WO2017222056A1 - ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム - Google Patents

ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム Download PDF

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nucleic acid
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克之 城口
隆二 鈴木
隆治 松谷
一孝 北浦
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国立研究開発法人理化学研究所
Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a technique for performing reverse transcription template switching PCR in one step and a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire analysis system using this technique.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • Reverse transcription polymerase chain reaction (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) is widely used in the field of genetic engineering as a technique for amplifying a specific gene using RNA as a template.
  • RNA is first reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase), and then the cDNA is amplified to a detectable level by thermostable DNA polymerase.
  • reverse transcriptase RNA-dependent DNA polymerase
  • thermostable DNA polymerase reverse transcriptase
  • This reaction combination is carried out in an orthodox manner in two steps (using a separate tube for each reaction, and the reaction is continued), but this reaction combination can be achieved by devising reverse transcriptase and the composition of the reaction solution. Technology has been developed that performs steps (reacts continuously in one tube).
  • Template switching is a technology that enables RT-PCR amplification using RNA as a template even if the 5 'end sequence of the template RNA is unknown or does not have a common sequence. is there.
  • a specific short sequence eg, Moloney Murine Leukemia Virus
  • MMLV RT derived reverse transcriptase
  • oligonucleotide template switching oligonucleotide
  • 3 of the cDNA synthesized with the template switching oligonucleotide is synthesized. 'Hybridize to the end and extend the template for reverse transcriptase. Since reverse transcriptase changes templates and continues cDNA synthesis to the 5 'end of the anchor sequence, a sequence complementary to the anchor sequence is added to the 3' end of the cDNA.
  • cDNA synthesized newly by using an oligo DNA containing a sequence complementary to a specific sequence in the template RNA or a specific known sequence added to the 5 ′ end is used. Since the 5 ′ end also has a known sequence, the resulting newly synthesized cDNA (antisense strand) will have known sequences at both ends of the 5 ′ end and the 3 ′ end. Therefore, PCR amplification becomes possible by using a primer set designed based on these known sequences.
  • Synthesis of cDNA corresponding to mRNA having a poly (A) tail is achieved by reverse transcription using a random primer or an oligo (dT) -containing primer complementary to the poly (A) tail.
  • cDNA is synthesized from all mRNAs having a poly (A) tail, so that a cDNA library is constructed.
  • a primer specific for a specific gene in reverse transcription, it becomes possible to specifically synthesize only the cDNA of the specific gene.
  • oligonucleotide primers to which a thermolabile modifying group is bonded have been developed (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • this oligonucleotide primer one or more internucleotide bonds or 3 ′ terminal hydroxyl groups are substituted with modifying groups.
  • This modification group protection prevents DNA polymerase-mediated oligonucleotide primer extension before the initial high temperature incubation period in PCR amplification. Due to the presence of the modifying group, the primer is in an inactive state until the initial denaturation temperature (often 95 ° C.) is reached. When the initial denaturation temperature is reached, the modifying group is detached, resulting in a corresponding unmodified oligonucleotide primer that can be extended by polymerase.
  • Patent Document 3 discloses a method for quantitatively analyzing a repertoire of a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR) using a nucleic acid sample amplified in an unbiased manner by an adapter primer. To do.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the present invention provides a technique for performing reverse transcription template switching PCR more quickly, more simply, and with high specificity.
  • the present invention also provides a method for quantitatively analyzing the repertoire of the variable region of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) by applying reverse transcription template switching PCR.
  • the inventor uses a primer specific for a specific gene as a primer for reverse transcription, and an oligonucleotide having an anchor sequence in the template switching primer as a primer set for PCR. And a combination of the primers for reverse transcription and the reaction combination of reverse transcription and PCR in one step (one step in the same reaction system).
  • a side reaction occurred, and this tendency was remarkable especially when the number of RNA copies used as a template was small and the number of PCR cycles was increased.
  • the side reaction is caused by the fact that the specificity of PCR depends only on the primer for reverse transcription, and the reverse transcription primer is not used because the reverse transcription primer is present in excess of the template RNA copy number. It was thought that it hybridizes specifically to the template RNA and nonspecific reverse transcription occurs.
  • the reverse transcription primer is used not only as a reverse transcription but also as a primer in PCR, but this has been changed so that the 3 ′ terminal OH of the same oligonucleotide as the reverse transcription primer is heated.
  • a primer that has been inactivated by protection with an unstable modifying group (hereinafter, the inactivated primer may be referred to as a block primer) is used as a PCR primer, and the amount of added reverse transcription primer is reduced. Succeeded in suppressing the occurrence of reaction.
  • the reverse transcription primer and the block primer hybridize to the template RNA, but the block primer cannot contribute to reverse transcription because of protection by the modifying group, and only the reverse transcription primer. Reverse transcription occurs starting from.
  • the present invention is applied to the quantitative analysis of the repertoire of the variable region of the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) by applying the above-described one-step reverse transcription template switching PCR. is there.
  • the present inventor has further studied based on the above findings and has completed the present invention.
  • the present invention includes: [1] A nucleic acid amplification method for amplifying at least a partial region of RNA using a modified oligonucleotide primer,
  • the nucleic acid amplification reaction includes a reverse transcription step a) using RNA as a template, a template switching step b) for adding a template switching oligonucleotide to the cDNA synthesized in step a), and DNA amplification step c) by PCR using the template switch cDNA synthesized in step b) as a template, and steps a) to c) are performed in one step in the same reaction system
  • the modified oligonucleotide primer is characterized in that a part or all of the primer function is inhibited in the reverse transcription step a) by the modification, and the inhibition of the primer function is released in the DNA amplification step c).
  • Amplification method [2] The following steps: 1) i) a template switching oligonucleotide, ii) a primer set consisting of a 5 ′ anchor oligonucleotide primer containing at least part of the anchor sequence contained in the template switching oligonucleotide, and a modified oligonucleotide primer, and iii) a template RNA, All reagents necessary for template-switching reverse transcription of the template RNA to cDNA and for PCR amplification of at least a portion of the cDNA (except for oligonucleotide primers that initiate reverse transcription)
  • Providing a composition comprising: 2) By incubating the composition provided in 1) at a temperature at which reverse transcription can proceed, a cDNA having a nucleotide sequence complementary to the anchor sequence added to the 3 ′ end is generated from the template RNA.
  • a nucleic acid in which the region sandwiched between the primer sets is amplified using the cDNA as a template is obtained.
  • a method for amplifying a nucleic acid comprising amplifying at least a partial region of RNA using a modified oligonucleotide primer, In the modified oligonucleotide primer, a part or all of the primer function in reverse transcription is inhibited by the modification, and the inhibition of the primer function is released by the result of the reverse transcription or the initial heat denaturation treatment of PCR. ,Method.
  • composition provided in 1) further comprises an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR, or heat
  • the modified oligonucleotide primer includes a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of template RNA.
  • kits according to [9] comprising the oligonucleotide of i) and the primer set of ii) as a composition containing a mixture of both.
  • the kit according to [9] or [10] further comprising an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the kit according to [9] or [10] which does not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • a method of amplifying at least a partial region of a target RNA comprising: a) Mixing the target RNA, a reagent necessary for reverse transcription, a reagent necessary for template switching, and a reagent necessary for polymerase chain reaction, and subjecting the mixture to conditions that cause reverse transcription, a template switching oligonucleotide And providing a cDNA comprising a nucleic acid sequence corresponding to the RNA of interest; b) subjecting the cDNA obtained from step a) to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to amplify at least a partial region of the cDNA,
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction is a modified oligonucleotide primer designed such that part or all of the primer function is inhibited in the step a) and the inhibition of the primer function is canceled in the step b) Including a method.
  • a method for producing an amplified nucleic acid sample based on at least a partial region of a target RNA comprising: a) Mixing the target RNA, a reagent necessary for reverse transcription, a reagent necessary for template switching, and a reagent necessary for polymerase chain reaction, and subjecting the mixture to conditions that cause reverse transcription, a template switching oligonucleotide And providing a cDNA comprising a nucleic acid sequence corresponding to the RNA of interest; b) subjecting the cDNA obtained from step a) to conditions under which polymerase chain reaction occurs,
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction is a modified oligonucleotide primer designed such that part or all of the primer function is inhibited in the step a) and the inhibition of the primer function is canceled in the step b) Including a method.
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction includes a 5 ′ anchor oligonucleotide primer including at least a part of an anchor sequence included in the template switching oligonucleotide, if necessary [A1] or [A2] The method described in 1. [A4] The method according to [A3], wherein the reagent necessary for the polymerase chain reaction does not include the 5 ′ anchor oligonucleotide primer.
  • the reagent necessary for the reverse transcription includes an oligonucleotide primer for initiating reverse transcription, and the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription in the mixture at a final concentration of about 40 nM or less, or the modification
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR, or The method according to any one of [A1] to [A5], comprising a thermolabile modifying group. [A7] The method according to any one of [A1] to [A6], wherein the modified oligonucleotide primer includes a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of a template RNA.
  • a kit for amplifying at least a partial region of a target RNA comprising: i) Reagents necessary for reverse transcription; ii) Reagents required for the template switch, iii) Reagents necessary for polymerase chain reaction using modified oligonucleotide primers and iv) If necessary, instructions for use are included, The reagents of i) to iii) and the modified oligonucleotide primer are all mixed in the reaction system at the start of the reaction, and the modified oligonucleotide primer is a part of the primer function under conditions that cause reverse transcription.
  • kits that is designed so that inhibition of primer function is released under conditions where all are inhibited and a polymerase chain reaction occurs.
  • the reagent necessary for the template switch includes a template switching oligonucleotide, and the reagent necessary for the polymerase chain reaction optionally includes at least a part of an anchor sequence included in the template switching oligonucleotide.
  • the kit according to [A10] wherein the reagent necessary for the polymerase chain reaction does not include the 5 ′ anchor oligonucleotide primer.
  • the reagent necessary for reverse transcription includes an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, and the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription is at a final concentration of about 40 nM or less, or relative to the modified oligonucleotide primer.
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region until the initial heat denaturation treatment of PCR, or
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR, or
  • the composition of [A16] comprising a thermolabile modifying group.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • a cDNA comprising a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences; b) subjecting the cDNA obtained from step a) to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to provide a nucleic acid sample containing the nucleic acid sequences of the plurality of types of T cell receptors (TCR) or B cell receptors (BCR) Process,
  • the reagents required for the template switch include a template switching oligonucleotide,
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction contains a C region specific primer of the TCR or the BCR, and the C region specific primer is partially or completely inhibited in the primer function in the step a),
  • a method wherein the step b) is a modified oligonucleotide primer designed to release inhibition of primer function.
  • a method of producing a nucleic acid sample for analyzing a repertoire of a T cell receptor (TCR) or a variable region of a B cell receptor (BCR) in a subject comprising (1) Providing a nucleic acid sample comprising a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences amplified from RNA obtained from a subject, the step (1), a) Mix RNA obtained from the subject, a reagent necessary for reverse transcription, a reagent necessary for template switch, and a reagent necessary for polymerase chain reaction, and subject the mixture to conditions under which reverse transcription occurs.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • a cDNA comprising a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences; b) subjecting the cDNA obtained from step a) to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to provide a nucleic acid sample containing the nucleic acid sequences of the plurality of types of T cell receptors (TCR) or B cell receptors (BCR) Including a process,
  • the reagents required for the template switch include a template switching oligonucleotide,
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction contains a C region specific primer of the TCR or the BCR, and the C region specific primer is partially or completely inhibited in the primer function in the step a),
  • a method wherein the step b) is a modified oligonucleotide primer designed to release inhibition of primer function.
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction further includes a 5 ′ anchor oligonucleotide primer including at least a part of an anchor sequence included in the template switching oligonucleotide, if necessary.
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction does not include the 5 ′ anchor oligonucleotide primer, and the template switching oligonucleotide functions as a 5 ′ anchor oligonucleotide primer.
  • the reagent necessary for reverse transcription includes an oligonucleotide primer for initiating reverse transcription, and the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription is in the mixture at a final concentration of about 40 nM or less, or the modification
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region until the initial heat denaturation treatment of PCR, or The method according to any one of [B1] to [B6], comprising a thermolabile modifying group.
  • Any one of [B1] to [B7], wherein a part of the modified oligonucleotide primer whose primer function is not inhibited functions as an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription by hybridizing to the template RNA. The method according to item.
  • the reagents of i) to iii) and the modified oligonucleotide primer are all mixed in the reaction system at the start of the reaction,
  • the reagent of ii) comprises a template switching oligonucleotide,
  • the modified oligonucleotide primer is designed such that part or all of the primer function is inhibited under conditions where reverse transcription occurs, and the inhibition of the primer function is released under conditions where polymerase chain reaction occurs.
  • kits which is a C region-specific primer of the BCR [B10] The kit according to [B9], wherein the reagent necessary for the polymerase chain reaction includes a 5 ′ anchor oligonucleotide primer including at least a part of an anchor sequence included in the template switching oligonucleotide. [B11] The kit according to [B9] or [B10], wherein the reagent necessary for the polymerase chain reaction does not include the 5 ′ anchor oligonucleotide primer.
  • the reagent necessary for reverse transcription includes an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, and the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription is at a final concentration of about 40 nM or less, or relative to the modified oligonucleotide primer.
  • the modified oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, and takes a folded structure by the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR, or The kit according to any one of [B9] to [B12], comprising a thermolabile modifying group.
  • Some modified oligonucleotide primers whose primer functions were not inhibited function as oligonucleotide primers that initiate reverse transcription by hybridizing to the TCR or the partial sequence of the C region of the template RNA of the BCR. [B9] to [B13].
  • the step (1) further includes a step of providing a nucleic acid sample to which an appropriate sequence has been added for sequence analysis, and [B3] to [B3] to [B1] when subordinate to [B1]. B8].
  • the method according to [B16], wherein the sequence suitable for sequence analysis is a sequence suitable for sequence analysis using bridge PCR or emulsion PCR.
  • the step (1) includes the following: c) PCR amplification product of step b), a second 5 ′ anchor oligonucleotide primer to which a first tag sequence is added, and a C region of the second TCR or BCR to which a second tag sequence is added
  • a mixture containing specific primers is subjected to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to provide a nucleic acid sample containing a plurality of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences to which a tag sequence has been added.
  • Providing a nucleic acid sample comprising a nucleic acid sequence of the plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) to which an index sequence has been added, comprising the third 5 ′ anchor oligonucleotide primer and
  • the third TCR or BCR C region-specific primer further comprises a step to which a sequence for immobilization on a substrate for sequence analysis and an index sequence are added, subordinate to [B1] and [B1] The method according to [B3] to [B8], [B16] or [B17].
  • the step (3) includes the following: (3-1) providing a reference database for each gene region including at least one of the V region, the D region, the J region and, if necessary, the C region; (3-2) a step of trimming as necessary, and providing an input sequence set in which an appropriate length is extracted as necessary; (3-3) performing a homology search with the reference database for each of the gene regions for the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (3-4) assigning a V region and a J region for the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (3-5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; (3-6) Based on the classification in the step (3-5), by calculating the appearance frequency of each of the V region, D region, J region and, if necessary, the C region, or a combination thereof, Deriving a TCR or BCR repertoire,
  • [B20] A system for quantitatively analyzing a repertoire of a variable region of a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) using a database, the system comprising: (1) The kit according to any one of [B9] to [B15]; (2) an apparatus for determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) A system comprising an apparatus for calculating the appearance frequency of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the kit is as follows: c) PCR amplification product of step b), a second 5 ′ anchor oligonucleotide primer to which a first tag sequence is added, and a C region of the second TCR or BCR to which a second tag sequence is added A mixture containing specific primers is subjected to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to provide a nucleic acid sample containing a plurality of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences to which a tag sequence has been added.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the apparatus for deriving the TCR or BCR repertoire is as follows: (3-1) Means for providing a reference database for each gene region including at least one of V region, D region, J region, and, if necessary, C region; (3-2) means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3-3) Means for performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (3-4) Means for assigning a V region and a J region for the input sequence set, and extracting a nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (3-5) means for translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; and (3-6) based on the classification in the step (3-5) A means for deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the
  • [B23] A system according to any one of [B20] to [B22], and means for analyzing a disease, disorder or condition of the subject based on a TCR or BCR repertoire derived based on the system A system for analyzing a disease, disorder or condition of a subject.
  • [B24] Means for quantitatively associating a disease, disorder or condition of a subject determined by the system according to [B23] with the TCR or BCR repertoire, and appropriate treatment or prevention from the quantitative association And a means for selecting a means for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject.
  • reverse transcription template switching PCR can be expected to be performed in a single step with high specificity.
  • the number of RNA copies used as a template is small and the number of PCR cycles is increased, it can be expected to amplify a specific PCR product while suppressing the occurrence of side reactions.
  • Amplification of TCR ⁇ chain by one-step reverse transcription template switching PCR under various conditions The arrow indicates the full-length TCR ⁇ chain band. Amplification of TCR ⁇ chain by one-step reverse transcription template switching PCR under various conditions. The arrow indicates the full-length TCR ⁇ chain band. Amplification of TCR ⁇ chain by one-step reverse transcription template switching PCR using single-cell T cells as templates. The upper arrow indicates the full-length TCR ⁇ chain band. The lower arrow indicates the band of the TCR ⁇ chain fragment. Amplification of TCR ⁇ chain by one-step reverse transcription template switching PCR under various conditions. The arrow indicates the full-length TCR ⁇ chain band. Amplification of TCR ⁇ chain by one-step reverse transcription template switching PCR under various conditions.
  • the arrow indicates the full length target sequence band of the TCR ⁇ chain.
  • Electrophoresis photograph of index PCR reaction solution The left lane shows a marker DNA, and the right lane shows a DNA band amplified from RNA extracted from Pmel-1-derived lymphocytes.
  • V gene and J gene usage frequency graph obtained from Pmel-1 mouse-derived lymphocyte cells.
  • V-J usage frequency graph obtained from lymphocyte cells derived from Pmel-1 mice.
  • Each lane is, in order from the left, 1: marker DNA, 2-6: mouse spleen tissue (1000 ng, 200 ng, 40 ng, 8 ng, 1.6 ng), 7-8: Pmel-1-derived lymphocytes (8 ng, 1.6 ng), 9: Indicates blank.
  • the usage frequency graph of each of the V gene and J gene obtained from the spleen tissue of C57BL / 6 mice.
  • the present invention relates to a method for amplifying at least a partial region of a template RNA by one-step reverse transcription template switching PCR.
  • Reverse transcription template switching PCR is a technology that enables RT-PCR amplification using RNA as a template even when the 5 'end sequence of the template RNA is unknown or does not have a common sequence. is there.
  • reverse transcription template switching PCR when the reverse transcriptase reaches the 5 'end of the template RNA, a specific short sequence is automatically generated at the 3' end of the newly synthesized cDNA due to the terminal transferase activity of the reverse transcriptase. Use added phenomena.
  • MMLV RT Moloney Murine Leukemia Virus
  • a cytosine-rich short sequence eg, CC, CCC, CCCC
  • nucleotide sequence template switching oligonucleotide
  • first anchor sequence a nucleotide sequence in which a sequence complementary to this short additional sequence is added to the 3 ′ end of a specific anchor sequence
  • the template is transferred to the template switching oligonucleotide and continues to synthesize the cDNA until the 5 ′ end.
  • a sequence complementary to the anchor sequence (first anchor sequence) is added.
  • the newly synthesized cDNA has a known sequence at the 5 ′ end.
  • PCR amplification using a newly synthesized cDNA as a template can be performed by using a primer set including an oligonucleotide primer including the known sequence and an oligonucleotide primer including at least a part of the first anchor sequence. It becomes possible.
  • template switching may not be performed if the sequence on the 5 ′ end side of the template RNA is known.
  • reverse transcription template switching PCR is performed in “one step (one step)”.
  • RT-TS-PCR reverse transcription template switch PCR
  • RT-TS-PCR reverse transcription template switch PCR
  • the nucleic acid amplification reaction consists of a reverse transcription step a) using RNA as a template, a template switching step b) for adding a template switching oligonucleotide to the cDNA synthesized in step a), and a step DNA amplification step c) by PCR using the template switch cDNA synthesized in b) as a template, and steps a) to c) are performed in one step in the same reaction system.
  • the present invention relates to a method of amplifying at least a partial region of a target RNA, the method comprising: a) the target RNA, a reagent necessary for reverse transcription, and a polymerase chain reaction. Mixing with the necessary reagents and subjecting the mixture to conditions under which reverse transcription occurs, the mixing comprising mixing the necessary reagents for the template switch, if necessary, b) Subjecting the mixture to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to amplify at least a partial region of the RNA of interest, wherein the reagents required for the polymerase chain reaction are part of the primer function in step a)
  • a method is provided that comprises a modified oligonucleotide primer that is fully inhibited, wherein step b) is designed to release inhibition of primer function.
  • the present invention relates to a method for producing an amplified nucleic acid sample based on at least a partial region of a target RNA, the method comprising: a) the target RNA, a reagent necessary for reverse transcription, a polymerase Mixing the reagents necessary for the chain reaction and subjecting the mixture to conditions that cause reverse transcription, the mixing comprising mixing the reagents necessary for the template switch, if necessary, b) subjecting the mixture to conditions under which a polymerase chain reaction occurs, wherein the reagent necessary for the polymerase chain reaction is partially or fully inhibited in the primer function in step a), and the step b ) Provides a method comprising a modified oligonucleotide primer designed to release inhibition of primer function.
  • a specific anchor sequence can be added to the 5' end of the template RNA by performing a template switch Therefore, it is advantageous.
  • the template switch need not be performed.
  • the reagent necessary for the template switch may include a template switching oligonucleotide.
  • the reagents required for the polymerase chain reaction may or may not include a 5 'anchor oligonucleotide primer that includes at least a portion of the anchor sequence included in the template switching oligonucleotide.
  • the template switching oligonucleotide TS-Oligo
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction may not contain the 5 'anchor oligonucleotide primer, and may be a smaller amount than that usually used.
  • PCR amplification could be achieved with high specificity.
  • some of the modified oligonucleotide primers are not inhibited in function, and some modified oligonucleotide primers are not inhibited in function.
  • the reagents required for reverse transcription may or may not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, but will initiate reverse transcription used in the method.
  • the amount of oligonucleotide primer may be smaller than the amount normally used.
  • the concentration of oligonucleotide primer that initiates reverse transcription in the composition is, for example, about 40 nM or less, preferably about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 2.5 nM or less, about 2.0 nM or less.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription in the composition is about 1/10 or less, preferably about 1/20 or less, about 1/40 of the modified oligonucleotide primer. Less than about 1/160, less than 1/200, less than 1/635, less than 1 / 2,000, less than 1 / 2,500, less than 1 / 20,000, less than 1 / 200,000 About 2,000,000 or less, or about 20,000,000 or less.
  • oligonucleotide primer in PCR as at least one oligonucleotide primer in PCR, a part or all of the primer function in reverse transcription is inhibited by modification, and the inhibition of the primer function is released in the PCR nucleic acid amplification step.
  • This achieves functional separation of the primers used in the reverse transcription reaction stage and the PCR nucleic acid amplification stage in the same reaction system, and greatly differs the primer concentration in each reaction stage. It is characterized by.
  • the primer function at the time of reverse transcription is inhibited by a primer containing a thermolabile modifying group or designed to retain a folded structure in the reverse transcription reaction step.
  • the inhibition of the primer function is released by the dissociation of the thermolabile modifying group or the elimination of the folded structure by heat treatment. 2)
  • the function as a primer is inhibited in the reverse transcription reaction step by a primer containing an artificial base.
  • a cDNA incorporating a nucleic acid paired with an artificial base contained in the primer is synthesized from the template RNA by the reverse transcription reaction, and the primer can be annealed to the artificial nucleic acid. The inhibition is released.
  • RT-PCR In one-step RT-PCR, generally, at the start of reverse transcription, PCR is performed using all reagents necessary for reverse transcription of template RNA into cDNA in the reaction system and the resulting cDNA as a template. All reagents necessary to do are included. Since the Tm of the PCR primer is usually set to 50 ° C. or higher, the primer specificity may not be sufficiently exhibited in a temperature range where reverse transcription can proceed (eg, 42 ° C.). Further, in PCR, the template copy number increases exponentially, so the required concentration of PCR primer is much higher than the concentration of primer for reverse transcription.
  • the PCR primer may misanneal with the template RNA, resulting in nonspecific reverse transcription starting from the template RNA, and possibly a nonspecific PCR product.
  • a reverse primer in PCR a part or all of the primer function in reverse transcription is inhibited by modification, and the reverse transcription product or heat denaturation treatment is used as a template.
  • Nonspecific reverse transcription can be suppressed by using a modified oligonucleotide primer that acquires a primer function in PCR.
  • oligonucleotide generally represents a single-stranded polynucleotide. It may be naturally occurring or synthetic. It usually consists of a sequence of about 5 to about 50 nucleotides, more preferably about 10 to about 30 nucleotides, or more preferably about 15 to about 25 nucleotides. Oligonucleotides include DNA, RNA, DNA / RNA chimeras.
  • forward primer means an oligonucleotide primer that anneals to its antisense strand when template RNA in RT-PCR is used as the sense strand.
  • reverse primer means an oligonucleotide primer that anneals to the sense strand.
  • the modified oligonucleotide primer used in the present invention includes a sequence complementary to a partial sequence of template RNA.
  • the length of the partial sequence is not particularly limited, but is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.
  • the partial sequence may be a partial sequence at the 3 'end of the region intended for amplification contained in the template RNA.
  • the modified oligonucleotide primer preferably contains a sequence complementary to a partial sequence of the template RNA at its 3 'end.
  • the modified oligonucleotide primer may contain an additional sequence at the 5 'end of a sequence complementary to a partial sequence of the template RNA.
  • the additional sequence is not particularly limited, but preferably does not include a sequence complementary to a partial sequence of the template RNA from the viewpoint of avoiding non-specific hybridization.
  • Examples of the additional sequence include a specific restriction enzyme recognition sequence.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, but is preferably shorter to avoid nonspecific hybridization.
  • the length of the additional sequence is usually 1 to 50 bases, preferably 1 to 30 bases, more preferably 1 to 10 bases.
  • the modified oligonucleotide primer consists of a sequence complementary to a partial sequence of the template RNA and does not contain an additional sequence.
  • Examples of the modification of the modified oligonucleotide primer used in the present invention include the following. (1) Oligonucleotide primer containing a thermolabile modifying group (2) One or more complementary regions on the same modified oligonucleotide primer sequence, and the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR Intramolecular hairpin loops are formed by taking a folded structure by, and oligonucleotide primer that includes a structure in which a sequence complementary to a partial sequence of template RNA is masked (3) oligonucleotide primer including an artificial base Detailed description.
  • the oligonucleotide primer contains a thermolabile modifying group, so that the modified nucleotide primer extends the strand along the polynucleotide to which it hybridizes. That is, it cannot be extended by inhibition of the enzyme or by reduced hybridization to the target nucleic acid.
  • one or more internucleotide linkages or 3 ′ terminal hydroxyl groups of the oligonucleotide primer are substituted with thermolabile modifying groups. Thus, chain extension does not occur to a substantial extent unless and until the modified or modified nucleotide is removed.
  • the modifying group is thermolabile, but the initial denaturation temperature in PCR amplification (eg, about 80-105 ° C., preferably about 85-100 ° C., more preferably about 90-96 ° C. (eg, 95 ° C.)) Until it reaches, almost no dissociation, so that part or all of the primer function in reverse transcription is inhibited.
  • the initial denaturation temperature is reached, partial or complete dissociation of the modifying group from the modified oligonucleotide primer is thermally induced and the modified oligonucleotide primer is converted to the corresponding unmodified oligonucleotide primer.
  • Unmodified oligonucleotide primers have an active phosphodiester bond and can be extended by polymerase.
  • thermolabile modifying groups are disclosed in US patent No. 8133669, the disclosure of which is incorporated herein by reference to the same extent as if all were explicitly stated.
  • a modified oligonucleotide primer in which the hydroxyl group at the 3 ′ end is replaced with a thermolabile modifying group US patent No. 8361753 (the disclosure of which is the same as that disclosed in full herein by reference)
  • modified oligonucleotide primers containing a thermolabile modifying group at one or more internucleotide linkages which are incorporated herein by reference to the extent incorporated herein by reference.
  • Z 10 is selected from the group consisting of O, S, and Se;
  • Each R 7 , each R 8 , each R 9 , and each R 10 is hydrogen, linear or branched, and optionally substituted, 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to Independently selected from the group consisting of hydrocarbyl groups having 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms;
  • the hydrocarbyl may include at least one substituent selected from the group consisting of halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amide, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, and heteroaryl.
  • Each X 6 , each X 7 , each X 8 , and each X 9 is acyl, acyloxy, alkenyl, alkenylaryl, alkenylene, alkyl, lower alkyl, alkylene, alkynyl, alkynylaryl, alkoxy, lower alkoxy, alkylaryl, alkyl Carbonylamino, alkylsulfinyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonylamino, alkylthio, alkynylene, amide, amidino, amino, arylalkynyl, aralkyl, aroyl, arylalkyl, aryl, arylcarbonylamino, arylene, aryloxy, arylsulfonylamino, carbamate, Dithiocarbamate, cycloalkenyl, cycloalkyl
  • the modifying group is O- (p-toluene) sulfonate; O-phosphate; O-nitric acid; O- [4-methoxy] tetrahydropyranyl; O- [4-methoxy] -tetrahydrothiopyranyl.
  • O-tetrahydrothiopyranyl O- [5-methyl] -tetrahydrofuranyl; O- [2-methyl, 4-methoxy] -tetrahydropyranyl; O- [5-methyl] -tetrahydropyranyl; O-tetrahydro pyranyl; and from OC (S) -OCH 3; O- tetrahydrofuranyl; O-phenoxyacetyl; O-methoxyacetyl; O-acetyl; OC (O) -OCH 3; OC (O) -CH 2 CH 2 CN Selected from the group consisting of In some particularly preferred forms, the modifying group is selected from the group consisting of O-methoxytetrahydropyranyl; O-tetrahydropyranyl; and O-tetrahydrofuranyl.
  • the modified oligonucleotide primer has the formula V
  • Z 3 is a 3′-O-oligonucleotidyl residue, or oligonucleotide primer
  • B is any “universal base” or “degenerate base” by a substituted or unsubstituted purine or pyrimidine, any aza derivative or deaza derivative thereof, or any NTP analog that is preferably recognizable by a nucleic acid polymerase.
  • A is selected from the group consisting of O, S, Se, CR 1 R 2 , and NR 1 ;
  • Each R 1 and each R 2 is H, F, Cl, Br, I, OR 3 , SR 3 , NR 3 R 4 , C (Y) R 5 , and substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl And independently selected from the group consisting of aralkyl, Each of the optional substituents may optionally contain one or more heteroatoms;
  • Each Y is independently selected from the group consisting of O, S, Se, CR 1 R 2 , and NR 1 ;
  • Each R 3 and each R 4 is H, or a group consisting of substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, and substituted or unsubstituted aralky
  • X 5 and Y 1 are each optionally covalently bonded to the X 4 , X 5 , Z 3 , A, W, or B portion of the NTP molecule of formula IB via an appropriate atom or group of atoms. there's a possibility that] It is a compound represented by these.
  • B is thymine, cytosine, adenine, guanine, uracil, aminoallyl uracil, 7-deazaguanine, 7-deaza-7-methylguanine, 7-deaza-7-iodoguanine, 7- Deaza-7-aminoallylguanine, 7-deaza-8-azaguanine, 7-deazadenine, 2,6-diaminopurine, 5-nitrocytosine, 5-aminoallylcytosine, 5- (biotin-16) -cytosine, 5- (Fluorescein-11) -cytosine, 4-methylamino-cytosine, and 2-thio-5-methyluracil, or 4-thio-5-methyluracil.
  • B is adenine, guanine, cytosine, thymine, or uracil.
  • the modified oligonucleotide primer is
  • the modified oligonucleotide primer of 1-1 can be produced by the method described in US patent No. 8361753.
  • the modifying group in the modified oligonucleotide primer has the formula I:
  • L is a straight or branched chain having 1-10 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, and even more preferably 4 carbon atoms
  • An optionally substituted hydrocarbylene group X is O, S, S (O), S (O) 2 , C (O), C (S) or C (O) NH
  • R 1 is hydrogen or 1-20 carbon atoms, preferably 1-10 carbon atoms, more preferably 1-6 carbon atoms, optionally substituted, straight or branched
  • the hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amide, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, And may contain at least one substituent selected from the group consisting of heteroaryl] Of the compound.
  • the modifying group is of formula Ia:
  • L is a straight or branched chain having 1-10 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, and even more preferably 4 carbon atoms
  • R 1 may be hydrogen or 1-20 carbon atoms, preferably 1-10 carbon atoms, more preferably 1-6 carbon atoms, optionally substituted, straight or branched
  • a hydrocarbyl group preferably, the hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amido, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, and It may contain at least one substituent selected from the group consisting of heteroaryl] Of the compound.
  • the modifying group is of formula Ib:
  • the hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amide, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, And may contain at least one substituent selected from the group consisting of heteroaryl] Of the compound.
  • the modifying group of formula Ib is 4-methylthio-1-butyl as shown below:
  • the modifying group is of formula Ic:
  • L is a straight or branched chain having 1-10 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, and even more preferably 4 carbon atoms
  • R 1 is hydrogen or 1-20 carbon atoms, preferably 1-10 carbon atoms, more preferably 1-6 carbon atoms, optionally substituted, straight or branched
  • the hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amide, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, And may contain at least one substituent selected from the group consisting of heteroaryl] Of the compound.
  • the modifying group of formula Ic is 3- (N-tert-butylcarboxamido) -1-propyl as shown below:
  • the modifying group is of formula Id:
  • L is a straight or branched chain having 1-10 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, and even more preferably 4 carbon atoms of it is hydrocarbylene group; and each R 1 has independently hydrogen or 1-20 carbon atoms, preferably 1-10 carbon atoms, more preferably 1-6 carbon atoms
  • a straight or branched chain optionally substituted hydrocarbyl group; preferably, the hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, May contain at least one substituent selected from the group consisting of amide, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, aryloxy, and heteroaryl] Of the compound.
  • the modifying group is of formula II:
  • L is a straight or branched chain having 1-10 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, and even more preferably 4 carbon atoms
  • a hydrocarbylene group of R 2 is hydrogen, cyano, or an optionally substituted carbocyclic, heterocyclic, aryl, or heteroaryl having 5-10 atoms] Of the compound.
  • the modifying group of formula II is N- (2-hydroxyethyl) -phthalimide as shown below:
  • the modifying group is of formula III:
  • L a and L b are each independently a single bond or a straight chain having 1-8 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, Selected from branched and optionally substituted hydrocarbylene groups;
  • A is, O, S, be the S (O), S (O ) 2, Se, CR 3 R 4, NR 3, C (O), C (S) or CNR 3;
  • B is C (O) R 3 , C (S) R 3 , C (O) NR 3 R 4 , OR 3 or SR 3 ; and
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen or 1-20 carbon atoms, preferably 1-10 carbon atoms, preferably 1-6 carbon atoms, straight or branched
  • Optionally substituted hydrocarbyl groups preferably hydrocarbyl is alkyl, alkenyl or alkynyl, which is optionally halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, amino, amide, cycloalkyl
  • the modifying group is represented by formula IV:
  • L a , L b and L c each independently have a single bond, or 1-8 carbon atoms, preferably 2-5 carbon atoms, more preferably 3-4 carbon atoms, Selected from linear or branched optionally substituted hydrocarbylene groups;
  • D is O, S, S (O), S (O) 2 , CR 5 R 6 , or NR 5 ;
  • E is O, S, S (O), S (O) 2 , CR 5 R 6 , or NR 6 ;
  • F is hydrogen, C (O) R 7 , C (S) R 7 , C (O) NR 7 R 8 , OR 7 or SR 7 ;
  • R 5 and R 6 may each independently be hydrogen, aryl, alkyl, halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, aryloxy, or amino, or R 5 and R 6 taken together Consists of 5-10 atoms and may form a monocyclic or bicyclic ring containing D, R 5
  • the modifying group is methoxymethyl-cyclohexyl-1,3-yl-ethyl as shown below:
  • the modified oligonucleotide primer has the structure I:
  • Nuc is a nucleoside in the primer sequence;
  • U and Z are independently O, S, Se, NR 9 , or CR 9 R 10 ;
  • R 9 and R 10 are each independently hydrogen or a linear or branched optionally substituted hydrocarbyl having 1-10 carbon atoms; preferably, the hydrocarbyl is an alkyl , Alkenyl or alkynyl, each independently containing at least one substituent selected from halo, oxo, hydroxyl, alkoxy, aryloxy, amino, amide or detectable label;
  • Y is O, S or Se;
  • W is any chemical component that allows Q to be thermally cleaved, such as O, S, S (O), S (O) 2 , Se, C (O), C (S), C (O) NH, C (N) H, NH, —C ( ⁇ NR 11 ) — or NR 9 ;
  • R 11 is hydrogen or an optionally substituted hydrocarbyl having 1-10 carbon
  • the modifying group Q comprises one or more thermally cleavable groups selected from the above formulas I, Ia, Ib, Ic, Id, II, III or IV.
  • the modified oligonucleotide primer contains any of the above-described modifying groups in at least one internucleotide bond.
  • the modified oligonucleotide primer preferably comprises one or more of any of the above-described modifying groups at its 3 'end.
