KR102593021B1 - mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 - Google Patents

mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

감도가 높은 메티실린 내성 유전자 검출을 실현하기 위한 메티실린 내성 유전자 검출용 프라이머로서, 서열 번호 3과 서열 번호 7의 조합, 서열 번호 2와 서열 번호 9의 조합, 서열 번호 1과 서열 번호 8의 조합, 서열 번호 1과 서열 번호 9의 조합, 서열 번호 4와 서열 번호 11의 조합, 서열 번호 5와 서열 번호 12의 조합, 서열 번호 6과 서열 번호 10의 조합 또는 서열 번호 6과 서열 번호 12의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어를 제공한다.

Description

mecA 유전자 증폭용 프라이머 페어, mecA 유전자 검출 키트 및 mecA 유전자 검출 방법{mecA GENE AMPLIFICATION PRIMER PAIR, mecA GENE DETECTION KIT AND mecA GENE DETECTION METHOD}
본 발명은, 메티실린 내성의 특이적인 유전 요소인, mecA 유전자를 간편, 신속하고 고감도로 검출하기 위한 프라이머 페어(primer pairs), 키트 및 검출 방법에 관한 것이다.
메티실린 내성 황색 포도 구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus, 이하 "MRSA"라고 약칭한다)은 전 세계에서 원내 감염의 주요한 원인균으로 되어 있어, 많은 나라에서 임상 상 가장 중요한 약제 내성균으로서 중요시되고 있다. MRSA의 메티실린 내성에 관련되는 유전자인 mecA는 PBP(Penicillin Binding Protein)-2'를 코드하고 있다(PBP-2a라고도 불린다). 통상, 황색 포도 구균은 주로 4개의 PBP를 산생(産生)한다. PBP는 세포벽의 펩타이드글라이칸(peptidoglycan) 합성에 관여하는 단백질이며, 트랜스펩티다아제 활성을 가지고 있다. β-락탐계 항생 물질(β-Lactam antibiotics)은 PBP의 활성 부위에 결합하여 트랜스펩티다아제 활성 및 펩타이드글라이칸 합성을 저해함으로써 작용한다. 그러나, PBP-2'는 β-락탐계 항생 물질과의 친화성을 저하시킴으로써 펩타이드글라이칸 합성 저해 효과를 회피하고 있다(비특허문헌 1).
황색 포도 구균 및 코아굴라제(coagulase) 음성 포도 구균(Staphylococci)에 있어서, 메티실린 내성의 유무는 감염 환자의 진단과 치료 방침의 결정에 있어서 매우 중요한 정보이다. 황색 포도 구균은 병원성이 강하기 때문에, 다른 코아굴라제 음성 포도 구균과 비교하여 중요시되고 있지만, 메티실린 내성을 획득한 황색 포도 구균 및 코아굴라제 음성 포도 구균에 관해서도 컴프로마이즈드 호스트(compromised host)로의 감염이 큰 문제가 되고 있다. 그 때문에 메티실린 내성 포도 구균의 원내 감염에 대한 대책으로서, 신속한 진단, 치료를 위해 메티실린 내성의 신속한 검출이 요망되어 왔다.
메티실린 내성을 시험하는 방법으로는, 약제 감수성 시험, 면역 분석법, PCR(polymerase chain reaction)에 의한 검출과 같은 방법이 실시되고 있다(비특허문헌 2).
약제 감수성 시험에서는, 환자로부터 채취된 혈액을 1일 이상 배양하여 포도 구균을 증가시킬 필요가 있다. 또한, 면역 분석법도 포도 구균을 배양하는 공정이 필요하기 때문에, 메티실린 내성 시험의 결과가 얻어지기까지 1일 이상을 필요로 한다.
이들과 비교하여, PCR 등의 핵산 증폭 검사는 감도가 매우 높기 때문에 배양 과정을 필요로 하지 않고, 환자 혈액으로부터 직접 시험을 실시하는 것이 가능하다. 그 때문에, 환자 혈액 검체가 도착 후 수 시간내에 시험 결과를 제출할 수 있다(특허문헌 1).
특허문헌 1 : 국제 공개 제2007/097323호
비특허문헌 1 : Journal of Bacteriology, May 1980 p.275 비특허문헌 2 : Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1685
이미 PCR 등의 핵산 증폭에 의한 메티실린 내성 유전자의 검출 방법은 몇가지 보고되어 있지만, 구체적인 검출 감도가 명기되어 있지 않은 보고가 많다. 검출 감도가 명기되어 있어도 임상 현장에서 사용하기에 충분한 검출 감도를 달성하지 못했다고 하는 보고밖에 없다(비특허문헌 2).
한편으로, 메티실린 내성 유전자의 검출은, 환자의 진단, 치료 방침에 크게 영향을 미치기 때문에, 신속히 정확하고 확실하게 검출하는 방법의 개발은 임상 상의 급선무이다. 그 때문에 본 발명에서는 신속히 정확하고 확실하게 메티실린 내성 유전자를 검출하는 것을 과제로 한다. 특히 감도가 높은 메티실린 내성 유전자 검출을 실현하기 위한 프라이머 페어를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은, 핵산 증폭법을 이용함으로써 환자 검체로부터 직접 메티실린 내성 유전자를 신속히 동정(同定)하는 동시에, 종래법보다도 높은 검출 감도로 확실하게 검출하는 방법이다. 본 발명자는, 고감도이면서 신속한 메티실린 내성 유전자의 검출 방법의 확립을 목표로 하여, PCR법에 착안했다. 특히 고감도로 메티실린 내성 유전자를 검출하기 위해 PCR법에서 사용하는 프라이머(primer)의 검토를 실시했다.
프라이머의 설계에 있어서는 이하와 같은 조건으로 했다.
