TW201805432A - 利用單步驟逆轉錄模板置換pcr之t細胞受體及b細胞受體多樣性解析系統 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析的方法，該方法包括如下步驟：(1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係利用單步驟逆轉錄模板置換PCR而由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得；(2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟。
Description
本發明係關於一種用以藉由單步驟實施逆轉錄模板置換PCR之技術及利用該技術之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)多樣性解析系統。
逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)作為以RNA為模板而擴增特定之基因之方法，通用於基因工程之領域。於RT-PCR中，首先使用逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)將RNA逆轉錄為cDNA，進而藉由耐熱性DNA聚合酶擴增至能夠檢測出該cDNA之水準。傳統上該反應之組合係以兩步驟(各反應各別地使用試管繼續反應)進行，但業界正開發藉由努力研究逆轉錄酶或反應溶液組成而以單步驟(於1個管中連續反應)進行該反應之組合的技術。 模板置換(Template Switching)係即使於未知成為模板之RNA之5'末端的序列，或不具有共通序列之情形時，亦能夠實現以該RNA作為模板之RT-PCR擴增之技術。模板置換利用如下現象：若逆轉錄酶到達模板RNA之5'末端，則藉由逆轉錄酶所具有之末端轉移酶活性，而於新合成之cDNA之3'末端自動地附加特定之較短之序列(例如於來自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)之逆轉錄酶(MMLV RT)之情形時，為富含胞嘧啶之較短之序列)。若於對附加於錨定序列之3'末端之寡核苷酸(模板置換寡核苷酸)進行逆轉錄時向系內添加與該較短之附加序列互補之序列，則該模板置換寡核苷酸與所合成之cDNA之3'末端進行雜交，而延長用於逆轉錄酶之模板。由於逆轉錄酶改換模板，繼續cDNA合成直至錨定序列之5'末端為止，因此會於cDNA之3'端附加與錨定序列互補之序列。藉由使用含有與模板RNA中之特定序列互補之序列的寡聚DNA、或於5'末端附加有特定之已知序列之寡聚DNA作為逆轉錄之引子而新合成之cDNA於5'末端亦具有已知序列，故而結果為新合成之cDNA(反義鏈)於5'末端與3'末端之兩端具備已知序列。因此，藉由使用基於該等已知序列所設計之引子組，變得能夠實現PCR擴增。 與具有聚(A)尾之mRNA相對應之cDNA之合成可藉由使用無規引子或含有與聚(A)尾互補之寡聚(dT)之引子的逆轉錄而達成。於該反應中，由於由具有聚(A)尾之全部mRNA合成cDNA，因此形成cDNA基因庫。另一方面，藉由在逆轉錄中使用對特定基因具有特異性之引子，而能夠僅特異性地合成特定之基因之cDNA。 為了能夠應用於高通量，業界謀求更迅速、更簡便、且以較高之特異性進行逆轉錄模板置換PCR之技術。 然，作為避免PCR中之副反應之技術，業界正開發各種熱啟動(hot start)技術。即，於進行PCR時，於從製備反應液起至溫控循環機之溫度上升為止之期間，將PCR反應混合液曝露於室溫～50℃之溫度下。由於通常將引子之Tm設定為50℃以上，因此於該溫度區域不會充分地發揮引子之特異性。另一方面，由於即使在該溫度區域，雖然較弱，聚合酶亦表現出活性，因此產生以經誤退火之引子為起點之伸長，成為各種副反應(引子二聚物、額外帶(extra band)等)之原因。作為避免該副反應之技術，正開發鍵結有熱不穩定性之修飾基之寡核苷酸引子(專利文獻1及2、非專利文獻1及2)。於該寡核苷酸引子中，於1個以上之核苷酸間之鍵或3'末端羥基取代有修飾基。由於利用該修飾基進行保護，因此可抑制PCR擴增中於最初之高溫下之培養期間前之DNA聚合酶媒介性寡核苷酸引子伸長。由於存在修飾基，因此引子於達到最初之改性溫度(多數情形時為95℃)之前處於非活性狀態。若達到最初之改性溫度，則藉由修飾基脫離，成為能夠利用聚合酶而伸長之相對應之未修飾寡核苷酸引子。 近年來，藉由快速進步之下一代序列解析技術，變得能夠實現大規模之基因之鹼基定序。藉由從人類試樣中PCR擴增TCR基因，利用下一代序列解析技術，而由先前為小規模且獲得V鏈使用頻度等有限之資訊之TCR多樣性解析，實現獲得純系水準更詳細之基因資訊進行解析之下一代TCR多樣性解析法。專利文獻3揭示使用利用接附引子(adaptor primer)無偏地進行擴增之核酸試樣對T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析之方法。 [先前技術文獻] [專利文獻] [專利文獻1]美國專利第8133669號說明書 [專利文獻2]美國專利第8361753號說明書 [專利文獻3]國際公開第2015/075939號 [非專利文獻] [非專利文獻1]Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2009 Sep; Chapter 4: Unit 4.35 1-17 [非專利文獻2]Nucleic Acids Res. 2008 Nov; 36(20):e131
[解決問題之技術手段] 本發明提供一種更迅速、更簡便、且以較高之特異性進行逆轉錄模板置換PCR之技術。又，本發明提供一種應用逆轉錄模板置換PCR對T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析之方法。 以下，對本發明進行詳細說明。於逆轉錄模板置換PCR中，本發明者使用對特定之基因具有特異性之引子作為逆轉錄用之引子，且使用具有模板置換引子中之錨定序列之寡核苷酸與上述逆轉錄用之引子之組合作為PCR用之引子組，而嘗試以單步驟(於同一反應系中為一個階段)實施逆轉錄與PCR之反應組合。然而，該方法會產生副反應，尤其於成為模板之RNA之複本數較少而增多PCR之循環數時，該傾向較顯著。認為產生副反應之原因如下：PCR之特異性僅取決於逆轉錄用之引子；由於相對於模板RNA之複本數，逆轉錄用引子遠過量地存在，因此逆轉錄用引子非特異性地與模板RNA進行雜交，而產生非特異性之逆轉錄。 因此，於上述反應組合中，逆轉錄用引子不僅用作逆轉錄中之引子，而且亦用作PCR中之引子，藉由改變該情況，以利用熱不穩定性之修飾基保護與逆轉錄用引子相同之寡核苷酸之3'末端OH而不活化之引子(以下，有時將經不活化之引子稱為阻斷引子)作為PCR用之引子，減少逆轉錄用引子之添加量，而成功地抑制了副反應之產生。藉由該方法，於逆轉錄中逆轉錄用引子及阻斷引子與模板RNA進行雜交，但阻斷引子因修飾基之保護而無助於逆轉錄，從而僅以逆轉錄用引子為起點產生逆轉錄。即使阻斷引子非特異性地與模板RNA進行雜交，亦不會產生逆轉錄產物。若藉由PCR擴增中之最初之高溫下之培養，修飾基自阻斷引子脫離而轉化為未修飾引子，則變得有助於伸長反應，因此PCR會進行。令人驚訝的是，即使不添加未修飾之逆轉錄用引子，僅添加阻斷引子，以單步驟進行逆轉錄模板置換PCR，亦能夠達成具有較高之特異性之PCR擴增。 本發明係應用於利用上述單步驟逆轉錄模板置換PCR對T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析者。 本發明者基於上述見解並進一步研究，而完成本發明。 即，包括本發明： [1]一種核酸之擴增方法，其特徵在於：其係使用改型寡核苷酸引子擴增RNA之至少一部分區域者，且 核酸之擴增反應包括：以RNA作為模板之逆轉錄步驟a)；對步驟a)中所合成之cDNA附加模板置換寡核苷酸之模板置換步驟b)；及利用以步驟b)中所合成之模板置換cDNA作為模板之PCR之DNA擴增步驟c)，上述步驟a)～c)係於同一反應系中在一個階段進行， 該改型寡核苷酸引子因該改型而於逆轉錄步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙，並且於DNA擴增步驟c)中引子功能之阻礙得以解除。 [2]一種核酸之擴增方法，其係使用改型寡核苷酸引子擴增RNA之至少一部分區域者，其包括以下之步驟： 1)提供一種組合物，該組合物包含：i)模板置換寡核苷酸；ii)包含含有該模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子、及改型寡核苷酸引子之引子組；以及iii)模板RNA，並且含有將該模板RNA模板置換逆轉錄為cDNA、及將該cDNA之至少一部分區域進行PCR擴增所需之全部試劑(其中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子除外)； 2)藉由在可進行逆轉錄之溫度下培養1)所提供之組合物，由該模板RNA生成於3'末端附加有與錨定序列互補之核苷酸序列之cDNA，而獲得含有該cDNA之反應混合液；及 3)藉由將2)中獲得之反應混合液供於可進行PCR之複數次熱循環操作流程中，而以該cDNA作為模板，獲得夾在上述引子組間之區域經擴增之核酸，且 該改型寡核苷酸引子因該改型而使逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙，且藉由該逆轉錄之結果、或PCR之初期熱改性處理，引子功能之阻礙得以解除。 [3]如[2]所記載之方法，其中1)所提供之組合物進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 [4]如[1]至[3]中任一項所記載之方法，其中改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [5]如[4]所記載之方法，其中該改型寡核苷酸引子含有與模板RNA之部分序列互補之核苷酸序列。 [6]如[5]所記載之方法，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [7]如[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中起始逆轉錄之寡核苷酸引子之濃度為40 nM以下。 [8]如[1]至[7]中任一項所記載之方法，其中PCR之熱循環之次數為40次以上。 [9]一種用以實施單步驟逆轉錄模板置換PCR的套組，其包含： i)模板置換寡核苷酸；以及 ii)包含含有該模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子、及改型寡核苷酸引子之引子組； 該改型寡核苷酸引子因該改型而使逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙，且藉由該逆轉錄之結果、或熱改性處理而獲得以該逆轉錄之產物作為模板之PCR中之引子功能。 [10]如[9]所記載之套組，其以包含i)之寡核苷酸、及ii)之引子組之混合物之組合物之形式含有兩者。 [11]如[9]或[10]所記載之套組，其進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 [12]如[9]或[10]所記載之套組，其不含起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 [A1] 一種將對象RNA之至少一部分區域進行擴增之方法，該方法包括： a)將該對象RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有模板置換寡核苷酸及與該對象RNA相對應之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而將該cDNA之至少一部分區域進行擴增之步驟； 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 [A2] 一種生產基於對象RNA之至少一部分區域而擴增之核酸試樣之方法，該方法包括： a)將該對象RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有模板置換寡核苷酸及與該對象RNA相對應之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件之步驟； 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 [A3] 如[A1]或[A2]所記載之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑視需要包含含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。 [A4] 如[A3]所記載之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子。 [A5] 如[A1]至[A4]中任一項所記載之方法，其中上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，且該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比含有於上述混合物中。 [A6] 如[A1]至[A5]中任一項所記載之方法，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [A7] 如[A1]至[A6]中任一項所記載之方法，其中上述改型寡核苷酸引子含有與模板RNA之部分序列互補之核苷酸序列。 [A8] 如[A7]所記載之方法，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [A9] 一種用以將對象RNA之至少一部分區域進行擴增的套組，其係以包含 i)逆轉錄所需之試劑、 ii)模板置換所需之試劑、 iii)使用改型寡核苷酸引子之聚合酶鏈反應所需之試劑、及 iv)視需要之使用說明書，且 於反應開始時將i)～iii)之試劑及該改型寡核苷酸引子全部於反應系中加以混合為特徵，該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分或全部受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計。 [A10] 如[A9]所記載之套組，其中上述模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸，且上述聚合酶鏈反應所需之試劑視需要包含含有該模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。 [A11] 如[A10]所記載之套組，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子。 [A12] 如[A9]至[A11]中任一項所記載之套組，其特徵在於：上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，且該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比而使用。 [A13] 如[A9]至[A12]中任一項所記載之套組，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [A14] 如[A9]至[A13]中任一項所記載之套組，其中上述改型寡核苷酸引子含有與模板RNA之部分序列互補之核苷酸序列。 [A15] 如[A14]所記載之套組，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [A16] 一種含有改型寡核苷酸引子之用以將對象RNA之至少一部分區域進行擴增的組合物，該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計，引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [A17] 如[A16]所記載之組合物，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [A18] 如[A16]或[A17]所記載之組合物，其中上述組合物係於單步驟逆轉錄模板置換PCR中所使用者。 [B1]一種對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析之方法，其包括： (1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得； (2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟；及 (3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟； 該步驟(1)包括： a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟， 該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸； 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 [B2]一種生產用以對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析之核酸試樣的方法，該方法包括(1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得，該步驟(1)包括： a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟； 該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸， 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 [B3]如[B1]或[B2]所記載之方法，其中上述核酸試樣係無偏性地進行擴增之核酸試樣。 [B4]如[B1]至[B3]中任一項所記載之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑視需要進而包含含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。 [B5]如[B1]至[B4]中任一項所記載之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子，上述模板置換寡核苷酸作為5'錨定寡核苷酸引子而發揮功能。 [B6]如[B1]至[B5]中任一項所記載之方法，其中上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比含有於上述混合物中。 [B7]如[B1]至[B6]中任一項所記載之方法，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [B8]如[B1]至[B7]中任一項所記載之方法，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [B9]一種用以將T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區進行擴增的套組，其係以包含 i)逆轉錄所需之試劑、 ii)模板置換所需之試劑、 iii)使用改型寡核苷酸引子之聚合酶鏈反應所需之試劑、及 iv)視需要之使用說明書，且 於反應開始時將i)～iii)之試劑及該改型寡核苷酸引子全部於反應系中加以混合為特徵， ii)之試劑含有模板置換寡核苷酸， 該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分或全部受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計之該TCR或該BCR之C區特異性引子。 [B10]如[B9]所記載之套組，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑包含含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。 [B11]如[B9]或[B10]所記載之套組，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子。 [B12]如[B9]至[B11]中任一項所記載之套組，其特徵在於：上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比而使用。 [B13]如[B9]至[B12]中任一項所記載之套組，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。 [B14]如[B9]至[B13]中任一項所記載之套組，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與上述TCR或該BCR之模板RNA之C區之部分序列雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 [B15]如[B9]至[B14]中任一項所記載之套組，其係用以提供由從受驗體獲得之RNA無偏地進行擴增之含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸試樣者。 [B16]如[B1]、及依附於[B1]之情形時之[B3]至[B8]所記載之方法，其中上述步驟(1)進而包括提供附加有適於序列解析之序列的核酸試樣之步驟。 [B17]如[B16]所記載之方法，其中上述適於序列解析之序列係適於使用橋式PCR或乳化PCR之序列解析之序列。 [B18]如[B1]、依附於[B1]之情形時之[B3]至[B8]、[B16]或[B17]所記載之方法，其中上述步驟(1)進而包括以下步驟： c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；及 d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 [B19]如[B1]、依附於[B1]之情形時之[B3]至[B8]、[B16]、[B17]或[B18]所記載之方法，其中上述步驟(3)包括以下步驟： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟； (3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟； (3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟；及 (3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。 [B20]一種用於使用資料庫對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析的系統，其具備： (1)如[B9]至[B15]中任一項所記載之套組； (2)用以確定該核酸試樣所含之該核酸序列之裝置；及 (3)用以基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之裝置。 [B21]如[B20]所記載之系統，其中(1)上述套組進而包括以下機構： c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構；及 d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 [B22]如[B20]或[B21]所記載之系統，其中(3)上述用以導出TCR或BCR多樣性之裝置具備以下機構： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之機構； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之機構； (3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之機構； (3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之機構； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之機構；及 (3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之機構。 [B23]一種係用以分析受驗者之疾病、障礙或狀態的系統，其具備如[B20]至[B22]中任一項所記載之系統、與基於利用該系統所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之機構。 [B24]一種用以對由如[B23]所記載之系統所確定之受驗者之疾病、障礙或狀態進行處置或預防的系統，其具備將該受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之機構、及根據該定量之關聯選擇適當之用以處置或預防之機構的機構。 於本發明中，上述1個或複數個特徵除了明確揭示之組合以外，意在可進一步加以組合而提供。關於本發明之進一步之其他實施形態及優點，從業者視需要閱讀以下之詳細說明並加以理解而可認識到。 [發明之效果] 根據本發明，可期待以較高之特異性且以單步驟實施逆轉錄模板置換PCR。尤其是即使於成為模板之RNA之複本數較少，增多PCR之循環數之情形時，亦可期待抑制副反應之產生，並且擴增特異性PCR產物。
