JPWO2019074091A1 - mecA遺伝子増幅用プライマーペア、mecA遺伝子検出キット及びmecA遺伝子検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌において、メチシリン耐性の有無は感染患者の診断と治療方針の決定において非常に重要な情報である。黄色ブドウ球菌は病原性が強いため、他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と比較して重要視されているが、メチシリン耐性を獲得した黄色ブドウ球菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌についてもコンプロマイズドホストへの感染が大きな問題となっている。そのためメチシリン耐性ブドウ球菌の院内感染への対策として、迅速な診断、治療のためにメチシリン耐性の迅速な検出が望まれてきた。
メチシリン耐性を試験する方法としては、薬剤感受性試験、イミュノアッセイ、PCR(polymerase chain reaction)による検出といった方法が実施されている(非特許文献2)。
薬剤感受性試験では、患者から採取された血液を一日以上培養しブドウ球菌を増やす必要がある。また、イミュノアッセイもブドウ球菌を培養する工程が必要であるため、メチシリン耐性試験の結果が得られるまでに一日以上を要する。
これらと比較して、PCRなどの核酸増幅検査は感度が非常に高いため培養の過程を必要とせず、患者血液から直接試験を行うことが可能である。そのため、患者血液検体が到着後数時間で試験結果を提出することが出来る(特許文献1)。
一方で、メチシリン耐性遺伝子の検出は、患者の診断、治療方針に大きく影響するため、迅速に正確かつ確実に検出する方法の開発は臨床上の急務である。そのため本発明では迅速に正確かつ確実にメチシリン耐性遺伝子を検出することを課題とする。特に感度の高いメチシリン耐性遺伝子検出を実現するためのプライマーペアを提供することを課題とする。
プライマーの設計に当たっては以下のような条件とした。
増幅効率が低下しない範囲で増幅されるDNA断片のサイズを大きくした。具体的にはDNA断片のサイズを150bp以上700bp以下とした。増幅されるDNA断片のサイズを大きくすることにより、PCR反応時の増幅曲線の蛍光強度を高くし、Melting analysisで得られるピークのheightについても高くなるようにした。
mecAホモログの配列を確認し、保存性が高い部分でのみプライマーペアの塩基配列を設計する。具体的には、プライマーの3’末端から5塩基以内に保存性の低い配列を含むものを除外し、塩基配列を修正して保存性の高い配列とした。
以上のようなコンセプトに基づき、特定のFwd、及びRevプライマーをそれぞれ32本作製し、それらを組み合わせて有望と考えられる313のプライマーペアを作製し、その中から最適の組み合わせを検討することで、先願である特許文献1と比較して高い検出感度を達成し得るプライマーペアを選抜した。
すなわち本発明にかかるプライマーペアは、
mecA遺伝子(メチシリン耐性遺伝子)を検出するためのプライマーペアであって、
前記プライマーペアが、以下の(a)〜(c)からなる群から選択された1つのプライマーペアであることを特徴とする。
(a)配列番号3と配列番号7の組み合わせ、配列番号2と配列番号9の組み合わせ、配列番号1と配列番号8の組み合わせ、配列番号1と配列番号9の組み合わせ、配列番号4と配列番号11の組み合わせ、配列番号5と配列番号12の組み合わせ、配列番号6と配列番号10の組み合わせ又は配列番号6と配列番号12の組み合わせからなるプライマーペア、
(b)前記(a)において、一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1〜2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、
(c)前記(a)又は(b)の塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。
本発明にかかる検体中のmecAの検出方法は、
検体中から調製したDNAと、DNAを増幅するためのプライマーペアとを用いてPCRを行うPCR工程と、
前記PCR工程により得られる増幅産物中でのmecA遺伝子の検出により、または、該増幅産物の分析により、前記検体中におけるmecA遺伝子の検出を行う工程と、
を有し、
前記PCR工程において用いられるプライマーペアが、上記の(a)〜(c)からなる群から選択された少なくとも一つのプライマーペアである
ことを特徴とする。
本発明においてプライマーとは、PCR法におけるDNA複製時に起点となるDNAを指す。本明細書においては、断わりのない限り、プライマーとはDNAプライマーを指す。
本発明のポイントは、検出感度向上という効果が享受できる特定のプライマーペアにある。
特許文献1に記載の配列番号45の塩基配列からなるプライマーと配列番号46の塩基配列からなるプライマーのペアは、メチシリン耐性遺伝子(mecA)の構造遺伝子内の配列にハイブリダイズするDNA配列を有する。なお、特許文献1に記載の配列番号45の塩基配列及び配列番号46の塩基配列を、本明細書では、それぞれ配列番号13及び14と表記する。
しかし、上記のプライマーペアでもPCRを用いた検出方法では、十分な検出感度を有しておらず、低濃度のmecAを検出することができなかった(後述する実施例5及び表2)。これは低濃度のMRSAを含む検体を分析した際に、検出感度不足による偽陰性を示す可能性がある。
(a)群:
(a1)配列番号3からなるプライマーと、配列番号7からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a2)配列番号2からなるプライマーと、配列番号9からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a3)配列番号1からなるプライマーと、配列番号8からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a4)配列番号1からなるプライマーと、配列番号9からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a5)配列番号4からなるプライマーと、配列番号11からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a6)配列番号5からなるプライマーと、配列番号12からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a7)配列番号6からなるプライマーと、配列番号10からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(a8)配列番号6からなるプライマーと、配列番号12からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
従って、以下の(b)群に含まれるプライマーペアもmecA遺伝子検出用プライマーペアとして利用することができる。
(b)群:
(b1−1)配列番号3の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号7からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b1−2)配列番号3からなるプライマーと、配列番号7の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b1−3)配列番号3の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号7の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b2−1)配列番号2の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号9からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b2−2)配列番号2からなるプライマーと、配列番号9の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b2−3)配列番号2の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号9の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b3−1)配列番号1の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号8の塩基配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b3−2)配列番号1からなるプライマーと、配列番号8の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b3−3)配列番号1の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号8の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b4−1)配列番号1の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号9からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b4−2)配列番号1からなるプライマーと、配列番号9の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b4−3)配列番号1の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号9の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b5−1)配列番号4の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号11からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b5−2)配列番号4からなるプライマーと、配列番号11の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b5−3)配列番号4の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号11の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b6−1)配列番号5の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号12からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b6−2)配列番号5からなるプライマーと、配列番号12の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b6−3)配列番号5の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号12の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b7−1)配列番号6の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号10からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b7−2)配列番号6からなるプライマーと、配列番号10の