증폭 효율이 저하되지 않는 범위에서 증폭되는 DNA 단편의 사이즈를 크게 했다. 구체적으로는 DNA 단편의 사이즈를 150 bp 이상 700 bp 이하로 했다. 증폭되는 DNA 단편의 사이즈를 크게 함으로써, PCR 반응 시의 증폭 곡선의 형광 강도를 높게 하고, Melting analysis에서 얻어지는 피크의 height에 관해서도 높아지도록 했다.
mecA 호몰로그(homolog)의 서열을 확인하고, 보존성이 높은 부분에서만 프라이머 페어의 염기 서열을 설계한다. 구체적으로는, 프라이머의 3' 말단으로부터 5염기 이내에 보존성이 낮은 서열을 포함하는 것을 제외하고, 염기 서열을 수정하여 보존성이 높은 서열로 했다.
상술한 컨셉트에 기초하여, 특정 Fwd, 및 Rev 프라이머를 각각 32개 제작하고, 그것들을 조합하여 유망하다고 생각되는 313개의 프라이머 페어들을 제작하고, 그 중에서 최적의 조합을 검토함으로써, 선출원인 특허문헌 1과 비교해서 높은 검출 감도를 달성할 수 있는 프라이머 페어를 선발했다.
즉, 본 발명에 관련되는 프라이머 페어는,
mecA 유전자(메티실린 내성 유전자)를 검출하기 위한 프라이머 페어로서,
상기 프라이머 페어가, 이하의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택된 1개의 프라이머 페어인 것을 특징으로 한다.
(a) 서열 번호 3과 서열 번호 7의 조합, 서열 번호 2와 서열 번호 9의 조합, 서열 번호 1과 서열 번호 8의 조합, 서열 번호 1과 서열 번호 9의 조합, 서열 번호 4와 서열 번호 11의 조합, 서열 번호 5와 서열 번호 12의 조합, 서열 번호 6과 서열 번호 10의 조합 또는 서열 번호 6과 서열 번호 12의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어,
(b) 상기 (a)에 있어서, 일방 또는 양방의 프라이머의 염기 서열의 일부를 프라이머로서의 기능을 손상시키지 않는 범위에서 1~2의 염기가 부가, 결실 또는 치환된 프라이머 페어,
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기 서열에 대응하는 상보적 서열로 이루어지는 프라이머 페어.
본 발명에 관련되는 mecA 유전자 검출 키트는, 상기의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 프라이머 페어를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 관련되는 검체 중의 mecA의 검출 방법은,
검체 중에서 조제한 DNA와, DNA를 증폭하기 위한 프라이머 페어를 이용하여 PCR을 실시하는 PCR 공정과,
상기 PCR 공정에 의해 얻어지는 증폭 산물 중에서의 mecA 유전자의 검출에 의해, 또는, 그 증폭 산물의 분석에 의해, 상기 검체 중에 있어서의 mecA 유전자의 검출을 실시하는 공정을 가지며,
상기 PCR 공정에 있어서 사용되는 프라이머 페어가, 상기의 (a)~(c)로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1개의 프라이머 페어인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 고감도에서의 mecA 유전자 검출을 위한 PCR용 프라이머 페어 및 mecA 유전자 검출 키트, 그리고 mecA 유전자의 검출 방법을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 의료 분야, 식품 분야 등에 있어서의 검체 중의 미량인 mecA 유전자를 검출하는 것을 종래의 검사 키트보다도 고감도, 고정밀도로 실시할 수 있다.
도 1은, 메티실린 내성주와 메티실린 감수성주에서의 측정 결과의 비교를 나타내는 도면이다. 도 1(a)는 메티실린 내성주로부터의 샘플을 사용한 경우의 증폭 곡선과 Tm값의 측정 결과를, 도 1(b)는 메티실린 감수성주로부터의 샘플을 사용한 경우의 증폭 곡선과 Tm값의 측정 결과를 나타낸다.
<프라이머>
본 발명에 있어서 프라이머란, PCR법에 있어서의 DNA 복제 시에 기점이 되는 DNA를 가리킨다. 본 명세서에 있어서는, 언급이 없는 한, 프라이머란 DNA 프라이머를 가리킨다.
본 발명의 포인트는, 검출 감도 향상이라는 효과를 누릴 수 있는 특정 프라이머 페어에 있다.
특허문헌 1에 기재된 서열 번호 45의 염기 서열로 이루어지는 프라이머와 서열 번호 46의 염기 서열로 이루어지는 프라이머의 페어는, 메티실린 내성 유전자(mecA)의 구조 유전자 내의 서열에 하이브리다이즈(hybridize)하는 DNA 서열을 갖는다. 또한, 특허문헌 1에 기재된 서열 번호 45의 염기 서열 및 서열 번호 46의 염기 서열을, 본 명세서에서는, 각각 서열 번호 13 및 14로 표기한다.
그러나, 상기 프라이머 페어여도 PCR을 사용한 검출 방법에서는, 충분한 검출 감도를 가지지 않아, 저농도의 mecA를 검출할 수 없었다(후술하는 실시예 5 및 표 2). 이것은 저농도의 MRSA를 포함하는 검체를 분석했을 때에, 검출 감도 부족에 의한 위음성(僞陰性)을 나타낼 가능성이 있다.
mecA 유전자의 구조 유전자는 대략 2100 bp로 구성되어 있으며, 구조 유전자 내에 하이브리다이즈하도록 본 발명자들에 의해 설계된 이하의 (a)군 포함되는 프라이머 페어의 각각을 사용하여 PCR을 실시함으로써 더욱 고감도로 mecA 유전자를 검출 가능한 것이 판명되었다.
