amino” o amino sustituido indica el grupo -NRnRn', en el que Rn y
Rn’
pueden ser de forma independiente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo o heteroarilo sustituido como se define en el presente documento, acilo o sulfonilo. Una “amina divalente” indica el grupo NH-. Una “amina divalente sustituida” indica el grupo NR-en el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, acilo, acilo sustituido, sulfonilo o sulfonilo sustituido.
Como se usa en el presente documento, la expresión “amino sustituido” o “amina sustituida” indica el grupo –NRpRp’ , en el que Rp y Rp ’son de forma independiente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, acilo, acilo sustituido, sulfonilo o sulfonilo sustituido, no obstante, con la condición de que al menos uno de Rp y Rp’ no sea hidrógeno. RpRp' en combinación con el nitrógeno pueden formar un anillo heterocíclico o heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “arilalquinilo” se refiere a grupos alquinilo sustituidos con arilo y “arillquinilo sustituido” se refiere a grupos arilalquinilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “aralquilo” significa alquilo como se ha definido en el presente documento, en el que un átomo de hidrógeno alquilo está sustituido con un arilo tal como se ha definido en el presente documento. Ejemplos de radicales aralquilo incluyen bencilo, fenetilo, 1-fenilpropilo, 2-fenilpropilo, 3-fenilpropilo, 1naftilpropilo, 2-naftilpropilo, 3-naftilpropilo, 3-naftilbutirilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “aroílo” se refiere a especies de aril-carbonilo tal como benzoílo y “aroílo sustituido” se refiere a grupos aroílo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “arilalquilo” se refiere a grupos alquinilo sustituidos con arilo y “arilalquilo sustituido” se refiere a grupos arilalquilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “arilo” solo o en combinación significa fenilo o naftilo opcionalmente carbocíclico condensado con un cicloalquilo de, preferentemente, 5-7, más preferentemente 5-6, miembros de anillo y/o opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxi, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono o disustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-disustituidos con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcabonilamino, heteroarilcarbonilamino o similares.Como se usa en el presente documento, el término “arilcarbonilamino” indica el grupo -NRqC(O)Rr, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior y Rr es arilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “arileno” se refiere a grupos aromáticos divalentes que normalmente tienen en el intervalo de 6 hasta 14 átomos de carbono y “amileno sustituido” se refiere a grupos amileno que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “ariloxi” indica el grupo –OAr, en el que Ar es un grupo arilo o arilo sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “arilsulfonilamino” indica el grupo -NRqS(O)2Rr, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior y Rr es arilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, en referencia a “un grupo carbamato” abarca los sustituyentes de la estructura -O-C(O)-NR2, en el que cada R es de forma independiente H, alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido como se ha establecido en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, en referencia a “un grupo ditiocarbamato” abarca los sustituyentes de la estructura -S-C(S)-NR2, en el que cada R es de forma independiente H, alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido como se ha establecido en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “carbociclo” significa un grupo saturado, insaturado o aromático que tiene un único anillo o múltiples anillos condensados compuestos por átomos de carbono unidos. El o los anillos puede, opcionalmente, estar insustituidos o sustituidos con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “cicloalquenilo” se refiere a grupos cíclicos que contienen anillos que contienen en el intervalo de 3 hasta 20 átomos de carbono y que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono y “cicloalquenilo sustituido” se refiere a grupos cicloalquenilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “cicloalquilo” se refiere a un grupo alquilo monocíclico o policíclico que contiene de 3 a 15 átomos de carbono y “cicloalquilo sustituido” se refiere a grupos cicloalquilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “cicloalquileno” se refiere a grupos divalentes que contienen anillos que contienen en el intervalo de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono y “cicloalquileno sustituido” se refiere a grupos cicloalquileno que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “guanidinilo” se refiere a la estructura N=C(NH2)2 y “guanidinilo sustituido” se refiere a la estructura N=C(NH2)2, en la que cada R es de forma independiente H, alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido como se ha establecido en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “halógeno” o “halo”, solo o en combinación, significa todos los halógenos es decir flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) y yodo (I).
Como se usa en el presente documento, el término “heteroarilo” solo o en combinación se refiere a una estructura de anillo aromático monocíclico que contiene 5 ó 6 átomos de anillo, o a un grupo aromático bicíclico que tiene de 8 a 10 átomos, que contiene uno o más, preferentemente 1-4, más preferentemente 1-3, incluso más preferentemente 1-2, heteroátomos seleccionados de forma independiente del grupo O, S y N y opcionalmente sustituidos con de 1 a 3 grupos o sustituyentes de halo, hidroxi, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aciloxi, ariloxi, heteroariloxi, amino opcionalmente mono o disustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-disustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino o similares. Con heteroarilo también se pretende incluir S o N oxidado, tal como sulfinilo, sulfonilo y N-óxido de un nitrógeno de anillo terciario. Un átomo de carbono o de nitrógeno es el punto de unión de la estructura de anillo heteroarilo de modo que se retiene un anillo aromático estable. Ejemplos de grupos heteroarilo son ftalimida, piridinilo, piridazinilo, pirazinilo, quinazolinilo, purinilo, indolilo, quinolinilo, pirimidinilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, tienilo, isoxazolilo, oxatiadiazolilo, isotiazolilo, tetrazolilo, imidazolilo, triazinilo, furanilo, benzofurilo, indolilo y similares. Un heteroarilo sustituido contiene un sustituyente fijado a un carbono o nitrógeno disponible para producir un compuesto estable.
Como se usa en el presente documento, la expresión “heteroarilo sustituido” se refiere a un heterociclo opcionalmente mono o poli-sustituido con uno o más grupos funcionales, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “heteroarilcarbonilamino” indica el grupo –NRqC(O)Rf, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior y Rr es arilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “heteroariloxi” indica el grupo -OHet, en el que Het es un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “heteroarilsulfonilamino” indica el grupo -NRqS(O)2Rs, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior y Rs es heteroarilo opcionalmente sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “heterociclo” se refiere a un grupo aromático saturado o insaturado que tiene un único anillo (p. ej., morfolino, piridilo o furilo) o múltiples anillos condensados (p. ej., naftpiridilo, quinoxalilo, quinolinilo, indolicinilo o benzo[b]tienilo) y que tiene átomos de carbono y al menos un heteroátomo, tal como N, O o S, dentro del anillo, que opcionalmente puede estar insustituido o sustituido con, por ejemplo, halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio, acetileno, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, heteroarilo, heteroarilo sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfamido y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “heterociclo sustituido” es un heterociclo sustituido con 1 o más, por ejemplo 1, 2 ó 3 sustituyentes seleccionados del grupo constituido por alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, halo, hidroxi, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aciloxi, arilo, arilo sustituido, ariloxi, heteroariloxi, amino, amido, amidino, urea opcionalmente sustituida con grupos alquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo, aminosulfonilo opcionalmente N-mono o N,N-disustituido con grupos alquilo, arilo o heteroarilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, acilo, carboxilo, heterociclo, heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, nitro, ciano, tiol, sulfonamido y oxi, unidos en cualquier punto disponible para producir un compuesto estable.
Como se usa en el presente documento, el término “hidrocarbilo” comprende un radical orgánico en el que el armazón del mismo comprende sólo carbono e hidrógeno. Por tanto, hidrocarbilo abarca alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, arilalquenilo, alquenilarilo, arilalquinilo, alquinilarilo y similares.
Como se usa en el presente documento, el término “hidrocarbilo sustituido” comprende cualquiera de los grupos hidrocarbilo a los que se ha hecho referencia anteriormente que además portan uno o más sustituyentes seleccionados de hidroxi, hidrocarbiloxi, hidrocarbiloxi sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, amino, alquilamino, alquilamino sustituido, carboxi, -C(S)SR, -C(O)SR, -C(S)NR2, en el que cada R es, de forma independiente, hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido, nitro, ciano, halo, -SO3M o –OSO3M, en el que M es H, Na, K, Zn, Ca o meglumina, guanidinilo, guanidinilo sustituido, hidrocarbilo, hidrocarbilo sustituido, hidrocarbilcarbonilo, hidrocarbilcarbonilo sustituido, hidrocarbiloxicarbonilo, hidrocarbiloxicarbonilo sustituido, hidrocarbilcarboniloxi, hidrocarbilcarboniloxi sustituido, acilo, aciloxi, heterocíclico, heterocíclico sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroarilcarbonilo, heteroarilcarbonilo sustituido, carbamoílo, monoalquilcarbamoílo, dialquilcarbamoílo, arilcarbamoílo, un grupo carbamato, un grupo ditiocarbamato, aroílo, aroílo sustituido, organosulfonilo, organosulfonilo sustituido, organosulfinilo, alquilsulfinilo sustituido, alquilsulfonilamino, alquilsulfonilamino sustituido, arilsulfonilamino, arilsulfonilamino sustituido, un grupo sulfonamida, sulfurilo y similares, incluidos dos o más de los grupos descritos con anterioridad unidos a dicho resto hidrocarbilo mediante dichos restos ligador/espaciador como –O-, -S-, -NR-, en el que R es hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido, -C(O)-, -C(S)-, -C(=NR’)-, -C(=CR'2)-, en el que R’ es alquilo o alquilo sustituido, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR-(o -NR-C(O)-O-), -NR-C(O)-, -NR-C(O)-NR-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -SC(O)-NR-, -O-S(O)2, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR-, -O-NR-C(O)-, -O-NR-C(O)-O-, -ONR-C(O)-NR-, -NR-O-C(O)-, -NR-O-C(O)-O-, -NR-O-C(O)-NR-, -O-NR-C(S)-, -O-NR-C(S)-O-, -O-NRC(S)-NR-, -NR-OC(S)-, -NR-O-C(S)-O-, -NR-O-C(S)-NR-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR-(o -NR-C(S)-O-), -NR-C(S)-, -NR-C(S)-NR-, -S-S(O)2, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2-NR-, -NR-O-S(O)-, -NR-O-S(O)-O-, -NR-O-S(O)-NR-, -NR-OS(O)2, -NR-O-S(O)2-O-, NR-O-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)-, -O-NR-S(O)-O-, -O-NR-S(O)-NR-, -O-NR-S(O)2O-, -O-NRS(O)2-NR-, -O-NR-S(O)2-, -OP(O)R2-, -S-P(O)R2-, -NR-P(O)R2-, en los que cada R es de forma independiente hidrógeno, alquilo o alquilo sustituido y similares.