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b7−3)配列番号6の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号10の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b8−1)配列番号6の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号12からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b8−2)配列番号6からなるプライマーと、配列番号12の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(b8−3)配列番号6の改変塩基配列からなる改変プライマーと、配列番号12の改変塩基配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c)群:
(c1−1)配列番号3の相補配列からなるプライマーと、配列番号7の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c1−2)配列番号3の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号7の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c1−3)配列番号3の相補配列からなるプライマーと、配列番号7の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c1−4)配列番号3の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号7の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c2−1)配列番号2の相補配列からなるプライマーと、配列番号9の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c2−2)配列番号2の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号9の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c2−3)配列番号2の相補配列からなるプライマーと、配列番号9の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c2−4)配列番号2の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号9の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c3−1)配列番号1の相補配列からなるプライマーと、配列番号8の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c3−2)配列番号1の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号8の塩基配列の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c3−3)配列番号1の相補配列からなるプライマーと、配列番号8の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c3−4)配列番号1の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号8の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c4−1)配列番号1の相補配列からなるプライマーと、配列番号9の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c4−2)配列番号1の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号9の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c4−3)配列番号1の相補配列からなるプライマーと、配列番号9の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c4−4)配列番号1の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号9の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c5−1)配列番号4の相補配列からなるプライマーと、配列番号11の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c5−2)配列番号4の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号11の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c5−3)配列番号4の相補配列からなるプライマーと、配列番号11の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c5−4)配列番号4の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号11の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c6−1)配列番号5の相補配列からなるプライマーと、配列番号12の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c6−2)配列番号5の