(a)군 :
(a1) 서열 번호 3으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 7로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a2) 서열 번호 2로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a3) 서열 번호 1로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 8로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a4) 서열 번호 1로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a5) 서열 번호 4로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 11로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a6) 서열 번호 5로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a7) 서열 번호 6으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 10으로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(a8) 서열 번호 6으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
본 발명의 효과를 누릴 수 있는 범위이면, 상기 각 프라이머(primer)를 구성하는 DNA 단편(올리고뉴클레오타이드)이 갖는 염기 서열 중의 일부의 염기를 변환하여 얻어지는 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머도 적용할 수 있다. 원칙적으로, 개변 프라이머가, 상기의 각 프라이머의 상보 DNA쇄(鎖)와 하이브리다이즈 가능하면 각 프라이머와 동등하다고 간주된다. 또한, 이 동등하다고 간주되는 개변 프라이머는, 원래의 프라이머의 상보 DNA쇄와 하이브리다이즈하는 프라이머로서의 기능을 가지며, 또한, 원래의 프라이머의 염기 서열에 있어서 1 또는 2개의 염기가 부가, 결실 또는 치환된 개변 염기 서열을 갖는 프라이머인 것이 바람직하다.
따라서, 이하의 (b)군에 포함되는 프라이머 페어도 mecA 유전자 검출용 프라이머 페어로서 이용할 수 있다.
(b)군 :
(b1-1) 서열 번호 3의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 7로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b1-2) 서열 번호 3으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 7의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b1-3) 서열 번호 3의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 7의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
*(b2-1) 서열 번호 2의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b2-2) 서열 번호 2로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b2-3) 서열 번호 2의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b3-1) 서열 번호 1의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 8의 염기 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b3-2) 서열 번호 1로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 8의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b3-3) 서열 번호 1의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 8의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b4-1) 서열 번호 1의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b4-2) 서열 번호 1로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b4-3) 서열 번호 1의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b5-1) 서열 번호 4의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 11로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b5-2) 서열 번호 4로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 11의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b5-3) 서열 번호 4의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 11의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b6-1) 서열 번호 5의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b6-2) 서열 번호 5로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b6-3) 서열 번호 5의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b7-1) 서열 번호 6의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 10으로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b7-2) 서열 번호 6으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 10의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b7-3) 서열 번호 6의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 10의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b8-1) 서열 번호 6의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b8-2) 서열 번호 6으로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(b8-3) 서열 번호 6의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
또한, 상기의 각 프라이머 페어를 구성하는 프라이머의 상보 서열로 이루어지는 상보 프라이머의 페어도, mecA 유전자 검출용 프라이머 페어로서 이용할 수 있다. 즉, 이하의 (c)군에 포함되는 프라이머 페어도 mecA 유전자 검출용 프라이머 페어로서 이용할 수 있다.
(c)군 :
(c1-1) 서열 번호 3의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 7의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c1-2) 서열 번호 3의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 7의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c1-3) 서열 번호 3의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 7의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c1-4) 서열 번호 3의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 7의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c2-1) 서열 번호 2의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c2-2) 서열 번호 2의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c2-3) 서열 번호 2의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c2-4) 서열 번호 2의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c3-1) 서열 번호 1의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 8의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c3-2) 서열 번호 1의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 8의 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c3-3) 서열 번호 1의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 8의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c3-4) 서열 번호 1의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 8의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c4-1) 서열 번호 1의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c4-2) 서열 번호 1의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c4-3) 서열 번호 1의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c4-4) 서열 번호 1의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 9의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c5-1) 서열 번호 4의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 11의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c5-2) 서열 번호 4의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 11의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c5-3) 서열 번호 4의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 11의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c5-4) 서열 번호 4의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 11의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c6-1) 서열 번호 5의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c6-2) 서열 번호 5의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c6-3) 서열 번호 5의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c6-4) 서열 번호 5의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
*(c7-1) 서열 번호 6의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 10의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c7-2) 서열 번호 6의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 10의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c7-3) 서열 번호 6의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 10의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c7-4) 서열 번호 6의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 10의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c8-1) 서열 번호 6의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c8-2) 서열 번호 6의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 상보 서열로 이루어지는 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c8-3) 서열 번호 6의 상보 서열로 이루어지는 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
(c8-4) 서열 번호 6의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머와, 서열 번호 12의 개변 염기 서열의 상보 서열로 이루어지는 개변 프라이머의 조합으로 이루어지는 프라이머 페어.
*이들의 프라이머 페어 중에서는, 프라이머 페어 (a7), 그리고, 프라이머 페어 (b7-1)~(b7-3), (c7-1)~(c7-4)의 프라이머 페어가 바람직하다.
또한, 상기 (a)군~(c)군에 포함되는 각 프라이머 페어는, mecA 유전자가 갖는 구조 유전자 내에 특이적으로 하이브리다이즈하여 mecA 유전자에 특이적인 DNA 단편을 증폭하는 점에 있어서 공통된 기능을 갖는다.
본 발명의 프라이머 페어는, 여러 가지 프라이머의 상당량의 조합에 기초하여 효과의 유무를 확인한 후에 비로소 발견한 것이며, 단순한 효과의 추인(追認) 레벨에서는 이룰 수 없는 것임을 부기한다. 또한, 서열 검색의 결과, mecA 유전자 검출용 프라이머 페어로서는 신규한 조합인 것을 확인하고 있는 것을 부기한다.
본 발명은, 본 발명의 프라이머 페어 이외에, 세균, 진균, 바이러스에 관한 공지 프라이머를 복수 병용하는 것을 방해하는 것은 아니다.
PCR에 있어서의 Primer 농도는 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로는 0.05 μM~1.0 μM의 범위에서, 검토에 따라 적절히 설정한다.
<PCR용 효소>
본 발명에서 사용되는 PCR용 효소는, 바람직하게는 내열성을 갖는 생물 유래의 내열성 DNA 폴리메라아제(polymerase)이며, 보다 바람직하게는 메탄균(methanogen), 호열호산균(thermophilic eosinophiles), 호열균(thermophiles), 초호열균(hyperthermophile) 등의 원핵 생물(prokaryotes) 유래인 것이다.