以下，對本發明進行說明。於本說明書之全文中，只要未特別說明，則單數形之表述應理解為亦包括其複數形之概念。因此，只要未特別說明，則單數形之冠詞(例如，英語之情形時為「a」、「an」、「the」等)應理解為亦包括其複數形之概念。又，只要未特別說明，則本說明書中所使用之用語應理解為以該領域通常所使用之含義而使用。因此，只要未作其他定義，則本說明書中所使用之全部專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之從業者通常理解之含義相同。於產生矛盾之情形時，本說明書(包括定義)優先。於本說明書中，數值前之所謂「約」意指其後之數值之±10%。 本發明係關於藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR而將模板RNA之至少一部分區域進行擴增之方法。 逆轉錄模板置換PCR係即使於成為模板之RNA之5'末端的序列為未知，或不具有共通序列之情形時，亦能夠實現以該RNA作為模板之RT-PCR擴增之技術。逆轉錄模板置換PCR係利用如下現象：若逆轉錄酶到達模板RNA之5'末端，則藉由逆轉錄酶所具有之末端轉移酶活性，而於新合成之cDNA之3'末端自動地附加特定之較短之序列。例如，來自莫洛尼鼠白血病病毒之逆轉錄酶(MMLV RT)係將富含胞嘧啶之較短之序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端。若於對含有附加於特定之錨定序列(第1錨定序列)之3'末端之核苷酸序列的寡核苷酸(模板置換寡核苷酸)進行逆轉錄時向系內添加與該較短之附加序列互補之序列，則經由cDNA之3'末端之附加序列與模板置換寡核苷酸之3'末端之該附加序列的互補序列之間之相互作用，模板置換寡核苷酸與所合成之cDNA之3'末端進行雜交，而會延長用以形成逆轉錄酶之模板。其結果為，若逆轉錄酶到達模板RNA之5'末端，則由於將模板變換為模板置換寡核苷酸，而繼續cDNA合成直至其5'末端為止，因此會對cDNA之3'端附加與模板置換寡核苷酸之錨定序列(第1錨定序列)互補之序列。藉由使用含有與模板RNA中之特定序列互補之序列之寡核苷酸引子，或於5'末端附加有特定之錨定序列(第2錨定序列)之寡核苷酸引子(無規引子、寡聚(dT)引子等)作為逆轉錄之引子，從而新合成之cDNA於5'末端亦具備已知序列。其結果為，藉由使用包含含有該已知序列之寡核苷酸引子、及含有上述第1錨定序列之至少一部分之寡核苷酸引子的引子組，可實現以新合成之cDNA作為模板之PCR擴增。 於若干實施形態中，於已知模板RNA之5'末端側之序列之情形時，亦可不進行模板置換。 於本發明之方法中，係以「單步驟(一個階段)」實施逆轉錄模板置換PCR。所謂「單步驟逆轉錄模板置換PCR(RT-TS-PCR)」意指來自逆轉錄反應之核酸擴增方法，該核酸擴增方法之特徵在於：於反應開始時預先將逆轉錄、模板置換及PCR所需之試劑全部加以混合，且不進一步追加逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及PCR擴增所需之試劑，較佳為不開放反應系(即不進行管之開閉或試劑之添加)，而於同一反應系中進行反應。 即，於本發明之方法中，核酸之擴增反應包括：以RNA作為模板之逆轉錄步驟a)；對步驟a)中所合成之cDNA附加模板置換寡核苷酸之模板置換步驟b)；及利用以步驟b)中所合成之模板置換cDNA作為模板之PCR之DNA擴增步驟c)；上述步驟a)～c)係於同一反應系中在一個階段進行。 又，於另一態樣中，本發明提供一種將對象RNA之至少一部分區域進行擴增之方法，該方法包括：a)將該對象RNA、逆轉錄所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，並將混合物供於產生逆轉錄之條件之步驟，該混合包括視需要而混合模板置換所需之試劑；及b)將該混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而將該對象RNA之至少一部分區域進行擴增之步驟，該聚合酶鏈反應所需之試劑含有以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 進而，本發明提供一種生產基於對象RNA之至少一部分區域而擴增之核酸試樣之方法，該方法包括：a)將該對象RNA、逆轉錄所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，並將混合物供於產生逆轉錄之條件之步驟，該混合包括視需要而混合模板置換所需之試劑；及b)將該混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件之步驟，且該聚合酶鏈反應所需之試劑含有以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。 於未知成為模板之RNA之5'末端的序列，或不具有共通序列之情形時，藉由實施模板置換，可對模板RNA之5'末端附加特定之錨定序列，故而較為有利。另一方面，於已知模板RNA之5'末端側之序列之情形時，亦可不進行模板置換。 於一態樣中，上述模板置換所需之試劑可含有模板置換寡核苷酸。於又一態樣中，聚合酶鏈反應所需之試劑可包含含有模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子，亦可不含該引子。如本說明書之實施例中所實證般，模板置換寡核苷酸(TS-Oligo)意外地亦可作為PCR擴增中之前置引子而發揮功能。因此，聚合酶鏈反應所需之試劑可不含上述5'錨定寡核苷酸引子，亦可為少於通常使用量之少量。 令人驚訝的是，即使不添加逆轉錄用引子，僅添加上述改型寡核苷酸引子，而進行逆轉錄PCR，亦可以較高之特異性達成PCR擴增。雖然不期望受理論所限制，但於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子中之一部分之功能未受到阻礙，功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子亦可作為逆轉錄引子而發揮功能，或於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子之功能受到部分地阻礙，因此功能受到部分地阻礙之改型寡核苷酸引子可限定性地作為逆轉錄引子而發揮功能。因此，於若干實施形態中，逆轉錄所需之試劑可不含起始逆轉錄之寡核苷酸引子，即使含有該引子，本方法中所使用之起始逆轉錄之寡核苷酸引子亦可為少於通常使用之量之少量。於若干實施形態中，上述組合物中之起始逆轉錄之寡核苷酸引子之濃度例如為約40 nM以下，較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。於另一實施形態中，上述組合物中之起始逆轉錄之寡核苷酸引子以相對於改型寡核苷酸引子而為約十分之一以下之莫耳比含有，較佳為以約20分之1以下、約40分之1以下、約160分之1以下、約200分之1以下、約635分之1以下、約2,000分之1以下、約2,500分之1以下、約20,000分之1以下、約200,000分之1以下、約2,000,000分之1以下、或約20,000,000分之1以下之莫耳比含有。 本發明之方法之特徵在於：作為PCR中之至少一寡核苷酸引子，因改型而使逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙，於PCR之核酸擴增之步驟中引子功能之阻礙得以解除。藉此，雖然處於同一反應系中，但是能夠功能性地區分逆轉錄反應階段與PCR之核酸擴增階段之各階段所使用之引子，而使各反應階段之引子濃度產生較大差異。 作為阻礙、解除引子功能之方法，例如可列舉以下之方法。 1)利用含有熱不穩定性修飾基、或以於逆轉錄反應階段保持摺疊結構之方式設計之引子而阻礙逆轉錄時之引子功能。 逆轉錄反應後，藉由利用熱處理使熱不穩定修飾基背離或消除摺疊結構，而解除引子功能之阻礙。 2)利用含有人工鹼基之引子，於逆轉錄反應階段作為引子而阻礙功能。 逆轉錄反應之結果為，藉由逆轉錄反應，由模板RNA合成組入有與引子中所含之人工鹼基成對之核酸的cDNA，針對該人工核酸，引子可退火，從而引子功能之阻礙得以解除。 於單步驟RT-PCR中，通常與逆轉錄之起始時點，反應系內包含將模板RNA逆轉錄為cDNA所需之全部試劑、及以所獲得之cDNA作為模板進行PCR所需之全部試劑。由於通常將PCR引子之Tm設定為50℃以上，因此於可進行逆轉錄之溫度區域(例如，42℃)，有不會充分發揮引子之特異性之可能性。又，於PCR中模板之複本數會依指數函數增加，故而所需之PCR引子之濃度壓倒性地高於逆轉錄用之引子濃度。因此，於進行逆轉錄時，有PCR引子誤退火為模板RNA，而發生以其為起點之非特異性逆轉錄，最終產生非特異性之PCR產物之虞。於本發明中，藉由使用因改型而使逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙且藉由該逆轉錄之結果、或熱改性處理而獲得以該逆轉錄之產物作為模板之PCR中之引子功能的改型寡核苷酸引子作為PCR中之反置引子，可抑制非特異性逆轉錄。 於本說明書中，「寡核苷酸」、「引子」、或「寡核苷酸引子」通常表示單鏈之聚核苷酸。可為天然產生者，亦可為合成者。通常包含約5～約50個核苷酸、更佳為包含約10～約30個核苷酸、或更佳為包含約15～約25個核苷酸之序列。寡核苷酸包括DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體。 於本說明書中，用語「前置引子」意指於以RT-PCR中之模板RNA作為正義鏈時，退火為其反義鏈之寡核苷酸引子。「反置引子」意指退火為正義鏈之寡核苷酸引子。 於一態樣中，本發明所使用之改型寡核苷酸引子含有與模板RNA之部分序列互補之序列。該部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為18～25個鹼基。該部分序列可為模板RNA所含之意欲擴增之區域之3'末端的部分序列。該改型寡核苷酸引子較佳為於其3'末端含有與模板RNA之部分序列互補之序列。該改型寡核苷酸引子亦可於與模板RNA之部分序列互補之序列之5'末端含有附加序列。附加序列並無特別限定，就避免非特異性之雜交之觀點而言，適宜為不含與模板RNA之部分序列互補之序列。作為附加序列，例如可列舉特定之限制酶識別序列。附加序列之長度並無特別限定，為了避免非特異性之雜交，較佳為較短。附加序列之長度通常為1～50個鹼基，較佳為1～30個鹼基，更佳為1～10個鹼基。於一態樣中，該改型寡核苷酸引子含有與模板RNA之部分序列互補之序列，不含附加序列。 作為本發明所使用之改型寡核苷酸引子中之改型之態樣，例如可列舉以下。 (1)含有熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子 (2)於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，藉此形成分子內髮夾環而呈現與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽之結構之寡核苷酸引子 (3)含有人工鹼基之寡核苷酸引子 以下，對各態樣進行詳細說明。 (1)含有熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子 於本態樣中，藉由使寡核苷酸引子含有熱不穩定性修飾基，修飾核苷酸引子無法沿其所雜交之聚核苷酸而將鏈伸長，即因酶之阻礙，或與靶核酸之雜交之降低，而無法伸長。於較佳之態樣中，於寡核苷酸引子之1個或1個以上之核苷酸間之鍵或3'末端羥基上取代熱不穩定性修飾基。因此，只要不去除修飾或經修飾之核苷酸，則於去除之前，實質上不產生鏈伸長。該修飾基雖然為熱不穩定性，但在達到PCR擴增中之最初之改性溫度(例如約80～105℃、較佳為約85～100℃、更佳為約90～96℃(例如95℃))之前，幾乎不會解離，因此逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙。若達到最初之改性溫度，則來自修飾寡核苷酸引子之修飾基之局部或完全之解離受到熱誘導，而修飾寡核苷酸引子轉化為相對應之未修飾寡核苷酸引子。未修飾寡核苷酸引子具有活性狀態之磷酸二酯鍵，可藉由聚合酶而伸長。 作為含有熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子，可列舉US patent No. 8133669(揭示內容係藉由本說明書中之引用，而以與明確揭示其全部內容相同之程度併入本說明書中)所揭示之3'末端之羥基被取代為熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子、US patent No. 8361753(揭示內容係藉由本說明書中之引用，而以與明確揭示其全部內容相同之程度併入本說明書中)所揭示之於1個或1個以上之核苷酸間之鍵中含有熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子等。 (1-1)3'末端之羥基被取代為熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子(US patent No. 8133669) 於一態樣中，該修飾寡核苷酸引子之3'末端所含之該修飾基為選自由如下基所組成之群中之任一基， [化1]
[式中， Z10
選自由O、S、及Se所組成之群； 各R7
、各R8
、各R9
、及各R10
獨立地選自由氫、直鏈狀或支鏈狀且可經取代之具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之烴基所組成之群， 該烴基為可包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基之烷基、烯基、或炔基； 各X6
、各X7
、各X8
、及各X9
獨立地選自由醯基、醯氧基、烯基、烯基芳基、伸烯基、烷基、低級烷基、伸烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低級烷氧基、烷基芳基、烷基羰基胺基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、烷基磺醯基胺基、烷硫基、伸炔基、醯胺、脒基、胺基、芳基炔基、芳烷基、芳醯基、芳基烷基、芳基、芳基羰基胺基、伸芳基、芳氧基、芳基磺醯基胺基、胺基甲酸酯、二硫代胺基甲酸酯、環烯基、環烷基、伸環烷基、胍基、鹵基、鹵素(halogen)、雜芳基、雜芳基羰基胺基、雜芳氧基、雜芳基磺醯基胺基、雜環、雜環、烴基、烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、烴基羰氧基、伸烴基、有機亞磺醯基、羥基、有機亞磺醯基、有機磺醯基、亞磺醯基、磺醯基、磺醯基胺基、及硫醯基所組成之任意經取代或未經取代之基； 各X10
獨立地選自由O、S、Se、NR11
、N-OR11
、及CR11
R12
所組成之群；各R11
及各R12
獨立地選自由醯基、醯氧基、烯基、烯基芳基、伸烯基、烷基、低級烷基、伸烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低級烷氧基、烷基芳基、烷基羰基胺基、烷基亞磺醯基、烷基磺醯基、烷基磺醯基胺基、烷硫基、伸炔基、醯胺、脒基、胺基、芳基炔基、芳烷基、芳醯基、芳基烷基、芳基、芳基羰基胺基、伸芳基、芳氧基、芳基磺醯基胺基、胺基甲酸酯、二硫代胺基甲酸酯、環烯基、環烷基、伸環烷基、胍基、鹵基、鹵素(halogen)、雜芳基、雜芳基羰基胺基、雜芳氧基、雜芳基磺醯基胺基、雜環、雜環、烴基、烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、烴基羰氧基、伸烴基、有機亞磺醯基、羥基、有機亞磺醯基、有機磺醯基、亞磺醯基、磺醯基、磺醯基胺基、及硫醯基所組成之任意經取代或未經取代之基； 各Y1
獨立地選自由O、S、Se、NR6
、N-OR6
、及CR6
R7
所組成之群]。 於較佳之態樣中，該修飾基選自由O-對甲苯磺酸酯、O-磷酸、O-硝酸、O-[4-甲氧基]四氫吡喃基、O-[4-甲氧基]四氫噻喃基、O-四氫噻喃基、O-[5-甲基]四氫呋喃基、O-[2-甲基,4-甲氧基]四氫吡喃基、O-[5-甲基]四氫吡喃基、O-四氫吡喃基、O-四氫呋喃基、O-苯氧基乙醯基、O-甲氧基乙醯基、O-乙醯基、O-C(O)-OCH3
、O-C(O)-CH2
CH2
CN、及O-C(S)-OCH3
所組成之群。於一部分尤佳之形態中，該修飾基選自由O-甲氧基四氫吡喃基、O-四氫吡喃基、及O-四氫呋喃基所組成之群。 於另一態樣中，修飾寡核苷酸引子係式V所表示之化合物， [化2]
[式中， Z3
為3'-O-寡核苷酸基殘基、或寡核苷酸引子， B選自經取代或未經取代之嘌呤或嘧啶、其任意之氮雜衍生物或去氮雜衍生物、或較佳為能夠利用核酸聚合酶加以識別之由任意NTP(nucleoside triphosphate，核苷三磷酸)類似物形成之任意「通用鹼基」或「退化鹼基」； A選自由O、S、Se、CR1
R2
、及NR1
所組成之群； 各R1
及各R2
獨立地選自由H、F、Cl、Br、I、OR3
、SR3
、NR3
R4
、C(Y)R5
、以及經取代或未經取代之烷基、烯基、炔基、芳基、及芳烷基所組成之群， 任意取代基分別視情況而有含有1個或複數個雜原子之可能性； 各Y獨立地選自由O、S、Se、CR1
R2
、及NR1
所組成之群； 各R3
及各R4
獨立地選自由H、或者經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之芳基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群， 任意取代基分別視情況而有含有1個或複數個雜原子之可能性； 各R5
獨立地選自由H、F、Cl、Br、OR3
、SR3
、NR3
R4
、以及經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、經取代或未經取代之芳基、及經取代或未經取代之芳烷基所組成之群， 任意取代基分別視情況而有含有1個或複數個雜原子之可能性； X4
獨立地選自由R1
、F、Cl、Br、I、OR3
、SR3
、SeR3
、NR3
R4
、NR3
OR3
、NR3
-NR3
R4
、CN、N3
、C(Y)R5
、NO2
、CN、及SSR3
所組成之群； X5
選自由O、S、Se、NR6
、N-OR6
、及CR6
R7
所組成之群； Y1
選自由O、S、Se、NR6
、N-OR6
、CR6
R7
、及C(Y)所組成之群； 各R6
及各R7
獨立地選自由氫、或者直鏈狀或支鏈狀且可經取代之具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之烴基所組成之群， 該烴基為可包含選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1個取代基之烷基、烯基、或炔基； X5
及Y1
分別視情況而有經由合適之原子或原子群與式IB所表示之NTP分子之X4
、X5
、Z3
、A、W、或B部分共價鍵結之可能性]。 於式V之特定之實施形態中，B為胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胺基烯丙基尿嘧啶、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-7-甲基鳥嘌呤、7-去氮雜-7-碘鳥嘌呤、7-去氮雜-7-胺基烯丙基鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、5-硝基胞嘧啶、5-胺基烯丙基胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(螢光素-11)-胞嘧啶、4-甲基胺基-胞嘧啶、及2-硫代-5-甲基尿嘧啶、或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。 於式V之較佳之實施形態中，B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、或尿嘧啶。 於較佳之態樣中，修飾寡核苷酸引子為選自由如下化合物所組成之群中之任一化合物， [化3]
。 上述1-1之修飾寡核苷酸引子可藉由US patent No. 8361753所記載之方法而製造。 (1-2)於1個或1個以上之核苷酸間之鍵中含有熱不穩定性修飾基之修飾寡核苷酸引子(US patent No. 8361753) 於一態樣中，包含該修飾寡核苷酸引子中之修飾基為式I之化合物， [化4]
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基； X為O、S、S(O)、S(O)2
、C(O)、C(S)或C(O)NH；及 R1
為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 於一態樣中，提供修飾基為式Ia之化合物， [化5]
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基；及 R1
為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 式Ia之修飾基之較佳態樣如下： [化6]
4-側氧基-1-戊基、 [化7]
5-側氧基-1-己基、 [化8]
6-側氧基-1-庚基、 [化9]
4-側氧基-1-己基、 [化10]
5-甲基-4-側氧基-1-己基、 [化11]
2-甲基-5-側氧基-己基、 [化12]
1-乙基-4-側氧基-戊基、 [化13]
1-甲基-4-側氧基-戊基、 [化14]
1,1-二甲基-4-側氧基-戊基、 [化15]
4-側氧基-1-辛基 [化16]
4-側氧基-1-十四烷基、及 [化17]
4-側氧基-1-二十烷基。 於一態樣中，提供修飾基為式Ib之化合物 [化18]
[式中， k為0～2之整數； L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基；及 R1
為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 於較佳之態樣中，式Ib之修飾基為下述所示之4-甲硫基-1-丁基： [化19]
於一態樣中，提供修飾基為式Ic之化合物， [化20]
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基；及 R1
為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 於較佳之態樣中，式Ic之修飾基為下述所示之3-(N-第三丁基羧醯胺)-1-丙基： [化21]
於一態樣中，提供修飾基為式Id之化合物， [化22]
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之伸烴基；及 各R1
獨立為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、更佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 作為修飾基式Id之較佳之態樣，可列舉2-(N-甲醯基-N-甲基)胺基乙基或2-(N-乙醯基-N-甲基)胺基乙基(如下述所示)： [化23]
2-(N-乙醯基-N-甲基)胺基乙基 於另一態樣中，提供修飾基為式II之化合物， [化24]
[式中， L為具有1～10個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子、進而更佳為4個碳原子之直鏈或支鏈之伸烴基；及 R2
為氫、氰基、或具有5～10個原子之可任意地經取代之碳環、雜環、芳基或雜芳基]。 於較佳之態樣中，式II之修飾基為下述所示之N-(2-羥基乙基)-鄰苯二甲醯亞胺： [化25]
N-(2-羥基乙基)-鄰苯二甲醯亞胺 於另一態樣中，提供修飾基為式III之化合物， [化26]
[式中， La
及Lb
分別獨立地選自單鍵、或具有1～8個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基； A為O、S、S(O)、S(O)2
、Se、CR3
R4
、NR3
、C(O)、C(S)或CNR3
； B為C(O)R3
、C(S)R3
、C(O)NR3
R4
、OR3
或SR3
；及 R3
及R4
分別獨立為氫或具有1～20個碳原子、較佳為1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，其可任意地含有選自由鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、胺基、醯胺、環烷基、雜環烷基、芳基、芳氧基、及雜芳基所組成之群中之至少1種取代基]。 於另一態樣中，提供修飾基為式IV之化合物， [化27]
[式中， La
、Lb
及Lc
分別獨立地選自單鍵、或具有1～8個碳原子、較佳為2～5個碳原子、更佳為3～4個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之伸烴基； D為O、S、S(O)、S(O)2
、CR5
R6
、或NR5
； E為O、S、S(O)、S(O)2
、CR5
R6
、或NR6
； F為氫、C(O)R7
、C(S)R7
、C(O)NR7
R8
、OR7
或SR7
； R5
及R6
可分別獨立為氫、芳基、烷基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、或胺基，或R5
及R6
可一併包含5～10個原子而形成含有D、R5
、R6
、E及Lb
之單環或二環，其中於R5
及R6
一併形成環之情形時，n為0～2；及 R7
及R8
分別獨立地選自芳基、烷基、鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺、可任意地經取代之環烷基、可任意地經取代之雜環烷基、可任意地經取代之芳基、可任意地經取代之芳氧基、或可任意地經取代之雜芳基]。 於R5
及R6
一併形成環之式IV之化合物之一態樣中，修飾基為下述所示之甲氧基甲基-環己-1,3-基-乙基： [化28]
甲氧基甲基-環己-1,3-基-乙基 於一態樣中，修飾寡核苷酸引子具有結構I之修飾骨架， [化29]
[式中， Nuc為引子序列中之核苷； U及Z分別獨立為O、S、Se、NR9
、或CR9
R10
； R9
及R10
分別獨立為氫、或具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈之可任意地經取代之烴基；烴基較佳為烷基、烯基或炔基，各自可獨立地含有選自鹵基、側氧基、羥基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺或能夠檢測出之標記中之至少1種取代基； Y為O、S或Se； W為能夠將Q藉由熱而切斷之任意化學成分，例如為O、S、S(O)、S(O)2
、Se、C(O)、C(S)、C(O)NH、C(N)H、NH、-C(=NR11
)-或NR9
； R11
為氫或具有1～10個碳原子、較佳為1～6個碳原子之可任意地經取代之烴基；R11
較佳為H、烷基或低級烷基；及 Q為含有1個或1個以上之熱切斷性基之修飾基]。 於一態樣中，修飾基Q含有選自上述式I、Ia、Ib、Ic、Id、II、III或IV中之1個或1個以上之熱切斷性基。 修飾寡核苷酸引子於至少1個核苷酸間之鍵中含有上述之任一修飾基。修飾寡核苷酸引子較佳為於其3'末端含有1個或1個以上之上述之任一修飾基。修飾寡核苷酸引子較佳為於其3'末端之最後6個核苷酸間之鍵之任一者、較佳為於最後3個核苷酸間之鍵之任一者中含有1個或1個以上之上述之任一修飾基。 於另一態樣中，寡核苷酸引子可含有以寡核苷酸引子之3'-末端終止之2、3、4、5或6個修飾核苷酸間之鍵之連續序列。於又一態樣中，寡核苷酸引子可含有複數個非連續性3'修飾核苷酸間之鍵。修飾寡核苷酸引子之5'-末端亦可具有含有修飾核苷酸間之鍵的核苷酸之序列。於又一態樣中，寡核苷酸之全部核苷酸間之鍵可經修飾。 於另一較佳之態樣中，修飾寡核苷酸引子於寡核苷酸引子之3'n核苷酸間之鍵含有修飾基，此處n為3'末端之核苷酸間之鍵。於又一態樣中，修飾基存在於寡核苷酸之3'n－1、n－2、n－3或n－4核苷酸間之鍵。於又一態樣中，寡核苷酸於n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之2個位置或其以上，較佳為n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之2個位置或其以上，較佳為n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之3個位置或其以上，較佳為n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之4個位置或其以上，較佳為n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之5個位置或其以上，或者較佳為n、n－1、n－2、n－3、n－4、n－5或n－6位之6個位置或其以上具有修飾基。 上述1-2之修飾寡核苷酸引子可藉由US patent No. 8361753所記載之方法而製造。 (2)於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，藉此形成分子內髮夾環而呈現與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽之結構的寡核苷酸引子 於該態樣中，於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，藉此形成分子內髮夾環。該互補區係指由1個或1個以上之寡核苷酸構成之第1序列、與含有1個或1個以上之與上述寡核苷酸互補之寡核苷酸的第2序列之組合。 第1序列與第2序列之位置可互相鄰接，第1序列與第2序列亦可於其間插入1個或1個以上之寡核苷酸。於第1序列或第2序列含有與模板RNA之部分序列互補之序列之情形時，藉由第1序列與第2序列之互補性鍵結，與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽。因此，於該情形時，第1序列與第2序列之寡核苷酸之數量並無特別限定。 於第1序列或第2序列不含與模板RNA之部分序列互補之序列之情形時，於第1序列與第2序列之寡核苷酸之間含有與模板RNA之部分序列互補之序列，藉由形成分子內髮夾環，與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽。 由於與模板RNA之部分序列互補之序列被遮蔽，因此於逆轉錄時，無法與模板RNA之對應部分序列進行雜交，引子功能之一部分或全部受到阻礙。然而，於PCR擴增中之改性溫度(例如約55～105℃、較佳為約85～100℃、更佳為約90～96℃(例如95℃))下，髮夾環結構發生解離，而將與模板RNA之部分序列互補之序列曝露，因此於接下來之聯會溫度下，變得能夠與cDNA中之對應之部分序列進行雜交(即，獲得引子功能)。髮夾環之環部分之長度通常為5～25個鹼基左右。該環部分之核苷酸序列只要可形成分子內髮夾環，則無特別限定。 (3)含有人工鹼基之寡核苷酸引子 由於該態樣之改型寡核苷酸引子含有人工鹼基(非天然鹼基)，因此該改型寡核苷酸引子之核苷酸序列之互補序列實質上並不存在於模板RNA(不含人工鹼基之模板RNA)中。因此，該改型寡核苷酸引子與模板RNA之雜交受到抑制，故而逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙。於一態樣中，該改型寡核苷酸引子之3'末端之15個鹼基中，1個鹼基以上、較佳為3個鹼基以上、5個鹼基以上、10個鹼基以上、12個鹼基以上、較佳為15個鹼基全部為人工鹼基。於較佳之態樣中，該改型寡核苷酸引子之最靠近3'末端之鹼基為人工鹼基。 該態樣之改型寡核苷酸引子係與包含含有該改型寡核苷酸引子之人工鹼基之部分序列的用以起始逆轉錄之寡核苷酸引子加以組合而使用。含有人工鹼基之部分序列之長度為10～40個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為18～25個鹼基。含有人工鹼基之部分序列並無特別限定，例如可為該改型寡核苷酸引子之3'末端之部分序列。用以起始逆轉錄之寡核苷酸引子包含與模板RNA之部分序列互補之序列、及上述含有人工鹼基之部分序列，該含有人工鹼基之部分序列係附加於與模板RNA之部分序列互補之序列之5'側。模板RNA之部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為18～25個鹼基。該部分序列可為模板RNA所含之意欲擴增之區域之3'末端的部分序列。用以起始逆轉錄之寡核苷酸引子較佳為於其3'末端含有與模板RNA之部分序列互補之序列。 若使用此種組合進行單步驟逆轉錄模板置換PCR，則於逆轉錄中合成於5'末端附加有含有改型寡核苷酸引子之人工鹼基之部分序列的cDNA，因此其結果為，上述含有人工鹼基之改型寡核苷酸引子獲得以該cDNA為模板之PCR中之引子功能。此外，藉由進行以該cDNA作為模板且以該改型寡核苷酸引子作為一引子之PCR擴增，可將目標區特異性地擴增。 作為人工鹼基，可列舉Z鹼基/F鹼基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 105061；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 950；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 954)、Q鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2323)、異G鹼基/異C鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8322)、2-硫代T(TS