  • the modified oligonucleotide primer is preferably one of one or more of the above-described ones of any of the last six internucleotide linkages at its 3 ′ end, preferably any of the last three internucleotide linkages. Including the modifying group.
  • the oligonucleotide primer can comprise a contiguous sequence of 2, 3, 4, 5 or 6 modified internucleotide linkages ending at the 3'-end of the oligonucleotide primer.
  • the oligonucleotide primer may comprise a plurality of non-consecutive 3 'modified internucleotide linkages.
  • the 5'-end of the modified oligonucleotide primer may also have a sequence of nucleotides that includes a modified internucleotide linkage.
  • all internucleotide linkages of the oligonucleotide may be modified.
  • the modified oligonucleotide primer comprises a modifying group in the 3'n internucleotide linkage of the oligonucleotide primer, where n is the 3'terminal internucleotide linkage.
  • the modifying group is present at the 3'n-1, n-2, n-3 or n-4 internucleotide linkage of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide comprises two or more of the n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 or n-6 positions; preferably n, n-1 , N-2, n-3, n-4, n-5 or n-6 or more; preferably n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 Or 3 or more in the n-6 position; preferably 4 or more in the n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 or n-6 position; preferably n, n ⁇ 1, n ⁇ 2, n ⁇ 3, n ⁇ 4, n ⁇ 5 or n ⁇ 6 or more, or preferably n, n ⁇ 1, n ⁇ 2, n ⁇ 3, n ⁇ 4, It has a modifying group at 6 or more in the n-5 or n-6 position.
  • the modified oligonucleotide primer of 1-2 can be produced by the method described in US patent No. 8361753. (2) Having one or more complementary regions on the same modified oligonucleotide primer sequence and forming an intramolecular hairpin loop by taking a folded structure with the complementary region before the initial heat denaturation treatment of PCR. An oligonucleotide primer that exhibits a structure in which a sequence complementary to a partial sequence of the template RNA is masked.In this embodiment, the oligonucleotide primer has one or more complementary regions on the sequence of the same modified oligonucleotide primer, Until the initial heat denaturation treatment, an intramolecular hairpin loop is formed by taking a folded structure by the complementary region.
  • the complementary region refers to a combination of a first sequence composed of one or more oligonucleotides and a second sequence containing one or more complementary oligonucleotides thereto.
  • the positions of the first sequence and the second sequence may be adjacent to each other, but may be located between the first sequence and the second sequence via one or more oligonucleotides.
  • the first sequence or the second sequence includes a sequence complementary to the partial sequence of the template RNA
  • the complementary sequence of the first sequence and the second sequence is complementary to the partial sequence of the template RNA.
  • the array is masked. Therefore, in this case, the number of oligonucleotides of the first sequence and the second sequence is not particularly limited.
  • the partial sequence of the template RNA is complementary between the oligonucleotides of the first sequence and the second sequence.
  • a sequence complementary to the partial sequence of the template RNA is masked by intramolecular hairpin loop formation.
  • the hairpin loop structure dissociates and the template Since the sequence complementary to the partial sequence of RNA is exposed, it can hybridize to the corresponding partial sequence in the cDNA (ie, acquire primer function) at the subsequent pairing temperature.
  • the length of the loop portion of the hairpin loop is usually about 5 to 25 bases.
  • the nucleotide sequence of the loop portion is not particularly limited as long as an intramolecular hairpin loop can be formed.
  • Oligonucleotide primer containing artificial base Since the modified oligonucleotide primer of this embodiment contains an artificial base (unnatural base), the complementary sequence of the nucleotide sequence of the modified oligonucleotide primer is template RNA (artificial base). Not substantially present in the template RNA). Therefore, since the hybridization of the modified oligonucleotide primer to the template RNA is suppressed, a part or all of the primer function in reverse transcription is inhibited.
  • 1 base or more, preferably 3 bases or more, 5 bases or more, 10 bases or more, 12 bases or more, preferably all 15 bases are artificial. It is a base.
  • the most 3 ′ terminal base of the modified oligonucleotide primer is an artificial base.
  • the modified oligonucleotide primer of this embodiment is used in combination with an oligonucleotide primer for initiating reverse transcription, which includes a partial sequence containing an artificial base of the modified oligonucleotide primer.
  • the length of the partial sequence containing the artificial base is 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.
  • the partial sequence containing the artificial base is not particularly limited, and may be, for example, a partial sequence at the 3 'end of the modified oligonucleotide primer.
  • the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription includes a sequence complementary to the partial sequence of the template RNA and a partial sequence containing the artificial base, and the partial sequence containing the artificial base is complementary to the partial sequence of the template RNA. To the 5 'end of a typical sequence.
  • the length of the partial sequence of the template RNA is not particularly limited, but is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.
  • the partial sequence may be a partial sequence at the 3 'end of the region intended for amplification contained in the template RNA.
  • the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription preferably comprises a sequence complementary to the partial sequence of the template RNA at its 3 'end.
  • a cDNA in which a partial sequence including an artificial base of a modified oligonucleotide primer is added to the 5 ′ end in reverse transcription is synthesized.
  • the modified oligonucleotide primer containing the artificial base acquires a primer function in PCR using the cDNA as a template.
  • the target region can be specifically amplified by performing PCR amplification using the cDNA as a template and the modified oligonucleotide primer as one primer.
  • Z base / F base Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 105061; Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 950; Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 954)
  • Q base J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2323
  • iso-G base / iso-C base J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8322
  • 2-thio T (T S ) base Nucleic Acids Res. 2005, 33, 5640
  • P base / Z base Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4238
  • PICS base J. Am. Chem. Soc.
  • These unnatural base by forming the following nucleotide pairs may contribute to the reverse transcription and / or PCR amplification: ZF bp, QF bp, isoG-isoC base pairs, AT S bp, PZ bp , PICS-PICS base pair (self-complementary), 5SICS-MMO2 base pair, 5SICS-NaM base pair, xy base pair, sy base pair, sz base pair, Ds-Pa base pair, Ds-Pn base pair, Ds- Px base pair, xA-T base pair, A-xT base pair, Im-N O -Na-O N base pair, Im-O N -Na-N O base pair.
  • template switching oligonucleotide ii) a primer set comprising a 5 ′ anchor oligonucleotide primer containing at least a part of an anchor sequence contained in the template switching oligonucleotide, and the modified oligonucleotide primer, and iii) Template RNA Including all reagents (except for oligonucleotide primers that initiate reverse transcription) necessary for template-switching reverse transcription of the template RNA into cDNA and PCR amplification of at least a portion of the cDNA A composition is provided.
  • a template switching oligonucleotide is a sequence that is added to the 3 ′ end of a newly synthesized cDNA when the reverse transcriptase reaches the 5 ′ end of the template RNA.
  • a complementary sequence to the RT additional sequence, and an anchor sequence (first anchor sequence) is added to the 5 ′ end of the complementary sequence of the RT added sequence.
  • the complementary sequence of the RT addition sequence is located at the 3 'end of the template switching oligonucleotide.
  • the RT addition sequence depends on the type of reverse transcriptase.
  • Moloney Murine Leukemia Virus-derived reverse transcriptase is a complementary sequence because it adds a short cytosine-rich sequence (eg, CC, CCC, CCCC) to the 3 ′ end of the synthesized cDNA.
  • a guanine-rich short sequence eg, GG, GGG, GGGG
  • anchor sequence is meant an artificial sequence that is added to the 5 'end of an oligonucleotide.
  • the anchor sequence is preferably a sequence that does not exist in nature.
  • the length of the anchor sequence is not particularly limited, but is usually about 10 to 100 bases, preferably about 15 to 50 bases.
  • the template switching oligonucleotide may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • the template switching oligonucleotide is preferably an RNA or DNA / RNA chimera, more preferably a DNA / RNA chimera.
  • the portion of the complementary sequence of the RT addition sequence is RNA and the portion of the anchor sequence is a DNA or DNA / RNA chimera.
  • the template switching oligonucleotide also functions as a 5 'anchor oligonucleotide primer described below. Thus, in some embodiments, the addition of 5 'anchor oligonucleotide primers can be omitted or reduced.
  • the 5 'anchor oligonucleotide primer includes a part or all of the anchor sequence (first anchor sequence) included in the template switching oligonucleotide.
  • the length of part or all of the anchor sequence is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.
  • it is a DNA or DNA / RNA chimera, preferably DNA.
  • the 5 'anchor oligonucleotide primer can be a forward primer in PCR.
  • RNA As the template RNA, mRNA, rRNA, tRNA, non-coding RNA, chemically synthesized RNA, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • mRNA, rRNA and tRNA may be derived from any cell / tissue.
  • mRNA, rRNA, and tRNA may be collected from a small amount of cells / tissues (for example, a single cell) obtained using a cell sorter or the like.
  • mRNA, rRNA, and tRNA may be included as part of total RNA.
  • the composition includes all reagents necessary for template-switching reverse transcription of the template RNA to cDNA and for PCR amplification of at least a portion of the cDNA (excluding oligonucleotide primers that initiate reverse transcription). ) Is included.
  • the reagent include the following in addition to the template switching oligonucleotide, primer set, and template RNA described above.
  • ⁇ Reverse transcriptase RNA-dependent DNA polymerase
  • Heat resistant DNA polymerase DNA-dependent DNA polymerase
  • reverse transcriptase having terminal transferase activity examples include, but are not limited to, reverse transcriptase derived from Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV RT).
  • the terminal transferase activity is preferably an activity of adding a short cytosine-rich sequence (eg, CC, CCC, CCCC) to the 3 ′ end of the synthesized cDNA.
  • thermostable DNA polymerases include Taq, Tth, KOD, Pfu, and Bst, but are not limited to these, and various thermostable DNA polymerases that can be used for PCR have been developed. Any of these can be used in the present invention.
  • Thermostable DNA polymerases that can be used for PCR are well known to those skilled in the art and can be appropriately selected.
  • the composition further comprises an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription contains a sequence complementary to a partial sequence of template RNA, so that it hybridizes to template RNA and initiates reverse transcription.
  • the length of the partial sequence is not particularly limited, but is usually 10 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 25 bases.
  • the oligonucleotide primer for initiating reverse transcription preferably comprises a sequence complementary to the partial sequence of the template RNA at its 3 'end.
  • An anchor sequence (second anchor sequence) may be added to the 5 'end of the sequence complementary to the partial sequence of the template RNA.
  • the second anchor sequence is preferably a sequence that does not exist in nature.
  • the length of the second anchor sequence is not particularly limited, but is usually about 10 to 100 bases, preferably about 15 to 50 bases.
  • the second anchor sequence is preferably non-identical with the first anchor sequence.
  • the second anchor sequence includes an artificial base.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription does not include a second anchor sequence.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription is either a primer specific for a particular gene, an oligo dT primer that binds to the poly A tail of mRNA, or a random primer such as a random hexamer primer, but preferably A primer specific for a particular gene.
  • the primer includes a sequence complementary to a partial sequence of RNA (eg, mRNA) encoding the gene of interest.
  • RNA eg, mRNA
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription is a DNA or DNA / RNA chimera, preferably DNA, so that it can function as a primer in reverse transcription.
  • the region on the template RNA where the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes with the region where the modified oligonucleotide primer hybridizes at least partially overlaps.
  • the length of the overlapping hybridization region is usually 10 bases or more, preferably 15 bases or more, more preferably 18 bases or more, but is not particularly limited.
  • the length of the overlapping hybridization region can be, for example, 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the 5 ′ end of the template RNA region to which the modified oligonucleotide primer hybridizes is more 5 ′ of the template RNA than the 5 ′ end of the region of the template RNA to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes.
  • the template RNA region to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes and the template RNA region to which the modified oligonucleotide primer hybridizes are partially overlapped (semi-nested). It is also possible to make it full-nested without overlapping.
  • the modified oligonucleotide primer hybridizes When the region of the template RNA to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes with the region of the template RNA to which the modified oligonucleotide primer hybridizes partially, for example, the modified oligonucleotide primer hybridizes.
  • the 5 ′ end of the template RNA region is, for example, 1 to 12 bases, preferably 1, 2, 3, 4 or 5 than the 5 ′ end of the template RNA region to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes.
  • 5 ′ side (upstream) of template RNA ie, 3 ′ end of modified oligonucleotide primer is, for example, 1 to 10 bases, preferably 3 ′ end of oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, preferably Design both primers to hybridize 1, 2, 3, 4 or 5 bases to the 5 'side (upstream) of the template RNA
  • 3 ′ end of modified oligonucleotide primer is, for example, 1 to 10 bases, preferably 3 ′ end of oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, preferably Design both primers to hybridize 1, 2, 3, 4 or 5 bases to the 5 'side (upstream) of the template RNA
  • the template RNA region to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes with the template RNA region to which the modified oligonucleotide primer hybridizes, and the modified oligonucleotide primer
  • the 5 ′ end of the template RNA region to hybridize coincides with the 5 ′ end of the template RNA region to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes. That is, the 3 'end of the modified oligonucleotide primer hybridizes to the template RNA at the same position as the 3' end of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the template RNA region to which the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription hybridizes and the template RNA region to which the modified oligonucleotide primer hybridizes are the same.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription can be an unmodified oligonucleotide primer corresponding to the modified oligonucleotide primer.
  • the modified oligonucleotide primer includes a partial sequence of an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription at its 3 'end.
  • the length of the partial sequence (hereinafter sometimes referred to as a common sequence) is usually 10 bases or more, preferably 15 bases or more, more preferably 18 bases or more, but is not particularly limited.
  • the length of the 3 'terminal partial sequence can be, for example, 40 bases or less, 30 bases or less, or 25 bases or less.
  • the consensus sequence can be a partial sequence at the 3 'end of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the 3 ′ end of the common sequence is at least 1 base (eg, 1-20 bases, 1-10 bases, 1-8 bases) than the 3 ′ end of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, Located on the 5 'side.
  • the common sequence is a sequence complementary to a partial sequence of template RNA or a partial sequence thereof, which is included in an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the consensus sequence is a second anchor sequence or a partial sequence thereof.
  • the consensus sequence is a partial sequence of an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription spanning a sequence complementary to a partial sequence of template RNA and a second anchor sequence.
  • the modified oligonucleotide primer is an oligonucleotide primer containing an artificial base
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription contains a second anchor sequence containing an artificial base at the 5 ′ end
  • the consensus sequence is The second anchor sequence or a partial sequence thereof.
  • the concentration of the oligonucleotide primer only needs to be sufficient to initiate reverse transcription.
  • reverse transcription if one copy of a cDNA containing a region intended for amplification can be synthesized, it can be amplified to a detectable level by subsequent PCR. Therefore, it is sufficient that the composition contains at least 1 copy, preferably 10 copies or more, more preferably 100 copies or more, of an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription (in the reaction system). If the concentration of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription is too high, side reactions due to non-specific hybridization may occur.
  • the concentration of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription in the composition is, for example, about 40 nM or less, preferably about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 2.5 nM or less, about 2.0 nM or less, about 0.63 nM or less, about 0.2 nM or less, about 0.16 nM or less, about 0.02 nM or less, about 2.0 pM or less, about 0.2 pM or less, or about 0.02 pM or less.
  • the composition does not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • an oligonucleotide primer containing a thermolabile modifying group and containing a sequence complementary to a partial sequence of template RNA is used as the above-mentioned modified oligonucleotide primer.
  • the modified oligonucleotide primer preferably comprises one or more internucleotide linkages or a thermolabile modifying group at the 3 'end.
  • the heat labile modifying group contained in the modified oligonucleotide primer is used for the initial denaturation temperature in PCR amplification (eg, about 80-105 ° C., preferably about 85-100 ° C., more preferably about 90-96 ° C. (eg, 95 ° C)) until it reaches almost no dissociation, but the present inventor has slightly dissociated at the temperature at which this thermolabile modifying group proceeds reverse transcription (eg, 45 ° C). It has been found that the corresponding unmodified oligonucleotide can function as an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the above composition may contain a buffer, a salt (magnesium ion, etc.) and an RNAase inhibitor as necessary.
  • the concentration of the template switching oligonucleotide contained in the composition is not particularly limited as long as the method of the present invention can be performed, but is, for example, about 0.05 to 5.0 ⁇ M, preferably about 0.1 to 1.0 ⁇ M.
  • concentrations of the 5 'anchor oligonucleotide primer and the modified oligonucleotide primer contained in the composition are the same as the primer concentrations used in the conventional PCR, for example, about 0.1 to 1.0 ⁇ M.
  • concentrations of other components template RNA, reverse transcriptase, thermostable DNA polymerase, dNTPs mixture, buffer, salt, RNAase inhibitor
  • concentrations of other components are well known in the prior art of one-step RT-PCR.
  • optimization of concentrations used in the context of the present invention can be obtained from routine experiments.
  • the composition provided above is incubated at a temperature at which reverse transcription can proceed.
  • the temperature at which reverse transcription can proceed can be appropriately adjusted depending on the type of reverse transcriptase, but is usually 37 ° C. to 62 ° C., preferably 37 ° C. to 55 ° C.
  • the incubation time can be appropriately adjusted in consideration of the size of the template RNA and the like, but is usually 30 seconds to 120 minutes, preferably 5 minutes to 60 minutes.
  • an oligonucleotide primer that starts reverse transcription contained in the composition or an unmodified oligonucleotide generated by dissociation of a thermolabile modifying group from the modified oligonucleotide primer primes reverse transcription.
  • a cDNA (antisense strand) complementary to the template RNA is synthesized.
  • the reverse transcriptase reaches the 5 'end of the template RNA, it switches the template to the template switching oligonucleotide and continues cDNA synthesis to the 5' end, so the 3 'end is complementary to the anchor sequence of the template switching oligonucleotide. This produces a single-stranded cDNA (antisense strand) with an added sequence.
  • the thermal cycling protocol consists of a cycle of three temperature steps: denaturation (also called thermal denaturation), annealing, and extension.
  • Denaturation is not particularly limited as long as it is a temperature sufficient to dissociate double-stranded DNA, and a preferable lower limit of heat denaturation temperature is 90 ° C. and an upper limit is 100 ° C.
  • Annealing is a step of annealing the primer to the dissociated DNA, and the temperature (annealing temperature) at that time is not particularly limited, but the preferred lower limit of the annealing temperature is 45 ° C., more preferably 50 ° C.
  • the preferable upper limit is 75 ° C, more preferably 70 ° C.
  • Elongation is a step of synthesizing a complementary strand with DNA polymerase, and the temperature (elongation temperature) at that time is not particularly limited.
  • the annealing temperature does not exceed the extension reaction temperature.
  • the thermal cycling protocol is also possible to configure the thermal cycling protocol as a cycle of substantially two temperature steps by performing annealing and extension at one temperature.
  • the lower limit of the preferable annealing and elongation temperature is 50 ° C, more preferably 55 ° C.
  • the preferred upper limit is 70 ° C, more preferably 65 ° C. Examples of the incubation time in each step include 1 second to 5 minutes, but those skilled in the art can easily set an appropriate incubation time in consideration of the size of the amplification product and the like.
  • a denaturation step for inactivating the reverse transcriptase may be performed.
  • the denaturation temperature is not particularly limited as long as the reverse transcriptase can be inactivated, but a preferable lower limit of the heat denaturation temperature is 90 ° C. and an upper limit is 100 ° C.
  • the denaturation time is not particularly limited as long as the reverse transcriptase can be inactivated, but it is usually 1 minute or more and 15 minutes or less.
  • oligonucleotide primer containing a thermolabile modifying group When an oligonucleotide primer containing a thermolabile modifying group is used as a modified oligonucleotide primer, the modifying group is dissociated from the modified oligonucleotide primer in the first denaturation step or preincubation step of the thermal cycling protocol, and the corresponding unmodified Converted to a modified oligonucleotide primer. Unmodified oligonucleotide primers have an active phosphodiester bond and can be primed for extension by polymerase.
  • a 5 'anchor oligonucleotide is added to a sequence complementary to the anchor sequence present at the 3' end of the single-stranded cDNA (antisense strand) obtained in the reverse transcription process.
  • primer anneals polymerase extension occurs, cDNA is synthesized with the anchor sequence (first anchor sequence) added to the 5 'end, resulting in the anchor sequence being added to the 5' end of the sense strand Resulting in double stranded cDNA.
  • reaction mixture containing the above double-stranded cDNA is subsequently subjected to a plurality of thermal cycling protocols, whereby a region sandwiched between the 5 ′ anchor oligonucleotide primer and the modified oligonucleotide primer (ie, the 5 ′ end anchor sequence). To the region where the modified oligonucleotide primer hybridizes).
  • the number of thermal cycling can be appropriately set in consideration of the amount of template RNA, etc., for example, 20 times or more, preferably 30 times or more, 40 times or more, 45 times or more, 50 times or more, or 55 times. That's it.
  • the amplification reaction reaches saturation after about 40 thermal cyclings.
  • the amplification reaction does not reach saturation even after 45, 50, or 55 thermal cycling cycles. Amplification may be possible.
  • the amplification efficiency per one thermal cycle is higher than that of general RT-PCR. May also be suppressed. Therefore, for example, when the number of copies of template RNA intended for amplification is small (eg, 100 copies or less, 10 copies or less, single copy), or RNA isolated from a single cell (particularly total RNA) as template RNA, the present invention
  • the number of thermal cycling is preferably 40 times or more, 45 times or more, 50 times or more, or 55 times or more.
  • reverse transcription template switching PCR can be expected to be performed in one step with high specificity.
  • the specificity can be substantially determined only by the reverse primer.
  • the above-described modified oligonucleotide primer is used as the reverse primer, thereby achieving high specificity.
  • the number of RNA copies used as a template is small (for example, when RNA derived from a single cell is used as a template)
  • the occurrence of side reactions is suppressed and specific It can be expected to amplify the target PCR product.
  • the reverse primer specific for the constant region of an antigen receptor eg, antibody (heavy chain, light chain), T cell receptor ( ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain) is modified as described above.
  • reverse primers specific for the constant regions of antigen receptors eg, antibodies (heavy chain, light chain), T cell receptors ( ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain)
  • the sequence analysis of the antigen recognition site of the antigen receptor can be performed at the single cell level.
  • the present invention also provides: i) a template switching oligonucleotide; and ii) for performing a one-step reverse transcription template switching PCR comprising a primer set consisting of a 5 ′ anchor oligonucleotide primer containing at least a part of an anchor sequence contained in the template switching oligonucleotide and a modified oligonucleotide primer;
  • the kit of the present invention further comprises an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the kit of the present invention further does not contain an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the kit of the present invention includes other reagents necessary for carrying out one-step reverse transcription template switching PCR (for example, reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase), thermostable DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase), dNTPs mixture, buffer, salt (magnesium ion, etc.), RNAase inhibitor) may be contained.
  • reverse transcriptase RNA-dependent DNA polymerase
  • DNA-dependent DNA polymerase thermostable DNA polymerase
  • dNTPs mixture buffer, salt (magnesium ion, etc.), RNAase inhibitor
  • the above reagents may be individually enclosed in a container and contained in one package, or may be provided as a composition containing a part or all of the mixture.
  • the kit of the present invention comprises the oligonucleotide of i) and the primer set of ii) as a composition comprising a mixture of both.
  • the composition further comprises an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • the composition further does not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription.
  • composition is selected from the group consisting of reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase), thermostable DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase), dNTPs mixture, buffer, salt (magnesium ion, etc.), and RNAase inhibitor. 1, 2, 3, 4, 5 or 6 reagents may be included.
  • one-step reverse transcription template switching PCR can be carried out simply by the method of the present invention using an arbitrary template RNA.
  • the present invention also relates to a kit for amplifying at least a partial region of the target RNA, the kit comprising i) a reagent necessary for reverse transcription, and ii) necessary for a template switch, if necessary.
  • Reagents iii) Reagents necessary for polymerase chain reaction using modified oligonucleotide primers, and iv) If necessary, including instructions for use, i) Reagents, if present ii) Reagents, iii) Reagents And the modified oligonucleotide primer is mixed in the reaction system at the beginning of the reaction, and the modified oligonucleotide primer is partially or completely inhibited under the conditions where reverse transcription occurs.
  • a kit is provided that is designed to release inhibition of primer function under conditions in which the polymerase chain reaction occurs.
  • the present invention provides a method for analyzing a repertoire of a T cell receptor (TCR) or a variable region of a B cell receptor (BCR) in a subject, comprising: (1) from the subject Providing a nucleic acid sample containing a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences amplified from the obtained RNA; and (2) the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample. And (3) calculating the frequency of occurrence of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • RNA obtained from the subject a reagent necessary for reverse transcription, a reagent necessary for template switching, and a reagent necessary for polymerase chain reaction, and the mixture is subjected to conditions under which reverse transcription occurs.
  • TCR T cell receptors
  • Providing a cDNA containing a nucleic acid sequence of a B cell receptor (BCR), b) subjecting the cDNA obtained from the step a) to conditions under which a polymerase chain reaction occurs, and the plurality of types of T cell receptors (Providing a nucleic acid sample comprising a nucleic acid sequence of TCR) or B cell receptor (BCR), wherein the reagent required for the template switch comprises a template switching oligonucleotide, and the reagent required for the polymerase chain reaction comprises: The TCR or the BCR C region specific primer, wherein the C region specific primer is partially or completely inhibited in the primer function in the step a), the primer function inhibition in the step b) Methods are provided that are modified oligonucleotide primers designed to be released.
  • the nucleic acid sample is preferably amplified without bias.
  • a reverse transcription template switch PCR (steps a) and b) above is used for a nucleic acid sample for sequence analysis.
  • the use of reverse transcription template switch PCR (RT-TS-PCR) in repertoire analysis is advantageous because it can reduce time, labor and cost.
  • RT-TS-PCR has fewer steps and can be processed in a short time, reducing labor, and is advantageous for multi-sample processing. Since there are few reagents to be used, cost can be reduced.
  • the method of the present invention is further advantageous in the following points. 1.
  • the present invention is a method for producing a nucleic acid sample for analyzing a repertoire of a variable region of a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR), the method comprising: 1) providing a nucleic acid sample comprising a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences amplified from RNA obtained from the subject, the step (1) A) Mixing RNA obtained from the subject, a reagent necessary for reverse transcription, a reagent necessary for template switching, and a reagent necessary for polymerase chain reaction, and subjecting the mixture to conditions under which reverse transcription occurs.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • TCR T cell receptors
  • BCR BCR
  • the C region-specific primer is such that part or all of the primer function is inhibited in the step a), and the inhibition of the primer function is released in the step b).
  • Methods are provided that are engineered modified oligonucleotide primers.
  • the nucleic acid sample is preferably amplified without bias.
  • the reagent necessary for the template switch may include a template switching oligonucleotide.
  • the reagents required for the polymerase chain reaction may or may not include a 5 'anchor oligonucleotide primer that includes at least a portion of the anchor sequence included in the template switching oligonucleotide.
  • the template switching oligonucleotide TS-Oligo
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction may not contain the 5 'anchor oligonucleotide primer, and may be a smaller amount than that usually used.
  • PCR amplification could be achieved with high specificity.
  • some of the modified oligonucleotide primers are not inhibited in function, and some modified oligonucleotide primers are not inhibited in function.
  • the reagents required for reverse transcription may or may not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, but will initiate reverse transcription used in the method.
  • the amount of oligonucleotide primer may be smaller than the amount normally used.
  • the concentration of oligonucleotide primer that initiates reverse transcription in the composition is, for example, about 40 nM or less, preferably about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 2.5 nM or less, about 2.0 nM or less.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription in the composition is about 1/10 or less, preferably about 1/20 or less, about 1/40 of the modified oligonucleotide primer. Less than about 1/160, less than 1/200, less than 1/635, less than 1 / 2,000, less than 1 / 2,500, less than 1 / 20,000, less than 1 / 200,000 About 2,000,000 or less, or about 20,000,000 or less.
  • the repertoire analysis method of the present invention may further include a step of providing a nucleic acid sample to which an appropriate sequence has been added for sequence analysis after performing reverse transcription template switch PCR.
  • a person skilled in the art can select an appropriate sequence for sequence analysis according to the type of sequence analysis, and for example, bridge PCR or emulsion PCR is used as an appropriate sequence for sequence analysis.
  • sequences suitable for sequence analysis include, but are not limited to.
  • the sequence analysis used in the present invention is a sequence analysis using bridge PCR, but suitable sequences added for the sequence analysis using bridge PCR are an index sequence, a tag sequence, and a sequence analysis. It includes an array for immobilization on a substrate (eg, flow cell).
  • the reverse transcription template switch PCR (first PCR amplification reaction), tag PCR (second PCR amplification reaction) ), And index PCR (third PCR amplification reaction) can be performed.
  • the 5 ′ anchor oligonucleotide primer used in reverse transcription template switch PCR may be referred to as the first 5 ′ anchor oligonucleotide primer.
  • the first 5 ′ anchor oligonucleotide primer is an oligonucleotide primer that includes at least a portion of the anchor sequence included in the template switching oligonucleotide.
  • the first 5 ′ anchor oligonucleotide primer may not be used.
  • the step (1) includes c) a PCR amplification product of the step b), a second 5 ′ anchor oligonucleotide primer to which a first tag sequence is added, and a second tag sequence.
  • the mixture containing the second TCR or BCR C region-specific primer is subjected to conditions under which a polymerase chain reaction occurs, and a plurality of T cell receptors (TCR) or B cell receptors ( BCR) a nucleic acid sample comprising the nucleic acid sequence, d) the PCR amplification product of step c), a third 5 ′ anchor oligonucleotide primer, and a third TCR or BCR C region-specific primer.
  • TCR T cell receptors
  • BCR B cell receptors
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the tag sequence is a sequence used for sequencing (for example, sequencing by Miseq), and sequencing is started from the tag sequence.
  • the tag sequence may function as a priming site for index PCR (third PCR amplification reaction) to which an index sequence is added.
  • the first tag sequence may be a sequence added to a second 5 ′ anchor oligonucleotide primer, and the second tag sequence is a sequence added to a second TCR or BCR C region specific primer. possible.
  • the “first TCR or BCR C region-specific primer” is a primer used in the PCR amplification reaction by the reverse transcription template switching PCR of the present invention, and is specific to the TCR or BCR C region. Refers to a primer containing a typical sequence.
  • the “second TCR or BCR C region-specific primer” means a PCR amplification reaction (second PCR) for providing a nucleic acid sample containing a TCR or BCR nucleic acid sequence to which a tag sequence is added.
  • a primer used in an amplification reaction which includes a sequence specific to the C region of TCR or BCR.
  • a tag sequence serving as a priming site for the third PCR amplification reaction is added to the C region specific primer of the second TCR or BCR.
  • the “third TCR or BCR C region-specific primer” means a PCR amplification reaction (third PCR) for providing a nucleic acid sample containing a TCR or BCR nucleic acid sequence to which an index sequence is added.
  • a primer used in an amplification reaction which includes a sequence specific to the C region of TCR or BCR.
  • the C region specific primer of the third TCR or BCR is added with a sequence and an index sequence for immobilization on the substrate for sequence analysis, as necessary.
  • the “first 5 ′ anchor oligonucleotide primer” is a primer used in a PCR amplification reaction by reverse transcription template switching PCR of the present invention. Since the template switching oligonucleotide can also function as a 5 ′ anchor oligonucleotide primer, the first 5 ′ anchor oligonucleotide primer is not used or can be used in small amounts.
  • the “second 5 ′ anchor oligonucleotide primer” means a PCR amplification reaction (second PCR amplification reaction) for providing a nucleic acid sample containing a TCR or BCR nucleic acid sequence to which a tag sequence is added. ) Used in the above.
  • the “third 5 ′ anchor oligonucleotide primer” refers to a PCR amplification reaction (third PCR amplification reaction) for providing a nucleic acid sample containing a TCR or BCR nucleic acid sequence to which an index sequence is added. ) Used in the above.
  • the third 5 ′ anchor oligonucleotide primer is added with a sequence and an index sequence for immobilization on a substrate for sequence analysis, as necessary.
  • the “first PCR amplification reaction” is a PCR amplification reaction carried out using RNA obtained from a subject by one-step reverse transcription template switching PCR of the present invention as a template.
  • the “second PCR amplification reaction” refers to a PCR amplification reaction in which the product is used as a template after the first PCR amplification reaction in the sample production for the repertoire analysis of the present invention.
  • a nucleic acid sample to which a tag sequence for providing a priming site for the third PCR amplification reaction is added is provided. This tag sequence is also the starting point for sequence analysis.
  • the “third PCR amplification reaction” is a PCR amplification reaction that is performed using the amplification product of the second PCR amplification reaction as a template in the sample production for the analysis of the present invention. Which contain sequences suitable for use in the sequence analysis of the present invention.
  • a sequence for immobilization on the substrate for sequence analysis and an index sequence are added.
  • the step (3) includes (3-1) providing a reference database for each gene region including at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region; 3-2) providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; and (3-3) for each of the gene regions for the input sequence set. Performing a homology search with the reference database and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele, and (3-4) assigning a V region and a J region to the input sequence set.
  • the present invention also relates to a kit for amplifying a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR), the kit comprising i) a reagent necessary for reverse transcription, and ii) a template switch.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • Iii) a reagent necessary for the polymerase chain reaction using the modified oligonucleotide primer, and iv) an instruction for use if necessary, and the reagents of i) to iii) and the modified oligonucleotide primer
  • the reagent of ii) contains a template switching oligonucleotide, and the modified oligonucleotide primer is a part of the primer function under the conditions that cause reverse transcription or
  • the TCR is designed so that inhibition of primer function is released under conditions where all are inhibited and the polymerase chain reaction occurs.
  • Is C region-specific primers of the BCR provides kits.
  • the kit of the present invention can provide a nucleic acid sample containing a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences, which are amplified biaslessly from RNA obtained from a subject. It is.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the “kit” refers to a unit in which parts to be provided (eg, reagents, primers, drugs, labels, instructions, etc.) are usually divided into two or more sections.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in admixture for stability or the like, but preferably used in admixture immediately before use.
  • Such a kit preferably comprises instructions or instructions that describe the provided part (eg how to use the drug or how to process the reagent).
  • the kit when a kit is used as a reagent kit, the kit usually includes instructions describing how to use drugs, antibodies, and the like.
  • the “instruction” describes the method for using the present invention for the user.
  • This instruction manual includes a word indicating the reverse transcription template switching PCR and the method of using the reagent of the present invention.
  • the instruction sheet may include a word indicating a usage method (screening method).
  • This instruction is prepared according to the format prescribed by the national supervisory authority in which the present invention is to be implemented, and it is clearly stated that it has been approved by the supervisory authority.
  • the instruction sheet is a so-called package insert, and may be provided in a paper medium or may be provided in a form such as an electronic medium (for example, a home page or an e-mail provided on the Internet).
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction contained in the kit of the present invention may not contain a primer.
  • the primer may be provided in the kit of the present invention or may be provided separately.
  • a person skilled in the art can appropriately design and produce a primer based on the target RNA, or can ask a primer provider to produce the primer.
  • the above modified oligonucleotide primer is used as a reverse primer used in the kit of the present invention.
  • a forward primer a template switching oligonucleotide or a 5 'anchor oligonucleotide primer comprising at least a part of an anchor sequence contained in the template switching oligonucleotide can be used.
  • the reagent necessary for the template switch in the kit of the present invention may include a template switching oligonucleotide.
  • the reagents necessary for the polymerase chain reaction in the kit of the present invention may or may not include a 5 ′ anchor oligonucleotide primer that includes at least part of the anchor sequence included in the template switching oligonucleotide.
  • the template switching oligonucleotide TS-Oligo
  • the reagent necessary for the polymerase chain reaction may not contain the 5 'anchor oligonucleotide primer, and may be a smaller amount than that usually used.
  • PCR amplification could be achieved with high specificity.
  • some of the modified oligonucleotide primers are not inhibited in function, and some modified oligonucleotide primers are not inhibited in function.
  • the reagents required for reverse transcription may or may not include an oligonucleotide primer that initiates reverse transcription, but if present, the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription used. May be smaller than the amount normally used.
  • the final concentration of the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription used is, for example, about 40 nM or less, preferably about 20 nM or less, about 10 nM or less, about 2.5 nM or less, about 2.0 nM or less, About 0.63 nM or less, about 0.2 nM or less, about 0.16 nM or less, about 0.02 nM or less, about 2.0 pM or less, about 0.2 pM or less, or about 0.02 pM or less.
  • the oligonucleotide primer that initiates reverse transcription used is about 1/10 or less, preferably about 1/20 or less, about 1/40 or less of the modified oligonucleotide primer, About 1/160 or less, 1/200 or less, 1/635 or less, 1 / 2,000 or less, 1 / 2,500 or less, 1 / 20,000 or less, 1 / 200,000 or less, approx. Used in a molar ratio of less than 1 / 2,000,000 or less than about 1 / 20,000,000.
  • modified oligonucleotide primer used in the kit of the present invention is described in detail above.
  • the present invention also provides a system for quantitatively analyzing a repertoire of a variable region of a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) using a database, the system comprising: (1) A kit for providing a nucleic acid sample comprising a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences, amplified in a biased manner from RNA obtained from a subject; 2) an apparatus for determining the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample; and (3) calculating the frequency of occurrence of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, A system comprising an apparatus for deriving a BCR repertoire is provided.