본 발명에 사용되는 내열성 DNA 폴리메라아제의 구체예로는, 서머스·아쿠아티커스(Thermus aquaticus), 서머스·서모필러스(Thermus thermophilus), 바실루스·스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus), 서모코커스·고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius), 서모코커스·코다카라엔시스 KOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1), 파이로코커스·워에세이(Pyrococcus woesei), 파이로코커스·퓨리오시스(Pyrococcus furiosus), 에어로파이럼·페르닉스(Aeropyrum pernix), 아퀴펙스·아에오리커스(Aquifex aeolicus), 술포로부스·토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 파이로로부스·퓨마리(Pyrolobus fumarii), 또는 메타노파이러스·칸드레리(Methanopyrus kandleri) 유래의 내열성 DNA 폴리메라아제를 들 수 있다.
또한, 내열성 DNA 폴리메라아제는 유전자 공학적으로 인공적으로 합성된 내열성 DNA 폴리메라아제여도 된다.
<그 밖의 시약>
본 발명에서 PCR 분석을 위해 사용되는 프라이머 페어 이외의 시약은, 공지된 것을 공지된 조합으로 사용할 수 있다. 측정에 필요한 시약은 PCR용 효소, pH 완충액, dNTP, Mg2+원(源), 멸균수 등을 들 수 있다. 또한, 리얼타임 PCR(real-time PCR) 분석에 있어서는 형광 색소 등의 표식 물질이 상기에 추가하여 필요하게 된다.
pH 완충액은, PCR 분석에 제공하는 시료로서, pH=7.0~10.0, 보다 바람직하게는, pH 8.0~9.0으로 조정하기 위해 사용된다. 구체적으로는, Tris 염산 완충액 등을 들 수 있다. 예를 들어, Tris 염산 완충액의 경우, 5 mM~100 mM으로 사용한다.
dNTP는, PCR에 의한 DNA 증폭을 위한 뉴클레오사이드원(源)이며, dATP, dCTP, dGTP, dTTP의 4종류가 필요하다. 또한, dNTP는 핫스타트법(hot start method)에 사용하기 위해 화학 수식된 것, 예를 들어 TriLink BioTechnologies, Inc. 제의 CleanAmpTM dNTP를 사용해도 된다. 사용량은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 각각 0.1~0.2 mM 전후의 농도로 사용한다.
PCR에 의한 DNA 증폭에 있어서는, Mg2+가 필요하다. Mg2+원으로는 MgCl2, MgSO4 등을 들 수 있다. 바람직한 것은 MgCl2이며, 그 사용량은 0.5 mM~5.0 mM의 범위에서 검토에 따라 적절히 사용한다.
형광 색소는, 리얼타임 PCR에 의한 DNA 증폭 산물의 검출, 나아가서는, 증폭된 DNA 단편의 Tm값의 측정 목적으로 사용되며, 예를 들어, 표식 기능을 갖는 인터컬레이터(intercalator)를 사용하는 방법을 들 수 있다. 인터컬레이터로는, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide), 사이버·그린I(SYBR GreenI) 및 Resolight(Roche사 제), EvaGreen(Biotium사 제) 및 BOXTO(tataa biocenter 제) 등을 들 수 있다. 바람직한 인터컬레이터로서는, EvaGreen 및 Resolight이다. 사용량은, 사용하는 형광 색소의 제조 판매 메이커의 권장에 따른다.
그 밖의 키트에는, PCR의 양성 대조로서 사용하는 세균의 게놈 DNA나, 음성 대조로서 사용하는 멸균수(水)가 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 사용되는 PCR 분석 측정용 용기(예를 들어, 분석 측정용 튜브)로는, 측정 기기에 따른 형상이나 구조를 갖는 것을 선택하여 사용할 수 있다. 측정 기기의 입수처에 의해 권장된 것을 사용하면, 특별히 문제없이 측정에 사용할 수 있다.
본 발명을 실시함에 있어서 그 밖에 필요한 기구로는, 피펫(pipette), 피펫용 팁(pipette tip), 1.5 ml 마이크로튜브(microtube) 등 널리 분자 생물학의 실험에 사용되는 기구류를 들 수 있으며, 기기류로는 PCR, 클린벤치, 튜브용 원심기(tube centrifuge) 등 널리 분자 생물학의 실험에 사용되는 기기를 들 수 있다.
<키트의 양태>
본 발명의 mecA 유전자 검출 키트는, 본 발명의 프라이머 페어에 의해 증폭되는 DNA 단편을 해석함으로써 mecA 유전자를 검출하는 키트이다. 증폭 산물로서의 DNA 단편의 해석은, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, DNA 단편의 분자량 해석, Tm값 측정(융해 곡선 분석) 등에 의해, 증폭 산물로서의 DNA 단편의 해석을 실시할 수 있다. 2종 이상의 해석 방법을 조합해도 된다. 바람직하게는 Tm값의 측정이며, 이 목적에 있어서 리얼타임 PCR이 적합하게 사용된다. 분자량의 해석은, 전기 영동이나 질량 분석계 등에 의해 실시할 수 있다.
본 발명에 관련되는 mecA 유전자 검출 키트는, 상술한 (a)군~(c)군의 프라이머 페어의 1개 이상을 포함하여 구성된다. 이 프라이머 외에, 필요에 따라서, PCR용 효소, pH 완충액, MgCl2, dNTP(또는 CleanAmpTM dNTP) 및 멸균수 등의 시약, PCR분석 측정용 용기(예를 들어 분석 측정용 튜브)나 그 밖에 필요한 기구 등의 부품에서 선택되는 적어도 1종의 시약 및/또는 부품을 포함할 수 있다. 또한, 리얼타임 PCR에서의 해석에 있어서는 형광 색소를 성분으로서 첨가할 수 있다. 또한, PCR법의 각종 양태에 따라서는, 이들 성분 외에 사용하는 PCR법에 필요한 성분을 키트에 첨가해도 된다. 이들 각 시약 또는 각 부품은, 개별적으로, 또는 그 일부마다, 혹은 전부가 일체 등, 어떠한 형태로 포장되어 있어도 된다. 구체적으로는, 예를 들어 이하와 같은 양태이다.