Como se usa en el presente documento, “hidrocarbiloxi” se refiere a grupos –O-hidrocarbilo que contienen 2-20 átomos de carbono e “hidrocarbiloxi sustituido” se refiere a grupos hidrocarbiloxi que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, “hidrocarbilcarbonilo” se refiere a grupos –C(O)-hidrocarbilo que contienen 220 átomos de carbono e “hidrocarbilcarbonilo sustituido” se refiere a grupos hidrocarbilcarbonilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, “hidrocarbiloxicarbonilo” se refiere a grupos –C(O)-O-hidrocarbilo que contienen 2-20 átomos de carbono e “hidrocarbiloxicarbonilo sustituido” se refiere a grupos hidrocarbiloxicarbonilo que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, “hidrocarbilcarboniloxi” se refiere a grupos -O-C(O)-hidrocarbilo que contienen 2-20 átomos de carbono e “hidrocarbilcarboniloxi sustituido” se refiere a grupos hidrocarbilcarboniloxi que además portan uno o más sustituyentes como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, “hidrocarbileno” comprende cualquier radical divalente orgánico en el que el armazón del mismo comprende sólo carbono e hidrógeno. Por tanto, hidrocarbileno abarca alquileno, cicloalquileno, alquenileno, cicloalquenileno, alquinileno, arileno, alquilarileno, arilalquileno, arilalquenileno, alquenilarileno, arilalquinileno, alquinilarileno y similares, e “hidrocarbileno sustituido” se refiere a cualquiera de los grupos hidrocarbileno a los que se ha hecho referencia anteriormente que además portan uno o más sustituyentes tal como se ha establecido en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, los términos “hidroxilo” e “hidroxi” se refieren al grupo -OH.
Como se usa en el presente documento, el término “organosulfinilo” se refiere a sustituyentes que tienen la estructura – S(O)-organo, en la que organo abarca restos alquilo, alcoxi, alquilamino y arilo, así como restos alquilo, alcoxi, alquilamino y arilo sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término “organosulfonilo” se refiere a sustituyentes que tienen la estructura –S(O)2-organo, en la que organo abarca restos alquilo, alcoxi y alquilamino, así como restos alquilo, alcoxi o alquilamino sustituidos.
Como se usa en el presente documento, el término “oxo” se refiere a un sustituyente oxígeno unido mediante un doble enlace al carbono.
Como se usa en el presente documento, el término “sulfinilo” indica el grupo –S(O)-.
Como se usa en el presente documento, la expresión “sulfinilo sustituido” indica el grupo -S(O)Rt, en el que Rt es alquilo inferior, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquilalquilo, cicloalquilalquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, heterociclilalquilo, heterociclilalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroaralquilo, heteroaralquilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “sulfonilo” indica el grupo –S(O)2-.
Como se usa en el presente documento, la expresión “sulfonilo sustituido” indica el grupo -S(O)2Rt, en el que Rt es alquilo inferior, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquilalquilo, cicloalquilalquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, heterociclilalquilo, heterociclilalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroaralquilo, heteroaralquilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término “sulfonilamino” indica el grupo –NRqS(O)2-, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior.
Como se usa en el presente documento, la expresión “sulfonilamino sustituido” indica el grupo -NRqS(O)2RU, en el que Rq es hidrógeno o alquilo inferior, y Ru es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroaralquilo, heteroaralquilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido.
Como se usa en la presente memoria, el término “sulfurilo” se refiere a sustituyentes de la estructura =S(O)2.
Como se usa en el presente documento con relación a valores numéricos, los términos “aproximadamente” y “alrededor de” significan un 10% del valor indicado.
La figura 1 es una representación esquemática de la modificación química (Q) que altera la extensión del cebador oligonucleotídico mediada por la ADN polimerasa antes de la activación de “inicio en caliente”.
La figura 2 es una representación esquemáticas del mecanismo probable de la fragmentación intramolecular inducida térmicamente mediante la cual un enlace fosfotriéster se convierte en un enlace fosfodiéster no modificado en estado activo en el extremo 3’ que puede extender la polimerasa.
La figura 2 es un esquema sintético general para modificar los cebadores oligonucleotídicos con derivados fosforoamidita.
Una reacción de amplificación de ácido nucleico tal como la PCR implica hibridación de un cebador oligonucleotídico con un ácido nucleico diana mediante la cual una polimerasa incorpora desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) para formar múltiples copias de una secuencia diana. No obstante, la reacción de amplificación a menudo da productos no deseados debido a un cebado incorrecto y a la formación de dímeros de cebadores que afectan a la eficiencia y precisión del procedimiento. Muchos productos no deseados se producen durante la temperatura inicial aumentan la reacción de amplificación.
La presente invención proporciona procedimientos mejorados para amplificar ácidos nucleicos. En aspectos concretos, la invención está dirigida al uso de cebadores oligonucleotídicos para amplificación e las reacciones de amplificación dependientes de la temperatura. En ciertos aspectos, los cebadores oligonucleotídicos para amplificación pueden emplear un grupo de modificación termoextraíbles preferentemente en el extremo 3’ que altera la formación de productos de amplificación no deseados.
Algunas estrategias se basan en el uso de cebadores oligonucleotídicos modificados químicamente. Will, y coI., (patente de EE.UU. nº 6.001,611) describe el uso de modificaciones de bases en el cebador para minimizar la formación de dímeros de cebadores y el cebado incorrecto. Ankenbauer, y col. (solicitud de patente de EE.UU. nº 20030119150, también publicada como EP1275735 y JP2003038180) describen un cebador oligonucleotídico bloqueado en el extremo 3’ con un grupo fosfato que se elimina mediante una 3'-5' exonucleasa termoestable. Ullman, y col. (patente de EE.UU. nº 6.482.590) divulgan un cebador oligonucleotídico que está modificado en el extremo 3’ que también se elimina mediante una exonucleasa. Bonner, y col. (solicitud de la patente de EE.UU. nº 20030162199) reivindica un cebador oligonucleotídico modificado con glioxilo en el nucleótido guanosina que es un enlace covalente termoreversible que rompe la hibridación con una hebra diana.
Se han usado grupos termolábiles y se han descrito en la literatura para usar en el proceso de síntesis de cebadores oligonucleotídicos. Véase Grajkowski, y col., 3 Org. Lett., 1287-90 (2001); Wilk, A., y col., 42 Tetrahedron Lett., 5635-39 (2001); Wilk, A., y coI., 67 J. Org. Chem., 6430-38 (2002); Cieslak, J., y coI., 68 J. Org. Chem., 10123-29 (2003); Cieslak, J., y coI., 69 J. Org. Chem., 2509-15 (2004); y Beaucage y coI., patente de EE.UU. nº 6.762,298.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, en el que el procedimiento incluye amplificar ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado, en el que el cebador oligonucleotídico modificado incluye uno o más grupos de modificación en el extremo 3’. El grupo de modificación se disocia durante la etapa de desnaturalización inicial de la amplificación. En una forma de realización, el grupo de modificación incluye uno o más de los siguientes grupos químicos de fórmula I, Fórmula la, Fórmula Ib, Fórmula Ic, Fórmula Id, Fórmula II, Fórmula III y/o Fórmula IV como se describe más adelante en el presente documento.