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号12の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c6−3)配列番号5の相補配列からなるプライマーと、配列番号12の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c6−4)配列番号5の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号12の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c7−1)配列番号6の相補配列からなるプライマーと、配列番号10の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c7−2)配列番号6の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号10の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c7−3)配列番号6の相補配列からなるプライマーと、配列番号10の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c7−4)配列番号6の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号10の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c8−1)配列番号6の相補配列からなるプライマーと、配列番号12の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c8−2)配列番号6の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号12の相補配列からなるプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c8−3)配列番号6の相補配列からなるプライマーと、配列番号12の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
(c8−4)配列番号6の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーと、配列番号12の改変塩基配列の相補配列からなる改変プライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
なお、上記の(a)群〜(c)群に含まれる各プライマーペアは、mecA遺伝子が有する構造遺伝子内に特異的にハイブリダイズしてmecA遺伝子に特異的なDNA断片を増幅する点において共通の機能を有する。
本発明は、本発明のプライマーペア以外に、細菌、真菌、ウイルスについての公知プライマーを複数併用することを妨げるものではない。
PCRにおけるPrimer濃度は特に限定されないが、一般的には0.05μM〜1.0μMの範囲で、検討に応じて適宜設定する。
本発明で使用されるPCR用の酵素は、好ましくは耐熱性を有する生物由来の耐熱性DNAポリメラーゼであり、より好ましくはメタン菌、好熱好酸菌、好熱菌、超好熱菌などの原核生物由来のものである。
本発明に用いられる耐熱性DNAポリメラーゼの具体例としては、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)、サーモコッカス・コダカラエンシスKOD1(Thermococcus kodakaraensis KOD1)、パイロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)、パイロコッカス・フリオシス(Pyrococcus furiosus)、エアロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アクイフェックス・アエオリカス(Aquifex aeolicus)、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、パイロロバス・フマリ(Pyrolobus fumarii)、またはメタノパイラス・カンドレリ(Methanopyrus kandleri)由来の耐熱性DNAポリメラーゼを挙げることができる。
また、耐熱性DNAポリメラーゼは遺伝子工学的に人工的に合成された耐熱性DNAポリメラーゼであってもよい。
本発明でPCR分析のために使用されるプライマーペア以外の試薬は、公知のものを公知の組み合わせで使用することが出来る。測定に必要な試薬はPCR用の酵素、pH緩衝液、dNTP、Mg2+源、滅菌水などがあげられる。また、リアルタイムPCR分析においては蛍光色素等の標識物質が上記に加えて必要となる。
pH緩衝液は、PCR分析に供する試料として、pH=7.0〜10.0(より好ましくは、pH8.0〜9.0)に調整するために用いられる。具体的には、Tris塩酸緩衝液などが挙げられる。例えば、Tris塩酸緩衝液の場合、5mM〜100mMで使用する。
dNTPは、PCRによるDNA増幅のためのヌクレオシド源であり、dATP,dCTP、dGTP、dTTPの4種類が必要である。また、dNTPはホットスタート法に用いるために化学修飾されたもの、例えばTriLink BioTechnologies,Inc.製のCleanAmpTM dNTPを用いても良い。使用量は、dATP、dCTP、dGTP、dTTPを各々0.1〜0.2mM前後の濃度で使用する。
PCRによるDNA増幅においては、Mg2+が必要である。Mg2+源としてはMgCl2、MgSO4などが挙げられる。好ましいのはMgCl2であり、その使用量は0.5mM〜5.0mMの範囲で検討に応じて適宜使用する。