1) 사용하는 시약마다 개별 분리한다.
2) pH 완충액, MgCl2, dNTP(또는 CleanAmpTM dNTP), 및 리얼타임 PCR에서의 해석에 있어서는 형광 색소를 미리 혼합한 혼합물, 1개의 프라이머쌍 및 PCR용 효소의 3가지 부품들을 분리하여, 즉 따로따로 나누어 포장한다.
3) pH 완충액, MgCl2, dNTP(또는 CleanAmpTM dNTP), 및 리얼타임 PCR에서의 해석에 있어서는 형광 색소, 1개의 프라이머쌍을 미리 혼합한 혼합물, 및 PCR용 효소의 2가지 부품들을 분리하여, 즉 따로따로 나누어 포장한다.
4) pH 완충액, MgCl2, dNTP(또는 CleanAmpTM dNTP), 및 리얼타임 PCR에서의 해석에 있어서는 형광 색소, 1개의 프라이머쌍 및 PCR용 효소의 전부를 미리 혼합한 혼합물을 패키지한다.
또한, 키트가 복수의 프라이머쌍을 갖는 경우는, 복수의 프라이머쌍을 따로따로 나누어 포장한다. 상이한 프라이머쌍을 포함하는 복수의 혼합물을 키트의 구성에 사용하는 경우에 관해서도, 각 혼합물을 따로따로 나누어 포장한다.
<용도 분야·검체>
본 발명의 mecA 유전자 검출 키트는, 의료 분야, 식품 분야, 환경 분석 등, 다양한 분야에 있어서 mecA 유전자 검출을 위해 사용할 수 있다. 또한, 특허문헌 1에 있는 감염증 기인균의 신속 동정 방법과 조합하여 사용하고, 기인균(起因菌) 동정과 mecA 유전자 검출을 동시에 또한 신속하게 실시하기 위해서 사용할 수 있다.
검사에 제공되는 검체로는, 특별히 한정되지 않고 광범위한 검체에 적용 가능하다. 구체적으로는, 의료 분야에 있어서 혈액(血液), 수액(髓液), 누액(淚液), 안방수(眼房水), 양수(羊水), 관절액(關節液), 타액(唾液), 코세정액, 소변, 그 밖의 체액, 카테터(catheter) 등 의료 기구 부착물 등을 들 수 있다. 식품 분야에 있어서는, 식품 자체, 생산 도중의 액체, 또는 고체 사료, 제조 공정 내의 기기 부착물 등을 들 수 있다.
<DNA 추출 처리>
본 발명의 mecA 유전자 검출 키트를 사용하여 검체 중의 mecA 유전자 검출을 실시하는 경우, 검체 중에 존재할 세균으로부터 미리 DNA를 추출해 둘 필요가 있다. DNA 추출 방법으로는, 현재, 알칼리 용해법, 보일링법, 페놀 추출법, 비즈 파쇄법(bead crushing method) 등이 알려져 있으며, 또한, 메이커 각 사(社)로부터 다양한 DNA 추출 키트도 판매되고 있다.
본 발명에 있어서의 DNA 추출 방법은 특별히 한정되지 않지만, 검체에 따라 최적인 방법은 상이하기 때문에, 대상 검체에 상응한 방법을 선택하는 것이 바람직하다.
<PCR 분석>
본 발명의 프라이머 페어는, PCR법에 있어서 사용된다. PCR법으로는, mecA 유전자를 검출하기 위한 목적의 유전자 증폭을 위한 PCR법이면 여러 가지 PCR법을 이용할 수 있다. 바람직한 분석법으로는, 리얼타임 PCR이며, 보다 바람직하게는 리얼타임 PCR과 Tm값 측정을 위한 융해 곡선 분석(melting curve analysis)의 조합이다. 이 경우, 사용하는 리얼타임 PCR 기기는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본원 실시예에 있어서 사용하고 있는 주식회사 키아겐 제 Rotor Gene Q는 적합하게 사용 가능한 리얼타임 PCR 기기의 일례이다.
PCR 및 리얼타임 PCR에 있어서는, 장치, 수법 등 통상 알려진 것을 사용하면 된다.
PCR에 있어서의 온도 사이클의 조건(온도, 시간, 승강온 속도, 사이클 수)은 특별히 한정되지 않고, 사용하는 프라이머, PCR용 효소, 주형(鑄型) 등의 성질이나 PCR 후의 DNA 검출 방법의 감도에 따라 적절히 설정하면 된다. 이러한 조건의 설정에 관해서는 많은 문헌이 이미 알려져 있다.
PCR에 있어서, 일반적으로는, 주형 이중쇄 DNA의 열변성(thermal denaturing) 스텝, 프라이머의 어닐링(annealing) 스텝, PCR용 효소에 의한 DNA 신장 스텝을 반복한다. 열변성 스텝은 주형 이중쇄 DNA가 단일쇄로 해리되는 온도와 시간이면 되며, 예를 들어 90℃~98℃에서 수 초~수 분을 설정한다. 또한 PCR 개시 시에는 그 1회째 사이클에만 수 분~10분의 열변성 과정을 추가하는 경우도 많다. 프라이머의 어닐링 스텝은 프라이머의 염기 서열, 염기 수에 따라 설정하지만, 40℃~72℃에서 수 초~수 십초를 설정하는 경우가 많다. DNA 신장 스텝에 있어서는, 온도에 관해서는 PCR용 효소의 최적 온도 등의 성질에 따라, 예를 들어, 58℃~76℃가 일반적이며, DNA 신장 스텝의 시간에 관해서는 증폭시키고자 하는 DNA의 쇄길이와 PCR용 효소의 DNA 합성 속도로부터 필요 시간을 어림잡아 설정한다. 열변성, 어닐링, 신장 스텝을 반복함으로써 목적으로 하는 DNA를 증폭시키는데, 이 반복 횟수는, 주형 DNA의 양이나, PCR용 효소의 양, PCR 후의 DNA 검출 방법의 감도에 따라, 적절히 변경하면 되지만, 일반적인 예로 10~50회가 예시된다. 또한, 어닐링의 온도와 DNA 신장의 온도가 동일한 정도인 경우, 양 스텝을 동시에 실시하는 것도 가능하다.