  • the kit used in the system of the present invention includes the following: c) the PCR amplification product of step b), the second 5 ′ anchor oligonucleotide primer to which the first tag sequence is added, and the second tag A mixture comprising a second TCR or BCR C region-specific primer to which a sequence has been added is subjected to conditions under which a polymerase chain reaction occurs to produce a plurality of T cell receptors (TCR) or B to which a tag sequence has been added.
  • TCR T cell receptors
  • Means for providing a nucleic acid sample comprising a nucleic acid sequence of a cell receptor (BCR), d) a PCR amplification product of step c), a third 5 ′ anchor oligonucleotide primer, and a C region of a third TCR or BCR
  • a mixture containing specific primers is subjected to conditions under which a polymerase chain reaction occurs, and a nucleic acid sample containing the nucleic acid sequences of the plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) to which an index sequence is added is obtained.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the apparatus for deriving the TCR or BCR repertoire includes the following: (3-1) a gene region comprising at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region Means for providing a reference database for each; (3-2) means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3-3) the input Means for performing a homology search with the reference database for each gene region and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; (3-4) the input sequence set Means for assigning the V region and the J region, and extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (3-5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and using the amino acid sequence Means for classifying the D region; and (3- 6) Based on the classification in the step (3-5), by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region and, if necessary, the C
  • the present invention provides a system for quantitatively analyzing the repertoire of the TCR or BCR variable region, and the subject's disease, disorder or disorder based on the TCR or BCR repertoire derived based on the system.
  • a system for analyzing a disease, disorder or condition of a subject comprising means for analyzing the condition.
  • the present invention provides means for quantitatively associating a subject disease, disorder or condition determined by the system for analyzing a disease, disorder or condition of the subject with the TCR or BCR repertoire, and There is provided a system for treating or preventing a disease, disorder or condition in said subject comprising means for selecting an appropriate means for treatment or prevention from a quantitative relationship.
  • the “database” refers to an arbitrary database relating to a gene, and particularly refers to a database including a T cell receptor and a B cell receptor repertoire in the present invention.
  • databases include the IMGT (the international ImmunGeneTics information system, www.imgt.org) database, the Japan DNA Databank (DDBJ, DNA Data Bank of Japan, www.ddbj.jp. US Biotechnology Information Center, www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) database, ENA (EMBL (European Institute for Molecular Biology), www.ebi.ac.uk/ena) database, etc. However, it is not limited to this.
  • variable region repertoire refers to a set of V (D) J regions arbitrarily created by gene rearrangement by TCR or BCR.
  • the “index sequence” is a sequence for imparting uniqueness so that an amplification product can be identified. Therefore, it is preferably different from the target sequence. Moreover, it is preferable that the sequence does not affect amplification.
  • the criteria for the index array and typical examples thereof are as follows. That is, the criteria for determining the index sequence will be described.
  • the index sequence is a base sequence added to identify each sample when a plurality of samples are mixed and sequenced simultaneously.
  • One index sequence is associated with a lead derived from one sample, and the sample from which the acquired read sequence is derived can be identified. It is an arbitrary sequence of four types of A, C, G, and T.
  • the base sequence length is preferably 2 to 40 bases, and more preferably 6 to 10 bases.
  • isotype refers to types that belong to the same type in IgM, IgA, IgG, IgE, IgD, etc., but have different sequences. Isotypes are displayed using various gene abbreviations and symbols.
  • the “subtype” is a type within the types existing in IgA and IgG in the case of BCR, and IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 is present for IgG, and IgA1 or IgA2 is present for IgA.
  • TCR is also known to exist in ⁇ and ⁇ chains, and TRBC1 and TRBC2 or TRGC1 and TRGC2 exist, respectively.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous.
  • a “homolog” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that performs the same biological function as the protein component of the complex further described herein. Means.
  • the term “subject” refers to the origin of the sample for the repertoire analysis of the present invention or the subject of the diagnosis of the present invention, and the subject is a mammal (for example, human, mouse, rat, hamster, Rabbits, cats, dogs, cows, horses, sheep, monkeys, etc.), primates are preferred, and humans are particularly preferred.
  • sample refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, nucleic acids (eg, RNA), cells, tissues, organs, and the like. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description of the present specification.
  • nucleic acids eg, RNA
  • diagnosis refers to identifying various parameters related to a disease, disorder, or condition in a subject and determining the current state or future of such a disease, disorder, or condition.
  • conditions within the body can be examined, and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment to be administered or prevention in a subject.
  • various parameters such as methods can be selected.
  • diagnosis in a narrow sense means diagnosis of the current state, but in a broad sense includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “preliminary diagnosis”, and the like.
  • the diagnostic method of the present invention is industrially useful because, in principle, the diagnostic method of the present invention can be used from the body and can be performed away from the hands of medical personnel such as doctors.
  • diagnosis, prior diagnosis or diagnosis may be referred to as “support”.
  • the prescription procedure as a medicine such as the diagnostic agent of the present invention is known in the art, and is described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, and the pharmacopoeia of other countries. Accordingly, those skilled in the art can determine the amount to be used without undue experimentation as described herein.
  • trimming means removing inappropriate parts in gene analysis. Trimming is performed by deleting a low quality region from both ends of the lead, a partial sequence of an artificial nucleic acid sequence added in an experimental procedure, or both. Trimming is performed using software and documents known in the art (for example, cutadapt http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal, 2011); fastq-mcf Aronesty E., The Open Bioinformatics Journal (2013) 7, 1-8 (DOI: 10.2174 / 1875036201307010001); and fastx-toolkit http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2009)) .
  • the “appropriate length” means a length suitable for analysis when performing analysis such as alignment in the gene analysis of the present invention. Such length can be determined, for example, from the sequence determination start position on the C region so as to be not less than a length including 100 bases near the D region on the V region.
  • TCR it may be 200 nucleotides or more, preferably 250 nucleotides or more
  • BCR it may be 300 nucleotides or more, preferably 350 nucleotides or more, but is not limited thereto.
  • the “input sequence set” refers to a set of sequences to be analyzed for TCR or BCR repertoire in the gene analysis of the present invention.
  • gene region refers to each region such as V region, D region, J region, and C region. Such a gene region is known in the art and can be appropriately determined in consideration of a database or the like.
  • homology of a gene refers to the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally “having homology” means that the degree of identity or similarity is high. Say. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions.
  • homoology search refers to homology search. Preferably, it can be performed in silico using a computer.
  • “approximate” means that the degree of homology is high when homology search is performed.
  • software that performs homology search BLAST, FASTA, etc.
  • it is usually listed in the order of high homology, and therefore it can be approximated by appropriately selecting the ones with high rank.
  • “closest” means that the degree of homology is highest when homology search is performed.
  • homology search is performed by software, the one displayed in the first place is selected.
  • reference allele refers to a reference allele that is hit in the reference database when homology search is performed.
  • alignment is a bioinformatics that is arranged so that regions similar to the primary structure of biomolecules such as DNA, RNA, and protein can be identified, And to line up. Provides clues to know functional, structural, or evolutionary sequence relationships.
  • assignment refers to assigning information such as a specific gene name, function, characteristic region (eg, V region, J region, etc.) to a certain sequence (eg, nucleic acid sequence, protein sequence, etc.). . Specifically, this can be achieved by inputting or linking specific information to a certain array.
  • CDR3 refers to a third complementarity-determining region (CDR), where the CDR is a variable region, and the region directly contacting the antigen is particularly changed. Largely, it refers to this hypervariable region. There are three CDRs (CDR1 to CDR3) and four FRs (FR1 to FR4) surrounding the three CDRs in the light chain and heavy chain variable regions, respectively. Since the CDR3 region is said to exist across the V region, D region, and J region, it is said to hold the key to the variable region and is used as an analysis target.
  • the top of the CDR3 on the reference V region means an array corresponding to the top of the CDR3 in the V region targeted by the present invention.
  • end of CDR3 on reference J refers to a sequence corresponding to the end of CDR3 in the J region targeted by the present invention.
  • condition that allow random mutations to be scattered throughout refers to any conditions that result in random mutations being scattered, for example, BLAST / FASTA optimal parameters. It is well expressed with the following conditions: allows up to 33% mismatch over the entire alignment length and allows up to 60% non-matching mismatches for any 30 bp therein.
  • Functional equivalents such as isotypes of molecules such as IgG used in the present invention can be found by searching a database or the like.
  • search refers to another nucleic acid having a specific function and / or property using a certain nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods, preferably electronically. This refers to finding the base sequence.
  • BLAST Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)
  • FASTA Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444- 2448 (1988)
  • Smith and Waterman method Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981)
  • Needleman and Wunsch method Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443). -453 (1970)
  • BLAST is typically used.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR and in situ hybridization, etc. It is not limited to. In the present specification, it is intended that the gene used in the present invention should include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
  • the C region-specific primer when performing quantitative analysis of the BCR variable region repertoire, is present in a target isotype C region selected from the group consisting of IgM, IgA, IgG, IgE, and IgD. It has a sequence that contains a perfect match and has no homology to other C regions.
  • the C region specific primer is a sequence that, for IgA or IgG, perfectly matches a subtype that is either IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or either IgA1 or IgA2.
  • the C region-specific primer when performing quantitative analysis of the repertoire of the variable region of TCR, is a target strand selected from the group consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain. A sequence that perfectly matches the C region and has no homology to other C regions.
  • the C region-specific primer preferably selects a sequence portion that completely matches all C region allele sequences of the same isotype in the database. By selecting such a perfect match, a highly accurate analysis can be performed.
  • the present invention provides a method for performing gene analysis using a sample produced by the method of the present invention.
  • the gene analysis can be performed using any analysis method.
  • V, D, J obtained from the well-known IMGT (the international ImMgeneTics information system, http://www.imgt.org) database.
  • IMGT the international ImMgeneTics information system, http://www.imgt.org
  • a method of using IMGT's HighV-Quest by assigning V, D, J, and C sequences of each lead sequence using the C sequence as a reference sequence, or an application described as a preferred example of an analysis system also in this specification New software developed by humans (Repeiree Genesis) can be used.
  • the gene analysis is a quantitative analysis of a repertoire of a variable region of a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR).
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • a method for determining the profile of recombinant DNA sequences in T cells and / or B cells. The method can include the steps of isolating a sample from the subject, including one or more rounds of nucleic acid amplification, spatially isolating individual nucleic acids, and sequencing the nucleic acids.
  • a method for determining the correlation of one or more repertoires in a subject or individual is provided.
  • a method is provided for developing an algorithm that can predict the correlation of one or more repertoires in any sample from a subject having a disease.
  • an algorithm that can predict the correlation of one or more repertoires in any sample derived from a subject is used to discover the correlation of one or more repertoires of an individual Providing a method for
  • a method is provided for creating an algorithm for calculating a disease activity score.
  • a method for monitoring an individual's disease state is provided.
  • the present invention provides bioinformatics for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using next generation sequencing technology.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • the present invention is a method for analyzing TCR or BCR repertoire, which comprises the following steps: (1) a gene comprising at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region Step of providing a reference database for each area: (2) Step of providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) About the input sequence set Performing a homology search with the reference database for each gene region and recording an alignment with the approximate reference allele and the sequence of the reference allele; (4) assigning the V region and the J region to the input sequence set; And extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result (preferably, the V region for the input sequence set).
  • the J region are assigned, and the CDR3 sequence is extracted using the CDR3 beginning on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers, and (5) the nucleic acid sequence of the D region is translated into an amino acid sequence;
  • a step of classifying the D region using an amino acid sequence preferably, a step of translating the nucleic acid sequence of the CDR3 into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence;
  • (6) in (5) The step of deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the appearance frequency of the C region, or a combination thereof, based on the above classification is included.
  • the step of providing a reference database for each gene region including at least one of V region, D region, J region and optionally C region is, This can be achieved by appropriately selecting and providing a database including information on the V region.
  • the step of (2) trimming as necessary and providing an input sequence set in which an appropriate length is extracted as necessary includes functions such as software as needed. This is achieved by providing trimming and, if necessary, selecting the length as appropriate and providing the extracted input sequence set.
  • the input sequence can be, for example, a set of amplification products amplified by a known method, or a set of amplification products PCR amplified by the reverse transcription template switching PCR of the present invention.
  • (3) performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele Uses a software for performing homology search as appropriate, and performs a homology search with the reference database for each gene region (for example, V region, etc.) on the input sequence set, and the resulting approximate reference allele and This is done by recording an alignment with the sequence of the reference allele.
  • the step of (4) assigning the V region and J region to the input sequence set and extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result is based on known information from the sequence alignment.
  • an extraction which can be achieved by determining the V region and / or the J region, preferably the V region and the J region are assigned to the input sequence set, and the CDR3 head on the reference V region is assigned. It can be achieved by extracting the CDR3 sequence with the end of CDR3 on the reference J as a landmark.
  • the step of (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence is translated into amino acids using methods known in the art. And the sequence corresponding to the D region is extracted by homology search or the like for the amino acid sequence.
  • the CDR3 nucleic acid sequence can be translated into an amino acid sequence, and the D region can be classified using the amino acid sequence.
  • the step of deriving the TCR or BCR repertoire can be calculated by, for example, arranging the appearance frequencies of the V region, D region, J region and / or C region calculated in the above steps in a list. Thereby, a TCR or a BCR repertoire can be derived.
  • a reference database is provided. This may be stored in the external storage device 1405, but can usually be acquired as a publicly provided database through the communication device 1411. Alternatively, the data may be input using the input device 1409 and recorded in the RAM 1403 or the external storage device 1405 as necessary.
  • a database including a target area such as the V area is provided.
  • an input array set is provided.
  • a set of sequence information obtained from, for example, a set of amplification products amplified by a PCR amplification reaction is input using the input device 1409 or via the communication device 1411.
  • a device for receiving the amplification product of the PCR amplification reaction and analyzing the gene sequence may be connected. Such a connection is made through the system bus 1420 or through the communication device 1411.
  • trimming and / or extraction of an appropriate length can be performed as necessary.
  • Such processing is performed by the CPU 1401.
  • Programs for trimming and / or extracting can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (3) alignment is performed.
  • the input sequence set is searched for homology with the reference database for each gene region.
  • This homology search is performed with respect to the reference database obtained via the communication device 1411 or the like.
  • Perform program processing This process is performed by the CPU 1401. Further, the obtained result is analyzed and approximated with a reference allele and / or a sequence of the reference allele. This process is also performed by the CPU 1401. Programs for executing these can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (4) the nucleic acid sequence of D information is detected.
  • This process is also performed by the CPU 1401.
  • Programs for executing these can be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • the V region and the J region are assigned to the input array set.
  • Assignment processing is also performed by the CPU 1401.
  • the CPU 1401 also extracts the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result.
  • Programs for assignment and extraction processing may also be provided via an external storage device or a communication device or an input device, respectively.
  • it can be preferably achieved by determining the V region and / or the J region from the sequence alignment based on known information or the like.
  • the result can be saved in the RAM 1403 or the external storage device 1405.
  • Such extraction is preferably achieved by assigning a V region and a J region to the input sequence set, and extracting a CDR3 sequence with the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers. can do.
  • Such processing can also be performed by the CPU 1401.
  • Programs for this purpose can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (5) the D region is classified.
  • a process of translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence is also performed by the CPU 1401.
  • a program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • a sequence corresponding to the D region may be extracted by homology search or the like for the obtained amino acid sequence.
  • Such processing is also performed by the CPU 1401.
  • a program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • the CDR3 nucleic acid sequence can be translated into an amino acid sequence, and the D region can be classified using the amino acid sequence.
  • This process is also performed by the CPU 1401.
  • a program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • step (6) by calculating the appearance frequency of each of the V region, D region, J region and, if necessary, the C region or a combination thereof based on the above classification, the TCR or BCR repertoire is calculated. Is derived. Processing for this calculation and derivation is also performed by the CPU 1401. A program for this processing can also be provided via an external storage device, a communication device, or an input device, respectively.
  • the gene region used in the present invention includes all of the V region, D region, J region and optionally the C region.
  • the reference database is a database in which a unique ID is assigned to each array. By uniquely assigning IDs, gene sequences can be analyzed based on a simple index called ID.
  • the input array set is an unbiased array set. Unbiased sequence sets can be performed by PCR amplification by reverse transcription template switching PCR as described herein.
  • the array set is trimmed. By performing trimming, unnecessary or inappropriate nucleic acid sequences can be removed, and the efficiency of analysis can be increased.
  • trimming removes low quality regions from both ends of the lead; removes regions that match the template switching oligonucleotide sequence by 10 bp or more from both ends of the lead; and a remaining length of 200 bp or more (TCR) or 300 bp.
  • TCR 200 bp or more
  • BCR is achieved by the step used for analysis as high quality.
  • the low quality is a QV value with a 7 bp moving average of less than 30.
  • the approximate sequence is the closest sequence.
  • the approximating array is: 1. Number of matching bases 2. kernel length; Score, 4. Determined by the rank of the alignment length.
  • the homology search is performed under conditions that allow random mutations to be scattered throughout. Such conditions are well expressed, for example, for BLAST / FASTA optimal parameters: allow up to 33% mismatch over the entire alignment length and up to 60 for any 30 bp in it.
  • the homology search includes (1) reduced window size, (2) reduced mismatch penalty, (3) reduced gap penalty, and ( 4)
  • the top index priority includes at least one condition for the number of matching bases.
  • This condition can be used, for example, in a situation where only a part of the region is classified using a shorter ( ⁇ 200 bp) sequence (a situation that deviates from the “preferred example”), and a situation where an Illumina sequencer is used. But it can be used. In this case, the possibility of using bwa or bowtie for the homology search is considered.
  • the D region is classified based on the appearance frequency of the amino acid sequence.
  • step (5) if there is a D region reference database, the combination of the homology search result with the CDR3 nucleic acid sequence and the amino acid sequence translation result is used as the classification result.
  • the classification is made only by the appearance frequency of the amino acid sequence.
  • the appearance frequency is made in gene name units and / or allyl units.
  • the step (4) assigns a V region and a J region to the input sequence set, and extracts a CDR3 sequence with the CDR3 head on the reference V region and the CDR3 end on the reference J as markers. Is included.
  • the step (5) includes translating the CDR3 nucleic acid sequence into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence.
  • the present invention is a system for analyzing a TCR or BCR repertoire, the system comprising: (1) a gene region comprising at least one of a V region, a D region, a J region, and optionally a C region Means for providing a reference database for each: (2) Means for providing an input sequence set obtained by performing trimming as necessary and extracting an appropriate length as necessary; (3) About the input sequence set; Means for performing homology search with the reference database for each gene region and recording an alignment with the approximate reference allele and / or sequence of the reference allele; (4) V region and J region for the input sequence set; Means for assigning and extracting the nucleic acid sequence of the D region based on the assignment result; (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence; Means for classifying the D region using the non-acid sequence; (6) Each appearance frequency of the V region, the D region, the J region and, if necessary, the C region based on the classification in (5), or a combination thereof A system is
  • the present invention is a computer program that causes a computer to execute processing of a method of analyzing a TCR or BCR repertoire, the method comprising the following steps: (1) V region, D region, J region, and necessary A step of providing a reference database for each gene region including at least one of the C regions according to: (2) Trimming as necessary, and extracting an input sequence set having an appropriate length as necessary (3) performing a homology search with the reference database for each of the gene regions with respect to the input sequence set, and recording an alignment with the approximate reference allele and / or the sequence of the reference allele; 4) Assign V region and J region for the input sequence set, and based on the assignment result, nucleic acid of D region (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence, and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) based on the classification in (5), V Deriving a TCR or a BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each region, region D, region J, and, if necessary, region
  • the present invention is a recording medium storing a computer program that causes a computer to execute processing of a method for analyzing a TCR or BCR repertoire, the method comprising the following steps: (1) V region, D Step of providing a reference database for each gene region including at least one of region, J region, and C region as necessary: (2) Trimming as necessary, and having an appropriate length as necessary Providing the extracted input sequence set; (3) performing a homology search with the reference database for each gene region for the input sequence set, and aligning with the reference allele and / or the sequence of the reference allele (4) assigning V region and J region to the input array set, and assigning result And (5) translating the nucleic acid sequence of the D region into an amino acid sequence and classifying the D region using the amino acid sequence; (6) in (5) Deriving a TCR or BCR repertoire by calculating the appearance frequency of each of the V region, the D region, the J region, and, if necessary, the C region, or a combination thereof based on the classification of A recording
  • the gene analysis system 1 includes a CPU 1401 built in a computer system via a system bus 1420, a RAM 1403, an external storage device 1405 such as a flash memory such as a ROM, HDD, magnetic disk, or USB memory, and an input / output interface (I). / F) 1425 is connected.
  • An input device 1409 such as a keyboard and a mouse, an output device 1407 such as a display, and a communication device 1411 such as a modem are connected to the input / output I / F 1425, respectively.
  • the external storage device 1405 includes an information database storage unit 1430 and a program storage unit 1440. Both are fixed storage areas secured in the external storage device 1405.
  • the reference database In the database storage unit 1430, the reference database, the input sequence set, the generated classification data, TCR or BCR repertoire data, etc., or information acquired via the communication device 1411 or the like is written and updated as needed.
  • the information belonging to the sample to be accumulated can be identified by the ID defined in each master table. It becomes possible to manage.
  • the database storage unit 1430 stores sample provider ID, sample information, nucleic acid analysis results, known individual / physiology information, and TCR or BCR repertoire analysis results in association with the sample IDs as input sequence set entry information.
  • the TCR or BCR repertoire analysis result is information obtained by processing the nucleic acid analysis result by the processing of the present invention.
  • the computer program stored in the program storage unit 1440 configures the computer as the above-described processing system, for example, a system that performs processing such as trimming, extraction, alignment, assignment, classification, translation, and the like.
  • Each of these functions is an independent computer program, its module, routine, etc., and is executed by the CPU 1401 to configure the computer as each system or device. In the following, it is assumed that each function in each system cooperates to constitute each system.
  • the present invention provides a method for quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a database.
  • the method comprises (1) providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence, amplified unbiased from the subject; (2) contained in the nucleic acid sample And (3) calculating the frequency of occurrence of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject.
  • This method and methods that include one or more additional features described herein are also referred to herein as “the repertoire analysis method of the present invention”.
  • a system for realizing the repertoire analysis method of the present invention is also referred to as a “repertoire analysis system of the present invention”.
  • (1) providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence amplified in a biased manner from the subject in the method of the present invention comprises determining the nucleic acid sequence; Any sample may be used as long as the sample is suitable.
  • Reverse transcriptase-PCR in addition to the above-described preferred amplification method of the present invention, Reverse transcriptase-PCR, real-time PCR, digital PCR, emulsion PCR, amplified fragment polymorphism (AFLP) PCR, allele-specific PCR, assembled PCR, asymmetric PCR , Colony PCR, helicase-dependent amplification, hot start PCR, inverse PCR, in situ PCR nested PCR, Touchdown PCR, loop-mediated isometric PCR (LAMP), Nucleic acid sequence based amplification (a NASB) Reaction, Branch DNA Amplification, Rolling Circle Amplification, Circle to circle Amplification, SPIA amplification, Trget Amplification by Capture and Ligation (TACL), 5'-Rapid amplification of cDNA end (5'-RACE), 3'-Rapid amplification of cDNA End (3'-RACE), Switching Mechanism at 5'-endof the RNA Transscript (SMART) can also
  • any method may be used as long as the nucleic acid sequence can be determined.
  • an automated large-scale sequencing method include sequencing using the Roche 454 sequencer (GS FLX +, GS Junior), sequencing using the ion torrent sequencer (Ion PGM TM Sequencer) method, Illumina's method (GenomeAnalyzer IIx, There is sequencing using Hiseq, Miseq).
  • Other sequence methods include Helicescope TM Sequencer, Helicos True Single Molecule Sequencing (tSMA) (Harris. TD et al.
  • the Roche 454 sequence creates a single-stranded DNA in which two types of adapters that specifically bind to the 3 ′ end and the 5 ′ end are bound.
  • the single-stranded DNA binds to the bead via an adapter, and wraps in a water-in-oil emulsion to form a microreactor with the bead and the DNA fragment.
  • emulsion PCR is performed in a water-in-oil emulsion to amplify the target gene.
  • the beads are applied to a pico titer plate and sequenced.
  • ATP is produced by sulfurylase using pyrophosphate generated when dNTP is taken into DNA by DNA polymerase (Pyrosequencing).
  • Luciferase emits fluorescence using this ATP and Luciferin as substrates, and the base sequence is determined by detecting with a CCD camera.
  • the ion torrent method after emulsion PCR is performed in the same manner as Roche, the beads are transferred to a microchip and a sequence reaction is performed on the microchip. In the detection, the hydrogen ion concentration released when DNA is extended by polymerase is detected on a semiconductor chip and converted into a base sequence.
  • Illumina sequencing is a method in which the target DNA is amplified on a flow cell by the bridge PCR method and Sequencing-by-synthesis, and sequencing is performed while synthesis.
  • the bridge PCR method creates a single-stranded DNA with different adapter sequences added to both ends.
  • An adapter sequence on the 5 ′ end side is fixed in advance on the flow cell, and is fixed to the flow cell by performing an extension reaction.
  • an adapter on the 3 ′ end side is fixed at an adjacent position, and is combined with the 3 ′ end of the synthesized DNA to synthesize a double-stranded DNA in a so-called bridge form.
  • bridge binding ⁇ extension ⁇ denaturation a large number of single-stranded DNA fragments are locally amplified to form an accumulated cluster. Sequencing is performed using this single-stranded DNA as a template. Sequencing-by-synthesis performs a 1-base synthesis reaction with 3 ′ end block fluorescent dNTPs by DNA polymerase after adding a sequence primer.
  • a fluorescent substance bound to a base is excited by laser light, and light emission is recorded as a photograph by a fluorescence microscope.
  • the base sequence is determined by removing the fluorescent substance and blocking, performing the next extension reaction, and proceeding with the step of detecting fluorescence.
  • the nucleic acid sample includes a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences, and in the step of determining the sequence of (2), single sequencing is performed.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • single sequencing is performed.
  • the method of the present invention can reduce or eliminate the bias that can arise from performing multiple types of sequencing by performing a single sequencing. Therefore, it is particularly useful for accurately detecting TCR or BCR leads that occur only infrequently.
  • At least one of the sequences used as a primer in the single sequencing, in the amplification from the nucleic acid sample to the sample for sequencing, at least one of the sequences used as a primer is the same as the nucleic acid sequence encoding the C region or a complementary strand thereof. It has the arrangement.
  • a primer having the same sequence as the nucleic acid sequence encoding the C region or its complementary strand similar amplification can be performed in any TCR or BCR, and unbiased can be achieved.
  • the non-biased amplification includes not being V region specific amplification.
  • the bias can be further reduced or eliminated as compared with the case where non-biased amplification is performed by devising a multiplex using a V-specific primer.
  • the repertoire targeted by the present invention is a BCR variable region repertoire
  • the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • BCR is likely to be mutated. In particular, it is said that mutations frequently occur in the V region, and it is difficult to accurately analyze BCR repetoa by a technique using V region specific amplification.
  • the present invention provides a method for analyzing a disease, disorder or condition of the subject based on a TCR or BCR repertoire derived based on the repertoire analysis method of the present invention.
  • a technique for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on the repertoire analysis method of the present invention is a disease, disorder or the like.
  • Clinical information such as status, and derived lead type, number of leads, read frequency, V data, J data, C data, CDR3 data, etc., are linked, and a database is created using a spreadsheet such as EXCEL It starts from doing.
  • a TCR having a known function such as NKT or MAIT is searched. 2. Search existing public database and collate with TCR or BCR whose functions such as antigen specificity are known. 3.
  • the disease, disorder or condition of the subject is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T-cell leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, Examples include idiopathic thrombocytopenic purpura, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a method for quantitatively associating a disease, disorder or condition of a subject determined by the method of the present invention with the TCR or BCR repertoire, Methods are provided for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject comprising selecting a means for treatment or prevention.
  • the disease, disorder or condition of the subject targeted in the method for treatment or prevention of the present invention is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell.
  • examples include, but are not limited to, large granular lymphocytic leukemia and idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the present invention provides a system (analysis system) for quantitatively analyzing a subject's T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using a database.
  • the system comprises: (1) a kit for providing a nucleic acid sample comprising a T cell receptor (TCR) or a B cell receptor (BCR) nucleic acid sequence, amplified unbiased from the subject; (2) the nucleic acid sample An apparatus for determining the nucleic acid sequence contained in the gene; and (3) calculating the appearance frequency of each gene or a combination thereof based on the determined nucleic acid sequence, and deriving the TCR or BCR repertoire of the subject
  • a device for A system that includes such a system and one or more additional features described herein is referred to as a “repertoire analysis system of the present invention”.
  • the repertoire analysis system of the present invention realizes the “repertoire analysis method of the present invention”.
  • the nucleic acid sample comprises a plurality of types of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) nucleic acid sequences
  • the device of (2) uses a single sequencing to extract the nucleic acid sequences. Configured to be able to determine.
  • the single sequencing is characterized in that at least one of the sequences used as primers in the amplification from the nucleic acid sample to the sequencing sample has the same sequence as the C region.
  • the system of the present invention can reduce or eliminate the bias that can arise from performing multiple types of sequencing by performing a single sequencing.
  • the system of the present invention is particularly useful for accurately detecting TCR or BCR leads that occur only infrequently.
  • At least one of the sequences used as a primer in the single sequencing, in the amplification from the nucleic acid sample to the sample for sequencing, at least one of the sequences used as a primer is the same as the nucleic acid sequence encoding the C region or a complementary strand thereof. It has the arrangement.
  • a primer may be provided in this apparatus, may be included in a kit, or may be provided separately.
  • the nucleic acid sequence contained in the nucleic acid sample provided by the kit of the present invention is subjected to the unbiased amplification, but the amplification is not V region specific amplification.
  • the bias can be further reduced or eliminated as compared with the case where non-biased amplification is performed by devising a multiplex using a V region specific primer.
  • the repertoire to be analyzed by the system of the present invention is a BCR variable region repertoire
  • the nucleic acid sequence is a BCR nucleic acid sequence.
  • BCR is likely to be mutated. In particular, it is said that mutations frequently occur in the V region, and it is difficult to accurately analyze BCR repetoa by a technique using V region specific amplification. By using the system of the present invention, it has become possible to accurately analyze BCR repeaters.
  • the present invention comprises a subject's analysis system, and means for analyzing the subject's disease, disorder or condition based on a TCR or BCR repertoire derived based on the system.
  • a system for analyzing a disease, disorder or condition is provided.
  • the means for analyzing the disease, disorder or condition of the subject based on the TCR or BCR repertoire derived based on the analysis system of the present invention includes clinical information such as the disease, disorder or condition and the derived lead. It begins with connecting read data consisting of type, number of reads, read frequency, V region, J region, C region, CDR3 array, etc., and creating a database using a spreadsheet such as EXCEL.
  • a TCR having a known function such as NKT or MAIT is searched. 2. Search existing public database and collate with TCR or BCR whose functions such as antigen specificity are known. 3. Search in the constructed database or existing public database, and relate to the disease, disorder or condition from the origin, characteristics or function of the common sample. Next, regarding the lead arrangement in the sample, 1. Determine if the frequency of a particular lead increases (increases clonality). 2. It is examined whether the frequency of use of a specific V chain or J chain increases or decreases depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 3. It is examined whether the CDR3 sequence length in a specific V chain is increased or decreased depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 4).
  • composition and sequence of the CDR3 region that changes depending on the onset of the disease and the state of the disorder are examined. 5. Search for leads that appear or disappear depending on the onset of the disease or the state of the disorder. 6). Search for leads that increase or decrease depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 7). Leads that appear or increase / decrease in response to the onset of the disease or the state of the disorder are searched in other samples and associated with the disease, disorder or condition. 8). Diversity index or similarity index is calculated using statistical analysis software such as ESTIMATES or R (vegan) using data such as number of samples, lead type and number of leads. 9. Changes in diversity index or similarity index can be associated with disease onset and disorder status.
  • the disease, disorder or condition of the subject that can be analyzed by the analysis system of the present invention includes blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell large granules.
  • examples thereof include, but are not limited to, lymphocytic leukemia and idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the present invention provides a means for quantitatively associating a disease, disorder or condition of a subject determined by the analysis system of the present invention with the TCR or BCR repertoire,
  • a system treatment system or prevention system for treating or preventing a disease, disorder or condition in the subject, comprising means for selecting a means for treatment or prevention.
  • the means for associating the subject's disease, disorder or condition with the TCR or BCR repertoire quantitatively in the system of the present invention can be realized by the following configuration. That is, repertoire information derived by the analysis system of the present invention can be read, and this can be realized by reading information on a subject's disease, disorder or condition and associating them.
  • the V region, the J region, and the C region are assigned from the collation operation with respect to the existing reference sequence, and the CDR3 sequence is determined.
  • the corresponding reads are counted, and the number of reads detected in the sample and the ratio to the total number of reads for each unique lead (the other lead that does not have the same sequence) ( Frequency) is calculated.
  • This information (read sequence, number of reads, read frequency, V region, J region, C region, CDR3 sequence) and clinical information of the subject (history, disease name, disease type, progression, severity, HLA type, immune status, etc.) )
  • a spreadsheet such as EXCEL or software having a database creation function.
  • the lead array in the sample is sorted by the number of reads and frequency, and ranking processing is performed.
  • the number of reads is totaled for each V area or J area, and the V area usage frequency or J area usage frequency is calculated. Based on these information, 1. Determine if the frequency of a particular lead increases (increases clonality). 2. It is examined whether the frequency of use of a specific V chain or J chain increases or decreases depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 3. It is examined whether the CDR3 sequence length in a specific V chain is increased or decreased depending on the onset of the disease and the state of the disorder. 4). The composition and sequence of the CDR3 region that changes depending on the onset of the disease and the state of the disorder are examined. 5. Search for leads that appear or disappear depending on the onset of the disease or the state of the disorder. 6).