)鹼基(Nucleic Acids Res. 2005, 33, 5640)、P鹼基/Z鹼基(Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4238)、PICS鹼基(J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11585)、5SICS鹼基/MMO2鹼基/NaM鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14620)、2-胺基-6-二甲基胺基嘌呤(2-amino-6-dimethylaminopurine)(x)/2-側氧基吡啶(2-oxopyridine)(y)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 4922)、2-胺基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)(J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 17286；Nucleic Acids Res. 2005, 33, e129；Biotechniques 2006, 40, 711)、咪唑啉-2-酮(imidazolin-2-one)(z)(J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13298)、Ds鹼基/Pa鹼基(Nat. Methods 2006, 3, 729)、Pn鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15549)、Px鹼基(Nucleic Acids Res. 2009, 37, e14)、xA鹼基、xT鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 11826)、Im-NO
鹼基/Na-ON
鹼基、Im-ON
鹼基/Na-NO
鹼基(J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1644；Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 596)等，但並不限定於該等。該等人工鹼基藉由形成以下之鹼基對，而可有助於逆轉錄及/或PCR擴增：Z-F鹼基對、Q-F鹼基對、異G-異C鹼基對、A-TS
鹼基對、P-Z鹼基對、PICS-PICS鹼基對(自補)、5SICS-MMO2鹼基對、5SICS-NaM鹼基對、x-y鹼基對、s-y鹼基對、s-z鹼基對、Ds-Pa鹼基對、Ds-Pn鹼基對、Ds-Px鹼基對、xA-T鹼基對、A-xT鹼基對、Im-NO
-Na-ON
鹼基對、Im-ON
-Na-NO
鹼基對。 以下，進一步詳細記載本發明之方法。 於本發明之方法中，首先，提供一種組合物，其包含： i)模板置換寡核苷酸； ii)包含含有該模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子、及上述改型寡核苷酸引子之引子組；以及 iii)模板RNA，並且 含有將該模板RNA模板置換逆轉錄為cDNA、及將該cDNA之至少一部分進行PCR擴增所需之全部試劑(其中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子除外)。 模板置換寡核苷酸於逆轉錄酶到達模板RNA之5'末端時，藉由逆轉錄酶所具有之末端轉移酶活性，而含有與附加於新合成之cDNA之3'末端之序列(有時簡稱為RT附加序列)互補之序列、及錨定序列，於RT附加序列之互補序列之5'末端附加有錨定序列(第1錨定序列)。較佳為RT附加序列之互補序列位於模板置換寡核苷酸之3'末端。RT附加序列取決於逆轉錄酶之種類。例如，來自莫洛尼鼠白血病病毒之逆轉錄酶(MMLV RT)係將富含胞嘧啶之較短之序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端，因此作為其互補序列之富含鳥嘌呤之較短序列(例如GG、GGG、GGGG)作為RT附加序列之互補序列而含有於模板置換寡核苷酸中。所謂錨定序列意指附加於寡核苷酸之5'末端之人工序列。錨定序列較佳為自然界中不存在之序列。錨定序列之長度並無特別限定，通常為10個鹼基～100個鹼基左右，較佳為15個鹼基～50個鹼基左右。 模板置換寡核苷酸可為DNA，亦可為RNA，或亦可為DNA/RNA嵌合體。為了作為逆轉錄中之模板而有效率地發揮功能，模板置換寡核苷酸適宜為RNA或DNA/RNA嵌合體，更佳為DNA/RNA嵌合體。於一態樣中，RT附加序列之互補序列之部分為RNA，錨定序列之部分為DNA或DNA/RNA嵌合體。模板置換寡核苷酸亦作為以下所說明之5'錨定寡核苷酸引子而發揮功能。因此，於若干實施形態中，可省略5'錨定寡核苷酸引子之添加或少量添加。迄今為止尚無於同一反應系中實施逆轉錄模板置換與PCR擴增之例，模板置換寡核苷酸作為PCR擴增之前置引子而發揮功能係於本說明書之實施例中初次得以證實。 5'錨定寡核苷酸引子含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列(第1錨定序列)之一部分或全部。錨定序列之一部分或全部長度通常為10～40個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為18～25個鹼基。為了能夠作為PCR中之引子發揮功能而為DNA或DNA/RNA嵌合體，較佳為DNA。5'錨定寡核苷酸引子可為PCR中之前置引子。 作為模板RNA，可使用mRNA、rRNA、tRNA、非編碼RNA(non-coding RNA)、化學合成之RNA等，但並不限定於該等。mRNA、rRNA及tRNA可為來自任何細胞、組織者。mRNA、rRNA及tRNA亦可為從利用細胞分選儀等獲得之微量之細胞、組織(例如，單細胞)中採集者。mRNA、rRNA及tRNA亦可為作為總RNA之一部分而含有之形態。 上述組合物中含有將該模板RNA模板置換逆轉錄為cDNA、及將該cDNA之至少一部分進行PCR擴增所需之全部試劑(其中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子除外)。作為該試劑，除了上述之模板置換寡核苷酸、引子組、及模板RNA以外，亦可列舉以下者。 ・逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶) ・耐熱性DNA聚合酶(DNA依賴性DNA聚合酶) ・dNTPs混合物 為了於cDNA之3'末端形成RT附加序列，所使用之逆轉錄酶具有末端轉移酶活性。作為具有末端轉移酶活性之逆轉錄酶，可列舉來自莫洛尼鼠白血病病毒之逆轉錄酶(MMLV RT)等，但並不限定於該等。末端轉移酶活性較佳為將富含胞嘧啶之較短之序列(例如CC、CCC、CCCC)附加於所合成之cDNA之3'末端之活性。 作為耐熱性DNA聚合酶，代表性而言可列舉Taq、Tth、KOD、Pfu、Bst等，但並不限定於該等，業界開發有可用於PCR之各種耐熱性DNA聚合酶，該等均可用於本發明。可用於PCR之耐熱性DNA聚合酶為從業者所周知，可適當進行選擇。 於一態樣中，上述組合物進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。起始逆轉錄之寡核苷酸引子藉由含有與模板RNA之部分序列互補之序列，而與模板RNA進行雜交，從而起始逆轉錄。該部分序列之長度並無特別限定，通常為10～40個鹼基，較佳為15～30個鹼基，更佳為18～25個鹼基。起始逆轉錄之寡核苷酸引子較佳為於其3'末端含有與模板RNA之部分序列互補之序列。亦可於與模板RNA之部分序列互補之序列之5'末端附加錨定序列(第2錨定序列)。第2錨定序列較佳為自然界中不存在之序列。第2錨定序列之長度並無特別限定，通常為10個鹼基～100個鹼基左右，較佳為15個鹼基～50個鹼基左右。第2錨定序列較佳為與上述第1錨定序列不同。於一態樣中，第2錨定序列中含有人工鹼基。於一態樣中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子不含第2錨定序列。起始逆轉錄之寡核苷酸引子為對特定之基因具有特異性之引子、鍵結於mRNA之聚A尾之寡聚dT引子、或無規六聚物引子之類的無規引子之任一者，較佳為對特定之基因具有特異性之引子。該引子含有與編碼目標基因之RNA(例如mRNA)之部分序列互補之序列。起始逆轉錄之寡核苷酸引子為了能夠作為逆轉錄中之引子發揮功能而為DNA或DNA/RNA嵌合體，較佳為DNA。 於一態樣中，模板RNA上之起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之區與上述改型寡核苷酸引子所雜交之區至少一部分重疊。重疊之雜交區之長度通常為10個鹼基以上，較佳為15個鹼基以上，更佳為18個鹼基以上，但並無特別限定。重疊之雜交區之長度例如可為40個鹼基以下、30個鹼基以下、25個鹼基以下。 於較佳之態樣中，改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端位於較起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端更靠模板RNA之5'側(上游)。即，以改型寡核苷酸引子之3'末端較起始逆轉錄之寡核苷酸引子之3'末端更靠模板RNA之5'側(上游)而與模板RNA進行雜交之方式設計兩引子。藉由以上述方式將上述2個引子設計為半嵌套狀(semi-nested)之位置關係，而可期待擴增之特異性之上升。於該情形時，可將起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區與上述改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區部分重疊而設為半嵌套狀(semi-nested)，亦可不重疊而設為完全嵌套狀(full-nested)。 於將起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區與上述改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區部分重疊之情形時，較佳為以例如改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端與起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端相比處於更靠近模板RNA之5'側(上游)例如1～12個鹼基、較佳為1、2、3、4或5個鹼基之位置之方式(即，以改型寡核苷酸引子之3'末端雜交於與起始逆轉錄之寡核苷酸引子之3'末端相比更靠近模板RNA之5'側(上游)例如1～10個鹼基、較佳為1、2、3、4或5個鹼基之位置之方式)設計兩引子，但並不限定於該等。 於另一態樣中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區與上述改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區至少一部分重疊，改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端與起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區域之5'末端一致。即，改型寡核苷酸引子之3'末端以與起始逆轉錄之寡核苷酸引子之3'末端相同之位置雜交於模板RNA。 於一態樣中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區與上述改型寡核苷酸引子所雜交之模板RNA之區相同。於該態樣中，起始逆轉錄之寡核苷酸引子可為與上述改型寡核苷酸引子相對應之未修飾寡核苷酸引子。 於另一態樣中，上述改型寡核苷酸引子於其3'末端含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子之部分序列。該部分序列(以下有時稱為共通序列)之長度通常為10個鹼基以上，較佳為15個鹼基以上，更佳為18個鹼基以上，但並無特別限定。該3'末端部分序列之長度例如可為40個鹼基以下、30個鹼基以下、25個鹼基以下。於一態樣中，該共通序列可為起始逆轉錄之寡核苷酸引子之3'末端之部分序列。於另一態樣中，該共通序列之3'末端位於與起始逆轉錄之寡核苷酸引子之3'末端相比更靠近5'側至少1個鹼基(例如1～20個鹼基、1～10個鹼基、1～8個鹼基)之位置。於一態樣中，該共通序列係起始逆轉錄之寡核苷酸引子所含之與模板RNA之部分序列互補之序列、或其部分序列。於一態樣中，該共通序列為第2錨定序列或其部分序列。於一態樣中，該共通序列係橫跨與模板RNA之部分序列互補之序列及第2錨定序列之起始逆轉錄之寡核苷酸引子之部分序列。於一態樣中，上述改型寡核苷酸引子為含有人工鹼基之寡核苷酸引子，起始逆轉錄之寡核苷酸引子於5'末端包含含有人工鹼基之第2錨定序列，共通序列為第2錨定序列或其部分序列。 於上述組合物含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子之情形時，該寡核苷酸引子之濃度具有對於起始逆轉錄而言充分之量即可。於逆轉錄中，只要可將包含意欲擴增之區域之cDNA合成1個複本，則藉由其後之PCR，可擴增至能夠檢測出其之水準。因此，於該組合物中(反應系內)含有至少1個複本、較佳為10個複本以上、更佳為100個複本以上之起始逆轉錄之寡核苷酸引子即可。若起始逆轉錄之寡核苷酸引子之濃度過高，則有引起由非特異性之雜交引起之副反應之可能性。上述組合物中之起始逆轉錄之寡核苷酸引子之濃度例如為約40 nM以下，較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。 於另一態樣中，上述組合物不含起始逆轉錄之寡核苷酸引子。於本態樣中，作為上述之改型寡核苷酸引子，使用含有熱不穩定性修飾基且含有與模板RNA之部分序列互補之序列的寡核苷酸引子。該改型寡核苷酸引子較佳為含有1個或1個以上之核苷酸間之鍵或者於3'末端含有熱不穩定性修飾基。該改型寡核苷酸引子所含之熱不穩定性修飾基於達到PCR擴增中之最初之改性溫度(例如約80～105℃、較佳為約85～100℃、更佳為約90～96℃(例如95℃))之前幾乎不解離，但本發明者發現，該熱不穩定性修飾基於進行逆轉錄之溫度(例如45℃)下少量解離，由此產生之對應之未修飾寡核苷酸可作為起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。 上述組合物亦可視需要含有緩衝劑、鹽(鎂離子等)、RNAase抑制劑(RNAase inhibitor)。 關於上述組合物中所含之模板置換寡核苷酸之濃度，只要能夠實施本發明之方法，則無特別限定，例如為0.05～5.0 μM，較佳為0.1～1.0 μM左右。 上述組合物中所含之5'錨定寡核苷酸引子及上述改型寡核苷酸引子之濃度與先前方法之進行PCR時之引子濃度相同，例如為0.1～1.0 μM左右。 上述組合物中可含有之其他構成因子(模板RNA、逆轉錄酶、耐熱性DNA聚合酶、dNTPs混合物、緩衝劑、鹽、RNAase抑制劑)之濃度於單步驟RT-PCR之先前技術中為周知，進而本發明中所使用之濃度之最佳化可由常規實驗獲得。 其次，於可進行逆轉錄之溫度下培養上述所提供之組合物。可進行逆轉錄之溫度可根據逆轉錄酶之種類而適當調整，通常為37℃～62℃，較佳為37℃～55℃。培養時間可考慮模板RNA之尺寸等而適當調整，通常為30秒～120分鐘，較佳為5分鐘～60分鐘。藉由該培養，因熱不穩定性修飾基自組合物中所含之起始逆轉錄之寡核苷酸引子、或改型寡核苷酸引子解離而產生之未修飾寡核苷酸引發逆轉錄，而合成與模板RNA互補之cDNA(反義鏈)。若逆轉錄酶達到模板RNA之5'末端，則將模板變換為模板置換寡核苷酸，繼續cDNA合成直至其5'末端為止，因此產生於3'端附加有與模板置換寡核苷酸之錨定序列互補之序列的單鏈cDNA(反義鏈)。 其次，將含有所獲得之cDNA之反應混合液供於可進行PCR之複數次熱循環操作流程中。該熱循環操作流程包括改性(亦稱為熱改性)、退火、伸長之3個溫度步驟之循環。改性只要為對於使雙鏈DNA解離而言充分之溫度，則無特別限定，較佳之熱改性溫度之下限為90℃，上限為100℃。退火係使引子與經解離之DNA進行退火之步驟，此時之溫度(退火溫度)並無特別限定，較佳之退火溫度之下限為45℃，進而較佳為50℃。另一方面，較佳之上限為75℃，進而較佳為70℃。伸長係藉由DNA聚合酶合成互補鏈之步驟，此時之溫度(伸長溫度)並無特別限定，較佳之伸長溫度之下限為50℃，上限為80℃。於上述循環中，退火溫度不超過伸長反應溫度。藉由在1個溫度下實施退火與伸長，實質上亦可以2個溫度步驟之循環之形式構成熱循環操作流程。於該情形時，較佳之退火及伸長之溫度之下限為50℃，進而較佳為55℃。另一方面，較佳之上限為70℃，進而較佳為65℃。作為各步驟中之培養時間，可例示1秒～5分鐘，若為從業者，則可考慮擴增產物之尺寸等而容易地設定合適之培養時間。 亦可於將反應混合液供於熱循環操作流程之前，實施用以使逆轉錄酶失活之改性步驟(預培養步驟)。該改性溫度只要可使逆轉錄酶失活，則無特別限定，較佳之熱改性溫度之下限為90℃，上限為100℃。改性時間只要可使逆轉錄酶失活，則無特別限定，通常為1分鐘以上且15分鐘以下。 於使用含有熱不穩定性修飾基之寡核苷酸引子作為改型寡核苷酸引子之情形時，於熱循環操作流程之最初之改性步驟、或預培養步驟中，修飾基從修飾寡核苷酸引子解離，而轉化為對應之未修飾寡核苷酸引子。未修飾寡核苷酸引子具有活性狀態之磷酸二酯鍵，可引發利用聚合酶進行之伸長。 於熱循環之最初之退火及伸長步驟中，5'錨定寡核苷酸引子退火為與存在於逆轉錄步驟中獲得之單鏈cDNA(反義鏈)之3'端之錨定序列互補之序列，產生利用聚合酶進行之伸長，而合成於5'末端附加有錨定序列(第1錨定序列)之cDNA(正義鏈)，其結果為，產生於正義鏈之5'末端附加有錨定序列之雙鏈cDNA。 然後，將含有上述雙鏈cDNA之反應混合物繼續供於複數次熱循環操作流程，藉此將夾在5'錨定寡核苷酸引子與改型寡核苷酸引子間之區域(即，5'末端錨定序列起至改型寡核苷酸引子所雜交之區為止)加以擴增。 熱循環之次數可考慮模板RNA之量等而適當設定，例如為20次以上，較佳為30次以上、40次以上、45次以上、50次以上、或55次以上。於通常之RT-PCR之情形時，即使於模板RNA之複本數較少之情形時(例如單複本)，若進行40次左右熱循環，則擴增反應達到飽和，但於本發明之方法中(尤其是使用含有熱不穩定性修飾基之改型寡核苷酸引子之情形時)，即使進行45次以上、50次以上、或55次以上之熱循環，擴增反應亦不會達到飽和，可進行進一步之擴增。雖然不受理論所限制，但於本發明之方法中(尤其是使用含有熱不穩定性修飾基之改型寡核苷酸引子之情形時)，可能存在每次熱循環之擴增效率較通常之RT-PCR更受抑制之可能性。因此，例如於意欲擴增之模板RNA之複本數較少之情形(例如100個複本以下、10個複本以下、單複本)、或以從單細胞單離之RNA(尤其是總RNA)作為模板RNA而實施本發明之方法之情形時，較佳為將熱循環之次數設為40次以上、45次以上、50次以上、或55次以上。 根據本發明之方法，可期待以較高之特異性且以單步驟實施逆轉錄模板置換PCR。於逆轉錄模板置換PCR中，其特異性實質上可僅取決於反置引子，於本發明中，藉由採用上述之改型寡核苷酸引子作為反置引子，可以較高之特異性將目標基因加以擴增。尤其於成為模板之RNA之複本數較少之情形時(例如於以來自單細胞之RNA作為模板之情形時)，即使於增多PCR之循環數之情形時，亦可期待抑制副反應之產生，並且將特異性PCR產物擴增。因此，例如藉由使用對抗原受體(例如抗體(重鏈、輕鏈)、T細胞受體(α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈))之恆定區具有特異性之反置引子作為上述之改型寡核苷酸引子，可以單細胞水準實施抗原受體之抗原識別部位之序列解析。 又，本發明亦提供一種用以實施單步驟逆轉錄模板置換PCR的套組，其包含： i)模板置換寡核苷酸；以及 ii)包含含有該模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子、及改型寡核苷酸引子之引子組； 該改型寡核苷酸引子因該改型而使逆轉錄中之引子功能之一部分或全部受到阻礙，且藉由該逆轉錄之結果、或熱改性處理而獲得以該逆轉錄之產物作為模板之PCR中之引子功能。 於一態樣中，本發明之套組進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 於一態樣中，本發明之套組不進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 本發明之套組亦可含有實施單步驟逆轉錄模板置換PCR所需之其他試劑(例如逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)、耐熱性DNA聚合酶(DNA依賴性DNA聚合酶)、dNTPs混合物、緩衝劑、鹽(鎂離子等)、RNAase抑制劑)。 上述試劑可個別地封入至容器中，再含有於1個封裝體中，亦可以含有其一部分或全部混合物之組合物之形式提供。 於一態樣中，本發明之套組以包含i)之寡核苷酸、及ii)之引子組之混合物之組合物之形式含有兩者。 於一態樣中，該組合物進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 於一態樣中，該組合物不進而含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子。 該組合物亦可含有選自由逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)、耐熱性DNA聚合酶(DNA依賴性DNA聚合酶)、dNTPs混合物、緩衝劑、鹽(鎂離子等)、及RNAase抑制劑所組成之群中之1、2、3、4、5或6種試劑。 若使用本發明之套組，則使用任意之模板RNA，藉由上述本發明之方法，可簡便地實施單步驟逆轉錄模板置換PCR。 本發明之套組所含之各構成要素之用語之定義係如上述本發明之方法中所記載。 又，本發明提供一種用以將對象RNA之至少一部分區域進行擴增的套組，其以包含i)逆轉錄所需之試劑、ii)視需要之模板置換所需之試劑、iii)使用改型寡核苷酸引子之聚合酶鏈反應所需之試劑及iv)視需要之使用說明書，且於反應開始時將i)之試劑、存在之情形時之ii)之試劑、iii)之試劑、及改型寡核苷酸引子全部於反應系中加以混合為特徵，該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分或全部受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計。 又，於另一態樣中，本發明提供一種對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析的方法，其包括：(1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得；(2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟；該步驟(1)包括：a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸，該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。上述核酸試樣較佳為無偏地進行擴增。 於本發明之解析多樣性之方法中，為了獲得用於序列解析之核酸試樣，而利用逆轉錄模板置換PCR(上述步驟a)及b))。藉由在多樣性解析中使用逆轉錄模板置換PCR(RT-TS-PCR)，可減少時間、勞力、成本而較為合適。於RT-TS-PCR中，由於步驟較少，因此可於短時間內處理，亦可減少勞力，對於多檢體處理而言有利。由於所使用之試劑類亦較少，因此可抑制成本。不僅有時間、勞力、成本之減少之有利方面，就以下之方面而言，本發明之方法進而有利。1.由於從RNA至PCR擴增為止之反應係於一個管內完成，因此可防止因管之開閉、試劑之添加、精製等操作引起之PCR產物之污染。2.由於不進行限制酶處理，因此可防止偶然發生之擴增產物本體之切斷。3.不存在至獲得供於定序之試樣為止之各步驟之精製操作中之損失，而可實現高感度之解析。 進而，本發明提供一種生產用以對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析之核酸試樣的方法，其包括(1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得，該步驟(1)包括：a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸，該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。上述核酸試樣較佳為無偏地進行擴增。 