리얼타임 PCR에 있어서도, DNA 증폭에 필요한 열변성, 어닐링, DNA 신장에 관한 조건 설정, 나아가서는 그들 스텝의 반복 횟수는, 상기 PCR에 관한 기재와 동일하다. 리얼타임 PCR에 있어서는, DNA 신장 스텝의 전후 등에, 인터컬레이터에서 유래하는 형광 강도를 측정함으로써 증폭된 DNA 양을 정량 내지는 추정하는 것이 가능하다. 형광 강도를 측정하는 온도는, 예를 들어 인터컬레이터를 이용한 실시의 경우에는, DNA 신장 시의 온도 그대로여도 되고, 또한, 증폭되는 목적 DNA의 쇄길이가 비교적 길고, 그 Tm값이 비교적 높은 경우에는, 프라이머 다이머(primer dimer) 등의 비교적 쇄길이가 짧은 비특이적으로 증폭된 목적 외 DNA(비특이적 증폭 DNA라고도 한다)는 그 Tm값이 비교적 낮은 것을 이용하여, 목적 DNA의 Tm값과 비특이적 증폭 DNA의 Tm값의 중간값을 비롯한, 이들 사이의 온도로 설정해도 된다. 이렇게 함으로써, 특히 인터컬레이터를 이용한 실시에서는 프라이머 다이머 등의 비특이적 증폭 DNA만이 이중쇄에서 단일쇄로 해리되고, 형광 강도로부터 정량 내지는 추정되는 DNA 양은 목적 DNA에 관한 것으로 하는 것이 가능하다.
또한, 리얼타임 PCR에 있어서는 DNA 증폭 공정의 종료 후, 융해 곡선 해석에 따라, 증폭된 DNA의 Tm값을 측정할 수 있다. 융해 곡선 분석에서는, 온도 변화에 따른 DNA의 이중쇄에서 단일쇄로의 해리를 관찰하지만, 그 온도 및 검출 조건은 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로, 열변성(Denaturation)(90℃에서 98℃), 이중쇄 형성(Annealing)(40℃에서 80℃), 융해(Melting)(이중쇄(duplex) 형성의 온도에서 98℃ 전후까지 서서히 승온)의 단계를 거쳐, 융해 스텝에서의 형광 강도의 변화를 모니터함으로써, 융해 곡선을 얻고, 그것으로부터 Tm값을 얻을 수 있다. 이러한 측정은 리얼타임 PCR 장치의 대부분의 기종에서 가능하며, 기기의 사용 방법에 준하여 실시 가능하다.
<검출 방법>
본 발명에 관련되는 검체 중의 mecA 유전자 검출 방법으로는, 이하의 공정을 갖는 방법을 이용할 수 있다.
(1) 상기 검체로부터 조제한 세균의 게놈 DNA와, mecA 유전자를 포함하는 증폭 산물을 얻기 위한 프라이머 페어와, 내열성 DNA 폴리메라아제를 비롯한 PCR용 시약을 사용하여 PCR을 실시하는 공정.
(2) 상기 PCR에 있어서의 증폭 산물 중에서의 mecA 유전자의 검출, 또는, 그 증폭 산물의 분석에 의해, 상기 검체 중에 있어서의 mecA 유전자의 검출을 실시하는 공정.
또한, 복수의 프라이머 페어를 사용하는 경우는, PCR 공정 (1)을 복수의 프라이머 페어마다 따로따로 실시한다. 즉, PCR용의 1개의 반응액 중에 1개의 프라이머 페어를 첨가하고, 상이한 프라이머 페어를 첨가한 복수의 반응액을 각각 개별적으로 사용하여 PCR 공정 (1)을 실시한다.
mecA 유전자를 포함하는 증폭 산물을 얻기 위한 프라이머 페어로서 본 발명에 관련되는 프라이머 페어 중 적어도 1종을 사용함으로써, 고감도인 메티실린 내성 유전자(mecA)의 검출을 실시할 수 있다.
이 검출 방법에서는, 증폭 공정을, 목적 유전자로서의 mecA 유전자 이외의 유전자(목적 외 유전자)의 증폭 억제하에서 실시하는 것이 바람직하다. 이 목적 외 유전자의 증폭 억제에는, 핫스타트법(hot start method) PCR을 이용할 수 있다. 일례로서는, 항DNA 폴리메라아제 항체를 사용하는 핫스타트법을 들 수 있다. 그 때, 내열성 DNA 폴리메라아제 1U에 대해서, 과잉량의 항DNA 폴리메라아제 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 특허문헌 1 및 국제공개 제2010/082640호 명세서에 개시되어 있는 바와 같이 DNA 폴리메라아제에 대해서, 가역적인 화학 수식을 실시하는 것에 의한 핫스타트법도 적합하게 이용할 수 있다. 나아가서는, 화학 수식된 dNTP를 사용하거나, 미국 특허출원공개 제20070281308호 명세서(US2007/0281308A1)에 기재된 바와 같이 화학 수식된 프라이머를 사용한 핫스타트법도 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 가열에 의해 용융되는 왁스 등을 사용하여, DNA 폴리메라아제와, DNA 폴리메라아제에 의한 DNA 증폭에 필요 불가결한 구성 성분(예를 들어, 프라이머나 dNTP나 Mg2+염)을 물리적으로 격리하는 것에 의한 핫스타트법도 적합하게 이용할 수 있다.