蛍光色素は、リアルタイムPCRによるDNA増幅産物の検出、さらには、増幅されたDNA断片のTm値の測定目的で用いられ、例えば、標識機能を有するインターカレーターを用いる方法が挙げられる。インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、サイバー・グリーンI(SYBR GreenI)やResolight(Roche社製)、EvaGreen(Biotium社製)、BOXTO(tataa biocenter製)などが挙げられる。好ましいインターカレーターとしては、EvaGreenやResolightである。使用量は、使用する蛍光色素の製造販売メーカーの推奨に従う。
その他キットには、PCRの陽性対照として使用する細菌のゲノムDNAや、陰性対照として使用する滅菌水が含まれていても良い。
本発明を実施するに際してその他に必要な器具としては、ピペット、ピペット用チップ、1.5mlマイクロチューブなど広く分子生物学の実験に使用される器具類が挙げられ、装置類としてはPCR、クリーンベンチ、チューブ用遠心機など広く分子生物学の実験に使用される機器が挙げられる。
本発明のmecA遺伝子検出キットは、本発明のプライマーペアによって増幅されるDNA断片を解析することでmecA遺伝子を検出するキットである。増幅産物としてのDNA断片の解析は、公知の方法により行うことができる。例えば、DNA断片の分子量解析、Tm値測定(融解曲線分析)などにより、増幅産物としてのDNA断片の解析を行うことができる。2種以上の解析方法を組み合わせてもよい。好ましくはTm値の測定であり、この目的においてリアルタイムPCRが好適に使用される。分子量の解析は、電気泳動や質量分析計などにより行うことができる。
本発明にかかるmecA遺伝子検出キットは、上述した(a)群〜(c)群のプライマーペアの1つ以上を含んで構成される。このプライマーの他に、必要に応じて、PCR用の酵素、pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmpTM dNTP)及び滅菌水等の試薬、PCR分析測定用容器(例えば分析測定用チューブ)やその他に必要な器具などの部品から選択される少なくとも1種の試薬及び/または部品を含むことができる。更に、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を成分として加えることができる。また、PCR法の各種態様によっては、これらの成分の他に用いるPCR法に必要な成分をキットに加えてもよい。これらの各試薬または各部品は、個別に、またはその一部毎に、あるいは全部が一体など、いかなる形態で包装されていても良い。具体的には、例えば以下のような態様である。
1)用いる試薬毎に個分けする。
2)pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmpTM dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を予め混合した混合物、一つのプライマー対及びPCR用の酵素の3つに個分け、すなわち別々に分けて包装する。
3)pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmpTM dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、一つのプライマー対を予め混合した混合物、及びPCR用の酵素の2つに個分け、すなわち別々に分けて包装する。
4)pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmpTM dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、一つのプライマー対及びPCR用の酵素の全てを予め混合した混合物をパッケージする。
なお、キットが複数のプライマー対を有する場合は、複数のプライマー対を別々に分けて包装する。異なるプライマー対を含む複数の混合物をキットの構成に用いる場合についても、各混合物を別々に分けて包装する。
<用途分野・検体>
本発明のmecA遺伝子検出キットは、医療分野、食品分野、環境分析等、様々な分野においてmecA遺伝子検出のために使用できる。また、特許文献1にある感染症起因菌の迅速同定方法と組み合わせて使用し、起因菌同定とmecA遺伝子検出を同時かつ迅速に行うために使用できる。
検査に供される検体としては、特に限定されずに広範囲な検体に適用可能である。具体的には、医療分野において血液、髄液、涙液、眼房水、羊水、関節液、唾液、鼻ぬぐい液、尿、その他体液、カテーテル等医療器具付着物などがあげられる。食品分野においては、食品自体、生産途中の液体、または固体飼料、製造工程内の機器付着物などが挙げられる。
本発明のmecA遺伝子検出キットを用いて検体中のmecA遺伝子検出を実施する場合、検体中に存在するであろう細菌からあらかじめDNAを抽出しておく必要がある。DNA抽出方法としては、現在、アルカリ溶解法、ボイリング法、フェノール抽出法、ビーズ破砕法などが知られており、また、メーカー各社から様々なDNA抽出キットも販売されている。
本発明におけるDNA抽出方法は特に限定されないが、検体により最適な方法は異なるため、対象検体に相応した方法を選択することが望ましい。
<PCR分析>
本発明のプライマーペアは、PCR法において使用される。PCR法としては、mecA遺伝子を検出するための目的遺伝子増幅のためのPCR法であれば種々のPCR法を利用できる。好ましい分析法としては、リアルタイムPCRであり、より好ましくはリアルタイムPCRとTm値測定のための融解曲線分析の組み合わせである。この場合、使用するリアルタイムPCR機器は特に限定されない。なお、本願実施例において使用している株式会社キアゲン製Rotor Gene Qは好適に使用可能なリアルタイムPCR機器の一例である。
PCRおよびリアルタイムPCRにおいては、装置、手法など通常知られたものを使用すればよい。