於一態樣中，上述模板置換所需之試劑可含有模板置換寡核苷酸。於又一態樣中，聚合酶鏈反應所需之試劑可包含含有模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子，亦可不含該引子。如本說明書之實施例中所實證，模板置換寡核苷酸(TS-Oligo)意外地亦可作為PCR擴增中之前置引子而發揮功能。因此，聚合酶鏈反應所需之試劑可不含上述5'錨定寡核苷酸引子，亦可為少於通常使用之量之少量。 令人驚訝的是，即使不添加逆轉錄用引子，僅添加上述改型寡核苷酸引子，而進行逆轉錄PCR，亦可以較高之特異性達成PCR擴增。雖然不期望受理論所限制，但於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子中之一部分之功能未受到阻礙，功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子亦可作為逆轉錄引子而發揮功能，或於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子之功能受到部分地阻礙，因此功能受到部分地阻礙之改型寡核苷酸引子可限定性地作為逆轉錄引子而發揮功能。因此，於若干實施形態中，逆轉錄所需之試劑可不含起始逆轉錄之寡核苷酸引子，即使含有該引子，本方法中所使用之起始逆轉錄之寡核苷酸引子亦可為少於通常使用之量之少量。於若干實施形態中，上述組合物中之起始逆轉錄之寡核苷酸引子之濃度例如為約40 nM以下，較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。於另一實施形態中，上述組合物中之起始逆轉錄之寡核苷酸引子以相對於改型寡核苷酸引子而為約十分之一以下之莫耳比含有，較佳為以約20分之1以下、約40分之1以下、約160分之1以下、約200分之1以下、約635分之1以下、約2,000分之1以下、約2,500分之1以下、約20,000分之1以下、約200,000分之1以下、約2,000,000分之1以下、或約20,000,000分之1以下之莫耳比含有。 於本發明之多樣性解析方法中，於進行逆轉錄模板置換PCR後可進一步包括提供附加有適於序列解析之序列之核酸試樣之步驟。若為從業者，則可根據序列解析之種類而選擇適於序列解析之序列，作為適於序列解析之序列，例如可列舉適於使用橋式PCR或乳化PCR之序列解析之序列，但並不限定於該等。較佳為本發明所使用之序列解析為使用橋式PCR之序列解析，為了使用橋式PCR之序列解析而附加之合適之序列包括索引序列、標籤序列、用以固定於序列解析之基板(例如流槽)之序列等。 於較佳之實施形態中，於本發明之多樣性解析方法中，為了提供用於序列解析之核酸試樣，可進行上述逆轉錄模板置換PCR(第1之PCR擴增反應)、標籤PCR(第2之PCR擴增反應)、及索引PCR(第3之PCR擴增反應)。 逆轉錄模板置換PCR(第1之PCR擴增反應)所使用之5'錨定寡核苷酸引子亦稱為第1之5'錨定寡核苷酸引子。第1之5'錨定寡核苷酸引子係含有模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的寡核苷酸引子。於第1之PCR擴增反應中，由於模板置換寡核苷酸亦作為5'錨定寡核苷酸引子而發揮功能，因此亦可不使用上述第1之5'錨定寡核苷酸引子。 於一態樣中，上述步驟(1)亦可進一步包括：c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；及d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 標籤序列係為了進行定序(例如利用Miseq之定序)而使用之序列，從標籤序列起開始定序。又，標籤序列亦可作為附加索引序列之索引PCR(第3之PCR擴增反應)之引發位點而發揮功能。第1標籤序列可為附加於第2之5'錨定寡核苷酸引子之序列，第2標籤序列可為附加於第2之TCR或BCR之C區特異性引子之序列。 於本說明書中所謂「第1之TCR或BCR之C區特異性引子」係指藉由本發明之逆轉錄模板置換PCR所進行之PCR擴增反應中所使用之引子，其含有對TCR或BCR之C區具有特異性之序列。 於本說明書中所謂「第2之TCR或BCR之C區特異性引子」係指用以提供含有附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸試樣的PCR擴增反應(第2之PCR擴增反應)所使用之引子，其含有對TCR或BCR之C區具有特異性之序列。第2之TCR或BCR之C區特異性引子附加有成為用於第3之PCR擴增反應之引發位點的標籤序列。 於本說明書中所謂「第3之TCR或BCR之C區特異性引子」係指用以提供含有附加有索引序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸試樣的PCR擴增反應(第3之PCR擴增反應)中所使用之引子，其含有對TCR或BCR之C區具有特異性之序列。第3之TCR或BCR之C區特異性引子視需要附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 於本說明書中所謂「第1之5'錨定寡核苷酸引子」係藉由本發明之逆轉錄模板置換PCR所進行之PCR擴增反應所使用之引子。由於模板置換寡核苷酸亦可作為5'錨定寡核苷酸引子而發揮功能，故而可不使用第1之5'錨定寡核苷酸引子、或少量使用。 於本說明書中所謂「第2之5'錨定寡核苷酸引子」係用以提供含有附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸試樣的PCR擴增反應(第2之PCR擴增反應)所使用之引子。 於本說明書中所謂「第3之5'錨定寡核苷酸引子」係用以提供含有附加有索引序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸試樣的PCR擴增反應(第3之PCR擴增反應)所使用之引子。第3之5'錨定寡核苷酸引子可視需要附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 於本說明書中所謂「第1之PCR擴增反應」係藉由本發明之單步驟逆轉錄模板置換PCR，以從受驗體獲得之RNA作為模板所進行之PCR擴增反應。 於本說明書中所謂「第2之PCR擴增反應」係指於用於本發明之多樣性解析之試樣生產中，於第1之PCR擴增反應後以其產物作為模板而進行之PCR擴增反應，其係用以提供含有附加有標籤序列之TCR或BCR之核酸序列之核酸試樣。於第2之PCR擴增反應中，提供附加有用以提供用於第3之PCR擴增反應之引發位點之標籤序列的核酸試樣。該標籤序列亦成為序列解析中之起始位置。 於本說明書中所謂「第3之PCR擴增反應」係於用於本發明之解析之試樣生產中，以第2之PCR擴增反應之擴增產物作為模板而進行之PCR擴增反應，該產物含有適於用於本發明之序列解析之序列。於第3之PCR擴增反應中，附加用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 於一態樣中，上述步驟(3)亦可包括：(3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟；(3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟；(3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟；(3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟；(3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟；及(3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。 又，本發明提供一種用以將T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區進行擴增的套組，其以包含i)逆轉錄所需之試劑、ii)模板置換所需之試劑、iii)使用改型寡核苷酸引子之聚合酶鏈反應所需之試劑及iv)視需要之使用說明書，且於反應開始時將i)～iii)之試劑及該改型寡核苷酸引子全部於反應系中加以混合為特徵，ii)之試劑含有模板置換寡核苷酸，該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分或全部受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計之該TCR或該BCR之C區特異性引子。本發明之套組可提供由從受驗體獲得之RNA無偏地進行擴增之含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣。 於本說明書中所謂「套組」係指通常分為2個以上之區塊而提供應提供部分(例如，試劑、引子、藥劑、標記、說明書等)之單元。於為了提供基於穩定性等而不應混合提供，而是較佳為在即將使用前加以混合使用之組合物時，該套組之形態較佳。此種套組較佳為具備記載如何使用所提供部分、例如如何使用藥劑、或應如何處理試劑之指示書或說明書，如此較有利。本說明書中於將套組以試劑套組之形式使用之情形時，套組中通常包含記載有藥劑、抗體等之使用方法等之指示書等。 於本說明書中，「指示書」係記載有對使用者說明使用本發明之方法者。該指示書記載有指示本發明之逆轉錄模板置換PCR及試劑之使用方法的內容。又，於指示書中亦可記載有指示使用方法(篩選方法)之內容。該指示書係依照實施本發明之國家之監管機關所規定之格式而製作，明確記載受該監管機關承認之意旨。指示書係所謂隨附文件(package insert)，可以紙介質提供，亦可以電子介質(例如以網際網路提供之主頁、電子郵件)之類的形態提供。 本發明之套組所含之聚合酶鏈反應所需之試劑亦可不含引子。引子可具備於本發明之套組中，亦可另行提供。從業者可基於對象RNA適當地設計引子而製造，或可委託引子之提供公司進行製造。作為本發明之套組所使用之反置引子，使用上述改型寡核苷酸引子。作為前置引子，可使用模板置換寡核苷酸、或含有模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。 於一態樣中，本發明之套組中之模板置換所需之試劑可含有模板置換寡核苷酸。於又一態樣中，本發明之套組中之聚合酶鏈反應所需之試劑可包含含有模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子，亦可不含該引子。如本說明書之實施例中所實證，模板置換寡核苷酸(TS-Oligo)意外地亦可作為PCR擴增中之前置引子而發揮功能。因此，聚合酶鏈反應所需之試劑可不含上述5'錨定寡核苷酸引子，亦可為少於通常使用之量之少量。 令人驚訝的是，即使不添加逆轉錄用引子，僅添加上述改型寡核苷酸引子，而進行逆轉錄PCR，亦可以較高之特異性達成PCR擴增。雖然不期望受理論所限制，但於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子中之一部分之功能未受到阻礙，功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子亦可作為逆轉錄引子而發揮功能，或於逆轉錄反應時，改型寡核苷酸引子之功能受到部分地阻礙，因此功能受到部分地阻礙之改型寡核苷酸引子可限定性地作為逆轉錄引子而發揮功能。因此，於若干實施形態中，逆轉錄所需之試劑可不含起始逆轉錄之寡核苷酸引子，即使含有該引子，所使用之起始逆轉錄之寡核苷酸引子亦可為少於通常使用之量之少量。於若干實施形態中，所使用之起始逆轉錄之寡核苷酸引子之最終濃度例如為約40 nM以下，較佳為約20 nM以下、約10 nM以下、約2.5 nM以下、約2.0 nM以下、約0.63 nM以下、約0.2 nM以下、約0.16 nM以下、約0.02 nM以下、約2.0 pM以下、約0.2 pM以下、或約0.02 pM以下。於另一實施形態中，所使用之起始逆轉錄之寡核苷酸引子以相對於改型寡核苷酸引子而為約十分之一以下之莫耳比使用，較佳為以約20分之1以下、約40分之1以下、約160分之1以下、約200分之1以下、約635分之1以下、約2,000分之1以下、約2,500分之1以下、約20,000分之1以下、約200,000分之1以下、約2,000,000分之1以下、或約20,000,000分之1以下之莫耳比使用。 上述對本發明之套組所使用之改型寡核苷酸引子進行詳細記載。 又，本發明提供一種用於使用資料庫對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析的系統，其具備：(1)用以提供由從受驗體獲得之RNA無偏地進行擴增之含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸試樣的套組；(2)用以確定該核酸試樣所含之該核酸序列之裝置；及(3)用以基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之裝置。 本發明之系統所使用之上述套組可進而包含以下機構：c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構；及d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。 於一態樣中，(3)上述用以導出TCR或BCR多樣性之裝置可具備以下機構：(3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之機構；(3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之機構；(3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之機構；(3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之機構；(3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之機構；及(3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之機構。 於又一態樣中，本發明提供一種用以分析受驗者之疾病、障礙或狀態的系統，其具備上述用以定量解析TCR或BCR之可變區之多樣性之系統、及基於利用該系統所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之機構。 於又一態樣中，本發明提供一種用以對該受驗者之疾病、障礙或狀態進行處置或預防的系統，其具備將利用上述用以分析受驗者之疾病、障礙或狀態之系統所確定之受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之機構、及根據該定量之關聯選擇適當之用以處置或預防之機構的機構。 於本說明書中所謂「資料庫」係指與基因相關之任意之資料庫，於本發明中尤其指包含T細胞受體及B細胞受體多樣性之資料庫。作為此種資料庫，可列舉IMGT(the international ImMunoGeneTics information system, www.imgt.org)資料庫、日本DNA資料庫(DDBJ, DNA Data Bank of Japan, www.ddbj.nig.ac.jp)、GenBank(美國生物工程學資訊中心，www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)資料庫、ENA(EMBL(歐洲分子生物學研究所)，www.ebi.ac.uk/ena)資料庫等，但不限定於此。 於本說明書中，所謂「可變區之多樣性(repertoire)」係指利用TCR或BCR，藉由基因再構成而任意地製造出之V(D)J區之集合。 於本說明書中，所謂「索引序列」係用以賦予唯一性而能夠鑑定擴增產物之序列。因此，較佳為與目標序列不同。又，較佳為不會對擴增產生影響之序列。關於針對索引序列之判定基準及其代表例如下所述。即，若對索引序列之判定基準進行說明，則索引序列係於將複數個樣品加以混合而同時進行定序時用以識別各樣品而附加之鹼基序列。對於來自一個樣品之前導對應地附加一個索引序列，而可識別所獲得之前導序列係來自何種樣品。可為A、C、G、T之4種鹼基之任意序列，理論上10種鹼基可製造出約100萬種序列，20種鹼基可製造出約1兆種序列。鹼基序列長度較佳為2個鹼基以上且40個鹼基以下，更佳為6個鹼基以上且10個鹼基以下。同時較理想為使用不含有連續序列(AA、CC、GG、TT)之序列。 於本說明書中，所謂「同型」係指IgM、IgA、IgG、IgE及IgD等中雖然屬於相同類型，但序列相互不同之類型。同型係使用各種基因之簡稱或符號而表示。 於本說明書中，所謂「亞型」係於BCR之情形時IgA及IgG中存在之類型中之類型，關於IgG存在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，關於IgA存在IgA1或IgA2。關於TCR亦已知存在於β鏈及γ鏈中，分別存在TRBC1、TRBC2、或TRGC1、TRGC2。 於本說明書中，所謂基因之「同源性」係指2個以上之基因序列相互間之同一性之程度，通常所謂具有「同源性」係指同一性或類似性之程度較高。因此，某2個基因之同源性越高，該等序列之同一性或類似性越高。2種基因是否具有同源性可藉由序列之直接之比較、或於核酸之情形時藉由在嚴格之條件下之雜交法進行調查。於直接比較2個基因序列之情形時，於該基因序列間DNA序列代表性而言至少50%相同之情形、較佳為至少70%相同之情形、更佳為至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同之情形時，該等基因具有同源性。因此，於本說明書中，「同源體」或「同源基因產物」意指發揮與本說明書中進而記載之複合體之蛋白質構成要素相同之生物學功能的其他種類、較佳為哺乳動物體內之蛋白質。 於本說明書中，所謂「受驗體」係指用於本發明之多樣性解析之試樣之起源或本發明之診斷對象，作為受驗體，可列舉哺乳動物(例如人類、小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、貓、狗、牛、馬、羊、猴等)，較佳為靈長類，尤佳為人類。 於本說明書中，所謂「試樣」係指從受驗體等獲得之任意物質，例如包括核酸(例如RNA)、細胞、組織、器官等。從業者可基於本說明書之記載而適當選擇較佳之試樣。 於本說明書中，所謂「機構」係指可成為達成某目的之任意器具者。 於本說明書中，所謂「診斷」係對與受驗體之疾病、障礙、狀態等相關之各種參數進行鑑定，並對此種疾病、障礙、狀態之現狀或將來加以判定。藉由使用本發明之方法、裝置、系統，可調查體內之狀態，使用此種資訊可選定受驗體之疾病、障礙、狀態、應投予之用於處置或預防之配方物或方法等各種參數。於本說明書中，狹義而言「診斷」係指診斷現狀，廣義而言包括「早期診斷」、「預測診斷」、「事前診斷」等。本發明之診斷方法原則上可利用來自身體之物，無需醫師等醫療從事者即可實施，因此於產業上有用。於本說明書中，為了明確無需醫師等醫療從事者即可實施，存在特別地將「預測診斷、事前診斷或診斷」稱為「支援」之情況。 作為本發明之診斷藥等醫藥等之配方順序於該領域中為公知，例如於日本藥典、美國藥典、其他國家之藥典等中有所記載。因此，從業者只要有本說明書之記載，則不進行過度之實驗便可確定應使用之量。 於本說明書中，所謂「修整」係指於基因解析中將不合適之部分去除。修整係藉由從前導兩端消除低品質區、或消除實驗順序中所賦予之人工核酸序列之部分序列、或消除該兩者而進行。修整可參照該領域公知之軟體及文獻(例如，cutadapt http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/ (EMBnet.journal,2011); fastq-mcf Aronesty E., The Open BioinformaticsJournal(2013) 7, 1-8 (DOI:10.2174/1875036201307010001)；及fastx-toolkit http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2009))而進行。 於本說明書中，所謂「合適之長度」係指如於本發明之基因解析中在進行比對等分析時適於分析之長度。此種長度例如可以設為從C區上之定序起始位置起包含V區上之靠近D區之100個鹼基的長度以上之方式決定，例如於本發明中，於TCR之情形時，可為200個核苷酸長度以上，較佳可為250個核苷酸長度以上，於BCR之情形時，可為300個核苷酸長度以上，較佳可為為350個核苷酸長度以上，但不限定於該等。 於本說明書中，所謂「輸入序列組」係指本發明之基因解析中成為TCR或BCR多樣性之解析之對象的序列組。 於本說明書中，所謂「基因區」係指V區、D區、J區及C區等各區。此種基因區於該領域為公知，可參考資料庫等而適當決定。於本說明書中，所謂基因之「同源性」係指2個以上之基因序列相互間之同一性之程度，通常所謂具有「同源性」係指同一性或類似性之程度較高。因此，某2個基因之同源性越高，該等序列之同一性或類似性越高。2種基因是否具有同源性可藉由序列之直接之比較、或核酸之情形時藉由在嚴格之條件下之雜交法進行調查。於本說明書中，所謂「同源性檢索」係指同源性之檢索。較佳為使用電腦以電腦模擬方式(in silico)進行檢索。 於本說明書中，所謂「近似」係指於進行同源性檢索時同源性之程度較高。由於在運行進行同源性檢索之軟體(BLAST、FASTA等)時通常以同源性之高低順序進行列舉，因此可藉由適當選擇順位較高者進行近似。 於本說明書中，所謂「最接近」係指於進行同源性檢索時同源性之程度最高。於藉由軟體進行同源性檢索之情形時選擇第1位所表示者。 於本說明書中，所謂「參照等位基因」係指於進行同源性檢索時參照資料庫中所選中(hit)之參照等位基因。 於本說明書中，所謂「比對」(英語為alignment或align)係指生物資訊學中以能夠特定出DNA或RNA、蛋白質等活體分子之一次結構之類似區域之方式進行排列而成者、及進行排列本身。可提供獲知功能性、結構性、或進化性之序列之關聯性的線索。 於本說明書中，所謂「指定」係指對某個序列(例如核酸序列、蛋白質序列等)分配特定之基因名、功能、特徵區(例如V區、J區等)等資訊。具體而言，可藉由對某個序列輸入特定資訊或使其與特定資訊形成鏈接等而達成。 於本說明書中，所謂「CDR3」係指第3個互補性決定區(complementarity-determining region，CDR)，此處，可變區中直接與抗原接觸之區變化尤其大，CDR係指該超可變區。於輕鏈與重鏈之可變區中分別存在3個CDR(CDR1～CDR3)、及包圍3個CDR之4個FR(FR1～FR4)。由於認為CDR3區橫跨V區、D區、J區而存在，因此認為其掌握可變區之關鍵而將其用作分析對象。 於本說明書中，所謂「參照V區上之CDR3開端」係指相當於本發明設為對象之V區中之CDR3之開端的序列。 於本說明書中，所謂「參照J上之CDR3末尾」係指相當於本發明設為對象之J區中之CDR3之末尾的序列。 於本說明書中，所謂「容許整體性地分散存在無規變異之條件」係指結果無規變異變得分散存在之任意條件，例如若為BLAST/FASTA最佳參數，則於以下之條件下良好地表現：於比對全長中，容許最大33%之不一致，且其中任意之30 bp容許最大60%之非連續之不一致。本發明所使用之IgG等分子之同型等功能性等效物可藉由檢索資料庫等而發現。於本說明書中，所謂「檢索」係指以電子方式或者藉由生物學或其他方法、較佳為以電子方式利用某個核酸鹼基序列而發現具有特定之功能及/或性質之其他核酸鹼基序列。作為電子方式之檢索，可列舉BLAST(Altschul et al., J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson & Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 85:2444-2448(1988))、Smith and Waterman法(Smith and Waterman, J.Mol.Biol.147:195-197(1981))、及Needleman and Wunsch法(Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453(1970))等，但不限定於該等。代表性而言，使用BLAST。作為生物學方式之檢索，可列舉嚴格雜交、將基因組DNA貼附於尼龍膜等之微陣列或貼附於玻璃板之微陣列(微陣列分析)、PCR及原位(in situ)雜交等，但不限定於該等。於本說明書中，意在本發明所使用之基因應亦包括藉由此種電子檢索、生物學檢索所鑑定出之對應基因。 於一實施形態中，於進行BCR之可變區之多樣性之定量解析的情形時，上述C區特異性引子包含與選自由IgM、IgA、IgG、IgE及IgD所組成之群中之目標同型C區完全匹配之序列，且具有與其他C區不具有同源性之序列。較佳為上述C區特異性引子係關於IgA或IgG而與作為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之任一者、或IgA1或IgA2之任一者之亞型完全匹配之序列。於另一實施形態中，於進行TCR之可變區之多樣性之定量解析的情形時，上述C區特異性引子係與選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所組成之群中之目標鏈之C區完全匹配，且與其他C區不具有同源性之序列。 於另一實施形態中，上述C區特異性引子較佳為選擇與上述資料庫中之相同之同型之C區等位基因序列全部完全匹配之序列部分。藉由選擇此種完全匹配，可進行精度較高之分析。 (大規模解析) 於另一態樣中，本發明提供使用藉由本發明之方法所製造之試樣進行基因解析之方法。 作為基因解析，可使用任意之解析方法進行，例如可使用以自公知之IMGT(the international ImMunoGeneTics information system, http://www.imgt.org)資料庫獲得之V、D、J、C序列作為參考序列而指定各前導序列之V、D、J、C序列並利用IMGT之HighV-Quest之方法，或者可使用於本說明書中亦作為解析系統之較佳例所記載之申請人所開發之新軟體(Repetoire Genesis)。 於一較佳之實施形態中，上述基因解析係T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)之定量解析。 藉由對各擴增分子進行定序，可識別不同之序列，因此定序具有用以檢測出純系增殖中之量之變化之感度。總之，於所提供之本發明之一態樣中，提供用以確定T細胞及/或B細胞中之重組DNA序列之分佈的方法。本方法可包括將試樣從對象單離之步驟、1輪或複數輪之核酸擴增、在空間上將各核酸單離之步驟、及對核酸定序之步驟。 於一態樣中，提供用以確定對象或個體中之1種或複數種多樣性之相關關係的方法。於另一態樣中，提供用以開發可預測來自有疾病之對象之任意試樣中之1種或複數種多樣性之相關關係的演算法之方法。於另一態樣中，提供用以使用可預測來自對象之任意試樣中之1種或複數種多樣性之相關關係的演算法而發現個體之1種多樣性之相關關係或複數種多樣性之相關關係的方法。於另一態樣中，提供用以製成算出疾病活動性得分之演算法的方法。於另一態樣中，提供用以監控個體之疾病狀態之方法。 (解析系統) 本發明提供用以使用下一代定序技術而進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)之定量解析的生物資訊。 於一態樣中，本發明係解析TCR或BCR多樣性之方法，其包括以下之步驟：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟；(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟；(3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及該參照等位基因之序列之比對的步驟；(4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟(較佳為對該輸入序列組指定V區及J區，以參照V區上之CDR3開端及參照J上之CDR3末尾為標記而提取CDR3序列之步驟)；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟(較佳為將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟)；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。 