  • a means for selecting an appropriate treatment or prevention means from a quantitative relationship can be configured as follows. In other words, the selection of this means of selection is realized by associating data showing quantitativeness with past information on treatment, treatment or prevention, or information currently available, and realizing selection of those whose subsequent courses improve. Can do.
  • the disease, disorder or condition of the subject is a blood tumor, colon cancer, immune condition, rheumatoid arthritis, adult T cell leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • a blood tumor colon cancer
  • immune condition rheumatoid arthritis
  • adult T cell leukemia T cell large granular lymphocytic leukemia
  • idiopathic thrombocytopenic purpura idiopathic thrombocytopenic purpura.
  • the base sequence (read) of the TCR or BCR gene identified by a large-scale sequence and the appearance frequency thereof can be calculated on software, and a list, distribution, or graph can be drawn. Based on such information, the change of the repertoire is detected by using various indicators as follows. Based on the changes, the association with diseases and disorders can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the use frequency of a V gene using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the V gene of each lead can be identified, and the proportion of each V gene in the total TCR or BCR gene can be calculated.
  • the increase or decrease in the frequency of use of V related to the disease or condition can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the frequency of use of the J gene using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the J gene of each lead can be identified, and the proportion of each J gene in the total TCR or BCR gene can be calculated.
  • the increase or decrease in the frequency of use of J related to the disease or condition can be clarified.
  • the present invention provides a method for detecting the frequency of subtype frequency analysis (BCR) using the analysis method or analysis system of the present invention. Based on the sequencing of the C region, the presence frequency of IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes can be calculated. Can reveal increases or decreases in specific subtypes associated with a disease or condition.
  • BCR subtype frequency analysis
  • the present invention provides a method for analyzing a CDR3 sequence length pattern using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the CDR3 base sequence length of each read can be calculated to clarify the distribution.
  • a normal TCR or BCR shows a normal distribution-like peak pattern, but a peak deviating from the normal distribution can be detected to clarify the relationship with a disease or disease state.
  • the present invention provides a method for analyzing TCR or BCR clonality using the analysis method or analysis system of the present invention. Based on the V sequence, J sequence and CDR3 sequence of each lead, reads having the same sequence are classified, and the copy number is calculated. By calculating the ratio of the number of copies of each lead to the total number of reads, it is possible to clarify the presence of a lead that exists frequently. The degree of clonality is evaluated by sorting the descending order according to the appearance frequency, and comparing the number and ratio of leads that exist frequently with normal samples. Therefore, the change of TCR or BCR clonality related to the disease or pathological condition is examined. In particular, it can be used for detection of leukemia cells and the like.
  • the present invention provides a method for extracting duplicate leads using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for searching for a disease-specific TCR or BCR clone using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • Search for TCR or BCR leads associated with a specific disease or disorder condition in a test sample, revealing its appearance, disappearance, increase or decrease, and predicting the onset or progression of disease can do.
  • the present invention provides a method for analyzing an object using a diversity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for supporting analysis of an object using a diversity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the number of read sequences identified based on the CDR3 sequence is counted, the number of read species and the number of individuals are calculated, and the diversity of TCR or BCR repertoire is indexed. Contrast with normal samples using Shannon-Wiener diversity index (H ′), Simpson diversity index ( ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇ ), Pierou uniformity index (J ′), Chao1 index, etc.
  • H ′ Shannon-Wiener diversity index
  • Simpson diversity index ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇
  • Pierou uniformity index J ′
  • Chao1 index etc.
  • It can be used as an index for measuring the degree of recovery of the immune system after bone marrow transplantation. It can also be used as an indicator for detecting abnormalities in immune system cells associated
  • the diversity in the method for analyzing a subject using a diversity index, is used as an index for measuring the degree of recovery of the immune system after bone marrow transplantation or detecting an abnormality of immune system cells associated with a hematopoietic tumor.
  • Use sex index. Analysis using such diversity indexes has been difficult with conventional systems.
  • various diversity indexes are obtained from the data of the number of samples, the type of lead, and the number of leads, EXCEL spreadsheet, ESTIMATES (Colwell, RK et al. Journal of Plant Ecology 5: 3-21.) Or R It can be calculated using software such as a package (vegan).
  • the Shannon-Wiener diversity index (H ′), the Simpson diversity index ( ⁇ , 1- ⁇ or 1 / ⁇ ), the Pierou uniformity index (J ′), or the Chao1 index are obtained by the following formulas.
  • N total number of leads
  • n i number of leads in lead i Shannon-Weaver index H ′
  • the present invention is a method of analyzing an object using a similarity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the present invention provides a method for supporting analysis of an object using a similarity index using the analysis method or analysis system of the present invention.
  • the number of species and individuals of the lead sequence identified based on the CDR3 sequence are calculated, and the similarity of TCR or BCR repertoire between samples to be compared is clarified.
  • the Morisita-Horn index, Kimoto's C ⁇ index or Pianka's ⁇ index the degree of similarity between samples is clarified. It can be used for evaluation of repertoire similarity between HLA type agreement or mismatch, evaluation of repertoire similarity between recipient and donor after bone marrow transplantation, and the like.
  • the similarity index is used as an assessment of repertoire similarity between HLA-type matches or mismatches, and an assessment of repertoire similarity between recipient and donor after bone marrow transplantation. Analysis using such a similarity index is difficult with a conventional system.
  • Various similarity indices can be calculated using the following formulas using ESTIMATES (Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5: 3-21.) Or R package (vegan).
  • the Morisita-Horn index, Kimoto's C ⁇ index or Pianka's ⁇ index is obtained by the following formula.
  • Morosita-Horn index X i number of leads i appearing in all X leads derived from one sample
  • y i number of leads i appearing in all Y leads derived from the other sample S: number of unique reads
  • the present invention can adjust samples for quantitative analysis of T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) variable region repertoire using next generation sequencing technology.
  • TCR T cell receptor
  • BCR B cell receptor
  • These sequencing techniques can obtain 1 million or more leads from a sample at a reasonable cost. Even genotypes present at a frequency of 1 / 1,000,000 or less can be detected in a specific and unbiased manner using these techniques.
  • Unbiased amplification methods are achieved to amplify all different types of sequences of specific portions of genes or transcripts from samples derived from DNA such as blood or bone marrow.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for use in cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy in a subject.
  • This method comprises (1) analyzing the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result, wherein the determination is based on the highest ranking sequence in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • a step of selecting the TCR or BCR derived from the cancer cell (3) determining a candidate amino acid sequence of the HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer The determination is based on a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm; And (4) comprising the step of combining the determined peptide.
  • the peptide synthesized here can be used for cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy. This method is sometimes referred to herein as "cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy".
  • cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy specifically, it can be performed clinically using the following procedure. For example, briefly, (1) peripheral blood cells of a cancer patient suffering from a blood tumor can be collected, lymphocyte cells can be isolated, and then the repertoire analysis method of the present invention can be performed, and this can be used. Cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy. In another embodiment, the repertoire analysis method of the present invention can be performed for a TCR in the case of a T cell tumor and for a BCR in the case of a B cell tumor.
  • the higher rank sequence is selected as the TCR or BCR derived from the cancer cell, and the cancer separately determined from the sequence containing the CDR3 region of the TCR or BCR gene
  • Peptides that bind to a patient's human leukocyte antigen (HLA) are predicted using an HLA-binding peptide prediction program (any known program can be used as described elsewhere herein).
  • an HLA binding peptide is synthesize
  • patient peripheral blood mononuclear cells are collected, added to the mixture of mononuclear cells or patient-derived antigen-presenting cells and CD8 + T cells, cultured, Stimulation with peptides can be performed.
  • the peptide-stimulated lymphocyte cells can be transferred to a patient and subjected to CTL therapy.
  • peptide-sensitized DC vaccine therapy after collecting peripheral blood mononuclear cells from patients, monocytes are isolated and induced to differentiate into dendritic cells (DC) in the presence of differentiation-inducing factors. Then, the peptide can be added and cultured, and the peptide-sensitized dendritic cells can be transferred to a patient and subjected to dendritic cell therapy.
  • DC dendritic cells
  • Cancer idiotype peptide sensitized immune cell therapy includes, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma B cell prolymphocytic leukemia, hairy cell leukemia, T cell prolymphocytic leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, adult T cell leukemia / lymphoma and other hematological cancers, multiple myeloma, bone marrow Can be used for leukemia-related diseases such as dysplasia syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc.
  • leukemia-related diseases such as dysplasia syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lup
  • the candidate for the HLA test peptide in step (3) of the present invention is determined using BIMAS, SYFPEITHI, RANKPEP, or NetMHC.
  • the present invention comprises, after step (4) of the present invention, mixing the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject. Including the step of culturing. This is also called an improved CTL method.
  • the improved CTL method for example, unlike the widespread activation of T cells by existing anti-CD3 antibodies and IL-2, antigen specificity is imparted to CD8 + T cells using an antigen peptide, resulting in higher specificity. Treatment with fewer side effects can be expected. Moreover, since the individualized peptide created based on the information obtained from the tumor cells of the patient is used, a high therapeutic effect can be expected.
  • Improved CTL methods include, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma, B cell prolymphocyte Leukemia, hairy cell leukemia, T-cell prolymphocytic leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, blood cancer such as adult T-cell leukemia / lymphoma, multiple myeloma, leukemia such as myelodysplastic syndrome Can be used for related diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc. Patients with end-stage cancer patients, refractory autoimmune diseases, severe infections Can be used.
  • the present invention includes a step of mixing and culturing the peptide and the dendritic cell derived from the subject after the step (4) of the present invention. This is also called DC vaccine therapy.
  • DC vaccine therapy for example, since individualized peptides are created based on sequence information obtained from tumor cells derived from the patient, they do not act on normal cells, but act more specifically on tumor cells and are high A therapeutic effect can be expected. Since a peptide is used as an antigen, there is an advantage that it can be easily chemically synthesized unlike a protein.
  • DC vaccine therapy includes, for example, acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma, B cell prolymphocytic Leukemia such as leukemia, hairy cell leukemia, T-cell prolymphocytic leukemia, T-cell large granular lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia / lymphoma, etc., multiple myeloma, myelodysplastic syndrome Can be used for diseases, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, patients with various infectious diseases, etc. For patients with terminal cancer patients, refractory autoimmune diseases, severe infections Can be used).
  • the present invention comprises, after step (4) of the present invention, mixing the peptide, the subject-derived dendritic cell or antigen-presenting cell, and the subject-derived CD8 + T cell. Culturing to produce a CD8 + T cell-dendritic cell / antigen-presenting cell-peptide mixture, and mixing the peptide and dendritic cells derived from the subject to culture, Including the process of producing. This is also called patient autoimmune cell therapy.
  • Patient autoimmune cell therapy includes, for example, blood cancer (leukemia, etc.), acute myeloid leukemia and related progenitor cell tumors, lymphoblastic leukemia / lymphoma, T lymphoblastic leukemia / lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphoma Hematopoietic lymphoma, B cell prolymphocytic leukemia, hairy cell leukemia, T cell prolymphocytic leukemia, T cell large granular lymphocytic leukemia, blood cancer such as adult T cell leukemia / lymphoma, multiple bone marrow It can be used for leukemia-related diseases such as myeloma, myelodysplastic syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, autoimmune diseases such as type I diabetes, various infectious disease patients, etc., terminal cancer patients, refractory autoimmunity It can be used for patients with diseases and serious
  • the present invention provides a method of giving cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy to a subject.
  • This method comprises (1) analyzing the T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; (2) A step of determining a TCR or BCR derived from the cancer cell of the subject based on the result, wherein the determination is based on the highest ranking sequence in the frequency ranking of the TCR or BCR gene derived from the cancer cell of the subject.
  • a step of selecting the TCR or BCR derived from the cancer cell (3) determining a candidate amino acid sequence of the HLA test peptide based on the determined TCR or BCR derived from the cancer The determination is based on a score calculated using an HLA-binding peptide prediction algorithm; Comprising a step of performing a treatment by using the optionally (5) synthesized peptide; 4) a step of synthesizing the determined peptide.
  • This method includes both a method of producing a therapeutic agent and a method of performing the treatment itself. When excluding medical practice, it can be completed in the steps up to (5).
  • the candidate for the HLA test peptide in the step (3) is determined using BIMAS, SYFPEITHI, RANKPEP, or NetMHC.
  • BIMAS is an estimation program for HLA peptide binding provided at www-bimas.cit.nih.gov/.
  • SYFPEITHI is a database and search engine for MHC ligands and peptide motifs provided at www.syfpeithi.de/.
  • RANKPEP is a peptide bond prediction program for class I and class II MHC molecules provided at http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html.
  • NetMHC is a program server that predicts the binding of peptides to many HLA alleles, which is provided at www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/.
  • the present invention comprises, after the step (4), the peptide, the dendritic cell or antigen-presenting cell derived from the subject, and the CD8 + T cell derived from the subject.
  • the present invention comprises a step of mixing and culturing the peptide and dendritic cells derived from the subject after the step (4), and treating the cultured mixture with a patient.
  • the present invention comprises, after the step (4), the peptide, dendritic cells or antigen-presenting cells derived from the subject, and CD8 + T cells derived from the subject. Culturing the mixture to produce a CD8 + T cell-dendritic cell / antigen-presenting cell-peptide mixture, and mixing the peptide with the subject-derived dendritic cell and culturing the dendritic cell. Performing the step of producing a peptide mixture and administering the CD8 + T cell-dendritic cell / antigen presenting cell-peptide mixture, and the dendritic cell-peptide mixture to a patient.
  • the present invention provides a technique for isolating a bespoke cancer-specific T cell receptor gene and a technique for isolating a cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation.
  • the present invention provides (A) an antigen protein or antigen peptide derived from a subject or a lymphocyte derived from the subject or a peptide determined in the “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” of the present invention, Mixing inactivated cancer cells derived from a subject and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells; (B) TCR of the tumor-specific T cells of the present invention Analyzing with the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; and (C) isolating a desired tumor-specific T cell based on the result of the analysis, Methods are provided for preparing isolated cancer-specific TCR genes.
  • Preparation of such an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation can be carried out using any technique known in the art once genetic information is obtained.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • Such an isolated tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and cancer-specific TCR gene can be specifically carried out clinically using the following procedure.
  • tumor cells are removed from a cancer patient.
  • the patient-derived tumor cells are crushed, separated into single cells, and inactivated by chemical treatment such as mitomycin C or irradiation.
  • Isolating peripheral blood cells from the whole blood of the cancer patient. (4) Extract RNA from cells using a part of peripheral blood cells as an untreated control sample. (5) Activate and proliferate tumor-specific T cells by mixing and culturing inactivated tumor cells and peripheral blood cells. .
  • peripheral blood cells are collected, and RNA is extracted from the cells as a sample after stimulation.
  • the repertoire analysis method of the present invention is performed from the RNA sample extracted in (4) and (6).
  • TCR genes greatly increased in the stimulation sample as compared with the control sample, rank them, and then select the upper TCR ⁇ and TCR ⁇ genes.
  • These full-length TCR ⁇ and TCR ⁇ genes are cloned and introduced into a retrovirus vector for gene expression.
  • a virus for gene transfer is prepared from these TCR ⁇ and TCR ⁇ gene expression retroviral vectors.
  • (11) Transform by infecting lymphocytes collected from the patient with TCR ⁇ and TCR ⁇ alone, or by creating a gene expression retroviral vector containing both TCR ⁇ and TCR ⁇ genes at the same time. Transform genes.
  • (12) Confirm the expression of TCR ⁇ / TCR ⁇ heterodimer on the cell surface.
  • (13) Using an isolated tailored cancer-specific T cell receptor gene and a cancer-specific TCR gene by transferring a tumor-specific patient lymphocyte expressing a target TCR ⁇ / TCR ⁇ into a patient. could be realized.
  • TCR or BCR determined by the method described in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” is used as an antigen or peptide.
  • Can do is used as an antigen or peptide.
  • any cancer antigen or inactivated cancer tissue derived from a patient is assumed here, the following methods can be typically used: any antigen protein or any antigen peptide, T lymphocyte and antigen-presenting cell A method of mixing a subject-derived lymphocyte and a subject-derived inactivated cancer cell; a TCR or BCR-derived peptide determined by a repertoire analysis provided in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy” A method of mixing T lymphocytes and antigen presenting cells is provided.
  • the step (A) in the present invention comprises an antigen protein or antigen peptide derived from a subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. Mixing and culturing to produce tumor-specific T cells.
  • the step (A) in the present invention comprises mixing and culturing lymphocytes derived from the subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. This is a process for producing tumor-specific T cells.
  • step (A) in the present invention is derived from the peptide determined in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy”, inactivated cancer cells derived from the subject, and the subject. This is a step of producing tumor-specific T cells by mixing and culturing with T lymphocytes.
  • Treatments using such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes include, for example, adrenal cancer, anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer , Chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer, oral cavity cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer , Non-Hodgkin lymphoma, melanoma, mesothelioma, multiple myeloma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, etc. .
  • the present invention provides isolation of a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search. Accordingly, the present invention provides (A) providing lymphocytes or cancer tissue isolated from subjects having a common HLA; (B) for the lymphocytes or cancer tissue, the tumor-specific T cells. A common sequence search comprising the steps of: analyzing the TCR of the subject by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; and (C) isolating T cells having sequences common to tumor-specific T cells.
  • a method for preparing an isolated cancer-specific TCR gene by Preparation of an isolated cancer-specific TCR gene by such a common sequence search can be performed using any technique known in the art once genetic information is obtained.
  • Such a gene obtained by isolation of a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search can be used for the treatment and prevention of various cancers. it can.
  • This method is also referred to as “isolation of a customized cancer-specific T cell receptor gene of the present invention and isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search”.
  • the gene obtained by the isolation of such a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and the isolation of a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search is specifically as follows in clinical practice. Can be implemented.
  • (2) Repertoire analysis is performed using tumor tissue or lymphocyte cells containing tumor cell infiltrating T cells.
  • a tumor-specific T cell that ranks based on its presence frequency in each sample and shows a higher presence frequency in tumor cells than in peripheral blood cells is selected.
  • a sequence common to a plurality of HLA-matched cancer patients is searched.
  • a tumor-specific TCR gene common to most cancer patients is selected as a therapeutic tumor-specific TCR.
  • TCR ⁇ and TCR ⁇ genes are cloned and introduced into a retrovirus vector for gene expression.
  • a virus for gene transfer is prepared from these TCR ⁇ and TCR ⁇ gene expression retroviral vectors.
  • Tumor-specific patient lymphocytes expressing the target TCR ⁇ / TCR ⁇ are transferred to a patient to isolate a custom-made cancer-specific T cell receptor gene, and a cancer-specific TCR by consensus sequence search Treatment using a gene obtained by gene isolation can be realized.
  • the treatment using the gene obtained by the isolation of such a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and the isolation of the cancer-specific TCR gene by consensus sequence search includes, for example, adrenocortical cancer, anal cancer, Bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer,
  • adrenocortical cancer anal cancer
  • Bile duct cancer bladder cancer
  • breast cancer cervical cancer
  • the present invention provides (A) an antigen protein or antigen peptide derived from a subject or a peptide determined in lymphocyte or cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy derived from the subject, Mixing inactivated cancer cells derived from a subject and T lymphocytes derived from the subject and culturing to produce tumor-specific T cells; (B) TCR of the tumor-specific T cells of the present invention Analyzing by the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention; and (C) isolating a desired tumor-specific T cell based on the result of the analysis, by in vitro antigen stimulation.
  • a method for isolating cancer-specific TCR genes is provided.
  • Preparation of such an isolated cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation can be performed using any technique known in the art once the genetic information is obtained.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • step (A) in the present invention is derived from an antigen protein or antigen peptide derived from a subject and the subject.
  • the step (A) in the present invention comprises mixing and culturing lymphocytes derived from the subject, inactivated cancer cells derived from the subject, and T lymphocytes derived from the subject. This is a process for producing tumor-specific T cells.
  • step (A) in the present invention is derived from the peptide determined in “cancer idiotype peptide-sensitized immune cell therapy”, inactivated cancer cells derived from the subject, and the subject. This is a step of producing tumor-specific T cells by mixing and culturing with T lymphocytes.
  • the present invention provides a technique for isolating a bespoke cancer-specific TCR gene by isolating a tailor-made cancer-specific T cell receptor gene and searching for a common sequence.
  • B a step of analyzing a TCR of the tumor-specific T cell for the lymphocyte or cancer tissue by the repertoire analysis method of the present invention
  • C A method for isolating a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search, comprising the step of isolating T cells having a sequence common to tumor-specific T cells.
  • Such isolated tailored cancer-specific T cell receptor genes and cancer-specific TCR genes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • the present invention provides cell processing therapy. Specifically, the present invention is based on A) the step of providing T lymphocytes collected from a patient; B) after the antigen stimulation of the T lymphocytes, and the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention.
  • Analyzing the TCR wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide; C) selecting optimal antigen and optimal TCR in the analyzed TCR; and D) for cell processing therapy comprising the steps of producing tumor-specific ⁇ and ⁇ TCR expressing viral vectors of the TCR gene of the optimal TCR
  • a method for preparing the tumor-specific TCR transgenic T lymphocytes for use in the present invention is provided. This cell processing therapy using tumor-specific TCR gene-transferred T lymphocytes can be used for the treatment and prevention of various cancers.
  • the cell processing therapy using such tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes can be specifically carried out clinically using the following procedure.
  • ⁇ isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, isolation of cancer-specific TCR gene by in vitro antigen stimulation> or ⁇ isolation of tailor-made cancer-specific T cell receptor gene, Tumor-specific TCR gene-introduced lymphocytes can be used by the method described in> Isolation of cancer-specific TCR gene by consensus sequence search.
  • any cancer antigen or cancer peptide can be produced or synthesized as an antigen by production or synthesis, and the collected inactivated patient cancer cells can be used, or a tumor-derived idio Type peptides can be used.
  • a selection method an antigen highly expressed in cancer tissue can be selected, or a peptide that binds to a patient HLA type can be selected as an antigen.
  • an optimal antigen for example, (1) an antigen highly expressed in patient cancer tissue, (2) the T cell is most strongly activated in an antigen-specific lymphocyte stimulation test Antigen, (3) From the repertoire analysis before and after antigen stimulation, it can be envisaged to select an antigen that most increases the frequency of a specific TCR, but is not limited thereto.
  • (3) a method of selecting the most increased TCR as the optimum TCR in an example in which the frequency of a specific TCR is most increased from repertoire analysis before and after antigen stimulation can be assumed.
  • an optimal TCR candidate is artificially introduced into a patient lymphocyte, and the one that exhibits the highest reactivity with an actual patient cancer tissue can be selected as the optimal TCR.
  • T lymphocytes include, for example, adrenocortical cancer, anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia Colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing tumor, gallbladder cancer, Hodgkin's disease, hypopharyngeal cancer, laryngeal cancer, oral cavity cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, non-Hodgkin lymphoma, melanoma, mesothelioma It can be used for a wide range of cancer patients such as multiple myeloma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, etc., but is not limited thereto.
  • adrenocortical cancer anal cancer, bile duct cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia Colore
  • the antigen stimulation of the method of the present invention is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • the antigen stimulation of the present invention is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • the antigen stimulation of the method of the present invention is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • step C) of the method of the present invention comprises selecting an antigen that is highly expressed in the cancer tissue of the subject.
  • step C) of the method of the invention comprises selecting the antigen that most strongly activates T cells in an antigen-specific lymphocyte stimulation test.
  • step C) of the method of the present invention most increases the frequency of a specific TCR from a repertoire analysis performed based on the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention before and after antigen stimulation. Selecting an antigen.
  • the present invention is isolated by “isolation of a customized cancer-specific T cell receptor gene of the present invention, a method for isolating a cancer-specific TCR gene by consensus sequence search”.
  • the present invention provides a method for evaluating efficacy and / or safety by conducting an in vitro stimulation test using a cancer-specific TCR gene.
  • the effectiveness is derived from a subject, for example, an antigenic protein or antigenic peptide derived from the subject that has been stimulated by an antigenic protein or antigenic peptide derived from the subject and a T cell into which a cancer-specific TCR gene has been introduced.
  • cytokine interferon ⁇ , etc.
  • Safety For example, when T cells derived from the subject into which a cancer-specific TCR gene has been introduced and normal cells derived from the subject are mixed, cytokines secreted in response to the activation of the T cells, Safety can be evaluated by measuring gene expression or expression of cell surface molecules and confirming that the TCR gene-introduced T cells are not activated by normal cells.
  • the specific steps of efficacy and / or safety assessment can be realized as follows. That is, for example, (1) tumor-specific TCR ⁇ and TCR ⁇ gene-introduced T lymphocyte cells are produced using a retrovirus gene expression system. (2) When evaluating the effectiveness, cancer cells derived from a patient are removed and separated, immortalized, and then mixed and cultured with tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes. (3) Using the above cultured cells, a cell proliferation test (such as a thymidine incorporation test, an MTT test, or an IL-2 production test) is performed to quantitatively evaluate the reactivity with tumor cells, and more strongly to tumor cells. A reactive TCR gene can be selected.
  • a cell proliferation test such as a thymidine incorporation test, an MTT test, or an IL-2 production test
  • the present invention is based on A) the step of collecting T lymphocytes from a patient; B) after the antigen stimulation of the T lymphocytes, and the repertoire analysis method of the present invention or the repertoire analysis system of the present invention. Analyzing the TCR, wherein the antigen stimulation is performed by an antigen protein or antigen peptide derived from the subject, an inactivated cancer cell derived from the subject, or a tumor-derived idiotype peptide; C) selecting an optimal antigen and optimal TCR in the analyzed TCR; D) producing a tumor-specific ⁇ and ⁇ TCR-expressing viral vector of the TCR gene of the optimal TCR; E) introducing the tumor-specific TCR gene Introducing a T lymphocyte into the patient.
  • the method for carrying out the step of introducing the obtained tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes into the patient is as follows: A) Step of producing tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes; B) Tumor-specific TCR ⁇ and TCR ⁇ C) a step of instilling tumor-specific TCR gene-introduced T lymphocytes from a vein.
  • the antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by an antigen protein or an antigen peptide derived from the subject.
  • antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by inactivated cancer cells derived from the subject.
  • antigen stimulation in the cell processing therapy of the present invention is performed by the tumor-derived idiotype peptide.
  • step C) in the cell processing therapy of the present invention includes selecting an antigen that is highly expressed in the cancer tissue of the subject.
  • step C) in the cell processing therapy of the present invention comprises selecting an antigen that most strongly activates T cells in an antigen-specific lymphocyte stimulation test.
  • the step C) in the cell processing therapy of the present invention selects an antigen that most increases the frequency of a specific TCR from repertoire analysis performed based on the repertoire analysis method of the present invention before and after antigen stimulation. including.
  • BCR gene repertoire analysis is performed using the repertoire analysis method of the present invention, and a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below (A) And a cell population containing antibody-producing B cells (eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells) is isolated from the mouse, and immunoglobulin is analyzed by BCR repertoire analysis using the repertoire analysis method of the present invention.
  • BCR gene repertoire analysis is performed using the repertoire analysis method of the present invention, and a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below (A)
  • a cell population containing antibody-producing B cells eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells
  • immunoglobulin is analyzed by BCR repertoire analysis using the repertoire analysis method of the present invention.
  • A1 Method A in which immunized mice are KM mice capable of producing fully human antibodies while maintaining antibody diversity
  • the immunized mice are NOD / scid Humans in NOG (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ null) mice with severe combined immunodeficiency created by mating IL-2 receptor ⁇ chain knockout mice to mice
  • Method A of humanized mice produced by transplanting cells B) immunoglobulin heavy and light chain gene sequences obtained from samples from mice derived from control mice and immunized mice, or mice before and after antigen immunization Compare frequency (C) Identify immunoglobulin heavy and light chain genes that are strongly expressed in immunized mice or increase after immunization (D) Select immunoglobulin heavy and light chain genes selected from step C And inserting the immunoglobulin heavy chain and light chain gene expression vectors prepared in the step (E) D into a single antibody expression vector or by separately inserting them into two different antibody expression vectors.
  • eukaryotic cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary) and perform cell culture (F) Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by genetically modified cells, target
  • eukaryotic cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary) and perform cell culture (F) Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by genetically modified cells, target
  • the antigen can be directly and rapidly changed without being changed into a chimeric antibody or humanized antibody with a human antibody.
  • This is a method for obtaining a specific human antibody and can be used for the development and production of an antibody drug comprising a human antibody.
  • NOD / SCID / gamma (c) (null) mouse an excellent recipient mouse model for engraftment of human. Nov 1; 100 (9): 3175-82.
  • Jayapal KP Wlaschin KF, Hu WS, Yap MGS. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and Count.Chem Eng Prog. 2007; 103: 40? 47.; Chusainow J, Yang YS, Yeo JH, Toh PC, Asvadi P, Wong NS, Yap MG.
  • a study of monoclonal antigen-producing CHO cell lines whatwhat You can refer to stable high producer? Biotechnol Bioeng. 2009 Mar 1; 102 (4): 1182-96.
  • a human-type antibody specific for a target antigen can be rapidly obtained by the method described below using the BCR gene repertoire analysis method.
  • A Target antigen protein or antigen A method in which a mouse is immunized with a peptide, a cell population containing antibody-producing B cells (eg, spleen, lymph nodes, peripheral blood cells) is isolated from the mouse, and immunoglobulin heavy chain and light chain genes are analyzed by BCR repertoire analysis ( A1) Method A in which the immunized mouse is a KM mouse that can produce fully human antibodies while maintaining antibody diversity (A2) The immunized mouse is a NOD / scid mouse and an IL-2 receptor ⁇ chain knockout mouse A humanized mouse produced by transplanting human stem cells into NOG (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ null) mice exhibiting severe combined immunodeficiency produced by mating Method (B) Compare the frequency of immunoglobulin heavy and light chain
  • the immunoglobulin heavy and light chain genes that increase after immunization are identified (D)
  • the immunoglobulin heavy and light chain genes selected from step C are selected and inserted in accordance with one antibody expression vector.
  • a method of separately inserting each of two types of antibody expression vectors (E) by introducing the immunoglobulin heavy chain and light chain gene expression vectors prepared in the step D into eukaryotic cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary), Perform cell culture (F) Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by recombinant cells, and test for specificity to target antibody protein or peptide
  • eukaryotic cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary)
  • Perform cell culture F
  • Isolate and purify antibody molecules produced and secreted by recombinant cells and test for specificity to target antibody protein or peptide
  • mice are immunized with Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55, MOG), an antigenic peptide of experimental autoimmune encephalomyelitis.
  • MOG35-55 Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
  • An equal volume of 2 mg / mL MOG peptide and complete Freund's adjuvant are mixed to make an emulsion, 200 ⁇ g MOG is immunized subcutaneously, and 400 ng pertussis toxin is simultaneously immunized to the peritoneal cavity.
  • Control mice are immunized with PBS and complete Freund's adjuvant.
  • 400 ng of pertussis toxin is immunized.
  • Next generation BCR repertoire analysis will be performed using the spleen of the affected and control mice.
  • IgG immunoglobulin heavy chains and immunoglobulin light chains the frequency of occurrence of individual BCR sequences and the ranking are performed. 4).
  • BCR sequences whose frequency of occurrence is greatly increased in the affected mice compared to the control mice are extracted and ranked. A combination of the highest ranking BCR sequences induced by administration of these antibodies is identified as a MOG-specific antibody gene. 5).
  • the full-length human immune fibrillin sequence is cloned from the BCR gene amplification product amplified from the affected mouse by PCR-cloning method.
  • Each of an IgG immunoglobulin heavy chain and an immunoglobulin light chain is cloned into an antibody expression vector.
  • CHO Choinese Hamster Ovary
  • the CHO cell culture medium is recovered, and the secreted antibody protein is recovered by purification with a Protein A affinity column and concentration by gel filtration. 8).
  • the binding activity against MOG35-55 or MOG protein is measured by ELISA assay using the collected antibody, and the specificity of the antibody is verified. 9.
  • an antibody expression stable expression cell line is obtained, and a human anti-MOG antibody is produced by a mass culture system.
  • Block primer GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC (SEQ ID NO: 1)
  • RT primer AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA (SEQ ID NO: 2)
  • Template switch Oligo 3 '3 bases are RNA): AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG (SEQ ID NO: 3)
  • Block primer and RT primer are reverse primers specific for the constant region of mouse TCR ⁇ chain. The entire sequence is designed to hybridize to TCR ⁇ mRNA.
  • RT primer is designed to be 4 bases nested on the 3 'side. The RT primer has a 5 'extension of 8 bases to increase affinity.
  • a reverse transcription template switching PCR using these primers By performing reverse transcription template switching PCR using these primers, it is possible to amplify from the constant region of the mRNA encoding the TCR ⁇ chain to the 5 ′ end.
  • the amplified region includes a reconstructed VDJ containing an antigen recognition site, an untranslated region, and the like. Therefore, a reverse transcription template switching PCR using these primers as a template for total RNA collected from the T cell population can be used to construct a cDNA library for the antigen recognition site and untranslated region of the TCR ⁇ chain. it can.
  • single-cell T cells sorted with a cell sorter or the like are used as they are as templates (intracellular RNA becomes a template), the antigen recognition site of each cell's TCR ⁇ chain is specifically amplified and its sequence determined. can do.
  • reverse transcription template switching PCR was performed in one step.
  • a reaction mixture having the composition shown in the following table was used.
  • composition of the reaction mixture and a part of the thermal cycling conditions were appropriately changed according to the test contents.
  • -Forward Tag primer v1 (63 bases): GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG (the underlined part is the tag sequence site) (SEQ ID NO: 7) -Reverse Tag primer v1 (63 bases): TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC (Underline is the tag sequence site) (SEQ ID NO: 8) -Index primer: Nextera XT Index Kit v2 Set A (Illumina) N7 series 12 species (SEQ ID NO: 9-20), S5 series 8 species (SEQ ID NO: 21-28).
  • the index sequences in the N7 series primers are as follows. TCGCCTTA (N701), CTAGTACG (N702), TTCTGCCT (N703), GCTCAGGA (N704), AGGAGTCC (N705), CATGCCTA (N706), GTAGAGAG (N707), CAGCCTCG (N710), TGCCTCTT (N711), TCCTCTAC (N712), TCATGAGC (N714), CCTGAGAT (N715)
  • the index sequences in the S5 series primers are as follows.
  • CTCTCTAT S502
  • TATCCTCT S503
  • GTAAGGAG S505
  • ACTGCATA S506
  • AAGGAGTA S507
  • CTAAGCCT S508
  • CGTCTAAT S510
  • TCTCTCCG S5
  • RNA preparation In this test, Total RNA was extracted from lymphocyte cells derived from a genetically modified mouse (Pmel-1 mouse) overexpressing a specific TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain.
  • the spleen repertoire was analyzed by the one-step reverse transcription template switch PCR repertoire analysis method.
  • the specimens used in the experiment were C57BL / 6 mouse spleen tissue specimens and Pmel-1 mouse-derived lymphocyte cells collected 48 hours after stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.
  • -Forward Tag primer v1 (63 bases): GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG (the underlined part is the tag sequence site) (SEQ ID NO: 7) -Reverse Tag primer v1 (63 bases): TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC (Underline is the tag sequence site) (SEQ ID NO: 8) -Index primer: Nextera XT Index Kit v2 Set A (Illumina) N7 series 12 species (SEQ ID NO: 9-20), S5 series 8 species (SEQ ID NO: 21-28).
  • the index sequences in the N7 series primers are as follows. TCGCCTTA (N701), CTAGTACG (N702), TTCTGCCT (N703), GCTCAGGA (N704), AGGAGTCC (N705), CATGCCTA (N706), GTAGAGAG (N707), CAGCCTCG (N710), TGCCTCTT (N711), TCCTCTAC (N712), TCATGAGC (N714), CCTGAGAT (N715)
  • the index sequences in the S5 series primers are as follows.
  • CTCTCTAT S502
  • TATCCTCT S503
  • GTAAGGAG S505
  • ACTGCATA S506
  • AAGGAGTA S507
  • CTAAGCCT S508
  • CGTCTAAT S510
  • TCTCTCCG S5
  • RNA preparation In order to perform TCR ⁇ repertoire in this test, RNA was extracted from spleen tissue and lymphocyte cells.
  • reverse transcription template switching PCR can be expected to be performed in a single step with high specificity. In particular, even when the number of RNA copies used as a template is small and the number of PCR cycles is increased, it can be expected to amplify a specific PCR product while suppressing the occurrence of side reactions.
  • reverse transcription template switching PCR technology a specifically amplified nucleic acid sample is provided, which is particularly useful in clinical application situations where quantitative analysis is particularly required.