PCRにおける温度サイクルの条件(温度、時間、昇降温速度、サイクル数)は特に限定されず、使用するプライマーやPCR用の酵素、鋳型などの性質やPCR後のDNA検出方法の感度に応じて適宜設定すればよい。こうした条件の設定については多くの文献が既に知られている。
PCRにおいて、一般的には、鋳型二本鎖DNAの熱変性ステップ、プライマーのアニーリングステップ、PCR用の酵素によるDNA伸長ステップを繰り返す。熱変性のステップは鋳型二本鎖DNAが一本鎖に解離する温度と時間であればよく、例えば90℃〜98℃で数秒〜数分を設定する。またPCR開始時にはその1回目のサイクルにのみ、数分〜10分の熱変性の過程を追加することも多い。プライマーのアニーリングステップはプライマーの塩基配列、塩基数に応じ設定するが、40℃〜72℃で数秒〜数十秒を設定することが多い。DNA伸長ステップにおいては、温度についてはPCR用の酵素の最適温度などの性質に応じ、例えば、58℃〜76℃が一般的であり、DNA伸長ステップの時間については増幅させたいDNAの鎖長とPCR用の酵素のDNA合成速度から必要時間を概算し設定する。熱変性、アニーリング、伸長のステップを繰り返すことで目的のDNAを増幅させるが、この繰り返し回数は、鋳型DNAの量や、PCR用の酵素の量、PCR後のDNA検出方法の感度に応じて、適宜変更すればよいが、一般的な例として10〜50回が例示される。また、アニーリングの温度とDNA伸長の温度が同程度である場合、両ステップを同時に行うことも可能である。
リアルタイムPCRにおいても、DNA増幅に必要な熱変性、アニーリング、DNA伸長についての条件設定、さらにはそれらのステップの繰り返し回数は、上記のPCRについての記載と同様である。リアルタイムPCRにおいては、DNA伸長のステップの前後などに、インターカレーターに由来する蛍光強度を測定することで増幅されたDNA量を定量ないしは見積もることが可能である。蛍光強度を測定する温度は、例えばインターカレーターを用いての実施の場合は、DNA伸長時の温度そのままでも良く、また、増幅される目的DNAの鎖長が比較的長く、そのTm値が比較的高い場合には、プライマーダイマーなどの比較的鎖長が短い非特異的に増幅された目的外DNA(非特異的増幅DNAともいう)はそのTm値が比較的低いことを利用して、目的DNAのTm値と非特異的増幅DNAのTm値の中間値をはじめとする、これらの間の温度に設定しても良い。こうすることで、特にインターカレーターを用いての実施ではプライマーダイマーなどの非特異的増幅DNAのみが二本鎖から一本鎖に解離し、蛍光強度から定量ないしは見積もられるDNA量は目的DNAについてのものとすることが可能である。
さらに、リアルタイムPCRにおいてはDNA増幅工程の終了後、融解曲線解析により、増幅されたDNAのTm値を測定できる。融解曲線分析では、温度変化に応じたDNAの二本鎖から一本鎖への解離を観察するが、その温度および検出条件は特に限定はない。一般的に、熱変性(Denaturation)(90℃から98℃)、二本鎖形成(Annealing)(40℃から80℃)、融解(Melting)(二本鎖形成の温度から98℃前後まで徐々に昇温)の段階をへて、融解のステップでの蛍光強度の変化をモニターすることで、融解曲線を得て、そこからTm値を得ることができる。こうした測定はリアルタイムPCR装置の多くの機種で可能であり、機器の使用方法に準じて実施可能である。
本発明にかかる検体中のmecA遺伝子検出方法としては、以下の工程を有する方法を用いることができる。
(1)前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、mecA遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーペアと、耐熱性DNAポリメラーゼをはじめとするPCR用試薬を用いてPCRを行う工程。
(2)前記PCRにおける増幅産物中でのmecA遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中におけるmecA遺伝子の検出を行う工程。
なお、複数のプライマーペアを用いる場合は、PCR工程(1)を複数のプライマーペア毎に別々に行う。すなわち、PCR用の1つの反応液中に1つのプライマーペアを添加して、異なるプライマーペアを添加した複数の反応液をそれぞれ個々に用いてPCR工程(1)を行う。
mecA遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーペアとして本発明にかかるプライマーペアの少なくとも1種を用いることによって、高感度なメチシリン耐性遺伝子(mecA)の検出を行うことができる。
この検出方法では、増幅工程を、目的遺伝子としてのmecA遺伝子以外の遺伝子(目的外遺伝子)の増幅抑制下で行うことが好ましい。この目的外遺伝子の増幅抑制には、ホットスタート法PCRが利用できる。一例として、抗DNAポリメラーゼ抗体を用いるホットスタート法が挙げられる。その際、耐熱性DNAポリメラーゼ1Uに対して、過剰量の抗DNAポリメラーゼ抗体を用いることが好ましい。また、特許文献1及び国際公開第2010/082640号明細書に開示されているようにDNAポリメラーゼに対して、可逆的な化学修飾を施すことによるホットスタート法も好適に利用できる。さらには、化学修飾されたdNTPを用いたり、米国特許出願公開第20070281308号明細書(US2007/0281308A1)に記載のように化学修飾されたプライマーを用いたホットスタート法も好適に利用できる。また、加熱により溶融するワックスなどを用いて、DNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅に必要不可欠な構成成分(例えば、プライマーやdNTPやMg2+塩)とを物理的に隔離することによるホットスタート法も好適に利用できる。