於本發明之方法中，(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟例如就V區而言，可藉由適當選擇包含該V區之資訊之資料庫並提供其而達成。 於本發明之方法中，(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟藉由在必要情形時適當使用軟體等之功能進行修整，又，在必要情形時適當選擇長度後提供所提取之輸入序列組而達成。輸入序列例如可為藉由公知之方法擴增之擴增產物組、或藉由本發明之逆轉錄模板置換PCR進行PCR擴增之擴增產物組。 於本發明之方法中，(3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟係藉由適當使用進行同源性檢索之軟體，對於輸入序列組，將各基因區(例如V區等)進行與參照資料庫之同源性檢索，並記錄結果所獲得之與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對而進行。 於本發明之方法中，(4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟可藉由基於已知之資訊等，由序列比對決定V區及/或J區而達成。於此種提取中，較佳可藉由對該輸入序列組指定V區及J區，並以參照V區上之CDR3開端及參照J上之CDR3末尾為標記來提取CDR3序列而達成。 於本發明之方法中，(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟可藉由使用該領域中公知之方法進行向胺基酸之轉譯，對該胺基酸序列藉由同源性檢索等來選出相當於D區之序列等而達成。較佳可將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類。 於本發明之方法中，(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟可藉由例如以清單之形式整理出至上述為止之步驟中所算出之V區、D區、J區及/或C區之出現頻度等而算出。藉此，可導出TCR或BCR多樣性。 亦參照圖12對以上之步驟進一步加以說明。 於S1(步驟(1))中，提供參照資料庫。其亦可為保存於外部記憶裝置1405中者，通常可通過通訊設備1411自向公眾提供之資料庫獲得。或者，亦可使用輸入裝置1409進行輸入，視需要記錄於RAM(Random Access Memory，隨機存取記憶體)1403或外部記憶裝置1405中。此處，提供包含V區等目標區之資料庫。 於S2(步驟(2))中，提供輸入序列組。此處使用輸入裝置1409或經由通訊設備1411，而輸入例如由經PCR擴增反應所擴增之擴增產物組獲得之序列資訊組。此處，亦可連接接收PCR擴增反應之擴增產物並對其進行基因序列解析之裝置。此種連接係經由系統匯流排1420而進行，或經由通訊設備1411而進行。此處，可視需要進行修整及/或提取合適之長度者。此種處理可利用CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)1401進行。用以進行修整及/或提取之程式可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。 於S3(步驟(3))中進行比對。此處，對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，該同源性檢索係經由通訊設備1411等對所獲得之參照資料庫進行同源性檢索程式處理。該處理可利用CPU1401進行。又，其結果為，對所獲得之結果進行分析而進行與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對。又，該處理亦可利用CPU1401進行。用以實行該等之程式分別可經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。 於S4(步驟(4))中，檢測D資訊之核酸序列。又，該處理亦可利用CPU1401進行。用以實行該等之程式分別可經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。此處，對該輸入序列組指定V區及J區。又，指定處理亦可利用CPU1401進行。又，基於指定結果提取D區之核酸序列亦可利用CPU1401進行。又，用於指定及提取之處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。此處，較佳可藉由基於已知之資訊等，由序列比對決定V區及/或J區而達成。結果可保存於RAM1403或外部記憶裝置1405中。於此種提取中，較佳可藉由對該輸入序列組指定V區及J區，並以參照V區上之CDR3開端及參照J上之CDR3末尾為標記提取CDR3序列而達成。又，此種處理亦可於CPU1401中進行。又，用於該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。 於S5(步驟(5))中，對D區進行分類。進行將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之處理，又，該處理亦可利用CPU1401進行。又，用於該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。關於所獲得之胺基酸序列，亦可藉由同源性檢索等而選出相當於D區之序列。又，此種處理亦可利用CPU1401進行。又，用於該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。較佳可將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類。又，該處理亦可利用CPU1401進行。又，用於該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。 於S6(步驟(6))中，基於上述分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性。又，用於該算出及導出之處理亦可利用CPU1401進行。又，用於該處理之程式亦可分別經由外部記憶裝置、或通訊設備、或輸入裝置而提供。 於一較佳之實施形態中，本發明所使用之基因區包含V區、D區、J區及視需要之C區之全部。 於一實施形態中，上述參照資料庫係對各序列分配唯一ID之資料庫。藉由唯一地分配ID，可基於ID之簡單之指標而分析基因之序列。 於一實施形態中，上述輸入序列組係無偏序列組。無偏之序列組可藉由利用如本說明書所記載之逆轉錄模板置換PCR進行PCR擴增而實施。 於另一實施形態中，上述序列組係經修整者。藉由進行修整，可去除不需要或不合適之核酸序列，而可提高分析之效率。 於較佳之實施形態中，修整係藉由如下步驟達成：從前導兩端消除低品質區；從前導兩端消除與模板置換寡核苷酸之序列匹配10 bp以上之區；及若殘留之長度為200 bp以上(TCR)或300 bp以上(BCR)，則設為高品質而用於解析。較佳為上述低品質係QV值之7 bp移動平均值未達30者。 於較佳之實施形態中，上述近似之序列係最接近之序列。於具體之實施形態中，上述近似之序列依序由1.一致鹼基數、2.核心長度、3.得分、4.比對長度所確定。 於另一實施形態中，上述同源性檢索係於容許整體性地分散存在無規變異之條件下進行。關於此種條件，例如若為BLAST/FASTA最佳參數，則於以下之條件下良好地表現：比對全長中，容許最大33%之不一致，且其中任意之30 bp容許最大60%之不連續之不一致。於一實施形態中，上述同源性檢索與預設條件相比，包含如下條件之至少一個條件：(1)窗口尺寸之縮短；(2)失配罰分之減少；(3)空位罰分之減少；及(4)指標之優先順位之頂部為一致鹼基數。 於另一實施形態中，上述同源性檢索係於BLAST或FASTA中，於以下之條件下實施： V 失配罰分＝-1、最短比對長度＝30、最短核心長度＝15 D 字元長度＝7(BLAST之情形時)或K-tup＝3(FASTA之情形時)、失配罰分＝-1、空位罰分＝0、最短比對長度＝11、最短核心長度＝8 J 失配罰分＝-1、最短選中長度＝18、最短核心長度＝10 C 最短選中長度＝30、最短核心長度＝15。例如若為使用更短之(～200 bp)序列，甚至僅分類出一部分區域之狀況(背離「較佳之例」之狀況)，則可使用該條件，於利用Illumina製造之定序儀之狀況下亦可使用。於該情形時，考慮同源性檢索使用bwa或bowtie之可能性。 於特定之實施形態中，上述D區之分類係藉由上述胺基酸序列之出現頻度而進行。 於進一步之實施形態中，於上述步驟(5)中，於存在D區之參照資料庫之情形時，以與上述CDR3之核酸序列之同源性檢索結果及胺基酸序列轉譯結果之組合作為分類結果。 於另一實施形態中，於上述步驟(5)中，於不存在D區之參照資料庫之情形時，僅藉由上述胺基酸序列之出現頻度進行分類。 於具體之實施形態中，上述出現頻度係以基因名單位及/或等位基因單位表示。 於另一實施形態中，上述步驟(4)包含以下步驟：對該輸入序列組指定V區及J區，以參照V區上之CDR3開端及參照J上之CDR3末尾為標記而提取CDR3序列。 於進一步之實施形態中，上述步驟(5)包括將該CDR3之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟。 於一態樣中，本發明提供一種對TCR或BCR多樣性進行解析之系統，其具備：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之機構：(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之機構；(3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之機構；(4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之機構；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之機構；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之機構。 於另一態樣中，本發明提供一種使電腦實行解析TCR或BCR多樣性之方法之處理的電腦程式，該方法包括以下之步驟：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟：(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟；(3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟；(4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。 於又一態樣中，本發明提供一種儲存使電腦實行解析TCR或BCR多樣性之方法之處理的電腦程式的記錄介質，該方法包括以下之步驟：(1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟：(2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟；(3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟；(4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟；(5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟；(6)基於(5)中之分類，算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或其組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。 (系統構成) 其次，參照圖12之功能方塊圖，對本發明之系統1之構成進行說明。再者，於本圖中係表示以單一系統而實現之情形。 本發明之基因分析系統1係經由系統匯流排1420於內置於電腦系統中之CPU1401上連接RAM1403、ROM(Read Only Memory，唯讀記憶體)或HDD(hard disk drive，硬磁碟驅動機)、磁碟、USB(universal serial bus，通用串列匯流排)記憶體等快閃記憶體等外部記憶裝置1405及輸入輸出介面(I/F)1425而構成。於輸入輸出I/F1425上分別連接有鍵盤或滑鼠等輸入裝置1409、顯示器等輸出裝置1407、及數據機等通訊設備1411。外部記憶裝置1405具備資訊資料庫儲存部1430及程式儲存部1440。均為確保於外部記憶裝置1405內之一定之記憶區域。 於此種硬體構成中，藉由經由輸入裝置1409輸入各種指令(command)，或經由通訊I/F或通訊設備1411等接收指令，利用CPU1401將安裝於該記憶裝置1405之軟體程式讀取至RAM1403上進行運行而實行，藉此與OS(操作系統)協同發揮出該發明之功能。 於資料庫儲存部1430中隨機寫入參照資料庫或輸入序列組、或所產生之分類資料、或者TCR或BCR多樣性之資料等、或經由通訊設備1411等所獲得之資訊，並進行更新。藉由利用各主目錄對各輸入序列組中之各序列、參照資料庫之各基因資訊ID等資訊進行管理，而可利用各主目錄中所定義之ID對歸屬於成為儲存對象之樣品之資訊進行管理。 對於資料庫儲存部1430，將試樣提供者ID、試樣資訊、核酸分析結果、已知之個體・生理資訊、及TCR或BCR多樣性分析結果作為輸入序列組條目資訊而與試樣ID建立關聯並儲存於該資料庫儲存部1430中。此處，TCR或BCR多樣性分析結果係藉由本發明之處理對核酸分析結果進行處理而獲得之資訊。 又，儲存於程式儲存部1440中之電腦程式係將電腦構成為上述之處理系統、例如作為實施進行修整、提取、比對、指定、分類、轉譯等之處理之系統者。該等各功能係各自獨立之電腦程式或其模塊、常用程式等，藉由利用上述CPU1401進行實行而作為各系統或裝置而構成電腦。再者，以下，各系統中之各功能協同構成各系統。 (多樣性之解析系統、解析方法) 於一態樣中，本發明提供使用資料庫對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析的方法。該方法包括如下步驟：(1)提供來自該受驗者且無偏性地進行擴增之含有T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；(2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟；及(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟。於本說明書中亦將該方法及具有本說明書所說明之1個或複數個進一步特徵之方法稱為「本發明之多樣性解析法」。此外，亦將實現本發明之多樣性解析法的系統稱為「本發明之多樣性解析系統」。 關於本發明之方法中之(1)提供來自該受驗者且無偏性地進行擴增之含有T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，只要成為適於確定核酸序列之試樣，則可為任何試樣。作為此種方法，除了本發明之上述之較佳擴增方法以外，亦可使用逆轉錄酶(Reverse transcriptase)-PCR、即時PCR、數位PCR、乳化PCR、擴增片段長度多型性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)PCR、等位基因特異性PCR、組裝PCR、非對稱PCR、菌落PCR、解螺旋酶依賴性擴增、熱啟動PCR、反向PCR、原位(in situ)PCR、巢式(nested)PCR、遞減(Touchdown)PCR、環形恆溫(loop-mediated isothermal)PCR(LAMP)、依賴核酸序列擴增(Nucleid acid sequence based amplification，NASBA)、連接酶鏈反應(Ligase Chain Reaction)、分支DNA擴增(Branch DNA Amplification)、滾環式擴增(Rolling Circle Amplification)、環-環擴增(Circle to circle Amplification)、單引子恆溫擴增(single primer isothermal amplification，SPIA)、捕獲連結式靶向擴增(TACL，Trget Amplification by Capture and Ligation)、cDNA之5'末端快速擴增(5'-Rapid amplification of cDNA end，5'-RACE)、cDNA之3'末端快速擴增(3'-Rapid amplification of cDNA end，3'-RACE)、RNA轉錄本之5'末端之置換機制(SMART，Switching Mechanism at 5'-end of the RNA Transcript)。 本發明之方法中之(2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟中只要可確定核酸序列，則可使用任意方法。通常由於需要大量之定序，因此較佳為使用自動化之大規模定序方法。作為此種定序方法，有使用Roche 454定序儀之定序(GS FLX+、GS Junior)、使用Ion Torrent定序儀(Ion PGMTM
Sequencer)之方法之定序、使用Illumina公司之方法(GenomeAnalyzer IIx，Hiseq，Miseq)之定序。作為其他定序法，可列舉：HeliscopeTM
定序儀(Sequencer)、Helicos真正單分子定序(True Single Molecule Sequencing)(tSMA)(Harris.T.D.et.al Science 2008，320-160-109)、SoliDTM
定序(Sequencing)(Life Technologies, Inc.)、單分子即時(Single Molecule Real Time)(SMRTTM
)PacBio系統(Pacific Biosciences, CA)、奈米孔定序(Nanopore Sequencing)(Oxford Nanopore Technologies，UK)、LaserGenTM
(LaserGen, Inc. CA)(文獻：Litosh VA et al., Nucleic Acids Res. 2011 Mar; 39 (6): e39)、Lightspeed GenomicsTM
(Lightspeed Genomics, CA)、GnuBIO(GnuBIO Inc., MA)、Polonator定序(sequencing)(M. Danaher/Dover, Azco Biotec. Inc., CA)、Mebious Biosystem之單分子定序(Mebious Biosystem's single molecule sequencing)(Mebious Biosystems Limited)、Millikan定序(sequencing)(Caerus Molecular Diagnostics, Inc)、Intelligent Bio-Systems, Inc.(文獻：HutterD, et al Nucleosides Nucleotides Nucleic Acid 2010; 29(11): 879-95.)、雜交輔助奈米孔定序(Hybridization-Assisted Nanopore Sequencing)(Nabsys Inc., RI)、奈米孔定序(Nanopore sequencing)(Noblegen Biosciences, Inc.)、奈米孔定序(Nanopore sequencing)(Electronic Bioscciences, CA)、熱定序(Thermosequencing)(GENIUSTM
technology)(Genapsys, Inc., CA)、CAERUS MOLECULAR DIAGNOTICS, INC, CA、單分子快速奈米轉移佈局(IMPRNT，Individual Molecule Placement Rapid Nanotransfer)(Halcyon Molecular, Inc)、單色球差修正雙束低能電子顯微鏡(Monochromatic aberration-corrected dual-beam low energy electron microscopy，Electron Optica, Inc., CA)、ZS Genesis DNA 定序(Sequencing)(ZS Genetyics, Inc)等。Roche454定序係製造使特異性結合於3'末端與5'末端之2種轉接子(adaptor)結合之單鏈DNA。藉由將該單鏈DNA經由轉接子與珠粒結合，並包裹於油包水滴乳液中，而形成具有珠粒與DNA片段之微反應器。其後，於油包水滴乳液內進行乳液PCR而將目標基因加以擴增。將該珠粒應用於PicoTiter板，而進行定序。以利用DNA聚合酶使DNA包圍dNTP時產生之焦磷酸作為受質，利用硫酸化酶(sulfrylase)生成ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)(焦磷酸定序(Pyrosequencing))。以該ATP與螢光素(Luciferin)作為受質，螢光素酶(Luciferase)發出螢光，利用CCD(charge-coupled device，電荷耦合元件)攝影機對其進行檢測，藉此確定鹼基序列。Ion Torrent公司之方法係藉由與Roche公司相同之方法進行乳化PCR後，將珠粒轉移至微晶片，於微晶片上進行定序反應。檢測係於半導體晶片上檢測利用聚合酶使DNA伸長時釋放出之氫離子濃度，並轉換為鹼基序列。Illumina公司之定序係藉由橋式PCR法與合成定序(Sequencing-by-synthesis)之方法，於流槽上使目標DNA擴增，一邊合成一邊進行定序之方法。橋式PCR法係製作於兩末端附加有不同轉接序列之單鏈DNA。預先將5'末端側之轉接序列固定於流槽上，藉由進行伸長反應而固定於流槽。同樣地將3'末端側之轉接子固定於靠近之位置，與所合成之DNA之3'末端結合，以形成所謂橋之狀態合成雙鏈DNA。其後，藉由重複進行橋式結合→伸長→改性，多數單鏈DNA片段局部地進行擴增，而形成集聚之叢集。以該單鏈DNA為模板進行定序。合成定序(Sequencing-by-synthesis)係添加序列引子後，利用DNA聚合酶進行利用3'末端阻斷螢光dNTP之單鹼基合成反應。藉由雷射光激發結合於鹼基之螢光物質，利用螢光顯微鏡以照片之形式記錄發出之光。其次，移除螢光物質與阻斷，進行其後之伸長反應，推進檢測螢光之步驟，藉此確定鹼基序列。較佳為對複數個序列藉由單一定序而進行，如此較有利。對於更長之序列長度，亦可一次性地進行定序，如此亦有利。 本發明中之(3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟只要可算出基因之出現頻度及其組合，可導出TCR多樣性及/或BCR多樣性，則可使用任何技術。例如，除了上述之解析方法之較佳之例以外，亦可利用IMGT所提供之分析工具HighV-Quest。於其他方法中，亦可利用作為具備比對功能或分佈分析功能之軟體的AbMapper、ALLPATHS、Arachne、BACCardl、Bfast、BLAT、Bowtie、BWA-MEM、BWA-SW、BWA、CCRa VAT & QuTie、CLC workstation、CNV-seq、Elvira、ERNE-map (rNA)、GSMapper、Glimmer、gnumap、Goseq、ICAtools、LOCAS、MapSplice、Maq、MEME、Mosaik、NGSView、Novoalign、OSLay、Partek、Perm、Projector、Qpalma、RazerS、SHARCGS、SHRiMP2、SNP-o-matic、Splicemap、SSAHA2、Stampy、Tablet、TMAP、Tophat、Velve而進行。 於一實施形態中，上述核酸試樣含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列，於上述(2)之確定序列之步驟中，藉由單一定序而確定上述核酸序列。本發明之方法可減少或消除藉由利用單一定序進行複數種定序而會產生之偏向。因此，尤其對準確地檢測出僅於低頻度產生之TCR或BCR之前導有用。 於另一實施形態中，上述單一定序之特徵在於：於從上述核酸試樣向定序用之試樣之擴增中，用作引子之序列中之至少一者具有編碼C區之核酸序列或與其互補鏈相同之序列。藉由使用具有編碼C區之核酸序列或與其互補鏈相同之序列的引子，於任何TCR或BCR中均可進行相同之擴增，而可達成無偏。 於一實施形態中，上述無偏之擴增包括並非V區特異性之擴增。與努力研究使用V特異性引子之多工等而進行無偏之擴增之情形相比，可進一步減少或消除偏向。 於一實施形態中，設為本發明之對象的多樣性係BCR之可變區之多樣性，上述核酸序列係BCR之核酸序列。BCR容易產生變異，據稱尤其於V區多發變異，使用V區特異性擴增之方法難以進行BCR多樣性之準確分析。 於一態樣中，本發明提供基於根據本發明之多樣性解析方法所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之方法。 於本發明之疾病、障礙或狀態之分析方法中，作為基於根據本發明之多樣性解析方法所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之方法，以如下方法為代表：將疾病、障礙、狀態等臨床資訊與包括所導出之前導之種類、前導數、前導頻度、V區、J區、C區、CDR3序列等之前導資料加以連結，使用EXCEL等總分析表進行資料庫化。首先，針對所導出之各前導序列，1.檢索NKT或MAIT等具有已知功能之TCR。2.對現有之公共資料庫內進行檢索，與抗原特異性等功能已知之TCR或BCR進行對照。3.於所構建之資料庫內或現有之公共資料庫內進行檢索，根據共通之試樣之來源、特性或功能而與疾病、障礙或狀態建立關聯。其次，針對試樣中之前導序列，1.明確特定之前導之頻度是否增加(純系性(clonality)之增加)。2.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈或J鏈使用頻度是增加還是減少。3.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈中之CDR3序列長度是增加還是減少。4.調查根據疾病之發病或障礙之狀態而變化之CDR3區之組成或序列。5.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或消失之前導。6.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而增加或減少之前導。7.於其他試樣中檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或增加、減少之前導，與疾病、障礙或狀態建立關聯。8.使用樣品數、前導種類、前導數等資料，並且使用ESTIMATES或R(vegan)等統計解析軟體算出多樣性指數或類似性指數。9.可將多樣性指數或類似性指數之變化與疾病之發病或障礙之狀態建立關聯。 於一實施形態中，於本發明之分析方法中，上述受驗者之疾病、障礙或狀態可列舉血液腫瘤、大腸癌、免疫狀態、類風濕性關節炎、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、自發性血小板減少紫癜等，但不限定於該等。 於另一實施形態中，本發明提供一種用以對該受驗者之疾病、障礙或狀態進行處置或預防之方法，其包括：將藉由本發明之方法所確定之受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之步驟；及根據該定量之關聯選擇合適之用於處置或預防之機構的步驟。 