증폭 산물의 검출 공정에 있어서의 증폭 산물 중에서의 목적 유전자의 검출은, 검출용 형광 표식을 갖는 인터컬레이터를 이용한 리얼타임 PCR에 의해 Tm값을 측정함으로써 실시 가능하다. 바람직한 인터컬레이터는 사이버·그린I(Cyber GreenI), EvaGreen, Resolight나 BOXTO, 보다 바람직하게는 EvaGreen이나 Resolight이다.
리얼타임 PCR을 사용한 Tm값 측정에 의한 검출 공정에서는, 목적 유전자의 증폭 산물을 검출 가능하고, 그 이외의 목적 외 유전자의 증폭 산물은 비검출로 하여 실시할 수 있다. 그것을 위한 방법으로는, 목적유전자의 증폭 산물을 검출 가능으로 하고, 그 이외의 목적 외 유전자의 증폭 산물을 비검출로 하는 조건을,
(1) 목적 유전자 증폭 산물의 융해 온도(TmA)가, 목적 외 유전자의 증폭 산물의 융해 온도(TmB)보다도 높아지는 프라이머를 선택하고,
(2) 증폭 산물의 검출을, TmA와 TmB 사이의 온도에서 실시함으로써 설정하고, 목적 유전자의 증폭 산물만을 검출하는 방법이 바람직하다.
또한,　증폭 공정과 검출 공정을, 증폭 산물의 양을 표시하는 표시 장치를 이용하는 리얼타임 PCR에 의해 실시하고, 목적 외 유전자의 증폭 산물이 상기 표시장치에 있어서 비표시가 되는 방법을 이용할 수 있다.
검출 공정에 있어서의 증폭 산물의 분석은, 증폭 산물을 겔(gel) 상 등에서의 전기 영동에 의해 전개, 가시화하는 증폭 산물의 해석에 의해 실시할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석은, 증폭 산물의 염기 서열을 해독하는 것에 의한 증폭 산물의 해석에 의해 실시하는 것도 가능하다. 또한, 증폭 산물의 분석은 증폭 산물의 분자량을 질량 분석계로 측정하여 해석하는 방법에 의해 실시할 수도 있다.
실시예
(실시예 1) 1차 스크리닝(screening)
MRSA(리켄(理硏) 분양주, JCM31453)의 배양액으로부터 High pure PCR template preparation kit(Roche)를 사용하여 추출한 게놈 DNA를 주형에 서열 번호 15와 서열 번호 16의 프라이머를 사용하여 표 1에 나타낸 반응액 조성으로 PCR을 실시하여 mecA ORF 전길이를 증폭시켰다. 다음으로, mecA의 증폭 산물의 희석 계열을 제작하고, 서열 번호 13으로 이루어지는 포워드 프라이머(forward primer)와 서열 번호 14로 이루어지는 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어지는 비교용 프라이머 페어를 사용하여 표 1에 나타낸 반응액 조성으로 PCR을 실시하고, 상 승 사이클 수가 대략 20사이클이 되는 mecA의 증폭 산물의 농도를 결정하여, 주형으로서 사용했다. 또한, 메티실린 내성 Staphylococcus aureus, JCM31453은 미생물 재료 개발실(우편번호 305-0074, 이바라키켄 츠쿠바시 다카노다이 3-1-1, 국립연구개발법인 이화학연구소 바이오리소스센터 미생물 재료 개발실(RIKEN BRC-JCM)에서 공적으로 입수 가능하다.
다음으로, 제작한 프라이머의 평가를 실시하기 위해서, 313개의 프라이머 페어에 관해 표 1에 나타낸 반응액 조성으로 PCR을 실시했다. 리얼타임 PCR 장치는 로터진Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)을 이용했다. PCR의 반응 조건은, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 65℃ 10초, 72℃ 30초를 40회 반복했다. 평가는, 상 승 사이클 수, High resolution melting analysis(HRM)에서의 피크의 형상, 전기 영동에서의 밴드의 강도, 전기 영동에서의 비특이적 산물의 유무에 관해서, 비교용 프라이머 페어에서의 결과와 비교하여 개선이 인정되는 것, 88개의 페어를 선발했다.
(실시예 2) 2차 스크리닝
MRSA(리켄 분양주, JCM31453)의 배양액으로부터 High pure PCR template preparation kit(Roche)를 사용하여 추출한 게놈 DNA의 농도를, 50 μg/ml human genomic DNA 용액(invirogen)으로 시동 사이클 수가 대략 20사이클이 되도록 조정한 용액을 주형으로서 사용했다.
88개의 프라이머 페어에 관해 표 1에 나타낸 반응액 조성으로 PCR을 실시함으로써 평가했다. 리얼타임 PCR 장치는 로터진Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)을 이용했다. PCR의 반응 조건은, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 65℃ 10초, 72℃ 30초를 40회 반복했다. 평가는, 시동 사이클 수, HRM에서의 피크의 형상, 전기 영동에서의 밴드의 강도, 전기 영동에서의 비특이적 산물의 유무에 관해서, 비교용 프라이머 페어에서의 결과와 비교하여 개선이 인정된 57개의 페어를 선발했다.
(실시예 3) 3차 스크리닝
MRSA(리켄 분양주, JCM31453)의 배양액으로부터 High pure PCR template preparation kit(Roche)를 사용하여 추출한 게놈 DNA의 농도를, 50 μg/ml human genomic DNA 용액(invitrogen)으로 10.4 분자/반응액이 되도록 조정한 용액을 주형으로서 사용했다. 57개의 프라이머 페어에 관해 표 1에 나타낸 반응액 조성을 이용한 3중 측정으로 PCR을 실시함으로써 평가했다. 리얼타임 PCR 장치는 로터진Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)을 이용했다. PCR의 반응 조건은, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 65℃ 10초, 72℃ 30초를 40회 반복했다. 평가는, 3중 측정 전부에서 증폭이 보이거나, HRM에서의 dF/dT의 Height(channelA), 프라이머 다이머의 유무, 비특이적 산물의 피크의 유무에 관해서, 비교용 프라이머 페어에서의 결과와 비교하여 개선이 인정된 9개의 페어를 선발했다.