En el presente documento también se divulga un cebador oligonucleotídico modificado que es un cebador oligonucleotídico que posee al menos un nucleótido con un grupo de modificación en el extremo 3’ del mismo en comparación con un cebador oligonucleotídico que tiene un nucleótido no modificado o en estado activo en el extremo 3’. Para el fin de definir la posición de un nucleótido modificado, el extremo 3’ incluye cualquiera de los últimos seis nucleótidos del extremo 3’ del cebador oligonucleotídico, preferentemente cualquiera de los tres últimos nucleótidos. Un nucleótido modificado no puede extender la cadena, es decir no es extensible, a lo largo de un polinucleótido al que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
está hibridado bien a través de la inhibición de la enzima o a través de la disminución de la hibridación al ácido nucleico diana. De acuerdo con esto, no se produce ningún grado sustancial de extensión de la cadena a menos, y hasta que, se elimine la modificación o el nucleótido modificado. La modificación altera la extensión del cebador oligonucleotídico mediada por la ADN polimerasa antes del periodo de incubación inicial a una temperatura elevada de amplificación, como en la PCR. Los cebadores oligonucleotídicos tal como se divulgan en el presente documento tienen dos estados. Primero, la población del cebador oligonucleotídico está en un estado inactivo hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización inicial, a menudo 95ºC, pero puede ser entre 80 y 105ºC, más preferentemente entre aproximadamente 85 y 100ºC, más preferentemente entre 90 y 96ºC. Después de alcanzar la temperatura de desnaturalización inicial, el cebador oligonucleotídico se convierte en activo mediante fragmentación intramolecular inducida térmicamente que convierte un cebador oligonucleotídico modificado en el correspondiente cebador oligonucleotídico no modificado. Este segundo estado del cebador oligonucleotídico tiene un enlace fosfodiéster en estado activo y se puede extender con la acción de la polimerasa. La disociación parcial o completa del grupo de modificación se produce, preferentemente, tras incubación a aproximadamente 95ºC con t1/2 entre aproximadamente 0,1-1,20 minutos, pero puede producirse entre aproximadamente 1-120 minutos, 2-90 minutos, preferentemente entre aproximadamente 2-60 minutos, preferentemente entre aproximadamente 2-40 minutos, preferentemente entre aproximadamente 2-30 minutos, preferentemente entre aproximadamente 2-5 minutos, preferentemente aproximadamente 4 minutos, más preferentemente entre aproximadamente 3 minutos, e incluso más preferentemente en aproximadamente 2 minutos. En ciertas formas de realización, la disociación se produce con respecto a la temperatura y no requiere enzimas, agentes químicos o condiciones de reacción de amplificación, como el pH.
Los cebadores oligonucleotídicos modificados tal como se divulgan en el presente documento tienen dos estados. El primer estado del cebador oligonucleotídico modificado está en estado inactivo debido a la presencia de un grupo de modificación hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización inicial, preferentemente 80ºC o, preferentemente, 85ºC, o, preferentemente, 90ºC o, preferentemente, 95ºC. Después de alcanzar la temperatura de desnaturalización inicial, el cebador oligonucleotídico se activa mediante fragmentación intramolecular inducida térmicamente que convierte el oligonucleótido al segundo estado. Este segundo estado del cebador oligonucleotídico es el correspondiente cebador oligonucleotídico no modificado que tiene un enlace fosfodiéster en estado activo y se puede extender con la acción de la polimerasa. La disociación del grupo de modificación se produce, preferentemente, a aproximadamente 95ºC entre aproximadamente 0,1-120 minutos, o entre aproximadamente 1-120 minutos, o entre aproximadamente 2-90 minutos o entre aproximadamente 2-60 minutos o entre aproximadamente 2-40 minutos o entre aproximadamente 2-30 minutos, 2-10 minutos o entre aproximadamente 2-8 minutos o entre aproximadamente 2-5 minutos; o 2 minutos o 5 minutos o 10 minutos. En ciertas formas de realización, la disociación se produce con respecto a la temperatura y no requiere enzimas, agentes químicos o condiciones de reacción de amplificación, como el pH. En otra forma de realización, el grupo de modificación no se disocia de un oligonucleótido modificado por debajo de aproximadamente 80ºC o por debajo de aproximadamente 85ºC o por debajo de aproximadamente 90ºC.
También se divulga en el presente documento un cebador oligonucleotídico para amplificación de ácido nucleico en el que la secuencia de ácido nucleico tiene uno o más grupos de modificación. Preferentemente, el grupo de modificación incluye uno o más de los siguientes grupos químicos de fórmula I, Fórmula la, Fórmula Ib, Fórmula Ic, Fórmula Id, Fórmula II, Fórmula III y/o Fórmula IV. En una forma de realización preferida, el oligonucleótido modificado tiene entre aproximadamente 6-70 nucleótidos de longitud, preferentemente 10-45 nucleótidos de longitud, preferentemente entre 15-30, más preferentemente entre 19-29.
El cebador oligonucleotídico modificado tiene al menos un enlace internucleotídicos modificado. En otra forma de realización, el cebador oligonucleotídico puede comprender una secuencia contigua de 2, 3, 4, 5 ó 6 enlaces internucleotídicos modificados que terminan en el extremo 3’ del cebador oligonucleotídico. En otra forma de realización, el cebador oligonucleotídico puede comprende múltiples enlaces internucleotídicos modificados en 3’ no contiguos. El extremo 5’ del cebador oligonucleotídico modificado puede también tener una secuencia de nucleótidos, incluidos enlaces internucleotídicos modificados. En otra forma de realización, todos los enlaces internucleotídicos del oligonucleótido pueden estar modificados.
En otra forma de realización preferida, el cebador oligonucleotídico modificado comprende un grupo de modificación en el enlace internucleotídico 3’ n del cebador oligonucleotídico en el que n es el enlace internucleotídico en el extremo 3’. En otras formas de realización más, el grupo de modificación está en el enlace internucleotídico 3’ n-1, n-2, n-3 o n-4 del oligonucleótido. En otra forma de realización más, el oligonucleótido tiene grupos de modificación en más de una de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; preferentemente dos o más de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; preferentemente tres o más de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; preferentemente cuatro o más de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; preferentemente cinco o más de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6
o preferentemente seis o más de las posiciones n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6.
El grupo de modificación se puede integrar en un oligonucleótido usando los procedimientos síntesis automática y purificación existentes. Los cebadores oligonucleotídicos tal como se divulgan en el presente documento se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, incluida la síntesis química automática en fase sólida usando precursores de cianoetilfosforoamidita (Barone y coI., 12 Nucleic Acids Research, 4051 (1984)), y como se describe en J. Sambrook, E. F. Fritsch y Maniatis, T., Molecular Cloning, ch. 11 (2ª ed. 1989). Otros enfoques incluyen procedimientos de síntesis de fosfotriéster y fosfodiéster que se pueden usar (Narang, y col., Meth. Enzymol. 68-90 (1979)). Una revisión exhaustiva de diversos procedimientos para la síntesis de oligonucleótidos modificados y no modificados se puede encontrar en Beaucage, S.L. y coI., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2006). Tras la síntesis y purificación de un cebador oligonucleotídico modificado se pueden usar varios procedimientos diferentes para determinar la aceptabilidad del cebador oligonucleotídico en términos de tamaño y pureza. Uno de estos procedimientos es la electroforesis en gel de poliacrilamida. Otro de estos procedimientos es la cromatografía de líquidos de alto rendimiento ("HPLC"). Estos procedimientos son bien conocidos para los expertos en la técnica. Los procedimientos actuales empelados para la purificación y la separación en la técnica se pueden aplicar también a los cebadores oligonucleotídicos modificados. Se puede usar cualquier grupo de modificación que consiga los propósitos de la presente invención. El grupo de modificación deberá ser uno que se disocie o se pueda eliminar en las condiciones de la reacción de amplificación en la que se usa el cenador oligonucleotídico modificado. Por otro lado, la modificación no debe disociarse tan rápido que no se pueda obtener el control de la disociación necesario para alcanzar los beneficios de la presente invención. El tipo y la extensión de la modificación del extremo 3’ del cebador oligonucleotídico modifica se determina, en general, empíricamente con el objetivo de alcanzar los parámetros anteriores para el control de la disociación del extremo 3’ del cebador oligonucleotídico modificado.
Aunque se entiende que no todos los cebadores oligonucleotídicos en la reacción de amplificación estarán inicialmente en el estado inactivo, preferentemente la mezcla de estados del cebador oligonucleotídico mejora la especificidad en una población mixta en comparación con no usar ningún oligonucleótido modificado. Preferentemente, los oligonucleótidos modificados comprenden al menos un 30% de los oligonucleótidos totales, preferentemente al menos un 70% de los oligonucleótidos totales, preferentemente al menos un 80% de los oligonucleótidos totales y, más preferentemente, al menos un 90% de los oligonucleótidos totales. En otra forma de realización, sólo los oligonucleótidos directos o sólo los inversos pueden ser oligonucleótidos modificados. En las reacciones con sólo una orientación de oligonucleótidos modificados, tal como oligonucleótidos directos, los oligonucleótidos modificados comprenden al menos un 50% de los oligonucleótidos directos totales o al menos un 60% de los oligonucleótidos directos totales o al menos un 70% de los oligonucleótidos directos totales o al menos un 80% de los oligonucleótidos directos totales o al menos aproximadamente un 90% de los nucleótidos directos totales.
También se divulga en el presente documento una fosforoamidita químicamente modificada con un grupo de modificación que se puede extraer con calor cuando se forma el oligonucleótido correspondiente. Cada fosforoamidita se puede modificar con un grupo termolábil que a su vez se puede usar en la síntesis de cebadores oligonucleotídicos que sea compatible con los procedimientos de síntesis actuales. La fosforoamidita modificada se puede añadir a cualquier posición del cebador oligonucleotídico. En contraste con ello, la modificación de glioxilo sólo se puede añadir a guanina (dG). Por tanto, la localización de la modificación depende de la secuencia del cebador oligonucleotídico. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden tener grupos de modificación añadidos específicamente en cualquier posición o posiciones deseadas.