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Abstract

本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、(1)該被験体から得られたRNAから、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを利用して増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含む、方法を提供する。

Description

ワンステップ逆転写テンプレートスイッチＰＣＲを利用したＴ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパトア解析システム
　本発明は、ワンステップで、逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための技術およびこの技術を利用したT細胞受容体(TCR)またはB細胞受容体(BCR)レパトア解析システムに関する。
　逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse　Transcription　Polymerase　Chain　Reaction;　RT-PCR）は、RNAを鋳型として、特定の遺伝子を増幅する手法として、遺伝子工学の分野において汎用されている。RT-PCRにおいては、まず、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）を用いてRNAをcDNAに逆転写し、さらに耐熱性DNAポリメラーゼによりこのcDNAを検出可能なレベルにまで増幅させる。この反応のコンビネーションは、オーソドックスには、ツーステップ（反応ごとに別のチューブを用い、継続して反応させる）で行われるが、逆転写酵素や反応溶液組成の工夫により、この反応のコンビネーションをワンステップ（1つのチューブ中で連続して反応させる）で行う技術が開発されている。
　テンプレートスイッチング（Template　Switching）は、鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合でも、そのRNAを鋳型とするRT-PCR増幅を可能とする技術である。テンプレートスイッチングにおいては、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達すると、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に特定の短い配列（例えば、Moloney　Murine　Leukemia　Virus由来の逆転写酵素（MMLV　RT）の場合は、シトシンリッチな短い配列）が自動的に付加される現象を利用する。この短い付加配列に相補的な配列を、アンカー配列の3’末端に付加したオリゴヌクレオチド（テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）を逆転写時に系内に加えると、当該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが合成されたcDNAの3’末端にハイブリダイズし、逆転写酵素のための鋳型を延長する。逆転写酵素は鋳型を乗り換え、アンカー配列の5’末端までcDNA合成を続けるため、cDNAの3’端にアンカー配列に相補的な配列が付加される。逆転写のプライマーとして、鋳型RNA中の特定の配列に相補的な配列を含むオリゴDNAか、特定の既知配列が5’末端に付加されたオリゴDNAを用いることにより、新たに合成されるcDNAは5’末端にも既知配列を有するので、結果として新たに合成されるcDNA（アンチセンス鎖）は、5’末端と3’末端の両端に既知配列を備えることとなる。従って、これらの既知配列に基づき設計されたプライマーセットを用いることにより、PCR増幅が可能となる。
　ポリ（A）テイルを有するmRNAに対応するcDNAの合成は、ランダムプライマーまたはポリ（A）テイルに相補的なオリゴ（dT）含有プライマーを用いた逆転写によって達成される。この反応においては、ポリ（A）テイルを有する全てのmRNAから、cDNAが合成されるので、cDNAライブラリーが構築される。一方、特定の遺伝子に特異的なプライマーを逆転写において用いることにより、特定の遺伝子のcDNAのみを特異的に合成することが可能となる。
　ハイスループットへ適用可能とするように、より迅速に、より簡便に、且つ高い特異性で、逆転写テンプレートスイッチングPCRを行う技術が求められている。
　ところで、PCRにおける副反応を回避する技術として、種々のホットスタート技術が開発されている。即ち、PCRを行う際に、反応液を調製してからサーマルサイクラーの温度が上昇するまでの間、PCR反応混合液は室温～50℃という温度にさらされる。プライマーのTmは通常、50℃以上に設定されるので、この温度域ではプライマーの特異性が充分発揮されない。一方、この温度域でもポリメラーゼは弱いながら活性を示すため、ミスアニールしたプライマーを起点とした伸長が生じ、様々な副反応（プライマーダイマー、エキストラバンド等）の原因となる。この副反応を回避する技術として、熱不安定性の修飾基が結合したオリゴヌクレオチドプライマーが開発されている（特許文献1及び2、非特許文献1及び2）。このオリゴヌクレオチドプライマーにおいては、1以上のヌクレオチド間結合或いは3’末端ヒドロキシル基に修飾基が置換している。この修飾基による保護のため、PCR増幅における最初の高温でのインキュベーション期間前におけるDNAポリメラーゼ媒介性オリゴヌクレオチドプライマー伸長が抑制される。修飾基の存在のため、プライマーは、最初の変性温度（多くの場合95℃）に達するまでは不活性状態にある。最初の変性温度に到達すると、修飾基が離脱することにより、ポリメラーゼによる伸長の可能な、対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーとなる。
　近年、急速に進歩した次世代シーケンス解析技術により大規模な遺伝子の塩基配列決定が可能になった。ヒト試料からTCR遺伝子をPCR増幅し、次世代シーケンス解析技術を利用することで、従来は小規模かつV鎖使用頻度など限られた情報を得るTCRレパトア解析から、クローンレベルのより詳細な遺伝子情報を入手して解析する次世代TCRレパトア解析法が実現できるようになった。特許文献3は、アダプタープライマーにより非バイアス的に増幅された核酸試料を用いてT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法を開示する。
米国特許第８１３３６６９号明細書 米国特許第８３６１７５３号明細書 国際公開第2015/075939号
Curr　Protoc　Nucleic　Acid　Chem.　2009　Sep;　Chapter　4:　Unit　4.35　1-17 Nucleic　Acids　Res.　2008　Nov;　36(20):e131
　本発明は、より迅速に、より簡便に、且つ高い特異性で、逆転写テンプレートスイッチングPCRを行う技術を提供する。本発明はまた、逆転写テンプレートスイッチングPCRを応用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法を提供する。
　本発明を以下に詳細に説明する。本発明者は、逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいて、逆転写用のプライマーとして、特定の遺伝子に特異的なプライマーを使用し、且つPCR用のプライマーセットとして、テンプレートスイッチングプライマー中のアンカー配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記逆転写用のプライマーとの組み合わせを使用し、ワンステップ（同一の反応系において一段階）で、逆転写とPCRの反応コンビネーションを実施してみた。しかしながら、この方法では、副反応が生じてしまい、特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした時に、この傾向が顕著だった。副反応が生じる原因として、PCRの特異性が逆転写用のプライマーのみに依存すること、鋳型RNAのコピー数に対して、逆転写用プライマーが大過剰に存在するため、逆転写用プライマーが非特異的に鋳型RNAにハイブリダイズし、非特異的な逆転写が生じてしまうことが考えられた。
　そこで、上記反応コンビネーションにおいては、逆転写用プライマーが、逆転写のみならずPCRにおけるプライマーとしても使用されるが、これを改め、逆転写用プライマーと同一のオリゴヌクレオチドの3’末端OHを、熱不安定性の修飾基で保護して不活化したプライマー（以下、不活化したプライマーをブロックプライマーと呼ぶことがある）を、PCR用のプライマーとし、逆転写用プライマーの添加量を減らすことにより、副反応の発生を抑制することに成功した。この方法によると、逆転写において、逆転写用プライマーとブロックプライマーが鋳型RNAにハイブリダイズするが、ブロックプライマーは修飾基による保護のため、逆転写に寄与することが出来ず、逆転写用プライマーのみを起点に逆転写が生じる。ブロックプライマーは、仮に非特異的に鋳型RNAにハイブリダイズしたとしても、逆転写産物を生じない。PCR増幅における最初の高温でのインキュベーションにより、ブロックプライマーから修飾基が離脱して未修飾プライマーに変換されると、伸長反応に寄与可能となるため、PCRが進行する。驚くべきことに、未修飾の逆転写用プライマーを添加せずに、ブロックプライマーのみを添加して、ワンステップで逆転写テンプレートスイッチングPCRを行っても、高い特異性を持ったPCR増幅を達成することができた。
　本発明は、上記ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを応用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析することに応用したものである。
　本発明者は、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明を含む： 
［1］改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
核酸の増幅反応は、RNAを鋳型とする逆転写工程a)と、工程a)で合成されたcDNAにテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを付加するテンプレートスイッチング工程b)と、
工程b)で合成されたテンプレートスイッチcDNAを鋳型とするPCRによるDNA増幅工程c)、からなり、前記工程a)～c)は同一の反応系において一段階で行われ、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、DNA増幅工程c)ではプライマー機能の阻害が解除されることを特徴とする、核酸の増幅方法。
［2］以下の工程：
1）i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びにiii)鋳型RNA、を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部の領域をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）を含む、組成物を提供すること；
2）1）で提供された組成物を、逆転写が進行可能な温度でインキュベートすることにより、該鋳型RNAから、アンカー配列に相補的なヌクレオチド配列が3’末端に付加されたcDNAを生成し、該cDNAを含む反応混合液を得ること；及び
3）2）で得られた反応混合液を、PCRが進行可能な複数回の熱サイクリングプロトコールに付すことにより、該cDNAを鋳型として、前記プライマーセットにより挟まれた領域が増幅された核酸を得ること
を含む、改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又はPCRの初期熱変性処理によって、プライマー機能の阻害が解除される、方法。
［3］1）で提供される組成物が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、［2］記載の方法。
［4］改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［1］～［3］のいずれかに記載の方法。
［5］該改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［4］記載の方法。
［6］プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［5］記載の方法。
［7］逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が40nM以下である、［1］～［6］のいずれかに記載の方法。
［8］PCRの熱サイクリングの回数が40回以上である、［1］～［7］のいずれか記載の方法。
［9］i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キット。
［10］i)のオリゴヌクレオチド、及びii)のプライマーセットを、両者の混合物を含む組成物として含む、［9］記載のキット。
［11］更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［9］又は［10］記載のキット。
［12］逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［9］又は［10］記載のキット。
［A1］　対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、
　a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該cDNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程と
を含み、
　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
［A2］　対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、
　a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程と
を含み、
　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
［A3］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［A1］または［A2］に記載の方法。
［A4］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［A3］に記載の方法。
［A5］　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、［A1］～［A4］のいずれか一項に記載の方法。
［A6］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A1］～［A5］のいずれか一項に記載の方法。
［A7］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［A1］～［A6］のいずれか一項に記載の方法。
［A8］　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［A7］記載の方法。
［A9］　対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
　i)逆転写に必要な試薬と、
　ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
　iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
　iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
　i)～iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キット。
［A10］　前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［A9］に記載のキット。
［A11］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［A10］に記載のキット。
［A12］　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、［A9］～［A11］のいずれか一項に記載のキット。
［A13］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A9］～［A12］のいずれか一項に記載のキット。
［A14］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［A9］～［A13］のいずれか一項に記載のキット。
［A15］　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［A14］に記載のキット。
［A16］　改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するための組成物であって、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件でプライマー機能の阻害が解除されるように設計されており、プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、組成物。
［A17］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A16］に記載の組成物。
［A18］　前記組成物は、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRにおいて使用されるものである、［A16］または［A17］に記載の組成物。
［B1］　被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、
　(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
　(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、
　(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
を含み、
　該工程(1)は、
　a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
を含み、
　該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
［B2］　被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、
　a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
を含み、
　該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
［B3］　前記核酸試料は、非バイアス的に増幅された核酸試料である、［B1］または［B2］に記載の方法。
［B4］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、［B1］～［B3］のいずれか一項に記載の方法。
［B5］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まず、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B1］～［B4］のいずれか一項に記載の方法。
［B６］　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、［B1］～［B5］のいずれか一項に記載の方法。
［B7］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む［B1］～［B6］のいずれか一項に記載の方法。
［B8］　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B1］～［B7］のいずれか一項に記載の方法。
［B9］　T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
　i)逆転写に必要な試薬と、
　ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
　iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
　iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
　i)～iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、
　ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
　該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キット。
［B10］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［B9］に記載のキット。
［B11］　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［B9］または［B10］に記載のキット。
［B12］　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、［B9］～［B11］のいずれか一項に記載のキット。
［B13］　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［B9］～［B12］のいずれか一項に記載のキット。
［B14］　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、前記TCRまたは該BCRの鋳型RNAのC領域の部分配列にハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B9］～［B13］のいずれか一項に記載のキット。
［B15］　被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのものである、［B9］～［B14］のいずれか一項に記載のキット。
［B16］　前記工程(1)は、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含む、［B1］、ならびに［B1］に従属する場合の［B3］～［B8］に記載の方法。
［B17］　前記配列解析のために適切な配列は、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列である、［B16］に記載の方法。
［B18］　前記工程(1)は、以下：
　c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
　d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程と
をさらに含む、［B1］、［B1］に従属する場合の［B3］～［B8］、［B16］または［B17］に記載の方法。
［B19］　前記工程(3)は、以下：
　(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、
　(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、
　(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、
　(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、
　(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、
　(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
を含む、［B1］、［B1］に従属する場合の［B3］～［B8］、［B16］、［B17］または［B18］に記載の方法。
［B20］　データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
(1)［B9］～［B15］のいずれか一項に記載のキット；
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
(3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置
を備えるシステム。
［B21］　(1)前記キットは、以下：
　c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、
　d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段と
をさらに含む、［B20］に記載のシステム。
［B22］　(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：
　(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；
　(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
　(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
　(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；
　(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および
　(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段
を備える、［B20］または［B21］に記載のシステム。
［B23］　［B20］～［B22］のいずれか一項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステム。
［B24］　［B23」に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本発明によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。
種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 シングルセルのT細胞を鋳型として用いた、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。上側の矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。下側の矢印は、TCRβ鎖断片のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、TCRβ鎖のターゲット配列全長のバンドを示す。 インデックスPCR反応液の電気泳動写真。左のレーンは、マーカーDNA、右のレーンは、Pmel-1由来リンパ球より抽出したRNAから増幅したDNAのバンドを示す。 Pmel-1マウス由来リンパ球細胞から得られたV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ。 Pmel-1マウス由来リンパ球細胞から得られたV-J使用頻度グラフ。 インデックスPCR反応液の電気泳動写真。各レーンは、左から順に、1：マーカーDNA、2～6：マウス脾臓組織（1000ng、200ng、40ng、8ng、1.6ng）、7～8：Pmel-1由来リンパ球（8ng、1.6ng）、9：blankを示す。 C57BL/6マウス脾臓組織から得られたV遺伝子およびJ遺伝子それぞれの使用頻度グラフ。 C57BL/6マウス脾臓組織から得られたV-J使用頻度グラフ。 本発明のレパトア解析システムのブロック図。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、数値の前の「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本発明は、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRにより、鋳型RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法に関する。
　逆転写テンプレートスイッチングPCRは、鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合にでも、そのRNAを鋳型とするRT-PCR増幅を可能とする技術である。逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいては、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達すると、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に特定の短い配列が自動的に付加される現象を利用する。例えば、Moloney　Murine　Leukemia　Virus由来の逆転写酵素（MMLV　RT）は、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加する。この短い付加配列に相補的な配列を、特定のアンカー配列（第1のアンカー配列）の3’末端に付加したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）を逆転写時に系内に加えると、cDNAの3’末端の付加配列と、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの3’末端の当該付加配列の相補配列との間の相互作用を介して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが合成されたcDNAの3’末端にハイブリダイズし、逆転写酵素のための鋳型を延長する。その結果、逆転写酵素は、鋳型RNAの5’末端に達すると、鋳型をテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに乗り換え、その5’末端までcDNA合成を続けるため、cDNAの3’端に、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドのアンカー配列（第1のアンカー配列）に相補的な配列が付加される。逆転写のプライマーとして、鋳型RNA中の特定配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーか、特定のアンカー配列（第2のアンカー配列）が5’末端に付加したオリゴヌクレオチドプライマー（ランダムプライマー、オリゴ（dT）プライマー等）を用いることにより、新たに合成されるcDNAは5’末端にも既知配列を備える。その結果、当該既知配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記第1のアンカー配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、新たに合成されたcDNAを鋳型とするPCR増幅が可能となる。
　いくつかの実施形態では、鋳型RNAの5'末端側の配列が既知である場合は、テンプレートスイッチを行わなくてもよい。
　本発明の方法においては、「ワンステップ（一段階）」で逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施する。「ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR(RT-TS-PCR)」とは、逆転写、テンプレートスイッチおよびPCRに必要な試薬を反応開始時においてすべて混合しておき、さらなる逆転写に必要な試薬も、テンプレートスイッチに必要な試薬も、PCR増幅に必要な試薬も追加せずに、好ましくは、反応系を開放せずに（即ち、チューブの開閉や試薬の添加を行わずに）、同一の反応系において反応を進行することを特徴とする、逆転写反応からの核酸増幅方法を意味する。
　即ち、本発明の方法において、核酸の増幅反応は、RNAを鋳型とする逆転写工程a)と、工程a)で合成されたcDNAにテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを付加するテンプレートスイッチング工程b)と、工程b)で合成されたテンプレートスイッチcDNAを鋳型とするPCRによるDNA増幅工程c)、からなり、前記工程a)～c)は同一の反応系において一段階で行われる。
　また、別の態様において、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供する工程であって、該混合は、必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬を混合することを含む、工程と、b)該混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程とを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法を提供する。
　さらに、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供する工程であって、該混合は、必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬を混合することを含む、工程と、b)該混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程とを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法を提供する。
　鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合、テンプレートスイッチを実施することによって、鋳型RNAの5'末端に特定のアンカー配列を付加することができるため有利である。一方、鋳型RNAの5'末端側の配列が既知である場合は、テンプレートスイッチを行わなくてもよい。
　一態様において、前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
　驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、本方法において使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で含む。
　本発明の方法は、PCRにおける少なくとも一方のオリゴヌクレオチドプライマーとして、改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、PCRの核酸増幅の工程ではプライマー機能の阻害が解除される。このことによって、同一の反応系にありながら逆転写反応段階とPCRの核酸増幅段階の各段階で使われるプライマーを機能的に分けることが達成され、各反応段階におけるプライマー濃度を大きく差をつけることを特徴とする。
　プライマー機能の阻害・解除する手段として、例えば、以下のアプローチが挙げられる。１）熱不安定性修飾基を含む、または逆転写反応段階では折り畳み構造を保持するように設計されたプライマーによって逆転写時のプライマー機能を阻害する。
　逆転写反応後、熱処理によって熱不安定修飾基の乖離または折り畳み構造の解消により、プライマー機能の阻害が解除される。
２）人工塩基を含むプライマーによって逆転写反応段階ではプライマーとして機能を阻害する。
　逆転写反応の結果、逆転写反応によって鋳型RNAから、プライマー中に含まれる人工塩基と対をなす核酸が組み込まれたcDNAを合成され、当該人工核酸に対してプライマーがアニーリング可能となり、プライマー機能の阻害が解除される。
　ワンステップRT-PCRにおいては、一般的に、逆転写の開始時点において、反応系内に、鋳型RNAをcDNAに逆転写するために必要な全ての試薬と、得られたcDNAを鋳型としてPCRを行うために必要な全ての試薬が含まれる。PCRプライマーのTmは通常50℃以上に設定されるので、逆転写が進行可能な温度域（例えば、42℃）では、プライマーの特異性が十分発揮されない可能性がある。また、PCRにおいては鋳型のコピー数が指数関数的に増加するため、必要とされるPCRプライマーの濃度は、逆転写用のプライマー濃度よりも圧倒的に高い。従って、逆転写を行う際に、PCRプライマーが鋳型RNAにミスアニールし、そこを起点とした非特異的逆転写を生じ、最終的に非特異的なPCR産物を生じてしまうおそれがある。本発明においては、PCRにおけるリバースプライマーとして、改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、非特異的逆転写を抑制することができる。
　本明細書において、「オリゴヌクレオチド」、「プライマー」、又は「オリゴヌクレオチドプライマー」は、通常は一本鎖であるポリヌクレオチドを表す。天然に生ずるものであっても合成のものであってもよい。通常は約5－約50ヌクレオチド，より好ましくは約10－約30ヌクレオチド，またはより好ましくは約15－約25ヌクレオチドの配列から構成される。オリゴヌクレオチドには、DNA、RNA、DNA／RNAキメラが包含される。
　本明細書において、「フォワードプライマー」との用語は、RT-PCRにおける鋳型RNAをセンス鎖としたときに、そのアンチセンス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。「リバースプライマー」は、センス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。
　一態様において、本発明に用いられる改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。該部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10～40塩基、好ましくは15～30塩基、より好ましくは18～25塩基である。該部分配列は、鋳型RNAに含まれる増幅を意図する領域の3’末端の部分配列であり得る。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’末端に、付加配列を含んでいてもよい。付加配列は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを避ける観点から、好適には、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含まない。付加配列としては、例えば、特定の制限酵素認識配列を挙げることが出来る。付加配列の長さは、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを避けるため、短い方が好ましい。付加配列の長さは、通常1～50塩基、好ましくは1～30塩基、より好ましくは1～10塩基である。一態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列からなり、付加配列を含まない。
　本発明に用いられる改変オリゴヌクレオチドプライマーにおける改変の態様として、例えば、以下を挙げることができる。
（1）熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
（2）同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループ形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
（3）人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
　以下各態様について詳述する。
（1）熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
　本態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーが熱不安定性修飾基を含むことにより、修飾ヌクレオチドプライマーは、これがハイブリダイズしたポリヌクレオチドに沿って鎖を伸長することができず、すなわち，酵素の阻害により，または標的核酸へのハイブリダイゼーションの低下により、伸長可能ではない。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーの1又はそれ以上のヌクレオチド間結合又は3’末端ヒドロキシル基に、熱不安定性修飾基が置換する。したがって，鎖伸長は，修飾または修飾されたヌクレオチドが除去されないかぎり，そして除去されるまで，実質的な程度では生じない。該修飾基は熱不安定性であるが、PCR増幅における最初の変性温度（例えば、約80－105℃、好ましくは約85－100℃、より好ましくは約90－96℃（例、95℃））に到達するまでは、殆ど解離しないため、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害される。最初の変性温度に到達すると、修飾オリゴヌクレオチドプライマーからの修飾基の部分的または完全な解離が熱的に誘導され、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。未修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長が可能である。
　熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマーとしては、US　patent　No.　8133669（開示内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる）に開示された、3’末端のヒドロキシル基が、熱不安定性修飾基に置換された修飾オリゴヌクレオチドプライマー、US　patent　No.　8361753（開示内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる）に開示された、1又はそれ以上のヌクレオチド間結合において熱不安定性修飾基を含む修飾オリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。
（1-1）　3’末端のヒドロキシル基が、熱不安定性修飾基に置換された修飾オリゴヌクレオチドプライマー（US　patent　No.　8133669）
　一態様において、該修飾オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端に含まれる該修飾基は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
［式中、
Z10は、O、S、およびSeからなる群から選択され；
各R7、各R8、各R9、および各R10は、水素、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、1～20個の炭素原子、好ましくは1～10個の炭素原子、好ましくは1～6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
各X6、各X7、各X8、および各X9は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各X10は、O、S、Se、NR11、N-OR11、およびCR11R12からなる群から独立に選択され；各R11および各R12は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から独立に選択される］
からなる群から選択されるいずれかの基である。
　好ましい態様において、該修飾基は、O-（p-トルエン）スルホネート；O-リン酸；O-硝酸；O-［4-メトキシ］テトラヒドロピラニル；O-［4-メトキシ］-テトラヒドロチオピラニル；O-テトラヒドロチオピラニル；O-［5-メチル］-テトラヒドロフラニル；O-［2-メチル，4-メトキシ］-テトラヒドロピラニル；O-［5-メチル］-テトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロフラニル；O-フェノキシアセチル；O-メトキシアセチル；O-アセチル；O-C（O）-OCH3；O-C（O）-CH2CH2CN；およびO-C（S）-OCH3からなる群から選択される。一部の特に好ましい形態において、該修飾基は、O-メトキシテトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロピラニル；およびO-テトラヒドロフラニルからなる群から選択される。
　別の態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、式V
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
［式中、
Z3は3’-O-オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
Bは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、任意のNTP類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
Aは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から選択され；
各R1および各R2は、H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、NR3R4、C（Y）R5、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Yは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から独立に選択され；
各R3および各R4は、H、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各R5は、H、F、Cl、Br、OR3、SR3、NR3R4、ならびに置換または非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
X4は、R1、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、C（Y）R5、NO2、CN、およびSSR3からなる群から独立に選択され；
X5は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から選択され；
Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、CR6R7、およびC（Y）からなる群から選択され；
各R6および各R7は、水素、また、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、
1～20個の炭素原子、好ましくは1～10個の炭素原子、好ましくは1～6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
X5およびY1は各々、場合によって、式IBで示されるNTP分子のX4、X5、Z3、A、W、またはB部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合する可能性がある］
で表される化合物である。
　式Vの特定の実施形態において、Bは、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、アミノアリルウラシル、7-デアザグアニン、7-デアザ-7-メチルグアニン、7-デアザ-7-ヨードグアニン、7-デアザ-7-アミノアリルグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、7-デアザデニン、2，6-ジアミノプリン、5-ニトロシトシン、5-アミノアリルシトシン、5-（ビオチン-16）-シトシン、5-（フルオレセイン-11）-シトシン、4-メチルアミノ-シトシン、および2-チオ-5-メチルウラシル、または4-チオ-5-メチルウラシルである。
　式Vの好ましい実施形態において、Bは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
　好ましい態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
からなる群から選択されるいずれかの化合物である。
　上記1-1の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、US　patent　No.　8361753に記載された方法により製造することができる。
（1-2）　1又はそれ以上のヌクレオチド間結合において熱不安定性修飾基を含む修飾オリゴヌクレオチドプライマー（US　patent　No.　8361753）
　1つの態様においては、該修飾オリゴヌクレオチドプライマー中の修飾基は、式I：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
［式中、
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；
Xは、O、S、S（O）、S（O）2、C（O）、C（S）またはC（O）NHであり；および
R1は、水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、より好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を含む。
　1つの態様において、修飾基は、式Ia：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
［式中、
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、より好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
　式Iaの修飾基の好ましい態様は以下のとおりである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
4-オキソ-1-ペンチル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
5-オキソ-1-ヘキシル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
6-オキソ-1-ヘプチル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
4-オキソ-1-ヘキシル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
5-メチル-4-オキソ-1-ヘキシル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
2-メチル-5-オキソ-ヘキシル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
1-エチル-4-オキソ-ペンチル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
1-メチル-4-オキソ-ペンチル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
1、1-ジメチル-4-オキソ-ペンチル、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
4-オキソ-1-オクチル
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
4-オキソ-1-テトラデシル、および
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
4-オキソ-1-エイコサミル。
　1つの態様において、修飾基は式Ib：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
［式中、
kは0－2の整数であり；
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は、水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、より好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
　好ましい態様において、式Ibの修飾基は下記に示す4-メチルチオ-1-ブチルである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
　1つの態様においては、修飾基は式Ic：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  
［式中、
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は、水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、より好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
　好ましい態様において、式Icの修飾基は下記に示す3-（N-tert-ブチルカルボキサミド）-1-プロピルである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  
　1つの態様において、修飾基は式Id：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  
［式中、
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
各R1は、独立して、水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、より好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
　修飾基式Idの好ましい態様として、2-（N-ホルミル-N-メチル）アミノエチルまたは2-
（N-アセチル-N-メチル）アミノエチルが挙げられる（下記に示す）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  
2-（N-アセチル-N-メチル）アミノエチル
　別の態様において、修飾基は式II：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  
［式中、
Lは、1－10個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
R2は、水素、シアノ、または5－10個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環、複素環、アリールまたはヘテロアリールである］
の化合物を提供する。
　好ましい態様において、式IIの修飾基は下記に示すN-（2-ヒドロキシエチル）-フタルイミドである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
  