(실시예 4) 최종 스크리닝
MRSA(리켄 분양주, JCM31453)의 배양액으로부터 High pure PCR template preparation kit(Roche)를 사용하여 추출한 게놈 DNA를 50 μg/ml human genomic DNA 용액(invirogen)으로 각 농도(카피수/반응액: 표 2에서는 Copies/Reaction으로 표시)가 되도록 조정한 용액을 주형으로서 사용했다. 9개의 프라이머 페어에 관해 표 1에 나타낸 반응액 조성으로, 3중 측정으로 PCR을 실시함으로써 평가했다. 리얼타임 PCR 장치는 로터진Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)을 이용했다. PCR의 반응 조건은, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 65℃ 10초, 72℃ 30초를 40회 반복했다. 3중 측정 전부에서 증폭이 보이는 최저 농도를 검출 한계로 했다. 또한, 목적으로 하는 증폭 산물이 얻어졌는지의 여부는 Tm값의 측정에 의해 확인했다.
그 결과, 선출원인 특허문헌 1에서 나타낸 비교용 프라이머 페어를 사용하여 검출을 실시한 경우보다도 검출 한계의 향상이 보여진 8개의 페어를 선발했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 또한, 비교용의 프라이머 페어가 갖는 서열 번호 13, 14, 선발된 8개의 페어가 갖는 각 염기 서열을 표 3에 나타낸다.
(실시예 5) 메티실린 내성주 및 메티실린 감수성주에서의 비교
Staphylococcus aureus(메티실린 감수성 리켄 분양주, JCM2151) 및 MRSA(메티실린 내성 리켄 분양주, JCM16555)의 배양액으로부터 High pure PCR template preparation kit(Roche)를 사용하여 추출한 게놈 DNA 용액을 주형으로서 사용했다. 서열 번호 6과 서열 번호 10의 프라이머 페어에 관해 표 1에 나타낸 반응액 조성으로, PCR을 실시함으로써 평가했다. 리얼타임 PCR 장치는 로터진Q MDx 5plex HRM(QIAGEN)을 이용했다. PCR의 반응 조건은, 95℃ 5분간 가열한 후에, 94℃ 10초, 65℃ 10초, 72℃ 30초를 40회 반복했다. 또한, 목적으로 하는 증폭 산물이 얻어졌는지의 여부는 Tm값의 측정에 의해, 81℃ 부근에서의 피크의 유무로 확인했다. 메티실린 내성주의 결과를 도 1(a)에, 메티실린 감수성주의 결과를 도 1(b)에 나타낸다.
표 2에 기재된 시험 결과로부터, 본 발명의 프라이머 페어를 사용하는 본 발명의 검출 방법은, 1반응 중 10카피 이하라는 매우 미량인 mecA 유전자를 검출 가능한 것을 알 수 있었다. 본 발명의 검출 방법은, 극소량의 검체 중의 매우 희박한 mecA 유전자를 고감도, 고정밀도, 또한 신속하게 검출 가능한 점에서, 충분한 실용성과 넓은 응용성을 구비하고 있다. 본 발명의 프라이머 페어, 검출 방법 및 검출 키트는, 의료 분야, 식품 분야, 환경 분석에 있어서 발생하는, 다양한 검체 중의 미량의 mecA 유전자의 검출에 이용하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> Mitsui chemicals, inc. <120> A primer pair to amplify mecA gene, a kit for detection of mecA gene and a method of detection of mecA gene <130> 18-0075-MCI <150> JP 2017-198576 <151> 2017-10-12 <160> 16 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 1 ctgctatcca ccctcaaaca g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 2 actgctatcc accctcaaac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 3 gaagatggct atcgtgtcac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 4 atcttggggt ggttacaacg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 5 tagcactcga attaggcagt aag 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 6 agctgattca ggttacggac 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 7 aatctggaac ttgttgagca g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 8 aacgttgtaa ccaccccaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 9 tgtaacgttg taaccacccc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 10 gattttggca ttgtagctag cc 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 11 accacccaat ttgtctgcc 19 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 12 gtaccggatt tgccaattaa g 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 13 caaactacgg taacattgat cgc 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 14 atgtatgctt tggtctttct gc 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 15 atgaaaaaga taaaaattgt tc 22 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a primer <400> 16 ttattcatct atatcgtat 19

Claims (7)

  1. mecA 유전자(메티실린 내성 유전자)를 검출하기 위한 프라이머 페어로서,
    상기 프라이머 페어는 서열번호 1과 서열번호 8의 조합인 것을 특징으로 하는 mecA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 페어.
  2. 프라이머 페어를 포함하는, mecA 유전자 검출 키트로서,
    상기 프라이머 페어는 서열번호 1과 서열번호 8의 조합인 것을 특징으로 하는 mecA 유전자 검출 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    PCR용 효소, PCR용 시약 및 PCR용 기구 중 적어도 1종을 포함하는, 키트.
  4. 검체 중의 mecA의 검출 방법으로서,
    검체 중에서 조제한 DNA와, 상기 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 페어를 이용하여 PCR을 실시하는 PCR 공정과,
    상기 PCR 공정에 의해 얻어지는 증폭 산물 중에서의 mecA 유전자의 검출에 의해, 또는, 그 증폭 산물의 분석에 의해, 상기 검체 중에 있어서의 mecA 유전자의 검출을 실시하는 공정을 가지며,
    상기 PCR 공정에 있어서 사용되는 프라이머 페어는 서열번호 1과 서열번호 8의 조합인 것을 특징으로 하는 mecA 유전자의 검출 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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