También se divulga un cebador que contiene análogos nucleosídicos, tal como se describe en el presente documento.
La ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), una polimerasa termoestable, así como otras ADN polimerasas no extienden fácilmente los cebadores oligonucleotídicos que tienen uno o más enlaces internucleotídicos modificados con metilfosfonato en su extremo 3'. Sauer, y col. 30 Nucleic Acids Res., e22 (2002). Aunque no cabe predecir que los enlaces internucleotídicos de metilfosfonato (Figura 1) sufrieran conversión térmicamente inducida en un enlace fosfodiéster en estado activo en medios acuosos neutros, se puede diseñar una modificación alternativa como en la presente invención para hacerlo en case a factores estéricos y electrónicos.
También se divulga en el documento un cebador oligonucleotídico químicamente modificado con un grupo protector extraíble por calor en temperaturas compatibles con procedimientos de amplificación actualmente en uso. El grupo de modificación puede alterar el apareamiento de bases con una secuencia diana o inhibe la extensión por la polimerasa. La polimerasa no puede extender el cebador oligonucleotídico hasta que la reacción de amplificación alcanza una temperatura óptima que coincide con la etapa de desnaturalización inicial de la PCR y disminuye significativamente los productos de amplificación no deseados.
Además de ser estable a temperatura ambiente, el grupo de modificación es estable en las condiciones para la síntesis de cebadores oligonucleotídicos, procedimientos de separación tales como cromatografía, procedimientos de purificación tales como precipitación en alcohol, almacenamiento prolongado y preparación de la reacción de amplificación Preferentemente, los oligonucleótidos modificados se almacenan en forma de un sólido o en solución de DMSO a -80ºC, -20ºC, 4ºC o a temperatura ambiente.
En otra forma de realización, los cebadores oligonucleotídicos con el grupo de modificación son sustancialmente quiralmente puros (Rp o Sp). Stec, y coI., 26 Tetrahedron Lett., 2191-2194 (1985), Gallo, y col., 14 Nucleic Acids Res., 7405-7420 (1986), Koziolkiewicz, y col., 26 Chem. Scripta, 251-60 (1986) y LaPlanche, y coI., 14 Nucleic Acids Res., 9081-93 (1986) han descrito técnicas de separación. .
5
10
15
20
25
30
35
40
45
En otra forma de realización, los cebadores oligonucleotídicos con o sin el grupo de modificación son complementarios al ácido nucleico diana de interés. Preferentemente, el cebador oligonucleotídico es al menos 75%, al menos 85%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y, más preferentemente, al menos 98% complementario del ácido nucleico diana.
También se divulgan kit que contienen un cebador oligonucleótido modificado. Por ejemplo kit que contienen reactivos de PCR, así como cebadores oligonucleotídicos modificados para las dianas de amplificación habituales tales como genes domésticos. El kit puede comprender uno o más reactivos de amplificación de ácido nucleico seleccionados del grupo que consiste en tampón de reacción, dNTP, magnesio, polimerasa y cebadores oligonucleotídicos modificados. Preferentemente, el kit comprende dos o más reactivos de amplificación de ácido nucleico, preferentemente tres o más y más preferentemente cuatro o más.
También se divulgan reactivos de fosforoamidita modificados para la síntesis de cebadores en fase sólida. Estos reactivos se venderán individualmente o en equipos. Estos reactivos pueden incluir las fosforoamiditas de los cuatro desoxinucleótidos naturales (dA, dC, dG, and dT) modificados con uno del(los) grupo(s) de modificación descrito(s). Los reactivos pueden también incluir fosforoamiditas de análogos nucleosídicos tal como se ha definido en el presente documento.
También se divulgan reactivos de soporte sólido para usar en la síntesis de cebadores en fase sólida. Estos soportes sólidos contendrán al menos dos nucleótidos unidos, con grupos de modificación internucleótidos de fórmula I, la, Ib, Ic, Id, II, III o IV o en todas las posibles posiciones a lo largo del oligonucleótido.
La invención se describirá a continuación con mayor detalle por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Síntesis de nucleósidos fosforoamiditas
Una primera etapa de sintetizar una foforoamidita nucleósido es hacer reaccionar la bis(diisopropilamino)clorofosfina con el alcohol precursor del grupo de modificación deseado. El producto monoesterificado resultante se hace reaccionar con el nucleósido adecuadamente protegido en presencia de diisopropilamonio tetrazolida como catalizador para generar el nucleósido fosforoamidita nucleósido. Aunque los alcoholes N-(2-hidroxiemil)ftalamida, 4-oxo-1pentanol y 4-metiltio-1-butanol están comercialmente disponibles, se puede preparar 3-(N-terc-butilcarboxamido)-1propanol de acuerdo con el procedimiento publicado por Wilk, A., y col., 67 J. Org. Chem., 6430-38 (2002)
Previendo la baja estabilidad del fragmento de fosfotriéster en los cebadores oligonucleótidos sintetizados, las bases nucleosídicas se protegieron con un grupo protector ultradébil o tradicional, en los que el grupo protector de bases ultradébil incluía fenoxiacetilo para adenina y citosina, e isopropil-fenoxiacetilo para guanina.
Tras la producción de fosforoamiditas modificadas para 2’-desoxiadenosina, 2’-desoxicitosina, 2’-desoxiguanosina y 2’desoxitimidina, se sintetizaron las secuencias tetranucleotídicas modelo que contenían un único grupo PTE 3’internucleótido. El acoplamiento entre la fosforoamidita modificada y un 5’-OH nucleósido unido a un soporte de CPG puede realizarse manualmente o mediante una máquina para síntesis automática. En este caso se usó 8909 Expedite Synthesizer de acuerdo con los protocolos sugeridos por el fabricante.
Los derivados tetranucleótido 3-fosfotriéster se desprotegieron y escindieron del soporte de CPG mediante tratamiento con carbonato potásico 50 mM en metanol durante varias horas. Se usó purificación HPLC de fase inversa (con el gradiente de acetonitrilo en tampón de acetato de trietilamonio (pH 7,2)) para el aislamiento de los 3'-fosfotriéster tetranucleótidos que contienen grupos 4-metiltio-1-butanol (MTB), 4-oxo-1-pentanol (OXP) y 3-(N-tercbutilcarboxamido)-1-propanol (TBCA). En la mayoría de los casos, las condiciones usadas durante la síntesis, desprotección y escisión del soporte tuvieron como resultado una pérdida parcial de la función de PTE (para el grupo N-(2-hidroxietil)ftalimido PTE, EPH, durante estas etapas se produjo la desprotección completa). Con optimización adicional, el grado de degradación de la funcionalidad PTE puede disminuir significativamente. Se demostró que cada uno de los 3'-fosfotriéster tetranucleótidos era estable durante varios meses cuando se mantuvieron en solución congelada a -70ºC. Además de las secuencias de los tetranucleótidos también se prepararon secuencias de oligonucleótidos protegidos con PTE más largas adecuadas para PCR. En la Tabla 1 siguiente se proporcionan Ejemplos.
Tabla 1: Desoxioligonucleótidos sintetizados
- Secuencia (5’ a 3’)
- Grupo PTE Descripción
- GCAT (SEQ ID NO:1)
- TBCA modelo
- GCAT (SEQ ID NO:2)
- MTB Modelo
- GACT (SEQ 10 NO:3)
- TBCA modelo
- GCAT (SEQ 10 NO:4)
- OXP Modelo
- GACPa (SEC ID Nº 5)
- EPH modelo
- GAA TTG GGT GTC AAC ATA GCA GAA T (SEC ID Nº 6)
- OXP Cebador 1 de VIHb
- GAA TTG GGT GTC AAC ATA GCA GAA T (SEC ID Nº 7)
- Ninguno Cebador 1 de VIH
- AAT ACT ATG GTC CAC ACA ACT ATI GCT (SEC ID Nº 8)
- OXP Cebador 2 de VIH
- AAT ACT ATG GTC CAC ACA ACT ATT GCT (SEC ID Nº 9)
- nINGUNO Cebador 2 de VIH
- AAG GAG CTG GCT GAC ATT TTC G (SEC ID Nº 10)
- OXP Cebador 1 de ADNc Lambda
- AAG GAG CTG GCT GAC ATT TTC G (SEC ID Nº 11)
- Ninguno Cebador 1 de ADN Lambda
- CGG GAT ATC GAC ATT TCT GCA CC (SEC ID Nº 12)
- OXP Cebador 2 de ADN Lambda
- CGG GAT ATC GAC ATT TCT GCA CC (SEC ID Nº 13)
- Ninguno Cebador 2 de ADN Lambda
- TAA TGC CTA TTC TGC TAT GTT GGC ACC CAA TTC TTT TTT T ·(SEC ID Nº 14)
- Ninguno Molde 1 del VIH
- AAT CTT AGC AAT AGT TGT GTG GAC CAT AGT ATT TTT TTT T (SEC ID Nº 15)
- Ninguno Molde 2 del VIH
- apérdida completa del grupo PTE se produjo durante la desprotección bdiana de VIH: Kit de reactivos control Gen AMplimer HOV-1 cdiana de ADN lambda: Clon 857 Sam 7 (Roche)
Ejemplo 2
Conversión cinética de un oligonucleótido modificado con PTE en la correspondiente secuencia de PDE
Se investigó la cinética de la desprotección de las secuencias de tetranucleótidos modificadas con 3’-fosfotriéster (PTE)
5 con la correspondiente secuencia de fosfodiéster (PDE) a Ph “neutro” (en mezcla de acetoniTrilo acetato de trietilamonio, pH 7,2) o en tampón de PCR (Ph 8,4 a 25ºC) a 20ºC, 50ºC y 95ºC. En ambos tampones fueron obvias cinéticas de desprotección similares para los cebadores oligonucleotídicos que contienen PTE.