N-（2-ヒドロキシエチル）-フタルイミド
　別の態様において、修飾基は式III：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
  
［式中、
LaおよびLbは、それぞれ独立して、単結合、または1－8個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Aは、O、S、S（O）、S（O）2、Se、CR3R4、NR3、C（O）、C（S）またはCNR3であり；
Bは、C（O）R3、C（S）R3、C（O）NR3R4、OR3またはSR3であり；および
R3およびR4は、それぞれ独立して、水素または1－20個の炭素原子、好ましくは1－10個の炭素原子、好ましくは1－6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
　別の態様において、修飾基は、式IV：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  
［式中、
La、LbおよびLcは、それぞれ独立して、単結合、または1－8個の炭素原子、好ましくは2－5個の炭素原子、より好ましくは3－4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Dは、O、S、S（O）、S（O）2、CR5R6、またはNR5であり；
Eは、O、S、S（O）、S（O）2、CR5R6、またはNR6であり；
Fは、水素、C（O）R7、C（S）R7、C（O）NR7R8、OR7またはSR7であり；
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアミノであってもよく、またはR5およびR6は、一緒になって、5－10個の原子からなり、D、R5、R6、EおよびLbを含む単環または二環を形成してもよく、ただし、R5およびR6が一緒になって環を形成する場合、nは0－2であり；および
R7およびR8は、それぞれ独立して、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、任意に置換されていてもよいシクロアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールオキシ、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールから選択される］
の化合物を提供する。
　R5およびR6が一緒になって環を形成する式IVの化合物の1つの態様において、修飾基は下記に示すメトキシメチル-シクロヘキシ-1、3-イル-エチルである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
  
メトキシメチル-シクロヘキシ-1、3-イル-エチル
　1つの態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、構造I：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
  