於一實施形態中，本發明之用以處置或預防之方法中設為對象之受驗者之疾病、障礙或狀態可列舉：血液腫瘤、大腸癌、免疫狀態、類風濕性關節炎、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、自發性血小板減少紫癜等，但不限定於該等。 於另一態樣中，本發明提供用以使用資料庫對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析之系統(解析系統)。該系統具備：(1)用以提供來自該受驗者且無偏性地進行擴增之含有T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸試樣的套組；(2)用以確定該核酸試樣所含之該核酸序列之裝置；及(3)用以基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之裝置。將此種系統及具有本說明書所說明之1個或複數個進一步特徵之系統稱為「本發明之多樣性解析系統」。本發明之多樣性解析系統實現「本發明之多樣性解析法」。 於另一實施形態中，上述核酸試樣含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列，且上述(2)之裝置以可藉由單一定序確定上述核酸序列之方式構成。 於另一實施形態中，上述單一定序之特徵在於：於從上述核酸試樣向定序用之試樣之擴增中，用作引子之序列中至少一者具有與C區相同之序列。本發明之系統可減少或消除藉由利用單一定序進行複數種定序而會產生之偏向。因此，本發明之系統尤其對準確地檢測出僅於低頻度產生之TCR或BCR之前導有用。 於另一實施形態中，上述單一定序之特徵在於：於從上述核酸試樣向定序用之試樣之擴增中，用作引子之序列中至少一者具有編碼C區之核酸序列或與其互補鏈相同之序列。此種引子可設置於該裝置中，亦可含有於套組中，亦可另行提供。藉由使用具有編碼C區之核酸序列或與其互補鏈相同之序列的引子，於任何TCR或BCR中均可進行相同之擴增，而可達成無偏。 於一實施形態中，對本發明之套組所提供之核酸試樣所含之核酸序列進行上述無偏擴增，但該擴增並非V區特異性之擴增。與努力研究使用V區特異性之引子之多工等而進行無偏之擴增之情形相比，可進一步減少或消除偏向。 於一實施形態中，成為本發明之系統之分析之對象的多樣性係BCR之可變區之多樣性，上述核酸序列係BCR之核酸序列。BCR容易產生變異，據稱尤其於V區多發變異，使用V區特異性擴增之方法難以進行BCR多樣性之準確分析。藉由使用本發明之系統，亦可準確地分析BCR多樣性。 於另一態樣中，本發明提供分析受驗者之疾病、障礙或狀態之系統(分析系統)，其具備本發明之解析系統及基於利用該系統所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之機構。本發明之分析系統之基於利用該系統所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之機構代表性而言係將疾病、障礙、狀態等臨床資訊與包括所導出之前導之種類、前導數、前導頻度、V區、J區、C區、CDR3序列等之前導資料加以連結，使用EXCEL等總分析表進行資料庫化。首先，針對所導出之各前導序列，1.檢索NKT或MAIT等具有已知功能之TCR。2.對現有之公共資料庫內進行檢索，與抗原特異性等功能已知之TCR或BCR進行對照。3.於所構建之資料庫內或現有之公共資料庫內進行檢索，根據共通之試樣之來源、特性或功能而與疾病、障礙或狀態建立關聯。其次，針對試樣中之前導序列，1.明確特定之前導之頻度是否增加(純系性之增加)。2.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈或J鏈使用頻度是增加還是減少。3.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈中之CDR3序列長度是增加還是減少。4.調查根據疾病之發病或障礙之狀態而變化之CDR3區之組成或序列。5.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或消失之前導。6.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而增加或減少之前導。7.於其他試樣中檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或增加、減少之前導，與疾病、障礙或狀態建立關聯。8.使用樣品數、前導種類、前導數等資料，並且使用ESTIMATES或R(vegan)等統計解析軟體算出多樣性指數或類似性指數。9.可將多樣性指數或類似性指數之變化與疾病之發病或障礙之狀態建立關聯。 於一實施形態中，作為本發明之分析系統可分析之上述受驗者之疾病、障礙或狀態，可列舉血液腫瘤、大腸癌、免疫狀態、類風濕性關節炎、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、自發性血小板減少紫癜等，但不限定於該等。 於另一態樣中，本發明提供用以對該受驗者之疾病、障礙或狀態進行處置或預防之系統(處置系統或預防系統)，其具備：將藉由本發明之解析系統所確定之受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之機構；及根據該定量之關聯選擇適當之用以處置或預防之機構的機構。 本發明之系統中之將受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之機構可藉由如下構成而實現。即，可藉由讀取利用本發明之解析系統所導出之多樣性之資訊，讀取其中與受驗者之疾病、障礙或狀態相關之資訊，並將該等建立關聯而實現。對於所導出之前導合計資料，根據針對現有之參考序列之對照作業而指定V區、J區、C區，從而確定CDR3序列。基於V區、J區、CDR3序列均一致之前導，按照唯一前導(除此以外不具有相同之序列之前導)算出試樣中所檢測出之前導數及占總前導數之比例(頻度)。將該資訊(前導序列、前導數、前導頻度、V區、J區、C區、CDR3序列)與受驗者之臨床資訊(病史、疾病名、病型、進行度、重症度、HLA(human leukocyte antigen，人類白細胞抗原)型、免疫狀態等)連結，使用EXCEL等總分析表或具有資料庫化功能之軟體進行資料庫化。試樣中之前導序列係根據前導數或頻度進行分類排序，而進行排序處理。又，按照各V區或J區合計前導數，算出V區使用頻度或J區使用頻度。基於該等資訊，1.明確特定之前導之頻度是否增加(純系性之增加)。2.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈或J鏈使用頻度是增加還是減少。3.調查根據疾病之發病或障礙之狀態特定之V鏈中之CDR3序列長度是增加還是減少。4.調查根據疾病之發病或障礙之狀態而變化之CDR3區之組成或序列。5.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或消失之前導。6.檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而增加或減少之前導。7.於其他試樣中檢索根據疾病之發病或障礙之狀態而出現或增加、減少之前導，與疾病、障礙或狀態建立關聯。8.使用樣品數、前導種類、前導數等資料，並且使用ESTIMATES或R(vegan)等統計解析軟體算出多樣性指數或類似性指數。9.可將多樣性指數或類似性指數之變化與疾病之發病或障礙之狀態建立關聯。根據定量之關聯而選擇合適之用於處置或預防之機構之機構可採用如下構成。即，可藉由將顯示定量性之資料、與關於處置、治療或預防之至今為止之資訊或目前可獲得之資訊建立關聯，實現其後之經過得到改善者之選擇，而實現該選擇機構之選擇。 於一實施形態中，上述受驗者之疾病、障礙或狀態可列舉血液腫瘤、大腸癌、免疫狀態、類風濕性關節炎、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、自發性血小板減少紫癜等，但不限定於該等。 (應用)使用本發明，於軟體上算出由大規模定序鑑定出之TCR或BCR基因之鹼基序列(前導)與其出現頻度，而可描繪出清單、或分佈、或圖表。基於該等資訊，使用如下之各種指標，藉此檢測出多樣性之變化。基於該變化，可明確與疾病或障礙之關聯。 於一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統檢測出V基因之使用頻度之方法。鑑定各前導之V基因，可算出各V基因占總體之TCR或BCR基因之比例。可明確與疾病或病情關聯之V之使用頻度之增加或減少。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統檢測出J基因之使用頻度之方法。鑑定各前導之J基因，可算出各J基因占總體之TCR或BCR基因之比例。可明確與疾病或病情關聯之J之使用頻度之增加或減少。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統檢測出亞型之頻度解析(BCR)之使用頻度之方法。基於C區之定序，可算出IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型之存在頻度。可明確與疾病或病情關聯之特定亞型之增加或減少。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統對CDR3序列長度之圖案進行分析之方法。可算出各前導所具有之CDR3鹼基序列長度，而明確其分佈。正常之TCR或BCR表現出類常態分佈之波峰圖案，檢測出偏離正常之分佈之波峰，可明確與疾病或病情之關聯。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統對TCR或BCR之純系性進行分析之方法。基於各前導之V序列、J序列及CDR3序列，對具有相同之序列之前導加以分類，算出其複本數。算出各前導之複本數於總體之前導數中所占之比例，可明確高頻度地存在之前導之存在。根據出現頻度，以降序進行分類排序，關於高頻度地存在之前導之數或比例，藉由與正常試樣加以比較而對純系性之程度進行評價。據此調查與疾病或病情關聯之TCR或BCR純系性之變化。尤其可用於白血病細胞等之檢測。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統而提取重疊前導之方法。對分類為特定之疾病、病型、病情、組織、基因型(HLA等)之試樣之前導加以檢索，而提取試樣間重疊之TCR或BCR前導。由此可明確與疾病或障礙之狀態關聯之TCR或BCR基因。可鑑定出與自體免疫疾病之發病相關之疾病特異性T細胞、產生疾病關聯抗體之B細胞、攻擊癌細胞之癌特異性T細胞等。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統而檢索疾病特異性TCR或BCR純系之方法。對於試驗試樣，檢索與特定之疾病或障礙之狀態建立關聯之TCR或BCR前導，並明確其出現或消失、或者增加或減少，藉此可預測疾病之發病或者病情之進行或改善。 於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統，並使用多樣性指數分析對象之方法。或者，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統，並使用多樣性指數而支援對象之分析的方法。對基於CDR3序列所鑑定出之前導序列進行計數，算出前導之種數、個體數，針對TCR或BCR之多樣性進行指數化。使用夏農-維納(Shannon-Wiener)之多樣性指數(H')、辛普森(Simpson)之多樣性指數(λ、1－λ或1/λ)、Pielou均等度指數(J')或Chao1指數等，與正常試樣加以對比，藉此對多樣度進行評價。可用作評測骨髓移植後之免疫系之恢復度的指標。又，可用作檢測伴隨造血器腫瘤之免疫系細胞之異常的指標。 於一實施形態中，於使用多樣性指數之對象之分析方法中，使用上述多樣性指數作為評測骨髓移植後之免疫系之恢復度的指標、或檢測伴隨造血器腫瘤之免疫系細胞之異常之指標。使用此種多樣性指標之分析對於先前之系統而言較困難。 於本說明書中，各種多樣性指標可根據樣品數、前導之種類、前導數之資料，使用EXCEL總分析表、ESTIMATES(Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.)或R封裝體(vegan)等軟體而算出。夏農-維納之多樣性指數(H')、辛普森之多樣性指數(λ、1－λ或1/λ)、Pielou均等度指數(J')或Chao1指數係根據如下所示之數式而求出。N：總前導數、ni
：前導i中之前導數 夏農威沃爾(Shannon-Weaver)指數H' [數1]
辛普森指數λ [數2]
反向辛普森指數(Inverse Simpson's index) [數3]
Pielou均勻度指數J [數4]
SChao
1Sobs
：總前導種數、F1
：單前導、F2
：雙前導 [數5]
於另一態樣中，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統，並且使用類似性指數而分析對象之方法。或者，本發明提供使用本發明之解析方法、或解析系統，並且使用類似性指數而支援對象之分析之方法。算出基於CDR3序列所鑑定出之前導序列之種數、個體數，明確所比較之試樣間之TCR或BCR多樣性之類似度。使用Morisita-Horn指數、木元之Cπ指數或Pianka之α指數，明確試樣間之類似度。可用於HLA型一致或不一致間之多樣性之類似度之評價、骨髓移植後之受體(recipient)與予體間之多樣性之類似度之評價等。 於一實施形態中，作為HLA型一致或不一致間之多樣性之類似度之評價、骨髓移植後之受體(recipient)與予體間之多樣性之類似度之評價，使用上述類似性指數。使用此種類似性指數之分析對於先前之系統而言較困難。各種類似性指數可使用以下之數式，並且使用ESTIMATES(Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.)或R封裝體(vegan)而算出。Morisita-Horn指數、木元之Cπ指數或Pianka之α指數係藉由如下所示之數式求出。Morosita-Horn指數Xi
：於來自其中一樣品之總X前導中出現之前導i之次數；yi
：於來自另一樣品之總Y前導中出現之前導i之次數；S：唯一前導數 [數6]
木元之π指數 [數7]
[數8]
Pianka之α指數 [數9]
本發明可使用下一代定序技術，對用以進行T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)之定量解析的試樣進行調整。該等定序技術可以適當之成本由試樣獲得100萬或100萬以上之前導。即使為以1/1,000,000或較其更低之頻度存在之基因型，使用該等技術亦可以特異性方式並且以無偏之方式檢測到。可達成用於由來自血液或骨髓等之DNA之試樣將基因或轉錄物之特定部分之序列之不同型全部擴增之無偏擴增方法。 ＜癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法＞ 於一態樣中，本發明提供製備用於對受驗者使用癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法之組合物的方法。該方法包括如下步驟：(1)藉由本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統，解析該受驗者之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)多樣性之步驟；(2)基於該解析之結果，確定來自該受驗者之癌細胞之TCR或BCR之步驟，該確定係藉由在來自該受驗者之癌細胞之TCR或BCR基因之存在頻度排序中選擇排名靠前之序列作為該來自癌細胞之TCR或BCR而進行；(3)基於所確定之該來自癌之TCR或BCR而確定HLA檢查肽之候補之胺基酸序列的步驟，該確定係基於使用HLA結合肽預測演算法所算出之得分而進行；及(4)合成所確定之肽之步驟。此處所合成之肽可用於癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法。於本說明書中存在將該方法稱為「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」之情況。 於癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法中，具體而言，臨床方面可使用如下之順序實施。例如，簡單而言，(1)採集罹患血液腫瘤之癌症患者末梢血細胞，將淋巴細胞細胞分離，其後可實施本發明之多樣性解析法，並且可使用其進行癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法。於另一實施形態中，於T細胞系腫瘤之情形時對TCR實施本發明之多樣性解析法，於B細胞系腫瘤之情形時對BCR實施本發明之多樣性解析法。並且，其後於TCR或BCR基因之存在頻度排序中選擇排名靠前之序列作為該來自癌細胞之TCR或BCR，使用HLA結合肽預測程式(如本說明書中此外亦有說明般可使用任意之公知之程式)預測由含有該TCR或BCR基因之CDR3區之序列另行確定之結合於該癌症患者之人類白血球型抗原(HLA)之肽。然後，利用肽合成裝置而合成HLA結合肽，其後進行以下操作。於定製肽致敏CTL(cytotoxic T lymphocyte，細胞毒性T淋巴細胞)療法之情形時，可採集患者末梢血單核球細胞，將單核球細胞或來自患者之抗原呈現細胞與CD8＋T細胞加以混合，對所獲得者添加該肽進行培養，並利用抗原肽進行刺激。 於定製肽致敏CTL療法之情形時，可將該肽刺激淋巴細胞細胞移入患者體內，進行CTL療法。 或者，作為定製肽致敏DC(dendritic cells，樹突狀細胞)疫苗療法之其他方法，亦可藉由如下方式實現，即，採集患者末梢血單核球細胞後，將單球細胞分離，於分化誘導因子之存在下分化誘導為樹狀細胞(DC)後，添加該肽進行培養，並將該肽致敏樹狀細胞移入患者體內，進行樹狀細胞療法。 癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法例如可用於急性骨髓性白血病及近緣前驅細胞腫瘤、淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤等血液癌、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良症候群等白血病近緣疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病等自體免疫疾病、各種感染症患者等，可用於末期癌症患者、難治性自體免疫疾病、嚴重感染症之患者。尤其於進行以腫瘤細胞為靶之抗體療法等之情形時，因腫瘤細胞中未表現靶抗原、或靶抗原於正常細胞中亦有表現而成為問題。與此相比，由於選擇利用對腫瘤細胞具有特異性之序列，故而可期待特異性更高、副作用更少之治療。 於一實施形態中，本發明中之(3)步驟之HLA檢查肽之候補係使用BIMAS、SYFPEITHI、RANKPEP或NetMHC而確定。 於另一實施形態中，本發明包括：於本發明中之(4)步驟之後，將上述肽、上述來自受驗者之樹狀細胞或抗原呈現細胞、及上述來自受驗者之CD8＋
T細胞加以混合培養之步驟。此方法亦稱為改良型CTL法。 關於改良型CTL法，其特徵在於例如：與現有之利用抗CD3抗體或IL-2進行之廣泛之T細胞的活化不同，藉由利用抗原肽對CD8＋T細胞賦予抗原特異性，而可期待特異性更高且副作用更少之治療。又，由於利用基於由該患者之腫瘤細胞獲得之資訊所製造之個體化肽，故而可期待較高之治療效果。 改良型CTL法例如可用於急性骨髓性白血病及近緣前驅細胞腫瘤、淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤等血液癌、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良症候群等白血病近緣疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病等自體免疫疾病、各種感染症患者等，可用於末期癌症患者、難治性自體免疫疾病、嚴重之感染症之患者。 於另一實施形態中，本發明包括：於本發明之(4)步驟之後，將上述肽、及上述來自受驗者之樹狀細胞加以混合培養之步驟。此方法亦稱為DC疫苗療法。 於DC疫苗療法中，由於例如基於由來自該患者之腫瘤細胞獲得之序列資訊而製造個體化肽，故而不會作用於正常細胞，而更特異性地作用於腫瘤細胞，從而可預期較高之治療效果。由於使用肽作為抗原，故而具有不同於蛋白而可容易地進行化學合成之優點。 DC疫苗療法例如可用於急性骨髓性白血病及近緣前驅細胞腫瘤、淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤等血液癌、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良症候群等白血病近緣疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病等自體免疫疾病、各種感染症患者等，可用於末期癌症患者、難治性自體免疫疾病、嚴重之感染症之患者)。 於另一實施形態中，本發明包括：於本發明之(4)步驟之後，將上述肽、上述來自受驗者之樹狀細胞或抗原呈現細胞、及上述來自受驗者之CD8＋
T細胞加以混合培養，而生產CD8＋
T細胞-樹狀細胞/抗原呈現細胞-肽混合物之步驟；及將上述肽、及上述來自受驗者之樹狀細胞加以混合培養，而生產樹狀細胞-肽混合物之步驟。此方法亦稱為患者自體免疫細胞療法。 關於患者自體免疫細胞療法，其特徵在於例如：與CTL療法同樣地進行利用來自該患者之肽之CD8＋T細胞之刺激活化，同時亦進行樹狀細胞之肽致敏。藉由將來自該患者之CD8＋細胞與樹狀細胞一併移入患者體內，可期待因賦予有特異性之CTL產生之急性效果與因用作抗原呈現細胞之樹狀細胞產生之持續性效果之協同效果。 患者自體免疫細胞療法例如可用於血液癌(白血病等)、急性骨髓性白血病及近緣前驅細胞腫瘤、淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、T細胞前淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤等血液癌、多發性骨髓瘤、骨髓化生不良症候群等白血病近緣疾病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病等自體免疫疾病、各種感染症患者等，可用於末期癌症患者、難治性自體免疫疾病、嚴重之感染症之患者。 於另一態樣中，本發明提供對受驗者賦予癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法之方法。該方法包括如下步驟：(1)藉由本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統，解析該受驗者之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)多樣性之步驟；(2)基於該解析之結果，確定來自該受驗者之癌細胞之TCR或BCR之步驟，該確定係藉由在來自該受驗者之癌細胞之TCR或BCR基因之存在頻度排序中選擇排名靠前之序列作為該來自癌細胞之TCR或BCR而進行；(3)基於所確定之該來自癌之TCR或BCR而確定HLA檢查肽之候補之胺基酸序列的步驟，該確定係基於使用HLA結合肽預測演算法所算出之得分而進行；(4)合成所確定之肽之步驟；視需要之(5)使用所合成之肽進行治療之步驟。該方法包括製造治療劑之方法及進行治療本身之方法兩者。於排除醫療行為之情形時，進行(5)之前之步驟即可結束。 於較佳之實施形態中，本發明中上述(3)步驟之HLA檢查肽之候補係使用BIMAS、SYFPEITHI、RANKPEP或NetMHC所確定。 所謂BIMAS係www-bimas.cit.nih.gov/所提供之HLA肽鍵之推定程式。 所謂SYFPEITHI係www.syfpeithi.de/所提供之MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容複合體)配體及肽主題之資料庫及檢索引擎。 所謂RANKPEP係http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html所提供之對I類及II類MHC分子之肽鍵之預測程式。 所謂NetMHC係www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/所提供之預測肽對多數之HLA對偶基因之結合的程式服務。 於較佳之實施形態中，作為改良型CTL法，本發明包括：於上述(4)步驟之後，將上述肽、上述來自受驗者之樹狀細胞或抗原呈現細胞、及上述來自受驗者之CD8＋
T細胞加以混合培養之步驟；及將該培養後之混合物投予至患者之步驟。 於較佳之實施形態中，作為DC疫苗療法，本發明包括：於上述(4)步驟之後，將上述肽、及上述來自受驗者之樹狀細胞加以混合培養之步驟；及將該培養之混合物投予至患者之步驟。 於較佳之實施形態中，作為患者自體免疫細胞療法，本發明於上述(4)步驟之後，進行將上述肽、上述來自受驗者之樹狀細胞或抗原呈現細胞、及上述來自受驗者之CD8＋
T細胞加以混合培養，而生產CD8＋
T細胞-樹狀細胞/抗原呈現細胞-肽混合物之步驟，及將上述肽、及上述來自受驗者之樹狀細胞加以混合培養，生產樹狀細胞-肽混合物之步驟，並且包括將該CD8＋