El t1/2 para la conversión del cebador oligonucleótido modificado con PTE en la correspondiente secuencia de PDE se determinó que variaba de > 1 minuto a 10 minutos a 95ºC para los derivados de tetranucleótido 3’-fosfotriésteR OXP,
10 MTB y TBCA. A una temperatura menor (50ºC), las cinéticas de desprotección fueron menores, variando el t1/2 de 10 a 105 minutos. A temperatura ambiente (20ºC), el t1/2 fue entre 3 y > 100 horas. Para la aplicación adecuada en tecnologías de PCR de inicio en caliente, los grupos PTE deberán ser óptimamente estables durante las condiciones de síntesis y desprotección (20ºC) y se pueden eliminar fácilmente a temperaturas elevadas (95º).
Ejemplo 3
Para la síntesis y preparación a mayor escala de cantidades en múltiples gramos (escala a partir de 5 g) de las fosforoamiditas protegidas en 3’ de dA, dG, dC y dT usando el procedimiento en recipiente de dos etapas que se muestra en la Figura 3. Como antes se usaron grupos protectores ultradébiles para aminoácidos exocíclicos de las bases nucleosídicas. Las fosforoamiditas 3’ nucleósido protegidas en 5’-DMT se aislaron mediante cromatografía en
20 gel de sílice con un rendimiento global de 50-70ºC y se demostró que un sólido era estable a temperatura ambiente durante al menos dos semanas. Se ha previsto que la nucleósido 3’-fosforoamidita debería ser estable para su almacenamiento a baja temperatura (entre aproximadamente -70ºC a -100ºC) durante al menos un año.
Ejemplo 4
Comparación de la extensión por ADN polimerasa de PTE y PDE
Para las dianas de ADN de VIH-1 (Q. Chou y col.) y Lambda se preparó una serie de cebadores oligonucleótidos directos e inversos, que contenían modificaciones PTE. Para cada diana, un conjunto contenía un grupo fosfotriéster en el enlace 3’-internucleotídico y el otro conjunto contenía el enlace fosfodiéster en estado activo en la posición correspondiente. Estos cebadores oligonucleotídicos se escogieron porque se demostró que los cebadores oligonucleotídicos de PDE no modificados formaban dímeros de cebadores durante la PCR. El primer acoplamiento entre la fosforoamidita modificada y el 5’-OH nucleósido unido a un soporte sólido-CPG se realizó manualmente, mientras que el resto de la síntesis se realizó en 8909 Expedite Synthesizer usando los protocolos sugeridos por el fabricante (a escala de 1 µmol). Los cebadores oligonucleotídicos se desprotegieron y escindieron del soporte polimérico usando carbonato potásico 50 mM en metanol. La purificación en HPLC de fase inversa (con un gradiente de acetonitrilo en tampón de acetato de trietilamonio (Ph 7,2)) permitió el éxito de la purificación y el aislamiento de los cebadores oligonucleotídicos modificados con 3’-fosfotriéster. Se demostró que los cebadores oligonucleótidos con PTE aislados eran estables durante varios meses cuando se mantienen en una solución congelada a -20ºC.
Los cebadores de PDE y PTE aislados se hibridaron con moldes complementarios y se sometieron a experimentos de extensión con ADN polimerasa.Como control en estos experimentos se calentaron alícuotas de los cebadores de PDE y PTE a 95ºC durante la cantidad de tiempo necesaria para la eliminación del grupo PTE y se incluyeron en los experimentos de extensión del cebador. Los experimentos de extensión del cebador se realizaron a temperatura ambiente tanto para el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I como para la Taq ADN polimerasa, para evitar la pérdida extensa de la funcionalidad PTE. Para monitorizar la cinética de la extensión del cebador se tomaron alícuotas a intervalos de tiempo especificados durante un periodo de 2 a 80 minutos y se inactivaron en hielo seco mediante la adición de EDTA. El progreso de la extensión se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Es interesante que se ha descubierto que los cebadores modificados con PTE no calentados migraban más lentamente durante la electroforesis en gel que los correspondientes cebadores oligonucleotídicos de PDE (calentados o no( y que los cebadores oligonucleotídicos con PTE calentados.
Se investigaron las capacidades de la ADN polimerasa Taq y del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para realizar la elongación dependiente de molde del cebador oligonucleotídico modificado con 3¡-PTE (y los cebadores oligonucleotídicos control no modificados con PDE). En las condiciones de la reacción de amplificación se encontró que se puede alongar un cebador estándar con PDE hasta obtener un producto de extensión de longitud completa mientras que los cebadores oligonucleotídicos con PTE se extienden muy mal con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Durante el marco de tiempo de las reacciones de extensión del cebador se produjo una ligera acumulación de productos de extensión truncados para las reacciones que contienen el cebador oligonucleotídico con PTE, algo que puede atribuirse a una desprotección parcial del cebador oligonucleotídico con PTE durante la reacción de extensión o a la extensión preferente de un estereoisómero de PTE. Cuando los cebadores oligonucleotídicos con PDE y PTE se calentaron previamente a 95ºC, la extensión del cebador oligonucleotídico ya no está obstaculizada y es consistente con un cebador oligonucleotídico con PDE. Aunque los experimentos de extensión más detallados se realizaron con el fragmento Klenow mesofílico de la ADN polimerasa I, se obtuvieron resultados similares con la ADN polimerasa Taq, una ADN polimerasa adecuada para PCR. En general, la capacidad de extensión de los cebadores oligonucleótidos que contienen PTE se redujo significativamente con respecto al correspondiente cebador oligonucleotídico con PDE en estado activo, un criterio esencial para un cebador oligonucleotídico para PCR “de inicio en caliente” de la presente invención.
Ejemplo 5
Debido a la mala capacidad de extensión del cebador oligonucleotídico con PTE en los experimentos de extensión de cebadores oligonucleotídicos (Ejemplo 4), se concluyó que los cebadores oligonucleotídicos con PTE deberían disminuir considerablemente la cantidad de dímero de cebador formado durante la preparación de muestras y la etapa de calentamiento inicial de la PCR restringiendo la capacidad de extensión de la ADN polimerasa. Para explorar adicionalmente el efecto del grupo modificado con PTE sobre la formación de dímero del cebador, se evaluaron las condiciones de PCR que generan dímeros de cebador con rendimientos altos en ausencia del molde. Por tanto, los cebadores oligonucleotídicos modificados con PTE dirigidos al gen tat del VIH-1 se calentaron previamente a 95ºC en tampón de PCR (pH 8,4 a 25ºC) para incrementar las cantidades de tiempo antes de la amplificación por PCR mediante la ADN polimerasa Taq. Mediante precalentamiento de los cebadores con PTE para cantidades crecientes de tiempo se puede evaluar el efecto de la modificación con PTE sobre la formación de dímeros del cebador. Los dímeros de cebador, que se detectaron mediante electroforesis en gel de agarosa, se observaron en forma de un fragmento de 50-80 pares de bases.
Para el par de cebadores oligonucleótidos del VIH-1, la concentración del cebador oligonucleotídico para la formación de dímeros de cebador fue de 4,5 µM, aproximadamente 5 veces mayor de lo que generalmente se recomienda y los parámetros para el ciclado de la PCR incluyeron: 95ºC para 2 minutos; 30 ciclos de [95ºC durante 40 segundos; 56ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 2 minutos]; 72ºC durante 7 minutos. durante el tratamiento de calentamiento previo a la PRC de los correspondientes cebadores oligonucleotídicos con PTE antes de fijar la PCR, la cantidad de cebador oligonucleotídico con PDE generada debería ser proporcional al tiempo de precalentamiento de los cebadores oligonucleotídicos con PTE. Los inventores han descubierto que a medida que la fracción de cebadores oligonucleotídicos con PDE formada aumentaba, también lo hace la probabilidad de formar dímeros de cebadores durante la PCR. Para tiempos de pre-incubación hasta 0-40 minutos, la cantidad de dímero de cebador formada es proporcional al tiempo de calentamiento pre-PCR y la proporción se correlaciona de forma positiva con la cinética de la conversión del cebador oligonucleotídico con PTE en el cebador oligonucleotídico con PDE a 95ºC. No obstante, cuando los cebadores oligonucleotídicos con PTE sufren un extenso tratamiento de precalentamiento (80 y 150 minutos), la cantidad de formación de dímero de cebador disminuye, una posible consecuencia de la degradación de los cebadores oligonucleotídicos mediante despurinación. Eh general, el nivel de formación de dímero de cebador oligonucleotídico en la PCR disminuyó significativamente mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos con PTE.