リアルタイムPCRを用いたTm値測定による検出工程では、目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行うことができる。そのための方法としては、目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
(1)目的遺伝子増幅産物の融解温度(TmA)が、目的外遺伝子の増幅産物の融解温度(TmB)よりも高くなるプライマーを選択し、
(2)増幅産物の検出を、TmAとTmBとの間の温度で行う
ことにより設定し、目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法が好ましい。
更に、増幅工程と検出工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムPCRにより行い、目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる方法を用いることができる。
検出工程における増幅産物の分析は、増幅産物をゲル上などでの電気泳動により展開、可視化する増幅産物の解析により行うことができる。また、増幅産物の分析は、増幅産物の塩基配列を解読することによる増幅産物の解析により行うことも可能である。さらに、増幅産物の分析は増幅産物の分子量を質量分析計で測定して解析する方法によって行うことにもできる。
MRSA(理研分譲株,JCM31453)の培養液からHigh pure PCR template preparation kit (Roche)を使って抽出したゲノムDNAを鋳型に配列番号15と配列番号16のプライマーを用いて表1に示した反応液組成でPCRを行いmecA ORF全長を増幅した。次に、mecAの増幅産物の希釈系列を作製し、配列番号13からなるフォワードプライマーと配列番号14からなるリバースプライマーからなる比較用プライマーペアを用いて表1に示した反応液組成でPCRを行い、立ち上がりサイクル数がおおよそ20サイクルになるmecAの増幅産物の濃度を決定し、鋳型として用いた。なお、メチシリン耐性Staphylococcus aureus,JCM31453は微生物材料開発室(〒305−0074、茨城県つくば市高野台3−1−1、 国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(RIKEN BRC−JCM)より公的に入手可能である。
次に、作製したプライマーの評価を行うために、313のプライマーペアについて表1に示した反応液組成でPCRをおこなった。リアルタイムPCR装置はロータージーンQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)を用いた。PCRの反応条件は、95℃ 5分間加熱した後に、94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒を40回繰り返した。評価は、立ち上がりサイクル数、High resolution melting analysis(HRM)でのピークの形状、電気泳動でのバンドの強度、電気泳動での非特異的産物の有無について、比較用プライマーペアでの結果と比較し改善が認められるもの、88ペアを選抜した。
MRSA(理研分譲株,JCM31453)の培養液からHigh pure PCR template preparation kit (Roche)を使って抽出したゲノムDNAの濃度を、50μg/ml human genomic DNA溶液(invirogen)で立ち上がりサイクル数がおおよそ20サイクルになるよう調整した溶液を鋳型として用いた。
88のプライマーペアについて表1に示した反応液組成でPCRを行うことで評価した。リアルタイムPCR装置はロータージーンQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)を用いた。PCRの反応条件は、95℃ 5分間加熱した後に、94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒を40回繰り返した。評価は、立ち上がりサイクル数、HRMでのピークの形状、電気泳動でのバンドの強度、電気泳動での非特異的産物の有無について、比較用プライマーペアでの結果と比較し改善が認められた57ペアを選抜した。
MRSA(理研分譲株,JCM31453)の培養液からHigh pure PCR template preparation kit (Roche)を使って抽出したゲノムDNAの濃度を、50μg/ml human genomic DNA溶液(invitrogen)で10.4分子/反応液になるよう調整した溶液を鋳型として用いた。57のプライマーペアについて表1に示した反応液組成を用いた3重測定でPCRを行うことで評価した。リアルタイムPCR装置はロータージーンQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)を用いた。PCRの反応条件は、95℃ 5分間加熱した後に、94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒を40回繰り返した。評価は、3重測定の全てで増幅が見られるか、HRMでのdF/dTのHeight(channelA)、プライマーダイマーの有無、非特異的産物のピークの有無について、比較用プライマーペアでの結果と比較し改善が認められた9ペアを選抜した。
MRSA(理研分譲株,JCM31453)の培養液からHigh pure PCR template preparation kit (Roche)を使って抽出したゲノムDNAを50μg/ml human genomic DNA溶液(invirogen)で各濃度(コピー数/反応液:表2ではCopies/Reactionと表示)になるよう調整した溶液を鋳型として用いた。9のプライマーペアについて表1に示した反応液組成で、3重測定でPCRを行うことで評価した。リアルタイムPCR装置はロータージーンQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)を用いた。PCRの反応条件は、95℃ 5分間加熱した後に、94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒を40回繰り返した。3重測定の全てで増幅が見られる最低濃度を検出限界とした。なお、目的とする増幅産物が得られたかどうかはTm値の測定により確認した。