T細胞-樹狀細胞/抗原呈現細胞-肽混合物、及該樹狀細胞-肽混合物投予至患者之步驟。 ＜定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用活體外(in vitro)抗原刺激之癌特異性TCR基因之單離＞ 於另一態樣中，本發明提供定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用活體外(in vitro)抗原刺激之癌特異性TCR基因之單離技術。因此，本發明提供製備利用活體外(in vitro)抗原刺激單離之癌特異性TCR基因的方法，其包括如下步驟：(A)將來自受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、或來自該受驗者之淋巴細胞、或本發明之「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」中所確定之肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟；(B)藉由本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統而解析該腫瘤特異性T細胞之TCR之步驟；及(C)基於該解析之結果而單離所需之腫瘤特異性T細胞之步驟。此種利用活體外(in vitro)抗原刺激單離之癌特異性TCR基因之製備只要可獲得基因資訊，則可使用該領域所周知之任意方法而實施。使用此種單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因，可用於各種癌症之治療及預防。 具體而言，此種單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因於臨床上可使用如下之順序實施。 於一實施形態中，可藉由如下方式實施，例如可藉由如下操作實現使用單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因之治療：(1)從癌症患者摘取腫瘤細胞。(2)將該來自患者之腫瘤細胞破碎後，分離為單一細胞，藉由絲裂黴素C等之化學處理或放射線照射進行不活化處理。(3)從該癌症患者之全血中分離末梢血細胞。(4)以末梢血細胞之一部分作為未處理對照試樣，從細胞提取RNA。(5)藉由將不活化腫瘤細胞與末梢血細胞進行混合、培養而使腫瘤特異性T細胞活化、增殖。(6)活化後，回收末梢血細胞，製成刺激後試樣，並從細胞提取RNA。(7)由(4)及(6)中所提取之RNA試樣實施本發明之多樣性解析法。(8)提取與對照試樣相比刺激試樣中大幅度地增加之TCR基因，將該等加以排序後，選擇排名靠前之TCRα及TCRβ基因。(9)選殖該等全長TCRα及TCRβ基因，並導入至基因表現用反轉錄病毒載體中。(10)由該等TCRα及TCRβ基因表現反轉錄病毒載體而製造基因導入用病毒。(11)藉由單獨以TCRα、TCRβ相繼感染從該患者採集之淋巴細胞而進行轉形，或藉由製造含有TCRα及TCRβ兩基因之基因表現反轉錄病毒載體而一次性將兩基因轉形。(12)確認細胞表面之TCRα/TCRβ異型二聚物之表現。(13)將表現目標TCRα/TCRβ之腫瘤特異性患者淋巴細胞移植入患者體內。 具體而言，於本發明之實施形態中，例如於血液腫瘤之情形時，可使用藉由「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」所記載之方法所確定之TCR或BCR作為抗原或肽。此處，假定任意之癌抗原或來自患者之不活化癌組織，代表性而言可藉由以下之方法，提供如下方法：將任意之抗原蛋白質或任意之抗原肽、T淋巴細胞及抗原呈現細胞混合之方法；將來自受驗者之淋巴細胞及來自受驗者之不活化癌細胞加以混合之方法；將來自藉由「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」中所提供之多樣性解析所確定之TCR或BCR之肽、T淋巴細胞及抗原呈現細胞加以混合之方法。 因此，於一實施形態中，本發明中之(A)步驟包括將來自受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 於進一步之實施形態中，本發明中之(A)步驟係將來自上述受驗者之淋巴細胞、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 於進一步之實施形態中，本發明中之(A)步驟係將「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」中所確定之肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 使用此種單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因的治療可用於例如腎上腺皮質癌、肛門癌、膽道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏腫瘤、膽囊癌、霍奇金病、下咽癌、喉頭癌、唇癌及口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌等廣泛之癌患者等，但不限定於該等。 於又一態樣中，本發明提供定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離。因此，本發明提供製備利用共通序列檢索單離之癌特異性TCR基因之方法，其包括如下步驟：(A)提供從具有共通之HLA之受驗體單離之淋巴細胞或癌組織之步驟；(B)對於該淋巴細胞或癌組織，藉由本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統而解析該腫瘤特異性T細胞之TCR之步驟；及(C)將具有與腫瘤特異性T細胞共通之序列之T細胞進行單離之步驟。此種利用共通序列檢索單離之癌特異性TCR基因之製備只要可獲得基因資訊，即可使用該領域所周知之任意之方法而實施。藉由此種定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離所獲得之基因可用於各種癌之治療及預防。該方法亦稱為「本發明之定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離方法」。 具體而言，藉由此種定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離所獲得之基因於臨床上可使用如下之順序實施。於一實施形態中，首先可(1)從HLA相同之癌症患者摘取腫瘤細胞或分離末梢血。(2)使用含有腫瘤細胞浸潤T細胞之腫瘤組織、或淋巴細胞細胞進行多樣性解析。(3)於各試樣中基於其存在頻度進行排序，選擇與末梢血細胞相比腫瘤細胞表現出較高之存在頻度之腫瘤特異性T細胞。(4)對於該等腫瘤特異性T細胞，檢索複數之HLA一致癌症患者所共通之序列。(5)選擇最多之癌患者所共通之腫瘤特異性TCR基因作為治療用腫瘤特異性TCR。(6)選殖該等全長TCRα及TCRβ基因，並導入至基因表現用反轉錄病毒載體中。(7)由該等TCRα及TCRβ基因表現反轉錄病毒載體而製造基因導入用病毒。(8)藉由單獨以TCRα、TCRβ相繼感染從該患者採集之淋巴細胞而進行轉形，或藉由製造含有TCRα及TCRβ兩基因之基因表現反轉錄病毒載體而一次性地將兩基因轉形。(9)確認細胞表面之TCRα/TCRβ異型二聚物之表現。(10)將表現目標TCRα/TCRβ之腫瘤特異性患者淋巴細胞移植入患者體內，藉此實現使用藉由定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離所獲得之基因的治療。 使用藉由此種定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離所獲得之基因的治療，可用於例如腎上腺皮質癌、肛門癌、膽道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏腫瘤、膽囊癌、霍奇金病、下咽癌、喉頭癌、唇癌及口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌等廣泛之癌患者等，但不限定於該等。 因此，於另一態樣中，本發明提供利用活體外(in vitro)抗原刺激之癌特異性TCR基因之單離方法，其包括如下步驟：(A)將來自受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、或來自該受驗者之淋巴細胞、或癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法中所確定之肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟；(B)藉由本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統而解析該腫瘤特異性T細胞之TCR之步驟；及(C)基於該解析之結果而單離所需之腫瘤特異性T細胞之步驟。此種利用活體外(in vitro)抗原刺激單離之癌特異性TCR基因之製備只要可獲得基因資訊，則可使用該領域所周知之任意之方法而實施。使用此種單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因，可用於各種癌症之治療及預防。 因此，於該利用活體外(in vitro)抗原刺激之癌特異性TCR基因的單離方法之一實施形態中，本發明中之(A)步驟包括將來自受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 於進一步之實施形態中，本發明中之(A)步驟係將來自上述受驗者之淋巴細胞、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 於進一步之實施形態中，本發明中之(A)步驟係將「癌遺傳型肽致敏免疫細胞療法」中所確定之肽、來自該受驗者之不活化癌細胞、及來自該受驗者之T淋巴細胞加以混合培養，而生產腫瘤特異性T細胞之步驟。 於又一態樣中，本發明提供定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離技術，並且提供利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離方法，該方法包括如下步驟：(A)從具有共通之HLA之受驗體單離淋巴細胞或癌組織之步驟；(B)對於該淋巴細胞或癌組織，藉由本發明之多樣性解析法而解析該腫瘤特異性T細胞之TCR之步驟；及(C)將具有與腫瘤特異性T細胞共通之序列之T細胞進行單離之步驟。使用此種單離之定製癌特異性T細胞受體基因及癌特異性TCR基因，可用於各種癌症之治療及預防。 ＜細胞加工療法＞ 於又一態樣中，本發明提供一種細胞加工療法。詳細而言，本發明提供製備用於細胞加工療法之導入有該腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞的方法，其包括如下步驟：A)提供從患者採集之T淋巴細胞之步驟；B)對該T淋巴細胞進行抗原刺激後，基於本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統而解析TCR之步驟，該抗原刺激係利用來自上述受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、來自該受驗者之不活性化癌細胞、或來自腫瘤之遺傳型肽而進行；C)於經解析之該TCR中選擇最佳抗原及最佳TCR之步驟；及D)生產該最佳TCR之TCR基因之腫瘤特異性α及βTCR表現病毒載體之步驟。使用導入有該腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞之細胞加工療法可用於各種癌之治療及預防。 具體而言，使用此種導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞之細胞加工療法臨床方面可使用如以下之順序實施。例如可藉由＜定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用活體外(in vitro)抗原刺激之癌特異性TCR基因之單離＞或＜定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離＞所記載之方法，使用腫瘤特異性TCR基因而導入淋巴細胞。 因此，於本發明之細胞加工療法中，藉由製造或合成而生產作為抗原之任意之癌抗原或癌肽，可利用所採集之不活性化患者癌細胞，或可利用來自腫瘤之遺傳型肽。作為選擇方法，可選擇癌組織中高度表現之抗原，或選擇與患者HLA型結合之肽作為抗原。 於較佳之實施形態中，於本發明之細胞加工療法中，作為最佳抗原，可假定選擇如下抗原，但不限定於該等，例如：(1)於患者癌組織中高度表現之抗原、(2)抗原特異性淋巴細胞刺激試驗中最強地活化T細胞之抗原、(3)根據抗原刺激前後之多樣性解析使特定之TCR之頻度最大程度地增加之抗原。又，亦可假定在(3)根據抗原刺激前後之多樣性解析使特定之TCR之頻度最大程度地增加之例中選擇最大程度地增加之TCR作為最佳TCR之方法等。又，作為代表性之例，可將最佳TCR候補人工地基因導入至患者淋巴細胞中，選擇於實際之患者癌組織中顯示出最高反應性者作為最佳TCR。 使用此種導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞之細胞加工療法可用於例如腎上腺皮質癌、肛門癌、膽道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、大腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤因氏腫瘤、膽囊癌、霍奇金病、下咽癌、喉頭癌、唇癌及口腔癌、肝癌、非小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌等廣泛之癌患者等，但不限定於該等。 因此，於一實施形態中，本發明之方法之抗原刺激係利用來自上述受驗者之抗原蛋白質或抗原肽而進行。 於另一實施形態中，本發明之之抗原刺激係利用來自上述受驗者之不活性化癌細胞而進行。 於另一實施形態中，本發明之方法之抗原刺激係利用上述來自腫瘤之遺傳型肽而進行。 於另一實施形態中，本發明之方法之C)步驟包括選擇在上述受驗體之癌組織中高度表現之抗原。 於另一實施形態中，本發明之方法之C)步驟包括選擇在抗原特異性淋巴細胞刺激試驗中最強地活化T細胞之抗原。 於另一實施形態中，本發明之方法之C)步驟包括根據在抗原刺激前後基於本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統所進行之多樣性解析，而選擇使特定之TCR之頻度最大程度地增加之抗原。 於一特定之實施形態中，本發明提供使用藉由「本發明之定製癌特異性T細胞受體基因之單離、利用共通序列檢索之癌特異性TCR基因之單離方法」所單離之癌特異性TCR基因，於活體外進行刺激試驗，並進行有效性及/或安全性評價之方法。 關於有效性，例如可將導入有癌特異性TCR基因之T細胞與已進行利用來自受驗者之抗原蛋白質或抗原肽之抗原刺激的來自該受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、如已進行利用來自受驗者之不活性化癌細胞之抗原刺激的來自該受驗者之不活性化癌細胞、或者已利用來自腫瘤之遺傳型肽進行抗原刺激的來自腫瘤之遺傳型肽進行培養後，測定對應於T細胞之活化而分泌至細胞外之細胞激素(干擾素γ鏈等)量，測定對應於T細胞之活化而上升之特定基因之表現量，或測定對應於T細胞之活化而表現或表現增加之細胞表面分子，藉此評價有效性。 ＜安全性＞例如，於將導入有癌特異性TCR基因之來自上述受驗者之T細胞與來自該受驗者之正常細胞加以混合之情形時，測定對應於上述T細胞之活化所分泌之細胞激素、基因表現、或細胞表面分子之表現，確認該TCR基因導入T細胞未被正常細胞所活化，藉此可評價安全性。 於一實施形態中，有效性及/或安全性評價之具體步驟可藉由如下方式實現。即，例如，(1)使用逆轉錄病毒基因表現系製造腫瘤特異性TCRα及TCRβ基因導入T淋巴細胞細胞。(2)於評價有效性之情形時，將來自患者之癌細胞摘取、分離，進行永生化處理後，與導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞進行混合培養。(3)使用上述培養細胞，進行細胞增殖試驗(胸苷摻入試驗、MTT試驗或IL-2產生試驗等)，藉此可對針對腫瘤細胞之反應性進行定量評價，而選擇更強烈地與腫瘤細胞反應之TCR基因。(4)於評價安全性之情形時，使用成為對照之現有細胞株、不含患者癌細胞之正常組織(於摘取腫瘤之過程中採集之正常組織之一部分)、或實體腫瘤之情形時使用患者末梢血細胞進行永生化處理後，與導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞進行混合培養。(5)使用上述培養細胞，進行細胞增殖試驗(胸苷摻入試驗、MTT試驗或IL-2產生試驗等)，藉此可對針對腫瘤細胞之反應性進行定量評價，而選擇對正常細胞不顯示反應性之TCR基因。 因此，於另一態樣中，本發明提供包含如下步驟之細胞加工療法：A)從患者採集T淋巴細胞之步驟；B)對該T淋巴細胞進行抗原刺激後，基於本發明之多樣性解析法或本發明之多樣性解析系統而解析TCR之步驟，該抗原刺激係利用來自上述受驗者之抗原蛋白質或抗原肽、來自該受驗者之不活性化癌細胞、或來自腫瘤之遺傳型肽而進行；C)於經解析之該TCR中選擇最佳抗原及最佳TCR之步驟；D)生產該最佳TCR之TCR基因之腫瘤特異性α及βTCR表現病毒載體之步驟；E)將導入有該腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞導入至該患者之步驟。 實施將所獲得之導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞導入至該患者體內之步驟的方法包括以下步驟：A)製造導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞之步驟；B)確認腫瘤特異性TCRα及TCRβ之表現之步驟；C)從靜脈點滴移入導入有腫瘤特異性TCR基因之T淋巴細胞的步驟。 因此，於一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之抗原刺激係利用來自上述受驗者之抗原蛋白質或抗原肽而進行。 於另一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之抗原刺激係利用來自上述受驗者之不活性化癌細胞而進行。 於另一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之抗原刺激係利用上述來自腫瘤之遺傳型肽而進行。 於另一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之C)步驟包括選擇在上述受驗體之癌組織中高度表現之抗原。 於另一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之C)步驟包括選擇在抗原特異性淋巴細胞刺激試驗中最強地活化T細胞之抗原。 於另一實施形態中，本發明之細胞加工療法中之C)步驟包括根據在抗原刺激前後基於本發明之多樣性解析法所進行之多樣性解析，而選擇使特定之TCR之頻度最大程度地增加之抗原。 ＜利用BCR多樣性解析之人型抗體之單離＞ 作為一實施形態，可使用本發明之多樣性解析法進行BCR基因多樣性解析，藉由以下所記載之方法迅速地獲得對靶抗原具有特異性之人型抗體。 (A)利用成為靶之抗原蛋白或抗原肽對小鼠進行免疫，從該小鼠分離含有產生抗體之B細胞之細胞群(例如脾臟、淋巴結、末梢血細胞)，藉由利用本發明之多樣性解析法之BCR多樣性解析對免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因進行解析之方法 (A1)如A之方法，其中所免疫之小鼠係可於維持抗體多樣性之狀態下產生完全人型抗體之KM小鼠 (A2)如A之方法，其中所免疫之小鼠係對使NOD/scid小鼠與IL-2受體γ鏈剔除小鼠交配而製作之呈現出重度之複合型免疫缺乏之NOG(NOD/Shi-scid，IL-2Rγ null)小鼠移植人類幹細胞而製作之人源化小鼠 (B)將對照小鼠與免疫小鼠、或由來自抗原免疫前與抗原免疫後之小鼠之試樣所獲得之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因序列與其頻度加以比較 (C)鑑定出在免疫小鼠體內強烈地表現、或免疫後表現增加之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因 (D)選擇從C之步驟中選出之免疫球蛋白重鏈與輕鏈基因，一併插入至1種抗體表現用載體中，或分別插入至各別之2種抗體表現用載體中之方法 (E)將D之步驟中所製作之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因表現載體導入至CHO(Chinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢)等之真核細胞中，進行細胞培養 (F)將由基因重組細胞產生、分泌之抗體分子分離、精製，並驗證對靶抗體蛋白或肽之特異性 上述方法係藉由上述A～F之步驟，於獲得來自動物之抗體基因後無需改型為與人型抗體之嵌合型抗體或人源化抗體，而直接且迅速地獲得抗原特異性人型抗體的方法，其可用於含有人型抗體之抗體醫藥品之開發與製造。 關於該實施形態所使用之KM小鼠，可參照Ishida I、Tomizuka K、Yoshida H、Tahara T、Takahashi N、Ohguma A、Tanaka S、Umehashi M、Maeda H、Nozaki C、Halk E、Lonberg N. Production of human monoclonal and polyclonal antibodies in TransChromo animals. Cloning Stem Cells. 2002;4(1):91-102. Review.，關於NOG小鼠，可參照Ito M、Hiramatsu H、Kobayashi K、Suzue K、Kawahata M、Hioki K、Ueyama Y、Koyanagi Y、Sugamura K、Tsuji K、Heike T、Nakahata T. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 2002 Nov 1;100(9):3175-82.，關於CHO細胞/抗體產生，可參照Jayapal KP、Wlaschin KF、Hu W-S、Yap MGS、Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chem Eng Prog. 2007;103:40?47.；Chusainow J、Yang YS、Yeo JH、Toh PC、Asvadi P、Wong NS、Yap MG. A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines: what makes a stable high producer? Biotechnol Bioeng. 2009 Mar 1;102(4):1182-96。 ＜利用BCR多樣性解析之人型抗體之單離＞ 作為一實施形態，可利用該BCR基因多樣性解析法，藉由以下所記載之方法迅速地獲得對靶抗原具有特異性之人型抗體。 (A)利用成為靶之抗原蛋白或抗原肽對小鼠進行免疫，從該小鼠分離含有產生抗體之B細胞之細胞群(例如脾臟、淋巴結、末梢血細胞)，藉由BCR多樣性解析法對免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因進行解析之方法 (A1)如A之方法，其中所免疫之小鼠係可於維持抗體多樣性之狀態下產生完全人型抗體之KM小鼠 (A2)如A之方法，其中所免疫之小鼠係對使NOD/scid小鼠與IL-2受體γ鏈剔除小鼠交配而製作之呈現重度之複合型免疫缺乏之NOG(NOD/Shi-scid，IL-2Rγ null)小鼠移植人類幹細胞而製作之人源化小鼠 (B)將對照小鼠與免疫小鼠、或由來自抗原免疫前與抗原免疫後之小鼠之試樣獲得之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因序列與其頻度加以比較 (C)鑑定出在免疫小鼠體內強烈地表現、或免疫後表現增加之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因 (D)選擇從C之步驟中選出之免疫球蛋白重鏈與輕鏈基因，一併插入至1種抗體表現用載體中，或分別插入至各別之2種抗體表現用載體中之方法 (E)將D之步驟中所製作之免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因表現載體導入至CHO(Chinese Hamster Ovary)等之真核細胞中，進行細胞培養 (F)將由基因重組細胞產生、分泌之抗體分子分離、精製，並驗證對靶抗體蛋白或肽之特異性 上述方法係藉由上述A～F之步驟，於獲得來自動物之抗體基因後無需改型為與人型抗體之嵌合型抗體或人源化抗體，而直接且迅速地獲得抗原特異性人型抗體的方法，其可用於含有人型抗體之抗體醫藥品之開發與製造。 作為該等方法之實施形態，可列舉以下。作為其一例， 1.利用作為實驗性自體免疫性腦脊髓炎之抗原肽的髓鞘寡樹突膠細胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein)(MOG35-55，MOG)對KM小鼠進行免疫。將等量之2 mg/mL之MOG肽與完全弗氏佐劑加以混合，製成乳液，利用200 μg之MOG對皮下進行免疫，同時利用400 ng之百日咳毒素對腹腔進行免疫。利用對PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝鹽水)與完全弗氏佐劑進行免疫，設為對照小鼠。 2.於初次免疫後第2天利用400 ng之百日咳毒素進行免疫，於免疫後第10天確認發病後，從腦脊髓炎發病小鼠摘取脾臟。 3.使用發病小鼠與對照小鼠之脾臟，實施下一代BCR多樣性解析。對於IgG免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，對各BCR序列之出現頻度進行合計與排序。 4.提取與對照小鼠相比，發病小鼠體內出現頻度大幅度地增加之BCR序列並進行排序。對於藉由該等抗體投予所誘導之BCR序列之排名靠前之組合，作為MOG特異性抗體基因進行鑑定。 5.藉由PCR-cloning法由從發病小鼠擴增之BCR基因擴增產物選殖全長人類免疫球蛋白序列。於抗體表現用載體中分別選殖IgG免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈。有如下方法：合併插入至1種抗體表現用載體中，或者分別插入至各別之2種抗體表現用載體中。 6.於該等形成之表現載體中，使用脂染胺3000(Life Science)將CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞轉形，並導入IgG免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈。 7.回收CHO細胞培養液，藉由利用ProteinA親和管柱所進行之精製、利用凝膠過濾所進行之濃縮，而回收所分泌之抗體蛋白。 8.藉由使用所回收之抗體之ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析)分析，測定對MOG35-55或MOG蛋白之結合活性，驗證抗體之特異性。 9.若獲得充分之特異性，則獲得抗體表現穩定表現細胞株，利用大規模培養系統而製造人類型抗MOG抗體。 包括本說明書中所列舉之科學文獻、專利公報、專利申請案公報等參考文獻在內之全部刊物中所記載之內容係藉由本說明書中之引用，而以與明確揭示其全部內容相同程度地併入本說明書中。 以上，為了容易理解本發明而例示較佳之實施形態進行說明。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述之說明及以下之實施例僅為了例示而提供，並非以限定本發明之目的而提供。因此，本發明之範圍並不限定於本說明書所具體地記載之實施形態或實施例，僅由申請專利之範圍所限定。 以下，列舉實施例，進一步對本發明進行詳細說明，但本發明不受下述實施例等之任何制約。 [實施例] 使用以下之試劑。 [表1]
所使用之寡核苷酸之序列如下所述。 阻斷引子(Block primer)：GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA TCTC(序列編號1) RT引子(RT primer)：AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTT TGCAA(序列編號2) 模板置換寡聚物(Template switch Oligo)(3'之3個鹼基為RNA)：AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG(序列編號3) 阻斷引子(Block primer)及RT引子(RT primer)係對小鼠TCRβ鏈之恆定區具有特異性之反置引子。以全序列與TCRβmRNA雜交之方式進行設計。RT引子(RT primer)係於3'側將4個鹼基設計為巢狀(nested)。又，RT引子(RT primer)係將5'側伸長8個鹼基，而提高親和性(affinity)。藉由使用該等引子進行逆轉錄模板置換PCR，可將編碼TCRβ鏈之mRNA之恆定區至5'末端為止進行擴增。所擴增之區域包括包含抗原識別部位之再構成之VDJ或非轉譯區等。因此，藉由以從T細胞群採集之總RNA(total RNA)作為模板，使用該等引子進行逆轉錄模板置換PCR，可構建TCRβ鏈之抗原識別部位或非轉譯區等之cDNA基因庫。又，若直接使用利用細胞分選儀等所分選之單細胞之T細胞作為模板(細胞內之RNA成為模板)，則可將各細胞之TCRβ鏈之抗原識別部位進行特異性擴增，而確定該序列。 於本試驗中，以單步驟進行逆轉錄模板置換PCR。典型而言，使用以下之表之組成的反應混合液。 [表2]
典型而言使用以下之熱循環條件。 [表3]
﹡﹡變溫速率(Ramp Rate)6℃/s 再者，反應混合液之組成及熱循環條件之一部分係根據試驗內容而適當變更。 [試驗例1] 於以下之總RNA(Total RNA)濃度、阻斷引子濃度、及RT引子濃度之條件下，進行單步驟逆轉錄模板置換PCR。 [表4]
將結果示於圖1。於不使用阻斷引子時，檢測出大量非特異性之條帶(泳道1)，藉由添加阻斷引子，非特異性之條帶消失(泳道2～11)。於0.04 μM～0.00016 μM之RT引子濃度下，觀察到TCRβ鏈之特異性擴增。於相對較高之RT引子濃度(0.4 μM等)下，可見次要之非特異性條帶，藉由降低RT引子濃度，成功地抑制了該情況。 [試驗例2] 於以下之細胞數、阻斷引子濃度、及RT引子濃度之條件下，進行單步驟逆轉錄模板置換PCR。PCR之循環數設為48。 [表5]