Ejemplo 6
Rendimiento de los cebadores oligonucleotídicos con PTE en PCR
Para el cebador de ADN de lambda y del ADN del VIH-1, se identificaron las condiciones de PCR que formaban de forma eficiente dímeros de cebadores con los cebadores oligonucleotídicos con PDE no modificados en presencia de un molde. Usando los cebadores oligonucleotídicos dirigidos a los moldes de ADN del VIH y de lambda, las condiciones óptimas para la formación eficiente de dímeros de cebadores en presencia de molde emplearon una concentración de 1-2 µM de los cebadores oligonucleotídicos tanto directo como directo, 5-40.000 copias del molde y MgCl2 1,5 a 2,0 mM. Los parámetros del ciclo de PCR se usaron del siguiente modo: 95ºC durante 2 minutos; 40 ciclos de [95ºC durante 40 segundos; 56ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 2 minutos]; 72ºC durante 7 minutos. El progreso de la reacción se monitorizó eliminando los alícuotas después de los ciclos 30, 35 y 40, y analizándolos mediante electroforesis en gel de agarosa.
Para las dianas de ADN de lambda y del VIH-1, se descubrió que los cebadores oligonucleotídicos modificados con PTE no calentados (PTE 0ºC) mejoraban considerablemente el resultado de la PCR en comparación con los cebadores oligonucleotídicos con PDE no modificados sin calentar (PDE 0ºC). En cada caso, los cebadores oligonucleotídicos con PTE sin calentar mostraron una considerable disminución de la cantidad de formación de dímero de cebador y un correspondiente incremento en la formación de amplicones.
Para asegurar que los mejores resultados de los cebadores oligonucleotídicos con PTE en la PCR no se debían a ninguna diferencia en la preparación y manipulación de los cebadores oligonucleotídicos con PDE y PTE, los cebadores oligonucleotídicos con PTE se calentaron previamente en tampón de PCR para la conversión en el correspondiente cebador oligonucleotídico con PDE. Posteriormente, los cebadores oligonucleotídicos con PTE calentados (PTE 95ºC) y los cebadores oligonucleotídicos con PDE calentados (PDE 95ºC) se emplearon en la PCR y se descubrió que se formaban dímeros de cebador hasta un grado similar, si no mayor, que los cebadores oligonucleotídicos con PDE. La integración de las bandas de amplicón y de los dímeros de cebador para el sistema de ADN de lambda y del VIH (para el ciclo 35) revelaron una proporción mucho mayor entre el amplicón y el dímero de cebador para los cebadores oligonucleotídicos con PTE en comparación con las amplificaciones con PCR que se realizaron con cebadores oligonucleotídicos con PDE o con cebadores oligonucleotídicos con PTE calentados. Cuando la proporción entre el amplicón y el dímero de cebadores para todas las reacciones de amplificación se normalizó con respecto a la proporción para el cebador oligonucleotídico con PTE sin calentar se observó una marcada mejora en la especificidad de la PCR para la formación de amplicones tanto para el sistema del ADN de lambda como para el de ADN del VIH-1. El cebador oligonucleotídico con PTE produjo una mejora de entre 2,6 y 15 veces en el rendimiento de la PCR. En general, se ha demostrado la utilidad de los cebadores oligonucleotídicos con PTE en la PCR de inicio en caliente de la presente invención en comparación con los cebadores oligonucleotídicos con PDE. La cantidad de dímero de cebadores disminuyó significativamente con un incremento concurrente de la producción de amplicones.
Ejemplo 7
Se prepararon cebadores modificados con PTE para un sistema de RT-PCR de dos etapas usado para la detección del gen doméstico de la porfobilinógeno desaminasa (PBGD) tal como describen Kielar, D., y col., 47 Clinical Chemistry 2089-2097 (2001). Se fabricaron cebadores directos de SEC ID Nº 16 (5'-GAGTGATICGCGTGGGTACC) y cebadores inversos de SEC ID Nº 17 (5'-GGCTC-CGATGGTGAAGCC) que contienen dos modificaciones con PTE por cebador en las dos posiciones terminales en 3’. Se usó detección de un producto amplicón de 264 pb para validad un sistema de protocolo de dos etapas.
El protocolo de dos etapas incluye transcripción inversa, seguida por amplificación por PCR. Condiciones de la transcripción inversa utilizadas fueron cebador oligo(dT) 0,4 µM, 0 o 1 µg de ARN total de hígado humano y 15 U de transcriptasa inversa AMV clonada en una reacción de 20 µl. La reacción se sometió al siguiente protocolo de ciclado térmico con transcriptasa inversa: 25ºC durante 10 minutos; 42ºC durante 60 minutos; y 95ºC durante 5 minutos. Tras la finalización, el producto de la transcripción inversa se diluyó a 1 en 10 y se usó como molde para una serie de reacciones de PCR. Se prepararon dos conjuntos de reacciones de PCR. El primer conjunto contenía cebadores de PDE no modificados a 0,5 µM y el segundo conjunto contenía cebadores modificados con PTE a 0,5 µM. Cada conjunto de reacciones contenía tres reacciones, cada una de las cuales utilizaba moldes diferentes: Reacción a) agua, reacción b) 0 µg del producto de transcripción inversa del ARN total de hígado humano y reacción c) 1 µg del producto de transcripción inversa del ARN total de hígado humano. Todas las reacciones de PCR contenían 1,25 U de ADN polimerasa Taq y tenían un volumen de 50 µl. Las mezclas se sometieron al protocolo de ciclado térmico: 94ºC durante 10 minutos; [94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos] 40 veces. Los productos de reacción se analizaron después mediante análisis en gel de agarosa. Las reacciones a) y b) de ambos conjuntos funcionaron como controles negativos. Para los controles negativos, los cebadores con PDE no modificados formaron una cantidad significativa del dímero de cebadores, mientras que los cebadores con PTE modificados no mostraron ninguna formación detectable de dímero de cebadores. Para los cebadores con PDE y con PTE, la reacción c) formó el producto de 264 pb deseado. No obstante, como fue evidente a para los controles negativos, las reacciones del cebador con PDE contenían una cantidad significativa de formación de dímero de cebadores, mientras que las reacciones del cebador con PTE no la contenían. En general, el beneficio de los cebadores modificados con PTE en la RT-PCR de dos etapas es evidente, los cebadores modificados suprimían la formación de dímeros de cebadores no deseados.
Los mismos pares de cebadores también se usaron en un protocolo de RT-PCR de una etapa. Como en el protocolo de dos etapas se prepararon dos conjuntos de reacciones. El primer conjunto contenía cebadores con PDE no modificados a 0,5 µM y el segundo conjunto contenía cebadores modificados con PTE a 0,5 µM. Cada conjunto constaba de tres reacciones, siendo las reacciones b) y c) controles negativos. La reacción a) consistió en 0,25 µg de ARN total de hígado humano y 25 U de transcriptasa inversa de MMLV, la reacción b) consistió en 0,25 µg de ARN total de hígado humano y 0 U de transcriptasa inversa de MMLV y la reacción c) consistió en 0 µg de ARN total de hígado humano y 25 U de transcriptasa inversa de MMLV. Todas las reacciones contenían cebadores oligo(dT) a 5 µM y 0,3 U de ADN polimerasa Taq y fueron de un volumen de 25 µl. Las reacciones se incubaron del siguiente modo: 42ºC durante 60 minutos; 94ºC durante 5 minutos; [94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 5 minutos] 30 veces; y 72ºC durante 5 minutos. Los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Para ambos pares de cebadores, los controles sin RT, b) parecieron los mismos, con un ligero borrón en el gel, que probablemente se deba a la presencia de ARN total en las muestras. Para los controles sin ARN c) los cebadores con PDE mostraron una banda de dímero de cebador de bajo peso molecular, mientras que los cebadores con PTE no mostraron ningún producto de amplificación detectable. Es probable que la banda del dímero de cebador de bajo peso molecular se deba a la extensión mediada por transcriptasa inversa de los cebadores para PCR con PDE, como han tratado Peters, I.R., y col., 286 Journal of Immunological Methods 203-217 (2004). Para la reacción a) ambos pares de cebadores formaron el producto de 264 pb deseados. No obstante, el producto de reacción para los cebadores con PDE contenía varios productos de amplificación, incluida la banda del dímero de cebador observada en la reacción b), mientras que los cebadores con PTE formaron el producto de reacción deseado sin ningún producto de amplificación adicional. El uso de cebadores modificados con PTE en reacciones enzimáticas secuenciales, tal como RT-PCR de una etapa, permite que los cebadores específicos de gen se bloqueen parcial o completamente de la extensión durante la reacción de transcripción inversa a menor temperatura.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente.