［式中、
Nucはプライマー配列中のヌクレオシドであり；
UおよびZは、独立して、O、S、Se、NR9、またはCR9R10であり；
R9およびR10は、それぞれ独立して、水素、または1－10個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれは独立して、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミドまたは検出可能な標識から選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよく；
Yは、O、SまたはSeであり；
Wは、Qが熱的に切断されることを可能とする任意の化学成分、例えばO、S、S（O）、S（O）2、Se、C（O）、C（S）、C（O）NH、C（N）H、NH、-C（＝NR11）-またはNR9であり；
R11は、水素または1－10個の炭素原子、好ましくは1－6個の炭素原子を有する任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは、R11は、H、アルキルまたは低級アルキルであり；および
Qは1またはそれ以上の熱切断性基を含む修飾基である］
の修飾骨格を有する。
　1つの態様において、修飾基Qは、上記式I、Ia、Ib、Ic、Id、II、IIIまたはIVから選択される1またはそれ以上の熱切断性基を含む。
　修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも1つのヌクレオチド間結合において、上述のいずれかの修飾基を含む。修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、1またはそれ以上の、上述のいずれかの修飾基を含む。修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端の最後の6個のヌクレオチド間結合のいずれか、好ましくは最後の3個のヌクレオチド間結合のいずれかに、1またはそれ以上の上述のいずれかの修飾基を含む。
　別の態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーの3’－末端で終わる2、3、4、5または6個の修飾ヌクレオチド間結合の連続する配列を含むことができる。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、複数の非連続的3’修飾ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの5’－末端も、修飾ヌクレオチド間結合を含むヌクレオチドの配列を有していてもよい。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合が修飾されていてもよい。
　別の好ましい態様においては、修飾オリゴヌクレオチドプライマーはオリゴヌクレオチドプライマーの3’nヌクレオチド間結合に修飾基を含み、ここでnは3’末端のヌクレオチド間結合である。さらに別の態様においては、修飾基は、オリゴヌクレオチドの3’n－1、n－2、n－3またはn－4ヌクレオチド間結合に存在する。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドは、n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の2またはそれ以上；好ましくはn、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の2またはそれ以上；好ましくはn、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の3またはそれ以上；好ましくはn、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の4またはそれ以上；好ましくはn、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の5またはそれ以上、または好ましくはn、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5またはn－6位の6またはそれ以上に修飾基を有する。
　上記1-2の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、US　patent　No.　8361753に記載された方法により製造することができる。
（2）同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
　該態様においては、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成する。当該相補領域は、１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成される第１の配列と、それに対して１又はそれ以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む第２の配列の組みを指す。
　第１の配列と第２の配列の位置は、互いに隣接していてもよいが、第１の配列と第２の配列の間には１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを介して位置することでもよい。第１の配列または第２の配列が、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む場合は、第１の配列と第２の配列の相補的結合によって、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされる。従って、この場合において、第１の配列と第２の配列のオリゴヌクレオチドの数は特に限定されない。
　第１の配列または第２の配列が、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含まない場合は、第１の配列と第２の配列のオリゴヌクレオチドの間には鋳型RNAの部分配列に相補的な配列が含まれ、分子内ヘアピンループ形成により、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされる。
　鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされているため、逆転写時においては、鋳型RNAの対応する部分配列にハイブリダイズすることができず、プライマー機能の一部又は全部が阻害されている。しかしながら、PCR増幅における変性温度（例えば、約55－105℃、好ましくは約85－100℃、より好ましくは約90－96℃（例、95℃））においては、ヘアピンループ構造が解離し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列が曝露されるため、引き続く対合温度において、cDNA中の対応する部分配列にハイブリダイズ可能となる（即ち、プライマー機能を獲得する）。ヘアピンループのループ部分の長さは、通常、5～25塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、分子内ヘアピンループを形成することができる限り、特に限定されない。
（3）人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
　該態様の改変オリゴヌクレオチドプライマーは、人工塩基（非天然塩基）を含むので、該改変オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列の相補配列が、鋳型RNA（人工塩基を含まない鋳型RNA）中に実質的に存在しない。そのため、鋳型RNAへの該改変オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションが抑制されているので、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されることになる。一態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の15塩基のうち、1塩基以上、好ましくは、3塩基以上、5塩基以上、10塩基以上、12塩基以上、好ましくは15塩基全てが、人工塩基である。好ましい態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの最も3’末端の塩基が、人工塩基である。
　該態様の改変オリゴヌクレオチドプライマーは、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの人工塩基を含む部分配列を含む、逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて使用される。人工塩基を含む部分配列の長さは、10～40塩基、好ましくは15～30塩基、より好ましくは18～25塩基である。人工塩基を含む部分配列は、特に限定されないが、例えば、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の部分配列であり得る。逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列、及び前記人工塩基を含む部分配列を含み、該人工塩基を含む部分配列は、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’側に付加される。鋳型RNAの部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10～40塩基、好ましくは15～30塩基、より好ましくは18～25塩基である。該部分配列は、鋳型RNAに含まれる増幅を意図する領域の3’末端の部分配列であり得る。逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。
　このような組み合わせを用いて、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うと、逆転写において、5’末端に、改変オリゴヌクレオチドプライマーの人工塩基を含む部分配列が付加されたcDNAが合成されるので、その結果、上記人工塩基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーは、該cDNAを鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する。そして、該cDNAを鋳型とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーを一方のプライマーとするPCR増幅を行うことにより、目的とする領域を特異的に増幅することができる。
　人工塩基としては、Z塩基／F塩基（Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　1997,　94,　105061；Nat.　Struct.　Biol.　1998,　5,　950；Nat.　Struct.　Biol.　1998,　5,　954）、Q塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　1999,　121,　2323）、iso-G塩基／iso-C塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　1989,　111,　8322）、2-チオT（TS）塩基（Nucleic　Acids　Res.　2005,　33,　5640）、P塩基／Z塩基（Nucleic　Acids　Res.　2007,　35,　4238）、PICS塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　1999,　121,　11585）、5SICS塩基／MMO2塩基／NaM塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　2009,　131,　14620）、2-amino-6-dimethylaminopurine（x）／2-oxopyridine（y）（Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　2001,　98,　4922）、2-アミノ-6-(2-チエニル)プリン（s）（J.　Am.　Chem.　Soc.　2005,　127,　17286；Nucleic　Acids　Res.　2005,　33,　e129；Biotechniques　2006,　40,　711）、imidazolin-2-one（z）（J.　Am.　Chem.　Soc.　2004,　126,　13298）、Ds塩基／Pa塩基（Nat.　Methods　2006,　3,　729）、Pn塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　2007,　129,　15549）、Px塩基（Nucleic　Acids　Res.　2009,　37,　e14）、xA塩基、xT塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　2004,　126,　11826）、Im-NO塩基／Na-ON塩基、Im-ON塩基／Na-NO塩基（J.　Am.　Chem.　Soc.　2009,　131,　1644；Angew.　Chem.　Int.　Ed.　2005,　44,　596）等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの人工塩基は、以下の塩基対を形成することにより、逆転写及び／又はPCR増幅に寄与し得る：Z-F塩基対、Q-F塩基対、isoG-isoC塩基対、A-TS塩基対、P-Z塩基対、PICS-PICS塩基対（自己相補的）、5SICS-MMO2塩基対、5SICS-NaM塩基対、x-y塩基対、s-y塩基対、s-z塩基対、Ds-Pa塩基対、Ds-Pn塩基対、Ds-Px塩基対、xA-T塩基対、A-xT塩基対、Im-NO-Na-ON塩基対、Im-ON-Na-NO塩基対。
　以下に、本発明の方法を、更に詳細に記載する。
　本発明の方法においては、まず、
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びに
iii)鋳型RNA
を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）を含む、組成物が提供される。
　テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達した時に、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に付加される配列（単に、RT付加配列という場合がある）に相補的な配列、及びアンカー配列を含み、RT付加配列の相補配列の5’末端にアンカー配列（第1のアンカー配列）が付加されている。好ましくは、RT付加配列の相補配列は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する。RT付加配列は、逆転写酵素の種類に依存する。例えば、Moloney　Murine　Leukemia　Virus由来の逆転写酵素（MMLV　RT）は、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加するので、その相補配列であるグアニンリッチな短い配列（例、GG、GGG、GGGG）が、RT付加配列の相補配列として、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれる。アンカー配列とは、オリゴヌクレオチドの5’末端に付加される、人工的な配列を意味する。アンカー配列は自然界に存在しない配列であることが好ましい。アンカー配列の長さは、特に限定されないが、通常、10塩基～100塩基程度、好ましくは15塩基～50塩基程度である。
　テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。逆転写における鋳型として効率的に機能するため、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、好適には、RNA又はDNA／RNAキメラであり、より好ましくはDNA／RNAキメラである。一態様において、RT付加配列の相補配列の部分がRNAであり、アンカー配列の部分がDNA又はDNA／RNAキメラである。テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、以下に説明する5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能する。したがって、いくつかの実施形態では、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーの添加を省略または少量にすることができる。逆転写テンプレートスイッチとPCR増幅を同一の反応系で実施した例はこれまでになく、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが、PCR増幅のフォワードプライマーとして機能することは、本明細書の実施例において初めて実証された。
　5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、上記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列（第1のアンカー配列）の一部または全部を含む。アンカー配列の一部または全部の長さは、通常、10～40塩基、好ましくは15～30塩基、より好ましくは18～25塩基である。PCRにおけるプライマーとして機能し得るよう、DNAまたはDNA／RNAキメラであり、好ましくはDNAである。5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、PCRにおけるフォワードプライマーであり得る。
　鋳型RNAとしては、mRNA、rRNA、tRNA、non-coding　RNA、化学的に合成したRNA等を用いることができるが、これらに限定されない。mRNA、rRNA及びtRNAは、如何なる細胞・組織に由来するものであってもよい。mRNA、rRNA及びtRNAは、セルソーター等を利用して得られた微量の細胞・組織（例えば、シングルセル）から採取されたものであってもよい。mRNA、rRNA及びtRNAは、トータルRNAの一部として含まれるような形態でもよい。
　上記組成物には、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）が含まれる。該試薬としては、上述のテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、プライマーセット、及び鋳型RNA以外に、以下を挙げることが出来る。
・逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）
・耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）
・dNTPs混合物
　cDNAの3’末端にRT付加配列を形成するため、使用する逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素としては、Moloney　Murine　Leukemia　Virus由来の逆転写酵素（MMLV　RT）等が挙げられるが、これらに限定されない。ターミナルトランスフェラーゼ活性は、好ましくは、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加する活性である。
　耐熱性DNAポリメラーゼとしては、代表的にはTaq、Tth、KOD、Pfu、Bst等を挙げることができるが、これらに限定されず、PCRに使用可能な様々な耐熱性DNAポリメラーゼが開発されており、いずれも本発明に使用可能である。PCRに使用可能な耐熱性DNAポリメラーゼは当業者に周知であり、適宜選択可能である。
　一態様において、上記組成物は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含むことにより、鋳型RNAにハイブリダイズし、逆転写を開始する。該部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10～40塩基、好ましくは15～30塩基、より好ましくは18～25塩基である。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’末端にアンカー配列（第2のアンカー配列）が付加されていてもよい。第2のアンカー配列は自然界に存在しない配列であることが好ましい。第2のアンカー配列の長さは、特に限定されないが、通常、10塩基～100塩基程度、好ましくは15塩基～50塩基程度である。第2のアンカー配列は、上記第1のアンカー配列と非同一であることが好ましい。一態様において、第2のアンカー配列には、人工塩基が含まれる。一態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、第2のアンカー配列を含まない。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、特定の遺伝子に特異的なプライマー、mRNAのポリAテイルに結合するオリゴdTプライマー、またはランダムヘキサマープライマーのようなランダムプライマーのいずれかであるが、好ましくは、特定の遺伝子に特異的なプライマーである。該プライマーは、目的とする遺伝子をコードするRNA（例、mRNA）の部分配列に相補的な配列を含む。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写におけるプライマーとして機能し得るよう、DNAまたはDNA／RNAキメラであり、好ましくはDNAである。
　一態様において、鋳型RNA上の、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域とが、少なくとも一部重複する。重複するハイブリダイゼーション領域の長さは、通常10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは18塩基以上であるが、特に限定されない。重複するハイブリダイゼーション領域の長さは、例えば、40塩基以下、30塩基以下、25塩基以下であり得る。
　好ましい態様において、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端よりも、鋳型RNAの5’側（上流）に位置する。即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、鋳型RNAの5’側（上流）で、鋳型RNAにハイブリダイズするように、両プライマーをデザインする。このように半入れ子状（semi-nested）の位置関係に上記2つのプライマーをデザインすることにより、増幅の特異性の上昇が期待できる。この場合、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とを、一部重複させて半入れ子状（semi-nested）としてもよいし、重複させずに完全な入れ子状（full-nested）としてもよい。
　逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とを、一部重複させる場合、例えば、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端よりも、例えば1～12塩基、好ましくは1、2、3、4又は5塩基、鋳型RNAの5’側（上流）になるように（即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、例えば1～10塩基、好ましくは1、2、3、4又は5塩基、鋳型RNAの5’側（上流）にハイブリダイズするように）両プライマーをデザインすることが好ましいが、これらに限定されない。
　別の態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とが、少なくとも一部重複し、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端と一致する。即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端と同じ位置で、鋳型RNAにハイブリダイズする。
　一態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域が同一である。該態様においては、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。
　別の態様において、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの部分配列を、その3’末端に含む。当該部分配列（以下、共通配列と呼ぶ場合がある。）の長さは、通常10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは18塩基以上であるが、特に限定されない。当該3’末端部分配列の長さは、例えば、40塩基以下、30塩基以下、25塩基以下であり得る。一態様において、当該共通配列は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の部分配列であり得る。別の態様において、当該共通配列の3’末端は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、少なくとも1塩基（例えば1～20塩基、1～10塩基、1～8塩基）、5’側に位置する。一態様において、該共通配列は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーに含まれる、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列、又はその部分配列である。一態様において、該共通配列は、第2のアンカー配列又はその部分配列である。一態様において、該共通配列は、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列と第2のアンカー配列とに跨る、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの部分配列である。一態様において、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーが人工塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーであり、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが人工塩基を含有する第2のアンカー配列を5’末端に含み、共通配列が、第2のアンカー配列又はその部分配列である。
　上記組成物が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む場合、該オリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、逆転写を開始するのに十分な量があればよい。逆転写において、増幅を意図する領域を含むcDNAを1コピー合成することができれば、その後のPCRにより、これを検出可能なレベルにまで増幅することが可能である。従って、該組成物中に（反応系内に）少なくとも1コピー、好ましくは10コピー以上、より好ましくは100コピー以上の、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが含まれていればよい。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が高すぎると、非特異的なハイブリダイゼーションによる副反応を引き起こす可能性がある。上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。
　別の態様において、上記組成物は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。本態様においては、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、熱不安定性修飾基を含み、且つ鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、1又はそれ以上のヌクレオチド間結合或いは3’末端において熱不安定性修飾基を含む。該改変オリゴヌクレオチドプライマーに含まれる熱不安定性修飾基は、PCR増幅における最初の変性温度（例えば、約80－105℃、好ましくは約85－100℃、より好ましくは約90－96℃（例、95℃））に到達するまでは、殆ど解離しないが、本発明者は、この熱不安定性修飾基が逆転写を進行する温度（例、45℃）において、わずかに解離し、それにより生じた対応する未修飾オリゴヌクレオチドが、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得ることを見出した。
　上記組成物は、必要に応じてバッファー、塩（マグネシウムイオン等）、RNAase　inhibitorを含んでいてもよい。
　上記組成物中に含まれる、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの濃度は、本発明の方法を実施可能な限り特に限定されないが、例えば、0.05～5.0μM、好ましくは0.1～1.0μM程度である。
　上記組成物中に含まれる、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー及び上記改変オリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、従来法のPCRを行う際のプライマー濃度と同等であり、例えば0.1～1.0μM程度である。
　上記組成物中に含まれ得るその他の構成因子（鋳型RNA、逆転写酵素、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTPs混合物、バッファー、塩、RNAase　inhibitor）の濃度は、ワンステップRT-PCRの先行技術において周知であり、更に、本発明の文脈で使用される濃度の最適化がルーチン実験から得られ得る。
　次に、上記で提供された組成物を、逆転写が進行可能な温度でインキュベートする。逆転写が進行可能な温度は、逆転写酵素の種類によって適宜調整することができるが、通常、37℃～62℃、好ましくは37℃～55℃である。インキュベート時間は、鋳型RNAのサイズ等を考慮して適宜調整することができるが、通常、30秒～120分、好ましくは5分～60分である。当該インキュベーションにより、組成物中に含まれていた逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマー、或いは改変オリゴヌクレオチドプライマーから熱不安定性修飾基が解離することにより生じた未修飾オリゴヌクレオチドが、逆転写をプライムし、鋳型RNAに相補的なcDNA（アンチセンス鎖）が合成される。逆転写酵素は、鋳型RNAの5’末端に達すると、鋳型をテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに乗り換え、その5’末端までcDNA合成を続けるため、3’端に、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドのアンカー配列に相補的な配列が付加された1本鎖のcDNA（アンチセンス鎖）を生じる。
　次に、得られたcDNAを含む反応混合液を、PCRが進行可能な複数回の熱サイクリングプロトコールに付す。該熱サイクリングプロトコールは、変性（熱変性とも呼ぶ。）、アニーリング、伸長の3つの温度ステップのサイクルで構成される。変性は二本鎖DNAを解離させるのに十分な温度であれば特に限定されず、好ましい熱変性温度の下限は90℃、上限は100℃である。アニーリングは解離したDNAにプライマーをアニーリングするステップで、その際の温度（アニーリング温度）は特に限定されないが、好ましいアニーリング温度の下限は45℃であり、さらに好ましくは50℃である。一方好ましい上限は75℃であり、さらに好ましくは70℃である。伸長はDNAポリメラーゼで相補鎖を合成するステップで、その際の温度（伸長温度）は特に限定されないが、好ましい伸長温度の下限は50℃であり、上限は80℃である。前記サイクルにおいて、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。アニーリングと伸長とを1つの温度で実施することにより、実質的に2つの温度ステップのサイクルとして熱サイクリングプロトコールを構成することも可能である。この場合、好ましいアニーリング及び伸長の温度の下限は50℃であり、更に好ましくは55℃である。一方好ましい上限は70℃であり、さらに好ましくは65℃である。各ステップにおけるインキュベーション時間としては、1秒～5分を例示することができるが、当業者であれば、増幅産物のサイズ等を考慮し、容易に適切なインキュベーション時間を設定することができる。
　反応混合液を熱サイクリングプロトコールに付す前に、逆転写酵素を失活させるための変性工程（プレインキュベーション工程）を実施してもよい。該変性温度は、逆転写酵素を失活させることが出来るかぎり特に限定されないが、好ましい熱変性温度の下限は90℃、上限は100℃である。変性時間は、逆転写酵素を失活させることが出来るかぎり特に限定されないが、通常1分以上15分以下である。
　改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、熱不安定性修飾基を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合、熱サイクリングプロトコールの最初の変性工程、或いはプレインキュベーション工程において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーから修飾基が解離し、対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。未修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長をプライムできる。
　熱サイクリングの最初のアニーリング及び伸長工程においては、逆転写工程で得られた1本鎖のcDNA（アンチセンス鎖）の3’端に存在するアンカー配列に相補的な配列に、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーがアニールし、ポリメラーゼによる伸長が生じ、5’末端にアンカー配列（第1のアンカー配列）が付加されたcDNA（センス鎖）が合成される結果、センス鎖の5’末端にアンカー配列が付加された2本鎖cDNAが生じる。
　そして、上記2本鎖cDNAを含む反応混合物を、引き続き複数回の熱サイクリングプロトコールに付すことにより、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと改変オリゴヌクレオチドプライマーにはさまれた領域（即ち、5’末端アンカー配列から改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域まで）が増幅される。
　熱サイクリングの回数は、鋳型RNAの量等を考慮して適宜設定することができるが、例えば、20回以上、好ましくは30回以上、40回以上、45回以上、50回以上、又は55回以上である。一般的なRT-PCRの場合、鋳型RNAのコピー数が少ない場合（例えば、シングルコピー）であっても、40回程度熱サイクリングをおこなえば、増幅反応は飽和に達するが、本発明の方法においては（特に、熱不安定性修飾基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合）、45回以上、50回以上、又は55回以上の熱サイクリングを行っても、増幅反応が飽和に達せず、更なる増幅が可能であり得る。理論には拘束されないが、本発明の方法においては（特に、熱不安定性修飾基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合）、1回の熱サイクルあたりの増幅効率が一般的なRT-PCRよりも抑制されている可能性があり得る。従って、例えば増幅を意図する鋳型RNAのコピー数が少ない場合（例、100コピー以下、10コピー以下、シングルコピー）や、シングルセルから単離したRNA（特にトータルRNA）を鋳型RNAとして、本発明の方法を実施する場合、熱サイクリングの回数を、40回以上、45回以上、50回以上、又は55回以上とすることが好ましい。
　本発明の方法によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいては、その特異性が実質的にリバースプライマーのみで決定され得るが、本発明においては、リバースプライマーとして、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーを採用することにより、高い特異性で目的とする遺伝子を増幅することができる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少ない場合（例えば、シングルセル由来のRNAを鋳型とする場合）、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。従って、例えば、抗原受容体（例、抗体（重鎖、軽鎖）、T細胞受容体（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）の定常領域に特異的なリバースプライマーを、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、抗原受容体（例、抗体（重鎖、軽鎖）、T細胞受容体（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）の定常領域に特異的なリバースプライマーを用いることにより、シングルセルレベルで、抗原受容体の抗原認識部位の配列解析を実施することができる。
　また、本発明は、
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
を含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キットをも提供する。
　一態様において、本発明のキットは、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
　一態様において、本発明のキットは、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。
　本発明のキットには、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するために必要な他の試薬（例えば、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）、耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）、dNTPs混合物、バッファー、塩（マグネシウムイオン等）、RNAase　inhibitor）が含まれていてもよい。
　上記試薬は、それぞれ別個に容器に封入された上で、1つのパッケージ中に含まれていても良いし、その一部又は全部の混合物を含む組成物として提供されてもよい。
　一態様において、本発明のキットは、i)のオリゴヌクレオチド、及びii)のプライマーセットを、両者の混合物を含む組成物として含む。
　一態様において、該組成物は、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
　一態様において、該組成物は、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。
　該組成物は、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）、耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）、dNTPs混合物、バッファー、塩（マグネシウムイオン等）、及びRNAase　inhibitorからなる群から選択される1、2、3、4、5又は6の試薬を含んでいてもよい。
　本発明のキットを用いれば、任意の鋳型RNAを用いて、上記本発明の方法により、簡便に、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施することが出来る。
　本発明のキットに含まれる各構成要素の用語の定義は、上記本発明の方法において記載した通りである。
　また、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、i)逆転写に必要な試薬と、ii)必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬と、iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とiv)必要に応じて、使用説明書を含み、i)の試薬、存在する場合ii)の試薬、iii)の試薬、および改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キットを提供する。
　また、別の態様において、本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含み、該工程(1)は、a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程とを含み、該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法を提供する。前記核酸試料は、非バイアス的に増幅されるのが好ましい。
　本発明のレパトアを解析する方法において、配列解析のために核酸試料のために、逆転写テンプレートスイッチPCR（上記工程a)およびb)）が利用される。レパトア解析において逆転写テンプレートスイッチPCR(RT-TS-PCR)を使用することにより、時間、労力、コストを低減することが可能となり好都合である。RT-TS-PCRでは工程が少ないため短時間で処理でき、労力も低減でき、多検体処理に有利である。使用する試薬類も少ないためコストを抑えることが可能である。時間、労力、コストの低減という有利な点だけではなく、以下の点でさらに本発明の方法は有利である。１．RNAからPCR増幅までの反応が一つのチューブ内で完了するため、チューブの開閉、試薬の添加、精製等の操作によるPCR産物のコンタミネーションを防ぐことができる。２．制限酵素処理を行わないため、偶発的に発生する増幅産物本体の切断を防ぐことができる。３．シーケンシングに供する試料を得るまでの各工程での精製操作でのロスがなく高感度な解析が可能になる。
　さらに、本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程とを含み、該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法を提供する。前記核酸試料は、非バイアス的に増幅されるのが好ましい。
　一態様において、前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
　驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、本方法において使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で含む。
　本発明のレパトア解析方法において、逆転写テンプレートスイッチPCRを行った後にさらに、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含んでもよい。当業者であれば、配列解析の種類に応じて、配列解析のための適切な配列を選択することができるが、配列解析のために適切な配列としては、例えば、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用される配列解析は、ブリッジPCRを使用した配列解析であるが、ブリッジPCRを使用した配列解析ために付加される適切な配列は、インデックス配列、タグ配列、配列解析の基板（例えば、フローセル）に固定化するための配列等を含む。
　好ましい実施形態では、本発明のレパトア解析方法において、配列解析のための核酸試料を提供するために、上記逆転写テンプレートスイッチPCR(第1のPCR増幅反応)、タグPCR(第2のPCR増幅反応)、およびインデックスPCR(第3のPCR増幅反応)が行われ得る。
　逆転写テンプレートスイッチPCR(第1のPCR増幅反応)で使用される5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと称することもある。第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。第1のPCR増幅反応では、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが、5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能するため、上記第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを使用しなくてもよい。
　一態様において、前記工程(1)は、c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程とをさらに含んでもよい。
　タグ配列は、シーケンシング（例えば、Miseqによるシーケンシング）を行うために使用される配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCR(第3のPCR増幅反応)のプライミングサイトとして機能してもよい。第1のタグ配列は、第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーに付加された配列であり得、第2のタグ配列は、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーに付加された配列であり得る。
　本明細書において「第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、本発明の逆転写テンプレートスイッチングＰＣＲによるＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。
　本明細書において「第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第2のPCR増幅反応)において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、第3のPCR増幅反応のためのプライミングサイトとなるタグ配列が付加されている。
　本明細書において「第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、インデックス配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第3のPCR増幅反応)において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、必要に応じて、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている。
　本明細書において、「第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、本発明の逆転写テンプレートスイッチングＰＣＲによるＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーである。テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能し得るため、第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーが使用されない、または少量で使用され得る。
　本明細書において、「第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第2のPCR増幅反応)において使用されるプライマーである。
　本明細書において、「第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、インデックス配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第3のPCR増幅反応)において使用されるプライマーである。第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、必要に応じて、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている。
　本明細書において「第１のPCR増幅反応」とは、本発明のワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRにより被験体から得られたRNAを鋳型として行われるPCR増幅反応である。
　本明細書において「第２のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明のレパトア解析のための試料生産において、第１のＰＣＲ増幅反応の後その産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応をいう。第２のＰＣＲ増幅反応では、第3のPCR増幅反応のためのプライミングサイトを提供するためのタグ配列が付加された核酸試料が提供される。このタグ配列は、配列解析における開始地点にもなる。
　本明細書において「第３のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明の解析のための試料生産において、第２のＰＣＲ増幅反応の増幅産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、その産物は、本発明の配列解析における使用に適切な配列を含む。第３のＰＣＲ増幅反応では、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加される。
　一態様において、前記工程(3)は、(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含んでもよい。
　また、本発明は、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、i)逆転写に必要な試薬と、ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とiv)必要に応じて、使用説明書を含み、i)～iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キットを提供する。本発明のキットは、被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供することが可能である。
　本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、プライマー、薬剤、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、薬剤をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、薬剤、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の逆転写テンプレートスイッチングPCRおよび試薬の使用方法を指示する文言が記載されている。また、指示書には、使用方法（スクリーニング方法）を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package　insert）であり、紙媒体で提供されてもよく、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　本発明のキットに含まれるポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、プライマーを含まなくてもよい。プライマーは、本発明のキットに備えられていてもよいし、別途提供されていてもよい。当業者は、対象RNAに基づいて適切にプライマーを設計し、製造することができるか、またはプライマーの提供会社に製造を依頼することができる。本発明のキットで使用されるリバースプライマーとして、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーが使用される。フォワードプライマーとして、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーが使用され得る。
　一態様において、本発明のキットにおけるテンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、本発明のキットにおけるポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
　驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの終濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で使用される。
　本発明のキットにおいて使用される改変オリゴヌクレオチドプライマーについては、上記に詳細に記載される。
　また、本発明は、データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、(1)被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および(3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置を備えるシステムを提供する。
　本発明のシステムで使用される前記キットは、以下：c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段とをさらに含み得る。
　一態様において、(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段を備え得る。
　さらなる態様において、本発明は、上記TCRまたはBCRの可変領域のレパトアを定量的に解析するためのシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステムを提供する。
　さらなる態様において、本発明は、上記被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステムを提供する。
　本明細書において「データベース」とは、遺伝子に関する任意のデータベースをいい、特に本発明では、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパトアを含むデータベースをいう。このようなデータベースとしては、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，　ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベース、日本ＤＮＡデータバンク　（ＤＤＢＪ、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）データベース、ＧｅｎＢａｎｋ（米国生物工学情報センター、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）データベース、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ）データベース等をあげることができるがこれに限定されない。
　本明細書において「可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲで遺伝子再構成により任意に作り出されたＶ（Ｄ）Ｊ領域の集合をいう。
　本明細書において「インデックス配列」とは、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である。したがって、目的とする配列とは異なることが好ましい。また、増幅に影響しない配列であることが好ましい。インデックス配列についての判定基準およびその代表例については以下のとおりである。すなわち、インデックス配列の判定基準について説明すると、インデックス配列は、複数のサンプルを混合して同時にシーケンスする際に、各サンプルを識別するために付加する塩基配列である。一つのサンプル由来のリードには、一つのインデックス配列が対応付けられ、獲得されたリード配列がどのサンプルに由来するかを識別することができる。Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種の塩基の任意配列であり、理論的には１０塩基で約１００万、２０塩基で約１兆種類の配列を作り出すことができる。塩基配列長は、好ましくは、２塩基以上４０塩基以下であり、より好ましくは、６塩基以上１０塩基以下である。同時に、連続する配列（ＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＴＴ）を含まない配列を用いることが望ましい。
　本明細書において「アイソタイプ」とは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤ等において、同じタイプに属するが、相互に配列が異なるタイプを言う。アイソタイプは種々の遺伝子の略称や記号を用いて表示される。
　本明細書において「サブタイプ」とは、ＢＣＲの場合ＩｇＡおよびＩｇＧにおいて存在するタイプ内のタイプであって、ＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、ＩｇＡについてはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２が存在する。ＴＣＲについても、β鎖およびγ鎖において存在することが知られており、それぞれＴＲＢＣ１，ＴＲＢＣ２、あるいはＴＲＧＣ１，ＴＲＧＣ２が存在する。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。
本明細書において「被験体」とは、本発明のレパトア解析のための試料の起源または本発明の診断の対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
　本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、核酸（例えば、RNA）、細胞、組織、器官等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものをいう。
　本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
　本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
　本明細書において「トリミング」とは、遺伝子解析において、不適切な部分の除去を行うこという。トリミングは、リード両端から低クオリティ領域、もしくは実験手順において付与された人工的核酸配列の部分配列、もしくはその両方を削除することで行われる。トリミングは、当該分野で公知のソフトウエアおよび文献（例えば、cutadapt　http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal,2011)；fastq-mcf　Aronesty　E.,　The　Open　BioinformaticsJournal(2013)　7,　1-8　(DOI:10.2174/1875036201307010001)；およびfastx-toolkit　http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/　(2009)）を参照しておこなうことができる。
　本明細書において「適切な長さ」とは、本発明の遺伝子解析において、アラインメント等の分析を行う際に、分析に適合するような長さをいう。そのような長さは、例えば、Ｃ領域上の配列決定開始位置から、Ｖ領域上のＤ領域寄りの１００塩基を含む長さ以上とするようにして決定することができ、例えば、本発明では、ＴＣＲの場合、２００ヌクレオチド長以上、好ましくは２５０ヌクレオチド長以上であってよく、ＢＣＲの場合、３００ヌクレオチド長以上、好ましくは３５０ヌクレオチド長以上であってよいが、これらに限定されない。
　本明細書において「入力配列セット」とは、本発明の遺伝子解析において、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの解析の対象となる配列のセットをいう。
　本明細書において「遺伝子領域」とはＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域およびＣ領域等の各領域をさす。このような遺伝子領域は、当該分野で公知であり、データベース等を参酌して適宜決定することができる。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。本明細書において「相同性検索」とは、相同性の検索をいう。好ましくは、コンピュータを用いてインシリコで行うことができる。
　本明細書において「近似する」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が高いことをいう。相同性検索を行うソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を行った際には通常相同性の高い順序で列挙されるため、順位の高いものを適宜選択することで近似することができる。
　本明細書において「最も近しい」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が最も高いことをいう。ソフトウェアで相同性検索を行った場合は１位で表示されるものを選択する。
　本明細書において「参照アリル」とは、相同性検索を行った際に、参照データベースにおいてヒットする参照アリルをいう。
　本明細書において「アラインメント」（英語では、ａｌｉｇｎｍｅｎｔまたはａｌｉｇｎ）とは、バイオインフォマティクスにおいて、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質等の生体分子の一次構造の類似した領域を特定できるように並ぶように並べたもの、および並べることをいう。機能的、構造的、あるいは進化的な配列の関係性を知る手がかりを与えることができる。
　本明細書において「アサイン」とは、ある配列（例えば、核酸配列、タンパク質配列等）に、特定の遺伝子名、機能、特徴領域（例えば、Ｖ領域、Ｊ領域など）等情報を割り当てることをいう。具体的には、ある配列に特定の情報を入力またはリンクさせる等により達成することができる。
　本明細書において「ＣＤＲ３」とは、３つめの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＣＤＲ）をいい、ここで、ＣＤＲとは、可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、この超可変領域のことをいう。軽鎖と重鎖の可変領域に、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）と、３つのＣＤＲを取り囲む４つのＦＲ（ＦＲ１～ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ３領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域にまたがって存在するとされているため、可変領域の鍵を握るといわれており、分析対象として用いられる。
　本明細書において「参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭」とは、本発明が対象とするＶ領域中のＣＤＲ３の先頭に該当する配列をいう。
　本明細書において「参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾」とは、本発明が対象とするＪ領域中のＣＤＲ３の末尾に該当する配列をいう。
　本明細書において「ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件」とは、ランダム変異が、結果として散在することになる任意の条件をいい、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する。本発明で用いられるＩｇＧ等の分子のアイソタイプ等の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、好ましくは電子的に、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul　et　al.,　J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson　&　Lipman,　Proc.Natl.Acad.Sci.,USA　85:2444-2448(1988)）、Smith　and　Waterman法（Smith　and　Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman　and　Wunsch法（Needleman　and　Wunsch,　J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。BLASTが代表的に用いられている。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　１つの実施形態では、ＢＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される目的とするアイソタイプＣ領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列を有する。好ましくは、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＡまたはＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のいずれか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列である。別の実施形態では、ＴＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のＣ領域に完全マッチし、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列である。
　別の実施形態では、前記Ｃ領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択することが好ましい。このような完全マッチを選択することによって、精度の高い分析を行うことができる。
　（大規模解析）
　別の局面において、本発明は、本発明の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法を提供する。
　遺伝子解析としては、任意の解析手法を用いて行うことができ、たとえば、公知のＩＭＧＴ　（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベースから入手されるＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をリファレンス配列として各リード配列のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をアサインして、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔを利用する手法、あるいは、本明細書においても解析システムの好ましい例として記載される出願人が開発した新たなソフトウェア（Ｒｅｐｅｔｏｉｒｅ　Ｇｅｎｅｓｉｓ）を使用することができる。
　１つの好ましい実施形態では、前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である。
　個々の増幅分子を配列決定することで、異なる配列を識別することができ、したがって配列決定はクローン増殖における量的変化を検出するための感度を有する。概して、提供する本発明の１つの態様において、Ｔ細胞および／またはＢ細胞における組換えＤＮＡ配列のプロファイルを決定するための方法を提供する。本方法は、対象から試料を単離する工程、１ラウンドまたは複数ラウンドの核酸増幅、個々の核酸を空間的に単離する工程、および核酸を配列決定する工程を含む工程を含み得る。
　１つの局面において、対象または個体における１つまたは複数のレパトアの相関関係を決定するための方法を提供する。別の局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを開発するための方法を提供する。別の局面において、対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを用いて、個体の１レパトアの相関関係または複数のレパトアの相関関係を発見するための方法を提供する。別の局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法を提供する。別の局面において、個体の疾患状態をモニターするための方法を提供する。
　（解析システム）
　本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うためのバイオインフォマティクスを提供する。
　１つの局面において、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法であって、以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ（好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップ）；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ（好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ）；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップを包含する。
　本発明の方法において（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップは、例えば、Ｖ領域について言えば、そのＶ領域の情報を含むデータベースを適宜選択し、これを提供することで達成されうる。
　本発明の方法において、（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップは、必要な場合には適宜ソフトウェア等の機能を用いてトリミングを行い、また、必要な場合は、長さを適宜選択した上で、抽出した入力配列セットを提供することで達成する。入力配列は、例えば、公知の方法で増幅した増幅産物のセット、または本発明の逆転写テンプレートスイッチングPCRによってPCR増幅した増幅産物のセットでありうる。
　本発明の方法において、（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップは、相同性検索を行うソフトウェアを適宜用いて、遺伝子領域（例えば、Ｖ領域等）ごとに、参照データベースとの相同性検索を入力配列セットに対して行い、その結果得られる近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録することによって行われる。
　本発明の方法において（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる、このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。
　本発明の方法において、（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップは、当該分野で公知の方法を用いてアミノ酸への翻訳を行い、そのアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出すことなどで達成することができる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。
　本発明の方法において、（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップは、上記までのステップで算出したＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および／またはＣ領域の出現頻度を、例えば、リストで整理するなどにより算出することができる。これにより、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出することができる。
　以上のステップを図12も参照しながらさらに説明する。
　Ｓ１（ステップ（１））において、参照データベースが提供される。これは、外部記憶装置１４０５に保存されたものであってもよいが、通常は、通信デバイス１４１１を通じて、公共で提供されるデータベースとして取得することができる。あるいは入力装置１４０９を用いて入力し、必要に応じてＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に記録してもよい。ここでは、Ｖ領域などの目的とする領域を含むデータベースが提供される。
　Ｓ２（ステップ（２））では、入力配列セットが提供される。ここでは、入力装置１４０９を用いるか通信デバイス１４１１を介して、例えばＰＣＲ増幅反応で増幅した増幅産物のセットから得られる配列情報のセットが入力される。ここでは、ＰＣＲ増幅反応の増幅産物を受け取り、それを遺伝子配列解析する装置が接続されていてもよい。そのような接続はシステムバス１４２０を通じて行われるかまたは通信デバイス１４１１を通じて行われる。ここでは、必要に応じてトリミングおよび／または適切な長さのものの抽出を行うことができる。そのような処理は、ＣＰＵ１４０１で行われる。トリミングおよび／または抽出をするためのプログラムはそれぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ３（ステップ（３））では、アラインメントがなされる。ここでは、該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行うが、この相同性検索は、通信デバイス１４１１等を介して得られた参照データベースに対して相同性検索プログラム処理を行う。この処理はＣＰＵ１４０１で行われる。また、その結果得られた結果を分析して近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを行う。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ４（ステップ（４））では、Ｄ情報の核酸配列を検出する。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインする。アサイン処理もまたＣＰＵ１４０１でなされる。また、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出することもまたＣＰＵ１４０１でなされる。アサインおよび抽出の処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、好ましくは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる。結果は、ＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に保存することができる。このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。このような処理もまたＣＰＵ１４０１において行うことができる。そのためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ５（ステップ（５））では、Ｄ領域を分類する。該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する処理がなされるが、これもまたＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。得られたアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出してもよい。このような処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。この処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　Ｓ６（ステップ（６））では、上記分類に基づいてＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する。この算出および導出のための処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
　１つの好ましい実施形態では、本発明において使用される遺伝子領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の全部を含む。
　１つの実施形態では、前記参照データベースは、各配列に一意のＩＤが割り振られたデータベースである。ＩＤが一意に割り振られることによって、ＩＤという簡単な指標を元に遺伝子の配列を分析することができる。
　１つの実施形態では、前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである。非バイアスの配列セットは、本明細書において記載されるような逆転写テンプレートスイッチングPCRによってPCR増幅することによって実施することができる。
　別の実施形態では、前記配列セットはトリミングされたものである。トリミングを行うことによって、不要なあるいは不適切な核酸配列を除くことができ、分析の効率を上げることができる。
　好ましい実施形態では、トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される。好ましくは、前記低クオリティは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである。
　好ましい実施形態では、前記近似する配列は、最も近しい配列である。具体的な実施形態では、前記近似する配列は、１．一致塩基数、２．カーネル長、３．スコア、４．アラインメント長の順位によって決定される。
　別の実施形態では、前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる。このような条件は、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する１つの実施形態では、前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて（１）ウィンドウサイズの短縮、（２）ミスマッチペナルティの低減、（３）ギャップペナルティの低減および（４）指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも１つの条件を含む。
　別の実施形態では、前記相同性検索は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにおいて以下の条件
　　Ｖ　ミスマッチペナルティ＝－１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
　　Ｄ　ワード長＝７（ＢＬＡＳＴの場合）またはＫ－ｔｕｐ＝３（ＦＡＳＴＡの場合）、ミスマッチペナルティ＝－１、ギャップペナルティ＝０、最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
　　Ｊ　ミスマッチペナルティ＝－１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
　　Ｃ　最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５で実施される。この条件は、例えば、より短い（～２００ｂｐ）配列を用いて一部の領域だけでも分類する状況（「好ましい例」から外れる状況）であれば使用することができ、イルミナ製シーケンサを利用する状況でも使用することができる。この場合は、相同性検索にｂｗａもしくはｂｏｗｔｉｅを用いる可能性が考えられる。
　特定の実施形態では、前記Ｄ領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる。
　さらなる実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在する場合は、前記ＣＤＲ３の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
　別の実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる。
　具体的な実施形態では、前記出現頻度は、遺伝子名単位および／またはアリル単位でなされる。
　別の実施形態では、前記ステップ（４）は該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップを包含する。
　更なる実施形態では、前記ステップ（５）は、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップを包含する。
　１つの局面では、本発明はＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析するシステムであって、該システムは：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；を包含する、システムを提供する。
　別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、プログラムを提供する。
　さらに別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、記録媒体を提供する。
　（システム構成）
　次に、図12の機能ブロック図を参照して、本発明のシステム１の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示している。
　本発明の遺伝子分析システム１は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１４０１にシステムバス１４２０を介してＲＡＭ１４０３、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１４０５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１４２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１４０９、ディスプレイなどの出力装置１４０７、及びモデムなどの通信デバイス１４１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１４０５は、情報データベース格納部１４３０とプログラム格納部１４４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１４０５内に確保された一定の記憶領域である。
　このようなハードウェア構成において、入力装置１４０９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１４１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１４０５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１４０１によってＲＡＭ１４０３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働してこの発明の機能を奏するようになっている。
　データベース格納部１４３０には、参照データベースや入力配列セットあるいは生成した分類データやＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアのデータ等、もしくは通信デバイス１４１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
　データベース格納部１４３０には、入力配列セットエントリー情報として、試料提供者ＩＤ、試料情報、核酸分析結果、既知の個体・生理情報、及びＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果が試料ＩＤに関連付けて格納される。ここで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果は、核酸分析結果を本発明の処理によって処理して得られる情報である。
　また、プログラム格納部１４４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、上記した処理システム、例えば、トリミング、抽出、アラインメント、アサイン、分類、翻訳等を行う処理を実施するシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１４０１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。なお、以下においては、それぞれのシステムにおける各機能が協働してそれぞれのシステムを構成しているものとする。
　（レパトアの解析システム・解析方法）
　１つの局面において、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法を提供する。この方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含する。この方法および本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含む方法を、本明細書において「本発明のレパトア解析法」とも呼ぶ。そして本発明のレパトア解析法を実現するシステムを「本発明のレパトア解析システム」ともいう。
　本発明の方法における（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程は、核酸配列を決定するのに適切な試料となっている限り、どのような試料であってもよい。そのような手法として、本発明の上記の好ましい増幅方法のほか、Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＡＦＬＰ）ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、アッセンブルＰＣＲ，非対称ＰＣＲ，コロニーＰＣＲ，ヘリカーゼ依存性増幅、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ、Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ　ＰＣＲ、ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ＰＣＲ　（ＬＡＭＰ），Ｎｕｃｌｅｉｄ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＮＡＳＢＡ）、Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃｌｅ　ｔｏ　ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＰＩＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｔｒｇｅｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　（ＴＡＣＬ）、５’－Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ　（５’－ＲＡＣＥ）、３’－Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ　（３’－ＲＡＣＥ）、Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｔ　５’－ｅｎｄｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＳＭＡＲＴ）を用いることもできる。
　本発明の方法における（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程は、核酸配列を決定することができる限り、どのような方法を用いてもよい。通常は、大量の配列決定を要するため、自動化された大規模配列決定方法を用いることが好ましい。そのような配列決定方法としては、Ｒｏｃｈｅ　４５４シーケンサを用いた配列決定（ＧＳ　ＦＬＸ＋、ＧＳ　Ｊｕｎｉｏｒ）、イオントレントシーケンサ（Ｉｏｎ　ＰＧＭＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）の手法を用いた配列決定、イルミナ社の手法（ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ　ＩＩｘ，Ｈｉｓｅｑ，Ｍｉｓｅｑ）を用いた配列決定がある。その他のシーケンス法としては、ＨｅｌｉｓｃｏｐｅＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ　Ｔｒｕｅ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（ｔＳＭＡ）（Ｈａｒｒｉｓ．Ｔ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００８，３２０－１６０－１０９），ＳｏｌｉＤＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．），Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　（ＳＭＲＴＴＭ）ＰａｃＢｉｏシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ＣＡ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ），ＬａｓｅｒＧｅｎＴＭ（ＬａｓｅｒＧｅｎ，Ｉｎｃ．ＣＡ)（文献：Litosh　VA　et　al.,　Nucleic　Acids　Res.　2011　Mar;39(6):e39）、Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ　ＧｅｎｏｍｉｃｓＴＭ（Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＣＡ）、ＧｎｕＢＩＯ（ＧｎｕＢＩＯ　Ｉｎｃ．、ＭＡ）、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｍ．Ｄａｎａｈｅｒ／Ｄｏｖｅｒ，Ａｚｃｏ　Ｂｉｏｔｅｃ．　Ｉｎｃ．，　ＣＡ），Ｍｅｂｉｏｕｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｍｅｂｉｏｕｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ），Ｍｉｌｌｉｋａｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃａｅｒｕｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｉｎｃ）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｂｉｏ－Ｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｉｎｃ．（文献：HutterD,et　al　Nucleosides　Nucleotides　Nucleic　Acid　2010;29(11):879-95.），Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｎａｂｓｙｓ　Ｉｎｃ．，　ＲＩ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｎｏｂｌｅｇｅｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．），Ｎａｎｏｐｏｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｂｉｏｓｃｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ），Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＧＥＮＩＵＳＴＭ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｇｅｎａｐｓｙｓ、Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＣＡＥＲＵＳ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＩＡＧＮＯＴＩＣＳ，ＩＮＣ，ＣＡ，Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｒａｐｉｄ　Ｎａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ　（ＩＭＰＲＮＴ）（Ｈａｌｃｙｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ），Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ－ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ｄｕａｌ－ｂｅａｍ　ｌｏｗ　ｅｎｅｒｇｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｏｐｔｉｃａ，　Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＺＳ　Ｇｅｎｅｓｉｓ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＺＳ　Ｇｅｎｅｔｙｉｃｓ，Ｉｎｃ）等を挙げることができる。Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンスは、３’末端と５’末端に特異的に結合する２種類のアダプターを結合させた１本鎖ＤＮＡを作成する。その１本鎖ＤＮＡはアダプターを介してビーズに結合し、油中水滴エマルジョンの中に包み込むことにより、ビーズとＤＮＡフラグメントを持つマイクロリアクターを形成する。その後、油中水滴エマルション内でエマルションＰＣＲを行って目的遺伝子を増幅する。このビーズをピコタイタープレートへアプライし、シーケンスを行う。ＤＮＡポリメラーゼによりｄＮＴＰがＤＮＡに取りこまれるときに発するピロリン酸を基質として、ｓｕｌｆｒｙｌａｓｅによりＡＴＰを生成する（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。このＡＴＰとＬｕｃｉｆｅｒｉｎを基質としてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅが蛍光を発し、ＣＣＤカメラで検出することで塩基配列を決定する。イオントレント社の手法は、Ｒｏｃｈｅ社と同様の方法でエマルジョンＰＣＲを行った後、ビーズをマイクロチップに移し、マイクロチップ上でシーケンス反応を行う。検出は、ポリメラーゼによってＤＮＡが伸長する際に放出される水素イオン濃度を半導体チップ上で検出して、塩基配列に変換する。イルミナ社のシーケンスは、ブリッジＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法により、フローセル上で目的ＤＮＡを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行う方法である。ブリッジＰＣＲ法は、両末端に異なるアダプター配列を付加した1本鎖ＤＮＡを作成する。フローセル上には予め５’末端側のアダプター配列が固定されており、伸長反応を行うことによりフローセルに固定する。同様に近接する位置に３’末端側のアダプターが固定され、合成されたＤＮＡの３’末端と結合して、いわゆるブリッジを形成した状態で２本鎖ＤＮＡを合成する。その後、ブリッジ結合→伸長→変性を繰り返すことにより、多数の１本鎖ＤＮＡ断片が局所的に増幅し、集積したクラスターが形成される。この１本鎖ＤＮＡを鋳型として、シーケンシングを行う。Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓは、シーケンスプライマーを添加後、ＤＮＡポリメレースによって３’末端ブロック蛍光ｄＮＴＰによる1塩基合成反応を行う。レーザー光により塩基に結合している蛍光物質を励起させて、蛍光顕微鏡により発光を写真として記録する。次に、蛍光物質とブロックを外して次の伸長反応を行い、蛍光を検出するというステップを進めていくことで塩基配列を決定する。好ましくは、複数の配列を単一の配列決定で行うことが有利である。より長い配列長を一度に配列決定できることも有利である。
　本発明における（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程は、遺伝子の出現頻度およびその組み合わせを算出することができ、ＴＣＲレパトアおよび／またはＢＣＲレパトアを導出することができるかぎり、どのような技術であっても用いることができる。たとえば、上述の解析方法の好ましい例のほか、ＩＭＧＴが提供する分析ツールＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔが利用できる。他の手法ではアライメント機能あるいはマッピング機能を実装したソフトウェアであるＡｂＭａｐｐｅｒ，　ＡＬＬＰＡＴＨＳ，　Ａｒａｃｈｎｅ，　ＢＡＣＣａｒｄｌ，　Ｂｆａｓｔ，　ＢＬＡＴ，　Ｂｏｗｔｉｅ，　ＢＷＡ－ＭＥＭ，　ＢＷＡ－ＳＷ，　ＢＷＡ，　ＣＣＲａ　ＶＡＴ　＆　ＱｕＴｉｅ，　ＣＬＣ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，　ＣＮＶ－ｓｅｑ，　Ｅｌｖｉｒａ，　ＥＲＮＥ－ｍａｐ　（ｒＮＡ），　ＧＳＭａｐｐｅｒ，　Ｇｌｉｍｍｅｒ，　ｇｎｕｍａｐ，　Ｇｏｓｅｑ　，　ＩＣＡｔｏｏｌｓ，　ＬＯＣＡＳ，　ＭａｐＳｐｌｉｃｅ，　Ｍａｑ，　ＭＥＭＥ，　Ｍｏｓａｉｋ，　ＮＧＳＶｉｅｗ，　Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ，　ＯＳＬａｙ，　Ｐａｒｔｅｋ，　Ｐｅｒｍ，　Ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ，　Ｑｐａｌｍａ，　ＲａｚｅｒＳ，　ＳＨＡＲＣＧＳ，　ＳＨＲｉＭＰ２，　ＳＮＰ－ｏ－ｍａｔｉｃ，　Ｓｐｌｉｃｅｍａｐ，　ＳＳＡＨＡ２，　Ｓｔａｍｐｙ，　Ｔａｂｌｅｔ，　ＴＭＡＰ，　Ｔｏｐｈａｔ，　Ｖｅｌｖｅでも行うことができる。
　１つの実施形態において、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の配列を決定する工程では、単一の配列決定により前記核酸配列が決定される。本発明の方法は、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
　１つの実施形態では、前記非バイアス的な増幅はＶ領域特異的な増幅ではないことを含む。Ｖ特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスがさらに減少または消失させることができる。
　１つの実施形態において、本発明が対象とするレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。
　１つの局面において、本発明は、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する方法を提供する。
　本発明の疾患、障害または状態の分析方法において、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手法としては、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
　１つの実施形態では、本発明の分析方法において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の方法で決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける工程、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する工程を含む、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するための方法を提供する。
　１つの実施形態において、本発明の処置または予防するための方法において対象とされる被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の局面では、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステム（解析システム）を提供する。このシステムは、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置を備える。このようなシステムおよび本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含むシステムを「本発明のレパトア解析システム」という。本発明のレパトア解析システムは、「本発明のレパトア解析法」を実現する。
　別の実施形態では、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の装置は単一の配列決定により前記核酸配列を決定することができるように構成される。
　別の実施形態では、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域と同一配列を有することを特徴とする。本発明のシステムは、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、本発明のシステムは、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
　別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。このようなプライマーは、この装置に備え付けられていてもよいし、キットに含まれていてもよく、別途提供されてもよい。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
　１つの実施形態では、本発明のキットが提供する核酸試料に含まれる核酸配列は、前記非バイアス的な増幅になされるところ、その増幅は、Ｖ領域特異的な増幅ではない。Ｖ領域特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスをさらに減少または消失させることができる。
　１つの実施形態において、本発明のシステムの分析の対象となるレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。本発明のシステムを用いることによって、ＢＣＲレペトアも正確に分析することが可能になった。
　別の局面においては、本発明は、本発明の解析システムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム（分析システム）を提供する。本発明の分析システムの該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段は、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
　１つの実施形態では、本発明の分析システムが分析することがでいる前記被験者の疾患、障害または状態として、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析システムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム（処置システムまたは予防システム）を提供する。
　本発明のシステムにおける被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段は、以下のような構成により実現することができる。すなわち、本発明の解析システムによって導出されたレパトアの情報を読み取り、これを、被験者の疾患、障害または状態に関する情報を読み取り、これらを関連付けることで実現することができる。導出されたリード集計データは、既存のリファレンス配列に対する照合作業からＶ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされ、ＣＤＲ３配列が決定されている。Ｖ領域、Ｊ領域、ＣＤＲ３配列をもとに一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）が算出される。この情報（リード配列、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列）と被験者の臨床情報（病歴、疾患名、病型、進行度、重症度、ＨＬＡ型、免疫状態など）を連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートあるいはデータベース化機能をもつソフトウェアを使ってデータベース化を行う。試料中のリード配列は、リード数や頻度でソートし、ランキング処理を行う。また、各Ｖ領域別あるいはＪ領域別にリード数を集計し、Ｖ領域使用頻度あるいはＪ領域使用頻度を算出する。これらの情報に基づいて、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段は、以下のような構成をとることができる。すなわち、定量性を示すデータと、処置、治療または予防に関するこれまでの情報または現在入手できる情報とを関連付け、その後の経過が改善するものの選択を実現することでこの選択手段の選択を実現することができる。
　１つの実施形態において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　（応用）本発明を用いて、大規模シーケンスにより同定されたTCRまたはBCR遺伝子の塩基配列（リード）とその出現頻度をソフトウェア上で算出し、リストや分布あるいはグラフを描出できる。それら情報に基づいて、次のような様々な指標を使うことによりレパトアの変化を検出する。その変化に基づいて、疾患や障害との関連を明らかにすることができる。
　１つの局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、V遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのV遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各V遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したVの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、J遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのJ遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各J遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したJの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、サブタイプの頻度解析（BCR）の使用頻度を検出する方法を提供する。Ｃ領域の配列決定に基づいて、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４サブタイプの存在頻度を算出することができる。疾患や病態に関連した特定のサブタイプの増加や減少を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、CDR3配列長のパターンを分析する方法を提供する。各リードのもつＣＤＲ３塩基配列長を算出して、その分布を明らかにすることができる。正常なＴＣＲあるいはＢＣＲからは正規分布様のピークパターンを示すが、正常な分布より逸脱したピークを検出して、疾患や病態との関連を明らかにすることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、ＴＣＲあるいはＢＣＲのクローナリティを分析する方法を提供する。各リードのＶ配列、Ｊ配列およびＣＤＲ３配列に基づいて、同一配列を有するリードを分類し、そのコピー数を算出す。全体のリード数に占める各リードのコピー数の割合を算出し、高頻度に存在するリードの存在を明らかにすることができる。出現頻度により降順にソートして、高頻度に存在するリードの数や割合について正常試料と比較することでクローナリティの度合いを評価する。そのことから疾患や病態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲクローナリティの変化を調べる。特に、白血病細胞などの検出に用いることができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、重複リードを抽出する方法を提供する。特定の疾患、病型、病態、組織、遺伝子型（ＨＬＡなど）に分類される試料のリードを検索し、試料間に重複するＴＣＲまたはＢＣＲリードを抽出する。そのことから疾患や障害の状態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子を明らかにすることができる。自己免疫疾患の発症に関与する疾患特異的Ｔ細胞、疾患関連抗体を産生するＢ細胞、がん細胞を攻撃するがん特異的Ｔ細胞などの同定を行うことができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、疾患特異的TCRあるいはBCRクローンを検索する方法を提供する。特定の疾患や障害の状態に関連づけられたTCRあるいはBCRリードを、試験試料において検索し、その出現や消失、あるいは増加や減少を明らかにすることで、疾患の発症や病態の進行あるいは改善を予測することができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析する方法を提供する。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列をカウントし、リードの種数、個体数を算出し、ＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの多様性について指数化する。Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１－λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数などを用いて、正常試料と対比することで多様度を評価する。骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標として利用することができる。また、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として利用できる。
　１つの実施形態では、多様性指数を使った対象の分析方法では、骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標、または、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として前記多様性指数を使用する。このような多様性指標を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。
　本明細書において、種々の多様性指標は、サンプル数、リードの種類、リード数のデータから、ＥＸＣＥＬスプレッドシート、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell,　R.　K.　et　al.　Journal　of　Plant　Ecology　5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）等のソフトウェアを用いて算出することができる。Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１－λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数は次に示す数式により求める。Ｎ：　全リード数、ｎｉ：リードｉにおけるリード数Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｅａｖｅｒ　ｉｎｄｅｘ　Ｈ’
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000030
Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ　ｉｎｄｅｘ　λ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000031
Ｉｎｖｅｒｓｅ　Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ　ｉｎｄｅｘ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000032
Ｐｉｅｌｏｕ’ｓ　Ｊ
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000033
ＳＣｈａｏ１Ｓｏｂｓ：全リード種数、Ｆ１：シングルトンリード、Ｆ２：ダブルトンリード
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000034
 