將結果示於圖2。於任一條件下均觀察到TCRβ鏈之特異性擴增。即使不添加RT引子，亦觀察到TCRβ鏈之特異性擴增(泳道3)。又，將細胞數設為10個，將上述阻斷引子變更為CleanAmpTM
Turbo Primers(TriLink公司)，與上文所述之條件同樣地進行單步驟逆轉錄模板置換PCR，其結果為，同樣地觀察到TCRβ鏈之特異性擴增。 [試驗例3] 直接以單步驟於單細胞之小鼠T細胞中添加反應溶液，直接進行單步驟逆轉錄模板置換PCR。PCR之循環數設為56。 將結果示於圖3。可見僅TCRβ鏈之全長經擴增之細胞、以及TCRβ鏈之全長及片段經擴增之細胞。又，儘管循環數多達56次，但未見非特異性擴增。 [試驗例4] 將PCR擴增之循環數進行各種變動(循環數：38、40、42及44)。阻斷引子(Block primer)濃度設為0.4 μM，RT引子(RT primer)濃度設為0.002 nM。 將結果示於圖4(泳道1：38、泳道2：40、泳道3：42、泳道4：44)。於44次循環下，觀察到TCRβ鏈之特異性條帶。 [試驗例5] 於以下之總RNA(Total RNA)濃度、阻斷引子濃度、及RT引子濃度之條件下進行單步驟逆轉錄模板置換PCR。PCR之循環數設為42次。 [表6]
將結果示於圖5。於不使用阻斷引子時，檢測出拖尾狀之大量非特異性之條帶(泳道1)，藉由添加阻斷引子，非特異性之條帶消失(泳道2～10)。於相對較高之RT引子濃度(0.2 μM)下，殘存有次要之非特異性條帶，藉由降低RT引子濃度，成功地抑制了該情況。即使不添加RT引子，亦觀察到TCRβ鏈之特異性擴增(泳道10)。 [試驗例6] 藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR多樣性解析法進行來自過度表現特定之TCRα鏈及TCRβ鏈之基因改型小鼠(Pmel-1小鼠)之淋巴細胞細胞的多樣性解析。 試劑之清單 -PrimeScript II高準度單步驟RT-PCR套組(R026A，TAKARA BIO) -40 U/μL RNasin Plus RNase抑制劑(N2611，Promega) -40 U/μL Cloned RNase抑制劑(Ambion，AM2682) -20 U/μL SUPERaseIn RNase抑制劑(Ambion，AM2694) -200 U/μL SuperScript IV逆轉錄酶(18090010，Invitrogen) -2×KAPA HiFi熱啟動預混液(Hot Start Ready Mix)(KK2602，NIPPON Genetics) -AmpureXP Agencourt(A63880,BECKMAN COULTER) -Qubit dsDNA HS分析套組(Q32854，Thermo Fisher Scientific) 所使用之寡核苷酸序列 -RT引子(RT primer)(30個鹼基)：ACACGAGGGTAGCCTTTT GTTTGTTTGCAA(序列編號4) -阻斷引子(Block primer)(30個鹼基)：GAGGGTAGCCTTTTGTTT GTTTGCAATCTC(序列編號5) -TS-Oligo(30個鹼基)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT [G][G](G)※(序列編號6) ※從[]之右端起第2、3個之2個鹼基為RNA，()之右端之1個鹼基為LNA -前置標籤引子v1(Forward Tag primer v1)(63個鹼基)：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG(下劃線部分為標籤序列部位)(序列編號7) -反置標籤引子v1(Reverse Tag primer v1)(63個鹼基)：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC(下劃線部分為標籤序列部位)(序列編號8) -索引引子(Index primer)：選自Nextera XT Index Kit v2 Set A(Illumina)之N7系列12種(序列編號9～20)、S5系列8種(序列編號21～28)。 N7系列之引子中之索引序列如下所述。 TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715) S5系列之引子中之索引序列如下所述。 CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。 於本試驗中，使用N715-S505與N715-S506之索引之組合。 (1)RNA製備 於本試驗中，從來自過度表現特定之TCRα鏈及TCRβ鏈的基因改型小鼠(Pmel-1小鼠)之淋巴細胞細胞中提取總RNA(Total RNA)。 (2)單步驟逆轉錄模板置換PCR 使用所提取之總RNA(Total RNA)，於以下之反應組成液中連續實施加熱反應-PCR循環。首先進行45℃、30分鐘之逆轉錄反應，其次進行95℃、5分鐘之阻斷引子活化反應，繼而進行98℃、10秒及60℃、6秒之2步驟PCR反應(44循環)，最後進行60℃、5分鐘之最終伸長反應，藉此結束單步驟逆轉錄模板置換PCR反應。 [表7] 表7 單步驟逆轉錄模板置換PCR反應液組成
・加熱反應-PCR循環 45℃、30分鐘(逆轉錄反應) ↓ 95℃、5分鐘(阻斷引子活化) ↓ 98℃、10秒 60℃、6秒 44次循環(PCR反應) ↓ 60℃、5分鐘(最終伸長反應) ↓ 4℃ 儲備 (3)標籤PCR 於以下之反應組成液中，為了附加Miseq定序運行之標籤序列，使用於前置引子、及反置引子之5'末端分別附加有34個鹼基、33個鹼基之標籤序列之DNA引子對(Forward Tag primer v1與Reverse Tag primer v1之對)，進行95℃3分鐘、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分鐘之3步驟PCR反應(20次循環，最終循環後有72℃2分鐘之最終伸長反應)，藉此製備附加有標籤之TCR cDNA擴增子。標籤序列係進行利用Miseq之定序所需之序列，從標籤序列起開始定序。又，標籤序列亦作為附加索引序列之索引PCR之引發位點而發揮功能。 [表8] 表8 標籤PCR反應液組成
・PCR循環 95℃、3分鐘 ↓ 98℃、20秒 65℃、30秒 20次循環 72℃、2分鐘 ↓ 72℃、2分鐘 ↓ 12℃ 儲備 (4)索引PCR 於以下之反應組成液中，進行用以附加Miseq定序運行後之樣品分配用Index序列、及於最5'末端側附加用以固定於作為解析基板之流槽之序列(用於橋式PCR之序列)的PCR反應。反應係95℃3分鐘後進行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒之3步驟PCR反應(13次循環，最終循環後有72℃5分鐘之最終伸長反應)，藉此製備定序運行用之DNA樣品。 [表9] 表9
・PCR循環 95℃、3分鐘 ↓ 98℃、20秒 65℃、30秒 13次循環 72℃、2分鐘 ↓ 72℃、2分鐘 ↓ 4℃ 儲備 (5)索引PCR反應液之電泳確認 將索引PCR反應液3 μl於1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30分鐘，確認到於至此為止之實驗步驟中擴增了TCRDNA擴增子(圖6)。 (6)DNA片段之精製、濃度測定與濃度測定 分取反應液10 μl，添加AmpureXP Agencourt珠粒液8 μl，依照製造商之操作流程進行DNA向珠粒之結合反應、珠粒洗淨操作後，回收精製DNA並置於25 μl之純水中。測定利用Qubit dsDNA HS分析套組所精製之DNA之濃度。 (7)Miseq運行之實施 將精製DNA樣品稀釋為4 nM後，依照Illumina公司Miseq定序儀之標準操作流程進行定序運行。 (8)多樣性資料解析 藉由Repertoire Genesis軟體解析Fastq格式之定序資料。獲得樣品中之V基因及J基因使用頻度圖(圖7)、及V-J使用頻度圖(圖8)。又，將包含CDR3序列(序列編號29～33)之唯一前導排序之合計示於表10。 [表10] 表10(包含CDR3序列之唯一前導排序之合計)
[試驗例7] 使用C57BL/6小鼠脾臟組織檢體進行單步驟RT-TS-PCR多樣性解析。 藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR多樣性解析法進行脾臟之多樣性解析。供於實驗之檢體係使用C57BL/6小鼠脾臟組織檢體、以及來自抗CD3抗體與抗CD28抗體刺激後48小時所回收之Pmel-1小鼠之淋巴細胞細胞之2種。 試劑之清單 -PrimeScript II高準度單步驟RT-PCR套組(R026A，TAKARA BIO) -40 U/μL RNasin Plus RNase抑制劑(N2611，Promega) -40 U/μL Cloned RNase抑制劑(Ambion，AM2682) -20 U/μL SUPERaseIn RNase抑制劑(Ambion，AM2694) -200 U/μL SuperScript IV逆轉錄酶(18090010，Invitrogen) -2×KAPA HiFi熱啟動預混液(Hot Start Ready Mix)(KK2602，NIPPON Genetics) -AmpureXP Agencourt(A63880，BECKMAN COULTER) -Qubit dsDNA HS分析套組(Q32854，Thermo Fisher Scientific) 所使用之寡核苷酸序列 -RT引子(RT primer)(30個鹼基)：ACACGAGGGTAGCCTTTT GTTTGTTTGCAA(序列編號4) -阻斷引子(Block primer)(30個鹼基)：GAGGGTAGCCTTTTGTTT GTTTGCAATCTC(序列編號5) -TS-Oligo(30個鹼基)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT [G][G](G)※(序列編號6) ※從[]之右端起第2、3個之2個鹼基為RNA，()之右端之1個鹼基為LNA -前置標籤引子v1(Forward Tag primer v1)(63個鹼基)：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG(下劃線部分為標籤序列部位)(序列編號7) -反置標籤引子v1(Reverse Tag primer v1)(63個鹼基)：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC(下劃線部分為標籤序列部位)(序列編號8) -索引引子(Index primer)：選自Nextera XT Index Kit v2 Set A(Illumina)之N7系列12種(序列編號9～20)、S5系列8種(序列編號21～28)。 N7系列之引子中之索引序列如下所述。 TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715) S5系列之引子中之索引序列如下所述。 CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。 於本試驗中，使用N715-S502、S503、S505、S506、S507、S508、S510或S511之索引之組合。 實驗順序 (1)RNA製備 於本試驗中，為了進行TCRβ多樣性解析，而從脾臟組織及淋巴細胞細胞中提取RNA。 (2)單步驟逆轉錄模板置換PCR 使用所提取之RNA，於以下之反應組成液中連續實施加熱反應-PCR循環。首先進行45℃、30分鐘之逆轉錄反應，其次進行95℃、5分鐘之阻斷引子活化反應，繼而進行98℃、10秒及60℃、6秒之2步驟PCR反應(44循環)，最後進行60℃、5分鐘之最終伸長反應，藉此結束單步驟逆轉錄模板置換PCR反應。 [表11] 表11 單步驟逆轉錄模板置換PCR反應液組成
・加熱反應-PCR循環 45℃、30分鐘(逆轉錄反應) ↓ 95℃、5分鐘(阻斷引子活化) ↓ 98℃、10秒 60℃、6秒 44次循環(PCR反應) ↓ 60℃、5分鐘(最終伸長反應) ↓ 4℃ 儲備 (3)標籤PCR 於以下之反應組成液中，為了附加Miseq定序運行之標籤序列，使用於前置引子、及反置引子之5'末端分別附加有34個鹼基、33個鹼基之標籤序列之DNA引子對(Forward Tag primer v1與Reverse Tag primer v1之對)，進行95℃3分鐘、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分鐘之3步驟PCR反應(20次循環，最終循環後有72℃2分鐘之最終伸長反應)，藉此製備附加有標籤之TCR cDNA擴增子。標籤序列係進行利用Miseq之定序所需之序列，從標籤序列起開始定序。又，標籤序列亦作為附加索引序列之索引PCR之引發位點而發揮功能。 [表12] 表12 標籤PCR反應液組成
・PCR循環 95℃、3分鐘 ↓ 98℃、20秒 65℃、30秒 20次循環 72℃、2分鐘 ↓ 72℃、2分鐘 ↓ 12℃ 儲備 (4)索引PCR 於以下之反應組成液中，進行用以附加Miseq定序運行後之樣品分配用Index序列、及於最5'末端側附加用以固定於作為解析基板之流槽之序列(用於橋式PCR之序列)的PCR反應。反應係95℃3分鐘後進行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒之3步驟PCR反應(13次循環，最終循環後有72℃5分鐘之最終伸長反應)，藉此製備定序運行用之DNA樣品。 [表13] 表13
・PCR循環 95℃、3分鐘 ↓ 98℃、20秒 65℃、30秒 13次循環 72℃、2分鐘 ↓ 72℃、2分鐘 ↓ 4℃ 儲備 (5)索引PCR反應液之電泳確認 將索引PCR反應液3 μl於1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30分鐘，確認到於至此為止之實驗步驟中擴增了TCRDNA擴增子(圖9)。圖9中之泳道自左起依序表示1：標記DNA、2～6：小鼠脾臟組織(1000 ng、200 ng、40 ng、8 ng、1.6 ng)、7～8：來自Pmel-1之淋巴細胞(8 ng、1.6 ng)、9：空白對照。 (6)DNA片段之精製、濃度測定與濃度測定 分取反應液10 μl，添加AmpureXP Agencourt珠粒液8 μl，依照製造商之操作流程進行DNA向珠粒之結合反應、珠粒洗淨操作後，回收精製DNA置於25 μl之純水中。測定利用Qubit dsDNA HS分析套組所精製之DNA之濃度。 (7)Miseq運行之實施 將精製DNA樣品稀釋為4 nM後，依照Illumina公司Miseq定序儀之標準操作流程進行定序運行。 (8)多樣性資料解析 藉由Repertoire Genesis軟體解析脾臟組織檢體中獲得之Fastq格式之定序資料。獲得樣品中之V基因及J基因使用頻度圖(圖10)、及V-J使用頻度圖(圖11)。又，將包含CDR3序列(序列編號34～38)之唯一前導排序之合計示於表14。 [表14] 表14 (包含CDR3序列之唯一前導排序之合計)
上文強調較佳之態樣對本發明進行了說明，但從業者明瞭可將較佳之態樣加以改變。本發明意在表面可藉由本說明書所詳細記載之方法以外之方法而實施本發明。因此，本發明包括隨附之「申請專利範圍」之精神及範圍內所包含之全部變更。 藉由將包括此處所述之專利及專利申請案說明書在內之全部刊物所記載之內容引用至本文中，而以與明確揭示該等全部內容相同程度地併入至本說明書中。本發明對2016年6月23日提出申請之日本專利申請特願2016-125007號主張優先權，並將其內容以與明確揭示其全部內容相同程度地併入至本說明書中。 [產業上之可利用性] 根據本發明，可期待以較高之特異性且以單步驟實施逆轉錄模板置換PCR。尤其是即使於成為模板之RNA之複本數較少、增多PCR之循環數之情形時，亦可期待抑制副反應之產生，並且將特異性PCR產物進行擴增。藉由提供藉由利用此種逆轉錄模板置換PCR之技術而特異性地進行擴增之核酸試樣，於尤其需要定量分析之臨床應用場所特別有用。
1401‧‧‧CPU
1403‧‧‧RAM
1405‧‧‧外部記憶裝置
1407‧‧‧輸出裝置
1409‧‧‧輸入裝置
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1420‧‧‧系統匯流排
1425‧‧‧輸入輸出介面
1430‧‧‧資訊資料庫儲存部
1440‧‧‧程式儲存部
1403‧‧‧RAM
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圖1係於各種條件下之藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR所進行之TCRβ鏈之擴增。箭頭表示全長TCRβ鏈之條帶。 圖2係於各種條件下之藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR所進行之TCRβ鏈之擴增。箭頭表示全長TCRβ鏈之條帶。 圖3係藉由使用單細胞之T細胞作為模板之單步驟逆轉錄模板置換PCR所進行之TCRβ鏈之擴增。上側之箭頭表示全長TCRβ鏈之條帶。下側之箭頭表示TCRβ鏈片段之條帶。 圖4係於各種條件下之藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR所進行之TCRβ鏈之擴增。箭頭表示全長TCRβ鏈之條帶。 圖5係於各種條件下之藉由單步驟逆轉錄模板置換PCR所進行之TCRβ鏈之擴增。箭頭表示TCRβ鏈之靶序列全長之條帶。 圖6係索引PCR反應液之電泳照片。左邊之泳道表示標記DNA之條帶，右邊之泳道表示由從來自Pmel-1之淋巴細胞提取之RNA擴增之DNA之條帶。 圖7係由來自Pmel-1小鼠之淋巴細胞細胞獲得之V基因及J基因使用頻度圖。 圖8係由來自Pmel-1小鼠之淋巴細胞細胞獲得之V-J使用頻度圖。 圖9係索引PCR反應液之電泳照片。各泳道自左起依序表示1：標記DNA、2～6：小鼠脾臟組織(1000 ng、200 ng、40 ng、8 ng、1.6 ng)、7～8：來自Pmel-1之淋巴細胞(8 ng、1.6 ng)、9：空白對照(blank)。 圖10係由C57BL/6小鼠脾臟組織獲得之V基因及J基因各自之使用頻度圖。 圖11係由C57BL/6小鼠脾臟組織獲得之V-J使用頻度圖。 圖12係本發明之多樣性解析系統之方塊圖。
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Claims (24)
- 一種對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析之方法，其包括： (1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得； (2)確定該核酸試樣所含之該核酸序列之步驟；及 (3)基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之步驟； 該步驟(1)包括： a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟， 該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸， 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。
- 一種生產核酸試樣之方法，該核酸試樣係用以對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行解析者，該方法包括(1)提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該核酸試樣係由從該受驗體獲得之RNA進行擴增而獲得，該步驟(1)包括： a)將從該受驗體獲得之RNA、逆轉錄所需之試劑、模板置換所需之試劑、及聚合酶鏈反應所需之試劑加以混合，將混合物供於產生逆轉錄之條件，而提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的cDNA之步驟；及 b)將由該步驟a)所獲得之cDNA供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有該複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟， 該模板置換所需之試劑含有模板置換寡核苷酸， 該聚合酶鏈反應所需之試劑含有該TCR或該BCR之C區特異性引子，該C區特異性引子係以於該步驟a)中引子功能之一部分或全部受到阻礙且於該步驟b)中引子功能之阻礙得以解除之方式設計之改型寡核苷酸引子。
- 如請求項1或2之方法，其中上述核酸試樣係無偏性地進行擴增之核酸試樣。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑視需要進而包含含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。
- 如請求項4之方法，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子，上述模板置換寡核苷酸作為5'錨定寡核苷酸引子而發揮功能。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比含有於上述混合物中。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與模板RNA進行雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。
- 一種用以將T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區進行擴增的套組，其係以包含 i)逆轉錄所需之試劑、 ii)模板置換所需之試劑、 iii)使用改型寡核苷酸引子之聚合酶鏈反應所需之試劑、及 iv)視需要之使用說明書，且 於反應開始時將i)～iii)之試劑及該改型寡核苷酸引子全部於反應系中加以混合為特徵，而且 ii)之試劑含有模板置換寡核苷酸， 該改型寡核苷酸引子係以於產生逆轉錄之條件下引子功能之一部分或全部受到阻礙且於產生聚合酶鏈反應之條件下引子功能之阻礙得以解除之方式設計之該TCR或該BCR之C區特異性引子。
- 如請求項9之套組，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑包含含有上述模板置換寡核苷酸所含之錨定序列之至少一部分的5'錨定寡核苷酸引子。
- 如請求項10之套組，其中上述聚合酶鏈反應所需之試劑不含上述5'錨定寡核苷酸引子。
- 如請求項9至11中任一項之套組，其中上述逆轉錄所需之試劑含有起始逆轉錄之寡核苷酸引子，該起始逆轉錄之寡核苷酸引子係以約40 nM以下之最終濃度、或相對於上述改型寡核苷酸引子約為十分之一以下之莫耳比而使用。
- 如請求項9至12中任一項之套組，其中上述改型寡核苷酸引子於同一改型寡核苷酸引子之序列上具有1個或1個以上之互補區，於PCR之初期熱改性處理前藉由該互補區而具有回折結構，或含有熱不穩定性修飾基。
- 如請求項13之套組，其中引子功能未受到阻礙之一部分改型寡核苷酸引子係作為藉由與上述TCR或該BCR之模板RNA之C區之部分序列雜交而起始逆轉錄之寡核苷酸引子而發揮功能。
- 如請求項9至14中任一項之套組，其係用以提供含有複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列之核酸試樣者，該核酸試樣係由從受驗體獲得之RNA無偏性地進行擴增而獲得。
- 及依附於請求項1之請求項3至8中任一項之方法，其中上述步驟(1)進而包括提供附加有適於序列解析之序列的核酸試樣之步驟。
- 如請求項16之方法，其中上述適於序列解析之序列係適於使用橋式PCR或乳化PCR之序列解析之序列。
- 如請求項16之方法，其中上述步驟(1)進而包括以下步驟： c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟；及 d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之步驟，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
- 如請求項18之方法，其中上述步驟(3)包括以下步驟： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之步驟； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之步驟； (3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之步驟； (3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之步驟； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之步驟；及 (3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之步驟。
- 一種用於使用資料庫對受驗體之T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之可變區之多樣性(repertoire)進行定量解析的系統，其具備： (1)如請求項15之套組； (2)用以確定該核酸試樣所含之該核酸序列之裝置；及 (3)用以基於所確定之該核酸序列，算出各基因之出現頻度或其組合，而導出該受驗體之TCR或BCR多樣性之裝置。
- 如請求項20之系統，其中(1)上述套組進而包含以下機構： c)將包含上述步驟b)之PCR擴增產物、附加有第1標籤序列之第2之5'錨定寡核苷酸引子、及附加有第2標籤序列之第2之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有標籤序列之複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構；及 d)將含有上述步驟c)之PCR擴增產物、第3之5'錨定寡核苷酸引子、及第3之TCR或BCR之C區特異性引子之混合物供於產生聚合酶鏈反應之條件，而提供含有附加有索引序列之上述複數種T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)之核酸序列的核酸試樣之機構，該第3之5'錨定寡核苷酸引子及該第3之TCR或BCR之C區特異性引子係附加有用以固定於序列解析之基板之序列及索引序列。
- 如請求項20或21之系統，其中(3)上述用以導出TCR或BCR多樣性之裝置具備以下機構： (3-1)提供包含V區、D區、J區及視需要之C區之至少1者的各基因區之參照資料庫之機構； (3-2)提供視需要進行修整並視需要提取適當長度者而獲得之輸入序列組之機構； (3-3)對於該輸入序列組，將該各基因區與該參照資料庫進行同源性檢索，並記錄與近似之參照等位基因及/或該參照等位基因之序列之比對之機構； (3-4)對該輸入序列組指定V區及J區，並基於指定結果提取D區之核酸序列之機構； (3-5)將該D區之核酸序列轉譯為胺基酸序列，並利用該胺基酸序列將D區分類之機構；及 (3-6)基於該步驟(3-5)中之分類，而算出V區、D區、J區及視需要之C區之各自出現頻度、或該等區之組合之出現頻度，藉此導出TCR或BCR多樣性之機構。
- 一種用以分析受驗者之疾病、障礙或狀態之系統，其具備如請求項20至22中任一項之系統、及基於利用該系統所導出之TCR或BCR多樣性而分析上述受驗者之疾病、障礙或狀態之機構。
- 一種用以對該受驗者之疾病、障礙或狀態進行處置或預防之系統，其具備將藉由如請求項23之系統所確定之受驗者之疾病、障礙或狀態與上述TCR或BCR多樣性定量地建立關聯之機構、及根據該定量之關聯選擇適當之用以處置或預防之機構的機構。
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