Otras formas de realización se exponen en las reivindicaciones siguientes.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> TRILINK BIOTECHNOLOGIES
<120> CEBADORES OLIGONUCLEOTÍDICOS MODIFICADOS QUÍMICAMENTE PARA LA AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO
<130> p39903
<140> 07 777161.6
<141> 17/05/2007
<150> 60/810,665
<151> 01/06/2006
<160> 17
<170> Patentln ver. 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 1 gcat 4
<210> 2
<211> 4
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 2 gcat 4
<210> 3
<211> 4
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 3 gact 4
<210> 4
<211> 4
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 4 gcat 4
<210> 5
<211> 4
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 5
gact 4
<210> 6
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 6 gaattgggtg tcaacatagc agaat 25
<210> 7
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 7 gaattgggtg tcaacatagc agaat 25
<210> 8
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 8 aatactatgg tccacacaac tattgct 27 <210> 9
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 9 aatactatgg tccacacaac tattgct 27
<210> 10
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 10 aaggagctgg ctgacatttt cg 22
<210> 11
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 11 aaggagctgg ctgacatttt cg 22
<210> 12
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 12 cgggatatcg acatttctgc acc 23
<210> 13
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 13 cgggatatcg acatttctgc acc 23
<210>14
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 14 taatgcctat tctgctatgt tggcacccaa ttcttttttt 40
<210> 15
<211> 40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético
<400> 15 aatcttagca atagttgtgt ggaccatagt attttttttt 40
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético
<400> 16 gagtgattcg cgtgggtacc 20
<210> 17
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético
<400> 17 ggctccgatg gtgaagcc 18
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1.-Un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho procedimiento:amplificar el ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado,en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado comprende un grupo de modificación en uno o más enlacesinternucleotídicos; en el que dicho grupo de modificación puede disociarse térmicamente de forma no reversible; y en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado tiene la estructura I siguiente
imagen1 10en la que:Nuc es un nucleósido dentro de la secuencia del cebador;U y Z son, de forma independiente, O, S, Se, NR9, o CR9R10;R9 y R10 son cada uno de forma independiente hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado 15 opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, en el que cada uno puede incluirindependientemente al menos un sustituyente seleccionado de halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amidoo un marcador detectable; Y es O, S o Se; W es O, S, S(O), S(O)2, Se, C(O), C(S), C(O)NH, NH o NR9; y20 Q es un grupo de modificación que comprende uno o más grupos térmicamente escindibles. 2.-El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:(1) dicho grupo de modificación, Q, comprende uno o más grupos de modificación seleccionados del grupo que consiste en -L-X-R1 (Fórmula I) 25 en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono;X es O, S(O), S(O)2, C(O), C(S) o C(O)NH; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo,30 alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;imagen1 (Fórmula Ia)en la queL es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; yR1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que puedenincluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo,alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; L-S(O)k-R1 (Fórmula Ib)en la que: k es un número entero de 0-2; L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que puedenincluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;imagen1 10 (Fórmula Ic)en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; ycada R1 es, de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 15 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;imagen1 (Fórmula Id)20 en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que puedenincluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; 25 -L-R2 (Fórmula II) en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R2 es hidrógeno, ciano o un carbociclo, heterociclo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que tiene entre 5 y 10 átomos;30 -La-A-Lb-B (Fórmula III) en la que:La y Lb se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono; A es O, S, S(O), S(O)2, Se, CR3R4, NR3, C(O), C(S) o CNR3;35 B es C(O)R3, C(S)R3, C(O)NR3R4, OR3 o SR3; yR3 y R4 son, cada uno de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene5101520253035401-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; y-La-D-Lb-E-Lc (Fórmula IV)en la que:La, Lb y Lc se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono;D es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR5;E es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR6;F es hidrógeno, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NR7R8, OR7 y SR7;R5 y R6 pueden ser, cada uno de forma independiente, hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxio amino, o R5 y R6 pueden cooperar para formar un anillo mono o bicíclico que consiste en 5-10 átomos de carbono e incluye D, R5, R6, E y Lb, a condición de que cuando R5 y R6 cooperan para formar un anillo, n es de 0-2; y R7 y R8 se seleccionan cada uno de forma independiente, del grupo que consiste en arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, ariloxi opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.(2) dicho grupo de modificación, Q comprende:-L-X-R1 (Fórmula I)en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono;X es 0, S, S(O), S(O)2, C(O), C(S) o C(O)NH; yR1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;(3) dicho grupo de modificación, Q comprende:imagen1 (Fórmula Ia)en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; yR1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;(4) dicho grupo de modificación, Q comprende: L-S(O)k-R1 (Fórmula Ib)en la que: k es un número entero de 0-2; L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que puedenincluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;(5) dicho grupo de modificación, Q comprende:imagen1 5 (Fórmula Ic)en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; ycada R1 es, de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que 10 consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;(6) dicho grupo de modificación, Q comprende:imagen1 (Fórmula Id)15 en la que:L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; yR1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que puedenincluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; 20 (7) dicho grupo de modificación, Q comprende: -L-R2 (Fórmula II) en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R2 es hidrógeno, ciano o un carbociclo, heterociclo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que tiene entre 5 25 y 10 átomos;(8) dicho grupo de modificación, Q comprende: -La-A-Lb-B (Fórmula III) en la que: La y Lb son cada uno de forma independiente un enlace o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene30 entre 1 y 8 átomos de carbono; A es O, S, S(O), S(O)2, Se, CR3R4, NR3, C(O), C(S) o CNR3;B es C(O)R3, C(S)R3, C(O)NR3R4, OR3 o SR3; yR3 y R4 son, cada uno de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo 35 que consiste en hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;(9) dicho grupo de modificación, Q comprende: -La-O-Lb-E-Lc-F (Fórmula IV) en la que:La, Lb y Lc se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono; D es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR5;E es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR6;F es hidrógeno, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NR7R8, OR7 y SR7;R5 y R6 pueden ser, cada uno de forma independiente, hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxio amino, o R5 y R6 pueden cooperar para formar un anillo mono o bicíclico que consiste en 5-10 átomos de carbono e incluye D, R5, R6, E y Lb, a condición de que cuando R5 y R6 cooperan para formar un anillo, n es de 0-2; y R7 y R8 se seleccionan cada uno de forma independiente, del grupo que consiste en hidrógeno arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, ariloxi opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.(10) dicho grupo de modificación, Q, comprende uno o más restos químicos seleccionados del grupo que consiste en 4-oxo-1-hexilo, 4-oxo-1-pentilo, 5-oxo-1-hexilo, 6-oxo-1-heptilo, 1-metil-4-oxo-pentilo, 4-metiltio-1butilo, 5-metil-4-oxohexilo, 1-etil-4-oxo-pentilo, N-(2-hidroxietil)ftalimido, 2-(N-acetil-N-metil)aminoetilo, 2-(Nformil-N-metil)aminoetilo, 2-metil-5-oxo-hexilo, 1,1-dimetil-4-oxo-pentilo, 4-oxo-1-octilo, 4-oxo-1-tetradecilo, 4oxo-1-eicosamilo y 3-(N-terc-butilcarboxamido)-1-propilo;- (11)
- dicho cebador oligonucleótido modificado comprende un enlace internucleotídico fosfotriéster;
- (12)
- dicho cebador oligonucleótido modificado comprende dos o más grupos de modificación en la posición n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; en el que n es el enlace internucleotídico 3’ terminal;
- (13)
- dicho cebador oligonucleótido modificado comprende dos o más grupos de modificación;
- (14)
- dicha amplificación de ácido nucleico comprende una polimerasa de inicio en caliente;
- (15)
- dicho cebador oligonucleótido modificado es al menos un 90% quiralmente puro; o
- (16)
- dicho cebador oligonucleótido modificado comprende un marcador detectable;
- 3.-El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4.-El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha PCR comprende PCR multiplex. 5.-El procedimiento de la reivindicación 4, en el que:
- (1)
- una primera diana se amplifica usando cebadores no modificados y una segunda diana se amplifica usando cebadores no modificados; o
- (2)
- una primera diana se amplifica usando uno o más cebadores modificados con un primer grupo de modificación y una segunda diana se amplifica usando uno o más cebadores modificados con un segundo grupo de modificación, en el que dicho primero y segundo grupo de modificación son diferentes.
- 6.-El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende transcriptasa inversa (RT).
- 7.-El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende posteriores reacciones enzimáticas en un único tubo.
- 8.-el procedimiento de la reivindicación 7, en el que dichas posteriores reacciones enzimáticas comprenden la transcriptasa inversa (RT) como primera reacción enzimática y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como segunda reacción enzimática.
- 9.-El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha reacción RT comprende amplificar con uno o más cebadores no modificados y dicha reacción PCR comprende amplificar con uno o más cebadores modificados.