　別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析する方法。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列の種数、個体数を算出し、比較する試料間のＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの類似度を明らかにする。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数を用いて、試料間の類似度を明らかにします。ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価などに利用することができる。
　１つの実施形態では、ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価として前記類似性指数を使用する。このような類似性指数を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。種々の類似性指数は以下の数式を用いて、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell,　R.　K.　et　al.　Journal　of　Plant　Ecology　5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）を用いて算出することができる。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数は次に示す数式により求める。Ｍｏｒｏｓｉｔａ－Ｈｏｒｎ指数Ｘｉ：片方のサンプルに由来する全Ｘリードに出現するリードｉの回数ｙｉ：もう一方のサンプルに由来する全Ｙリードに出現するリードｉの回数Ｓ：ユニークリード数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000035
 
木元のπ指数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000036
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000037
Ｐｉａｎｋａのα指数
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000038
 
　本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料の調整を行うことができる。これらのシークエンシング技術は、妥当なコストで、試料から100万またはそれ以上のリードを得ることができる。1/1,000,000またはそれよりも低い頻度で存在する遺伝子型でさえ、これらの技術を用いて特異的様式で、しかもバイアスのかかっていない様式で検出することができる。血液または骨髄等のDNA由来の試料から、遺伝子または転写物の特定部分の配列の異なる型をすべて増幅するための非バイアス増幅方法が達成される。
　＜がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法＞
　１つの局面では、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および（４）決定されたペプチドを合成する工程を包含する。ここで合成されたペプチドは、がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用することができる。この方法は、本明細書において「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」と呼ばれることがある。
　がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法では、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、手短には、（１）血液腫瘍を罹患したがん患者末梢血細胞を採取し、リンパ球細胞を分離し、その後、本発明のレパトア解析法を実施することができ、そして、これを用いてがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を行うことができる。　別の実施形態では、Ｔ細胞系腫瘍の場合はＴＣＲ、Ｂ細胞系腫瘍の場合はＢＣＲについて本発明のレパトア解析法を実施することができる。そして、その後、ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列を該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択し、該ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を含む配列から別途決定した該がん患者のヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）に結合するペプチドを、ＨＬＡ結合ペプチド予測プログラム（本明細書においてほかにも説明されているように任意の公知のプログラムを用いることができる）を用いて予測する。そして、ＨＬＡ結合ペプチドをペプチド合成装置により合成し、その後、以下を行う。オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、患者末梢血単核球細胞を採取し、単核球細胞あるいは患者由来抗原提示細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を混合したものに該ペプチドを添加して培養し、抗原ペプチドによる刺激を行なうことができる。
　オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、該ペプチド刺激リンパ球細胞を患者に移入し、ＣＴＬ療法を行うことができる。
　あるいは、オーダーメイドペプチド感作ＤＣワクチン療法の別法として、患者末梢血単核球細胞を採取した後、単球細胞を分離し、分化誘導因子の存在下で樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導した後に、該ペプチドを添加して培養し、該ペプチド感作樹状細胞を患者に移入し、樹状細胞療法を行っても実現することができる。
　がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法は例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。特に、腫瘍細胞を標的とした抗体療法などを行なう場合、腫瘍細胞に標的抗原が発現していない、あるいは標的抗原が正常細胞にも発現することで問題となる。それと比し、腫瘍細胞に特異的な配列を選択して利用するため、より特異性の高い、副作用の少ない治療が期待される。
　１つの実施形態では、本発明における（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
　別の実施形態では、本発明は、本発明における（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、改良型ＣＴＬ法とも呼ばれる。
　改良型ＣＴＬ法では、例えば、既存の抗ＣＤ３抗体やＩＬ－２による広範なＴ細胞の活性化とは異なり、抗原ペプチドを利用したＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原特異性の付与により、より特異性が高く副作用の少ない治療が期待できる。また、該患者の腫瘍細胞から得られた情報をもとに作成した個別化ペプチドを利用するため、高い治療効果が期待できるのが特徴である。
　改良型ＣＴＬ法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、ＤＣワクチン療法とも呼ばれる。
　ＤＣワクチン療法では、例えば、該患者由来の腫瘍細胞から得られた配列情報をもとに個別化ペプチドを作出するため、正常細胞には作用せず、腫瘍細胞により特異的に作用して、高い治療効果が見込める。抗原としてペプチドを用いるため、蛋白とは異なり容易に化学合成することができる利点がある。
　ＤＣワクチン療法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる）。
　別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を包含する。これは、患者自己免疫細胞療法とも呼ばれる。
　患者自己免疫細胞療法では、例えば、ＣＴＬ療法同様に該患者由来のペプチドによるＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激活性化とともに、樹状細胞のペプチド感作も行なうことになる。該患者由来のＣＤ８＋細胞と樹状細胞を共に患者に移入することにより、特異性を付与したＣＴＬによる急性効果と抗原提示細胞として利用した樹状細胞による持続的効果の相乗効果が期待できるのが特徴である。
　患者自己免疫細胞療法では例えば、血液がん（白血病等）、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
　別の局面において、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を付与する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；（４）決定されたペプチドを合成する工程；必要に応じて（５）合成したペプチドを用いて治療を行う工程を包含する。この方法は、治療剤を製造する方法および治療自体を行う方法の両方を包含する。医療行為を除く場合は、（５）の前までの工程で完了させることができる。
　好ましい実施形態では、本発明では、前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
　ＢＩＭＡＳとは、www-bimas.cit.nih.gov/で提供されるＨＬＡペプチド結合の推定プログラムである。
　ＳＹＦＰＥＩＴＨＩとは、www.syfpeithi.de/で提供される、ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのデータベースおよび検索エンジンである。
　ＲＡＮＫＰＥＰとは、http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.htmlで提供される、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ分子に対するペプチド結合の予測プログラムである。
　ＮｅｔＭＨＣとはwww.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/で提供される、多数のＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチドの結合を予測するプログラムサーバーである。
　好ましい実施形態では、改良型ＣＴＬ法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程、および該培養後の混合物を患者に投与する工程を包含する。
　好ましい実施形態では、ＤＣワクチン療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程、および該培養された混合物を患者に投与する工程を包含する。
　好ましい実施形態では、患者自己免疫細胞療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞－ペプチド混合物を生産する工程を行い、該ＣＤ８＋Ｔ細胞－樹状細胞／抗原提示細胞－ペプチド混合物、および該樹状細胞－ペプチド混合物を患者に投与する工程を包含する。
　＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
　別の局面において、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または本発明の「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。
　１つの実施形態では、以下のように実施することができ、例えば、（１）がん患者から腫瘍細胞を摘出する。（２）該患者由来腫瘍細胞を破砕後、単一細胞に分離し、マイトマイシンＣなどの化学処理や放射線照射により不活化処理をする。（３）該がん患者の全血より末梢血細胞を分離する。（４）末梢血細胞の一部を未処理コントロール試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する（５）不活化腫瘍細胞と末梢血細胞を混合し、培養することにより腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、増殖させる。（６）活性化後、末梢血細胞を回収し、刺激後試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する。（７）（４）及び（６）で抽出したＲＮＡ試料から本発明のレパトア解析法を実施する。（８）コントロール試料に比し刺激試料で大きく増加したＴＣＲ遺伝子を抽出し、それらをランキングした後に、上位のＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を選択する。（９）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（１０）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（１１）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（１２）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１３）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療を実現することができる。
　具体的には、本発明の実施形態において、例えば、血液腫瘍の場合は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」に記載の方法で決定したＴＣＲまたはＢＣＲを抗原もしくはペプチドとして使用することができる。ここでは任意のがん抗原や患者由来の不活化がん組織が想定されるが、代表的に以下の方法が利用され得る：任意の抗原タンパク質または任意の抗原ペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法；被験者由来リンパ球と被験者由来不活化がん細胞を混合する方法；「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において提供されるレパトア解析より決定されたＴＣＲまたはＢＣＲ由来のペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法が提供される。
　したがって、１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　さらなる局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球またはがん組織を提供する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このような共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。この方法は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」とも呼ばれる。
　このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。１つの実施形態では、まず、（１）ＨＬＡが同一のがん患者から腫瘍細胞を摘出または末梢血を分離する。（２）腫瘍細胞浸潤Ｔ細胞を含む腫瘍組織、あるいはリンパ球細胞を用いてレパトア解析を行なう。（３）各試料においてその存在頻度に基づいてランキングし、末梢血細胞に比し腫瘍細胞で高い存在頻度を示した腫瘍特異的Ｔ細胞を選択する。（４）それら腫瘍特異的Ｔ細胞について、複数のＨＬＡ一致がん患者で共通する配列を検索する。（５）最も多くの癌患者で共通する腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を治療用腫瘍特異的ＴＣＲとして選択する。（６）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（７）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（８）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（９）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１０）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療を実現することができる。
　このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　したがって、別の局面では、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球またはがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法を提供する。このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　したがって、このｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法の１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
　さらに別の局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供し、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体からリンパ球またはがん組織を単離する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法によって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離する方法を提供する。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　＜細胞加工療法＞
　さらなる局面において、本発明は、細胞加工療法を提供する。詳細には、本発明は、A)患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程；およびＤ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法を提供する。この腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
　このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞あるいは＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞で記載された方法により腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を用いることができる。
　したがって、本発明の細胞加工療法において、抗原として任意のがん抗原またはがんペプチドを製造もしくは合成によって生産し、採取された不活性化患者がん細胞を利用することができ、あるいは腫瘍由来イディオタイプペプチドを利用することができる。選択方法としては、がん組織で高発現する抗原を選択する、あるいは患者ＨＬＡ型に結合するペプチドを抗原として選択することができる。
　好ましい実施形態では、本発明の細胞加工療法では、最適抗原として、例えば、（１）患者がん組織に高発現する抗原、（２）抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる、抗原を選択することが想定され得るがこれらに限定されない。また、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる例において最も増加したＴＣＲを最適ＴＣＲとして選択する方法なども想定することができる。また、代表的な例としては、最適ＴＣＲ候補を患者リンパ球に人為的に遺伝子導入し、実際の患者がん組織に最も高い反応性を示したものを最適ＴＣＲとして選択することができる。
　このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
　したがって、１つの実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明のの抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
　別の実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
　１つの特定の実施形態では、本発明は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法を提供する。
　有効性は、例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞と被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる抗原刺激がなされた該被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされ抗原刺激がなされたような該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによって抗原刺激がなされた腫瘍由来イディオタイプペプチドと培養した後に、Ｔ細胞の活性化に応じて細胞外に分泌されるサイトカイン（インターフェロンγ等）量を測定する、Ｔ細胞の活性化に応じて上昇する特定の遺伝子の発現量を測定する、あるいはＴ細胞の活性化に応じて発現または発現増加する細胞表面分子を測定することで、有効性を評価することができる。
　＜安全性＞例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した前記被験者に由来するＴ細胞と該被験者に由来する正常細胞を混合した場合に、上記Ｔ細胞の活性化に応じて分泌されるサイトカイン、遺伝子発現、あるいは細胞表面分子の発現を測定し、該ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞が正常細胞により活性化されないことを確認することにより安全性を評価することができる。
　１つの実施形態では、有効性および／または安全性評価の具体的なステップは以下のように実現することができる。すなわち、例えば、（１）レトロウイルス遺伝子発現系を用いて腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子導入Ｔリンパ球細胞を作出する。（２）有効性を評価する場合、患者由来の癌細胞を摘出・分離し、不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（３）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ－２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、より強く腫瘍細胞に反応するＴＣＲ遺伝子を選択することができる。（４）安全性を評価する場合、対照となる既存の細胞株、患者癌細胞を含んでいない正常組織（腫瘍摘出の過程で採取される正常組織の一部）、あるいは固形腫瘍の場合は患者末梢血細胞を用いて不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（５）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ－２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、正常細胞に対し反応性を示さないＴＣＲ遺伝子を選択することができる。
　したがって、別の局面では、本発明は、A)患者からＴリンパ球を採取する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程；Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程；E)該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を該患者に導入する工程；を包含する細胞加工療法を提供する。
　得られた腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を該患者に導入する工程を実施する方法は以下：Ａ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を製造する工程；Ｂ）腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβの発現を確認する工程；Ｃ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を静脈から点滴移入する工程を包含する。
　したがって、１つの実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
　別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法に基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
　＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
　一つの実施形態として、本発明のレパトア解析法を用いてＢＣＲ遺伝子レパトア解析を行い、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、本発明のレパトア解析法によるＢＣＲレパトア解析により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid,　IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese　Hamster　Ovary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ－Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
　この実施形態で用いられるKMマウスについては、Ishida　I,　Tomizuka　K,　Yoshida　H,　Tahara　T,　Takahashi　N,　Ohguma　A,　Tanaka　S,　Umehashi　M,　Maeda　H,　Nozaki　C,　Halk　E,　Lonberg　N.　Production　of　human　monoclonal　and　polyclonal　antibodies　in　TransChromo　animals.　Cloning　Stem　Cells.　2002;4(1):91-102.　Review.を参照することができ、NOGマウスについては、Ito　M,　Hiramatsu　H,　Kobayashi　K,　Suzue　K,　Kawahata　M,　Hioki　K,　Ueyama　Y,　Koyanagi　Y,　Sugamura　K,　Tsuji　K,　Heike　T,　Nakahata　T.　NOD/SCID/gamma(c)(null)　mouse:　an　excellent　recipient　mouse　model　for　engraftment　of　human　cells.　Blood.　2002　Nov　1;100(9):3175-82.を参照することができ、CHO細胞/抗体産生については、Jayapal　KP,　Wlaschin　KF,　Hu　W-S,　Yap　MGS.　Recombinant　protein　therapeutics　from　CHO　cells-20　years　and　counting.　Chem　Eng　Prog.　2007;103:40?47.；Chusainow　J,　Yang　YS,　Yeo　JH,　Toh　PC,　Asvadi　P,　Wong　NS,　Yap　MG.　A　study　of　monoclonal　antibody-producing　CHO　cell　lines:　what　makes　a　stable　high　producer?　Biotechnol　Bioeng.　2009　Mar　1;102(4):1182-96を参照することができる。
　＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
一つの実施形態として、当該ＢＣＲ遺伝子レパトア解析法を利用して、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、ＢＣＲレパトア解析法により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid,　IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese　Hamster　Ovary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ－Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
　これらの方法の実施形態としては以下を挙げることができる。その一例として、
１．ＫＭマウスに実験的自己免疫性脳脊髄炎の抗原ペプチドであるMyelin　Oligodendrocyte　Glycoprotein(MOG35-55,　MOG)を免疫する。等量の2mg/mL　MOGペプチドと完全フロイントアジュバントを混合し、エマルジョンを作成し、200μgのMOGを皮下に免疫し、同時に400ngの百日咳毒素を腹腔に免疫する。対PBSと完全フロイントアジュバントによる免疫を行い、対照マウスとする。
２．初回免疫後2日目に400ngの百日咳毒素を免疫し、免疫後10日目に発症を確認した後、脳脊髄炎発症マウスより脾臓を摘出する。
３．発症マウスと対照マウスの脾臓を用いて、次世代BCRレパトア解析を実施する。IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖について、個々のBCR配列の出現頻度の集計とランキングを行う。
４．対照ウスに比し、発症マウスにおいて出現頻度が大きく増加したBCR配列を抽出し、ランキングする。これら抗体投与によって誘導されたBCR配列のランキング上位のものの組み合わせについて、MOG特異的抗体遺伝子として同定する。
５．発症マウスから増幅したBCR遺伝子増幅産物からPCR-cloning法により全長ヒト免疫フロブリン配列をクローニングする。抗体発現用ベクターにIgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれをクローニングする。１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法がある。
６．これら構築した発現ベクターでリポフェクタミン３０００（Life　Science）を用いてＣＨＯ（Chinese　Hamster　Ovary）細胞を形質転換し、IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を導入する。
７．CHO細胞培養液を回収し、ProteinAアフィニティーカラムによる精製、ゲル濾過による濃縮により、分泌された抗体蛋白を回収する。
８．回収した抗体を用いたELISAアッセイにより、MOG35-55またはMOG蛋白に対する結合活性を測定し、抗体の特異性を検証する。
９．十分な特異性が得られたら、抗体発現安定発現細胞株を取得し、大量培養系によりヒト型抗MOG抗体を製造する。
　本明細書中で挙げられた科学文献、特許公報、特許出願公報などの参考文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
　以下の試薬を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
 
　使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
Block　primer:　GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号1）
RT　primer：　AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号2）
Template　switch　Oligo　（3’の3塩基はRNA）：AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG（配列番号3）
　Block　primer及びRT　primerは、マウスTCRβ鎖の定常領域に特異的なリバースプライマーである。全配列がTCRβmRNAにハイブリダイズするように設計されている。RT　primerは3’側に4塩基分、nestedに設計されている。またRT　primerは、5’側を8塩基伸ばし、affinityを高くしている。これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖をコードするmRNAの定常領域から5’末端までを増幅することができる。増幅される領域には、抗原認識部位を含む再構成されたVDJや非翻訳領域などが含まれる。従って、T細胞集団から採取したtotal　RNAを鋳型として、これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖の抗原認識部位や非翻訳領域などのcDNAライブラリーを構築することができる。また、セルソーター等によりソートしたシングルセルのT細胞をそのまま鋳型として用いれば（細胞内のRNAが鋳型となる）、個々の細胞のTCRβ鎖の抗原認識部位を特異的に増幅し、その配列を決定することができる。
　本試験においては、ワンステップで逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。典型的には以下の表の組成の反応混合液を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
 
　典型的には以下の熱サイクリング条件を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
  
　尚、反応混合液の組成及び熱サイクリング条件の一部は、試験内容に応じて、適宜変更した。
［試験例1］
　以下のTotal　RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
 
　結果を図1に示す。ブロックプライマーを用いないときは、多数の非特異的なバンドが検出されたが（レーン1）、ブロックプライマーの添加により、非特異的なバンドが消失した（レーン2～11）。0.04μM～0.00016μMのRTプライマー濃度で、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された。比較的高いRTプライマー濃度（0.4μMなど）において、マイナーな非特異的バンドを認めたが、RTプライマー濃度を低下させることにより、これを抑制することができた。
［試験例2］
　以下の細胞数、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は48とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
 
　結果を図2に示す。いずれの条件においても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された。RTプライマーを添加しなくても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された（レーン3）。また、細胞数を10個とし、上記ブロックプライマーをCleanAmpTM　Turbo　Primers（TriLink社）に変更して前述の条件と同様にワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った結果、同様にTCRβ鎖の特異的増幅が観察された。
［試験例3］
　シングルセルのマウスT細胞に、直接ワンステップで反応溶液を加え、ダイレクトワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は56とした。
　結果を図3に示す。TCRβ鎖の全長のみが増幅された細胞と、TCRβ鎖の全長及び断片が増幅された細胞が認められた。また、56回もの多サイクル数に関わらず、非特異的増幅は認められなかった。
［試験例4］
　PCR増幅のサイクル数を種々変動させた（サイクル数：38、40、42及び44）。Block　primer濃度は0.4μM、RT　primer濃度は0.002nMとした。
　結果を図4に示す（レーン1：38、レーン2：40、レーン3：42、レーン4：44）。44サイクルで、TCRβ鎖の特異的バンドが観察された。
［試験例5］
　以下のTotal　RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は42回とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
 
　結果を図5に示す。ブロックプライマーを用いないときは、スメア状の多数の非特異的なバンドが検出されたが（レーン1）、ブロックプライマーの添加により、非特異的なバンドが消失した（レーン2～10）。比較的高いRTプライマー濃度（0.2μM）において、マイナーな非特異的バンドが残存したが、RTプライマー濃度を低下させることにより、これを抑制することができた。RTプライマーを添加しなくても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された（レーン10）。
　[試験例6]
　ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRレパトア解析法にて特定のTCRα鎖およびTCRβ鎖を過剰発現する遺伝子改変マウス（Pmel-1マウス）由来リンパ球細胞のレパトア解析を行った。
　試薬のリスト 
-PrimeScript　II　HighFidelity　Onestep　RT-PCR　kit(R026A,　タカラバイオ)
-40U/uL　RNasin　Plus　RNase　Inhibitor　(N2611,　Promega)
-40　U/uL　Cloned　RNase　Inhibitor　(Ambion,　AM2682)
-20　U/uL　SUPERaseIn　RNase　Inhibitor　(Ambion,　AM2694)
-200U/uL　SuperScript　IV　Reverse　Transcriptase(18090010,　Invitrogen)
-2×KAPA　HiFi　Hot　Start　Ready　Mix(KK2602,　日本ジェネティクス)
-AmpureXP　Agencourt(A63880,　BECKMAN　COULTER)
-Qubit　dsDNA　HS　assay　kit　(Q32854,　Thermo　Fisher　Scientific)
　使用したオリゴヌクレオチド配列
-RT　primer(30塩基):　ACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号4）
-Block　primer（30塩基）:　GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号5）
-TS-Oligo（30塩基）：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT[G][G](G)※（配列番号6）
※[ ]の右端から2、3番目の２塩基はRNA、（）の右端の1塩基はLNA
-Forward　Tag　primer　v1　(63塩基)：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（下線部がタグ配列部位）（配列番号7）
-Reverse　Tag　primer　v1　(63塩基)：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（下線部がタグ配列部位）（配列番号8）
-Index　primer:　Nextera　XT　Index　Kit　v2　Set　A（Illumina）のN7シリーズ12種（配列番号9～20）、S5シリーズ8種（配列番号21～28）から選択した。
　N7シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715)
　S5シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。
　本試験では、N715-S505とN715-S506のインデックスの組み合わせを使用した。
　(1)RNA調製
　本試験において、特定のTCRα鎖およびTCRβ鎖を過剰発現する遺伝子改変マウス（Pmel-1マウス）由来のリンパ球細胞よりTotal　RNAを抽出した。
　(2)ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR
　抽出したTotal　RNAを用い、以下の反応組成液にて、連続的に加熱反応-PCRサイクルを実施した。まず45℃30分の逆転写反応、続いて95℃5分のブロックプライマー活性化反応、次に98℃10秒、60℃6秒の2ステップPCR反応(44サイクル)、最後に60℃5分の最終伸長反応を行うことにより、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR反応を完了した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
 　(3)タグPCR
　以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングランのタグ配列を付加するため、フォワードプライマー、並びにリバースプライマーの5'末端にそれぞれ34塩基、33塩基のタグ配列を付加したDNAプライマーペア（Forward　Tag　primer　v1とReverse　Tag　primer　v1のペア）を用い、95℃3分、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分の3ステップPCR反応(20サイクル、最終サイクル後に72℃2分の最終伸長反応あり)を行うことにより、タグ付加TCR　cDNAアンプリコンを調製した。タグ配列は、Miseqによるシーケンシングを行うために必要な配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCRのプライミングサイトとしても機能する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
 　(4)インデックスPCR
　以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングラン後のサンプル振り分け用Index配列、並びに最も5'末端側に解析基板であるフローセルに固定化するための配列(ブリッジPCRのための配列)を付加するためのPCR反応を行った。反応は95℃3分の後、95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒の3ステップPCR反応(13サイクル、最終サイクル後に72℃5分の最終伸長反応あり)を行うことにより、シークエンシングラン用のDNAサンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
 　(5)インデックスPCR反応液の電気泳動確認
　インデックスPCR反応液3μlを1.5％アガロースゲル中にて30分間電気泳動し、これまでの実験工程でTCRDNAアンプリコンが増幅されていることを確認した（図6）。
　(6)DNA断片の精製、濃度測定と濃度測定
　反応液10μlを分取し、AmpureXP　Agencourtビーズ液8μlを添加、メーカーのプロトコールに従いDNAのビーズへの結合反応、ビーズ洗浄操作を行った後、25μlの純水中に精製DNAを回収した。Qubit　dsDNA　HSアッセイキットにて精製したDNAの濃度を測定した。
　(7)Miseqランの実施
　精製DNAサンプルは4nMに希釈後、イルミナ社Miseqシークエンサーの標準プロトコールに従いシークエンシングランを行った。
　(8)レパトアデータ解析
　Fastq形式のシークエンシングデータをレパトアジェネシスソフトウエアにて解析した。サンプル中のV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ（図7）、およびV-J使用頻度グラフ（図8）が得られた。また、CDR3配列(配列番号29～33)を含めたユニークリードランキングの集計を表10に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
 　[試験例7]
　C57BL/6マウス脾臓組織検体を用いてワンステップRT-TS-PCRレパトア解析を行った。
　ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRレパトア解析法にて脾臓のレパトア解析を行った。実験に供した検体は、C57BL/6マウス脾臓組織検体と、抗CD３抗体と抗CD28抗体刺激後48時間に回収したPmel-1マウス由来のリンパ球細胞の2種類を用いた。
　試薬のリスト
-PrimeScript　II　HighFidelity　Onestep　RT-PCR　kit(R026A,　タカラバイオ)
-40U/uL　RNasin　Plus　RNase　Inhibitor　(N2611,　Promega)
-40　U/uL　Cloned　RNase　Inhibitor　(Ambion,　AM2682)
-20　U/uL　SUPERaseIn　RNase　Inhibitor　(Ambion,　AM2694)
-200U/uL　SuperScript　IV　Reverse　Transcriptase(18090010,　Invitrogen)
-2×KAPA　HiFi　Hot　Start　Ready　Mix(KK2602,　日本ジェネティクス)
-AmpureXP　Agencourt(A63880,　BECKMAN　COULTER)
-Qubit　dsDNA　HS　assay　kit　(Q32854,　Thermo　Fisher　Scientific)
　使用したオリゴヌクレオチド配列
-RT　primer(30塩基):ACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号4）
-Block　primer（30塩基）:GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号5）
-TS-Oligo（30塩基）：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT[G][G](G)※（配列番号6）
※[　]の右端から2、3番目の２塩基はRNA、（）の右端の1塩基はLNA
-Forward　Tag　primer　v1　(63塩基)：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（下線部がタグ配列部位）（配列番号7）
-Reverse　Tag　primer　v1　(63塩基)：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（下線部がタグ配列部位）（配列番号8）
-Index　primer:　Nextera　XT　Index　Kit　v2　Set　A（Illumina）のN7シリーズ12種（配列番号9～20）、S5シリーズ8種（配列番号21～28）から選択した。
　N7シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715)
　S5シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。
　本試験では、N715-S502、S503、S505、S506、S507、S508、S510またはS511のインデックスの組み合わせを使用した。
　実験手順
　(1)RNA調製
　本試験においてTCRβレパトアを行うために、脾臓組織およびリンパ球細胞よりRNAを抽出した。
　(2)ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR
　抽出したRNAを用い、以下の反応組成液にて、連続的に加熱反応-PCRサイクルを実施した。まず45℃30分の逆転写反応、続いて95℃5分のブロックプライマー活性化反応、次に98℃10秒、60℃6秒の2ステップPCR反応(44サイクル)、最後に60℃5分の最終伸長反応を行うことにより、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR反応を完了した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
 　(3)タグPCR
　以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングランのタグ配列を付加するため、フォワードプライマー、並びにリバースプライマーの5‘末端にそれぞれ34塩基、33塩基のタグ配列を付加したDNAプライマーペア（Forward　Tag　primer　v1とReverse　Tag　primer　v1のペア）を用い、95℃3分、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分の3ステップPCR反応(20サイクル、最終サイクル後に72℃2分の最終伸長反応あり)を行うことにより、タグ付加TCR　cDNAアンプリコンを調製した。タグ配列は、Miseqによるシーケンシングを行うために必要な配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCRのプライミングサイトとしても機能する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
 　(4)インデックスPCR
　以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングラン後のサンプル振り分け用Index配列、並びに最も5'末端側に解析基板であるフローセルに固定化するための配列(ブリッジPCRのための配列)を付加するためのPCR反応を行った。反応は95℃3分の後、95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒の3ステップPCR反応(13サイクル、最終サイクル後に72℃5分の最終伸長反応あり)を行うことにより、シークエンシングラン用のDNAサンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
 　(5)インデックスPCR反応液の電気泳動確認
インデックスPCR反応液3μlを1.5％アガロースゲル中にて30分間電気泳動し、これまでの実験工程でTCRDNAアンプリコンが増幅されていることを確認した（図9）。図9におけるレーンは、左から順に、1：マーカーDNA、2～6：マウス脾臓組織（1000ng、200ng、40ng、8ng、1.6ng）、7～8：Pmel-1由来リンパ球（8ng、1.6ng）、9：blankを示す。
　(6)DNA断片の精製、濃度測定と濃度測定
　反応液10μlを分取し、AmpureXP　Agencourtビーズ液8μlを添加、メーカーのプロトコールに従いDNAのビーズへの結合反応、ビーズ洗浄操作を行った後、25μlの純水中に精製DNAを回収した。Qubit　dsDNA　HSアッセイキットにて精製したDNAの濃度を測定した。
　(7)Miseqランの実施
　精製DNAサンプルは4nMに希釈後、イルミナ社Miseqシークエンサーの標準プロトコールに従いシークエンシングランを行った。
　(8)レパトアデータ解析
　脾臓組織検体において得られたFastq形式のシークエンシングデータをレパトアジェネシスソフトウエアにて解析した。サンプル中のV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ（図10）、およびV-J使用頻度グラフ（図11）が得られた。また、CDR3配列(配列番号34～38)を含めたユニークリードランキングの集計を表14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
 　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。本発明は、2016年6月23日に出願された日本国出願特願2016-125007号に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる。
　本発明によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。このような逆転写テンプレートスイッチングPCRの技術を利用することにより特異的に増幅された核酸試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。

Claims (24)

  1. 　被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、
    　(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
    　(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、
    　(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
    を含み、
    　該工程(1)は、
    　a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
    　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
    を含み、
    　該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
  2. 　被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、
    　a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
    　b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
    を含み、
    　該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    　該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
  3. 　前記核酸試料は、非バイアス的に増幅された核酸試料である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まず、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
    　i)逆転写に必要な試薬と、
    　ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
    　iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
    　iv)必要に応じて、使用説明書
    を含み、
    　i)～iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、
    　ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    　該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キット。
  10. 　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項９に記載のキット。
  11. 　前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、請求項１０に記載のキット。
  12. 　前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、請求項９～１１のいずれか一項に記載のキット。
  13. 　前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、前記TCRまたは該BCRの鋳型RNAのC領域の部分配列にハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項１３に記載のキット。
  15. 　被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのものである、請求項９～１４のいずれか一項に記載ｓのキット。
  16. 　前記工程(1)は、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含む、請求項１、ならびに請求項１に従属する場合の請求項３～８に記載の方法。
  17. 　前記配列解析のために適切な配列は、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記工程(1)は、以下：
    　c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
    　d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程と
    をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 　前記工程(3)は、以下：
    　(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、
    　(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、
    　(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、
    　(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、
    　(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、
    　(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
    を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 　データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
    (1)請求項１５に記載のキット；
    (2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
    (3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置
    を備えるシステム。
  21. 　(1)前記キットは、以下：
    　c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、
    　d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段と
    をさらに含む、請求項２０に記載のシステム。
  22. 　(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：
    　(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；
    　(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
    　(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
    　(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；
    　(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および
    　(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段
    を備える、請求項２０または２１に記載のシステム。
  23. 　請求項２０～２２のいずれか一項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステム。
  24. 　請求項２３に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。

     
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