その結果、先願である特許文献1で示された比較用プライマーペアを用いて検出を行った場合よりも検出限界の向上が見られた8ペアを選抜した。その結果を表2に示す。また、比較用のプライマーペアが有する配列番号13、14、選抜された8ペアが有する各塩基配列を表3に示す。
Staphylococcus aureus(メチシリン感受性 理研分譲株,JCM2151)及びMRSA(メチシリン耐性 理研分譲株,JCM16555)の培養液からHigh pure PCR template preparation kit (Roche)を使って抽出したゲノムDNA溶液を鋳型として用いた。配列番号6と配列番号10のプライマーペアについて表1に示した反応液組成で、PCRを行うことで評価した。リアルタイムPCR装置はロータージーンQ MDx 5plex HRM(QIAGEN)を用いた。PCRの反応条件は、95℃ 5分間加熱した後に、94℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 30秒を40回繰り返した。なお、目的とする増幅産物が得られたかどうかはTm値の測定により、81℃付近でのピークの有無にて確認した。メチシリン耐性株の結果を図1(a)に、メチシリン感受性株の結果を図1(b)に示す。
Claims (7)
- mecA遺伝子(メチシリン耐性遺伝子)を検出するためのプライマーペアであって、
前記プライマーペアが、以下の(a)〜(c)からなる群から選択された1つのプライマーペアであることを特徴とするmecA遺伝子を検出するためのプライマーペア。
(a)配列番号3と配列番号7の組み合わせ、配列番号2と配列番号9の組み合わせ、配列番号1と配列番号8の組み合わせ、配列番号1と配列番号9の組み合わせ、配列番号4と配列番号11の組み合わせ、配列番号5と配列番号12の組み合わせ、配列番号6と配列番号10の組み合わせ又は配列番号6と配列番号12の組み合わせからなるプライマーペア、
(b)前記(a)において、一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、
(c)前記(a)又は(b)の塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。 - 前記プライマーペアが、配列番号6と配列番号10の組み合わせからなるプライマーペア、または当該組み合わせの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペアである、請求項1に記載のプライマーペア。
- プライマーペアを含む、mecA遺伝子検出キットであって、
前記プライマーペアが、以下の(a)〜(c)からなる群から選択されたすくなくとも1つのプライマーペアであることを特徴とするmecA遺伝子検出キット。
(a)配列番号3と配列番号7の組み合わせ、配列番号2と配列番号9の組み合わせ、配列番号1と配列番号8の組み合わせ、配列番号1と配列番号9の組み合わせ、配列番号4と配列番号11の組み合わせ、配列番号5と配列番号12の組み合わせ、配列番号6と配列番号10の組み合わせ又は配列番号6と配列番号12の組み合わせからなるプライマーペア、
(b)前記(a)において、一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、
(c)前記(a)又は(b)の塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。 - 前記プライマーペアが、配列番号6と配列番号10の組み合わせからなるプライマーペア、または当該組み合わせの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペアである、請求項3に記載のキット。
- PCR用の酵素、PCR用の試薬及びPCR用の器具の少なくとも1種を含む、請求項3または4に記載のキット。
- 検体中のmecAの検出方法であって、
検体中から調製したDNAと、DNAを増幅するためのプライマーペアとを用いてPCRを行うPCR工程と、
前記PCR工程により得られる増幅産物中でのmecA遺伝子の検出により、または、該増幅産物の分析により、前記検体中におけるmecA遺伝子の検出を行う工程と、
を有し、
前記PCR工程において用いられるプライマーペアが、以下の(a)〜(c)からなる群から選択されたすくなくとも1つのプライマーペアであることを特徴とするmecA遺伝子の検出方法。
(a)配列番号3と配列番号7の組み合わせ、配列番号2と配列番号9の組み合わせ、配列番号1と配列番号8の組み合わせ、配列番号1と配列番号9の組み合わせ、配列番号4と配列番号11の組み合わせ、配列番号5と配列番号12の組み合わせ、配列番号6と配列番号10の組み合わせ又は配列番号6と配列番号12の組み合わせからなるプライマーペア、
(b)前記(a)において、一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペア、
(c)前記(a)又は(b)の塩基配列に対応する相補的配列からなるプライマーペア。 - 前記プライマーペアが、配列番号6と配列番号10の組み合わせからなるプライマーペア、または当該組み合わせの一方又は両方のプライマーの塩基配列の一部をプライマーとしての機能を損なわない範囲で1または2の塩基が付加、欠失または置換したプライマーペアである、請求項6に記載の検出方法。
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