- 10.-El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha reacción RT comprende amplificar con uno o más de un primer cebador modificado y dicha reacción PCR comprende amplificar con uno o más de un segundo cebador modificado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81066506P | 2006-06-01 | 2006-06-01 | |
| US810665P | 2006-06-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2360738T3 true ES2360738T3 (es) | 2011-06-08 |
Family
ID=38778971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07777161T Active ES2360738T3 (es) | 2006-06-01 | 2007-05-17 | Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8361753B2 (es) |
| EP (1) | EP2032714B1 (es) |
| JP (1) | JP5558811B2 (es) |
| CN (1) | CN101517091B (es) |
| AT (1) | ATE502122T1 (es) |
| AU (1) | AU2007268075C1 (es) |
| CA (1) | CA2653841C (es) |
| DE (1) | DE602007013223D1 (es) |
| ES (1) | ES2360738T3 (es) |
| HK (1) | HK1129045A1 (es) |
| WO (1) | WO2007139723A1 (es) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2647452T3 (es) | 2006-08-08 | 2017-12-21 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Estructura y uso de oligonucleótidos 5' fosfato |
| EP2113574A1 (en) * | 2008-04-28 | 2009-11-04 | Biotype AG | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| CA2722541C (en) | 2008-04-30 | 2017-01-10 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| US9738680B2 (en) | 2008-05-21 | 2017-08-22 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof |
| ES2625938T3 (es) * | 2008-05-27 | 2017-07-21 | Trilink Biotechnologies | Nucleósidos 5¿-trifosfatos modificados químicamente para replicación de ácido nucleico iniciada térmicamente |
| CN101638685B (zh) * | 2008-07-29 | 2013-01-09 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 |
| US8906621B2 (en) * | 2009-01-06 | 2014-12-09 | Qimin You | Cross priming amplification of target nucleic acids |
| WO2011045744A2 (en) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | Syntezza Molecular Detection Israel Ltd. | Methods and compositions for amplifying target sequences from nucleic acid samples |
| WO2012094343A1 (en) * | 2011-01-05 | 2012-07-12 | Trilink Biotechnologies | Chemically substituted thermosensitive probes and cofactors for hot start ligation |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| KR20140097398A (ko) * | 2011-11-18 | 2014-08-06 | 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 | 기능적으로-변형된 올리고뉴클레오티드 및 이의 서브유니트 |
| US9353393B2 (en) | 2012-02-15 | 2016-05-31 | General Electric Company | Methods and kits for reducing non-specific nucleic acid amplification |
| US9150896B2 (en) * | 2012-09-06 | 2015-10-06 | Illumina, Inc. | Nucleotides and primers with removable blocking groups |
| EP2712870A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-02 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Novel RIG-I ligands and methods for producing them |
| MY182940A (en) | 2013-10-07 | 2021-02-05 | Mitsui Chemicals Inc | Pcr primer set for bacterial dna amplification, kit for detecting and/or identifying bacterial species, and method for detecting and/or identifying bacterial species |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| PT3906789T (pt) | 2015-09-21 | 2023-12-18 | Trilink Biotechnologies Llc | Iniciadores de oligonucleótidos de iniciação para a sintetização de arn capeados em 5' |
| US11371087B2 (en) | 2016-06-10 | 2022-06-28 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods and compositions employing blocked primers |
| US20190300934A1 (en) * | 2016-06-23 | 2019-10-03 | Riken | T-cell receptor and b-cell receptor repertoire analysis system using one-step reverse transcription template-switching pcr |
| KR102593021B1 (ko) | 2017-10-12 | 2023-10-31 | 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤 | mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 |
| WO2020036926A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Cellecta, Inc. | Multiplex preparation of barcoded gene specific dna fragments |
| EP3842550A4 (en) | 2018-08-24 | 2022-06-29 | Repertoire Genesis Incorporation | Method for analyzing functional subunit pair gene of t cell receptor and b cell receptor |
| CN109680342B (zh) * | 2018-12-18 | 2021-09-28 | 上海药明康德新药开发有限公司 | DNA编码化合物库中On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法 |
| CN114008063A (zh) * | 2019-04-17 | 2022-02-01 | 硒瑞恩股份有限公司 | 用于dna和rna聚合和测序的修饰的核苷酸和方法 |
| US11739359B2 (en) | 2020-05-01 | 2023-08-29 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Universal template strands for enzymatic polynucleotide synthesis |
| US11702683B2 (en) | 2020-05-28 | 2023-07-18 | Microsoft Technology Licensing, Llc | De novo polynucleotide synthesis with substrate-bound polymerase |
| WO2023147352A1 (en) | 2022-01-27 | 2023-08-03 | Trilink Biotechnologies, Llc | Trinucleotide cap analogs and methods of use thereof |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5852188A (en) * | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages |
| WO1993014217A1 (en) | 1992-01-10 | 1993-07-22 | Life Technologies, Inc. | Use of predetermined nucleotides having altered base pairing characteristics in the amplification of nucleic acid molecules |
| US5830655A (en) * | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
| US5773258A (en) | 1995-08-25 | 1998-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme |
| US6057134A (en) | 1996-10-07 | 2000-05-02 | Ambion, Inc. | Modulating the efficiency of nucleic acid amplification reactions with 3' modified oligonucleotides |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US6399304B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-06-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules |
| ATE280177T1 (de) | 1997-03-20 | 2004-11-15 | Hoffmann La Roche | Modifizierte primer |
| US6965041B1 (en) | 1999-03-24 | 2005-11-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
| US6274353B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-08-14 | Genecopoeia, Inc. | Method and compositions for improved polynucleotide synthesis |
| WO2001075139A1 (en) | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| WO2002018616A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-03-07 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Adjusting the efficiency of nucleic acid template amplification by attenuated pcr with template-mimic oligonucleotides |
| US6743905B2 (en) * | 2001-04-16 | 2004-06-01 | Applera Corporation | Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same |
| GB0110501D0 (en) | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| EP1275735A1 (en) | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
| US7700281B2 (en) | 2004-06-30 | 2010-04-20 | Usb Corporation | Hot start nucleic acid amplification |
| GB2416352B (en) | 2004-07-21 | 2009-01-28 | Bioline Ltd | A method for performing the hot start of enzymatic reactions |
| EP1841888A4 (en) | 2005-01-04 | 2009-05-27 | Stratagene California | CHAIN REACTION OF HOT PRIMING POLYMERASE USING A THERMOLABILE BLOCKER |
| WO2007011901A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Applera Corporation | Hot start reverse transcription by primer design |
-
2007
- 2007-05-17 DE DE602007013223T patent/DE602007013223D1/de active Active
- 2007-05-17 ES ES07777161T patent/ES2360738T3/es active Active
- 2007-05-17 AT AT07777161T patent/ATE502122T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-05-17 EP EP07777161A patent/EP2032714B1/en active Active
- 2007-05-17 WO PCT/US2007/011950 patent/WO2007139723A1/en active Application Filing
- 2007-05-17 CA CA2653841A patent/CA2653841C/en active Active
- 2007-05-17 AU AU2007268075A patent/AU2007268075C1/en active Active
- 2007-05-17 CN CN200780027958.8A patent/CN101517091B/zh active Active
- 2007-05-17 JP JP2009513171A patent/JP5558811B2/ja active Active
- 2007-05-17 US US11/750,237 patent/US8361753B2/en active Active
-
2009
- 2009-09-04 HK HK09108152.8A patent/HK1129045A1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5558811B2 (ja) | 2014-07-23 |
| EP2032714A1 (en) | 2009-03-11 |
| CA2653841A1 (en) | 2007-12-06 |
| DE602007013223D1 (de) | 2011-04-28 |
| JP2009538621A (ja) | 2009-11-12 |
| EP2032714B1 (en) | 2011-03-16 |
| US8361753B2 (en) | 2013-01-29 |
| US20070281308A1 (en) | 2007-12-06 |
| WO2007139723A8 (en) | 2009-12-17 |
| HK1129045A1 (en) | 2009-11-13 |
| CN101517091A (zh) | 2009-08-26 |
| AU2007268075B2 (en) | 2012-09-13 |
| CN101517091B (zh) | 2013-02-13 |
| EP2032714A4 (en) | 2009-12-23 |
| ATE502122T1 (de) | 2011-04-15 |
| WO2007139723A1 (en) | 2007-12-06 |
| CA2653841C (en) | 2016-07-19 |
| AU2007268075A1 (en) | 2007-12-06 |
| AU2007268075C1 (en) | 2013-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2360738T3 (es) | Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico. | |
| AU2021206780C1 (en) | Compositions and methods for synthesizing 5'-Capped RNAs | |
| ES2625938T3 (es) | Nucleósidos 5¿-trifosfatos modificados químicamente para replicación de ácido nucleico iniciada térmicamente | |
| ES2890776T3 (es) | Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño | |
| ES2749463T3 (es) | Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño | |
| JP7012957B2 (ja) | Ｒｎａ配列の簡便検出法 | |
| JP2009017882A (ja) | 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法 | |
| PT1856295E (pt) | Composições e métodos para detectar ácidos nucleicos virais específicos na urina | |
| KR101231089B1 (ko) | 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 | |
| ES2376202T3 (es) | Amplificación de �?cidos nucleicos usando un oligonucleótido modificado reversiblemente. | |
| ES2440073T3 (es) | Amplificación preferente de ARNm respecto a ADN utilizando cebadores modificados químicamente | |
| ES2835899T3 (es) | Cebador para PCR unido a secuencia complementaria de nucleótidos o secuencia complementaria de nucleótidos que incluye nucleótidos mal apareados y método para amplificar ácido nucleico mediante el uso del mismo | |
| JP5834413B2 (ja) | エネルギー移動を用いた蛍光物質による核酸検出法 | |
| ES2362987T3 (es) | Nuevo oligonucleótido marcado. | |
| WO2023192900A1 (en) | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group useful in sequencing by synthesis |